细胞生物学研究方法细胞生物学 90页

第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜:以可见光为光源电子显微镜:以电子束为光源\n一、光学显微镜技术（一）普通光学显微镜1.结构:①照明系统:光源和聚光器②光学放大系统:物镜和目镜③机械装置:用于固定材料和观察方便\n双筒显微镜\n单筒显微镜\n2.原理:经物镜形成倒立实像,再经目镜进一步放大成像。\n3.几个概念:①放大(率)倍数:显微镜最后形成的物体放大像与被检物体的大小比例,即像高比物高。②分辨力(resolvingpower):指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力。③数值孔径(镜口率)（NumericAperture）：NA=ｎsin(α/2)\n光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N.A．其中λ为入射光线波长；N.A．为镜口率＝ｎsin(α/2)；n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。\n表一、几种介质的折射率\n4.显微镜的几个光学特点制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。镜口角总是要小于180，所以sin(a/2)的最大值必然小于1对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，因此普通显微镜的最大分辨率数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是200μm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000倍。\n(二)相差显微镜(phase-contrastmicroscope,PCM)由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别。P31在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：1.环形光阑（annulardiaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。2.相位板（annularphaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ\n环状光阑装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体——相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。\n原理图:\n\n微分干涉显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）当两束光通过光学系统时会发生相互干涉，如果相位相同，干涉的结果是亮度增强，反之，就会相互抵消变暗，这就是光波的干涉现象。微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光汇合，从而样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器，如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。\n(三)荧光显微镜技术(Fluorescencemicroscope)1.荧光显微镜的特点:①光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜\n②照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上③有两个特殊的滤光片，激发光滤片用以滤除可见光，目镜和物镜之间的阻断滤片用于滤除紫外线，用以保护人目\n荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色）荧光标记:同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记\n（四）、激光扫描共焦显微境\n激光共聚焦扫描显微镜光路图\n\n激光扫描共焦显微镜的特点:用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，能显示细胞样品的立体结构分辨率大约是普通光学显微镜的3倍用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点\nLCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管\n(五)暗视野显微镜光路图聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。\n(六)倒置显微镜\n倒置显微镜inversemicroscope物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。\n二、电子显微镜技术(electronmicroscope)（一）、透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM）1932年Ruska发明\n原理:(电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样)用电子束作光源，用电磁场作透镜,电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短.分辨率0.2nm,放大倍数为数百万倍.用于观察超微结构(ultrastructure),及小于0.2μm,光镜下无法看清的结构.\n光镜与电子显微镜(透射电镜)的结构\n3.制样技术:1）超薄切片技术:步骤:P36电子束穿透力很弱,超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。\n莱卡超薄切片机\n内质网透射电镜图\n2）负染技术用重金属盐(如磷钨酸)染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria\n3）冰冻蚀刻(freeze-etching):标本置于-100度的干冰或-196度的液氮中，进行快速冰冻。用冷刀骤然将标本断开升温，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构-蚀刻向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。\n冰冻断裂与冰冻蚀刻技术\n（二）、扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope，SEM)20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构.\n用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。\n\n（三）、扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）由Binnig等1981年发明,是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器.根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。\n利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。\n第二节细胞组分的分析方法一、离心技术(一)、细胞破碎:(二）、差速离心（differentialcentrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离\n速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀\n（三）、密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）：1、速度沉降（velocitysedimentation）:用途:用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器特点:介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度原理:介质密度梯度十分平缓,生物颗粒（细胞或细器）按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离\n2、等密度沉降（isopycnicsedimentation）:用途:用于分离密度不等的颗粒特点:介质密度较高,陡度大,介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度;所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心原理:细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力或足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离\n二、细胞化学（cytochemistry）技术——细胞内大分子物质的显示方法P40福尔根(Feulgen)反应:特异显示DNA的分布,酸水解-与希夫(Schiff)试剂反应-呈红色\nFeulgenReaction\nPAS反应:显示多糖的存在利用希夫(Schiff)试剂糖原由D-葡萄糖的分支或直链组成，过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成二个游离醛基（—CHO），游离醛基与Schiff‘s试剂反应生成紫红色产物，颜色深浅与多糖含量成正比。\n（二）其它显示方法金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。格莫瑞方法（P40）Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色（深红色）。米伦反应：氮汞试剂与蛋白质上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀，显示蛋白质的存在。（P40）\n三、免疫细胞化学（immunocytochemistry）——特异蛋白抗原的定位与定性研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术。应用免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。(一)免疫荧光技术（immunofluorescenttechnique）P41荧光素:异硫氰酸荧光素（fluoreceinisothiocyante，FITC），为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂。分子量为389，最大吸收光谱为490～495，最大发射光谱为520～530urn，呈现明亮的绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。免疫酶标技术:辣根过氧化物酶\n(二)免疫电镜技术免疫胶体金技术:金胶体颗粒氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。\n四、细胞内外特异核酸序列的定位与定性——分子杂交（molecularhybridization）可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系（一）、原位杂交（insituhybridization）概念（p41)：细胞内特异核酸（DNAorRNA)序列的定性和定位。用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意核苷酸序列在染色体上或在细胞中位置的方法。1.光镜原位杂交：荧光素、放射性同位素2.电镜原位杂交：生物素、金胶体颗粒\n（二）、Southern杂交原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。\n是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。\n五、定量细胞化学分析技术（一）、流式细胞仪流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）\n\n（二）、显微光谱分析技术—显微分光光度测定技术原理：利用细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱的特性，测定细胞中某些物质的含量。DNA：含量=50A*稀释倍数公式中50的含义是：在标准厚度为1cm的比色杯中，OD260为1相当于50mg/mL的双链DNA，40mg/mL的RNA。紫外光显微分光光度测定法：可见光显微分光光度测定法：\n第三节细胞培养与细胞工程一、细胞培养细胞培养（cellculture）:选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。\n人的（一）动物细胞培养细胞培养1.原代细胞:2.传代细胞:3.细胞贴壁:4.接触抑制:\n5.细胞系(cellline)：原代细胞度过传代危机又能进行传代的细胞。有限细胞系、永生细胞系。实验室常见的细胞系\n6.转化细胞:正常细胞在某种因子的作用下发生突变而成为具有癌性的细胞。7.细胞克隆：从某一细胞系中分离出单个细胞，由此增殖形成（通过有丝分裂）的具有相同遗传性状的细胞群。8.细胞株(cellstrain):经过筛选具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆。\n（二）植物细胞培养1.组织培养：2.单倍体培养：3.原生质体培养:原生质体（protoplast）\n植物组织培养\n植物原生质体培养\n(三)非细胞体系在细胞生物学研究中的作用非细胞体系(cell-freesystem):来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。近年来，人们利用这一体系探讨了许多细胞生命活动中的重要问题，如DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，膜泡运输，细胞周期调控、核膜及染色质的组装、核质运输机制等。\n二、细胞工程(cellengineering)(一)细胞融合（cellfusion）P44概念:细胞杂交（cellhybridization）同核体（homokaryon）异核体（heterokaryon）诱导细胞融合的方法:生物方法:化学方法:物理方法:\n细胞融合\n（二）、单克隆抗体技术克隆（clone）：对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。1.血清抗体:抗原免疫系统（B淋巴细胞）抗体（混合物,抗血清)2.单克隆抗体:单个B淋巴细胞抗体（单一物质)专一性B淋巴细胞：体外培养肿瘤细胞：体外培养杂交瘤细胞单克隆抗体\n培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c杂交瘤技术操作流程图解\n接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞(Blymphocytes)：杂交瘤技术与单克隆抗体\n骨髓瘤细胞(myelomacells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。\n2.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler和Milstein,19751984年Nobel医学奖\n3.杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活\nH,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-存活死亡外源性途径(旁路途径)HAT培养基筛选\n(二)细胞拆合概念:P44胞质体核体细胞拆合方法:化学方法:物理方法:(三)显微操作技术（micromanipulationtechnique）概念:p45显微操作装置——用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置应用：显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等\n\n细胞核移植克隆绵羊\n第四节细胞及生物大分子的动态变化荧光漂白恢复技术荧光共振能量转移技术酵母双杂交技术放射自显影技术\n一、荧光漂白恢复技术概念：P45原理：将待测细胞用荧光物质标记，借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，可以造成该区域荧光分子的光淬灭；通过低强度激光扫描成像，可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率。由于光淬灭过程是不可逆的，荧光恢复过程可明显的反映荧光标记物质及其结合物的运动。\n\n二、单分子技术与细胞生命活动概念：在单分子水平上对生物大分子的行为（包括构象变化、相互作用、相互识别等）进行实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵﹑调控等。主要的研究手段有两种：1）单分子光谱学（荧光、共振能量转移等）2）单分子操纵（光镊、磁镊等）\n三、荧光共振能量转移技术（FRET）用来检测活细胞内两种蛋白分子是否直接相互作用的重要手段\n四、酵母双杂交技术它是一种利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统。1989年由Fields等最先建立的，目前已得到广泛应用。与其他技术相比，它省去了耗时耗力的蛋白表达纯化以及抗体制备步骤，并且可以用于高通量的筛选，因此以其简便、快捷与廉价的优点迅速发展成为一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。\n酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达来探测蛋白-蛋白的相互作用。由含有DNA结合域（DB)和DNA转录激活域(AD)的转录激活因子以及酵母报告株构成。分别制备DB与诱饵蛋白质A的融合蛋白,AD与猎物蛋白B的融合蛋白,如果蛋白A与蛋白B在细胞内相互结合，则可形成与转录激活子类似的具有DB和Ad结构域的复合物，从而启动报告基因的表达\n\n五、放射自显影技术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。步骤:1.同位素标记的生物大分子前体的掺入(14C和3H)2.细胞内同位素所在位置的显示\n\n第五节模式生物与功能基因组的研究一、模式生物1、病毒：基因组小，适合遗传操作；研究生命物质自组装的材料；可作为外源基因的载体2、细菌：培养方便；生长快；基因结构简单；突变株的诱变和分离、鉴定容易；转基因技术成熟，进行基因定位简便3、酵母：具有与细菌细胞相同的一些特点；具有真核细胞的组织结构；是单细胞生物；生长迅速且易于遗传操作4、线虫：身体细胞数目少；生命周期短，繁殖快；显微镜下通体透明，每一个细胞的形成都可以被追踪\n5、果蝇：具有丰富的生物行为，易于进行遗传操作；基因组中很多基因与人类基因有很高的同源性6、斑马鱼：基因数目与人类相近，许多基因与人类一一对应；容易饲养；胚胎发育过程在体外完成，鱼卵和胚胎透明7、小鼠：是哺乳动物，进化方面接近人类8、拟南芥：个体小；生长周期快；种子多；生活力强；自花授粉，基因高度纯合；具有最小的植物基因组\n二、突变体制备技术DNA水平上的基因敲除RNA水平上的RNA干扰（RNAi）\n基因工程技术(geneengineering)DNA的分子操作\n基因敲除（knockout）：利用基因同源重组的原理，使基因功能丧失。基因插入（knockin）：利用基因同源重组的原理，插入功能基因