(生物学)芯片应用 88页

生物芯片的应用\n生物芯片分类据芯片探针的不同组织芯片芯片实验室（Lab-on-a-chip）基因芯片（Genechip，DNAchip，DNAmicroarray）蛋白芯片（Proteinchip）\n组织芯片组织芯片（tissuechip）:也称组织微阵列，是生物芯片技术的一个重要分支，是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片，进行同一指标的原位组织学研究。现在制备的多为石蜡标本组织芯片\n组织芯片制备过程\n\n芯片实验室（微流控芯片）\n基因芯片及其作用原理基于核酸探针杂交技术原理而研制的，一般包括DNA微阵列制备、样品制备、杂交和信号的检测分析蛋白芯片蛋白芯片是将各种蛋白质有序固定于滴定板、滤膜、玻片等各种载体上，然后用荧光标记抗体或其他成分与芯片作用，经洗脱、扫描、检测分析蛋白质之间的相互关系。\n生物芯片的应用生物学与医学研究基因表达谱、功能基因组等临床诊断和其他生物检测与其他检测手段的竞争个人基因档案个体化医学、药物开发\n表达谱芯片\nMeasuringGeneExpressionIdea：MeasuretheamountofmRNAtoseewhichgenesarebeingexpressedin(usedby)thecell.Measuringproteinwouldbemoredirect,butiscurrentlyharder.\nMicroarraysprovideameanstomeasuregeneexpression\nAreasbeingstudiedwithMicroarraysDifferentialgeneexpressionbetweentwo(ormore)sampletypes.SimilargeneexpressionacrosstreatmentsTumorsub-classidentificationusinggeneexpressionprofilesClassificationofmalignanciesintoknownclassesIdentificationof“marker”genesthatcharacterizedifferenttumorclassesIdentificationofgenesassociatedwithclinicaloutcomes(e.g.survival)\nmRNAlevelscomparedinmanydifferentcontextsDifferenttissues,sameorganism(brainv.liver)Sametissue,sameorganism(tumorv.non-tumor)Sametissue,differentorganisms(W+v.mutant)Timecourseexperiments(effectof+++,development)\n基因芯片在抗癌中药紫龙金片二次开发中的应用中医药擅长于从整体上进行功能的调节，在作用方式上具有多成份、多环节、多靶点的特性。这些复杂的特点，以往的药物研究方法，很难从整体到细胞水平，甚至是蛋白质水平进行全面地研究。\n用基因表达差异谱数据库筛选现代中药，为中药现代化研究提供了一个全新的思路和方向。该方法将中药与现代基因组学的疾病相关基因表达和现代药物学化学物质的作用在功能上统一起来，能够在中药和基因表达之间架起一座桥梁，在基因表达水平上解释中药理论和中药的作用机制。这样可使中药成为作用机制明确、物质基础清楚的药物，使中药理论成为人们可以普遍接受的国际医药学语言，使中药从根本上实现现代化、国际化。\n基因芯片在抗癌中药紫龙金片二次开发中的应用采用人类全基因组表达谱芯片技术，建立筛选模式生物体系，破解中成药紫龙金片对人肺癌细胞株基因的作用机制以获取肺癌预测和诊断所需分子标识，探索紫龙金片扶正作用的生物途径。\n实验所用细胞株：肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种基本类型，实验选取五株细胞，进行紫龙金表达谱实验。非小细胞肺癌的人腺癌肺癌细胞（A549）人肺鳞癌细胞（H520）人大细胞肺癌细胞（H460）小细胞肺癌人小细胞肺癌细胞（H446）人正常细胞人胚肺成纤维细胞（MRC-5）（均购自中国医学科学院肿瘤细胞库）\n紫龙金药物溶液浓度7个浓度用各种细胞的培养基配置实验药物并梯度稀释，浓度分别为：133mg/ml66mg/ml33mg/ml22mg/ml16.5mg/ml8.25mg/ml4.125mg/ml\n细胞生长试验培养好的细胞+不同浓度的药物处理细胞测OD550值，观察药物处理效果\n细胞生长抑制率．A549、H460、H520、H446、16HBE、MRC-5每株细胞加紫龙金药处理24h，浓度分别为16mg/ml、22mg/ml、33mg/ml、66mg/ml．\n总RNA提取电泳图A549-22A549-BH460-22H460-BH520-22H520-BH446-22H446-BMRC-5-22MRC-5-B\n表达谱试验操作\n\n芯片扫描全景图芯片扫描左上角放大图\n层次聚类分析图\n差异显著并具有相同变化趋势的基因483个，其中上调基因170个，下调基因313个。按功能进行聚类分析后将差异表达的基因分为63个大类，发现其主要涉及细胞生理过程的正负调控、代谢、胞内细胞器、膜结合细胞器、细胞核、细胞周期和转录等。根据已知数据库信息，进一步将63大类，归纳为25个通路。\n对具代表性的3个通路（细胞凋亡通路、细胞周期通路、Wnt信号通路）中的13个相关基因进一步研究，发现药物处理前这4株肺癌细胞中有6个基因表达为上调，其余7个基因表达为下调；药物处理后表达模式发生逆转，上调的基因转为下调，下调基因的转为上调证明了紫龙金药物的药效和对基因表达的调控作用。这13个基因在给药前后的变化为我们筛选肺癌基因分子标识和寻找药物作用靶点提供了可靠证据，也有助于在分子水平上阐释紫龙金片的作用机制。\n表1.基因功能分组FunctiongroupsNumbersofgenespvaluecellularphysiologicalprocess2150.000188intracellular1760.00001metabolism1740.000096cellularmetabolism1700.000015primarymetabolism1650.000011intracellularorganelle1460.000261organelle1460.000261intracellularmembrane-boundorganelle1370.000009membrane-boundorganelle1370.000009nucleus1060.000002regulationofbiologicalprocess930.00006regulationofcellularprocess910.000009regulationofphysiologicalprocess880.000028regulationofcellularphysiologicalprocess870.000012nucleobase,nucleoside,nucleotideandnucleicacidmetabolism860.000186transcriptionregulatoractivity410.000479cellcycle310.000036negativeregulationofbiologicalprocess310.000009transcription,DNA-dependent290.000463\n表2.代谢通路PathwayGenetitleProbesetFoldchangeApoptosishelicase,lymphoid-specific227350_at-4.83helicase,lymphoid-specific223556_at-3.69junoncogene201466_s_at11.76X-linkedinhibitorofapoptosis206536_s_at5.85Blood_Clotting_Cascadeserpinpeptidaseinhibitor,cladeE(nexin,plasminogenactivatorinhibitortype1),member1202627_s_at5.21Calcium_regulation_in_cardiac_cellsATPase,Ca++transporting,cardiacmuscle,slowtwitch2212361_s_at-3.18adenylatecyclase9204497_at-2.71Cell_cycleminichromosomemaintenancecomplexcomponent6238977_at-4.05cyclinE2205034_at-5.17cyclin-dependentkinaseinhibitor1A(p21,Cip1)202284_s_at4.35growtharrestandDNA-damage-inducible,alpha203725_at9.79Circadian_ExercisezincfingerRNAbindingprotein213286_at3.12DNA_replication_Reactomeminichromosomemaintenancecomplexcomponent6238977_at-4.05hematologicalandneurologicalexpressed1-like212109_at-3.67polymerase(DNAdirected),alpha1,catalyticsubunit204835_at-2.57\n表2.代谢通路(续)PathwayGenetitleProbesetFoldchangeElectron_Transport_ChainNADHdehydrogenase(ubiquinone)1alphasubcomplex,10,42kDa1554719_at3.75Fatty_Acid_Degradationacyl-CoenzymeAdehydrogenase,short/branchedchain226030_at-4.61carnitinepalmitoyltransferase2204264_at-4.1carnitinepalmitoyltransferase2204263_s_at-3.99G_Protein_Signalingadenylatecyclase9204497_at-2.71G1_to_S_cell_cycle_Reactomeminichromosomemaintenancecomplexcomponent6238977_at-4.05cyclinE2205034_at-5.17cyclin-dependentkinaseinhibitor1A(p21,Cip1)202284_s_at4.35growtharrestandDNA-damage-inducible,alpha203725_at9.79hematologicalandneurologicalexpressed1-like212109_at-3.67cyclinG2202769_at2.95cyclin-dependentkinaseinhibitor2C(p18,inhibitsCDK4)204159_at-11.71TranscriptionfactorDp-2(E2Fdimerizationpartner2)226157_at-3.92G13_Signaling_Pathwaycitron(rho-interacting,serine/threoninekinase21)212801_at-13.88SH3domaincontainingringfinger1225589_at3.81Glycolysis_and_Gluconeogenesisglutamic-oxaloacetictransaminase1,soluble(aspartateaminotransferase1)208813_at2.57hexokinase2202934_at9.19GPCRDB_Othercadherin,EGFLAGseven-passG-typereceptor2(flamingohomolog,Drosophila)36499_at-4.92\n表2.代谢通路(续)PathwayGenetitleProbesetFoldchangeHypertrophy_modelinterferon-relateddevelopmentalregulator1202147_s_at3.14interferon-relateddevelopmentalregulator1202146_at2.69vascularendothelialgrowthfactorA210512_s_at3.35activatingtranscriptionfactor3202672_s_at47.45Integrin-mediated_cell_adhesion_KEGGdedicatorofcytokinesis1203187_at-2.75Gprotein-coupledreceptorkinaseinteractingArfGAP2225558_at-3.34MAPK_Cascadejunoncogene201466_s_at11.76Mitochondrial_fatty_acid_betaoxidationcarnitinepalmitoyltransferase2204264_at-4.1carnitinepalmitoyltransferase2204263_s_at-3.99mRNA_processing_ReactomeCDC-likekinase3202140_s_at3.55cleavagestimulationfactor,3'pre-RNA,subunit2,64kDa,tauvariant212905_at-5cleavagestimulationfactor,3'pre-RNA,subunit3,77kDa229666_s_at-5.25cleavagestimulationfactor,3'pre-RNA,subunit3,77kDa229665_at-11.29heterogeneousnuclearribonucleoproteinU(scaffoldattachmentfactorA)235603_at-2.87splicingfactor,arginine/serine-rich5212266_s_at-3.06。。。。。。。。。。。。。\n表3.3个通路中的13个基因在4株肺癌细胞中经紫龙金药物处理前后的变化趋势PathwayProbesetGenesymbolFoldchangeFoldchangewithoutdrugtreatmentwithdrugtreatmentA549H446H460H520Apoptosis223556_atHELLS-3.694.392.621.903.33Apoptosis227350_atHELLS-4.833.213.002.242.91Apoptosis201466_s_atJUN11.76-5.48-3.01-15.8-6.16Apoptosis206536_s_atXIAP5.851.12-1.32-1.15-1.20Cell_cycle238977_atMCM6-4.055.507.219.418.49Cell_cycle204159_atCDKN2C-11.711.364.401.592.34Cell_cycle205034_atCCNE2-5.171.292.131.902.14Cell_cycle212109_atHN1L-3.672.031.581.652.12Cell_cycle226157_atTFDP2-3.921.311.25-1.411.28Cell_cycle202769_atCCNG22.95-3.01-1.61-2.70-1.77Cell_cycle203725_atGADD45A9.79-7.01-2.64-5.85-4.21Cell_cycle202284_s_atCDKN1A4.35-5.11-7.16-9.51-6.95Wnt_signaling217173_s_atLDLR3.39-3.61-2.06-1.83-2.01Wnt_signaling204420_atFOSL110.84-3.81-3.88-3.79-4.34Wnt_signaling201466_s_atJUN11.76-5.48-3.01-15.8-6.16\n\n致病微生物检测——奶粉中重要致病菌检测基因芯片的研制\n奶粉致病菌检测的必要性奶粉营养丰富，在加工和运输过程中很容易被微生物感染奶粉的消费人群多是免疫力低下的婴儿，儿童及老人。因此，一旦有致病微生物感染，致病率和致死率都较高，危害严重2002年，美国的“惠氏奶粉事件”2005年，法国的沙门氏菌感染事件中国是奶粉消费大国，一半需国外进口\n奶粉中常见致病菌的种类2004年和2006年，（FAO）和（WHO）在日内瓦联合召开了“关于婴儿配方奶粉（PIF）中阪崎肠杆菌和其他微生物”的专家会议CategoryorganismsincludedCategoryAorganisms——clearevidenceofcausalityEnterobactersakazakii,SalmonellaenteritidisCategoryBorganisms——causalityplausible,butnotyetdemonstratedEnterobacteragglomerans,Hafniaalvei,Klebsiellapenumoniae,Citrobacterkoseri,Citrobacterfreundii,Klebsiellaoxytoca,Eneterobactercloacae,Escherichiacoli,Serratiaspp.,Acinetobacterspp.,CategoryCorganisms——causalitylessplausible,ornotyetdemonstratedBacilluscereus,Clostridiumdifficile,Clostridiumperfringens,Clostridiumbotulinum,Listeriamonocytogenes,Staphylococcusaureusandcoagulase-negativestaphylococci\n目前，我国出入境检验检疫局对进口奶粉需检验检疫的致病菌项目包括：Enterobactersakazakii,SalmonellaKlebsiellapenumoniae,StreptococcuspyogenesShigellaStreptococcuspyogenes\n我们的检测对象EnerobactersakazakiiSalmonellaKlebsiellapneumoniaeKlebsiellaoxytocaSerratiamarcescensAcinetobacterbaumanniiBacilluscereusListeriamonocytogenesStaphylococcusaureusShigellaE.coliO157占FAO和WHO提到的菌中的（10/19）包括了全部的中国出入境检验检疫项目\n当前检测现状分离培养，生化鉴定分子生物学方法（PCR，real-timePCR，immunoassays）onlydetectionofE.sakazakiiandSalmonellainPIFhavebeenreported\n高通量一次多种微生物，多方面分析。自动化降低劳动强度，保证质量。速度快微型化减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。基因芯片特点\nObjective将生物芯片技术应用于奶粉中致病菌检测，研发出可一次快速、准确、高通量的检测出奶粉中多种致病菌的基因芯片。\n技术路线图\nResults1——Primers&Probes共筛选出4条引物和27条探针StrainsTargetGenePrimerNo..ProbeNo.E.sakazakiiITSwl-5793,wl-5794OA-1976,OA-1977,OA-1978salmonellaOA-1979S.pyogenesOA-1973OA-1974OA-2006K.pneumoniaeOA-2355OA-2356K.oxytocaOA-2351,OA-2352,OA-2354B.cereusOA-2391,OA-2393SerratiamarcescensOA-2568,OA-2569,OA-2570,OA-2571ListeriamonocytogenesOA-2094,OA-2095,OA-2096YersiniaenterocoliticaOA-2575,OA-2576,OA-2577AcinetobacterbaumaniiOA-2530OA-2531S.aureusOA-1973,OA-1974,OA-2006E.coliO157wzywl-5593,wl-5594OA-2528OA-2709OA-2710OA-2711\nResults2——Chipspreparation\nResults3——Optimizationofdetectionsystem扩增标记体系两重PCR，引物浓度比4：3两步法PCR杂交16ul杂交液-240℃水浴杂交12h\n\n性能验证特异性15个属，47个种的51株菌灵敏度G－菌以阪岐肠为代表，G+菌以金黄色葡萄球菌为代表Result：0.01ng/ulDNA；104cfu/ml(A)(B)(C)(D)(A)(C)(D)(B)\n性能验证多种菌的检测2种菌（A.baumannii和L.monocytogenes,E.coliO157和B.cereus）3种菌（E.sakazakii，Salmonella和B.cereus；S.marcescens，K.oxytoca和S.aureus）双盲试验26株分离株(A)(B)\n奶粉样品处理两步法前增菌选择性增菌优点有效富集抑制杂菌减少食品样品对后续PCR的影响TheconceptisexcellentandhastremendousimplicationforsafetyofPIF\n基因组DNA提取Buffer：NP40，Tween-20，沸水浴10min能很好的去除抑制剂，又可有效的破坏细菌细胞壁，去除蛋白并去除抑剂成分；灵敏度高，可对少至102cfu的样品进行处理，而获得稳定的PCR扩增效果；操作简便，适用于实际检验；所需试剂均为常规试剂，无毒且费用低；对DNA的损伤很小，提高了PCR的稳定性和分析结果的准确性。\n模拟样品和实际样品模拟样品——26例杂交结果表明，25g奶粉中含有3CFU的E.sakazakii，3CFU的Salmonella，2CFU的K.pneumoniae，6CFU的K.oxytoca，9CFU的S.marcescens，3CFU的A.baumannii，5CFU的B.cereus，3CFU的L.monocytogenes，7CFU的S.aureus，4CFU的E.coliO157就能被该芯片特异的检测出来，达到现行国标和行标的灵敏度标准要求实际样品——21例美国(n=9)，爱尔兰(n=3)，法国(n=2)，阿根廷(n=2)，荷兰(n=3)，印度(n=2)2例阪崎肠杆菌阳性，其它19例阴性结果与天津出入境检验检疫局动植食检验中心采用现有行标方法结果一致\n软件判读系统的开发原理：基于Microsoft.NETFramwork开发，使用C#语言编写，模式文件使用XML编写套圈分析之后，每个点的荧光强度值被读取并存储为本程序可处理的荧光强度文件有效性分析和归一化处理运行速度快，通用性与可移植性好\nConclusions1.设计和筛选得到了两对针对奶粉中10种重要致病菌的高效扩增的引物，两对引物的浓度分别为0.15µM和0.20µM时效果最好。2.设计并筛选得到了针对奶粉中10种重要致病菌的特异探针27条，正对照探针1条，荧光探针1条，负对照探针1条和空白对照探针1条。3.点制了可对奶粉中10种致病菌进行检测的芯片，完成了芯片的特异性，灵敏度，多种菌的同时检测和双盲试验，试验结果表明该芯片特异、灵敏、可靠，可同时检出多种菌。\nConclusions4.建立了一种两步法食品样品前处理的方法和基因组提取方法，该方法操作简便，经证明既能有效的富集出要检测的10种致病菌，对后续步骤无任何抑制作用。5.利用该芯片完成了26例模拟奶粉样品和21例实际奶粉样品的检测，实验结果表明该芯片具有较强的应用型。6.开发了操作简便的芯片结果判读软件，减少了人为误差。\n检测奶制品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒（200710004918.3）。食品样品中简易提取细菌DNA的方法（200810182554.2）。\n蛋白质芯片\n引言\n引言\n引言\n引言\n引言\n引言\n引言生物芯片基因芯片蛋白质芯片微流控芯片蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。www.proteinmicroarrays.com/\n引言\n研究蛋白质芯片的意义蛋白质是基因表达的最终产物,接近生命活动的物质层面；探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。\n根据制作方法和用途蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片蛋白质芯片的分类\n蛋白质芯片分类\n蛋白质芯片分类\n蛋白质芯片分类\n蛋白质芯片分类\n蛋白质芯片技术提出生物学问题（实验目的）样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应化学偶合，加底物，反应温度和时间，冲洗条件检测（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）数据分析和建模（图象量化，标准化，采集蛋白信息，建立模型）12345蛋白质芯片制备6SchenaM,Proteinmicroarrays,2005,7.\n蛋白质芯片的制备固相载体及其处理载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）蛋白质的预处理选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解点制微阵列可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等固定微阵列上的蛋白样点膜为载体：芯片放入湿盒，37°C1h载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白微阵列的封闭主要封闭试剂：BSA或Gly\n一、载体的选择及抗体或抗原的固化蛋白质芯片技术\n一、载体的选择及抗体或抗原的固化蛋白质芯片技术\n二、捕获分子第三节蛋白质芯片技术\n三、微阵列设计与制备第三节蛋白质芯片技术\n四、抗原或抗体的标记第三节蛋白质芯片技术\n四、抗原或抗体的标记第三节蛋白质芯片技术\n四、抗原或抗体的标记第三节蛋白质芯片技术\n五、蛋白质芯片检测方法第三节蛋白质芯片技术\n蛋白质芯片的应用疾病诊断和预警药物开发蛋白质组学\n定量检测组织提取液中的肿瘤标记物WeissensteinU,Proteomics2006,6,1427–1436.孵育后的微阵列荧光图A含抗原B无抗原微阵列方法与ELISA方法检出结果比较疾病诊断uPA尿激酶型纤溶酶原激活因子PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子VEGT血管内皮生长因子\n高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂药物开发JungSO,etal.,Proteomics2005,5,4427–4431.A1500个点阵的微阵列B局部点阵放大图及SPR信号His6-RB/GST-E7相互作用抑制剂筛选微阵列图加入His6-RB加入含PepC抑制剂的His6-RB\n人动脉平滑肌细胞蛋白谱SukhanovSandDelafontaineP，Proteomics,2005,5,1274–1280.蛋白质组学揭示了oxidizedlowdensitylipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式细胞经oxidizedlowdensitylipoprotein作用后的蛋白谱检出298个蛋白54个蛋白表达量发生变化4.7%抗原（一组细胞-细胞间相互作用分子）表达上调；13.4%抗原（结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降\nG-蛋白偶联受体芯片FangY，etal.,ChemBioChem2002,3,987-991.肾上腺素受体芯片（含三个亚型）筛选抑制剂药物开发抑制剂\n存在的问题成本过高,需一系列昂贵的尖端仪器芯片的标准化问题提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等\n展望—蛋白质芯片未来的发展重点建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。\nProteinMicroarraySystemTheProteinMicroarraySystemisacompletemicroarrayplatformthatincludesmicroarraymanufacturing,processing,surfacechemistry,detectionandanalysis.TeleChem/arrayit.comhttp://arrayit.comItissuitableforavarietyofproteomicapplicationsincludingMicroMultianalyteImmunoassays,protein-antibody,antibody-protein,antibody-antigen,protein-protein,andprotein-drugmicroarrayassays.