分子生物学分子生物学研究方法下 课件 67页

第六章分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术6.1基因表达研究技术6.2基因敲除技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术6.4基因芯片及数据分析6.5利用酵母鉴定靶基因功能6.6其他分子生物学技术\n6.1基因表达研究技术6.1.1基因表达系列分析技术6.1.2RNA的选择性剪切技术6.1.3原位杂交技术6.1.4基因定点突变技术6.1基因表达研究技术\nSAGE是以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。6.1.1基因表达系列分析技术（SAGE）常规SAGE方法（shortSAGE）6.1基因表达研究技术\n常规SAGE方法（shortSAGE）基本流程6.1基因表达研究技术\n—标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。—原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。LongSAGE技术：6.1基因表达研究技术\nRNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。类型：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。6.1.2RNA的选择性剪接技术6.1基因表达研究技术\n选择性剪切的不同类型RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切6.1基因表达研究技术\n果蝇Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体6.1基因表达研究技术\n原位杂交（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。6.1.3原位杂交技术6.1基因表达研究技术\nmRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。负对照，mRNA的同义链,无杂交信号正对照，UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠6.1基因表达研究技术\n荧光原位杂交（FISH）首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。6.1基因表达研究技术\n通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。6.1.4基因定点突变技术6.1基因表达研究技术\n寡核苷酸介导的DNA突变技术6.1基因表达研究技术\n重叠延伸介导的定点诱变6.1基因表达研究技术\n大引物诱变法示意图6.1基因表达研究技术\n6.2.基因敲除技术（geneknock-out）通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，进行精确的定位修饰和基因改造，同染色体一起稳定遗传。6.2.1基本原理6.2.2高等动物基因敲出技术6.2.3植物基因敲出技术6.2基因敲除技术\n经典遗传学（Forwardgenetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reversegenetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。6.2.1基本原理6.2基因敲除技术\n基因敲除分两种：完全基因敲除、条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。噬菌体Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。6.2基因敲除技术\n用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验6.2基因敲除技术\n正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞6.2基因敲除技术\n真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。6.2.2高等动物基因敲出技术6.2基因敲除技术\n模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。6.2基因敲除技术22\nT-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。6.2.3植物基因敲出技术6.2基因敲除技术\n植物基因敲除突变体植株筛选a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b.PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。6.2基因敲除技术\n6.3蛋白质及RNA相互作用技术6.3.1酵母单杂交系统6.3.2酵母双杂交系统6.3.3体外蛋白质相互作用技术6.3.4细胞内蛋白质相互作用研究6.3.5RNAi技术及其应用6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n酵母单杂交系统是20世纪90年代中期发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术。特点：可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。该体系也是分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法。6.3.1酵母单杂交系统6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n①将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。②将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。酵母单杂交的基本原理：6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n酵母单杂交的基本原理示意图6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（bindingdomain，BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录；而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。6.3.2酵母双杂交系统6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n酵母双杂交的基本原理示意图6.3蛋白质及RNA相互作用技术\na.选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株b.研究的猎物(或称靶蛋白)蛋白的基因与编码AD的序列结合c.诱饵(bait)蛋白的基因与编码BD的序列结合,形成两段融合基因d.将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因表达）的阳性菌落。酵母双杂交主要实验过程：6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n酵母双杂交系统的应用：发现新蛋白和蛋白的新功能研究抗原和抗体的作用（细胞内）筛选药物的作用位点建立基因组蛋白连锁图6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n6.3.3体外蛋白质相互作用技术FarWestern印迹技术GST融合蛋白沉降技术蛋白质芯片技术等离子表面共振技术免疫共沉淀技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术\nFarWestern印迹技术用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。GST融合蛋白沉降技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术\nGST融合蛋白沉降技术\n蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。蛋白质芯片技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n蛋白质芯片的制备\n将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。等离子表面共振技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术该技术不需要标志物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点是需要专门的仪器。\n等离子表面共振技术示意图6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。免疫共沉淀技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n免疫共沉淀示意图6.3蛋白质及RNA相互作用技术\nFRET荧光能量转移有三个基本条件：①给体与受体在合适的距离（1～10nm）；②给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；③给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。6.3.4细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法（FRET）6.3蛋白质及RNA相互作用技术\n荧光共振能量转移法6.3蛋白质及RNA相互作用技术当蛋白质A与B不发生相互作用时，其相对距离较大，无FRET现象；而蛋白质A与Ｂ发生相互作用时，其相对距离较小，发生FRET。\nRNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的论文。研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。经过Dicer（一种具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的外源双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），并有效定位目标mRNA。6.3.5RNAi（RNA干涉）技术及其应用6.3蛋白质及RNA相互作用技术\nsiRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介。siRNA具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核糖体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。6.3蛋白质及RNA相互作用技术\nRNAi作用机制示意图\n6.4基因芯片及数据分析6.4.1基因芯片技术原理6.4.2基因芯片的点制过程6.4.3基因芯片数据分析6.4基因芯片及数据分析\n基因芯片（DNAchip），又称DNA微阵列（DNAmicroarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。6.4.1基因芯片技术原理6.4基因芯片及数据分析\n基因芯片技术流程图6.4基因芯片及数据分析\n6.4.2基因芯片的点制过程简易基因芯片大规模基因芯片微珠芯片技术6.4基因芯片及数据分析\n简易基因芯片使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式。6.4基因芯片及数据分析\n基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。6.4.3基因芯片数据分析数据可靠性分析生物学意义分析——差异表达的生物学意义6.4基因芯片及数据分析\n6.5利用酵母鉴定靶基因的功能6.5.1酵母的遗传学和分子生物学简介6.5.2酵母基因转化与形状互补6.5.3外援基因在酵母中的功能鉴定6.5利用酵母鉴定靶基因的功能\n6.5.1酵母的遗传学和分子生物学简介具有和动植物细胞相似的结构特征和细胞生长发育过程；很多基因在酵母和动植物细胞中高度保守；容易进行生物化学与分子生物学操作；具有快速生长、无性繁殖、简便的平板影印能力；酵母是最早完成基因组DNA全序列测定的单细胞真核生物，有稳定的单倍体和二倍体细胞；酵母单倍体和二倍体细胞在形态上有相似性，但存在重大差异：①二倍体细胞的直径大约是单倍体的1.3倍；②二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体接近圆形；③二倍体细胞和单倍体细胞的出芽方式不同。6.5利用酵母鉴定靶基因的功能\n6.5.2酵母基因转化与形状互补利用整合型质粒可以对酵母基因组中的任意基因进行精确的敲除（置换），并通过孢子繁殖中的四分体分析技术进行观测和研究。基因置换一般在二倍体中进行；基因置换方法有两种：一步置换法二步置换法6.5利用酵母鉴定靶基因的功能\n6.5.3外援基因在酵母中的功能鉴定将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化野生型或突变酵母菌株，通过观察酵母的表型变化或分析细胞中化学成分的变化，推测该基因的生物学功能。因为酵母细胞中有与动植物细胞比较接近的蛋白质转录后修饰系统，许多在大肠杆菌中不产生功能蛋白质的动植物基因在酵母中表达后往往具有生物学功能。6.5利用酵母鉴定靶基因的功能\n\n6.6.1凝胶滞缓实验6.6.2噬菌体展示技术6.6.3蛋白质磷酸化分析技术6.6其他分子生物学技术6.6其他分子生物学技术\n凝胶滞缓试验（gelretardationassay），又叫作DNA迁移率变动试验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。6.6.1凝胶滞缓实验6.6其他分子生物学技术\n拟南芥转录因子与不同DNA元件有不同的结合能力。6.6其他分子生物学技术\n噬菌体是细菌病毒的总称，英文为Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，有“吞噬”之意。噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。6.6.2噬菌体展示技术6.6其他分子生物学技术\n将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。噬菌体展示技术的基本原理：6.6其他分子生物学技术\n噬菌体展示技术研究蛋白质的相互作用“诱饵”\n由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。6.6.3蛋白质磷酸化分析技术底物蛋白磷酸化：双向电泳、质谱分析蛋白激酶活性检测：体外激酶活性分析法6.6其他分子生物学技术\n蛋白激酶体外磷酸化活性分析6.6其他分子生物学技术