分子细胞生物学——细胞生物学研究技术 65页

第二章细胞生物学研究技术李莲军博士云南农业大学动物科技学院2003.9-2010.9\n生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成，往往来自新技术的应用。因此，方法上的突破，对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。\n第一节显微镜技术第二节细胞成分分析技术第三节细胞组分分离技术第四节　细胞分选技术第五节细胞工程技术第六节　分子生物学技术学习内容\n一、光学显微镜技术(lightmicroscopy)第一节显微镜技术二、电子显微镜技术(electronmicroscopy)观察细胞及其组分的形态和结构。\n显微镜成像三要素:①照明系统，②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统一、显微镜成像基本原理在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。\n0.61λ分辨率DN.sinα/2=λ:光源波长;α:物镜镜口角;N:介质折射率显微镜的分辨能力肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nm\n二、常用光学显微镜普通光学显微镜倒置显微镜(invertedmicroscope)荧光显微镜(fluorescencemicroscope)相差显微镜(phase-contrastmicroscope)微分干涉相差显微镜(differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC)暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)激光共焦扫描显微镜(laserconfocalmicroscope)\n倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。\n相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统，将光程差或相位差转换成振幅差，主要用于观察体外培养中活细胞的形态结构。\n利用紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等)发出强烈的紫外线光源，用于观察细胞中有自发荧光、诱发荧光或经荧光染料标记的结构。荧光显微镜特点是：a光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；b有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。\n微分干涉显微镜偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。\n暗视野显微镜暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓，不分辨内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。\n可对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，可进行一系列亚细胞水平的结构和功能研究。激光共聚焦扫描显微镜\n扫描电子显微镜Scanningelectronmicroscopy，SEM透射电子显微镜Transmissionelectronmicroscopy，TEM三、电子显微镜电子显微镜观察到的结构称超(亚)微结构，可放大几万倍至几十万倍。扫描隧道显微镜Scanningtunnelingmicroscope，STM\n观察细胞内部超微结构，分辨率0.2nm。用电子束穿透标本，经电磁场的会聚和放大后在荧光屏上显像或将影像投射到照相底片。由于电子束穿透力弱，故经固定后的电镜标本需制成超薄切片(50～80nm)，并用重金属盐如柠檬酸铅和醋酸铀等染色。标本制备：①固定(戊二醛等)②包埋(环氧树脂)③切片(50-80nm)④染色(醋酸铀和柠檬酸铅等重金属盐)。透射电镜术\n扫描电镜术用于观察细胞表面的立体细微结构。需将小块组织经固定、脱水、干燥后，在其表面喷镀薄层碳膜或金属膜。图像清晰，富有立体感。\n仪器设备使用注意事项使用前必须认真阅读“说明书”，了解其工作原理和性能，按照“说明书”的要求进行操作，或在技术人员的指导下操作。\n第二节细胞组分的分析方法一、细胞化学技术二、免疫细胞化学技术三、核酸杂交技术四、放射自显影技术\n一、细胞化学技术主要用于显示细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等。利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。如用过碘酸—Schiff反应检测多糖，用脂溶性染料显示脂类，用酶化学染色显示某种酶，用孚尔根反应显示DNA。\n二、免疫细胞化学技术是应用免疫学原理，采用标记的抗原或抗体，通过抗原与抗体的特异性结合，然后用显微镜观察标记物，显示细胞内的抗体或抗原(肽或蛋白质等)的分布部位及相对含量。常用的标记物有辣根过氧化物酶、荧光素等，因此又可分为免疫酶技术、免疫荧光技术等。\n二种基本染色法直接法：第一抗体被标记。间接法：第一抗体也被看作抗原，而第二抗体被标记。由于信号被放大，故灵敏度更高。\n是用标记的RNA或DNA探针检测RNA或DNA片段的有无、及在转录水平检测基因的活性(mRNA)的一种重要方法。三、核酸分子杂交技术原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。\n用核酸杂交技术检测细胞内某一基因在染色体上的定位，称染色体原位杂交。用核酸杂交技术检测某一基因或转录物mRNA在细胞内的定位和转录状况，称细胞原位杂交。原位杂交技术\nSouthern杂交是体外分析特异DNA序列的方法。操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用标记的探针杂交，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。\n四、放射自显影术放射自显影术(radioautography,autoradiography)用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、变化、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素标记物导入生物体内，经过一段时间后，进行制片、放射性曝光、显影、定影等处理，即得知标本中标记物的准确位置和数量。放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。\n第三节细胞成分的分离技术分离技术是一大类技术的总称，包括细胞亚结构的分离和生物大分子的分离。一、离心分离技术(centrifugation)二、层析分离技术(chromatography)\n一、离心分离技术离心分离细胞组分和生物分子是最常用的分离方法，因为不同的细胞器和生物分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。常用的两类离心分离方法：差速离心(differentialcentrifugation)密度梯度离心(densitygradientcentrifugation)\n细胞器及大分子的密度及其沉降系数\n不同的细胞结构分离所需的离心力结构离心力细胞核800-1000g线粒体20，000-30，000g叶绿体20，000-30，000g溶酶体20，000-30，000g微体20，000-30，000g粗面内质网50，000-80，000g质膜和滑面内质网80，000-100，000g游离核糖体、病毒粒子150，000-300，000g\n差速离心在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需再通过密度梯度离心进一步分离纯化。\n密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一个连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离。又可分为速度沉降和等密度沉降两种。\n速度沉降(velocitysedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。速度沉降\n等密度沉降(isopycnicsedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞器分离。等密度沉降\n二、层析分离技术层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。①凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)②离子交换层析(ion-exchangechromatography)③亲和层析(affinitychromatography)\n凝胶过滤层析又称排阻层析或分子筛过滤，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化的一种方法。原理：蛋白质的体积大小不一，凝胶上有大小不一的孔；大的蛋白质在凝胶中不进入孔内直接下来，速度最快，中等大小的进入大孔中，下来速度较慢，小的蛋白质则进入小孔中，下来速度最慢。\n离子交换层析离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。它以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。\n在生物分子中，有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可使这种结合解除，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法亲和层析\n一、离心分选术二、流式细胞分选术三、免疫磁珠分选术四、电泳分选术第四节细胞分选技术\n流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计(仪)(flowcytometer)。二、流式细胞术\n三、免疫磁珠法磁珠可以结合蛋白质，也可以被磁铁吸引而发生力学移动。将微小磁珠用抗体(或抗原)包被后，使之与溶液中目的细胞表面的抗原(或抗体)特异性结合，再通过磁力作用发生力学移动，从而达到目的细胞与其他细胞(或物质)分离。\n四、细胞电泳在一定pH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳(cellelectrophoresis)。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞电荷量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同，可用来分离不同种类的细胞。\n所谓细胞工程，就是应用细胞生物学和分子生物学的方法，对细胞进行操作。第五节细胞工程技术细胞工程基本技术主要包括：细胞体外培养、细胞融合、细胞器移植及基因转移等。\n一、细胞体外培养技术二、细胞融合及单抗技术三、显微操作技术四、干细胞技术\n将离体细胞或组织放置在适当的环境条件下进行培养，使其能生长并增殖的一种技术。用于检测各种理化因子、细胞因子等对细胞形态结构、增殖、分化、代谢、运动、吞噬、分泌等生命活动的影响，还可用于研究细胞癌变及逆转的机制，也可用于获取特定的细胞、细胞产物等等。一、细胞培养技术\n二、细胞融合技术通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cellfusion)或细胞杂交。相同基因型细胞融合成同核体(homokaryon)；不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。动物细胞融合有以下三条途径：1.病毒诱导融合；2.化学诱导融合；3.电激诱导融合。\n单克隆抗体技术单克隆抗体(monocloneantibody)技术是细胞杂交技术的成功应用。正常淋巴细胞(如小鼠脾细胞)具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞(如骨髓瘤)可以在体外长期培养，但不分泌抗体。1975英国人Kohler和Milstein将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。\n单克隆抗体制备流程用特异抗原免疫小鼠(BALB/c)取脾脏浆细胞鼠骨髓瘤细胞细胞融合筛选杂交瘤细胞生产单克隆抗体\n三、显微操作技术在显微镜下，用显微操作仪对细胞进行解剖手术和微量注射的技术属显微操作技术。包括细胞核移植、嵌合体制作、细胞器移植、基因或染色体注入、胚胎切割、体外胚胎生产等。\n1核移植(克隆动物)技术细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过受精等有性过程(无性繁殖)即可被激活，构成新的重组胚胎，重组胚胎移植后，发育成与供体细胞基因型相同的后代，使得核供体的基因得到完全复制。\n嵌合体(chimeras)是指由不同基因型细胞构成的生物体。嵌合动物是指由两种或两种以上具有不同遗传性质的细胞系组成的聚合胚发育成的动物个体。嵌合动物技术是指由两个或两个以上同种或异种的受精卵组合发育而来的一个复合个体的制作技术。制作嵌合动物的方法主要有聚合法和囊胚注射法。2嵌合动物技术\n聚合法是将2个或多个去除透明带的早期胚胎，简单地聚合在一起培养形成一个嵌合胚胎的过程。囊胚注射法是把细胞注射入囊胚腔中，囊胚经培养进一步发育形成一个嵌合胚胎的过程。注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、ES细胞和EG细胞，甚至是已分化的细胞。\n3染色体操作技术按照人们的意图，有计划地削减、添加和替换染色体或其某一部分的方法和技术，以改变生物的遗传基础，达到人类需要的目的。\n四、干细胞技术干细胞是一类能自我更新和分化为特殊种类细胞的细胞。干细胞被《SCIENCE》1999，2000及2003年评为“十大科技进展之一”。干细胞技术主要包括：建立干细胞系，体外诱导分化，遗传改造，移植、体外构建组织和器官等。\n干细胞分类胚胎性干细胞：胚胎干细胞ESs、胚胎生殖细胞EGs组织特异性干细胞：造血干细胞、肝干细胞、皮肤干细胞、全能干细胞：受精卵、卵裂球专能干细胞：造血干细胞,精原干细胞,皮肤干细胞多能干细胞：ESs、EGs；骨髓基质干细胞按来源划分按分化潜能划分\n第五节分子生物学技术一、PCR技术二、基因工程技术三、转基因动物技术\n一、PCR技术聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)用于在体外将微量的目标DNA进行大量扩增，以便进一步分析或操作。反应体系：①样品DNA；②引物(primer)；③4种dNTP；④TagDNA聚合酶；⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。反应过程：①变性；②复性；③延伸；④循环(重复上述“变性——复性——延伸”过程)。\n温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。PCR反应的温度循环周期\nPCR的反应体系\n二、基因工程技术在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重组，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。基因工程技术包括：1分子水平上的基因体外重组(即利用工具酶对DNA分子进行“外科手术”)2细胞水平上的基因表达。\n无性繁殖的转化子筛选载体的选择目的基因的制备体外重组DNA引入受体细胞重组DNA的检测基因体外重组\n转基因动物技术是指借助基因工程技术将体外重组的结构基因导入受精卵或早期胚胎，培育出转基因动物的技术。三、转基因动物技术\n一、受精卵雄原核显微注射法二、胚胎干细胞(ES细胞)法三、逆转录病毒感染法四、体细胞核移植法五、精子载体法六、YAC法转基因动物制作方法\n转基因动物制作步骤一、制备外源目的基因二、制备转基因胚胎三、转基因胚胎的筛选及培养，胚胎移植四、转基因胚胎的发育及鉴定五、筛选并建立转基因动物系\n乳腺生物反应器技术乳腺生物反应器是根据细胞中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物。\n