[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术 91页

[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n[分子生物学实验技术]分子生物学实验技术篇一:分子生物学实验技术DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u加ddH2O至20μl\n限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。5.酶切结束时，加入0.5MEDTA使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g×5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中。7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、电泳检测取质粒酶切产物适量，加适当loadingbuffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体作对照，采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。三、注意事项1.\n浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。2.购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。5.注意星号酶切活力。DNA片段回收与纯化质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。一、冻融法1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条捣碎，置于1.5ml离心管中；2.加入等体积的Tris-HCl饱和酚，振荡混匀；3.-20℃放置5-10min；4.4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；5.\n加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；6.-20℃，放置5-10min；7.4℃离心10000g×5min，合并上清液；8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9.加入1/10体积3MNaAc、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；10.-20℃，静置30min；11.4℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；12.加适量H2O或TE溶解沉淀。［］二、DNA回收试剂盒1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。2.加入BufferQG，置50℃水浴10min。3.若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇，混匀。4.将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。5.4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。6.加入500μlBufferQG于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。7.加入750μlBufferPE于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。8.4℃离心13000g×1min。弃去收集管。9.将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μl\nEB于柱上。放置1min，4℃离心13000g×1min。10.取5μl回收DNA电泳检测。三、注意事项紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。mRNA差别显示技术mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR2．第一链合成：总RNA样品2μg；cDNA合成引物1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PCA等。PC为阳性对照。混匀后稍离心。每管5管操作步骤TM5×第一链缓冲液2μl10μldNTPmix2μl10μlMMLV逆转录酶1μl5μl5μl25μl将2μl反应液分别转至新管中。将78μlddH2O分别加入B管中,混匀。将72μlddH2O分别加入A管中，混匀。1AP1,T91BP1,T92AP1,T92B\nP1,T9H2OP1,T9RNA1P1,T9RNA2P1,T9以下为阳性对照反应体系PC1AP10,T8PC1BP10,T8PC2AP10,T8PC2BP10,T810×PCRbuffer5μl5mMdNTPmix0.5μl引物P2.5μl引物T2.5μlTaq酶2μl加ddH2O至总体积为50μl执行PCR程序:93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循环；68℃5min。和3’端的Poly尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly尾，通常用Poly\n表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚纤维素或寡聚琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA3’末端含有Poly的特点，在RNA流经寡聚纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备++1．3M醋酸钠2．0.1MNaOH3．1×上样缓冲液：20mMTris-HCl；0.5MNaCl；1MEDTA；0.1%SLS、NaCl、EDTA的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育的10%SLS至终浓度为0.1%。4．洗脱缓冲液：10mMTris-HCl；1mMEDTA；0.05%SDS5．无水乙醇、70%乙醇6．DEPC二、操作步骤1．将0.5-1.0g寡聚-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC\nH2O洗柱。3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4．将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱PolyRNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。8．OD260测定PolyRNA分布，合并含PolyRNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时PolyRNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。10.用适量的DEPCH2O溶解RNA。\n++++三、注意事项1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly尾处的二级结构，使Poly尾充分暴露，从而提高PolyRNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。4．寡聚-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。5．一般而言，10哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPolyRNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。7++++NorthernBlot继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。\n与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物上，再用放射性标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影，以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量。但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。一、试剂准备1.0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,调pH至8.0,定容至100ml。[]2．50mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振荡,37℃过夜，高压灭菌。3．5×甲醛凝胶电泳缓冲液:MOPS[3-丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH调pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。4．20×SSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。5.6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。6．50×Denhardt:聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白0.5g加ddH2O至50ml,无菌抽滤、分装。7．1MNa2HPO4:Na2HPO4·12H2O35.81g,加dd\nH2O至100ml。8.1MNaH2PO4:NaH2PO4·2H2O15.6g,加ddH2O至100ml。9.0.1M磷酸钠缓冲液:Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml。10.STE缓冲液:1MTris-HCl2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml，加ddH2O至250ml。11.预杂交液:20×SSC5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml,10%SDS1ml,总体积20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA,使终浓度为4μl/ml。12.DEPCH2O:1000mlddH2O中加入DEPC1ml，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。二、操作步骤1.总RNA提取：见相关内容。2.变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPCH2O12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。3.样品制备：取总RNA4.5μl，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB1μl、上样缓冲液2μl。4.\n电泳：上样，50V电泳。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置。5.将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。将胶块切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。将一叠略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。\n6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。7.转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5min，以去除膜上残留的凝胶。8.将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。10.探针标记：取模板DNA25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。dNTPmix的制备:取dGTP1μl、dATP1μl、dTTP1μl混匀。将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：dNTPmix2.0μlBSA2.0μl5×buffer10.0μlKlenow酶1.0μlα-P-dCTP5.0μl32加入适量ddH2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。［)室温下反应1hr。11.预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3hr。12.杂交：将变性的探针加入到预杂交液中，42℃\n杂交16hr。13.洗膜：倾去杂交液。2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。14.压片：将膜用ddH2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影3～7天左右。三、注意事项1．操作时必须仔细、小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。2．必要时，可采用SephadesG-50柱层析法纯化标记的探针，以去除标记反应中未结合的核苷酸。3．膜的重复使用：结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下：杂交的膜置100℃0.5%SDS中煮沸3min，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。PCR产物的克隆PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoRV或SmaI切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃\n用DNA聚合酶I作用30min。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的VentDNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG8000，也只能很有限地提高效率。，加入等摩尔数PCR产物。②加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补足至10μl。⑶稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。⑷转染，蓝白斑筛选同前。二、注意事项1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。RNA操作中的一般要求在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。\n在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.\n设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。20μl、5MNaCl0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPCH2O至10ml。3.RNase消化液：5MNaCl120μl、1MTris-HCl20μl、0.5MEDTA20μl、RNaseA8μl、RNaseT11μl，加DEPCH2O至2ml二、操作步骤1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:T7启动子序列为：5’\n-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物ⅡT7启动子序列下游引物ⅠPCR先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR。探针合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂：RNasin0.5μlGACUPOOLGAC2μl?α-P?UTP2.5μl32DTT1μl5×转录buffer2μl模板1μlT7RNA聚合酶1μl混合后，短暂离心，37C保温1hr。［]O加入DNaseⅠ1μl,37C15min,然后75C10min以灭活DNAseⅠ和T7RNA聚合酶。O\nO加入：饱和酚50μl氯仿50μl酵母tRNA4μlDEPCH2O100μl室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20C静置30min。4C离心13500g×10min。弃上清OO液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4C离心13500g×2min,弃上清液。。OO2．杂交RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。取8μlRNA加入1-3μl探针于0.5ml离心管中。80C保温2min，然后40-45C下杂交12-18hr。OO3.消化杂交管于37C保温15min，加入RNase消化液，37C保温30min。OO加入10%SDS10μl、10μg/μl蛋白酶K20μl，混匀，37C保温10min。O加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M\nNaAc15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20C30min，4C离心,135000g×10min。OO弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影配制凝胶：40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺6.25ml5×TBE10ml尿素24g加H2O至50ml溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。预电泳以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50C。待胶板温度达50C时，暂停电泳，准备加样。OO加样将已溶解在加样缓冲液中的样品80C加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。。O\n电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70C曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。O三、注意事项1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。3、同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。4、RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。Southern杂交Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。［］其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern\n杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性的检测等。一、基因组DNA的制备二、基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg/μl为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA20μg10×酶切buffer4.0μl限制性内切酶5.0μl加ddH2O至500μl在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。消化后的DNA加入1/10体积的0.5MEDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿\n抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解。，实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围1.制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。2.电泳：电泳样品中加入6×Loading缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNAMarker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法。试剂准备１．变性液：0.5MNaOH；1.5MNaCl。２．中和液：1MTris-HCl；1.5MNaCl;３．转移液：NaCl175.3g;柠檬酸三钠82.2g，NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1000ml。操作步骤1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。\n2.中和:将凝胶转移到中和液15min。3．转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。4.转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80?C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。五、探针标记进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。2．在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling5×buffer10μldNTPmix\n2μlBSA2μl[?-P]dATP3μlKlenow酶5U3．将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混匀。1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0μl。三、操作步骤蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。转移：\n1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。：Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。3、1MTris-HCl：Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。4、10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶,浓盐酸调至pH7.2,定容至100ml。5、10?电泳缓冲液：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解,定容至100ml。6、10%过硫酸铵：1gAP加ddH2O至10ml。7、2?SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl2.5ml，?-巯基乙醇1.0ml，SDS0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml。8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O225ml。9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置聚丙烯酰胺凝胶的配制1、\n分离胶的配制:ddH2O4.0mlO30%储备胶3.3ml1.5MTris-HCl2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED10μl封底,余加TEMED4μl,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。［］2、积层胶的配制：ddH2O1.4ml30%储备胶0.33ml1MTris-HCl0.25ml10%SDS0.02ml10%AP0.02mlTEMED2μl将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。上样:取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。\n电泳:在电泳槽中加入1?电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。［］3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。表达蛋白的分离与纯化\n大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性，但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达，表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。一、可溶性产物的纯化试剂准备采用T7·TagAffinityPurificationKit1．T7·Tag抗体琼脂。2．B/W缓冲液：4.29mMNa2HPO4，1.47mMKH2PO4，2.7mMKCl，3.0.137mMNaCl，1%吐温-20，pH7.3。4.洗脱缓冲液:0.1M柠檬酸，pH2.2。5.中和缓冲液：2MTris，pH10.4。1.PEG20000。操作步骤1.100ml含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。2.重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心\n14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。3.将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。4.B/W缓冲液平衡后样品液过柱。5.10mlB/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。6.用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。7.将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。8.用PEG20000浓缩蛋白。注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。二、包涵体的纯化\n包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法进行重组蛋白质的纯化。试剂配制1．缓冲液A：50mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl。2．缓冲液B：50mMTris-HCl,1mMEDTA,100mMNaCl,1%NP-40。3．缓冲液Ⅰ：50mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,4M脲素。［)4．缓冲液Ⅱ：50MTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,3%TritonX-100。1．缓冲液Ⅲ：50mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,2M盐酸胍。5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100mMTris-HCl，2mMEDTA及脱氧胆酸钠。\n操作步骤1．用缓冲液A漂洗菌体细胞,离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g离心收集包涵体沉淀。4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。表达蛋白的生物学活性的检测一、MTT比色法检测细胞活性原理活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。试剂准备1、青链霉素溶液：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中,抽滤除菌。2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml100X青链霉素，5mlHEPES。3、\nMTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。4、SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。操作步骤1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节。2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。4、实验组分别加入纯化的表达蛋白，阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。5、37℃5%CO2培养48hr后，每孔加入10μlMTT，37℃5%CO2孵育4hr。6、加入100μl20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。二、DRG无血清培养检测促神经生长作用操作步骤：1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠DRG。2、镜下去除神经根和外膜，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔1个DRG。3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基，实验组加入纯化的表达蛋白，阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。4、37℃\n5%CO2培养，每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并进行测量，其数据作统计分析。二、注意事项1、MTT有毒，注意防护。2、单个DRG贴壁实验操作难度较大，需仔细耐心。放射性同位素标记的DNA序列测定分析测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。一、试剂准备１．硅化液：四氯化碳250ml，二氯二甲基硅烷25ml。２．6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE\n50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵50μl，TEMED50μl，轻摇混匀，立即灌胶。3.质粒DNA碱变性液：NaOH2M，NaAc3M，无水乙醇，70%乙醇。4.T7测序试剂盒。二、操作步骤1.测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。2.灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。夹好，将测序板放水平。聚合约3hr后预电泳。3.预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。设置温度50℃，功率100W，时间约30min。4.质粒DNA双链碱变性：DNA3-5μg溶于32μlddH2O中，加2NNaOH8μl，混匀，室温静置15min。加3MNaAc7μl，无水乙醇120μl，混匀，-20℃放置30min。离心12000g×15min，弃上清，70%乙醇500μl洗一次，离心12000g×7min。弃上清，晾干沉淀，10μl灭菌ddH2O溶解。[]5.模板与引物复性：加2μl测序引物、2μlAnnealing\nbuffer，混匀，稍稍离心，65℃温育5min，立即放置于37℃10min，室温5min以上。6.标记反应：加3μllabelingmixture、1μl相应放射性同位素、2μlT7测序酶，混匀，离心，置37℃5min。7.预先准备四个0.5ml微量离心管，标上A、C、G、T，分别在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。8.链终止反应：在A、C、G、T四个微量离心管中分别加入反应液4.5μl，37℃5min。加入stopsolution5μl，短暂离心。9.上样：关上预电泳电源，冲洗胶平面，将鲨鱼齿插入胶平面中约1-2mm形成加样孔。将四个反应管置80℃2min。立即取1.5-2μl加到加样孔上。10．电泳:50℃，100W，电泳2.5hr后，暂停电泳，在预留孔二次上样后，继续电泳2.5hr。11．下胶：停止电泳，取下测序板，倒掉电泳缓冲液。拆开测序板，凝胶应粘在未硅化的的玻璃板上。裁一张比胶稍大一些的滤纸，平铺在胶上，掀起滤纸，凝胶就被一起掀起。12．压片：将凝胶盖上保鲜膜，用monitor测读放射强度，以估计曝光时间。在暗室中覆上X光片，置暗夹中，-70℃放射自显影。13．洗片、读片：取出暗夹，回到室温。经D72显影、酸性定影液定影，水洗,晾干。在X光片灯上读出序列。三、注意事项1.\n测序板清洗、硅化的好坏直接影响灌胶及下胶。处理不好时容易导致灌胶时气泡的产生，下胶时则易使电泳胶损坏。2.灌胶时要避免胶的渗漏；注射器将凝胶灌到两块玻璃之间时，注意速度的控制，防止气泡的产生。3.测序反应及电泳上样时要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同时要加强整个后续实验过程中自身的防护。4.规范、妥善处理放射性同位素接触物品及废弃物。手工测序需要使用同位素，这给操作带来许多不便，对操作者也有一定的损害。DNA测序仪的出现解决了这一问题，它不使用同位素标记，自动化程度高，测序效果好。［）虽然DNA测序仪的价格目前仍比较高，但每次测序的花费并不算高，而且商品化服务也令人满意。聚合酶链反应一单链构象多态性分析聚合酶链反应-单链构象多态性分析是近年来发展起来的一种基因分析方法。\nPCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用γ-P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介3232绍同位素标记碱基掺入法。[）一、试剂准备⒈PCR相关试剂 \n⒉α-P-dCTP⒊30％聚丙烯酰胺：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g，溶于100mlddH2O中，4C保存。⒋10％过硫酸胺配制方法：1g过硫酸胺，溶于10mlddH2O中，4C保存。⒌TEMED⒍5×TBE缓冲液：Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA20ml，加ddH2O至1000ml。7．变性上样液：95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mMEDTA二、操作步骤⒈PCR扩增反应总体积为10μl，在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分：10×buffer1μldNTPmix70μMDNA模板100ng引物及TaqDNA酶依实验设计要求按比例加入α-P-dCTP0.1μl加ddH2O至10μl按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物。⒉聚丙烯酰胺凝胶电泳 \n⑴电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，晾干，95％乙醇擦拭，自然干燥。用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上，5～10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐，用固定夹夹紧两块玻璃，并用玻璃胶带封边。⑵制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气除气32OO32泡，加35μlTEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混匀。三、注意事项⒈核酸片段的大小:用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于⒉游离引物:游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。⒊低浓度变性剂:凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用2～3种条件做SSCP，可能提高敏感性。⒋电泳温度:\n一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。⒌凝胶的长度:可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。⒍凝胶浓度及厚度:凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。⒎假阴性:一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。O应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。\n聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由高温变性模板；引物与模板退火；引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：生成双链DNA中的特异序列作为探针；由少量mRNA生成cDNA文库；从cDNA中克隆某些基因；生成大量DNA以进行序列测定；突变的分析；染色体步移；RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。[）\n一、试剂准备1.DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCRBuffer4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×PCRbuffer5μldNTPmix4μl引物12μl引物22μlTaq酶1μlDNA模板1μl加ddH2O至50μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃\n长期保存。4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化PCR反应体系由反应缓冲液、脱氧核苷三磷酸底物、耐热DNA聚合酶、寡聚核苷酸引物、靶序列五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1．反应缓冲液：一般随TaqDNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mMKCl，10mMTris-HCl，1.5mMMgCl2。Mg的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg的浓度。据经验，一般以1.5-2mM较好。2．dNTP：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg结合，使游离的Mg浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg浓度。3．Taq\nDNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时，一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：⑴引物的长度以15-30bp为宜，一般的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4+2］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。⑵引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。⑷引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引2+2+2+2+2+2+2+\n物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。⑸引物一般用TE配制成较高浓度的母液，保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或10拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。四、注意事项１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。\n５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。4目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：目的DNA片段和载体的制备；目的DNA片段和载体的连接；连接产物的转化；重组子筛选。一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加ddH2O至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in高压灭菌20min。：15lbf/in高压灭菌20min，0℃冰浴备用。6．限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶。二、目的DNA片段和载体的制备\n选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端、不对称粘性末端、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。三、利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接连接要求和结果2222带有相同末端的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。[]因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸，可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子，补足ddH2O\n至8μl。3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。4．加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl，稍加离心，在适当温度连接8-14hr。四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备⑴保存于-70℃的DH5α用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现。⑵挑取单菌落，接种于2.0mlLB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜。⑶取0.5ml过夜培养液，接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。⑷将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1MMgCl225ml悬浮30min。2.不同厂家生产的T4DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液，其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。2.\n连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。3.制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15lbf/in高压灭菌20min。5.白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。2逆转录-聚合酶链反应逆转录-聚合酶链反应的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择1．Money鼠白血病病毒反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。2．禽成髓细胞瘤病毒反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。2+4．MMLV反转录酶的RNaseH突变体：商品名为SuperScript\n和SuperScriptⅡ。：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于PolyRNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。二、试剂准备1．RMA提取试剂2．第一链cDNA合成试剂盒3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4．TaqDNA聚合酶三、操作步骤1.总RNA的提取：见相关内容。2.cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis试剂盒为例。在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适量的DEPCH2O使总体积达11μl。在管中加10μMOligo12-18\n1μl，轻轻混匀、离心。70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。TM++-然后加入下列试剂的混合物：10×PCRbuffer2μl25mMMgCl22μl10mMdNTPmix1μl0.1MDTT2μl轻轻混匀，离心。［]42℃孵育2-5min。加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min。于70℃加热15min以终止反应。将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。3．PCR：取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2μl上游引物2μl下游引物2μldNTP4μl10×PCRbuffer5μlTaq酶1μl加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。\n设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。4．PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5．防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品。在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。\n细胞凋亡的分子生物学检测方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30﹪的染色体DNA在Ca和Mg依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译，使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。一、过氧化物酶标记测定法\n原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以2+2+掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶的抗地高辛抗体结合。：磷酸钠盐50mM，NaCl200mM。2、蛋白酶K：蛋白酶K0.02g；PBS100ml。3、含2%H2O2的PBS缓冲液：H2O22.0ml；PBS缓冲液98.0ml。4、TdT酶缓冲液：Trlzma碱3.63g用0.1NHCl调节pH至7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g。5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl，混匀，置于冰上备用。6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17.4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O1000ml7、0.05％二氨基联苯溶液：DAB5mg；PBS10ml，pH7.4,临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。8、0.5％甲基绿：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体实验步骤\n1、标本预处理：石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液，于室温水解15min，去除组织蛋白。［)用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5×10个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min。4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加54μlTdT酶反应液，置湿盒中于37C反应1hr。5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃\n保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。6、组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。7、用PBS洗4次，每次5min。8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。7原核表达将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。；一个多限制酶切位点接头；宿主体内自主复制的序列。\n原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。2、100mMIPTG：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。二、操作步骤获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物，PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、\n以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB中37℃过夜培养。2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0。3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀,70℃10min。5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。三、注意事项1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。原位杂交原位杂交组织化学简称原\n位杂交，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。[］根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展，更引起科技工作者的极大兴趣。一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。固定：目的是保持细胞结构；最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2MHCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton\nX-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K，还有链霉蛋白酶和胃蛋白酶等。35332杂交缓冲液孵育：杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。防止污染：由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。双链DNA探针和靶DNA的变性：杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交，双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。杂交液：杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。杂交液中含有较高浓度的Na可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA:RNA，RNA:DNA，DNA:DNA的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃\n。所以，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的。在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。探针的浓度：探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5-5.0μg/ml。最适宜的探针浓度要通过实验才能确定。探针的长度：一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。二、试剂准备1．0.1MPBS：Na2HPO4·12H2O61.6g、NaH2PO4·2H2O5.6g、NaCl9g，加ddH2O至2000ml，高压灭菌。+2．0.2MPB：Na2HPO4·12H2O61.6g、NaH2PO4·2H2O5.6g加ddH2O至1000ml，高压灭菌。0.2ml、5MNaCl1.2ml、0.5MEDTA0.04ml、0.1M二硫苏糖醇2ml、ddH2O2.21ml，总体积为10ml。无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。临用前加入50mg/ml变性鲑鱼精DNA75μl/ml。7．20×SSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加水至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，\n再用ddH2O定容至1000ml。8．抗体稀释液：TritonX-10080μl、BSA0.2g，以0.05MPBS定容至20ml。9．TSM1：1MTris-HCl10ml、5MNaCl2ml、1MMgCl21ml，加ddH2O100ml。TSM2：1MTris-HCl10ml、5MNaCl2ml、1MMgCl21ml，加ddH2O至100ml。显色液：5mlTSM2加显色液原液150μl，并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24μg/ml，避光。三、操作步骤取材、冰冻切片：将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注，再注入等量的4%多聚甲醛。。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡冲洗4-5次。将组织块入30%蔗糖/0.1MPBS液，1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。图2-7动物灌流探针制备与检测：1．随机引物制备cDNA核酸探针以DIGDNA标记检测试剂盒为例：探针制备：①模板DNA15μl，100℃变性10min，冰浴5min。②在冰浴中加：Hexanucleotidemix2μl,dNTPmix2μl,Klenow\nEnzyme1μl，反应总体积为20μl。37℃孵育过夜。③在上述20μl的标记产物中加4MLiCl2.5μl,75μl,轻轻混匀，-20℃放置2hr。4℃离心12000g×15min，弃上清。70%乙醇50μl洗涤，7500g×5min，弃上清，晾干沉淀,加TE50μl溶解沉淀，-20℃保存备用。探针敏感性检测：①样品稀释：取dig-标记探针1μl用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀释。②取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH2O中浸泡1min，6×SSC中浸泡10min，置点样器上，负压抽吸5min。[）③将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10min。④取下尼龙膜，置紫外灯下10cm处照射5min，晾干。⑤将膜置于适量预杂交液中，37℃预杂交10min。⑥加入Anti-dig抗体，37℃杂交30min。⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10min×2次。⑧显色：15mlTSM2中加300μl显色液，37℃避光显色30min。图2-8采用点样法检测随机引物法标记的dig-cDNA探针1．PCR法制备cDNA核酸探针：探针制备：以PCRDIGProbeSynthesisKit\n为例：在0.5ml离心管中，依次加入：PCR引物12μlPCR引物12μl质粒DNA模板2μlPCRDIGmix2μldNTPmix2μl10×PCRbuffer5μlTaq酶1μl加入适量ddH2O，使总体积达50μl。①将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。[]一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃45s→58℃45s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。②在上述PCR产物中加入4MLiCl12.5μl、预冷无水乙醇375μl，轻轻混合后置于-20℃2hr,12,000g×15min，弃上清。70%乙醇120μl洗涤沉淀，离心7500g×5min，弃上清，晾干沉淀,加TE50μl溶解,-20℃保存备用。探针检测：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量。21M原位杂交反应：1．0.1MPBS浸5-10min。2．0.1M甘氨酸/0.1MPBS浸5min。图注：1.\nDIG-NGF3．0.3%TritonX-100/0.1M2.NGF3.DNAMarkerPBS浸10-15min。4．0.1MPBS洗5min×3次，加蛋白酶K，37℃孵育30min。5．4%多聚甲醛浸5min。6．0.1MPBS洗5min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。7．预杂交：滴加适量预杂交液，42℃30min。1．杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液，覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。4℃孵育过夜。12．0.05MPBS洗15min×4次;TSM110min×2次;新鲜配制TSM210min×2次。13．显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。14．将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。15．显微镜下观察结果。图2-10NGFmRNA在小鼠颌下腺中的表达免疫组化和原位杂交双重染色1．免疫组化：将切片浸没于100ml甲醇溶液中，5min。0.01MPBS洗3min×3次，加入含0.25%TrionX-100的0.01M\nPBS，5min。0.01MPBS洗3min×3次，加入1%BSA包被液，37℃30min。0.01MPBS洗3min×3次，滴加适当稀释的一抗，4℃过夜。阴性对照组除不加一抗外，其余步骤相同。;1mMEDTA。7-92．TBS:25mMTris-HCl;200mMNaCl;5mMKCl。、酚/氯仿、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。⑶加20%SDS25?l，蛋白酶K25?l，混匀。⑷60?C水浴1-3hr。2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。⑵离心4000g×5min，去除上清液。⑶加10倍体积的裂解缓冲液。⑷50-55?C水浴1-2hr。\nDNA提取1.加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2.离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3.加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4.加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5.加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6.加1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7.待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。38.沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。［］9.室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100?lTE溶解过夜。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。\n大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况。通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为mRNA的基因组序列得到表达。揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。进行真核转染的一般程序：克隆目的基因－准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、试剂准备1、HBS：876mgNaCl溶于90mlddH2O，加入1MHepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml,pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。\n二、操作步骤克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。2、回收特异性扩增片段，连入T载体。3、转化DH5α，质粒制备。[)4、酶切初步鉴定，测序证实。真核重组表达载体的构建：pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收插入片段和pcDNA3线性片段T4连接酶连接转化DH5α质粒制备BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418\n分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿，每孔1-2ml培养基3×10细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。5典型贴壁细胞平板密度3、SHG-44细胞的转染：转染当天，加入脂质体/DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。[］准备不同比例的DOSPER/DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。①溶液A：用HBS稀释DNA各1.5μg到总体积50μl。②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl。③混合溶液A和B，轻柔混合，室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。不要移去培养基，逐滴加入100μl脂质体/DNA混合物，边加边轻摇培养板。37℃孵育6hr。6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。4、\nG418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。筛选结果鉴定：基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达。测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×10/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→10细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。44三、注意事项1、优化转染条件每种细胞和质粒均须进行。，10mMEDTA，1mMEDTA。1MTris-HCl1ml，0.5MEDTA0.2ml，加ddH2O至100ml。15lbf/in高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。5.苯酚/氯仿/异戊醇6.乙醇7.5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。15lbf/in高压湿热灭菌20min，4℃\n保存备用。8．溴化乙锭：10mg/ml9.RNaseA：不含DNA酶RNaseA的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。10.6×loadingbuffer：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖水溶液。11.1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液至终浓度0.5μg/ml，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中，即可上样。二、操作步骤1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mlLB液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜。2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽222可能流尽。，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解。5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K使SDS-蛋白复合物沉淀。6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g×\n10min。7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。9.沉淀溶于20μlTE，37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。取制备的质粒DNA1-2μl，加适当loadingbuffer混匀上样,采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。四、注意事项本裂解法小量制备质粒DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。\n+组织和细胞RNA的制备一、组织和细胞总RNA提取：异硫氰酸胍法试剂准备1．CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83%N-laurylsarcosine；0.2mMβ-巯基乙醇。25g、CSB缓冲液33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。3．2M乙酸钠：pH4.0。4．异丙醇5．无水乙醇、70%乙醇6．酚：氯仿：异戊醇7．DEPCH2O：100mlddH2O中，加入DEPC0.1ml，弃分振荡，37℃孵育过夜。15磅高压灭茵，4℃保存备用。操作步骤1．样品处理：培养细胞：收集细胞1-2×10，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心：500g×5min；PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2\nml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。组织：取1-2g组织置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。2．加2M乙酸钠0.2ml，混合后将溶液转移至5ml离心管中。3．加酚：氯仿：异戊醇2.2ml，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。4．4℃离心，12000g×20min。5．小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。6．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。77．4℃离心，12000g×15min。。9.加入等体积异丙醇，置-20℃30min。10.4℃离心，12000g×15min。11.弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。12.弃上清，将沉淀晾干。13.加入适量DEPCH2O溶液解RNA。注意事项：1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。TRIzol法TRIzolRNA提取试剂盒是由GIBCO\nBRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。试剂准备1．TRIzol试剂。2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇5．DEPCH2O操作步骤1．样品处理：培养细胞：收获细胞1-5×10，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。组织：取50-100mg组织置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。75．4℃离心，12000g×10min，弃上清。［)6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解。\n注意事项1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。二、总RNA定量RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA=40×OD260读数×稀释倍数/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。篇二:\n关于westernblot原理和常见故障分析-生物实验技术原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng中等大小的靶蛋白。一、抗原的选择和制备A：样品的制备1组织：组织的处理方法：组织洗涤后加进3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加进5×STOPbuffer，，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。加进β-ME，溴酚蓝煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。2：细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加进5×STOPbuffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。加进β-ME，溴酚蓝煮沸10min，分装后于-20℃\n保存，用时取出，直接溶解上样。3：分泌蛋白的提取：直接收集分泌液，加进β-ME、溴酚蓝制样。B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很正确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波优点有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除往干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃往上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂，结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和很多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要留意的是，加进福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加进到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立即搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。3.紫外吸收法：大多数蛋白质在280nm波优点有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。假如没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波优点有最大吸收。4.Bradford比色法：Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、往污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加进0.5mg/ml牛血清白蛋白，以0.15mmol/lNaCl补足至100μl，同时以两管100μl的0.15mmol/lNaCl作空缺对照。每管各加进1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并丈量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100μg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100μg另作一标准曲线进行测定。5．电泳估算法：样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。以提取癌组织总蛋白为例：①取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是往除样本中的血液。②每2克组织加进3ml1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。③加进5×STOPBuffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加进0.5mlβ-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；④\nSDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳A：实际操纵1.做胶前的预备1)检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立即重配。3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。2.制胶，电泳1）装好架子。2)按照下面配方配制分离胶。7.5％10％15%2×Sep.buffer44430％Gel.sol2.02.74ddH2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul0ul\n80ul在胶上面加进一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。3％2×Stacking.buffer1.730％Gel.sol0.35ddH2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插进预先预备好的梳子。4)待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。B：留意事项及常碰到的题目1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2。3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时轻易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。5）电泳中常出现的一些现象：︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。︵条带呈皱眉状，可能是由于装置分歧适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF，其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P和Immobilon-PSQ。A半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。由于电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。1实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小胶浓度转移时间80---1408%1.5-2.025---80101.515--4012\n0.75=膜>=胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）由于膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操纵中，膜也必须随时保持湿润。4）滤纸可以重复利用，上层滤纸内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为1.5小时，，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。1)在叠膜、胶、纸三明治时候，操纵于盛有转膜Buffer的大平皿中进行，叠好后，再将三者平行转移至转膜装置，切勿再移动，由于在buffer中操纵，已经完全排除了气泡存在的可能，无需再赶气泡2)关于转膜时间：半干转的话，20V×30min即可B湿法我们基本上不用此方法，这里暂不做先容。C转移后效果的鉴定1．染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。2．染膜有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-sred、FastgreenFC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。四、封闭封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有bovineserumalbumin，non-fatmilk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fatmilk。在转移结束前配好5%的Milk。转移结束后将膜放进milk中block，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。Block4°CO/N，或RT1小时。封闭后可以不洗膜，让膜的一角在吸水纸上接触，把封闭液控一下即可五、孵育一抗A.先将需要检测的抗体预备好，并决定好它们的稀释度。B.配好5%的Milk，按要求稀释好抗体。留意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。C.将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。留意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。六、洗涤用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins*5。洗涤是为了洗往一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。七、孵育二抗孵育RT1小时。一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低，否则轻易导致非特异性的结合。留意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD酶链的二抗或者标志其他探针的。八、洗涤用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins*5。洗涤是为了洗往二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。九、显色1．增强化学发光法Ecl显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺的分子结构及化学反应式如下：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP的作用下，发出荧光来。试验步骤：1）将两种显色底物1：1等体积混合。2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇摆使均匀。3）用保鲜膜把膜包起来，放进夹板中。4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。5）显影、定影。6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。留意：荧光在一段时间后会越来越弱。2.DAB显色DAB和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必须使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。对于AP标记的二抗我们选用BCIPandNBT显色，它们在碱性磷酸酶作用下反应可天生一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。Western显色ECL灵敏度比DAB高不少杂带多的原因无非是几点：1、你的一抗如是多克隆抗体，可以试着降低一抗的浓度，如一抗是单抗，可适当降低二抗的浓度2、还有最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少2小时室温封闭，时间答应可4度过夜封闭3、就是洗膜一定要充分我们一般PBST10分钟三次，还有看你是DAB显色吧，背景过深，DAB显色时间不要过长，一般2分钟足够。做一个好的阴性和阳性对照。这样出来的带该在哪个位置，不该在哪个位置一目了然十、分析结果及其判定常见题目原因分析及处理方法：见附录一、二。附录一：TroubleshootingBlottingProblems附录二：WesternBlottingTroubleshootingLogicTree附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液1)5xStopSolutionpH6.7:Stock:touse:20%Glycerol100mltakeGelsolution:0.8bis-acrylamide0.8g，29.2%acrylamide29.2gtotal100ml3)2xLaemmliSeparationBuffer:0.75MTris-HCl90.825g，0.2%SDS10ml20%SDS，total1000mlpH8.84)2xLaemmliStackingBuffer:0.25MTris15.14g，0.2%SDS1g，total500ml，pH6.8。5)10xLaemmliRunningBuffer:250mMTris60.55g，1.9MGlycine285.27g，1%SDS20gtotal2liters，pH8.36)TransferBuffer:48mMTrisbase5.81g，39mMGlycine2.93g，0.037%SDS0.375g20%MeOH200ml，total1000ml7)TBST:10mMTris-HCl，1.21g，100mMNaCl，0.2%Tween-20，Total1000ml，pH7.48)CoomassieStain:40%MeOH400ml，10%HAc100ml，0.1%BBR1gBrilliantBlueRtotal1000ml9)Destain:30%MeOH300ml，7.5%HAc75ml，total1000ml10)10×丽春红染液配方：丽春红2g，磺基水杨酸30，三氯醋酸30g，total100ml11）DABDAB50mg0.05mol/LTB100ml30%H2O230-40ul先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01％不显影不一定是抗原性丧失，Westernblot环节多，一抗和二抗原因是wb中比较难把握准的环节。\n