细胞生物学_03 细胞生物学研究方法讲解材料课件 68页

细胞生物学第三章细胞生物学研究方法生命科学学院主讲李桂兰\n首先我们学习第一节细胞的形态观察技术第三节细胞工程技术目录主要内容第二节细胞组分的分析与检测技术\n显微镜技术第一节细胞的形态观察技术µm(10-6m)nm(10-9m)Å(10-10m)肉眼分辨率:0.2mm光学显微镜:0.2µm电子显微镜:0.2nm\n显微镜技术光学显微镜技术电子显微镜技术SEM（scanningelectronmicroscope）TEM（transmitionelectronmicroscope）扫描隧道显微镜第一节细胞的形态观察技术\n一、光学显微镜技术以可见光（或紫外光）为光源类型普通复式光学显微镜特殊光学显微镜：相差和微分干涉显微镜、录像增差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜等多功能显微镜激光扫描共焦显微镜第一节细胞的形态观察技术\n1、普通复式光学显微镜构成：性能参数：分辨率放大率特点和局限性第一节细胞的形态观察技术\n（1）普通复式光学显微镜性能参数分辨率：区分开两点间的最小距离R=0.61λ/nsin(α/2)NA=nsin(α/2)NA(numericalaperture)为物镜的数值孔径值影响分辨率的因素入射光的波长镜口角介质的折射率第一节细胞的形态观察技术\n\n\n（1）活细胞观察技术—相差显微镜原理：把透过标本的可见光的光程差（相位差）变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。特殊构造：相差物镜、环形光阑、合轴调中望远镜、绿色滤光片第一节细胞的形态观察技术\n\n相差显微镜的应用特点：可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察未经染色的活细胞。第一节细胞的形态观察技术\n（2）活细胞观察技术—微分干涉显微镜特点：以平面偏振光为光源，能区分样品厚度的微小差别，增加样品反差，有立体感。应用：观察未染色标本，更适于研究活细胞中较大的细胞器（3）录像增差显微镜—计算机辅助的微分干涉显微镜降低背景噪声，提高分辨率，填补光镜与电镜之间的空白第一节细胞的形态观察技术\n（4）活细胞观察技术—倒置显微镜应用：通常具有相差物镜，用来观察正在培养的活细胞第一节细胞的形态观察技术\n3、特殊光学显微镜—荧光显微镜光源：汞灯—短波长紫外光装置：激发滤光片、阻断滤光片、分色镜荧光染料染色应用：在光镜水平对细胞中特异的蛋白质分子或核苷酸片段等进行定位、定性分析。绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）第一节细胞的形态观察技术\n3、特殊光学显微镜—荧光显微镜第一节细胞的形态观察技术Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen\n4、光学显微镜—激光扫描共焦显微镜用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，可自动改变观察的焦平面,通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构，并可通过三维重构,形成立体图像。在研究亚细胞结构与组分方面应用广泛.第一节细胞的形态观察技术\n4、光学显微镜—激光扫描共焦显微镜第一节细胞的形态观察技术\n光学显微镜—激光扫描共焦显微镜第一节细胞的形态观察技术FigureComparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.\n1荧光共振能量转移技术5、与荧光观察有关的技术第一节细胞的形态观察技术2荧光漂白恢复技术检测活体中生物大分子纳米级距离和距离变化的工具。GFP突变体：CFP青绿色、YFP黄色检测活体细胞表面或内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率大小的技术。\n6、特殊显微镜—暗视野显微镜原理：通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜，使来自聚光镜的光线不直接入射到物镜内，而被标本散射的光则可以进入物镜，从而达到在黑暗的背景下可看到标本的外部形态。特点视野是暗的，物象是亮的。可以观察在明视场中看不见的细菌等微小标本的存在。只能看清标本轮廓，分不清内部结构第一节细胞的形态观察技术\n\n7、多功能显微镜第一节细胞的形态观察技术\n二、电子显微镜以电子束作为光源扫描电子显微镜利用二次反射电子成像，主要用来观察样品表面的形态特征。透射电子显微镜利用透过的电子成像，用来观察细胞内部的详细结构。第一节细胞的形态观察技术\nFigureLimitofresolutionoftheelectronmicroscope.Electronmicrographofathinlayerofgoldshowingtheindividualfilesofatomsinthecrystalasbrightspots.Thedistancebetweenadjacentfilesofgoldatomsisabout0.2nm(2Å).\n二、电子显微镜1、基本构造电子束照明系统：成像系统：电磁透镜真空系统：记录系统：荧光屏或感光胶片第一节细胞的形态观察技术\n\n\n\n电子显微镜能不能取代光学显微镜呢？\n二、电子显微镜2、电子显微镜的优缺点优点：比光学显微镜分辨率高缺点：不能观察活的生物样品，而且不能观察细胞全貌。第一节细胞的形态观察技术\n二、电子显微镜3、电子显微镜制样技术超薄切片技术（厚度40～50nm）电镜负染色技术冷冻断裂和冷冻蚀刻技术电镜三维重构技术第一节细胞的形态观察技术超薄切片技术：固定、包埋、切片、染色染色剂：重金属，成黑白图像冷冻蚀刻电镜技术主要用于膜断裂面的蛋白质颗粒和膜面结构，深度蚀刻主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白电镜三维重构技术适于分析难以形成三维晶体的膜蛋白及病毒和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构\n\n三、扫描隧道显微镜分辨率：横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：是探测微观世界物质表面形态的仪器，三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。可直接观察生物大分子生物结构的原子排列，并且可避免损伤样品。工作原理第一节细胞的形态观察技术\n三、扫描隧道显微镜第一节细胞的形态观察技术STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu2500万倍硅晶体表面DNA\n第一节细胞的形态观察技术\n细胞组分的分析方法细胞组分的分离细胞组分的分析定量细胞化学技术第二节细胞组分分析技术\n一、细胞组分的分离细胞组分的获得：用低渗匀浆、超声破碎、研磨等方法获得细胞组分匀浆。细胞组分分离—离心技术：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。常用差速离心技术、密度梯度离心技术，或者是二者结合。第二节细胞组分分析技术\n一、细胞组分的分离第二节细胞组分分析技术低速离心机转速<8ooor/min，离心力<10kg高速离心机转速为10000~25000r/min，离心力为10-100（kg）转速超过25000r/min，离心力大于100Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。\n1、差速离心第二节细胞组分分析技术特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。通过差速离心可将细胞初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。\n2、密度梯度离心第二节细胞组分分析技术密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。速度区带离心用于分离密度相近大小不一的细胞组分等密度梯度离心用于分离不同密度的细胞组分用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。速度区带梯度介质最大密度小于样品颗粒最小密度要控制好离心时间分离密度不等的颗粒等密度梯度离心梯度介质最大密度大于样品颗粒最大密度，样品密度介于梯度密度最大与最小之间，样品不能到达离心管底部。\n二、细胞组分分析细胞化学技术：细胞学和化学的结合产生了细胞化学,主要是研究细胞结构的化学组成及化学分子的定位、分布及其生理功能,包括定性和定量分析。包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影示踪细胞化学技术等。第二节细胞组分分析技术\n二、细胞组分分析酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。免疫标记技术：特异性蛋白抗原的定性、定位分析——将免疫学方法与荧光标记技术、酶标记技术、金标技术等相结合用来研究特异蛋白在细胞内分布的方法。（选择11）原位杂交技术（Insituhybridization）：特异核酸序列的定位、定性分析。（选择题12-16）放射标记技术：研究生物大分子在细胞内的合成动态（选择题17）第二节细胞组分分析技术原位杂交技术将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。Northern杂交用来检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。WesternBlot中文一般称为蛋白质印迹。检测蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。\nInsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.Electron-microscopicautoradiography第二节细胞组分分析技术\n三、定量细胞化学技术显微分光光度技术流式细胞仪用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。计数、分类、测定等第二节细胞组分分析技术\n细胞工程应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术，按照人们的需要，有计划地大规模地培养生物组织和细胞，以获得生物及其产品，或改变细胞的遗传组成以获得新的种或品种，为社会和人类提供需要。第三节细胞工程与细胞培养\n细胞培养概念：在体外模拟体内的生理环境，使从机体取出的细胞在体外继续生长繁殖的技术包括：细菌培养、动物细胞培养和植物细胞培养在细胞培养中防止污染是决定细胞培养成败的关键。第三节细胞工程与细胞培养\n动物细胞培养术语原代培养（primaryculture）：从动物机体取出直接进行培养的细胞群叫原代细胞，对原代细胞的培养称为原代培养。传代培养：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。将细胞从一个培养瓶以一定的比例转移到另外的培养瓶继续培养的过程，即称为传代或传代培养。第三节细胞工程与细胞培养\n动物细胞原代培养第三节细胞工程与细胞培养\n传代细胞的培养过程第三节细胞工程与细胞培养\n动物细胞的培养形式单层细胞培养：也称群体培养，将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层克隆培养：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中；各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。悬浮培养：使用特定的装置，使细胞处于悬浮状态进行增殖的培养方法。第三节细胞工程与细胞培养\n单层细胞培养和克隆培养第三节细胞工程与细胞培养\n细胞培养有关的概念细胞系（cellline）：原代培养细胞经过传代形成的生物学特性不均一的细胞群体。有限细胞系（finitecellline）：指传代次数有限的体外培养细胞。有限细胞系仍然保持细胞原来染色体的二倍体数量和接触抑制行为。连续细胞系或永生细胞系（infinitecellline）：培养过程中发生突变或转化的细胞或从肿瘤组织培养建立的细胞群，在培养条件下可无限繁殖。染色体明显改变，失去接触抑制，容易传代培养。第三节细胞工程与细胞培养\n细胞克隆：从一个经过鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群.具有基本相同的遗传性状。细胞株:是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞.第三节细胞工程与细胞培养\n动物细胞培养的特点体外培养的细胞具有依附生长特性和接触抑制现象。接触抑制:细胞培养过程中,形成良好单层后,细胞彼此接触,移动运动停止的现象.贴壁生长细胞的基本形态：成纤维样细胞、上皮样细胞。第三节细胞工程与细胞培养\n植物细胞培养植物组织培养原生质体培养单倍体培养第三节细胞工程与细胞培养\n非细胞体系（P72）定义：来源于细胞，不具备完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。应用：近年来，非细胞体系在研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制及细胞核装配（染色质、核膜、核骨架装配）等方面显示了重要作用。第三节细胞工程与细胞培养\n细胞融合与细胞杂交技术细胞融合：自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂交细胞。诱导细胞融合的方法生物方法：灭活的仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒化学方法：聚乙二醇PEG物理方法：电击和激光第三节细胞工程与细胞培养\n第三节细胞工程与细胞培养单克隆抗体技术免疫技术细胞融合细胞培养：选择性细胞培养、克隆培养\n细胞拆合与显微操作技术细胞拆合：物理方法：机械方法或超声处理去核化学方法：松胞素处理使细胞排核，再离心得到胞质体和核质体。第三节细胞工程与细胞培养\n本章巩固练习一、名词解释1、原代培养2、传代培养3、克隆培养4、群体培养5、接触抑制6、细胞株7、细胞系8、非细胞体系二、填空1、光学显微镜的分辨率由、和三种因素决定，用紫外光为光源观察物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。2、适于观察活细胞的光镜有、、、等。3、电子显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是透镜。4、荧光显微镜是以为光源，而电子显微镜则以作为光源。5、可用技术来研究质膜结构的不对称性。6、细胞生物学研究中常用的光镜有、、、。7、贴壁生长细胞的形态为、。8、超速离心的方法包括和两种，其中前者适合对组分进行粗分离，而后者则为较为精细的分离手段。\n三、选择题1、在光学显微镜下所观察到的组织或细胞结构一般称为A．显微结构  B．超微结构  C．亚显微结构 D．分子结构2．研究细胞的超微结构一般要利用下列哪种技术A．光学显微镜技术   B．电子显微镜技术  C．X射线衍射技术D．离心技术   E．荧光显微镜3、适于观察细胞表面及断面超微结构三维图像的仪器是  A．普通光学显微镜   B．荧光显微镜  C．相差显微镜  D．扫描电镜E．透射电镜4、适于观察细胞内超微结构的显微镜是A．透射电镜  B．扫描电镜 C．荧光显微镜 D．倒置显微镜E．相差显微镜5、适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是A．透射电镜 B．扫描电镜  C．荧光显微镜  D．倒置显微镜E．相差显微镜6、不能用于研究膜蛋白流动性的方法是()技术。A．荧光抗体免疫标记B．荧光能量共振转移C．光脱色恢复D．荧光标记细胞融合\n7、用于观察活细胞的显微镜是()。A．倒置显微镜B．相差显微镜C．微分干涉显微镜D．三者都是8、激光共焦点扫描显微镜可用于()。A．获得细胞不同切面的图像B．观察无色透明的标本C．定量分析细胞中的化学成分D．观察细胞表面的立体形貌9、用电子显微镜在细胞中观察不到微粒体，其原因是()。A．微粒体太小，无法用电子显微镜观察B．它们是匀浆和离心后的人造产物C．电子能够完全穿透它们D．只有通过显微摄影才能看到10、分离细胞内不同细胞器的主要技术是()。A．超速离心技术B．电泳技术C．层析技术D．光镜技术11、研究表皮生长因子受体在细胞分布的部位可用()。A．原位杂交技术B．显微操作技术C．免疫电镜技术D．细胞融合技术\n12、要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过()实现。A．SouthernblotB．NorthernblotC．WesternblotD．insituhybridization13、细胞内特异DNA或RNA序列的定性与定位通常采用的技术是()。A．杂交瘤技术B．显微放射自显影C．原位杂交D．胶体金技术14、已克隆了人的rDNA，用()确定rDNA分布在人的哪几条染色体上。A．单克隆抗体技术B．免疫荧光技术C．免疫电镜技术D．原位杂交技术15、已克隆了鸡卵清蛋白的基因，用()技术证明在雏鸡的输卵管中该基因不转录而在母鸡输卵管中则活跃地转录。A．SouthernblotB．WesternblotC．NorthernblotD．免疫荧光技术\n16、下面()实验方法不能告诉你基因的表达与否。A．SouthernblotB．NorthernBlotC．WesternblotD．免疫荧光法17、某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的DNA复制还是阻止蛋白质合成，用()证明。A．电镜负染色技术B．放射自显影技术C．免疫荧光技术D．免疫电镜技术18、流式细胞术可用于测定()。A．细胞的大小和特定细胞类群的数量B．分选出特定的细胞类群C．细胞中DNA，RNA或某种蛋白的含量D．以上三种功能都有\n四、判断题1、贴壁生长的细胞呈单层生长，且有接触抑制现象.2、光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。3、在电子显微镜下观察细胞核时用碱性品红染色，染色质被染成红色。五、匹配题：请从20种方法中，挑选最佳的一种来研究下列问题：（1）高等动物克隆的制作（）（２）某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的DNA复制还是阻止蛋白质的合成（３）已克隆了鸡卵清蛋白的基因，如何证明在雏鸡的输卵管中该基因不转录而在产卵母鸡输卵管中则活跃的转录（）（４）已克隆了人的rDNA，问rDNA分布在人的哪几条染色体上（）（5）证明犯罪现场找到的头发中的DNA与被告嫌疑犯的DNA是吻合的（）（6）体外培养细胞，从G1期到S期，细胞表面形态结构的变化（）（7）研究表皮生长因子受体分布的部位。（）（8）原代培养细胞长成致密单层，由于接触抑制作用DNA合成停止，如何证明（）（9）观察腺病毒核衣壳表面的亚单位-衣粒形态与排列方式（）（10）研究酵母菌在无氧和有氧条件下生长时，其线粒体形态结构的变化（）\n方法：A、电子显微镜三维成像与X衍射和核磁共振技术；B、Southern杂交技术；C、扫描电镜技术；D、细胞显微分光光度法E、免疫荧光技术F、超薄切片技术G、Northern杂交技术；H、放射性自显影技术I、超离心技术；J、DNA序列分析K、原位杂交技术L、Western杂交技术；M、单克隆抗体技术N、负染技术O、细胞融合技术P、流式细胞术Q、DNA指纹技术\nA、相差显微镜B、录像增差显微镜C、激光共焦点扫描显微镜D、倒置显微镜　E、电镜技术1、（）可用来观察培养中活细胞的连续生理活动。2、（）不能观察活的生物样品，而且难以观察细胞的全貌。3、（）可以通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构，在研究亚细胞结构与组分方面应用广泛。4、（）用来观察未经染色的标本。5、（）在计算机辅助下，可以提高分辨率，为光镜水平在高分辨率下研究活细胞提供了必要的工具。