分子生物学 7页

1、基因的概念基因是合成一种有功能的多肽链或者RNA分子所必需的一段完整的DNA序列。〔不仅包括编码肽链或RNA的核苷酸顺序，还包括表达所需的调控等顺序〕2、现代基因概念的开展断裂基因—基因的结构是断裂的。原核生物的基因结构大多数是连续的，即基因编码蛋白质的序列是不中断的。而真核生物基因的编码序列是不连贯的，即在两个编码序列之间有一段不编码蛋白质的非编码序列。编码序列称为外显子，非编码序列称为内含子。重叠基因--两个基因共有一段重叠的核苷酸序列，这就是重叠基因。基因重叠有两种情况：一是一个基因的密码子完全包含在另一个基因内；二是两个基因只有一个或几个核苷酸的重叠。假基因---具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，所以假基因是没有功能的基因，常用Ψ表示。1、通常散布于有活性的功能基因之间。2、一般认为假基因是由mRNA反转录成cDNA，然后整合到基因组上。3、没有生物学功能，不再受到进化的选择压力，因此可以积累很多突变。3、基因的本质：4、基因的开展历史：5、DNA复性:热变性的DNA如缓缓冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋，这叫复性。6、DNA的变性：当双螺旋DNA加热至生理温度以上〔接近1000C〕时，它就失去生理活性，这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开成为无规那么线团，这个过程叫DNA的变性。7、DNA双螺旋：B-DNA双螺旋结构模型要点：（1）两条反平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕成右手双螺旋〔2〕脱氧核糖与磷酸在外侧形成螺旋的轨迹，核苷酸间彼此通过3’,5’-磷酸二酯键相连；碱基伸向内部，其平面与螺旋轴垂直；糖环平面与中轴平行。〔3〕两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相连系而结合在一起，且总是A=T，G≡C。〔4〕双螺旋的平均直径为2nm，每个螺旋圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nm。〔5〕螺旋外表有一条大沟和一条小沟。8、DNA损伤的修复：指DNA受到损伤后，细胞内发生的使DNA的化学组成和核苷酸序列重新恢复或使细胞对DNA损伤产生耐受的一系列反响。9、第一个重组DNA的酶是ecori。10、DNA复制与转录〔相同与不同〕：11、DNA分子标记技术有哪些：分子标记的类型：第一类为基于DNA-DNA杂交的DNA标记。该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳别离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA\n探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的RFLP标记。第二类为基于PCR的DNA标记。这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。随机引物PCR标记包括RAPD标记、ISSR标记等，其中RAPD标记使用较为广泛。特异引物PCR标记包括SSR标记、STS标记等，其中SSR标记已广泛地应用于遗传图谱构建、基因定位等领域。第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。这类DNA标记可分为二种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记。另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS标记。第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。RFLP标记：限制性酶切片段长度多样性，是用限制性内切酶处理不同个体基因组DNA所产生的大分子片段的大小的多样性。RAPD标记：以随机引物通过PCR反响非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳别离扩增片段，经染色来显示扩增DNA片段的多样性。SSR标记：以1-6个核苷酸为根本单元，串联重复次数一般为10-50，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，比拟扩增段的迁移距离，就可知在不同个体间某SSR作为上的长度多样性。AELP标记：扩增片段长度多样性，设计对某种限制性内切酶的通用接头及可与接头序列的限制性酶切位点的序列配对的专用引物，通过PCR进行的限制性片段扩增，分析其长度多态性。12、DNA复制具有哪些特点：1.DNA复制是半保存复制，在半保存复制方式中两条亲代链分开，分开后的每一条链都可作为模板用于合成互补的、反平行的子链。2.DNA合成需要DNA聚合酶，DNA聚合酶需要一个游离的3′羟基作为引物〔可以由RNA或DNA提供〕，以脱氧核苷三磷酸作为底物，催化3′羟基与脱氧核苷三磷酸的5′-α-磷酸基团形成磷酸二酯键，释放出焦磷酸〔随后水解为无机磷酸〕，使核苷酸整合到延伸的聚核苷酸链中。新链按5′→3′方向生长。3.原核生物中存在3种聚合酶〔polI、II和III〕。而真核生物中存在5种聚合酶〔polα、β、γ、δ和ε〕。在E.coli中，polⅢ是主要的复制酶，而polI既有复制功能，又有修复功能。所有三种原核生物的DNA聚合酶都具有3′→5′外切酶的活性。DNApolI和III还具有5′→3′外切酶活性。4.复制起始发生在复制起点，E.coli中存在唯一的复制起点〔OriC〕，从一个复制起点沿着相反方向双向进行；真核生物染色体含有许多复制起点。真核生物DNA的复制也是双向进行的，但与E.coli不同，可以在许多复制起点同时双向进行复制。5.DNA复制需要双链解旋形成复制叉，解旋需要解旋酶，ATP驱动的解旋酶使复制起点〔OriC〕区解旋，制造复制叉，单链结合蛋白与两条模板链结合防止他们重新形成双螺旋。在复制叉处，亲代DNA的两条链作为模板用于合成新的DNA。\n6.由于DNA聚合酶催化的链的延伸是5′→3′方向，以及双螺旋DNA中的两条链是反平行的。一条链〔前导链〕的合成是连续的，合成方向与复制叉移动方向一致；另一条链〔后随链〕的合成是不连续的，合成方向与复制叉移动方向相反。7.复制起始是借助于引发酶合成的RNA引物开始的，前导链合成需要一个RNA引物，而后随链合成需要多个RNA引物。8.复制的忠实性非常高，主要是由于DNA聚合酶具有3′→5′外切酶的活性。但在复制过程中由于碱基配对错误、以及碱基共价修饰、碱基缺失和插入等都会产生突变，并造成DNA损伤。复制后的修复主要包括5种修复机制：直接修复、切除修复、错配修复、重组修复和SOS修复等。13、启动子：是指RNA聚合酶识别、特异结合和开始转录的一段DNA序列。启动子是位于结构基因5’端上游的一段DNA序列，能够指导全酶同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。14、反式作用因子：能直接或间接识别和结合在顺式作用元件上，调控靶基因表达的蛋白质因子，也称为转录因子。15、熔解温度〔Tm〕：熔解曲线的中点，即一半的DNA双螺旋解为单链所对应的温度称为熔解温度。16、错义突变：碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。17、蛋白质组:一种基因组所表达的全套蛋白质；一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。18、蛋白质翻译后，新生态链的加工过程：①新生态链的折叠至少有两类蛋白质参与体内新生态链的折叠，即酶和分子伴侣。②蛋白质合成的加工与修饰某些蛋白质在其肽链合成结束后，还需进一步加工转变为具有正常生理功能的蛋白质，有些蛋白质还需经过一定修饰才能成为成品而参与正常的生理活动。③亚单位的聚合由多肽及其辅助成分〔脂类、核酸、血红素等〕构成的蛋白质，在多肽链合成后，还需经过多肽链及肽链与辅助成分之间聚合过程，才能成为有活性的蛋白。19、锌指结构〔301〕：指的是在很多蛋白中存在的一类具有指状结构的结构域，这些具有锌指结构的蛋白大多都是与基因表达调控有关的功能蛋白。锌指结构都是一个α螺旋与一个反向平行β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA的结合。20、遗传密码子的特性：1.连续性：编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。2.简并性：遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。3.通用性：蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。•已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。•密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。\n4.摆动性(wobble)转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。21、OD值与吸光度的换算：22、SD序列：mRNA上的AGGAGGU区域作为翻译起始信号，被称为Shine-Dalgarno顺序或SD序列。核酸的化学组成：碱基、核苷、核苷酸23、mRNA的可变剪接：许多真核生物基因的mRNA前体可以经过不同的剪接方式产生多种mRNA分子，从而编码出多种不同功能的异形体蛋白质，这种特殊的mRNA前体剪接方式称为可变剪接或选择性剪接。RNA的可变剪接：可变剪接是指同一基因转录形成的RNA前体可经过一种以上剪接方式产生多种不同的mRNA的过程。RNAi:*24、RNA干预：指双链小RNA高效、特异降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使相应的基因沉默。25、RNA的成熟：不管原核或真核生物的rRNA和tRNA都是以初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。26、RNA编辑：指修饰或秦轻微改变mRNA的核苷酸顺序，使他们与对应的模板DNA的顺序有所不同的过程。27、tRNA分子结构特征：tRNA的二级结构由于局部双螺旋的形成而呈现“三叶草〞形，故称为“三叶草〞结构。tRNA的“三叶草〞形结构包括：氨基酸臂、DHU臂、反密码臂、可变臂和TψC臂五局部“L〞形三级结构：TΨCloop&DHUloop位于“L〞两臂的交界处，利于“L〞结构的稳定；L〞结构中碱基堆积力大，使其拓扑结构趋于稳定。连接多聚核苷酸的键：磷酸二酯键核苷酸组成：核苷的磷酸酯，分为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。29、真核生物mRNA的转录后加工的结构特点：①5′端形成特殊的帽子结构，有三类：帽子0：m7GpppX单细胞生物〔如酵母〕；帽子1：m7GpppXm多细胞生物，主要形式；帽子2：m7GpppXmpYm占10-15%。帽子的功能是\n为核糖体识别mRNA提供信号增加mRNA的稳定性，保护5′端。②由一种360KD特异性酶切除3′末端一段后，经RNA末端腺甘酸转移酶催化加上polyA尾巴〔约200个A〕。PolyA的功能：可能在于增加mRNA的稳定性。③通过剪接除去由内含子转录的序列。④链内部核苷酸甲基化。主要是m6A，可能对mRNA前体的加工起识别作用。30、原核基因表达调控：原核基因调控机制的类型和特点调控的主要环节在转录起始正调控负调控转录调节普遍采用操纵子模式，原核生物功能相关的基因往往串联地排列在一起，在一个共同的调控区的调节下，一起转录生成一个多顺反子，最终表达产物是一些功能相关的酶或蛋白质，它们一起参与某种底物的代谢或某种产物的合成。31、基因表达调控〔乳糖操纵子、色氨酸操纵子〕：基因表达是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程基因表达调控是生物体内基因表达的调节控制机制，是细胞中基因表达在时间、空间上处于有序状态，并对环境条件的变化做出适当反响的复杂过程。32、乳糖操纵子的结构，及怎样操纵：一）乳糖操纵子(lacoperon)的结构三个结构基因Z基因：编码β-半乳糖苷酶〔β–galactosidase〕，分解乳糖成为半乳糖和葡萄糖。Y基因：编码透过酶，使外界乳糖等透过大肠杆菌细胞壁进入细胞内。A基因：编码乙酰基转移酶，能将乙酰CoA上的乙酰基转移到半乳糖上，形成乙酰半乳糖。三个调节序列：在结构基因的上游还有一个启动子〔P〕和一个操纵基因〔O〕，在启动子上游还有一个分解〔代谢〕物激活蛋白〔CAP〕结合位点，以及一个调节基因〔I〕，调节基因编码阻遏蛋白。\n〔二〕阻遏蛋白的负调控〔三〕CAP的正调控当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。cAMP—CAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；假设有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。乳糖操纵子的双调控系统(1)受乳糖与阻遏蛋白监控的、可诱导的负调控系统;(2)受cAMP与CAP调节的、可诱导的正调控系统。葡萄糖通过调节cAMP的合成间接监控这一过程。以此，为保证大肠杆菌灵活、经济、有效地适应外界环境，只有在必需的时候〔只有乳糖，没有葡萄糖〕才启动乳糖操纵子的表达。33、色氨酸调控：34、葡萄糖效应〔为什么会产生这个效应〕：葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中参加乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖的等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应。为什么会产生这种效应？因为添加葡萄糖后，细菌所需要的能量可从葡萄糖得到满足，葡萄糖是最方便的能源，细菌无需开启一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活性，减少环腺苷酸的合成，与它相结合的蛋白质-----环腺苷酸受体蛋白因找不到配体不能形成复合物。降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极地调节方式。35、PCR技术及其根本原理，包括哪些反响过程：聚合酶链式反响PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的DNA片断。简单地讲，PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。设计两段寡核苷酸引物，这两段寡核苷酸引物序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列由分别位于待扩增DNA区段的两侧。反响时，首先在摩尔数大大过量的两段引物及四种dNTP参与下对模板DNA\n进行加热变性；随之，将反响混合液冷却到某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列退火；此后退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环，就根本上使目的DNA产物增加一倍。这一指数反响的主产物是一段双链DNA，它的两个末端由寡核苷酸引物的5`端来决定，而长度那么取决于两引物间的距离。一个循环：高温变性低温退火中温延伸94℃55℃72℃36、PCR的特点：〔1〕特异性强〔2〕快速：一个PCR过程需要3-4小时即可完成〔3〕简便：产物可直接用于序列分析和克隆，〔4〕可扩增RNA或cDNA：逆转录酶将mRNA，cDNA再扩增〔5〕对起始材料要求低：粗提的DNA即可〔6〕有一定程度的单核苷酸错误掺入错配率万分之一37、分子克隆〔过程〕：分子克隆是指在体外对DNA分子进行人工重组，将重组分子导入适宜宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。根本步骤：制备目的基因——将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成重组DNA——导入寄主细胞——筛选、鉴定——扩增、表达