现代生物学进展 12页

王立安：电泳技术原理一、概述电泳：指带电胶粒或大分子在外加电场中，向着与其电荷相反的电极做定向移动的现（electrophoresisEP）。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所处介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。1808年 Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法（movingboundaryEP），将血清蛋白分为了5个组分，并于1948年荣获诺贝尔奖。20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年ShapiroAL等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。长期以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以期实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。目前，各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。1.电荷来源物质带电是一普遍现象。任何物质由于其自身的解离作用或表面上吸附其他带电质点均表现带电。两性电解质的带电与pI有关。如氨基酸、蛋白质、核酸。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。后来出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳，减少了扩散和对流等干扰作用。2.支持介质最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。3.电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。3.电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。电泳槽根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。(1)自由界面电泳槽Tiselius设计的自由界面电泳槽，是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。但90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。(2)管状电泳槽50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(discelectrophoresis)。(3)板状电泳槽板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slabelectrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm，厚度为1mm～2mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以，电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。附属设备随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、制胶板、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。4.影响电泳速度的外界因素待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度。强度越高，泳动越快。多用常压（100-500V，2-10V/cm）。溶液pH：要求恒定，所以用缓冲液作电极缓液，决定带电颗粒的解离程度；与pI有关。溶液的离子强度：缓液离子强度越高，电动势越小，颗粒泳动速度越慢；反之，则越快。最适值在0.02-0.2之间。电渗现象：液体在电场中，对一个固定支持物的相对移动。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。电渗现象是电泳的干扰因素，可选中性支持物克服。影响因素支持物：要求均匀、吸附力小，否则会造成电场强度不均匀，影响区带分离，结果重复性差。支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。温度：要求恒定。通过控制电压或电流、冷却散热解决。二、电泳分类1、按分离原理分为：区带电泳：电泳过程中，不同离子成分在均一的缓冲体系中分离成独立的区带，目前应用最广。移界电泳：Tiselius建立，在U形管中进行，目前已不用。等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动。等电聚焦：据不同pI的两性电解质在电场中，自动形成pH梯度，使被分离物按各自pI聚集成很窄的区带，分辨率较高。2、按有无固定支持物分类自由电泳，包括：显微电泳（细胞电泳），显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为；移界电泳；柱电泳（在层析柱中进行）自由流动幕电泳；等速电泳等。持物电泳，应用最多。无阻滞支持物，如滤纸、醋酸纤维薄膜、纤维素粉、淀粉、玻璃粉凝胶颗粒等。高密度凝胶，如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或琼脂糖凝胶。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳1、基本原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂（TEMED）和催化剂（AP）的作用下聚合、交联成三维网状结构的凝胶，以此胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。PAGE的历史1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“LastCheck”。聚丙烯酰胺凝胶的优点凝胶透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH制和温度变化较稳定。几乎无电渗作用，样品重复性好。样品不易扩散，且用量少，灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可调。分辨率高，尤其在不连续电泳体系中，即浓缩、分子筛和电荷效应为一体。应用广泛。可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量制备，还可测定分子量、pI等。\n连续与不连续凝胶电泳连续凝胶电泳：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应。不连续凝胶电泳：电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率都较前者佳，应用较广。2、不连续凝胶体系为了增加分辨率通常采用不连续凝胶体系，该体系是由浓缩胶、分离胶两部分组成。浓缩胶与分离胶由于有不同的凝胶浓度和缓冲液pH值，蛋白质样品在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此，当蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰条带，大大提高了分辨率。不连续凝胶体系中离子运动最广泛使用的不连续缓冲系统是由Ornstein和Davis（1964）设计的。样品和浓缩胶中含Tris-HCl(pH6.8)，上下槽缓液为Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-HCl(pH8.8)，系统所有组分中都含0.1%SDS。样品和和浓缩胶中的Cl-形成移动界面的先导界面，甘氨酸组成尾随界面，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前积聚。此处pH较高，甘氨酸被离子化后穿过被堆集的蛋白质并紧随Cl-之后，沿分离胶移动。从移动界面解脱后的蛋白质-SDS复合物形成一电位和pH均匀的区带涌动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小分开。3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质样品中加入SDS和巯基乙醇后，蛋白质分子在巯基乙醇的作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物，他们在水溶液中呈长椭圆棒状，短轴基本一致，但长轴随蛋白质分子量成正比的改变。因此蛋白质在电场中的移动主要取决于蛋白质分子量的大小，不在受蛋白质原有电荷和形状本身的等电点（带电荷）无关。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此，该方法用于分子量测定时，电泳结果显示的只是亚基或单个肽链的分子量。利用SDS-PAGE测蛋白分子量根据已知分子量的蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。优点：仪器设备简单，操作方便、样品用量少，耗时少（仅需1天），分辨率高，重复性好等。不足处：对电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白（如糖蛋白）及一些结构蛋白等测定结果不太可靠。常用的是连续SDS-PAGE，近几年趋向用不连续SDS-PAGE，其分辨率比连续SDS-PAGE高出1.5-2倍。SDS-PAGA常用试剂10%SDS，蛋白变性；消除颗粒电颗，使其统一带负电。丙稀酰胺Acr和甲叉双丙稀酰胺Bis（29：1）。注意：Arc和Bis有神经毒性并易于吸附皮肤。10%过硫酸铵（AP）（聚合的引发剂），提供甲叉双丙稀酰胺和丙稀酰胺聚合时所需的自由基，须现用现配。四甲基乙二胺（TEMED）是加速剂，通过催化AP形成自由基而加快甲叉双丙稀酰胺和丙稀酰胺聚合的速度。电极缓冲液:（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000mL。样品溶解液：50mMTris-HCl(pH6.8）；2%SDS，5%巯基乙醇,10%甘油，0.1%溴酚蓝。（样品缓冲液中的甘油可使样品溶液的密度变大，避免加样后样品上漂；2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂，并不再形成新的二硫键，溴酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置）。样品缓冲液中的甘油可使样品溶液的密度变大，避免加样后样品上漂；2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂，并不再形成新的二硫键，溴酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置。分离胶缓冲液：1.5MTris-HCl，严格调pH至8.8；Tris18.15g加水溶解，用6NHCl调pH，定容至100ml。缩胶缓冲液：0.5MTris-HCl，严格调pH至6.8；Tris1.5g加水溶解，用6NHCl调pH，定容至25ml。低分子量标准蛋白试剂盒（17500~94000），每种蛋白含量40μg，用时加入200μL样品溶解液，经处理后，上样10μL。染色液：0.1%CBB-R250，40%甲醇，10%冰乙酸。染色1小时或过夜。脱色液：10%冰乙酸，10%甲醇。脱色需3-10小时。凝胶选择操作步骤第一步：倒制胶板首先选择凝胶的浓度，高浓度凝胶的孔径较小对于小分子量的蛋白质有较高的分辨率，相反低浓度的凝胶对于大分子量的蛋白质有较高的分辨率。将两玻璃板密封好，将冰箱中贮存液取出，平衡到常温后，按上表比例混合，制备分离胶、浓缩胶(充分混匀)，加入聚合剂(10%过硫酸胺)及促聚剂(TEMED)轻搅混匀。倒入密封好的玻璃板间隙中（如果采用倒胶槽，可将胶液直接倒入倒胶槽）用少量正丁醇或水覆盖液面，以隔绝空气，并产生整齐的上液面（注意：由于丙稀酰胺是神经毒，在制胶过程中需要戴手套，凝胶聚合后则不再有毒性）。胶液的聚合大约需要半小时，随后倒掉胶板上沿的液体并加入配置好的浓缩胶溶液，插入梳子，聚合后移去梳子。操作步骤2）加样与电泳将制胶板中的密封胶条除去，装入电泳槽，在正负极水槽中加入电极缓冲液，将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空，装好电泳槽，接好电源，开始电泳。施加在每块胶板上的电流强度应该在30mA左右。第二步：样品处理与加样待测样品一般需10mg以上，太稀应予浓缩，含盐量高应先透析，有沉淀应先离心除去。将待测样品与4倍体积的样品缓冲液于塑料管中混匀，加热至沸保持4分钟，然后取出置冰水中冷却待用，用不完可冷冻贮存备用。标准液处理与待测液相同。加样一般加样体积为10-15微升（2-10μg蛋白）样品槽内不能有气泡。用移液器尽可能将样品送至底部，缓慢打出。第三步：通电电泳将电泳槽中倒入电极缓液，连接电泳仪与电泳槽。上槽接负极，下槽接正极。加样后，连接稳压电源，恒定电压。开始的电压为8V/cm，当染料前沿进入分离胶后，把电压提到15V/cm，当溴酚蓝前沿接近凝胶下沿，断开电源，停止电泳。第四步：染色与脱色电泳结束后，分离玻璃板，取出凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考马斯亮蓝中振荡染色约1h，再转入脱色液中脱色。脱色过程中需要更换3～4次脱色液（如果在脱色液中加入海绵和泡沫碎片以吸附染液中的考马氏亮蓝，可加快脱色速度并且可不必更换脱色液）。经染色、脱色后可得到条带清晰的凝胶，在有图象记录和分析的条件下，可用凝胶成像系统对凝胶进行数字化。成像、储存及定量分析。结果与讨论1）制胶与实验结果重复性的关系：由于每次制胶时试剂量的加入量有误差，可通过采用一次配制多块胶板的方法来提高实验的重复性。2）样品分子量与凝胶浓度的关系：目标蛋白质的分子量较大时，应采用浓度较低的凝胶，以获得较高的分辨率；反之，对分子量较小的蛋白质，应采用浓度较高的凝胶。3）凝胶聚合时间长短与凝胶质量的关系：凝胶的聚合应该在30～60min内完成，聚合太快凝胶不均匀，太慢则浪费时间。聚合的快慢可通过增减TEMED（四甲基乙二胺）的加入量来改变。4）电泳的快慢与电流之间强弱的关系：电流强时电泳速度加快，但产热较多影响奋力效果；电流过低时产热虽少，但对蛋白质泳动不利。常用的电流强度应该是每块胶板30mA左右。绘制标准曲线相对迁移率rf=蛋白样品距加样端的迁移距离（cm）/溴酚蓝区带中心距加样端的距离（cm）以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，标准蛋白的分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上得到一条标准曲线。根据未知蛋白样品的相对迁移率可直接在标准曲线查出分子量。4、蛋白质染色液氨基黑10B，酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。对SDS-PAGE效果不好。CBBR250，染色灵敏度比氨基黑高5倍，靠范德瓦尔力与蛋白质结合。尤其适合SDS-PAGE微量蛋白染色。CBBG250，比R250多两个甲基，灵敏度不如R250，但比氨基黑高5倍。染色稳定，适合定量。固绿（FastgreenFG），灵敏度近似氨基黑，但脱色时不易和蛋白质分离，克服了CBB脱色时的缺点。荧光染料，常用有丹磺酰氯、荧光胺、MDPF、ANS等。可与蛋白质末端氨基结合，荧光标记。银染，（AgNO3）较CBB灵敏100倍，染色机理不详。蛋白染染料用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。选择高吸光系数的染料，与生物大分子紧密结合，形成有色不溶的复合物，而支持介质不吸附染料，便于背景的脱色，有利于蛋白质条带的辨别和定量扫描，从而检测出蛋白质的纯度、含量及生物活性。可用于蛋白质电泳条带的染色方法很多，常用的主要有以下几种：氨基黑类染色：蛋白质染色最早是用氨基黑类染料，是一类含有磺酸基的酸性染料，它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合盐。常用的有：氨基黑10B(aminoblack10B)，萘黑12B200(naphthaleneblack12B200)，萘酚篮黑6B(naphthol6B)，水牛黑(buffaloblack)等。这类染料对不同的蛋白质着色不同，有蓝色、棕色、黑色，借此可以鉴别不同类型的蛋白质。这类染料对不同的蛋白质结合量不同，染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低，现在这类染料已很少应用，被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue，简称CBB)在蛋白质染色中，目前考马斯亮蓝染色法最为常用，1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色，它步骤简便、灵敏度较高，可进行定量扫描。它可分为R和G型两类：R型为三苯基甲烷(triphenylmethane)，每个分子含有两个SO3H基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料—蛋白质复合物。G型为二甲花青亮蓝(xylenecyaninebrilliantblue)，是一种甲基取代的三苯基甲烷。考马考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15-20mg），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250，其优点是在三氯乙酸中以胶体形式存在，能选择性地和蛋白质形成复合物，染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来，约45分钟后着色最深，本底低，重复性好，适用于定量分析。\n荧光染料：是一种在电泳前用荧光分子将蛋白质共价偶联标记，于电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法，但由于荧光标记蛋白质的定量需要特殊的扫描装置，影响了此方法的广泛应用。研究工作中使用的荧光染料有以下几种：(1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰，dansylchloride，简称DNS-Cl)：是最早应用的荧光染料，它在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，使它们获得荧光性质，在280nm和320nm波长的紫外灯下可观察到电泳条带。(2)荧光胺(fluorescamine，又称fluram)：作用与丹磺酰氯相似。在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，产生荧光。其优点是由于自身及分解产物均不显示荧光，标记的蛋白质是唯一的荧光物质，因此，凝胶没有荧光背景。(3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮[2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone，简称MDPF]：其作用与丹磺酰氯和荧光胺相似，其优点是凝胶上MDPF标记蛋白质的荧光可保持数月。用MDPF标记时，荧光强度在蛋白质浓度1—500ng范围内呈线性关系，标记蛋白做SDS-PAGE分析时，其相对分子质量的对数(log10)与相对迁移率之间呈线性关系。(4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonicacid，简称ANS)：染料本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光下可显出黄绿色荧光。电泳后将凝胶置于此染料溶液中，1—3分钟后在长波紫外光下即可观察到荧光蛋白条带。硝酸银染色：目前染色机理尚不清楚，可能是将结合在蛋白质上的银离子还原成金属银而显色，研究表明蛋白质上碱性和含硫氨基酸在银染中的重要性，染色灵敏度是考马斯亮蓝R-250的100倍左右，可以检测0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。银染显色的方法大致可以分化学显色和光显色两类。(1)化学显色法(chemicaldevelopment)：又分为双胺银染法(diaminesilverstains)和非双胺银染法(non-diaminesilverstains)。双胺法：是用碱性的NH4OH形成银—双胺复合物，固定后的凝胶浸泡在此溶液中，通过酸化（通常用柠檬酸）显像，使用较广泛。非双胺法：是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中，银离子与蛋白质发生作用，在碱性条件下，用甲醛将银离子还原为金属银而显像，用酸性溶液（柠檬酸或醋酸）终止显色反应，用碳酸钠处理凝胶可进一步增强银染色的强度。非双胺法的灵敏度较双胺法高10倍。特殊蛋白质染色:(1)糖蛋白染色：糖蛋白可以通过对蛋白或碳水化合物的染色来检测。如与糖链的反应，用过碘酸-Schiff试剂(periodic-Schiff’sreagent)染色，简称PAS染色，显色结果在543nm处可观测到颜色。检测灵敏度，最高可以达到40ng糖蛋白。(2)脂蛋白染色：脂蛋白可以用常规的染色方法，苏丹黑B(sudanblack)是常用的染料，银染法仍然是最灵敏的方法。近年有报道一种双染色方法，先用一种发荧光的染料Filipin使脂蛋白染色，再用考马斯亮蓝使其它蛋白染色，这样就可以在一块凝胶上同时检测出脂蛋白和其它蛋白，灵敏度高，可检测低至20ng低密度脂蛋白。(3)铁蛋白染色：血红蛋白、转铁蛋白和其它含铁蛋白能用多种方法检测，如普鲁士蓝(prussianblue)显色，它与蛋白质分子中的铁离子结合，方法十分简便。(4)铜蛋白染色：可用茜素蓝S(alizalinS)显色，它与蛋白质分子中的铜离子结合，蛋白条带为蓝色。四、转移电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要功能是将混合的蛋白质样品分离成可观察的条带，但如果需要用特定抗体在凝胶中寻找特异的蛋白质条带或需要切割下某一条带进行氨基酸序列分析，在凝胶上操作就极为不方便，这时就需要将所有蛋白质转移或印记到硝酸纤维素膜上，这一过程叫做蛋白质转移电泳，也叫做蛋白质印记。在电场作用下，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，在转移膜的表面沉积下来，转移到膜上的蛋白质条带的分布形式与原来的凝胶中的蛋白质分布形式完全一样。试剂和仪器转移电泳槽、转移缓冲液。转移电泳分槽式和半干式两种，由于半干式转移有方便、快速和费用低等特点逐渐成为人们主要选择的方法。结果和讨论转移效果评价在采用免疫印记的方法识别特定蛋白质前，可直接将转移膜染色来观察转移的结果，评定转移电泳实验是否成功，试看是否能够将凝胶中的大部分蛋白质转移到膜上。可以在SDS-PAGE电泳时加入预先染色的蛋白质分子量标准品（也叫Marker），这样在电泳后可以直接比较凝胶中和转移膜中的蛋白质标准品条带，观察凝胶中的标准品条带是否已经消失，膜上的标准品是否明显。如果没有预染的蛋白质标准品。可以将转移后的凝胶染色，通过观察凝胶中蛋白质的残留量来判断转移数率。由于大分子蛋白质的转移需要较长的时间，当蛋白质样品中含有较多的大分子量蛋白质时，应该适当延长转移的时间。五、琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳对于分离生物大分子具有较高的分辨率，但由于核酸分子比蛋白质分子大得多，只能采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以核酸带有负电荷，在电场中会向正极移动。用琼脂糖凝胶做支持物的电泳，常用于核酸的分离、鉴定。琼脂糖琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。琼脂糖凝胶电泳的优点操作简单，速度快，样品不需事先处理。含水量大，近似自由电泳，对样品无吸附琼脂糖本身无紫外吸收性，用UV检测。电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。试剂和仪器水平电泳槽、电泳仪溴化乙锭是荧光染料与核酸结合后在紫外线照射下可产生橙红色荧光，由于溴化乙锭有潜在的致癌性（诱变剂），操作时需要戴手套。贮存液为1mg/mL,使用浓度为0.5μg/mL。目前，已有多种代替EB的染色剂，如：GelRed和GelGreen等。电泳缓冲液，常用的为TAE(50×)、TBE(5×),使用时均为1×。TAE缓冲能力不如TBE，但TBE贮存时间长后会出现沉淀。操作方法含有琼脂糖的缓冲液经微波炉加热后被溶解，倒入制胶系统中，插入梳子，琼脂糖凝固后，拔掉梳子，将塑料托盘放入电泳槽，加入缓冲液，经加样后即可接通电源进行电泳。注意事项1）设置电泳参数时不要超过其能达到的额定值。2）电泳时电源线正负极不要插反（黑色线对应黑色插口，红色线对应红色插口）。3）电泳槽放置时一定要电源线的一面朝上放置，以免向下放置时折断电源线。4）电泳仪可以同时接四个电泳槽，如同时接多个电泳槽，应同时接上开始电泳。结果和讨论由于通常在凝胶缓冲液中加入了荧光物质溴化乙锭，荧光在254nm波长的紫外光照射下产生红色荧光，可在紫外光下照相，或者采用图像记录系统储存试验结果。琼脂糖凝胶电泳的制胶过程比聚丙烯酰胺凝胶电泳要简单得多。琼脂糖浓度得选择与聚丙烯酰胺凝胶电泳类似，即在分离分子量较大的核酸时，应选用较小的琼脂糖浓度；反之，则选用较大的琼脂糖浓度。琼脂糖凝胶的特性（1）琼脂糖凝胶属于大孔胶，电泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种大孔特性有利于免疫固定、免疫电泳和微量制备。琼脂糖形成凝胶后孔径的大小取决于琼脂糖百分浓度，(2)具有稳定的物理化学性质，对样品吸附极小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；(3)具有较高的机械强度，允许在1%或更低的浓度下使用，且在这种浓度下仍然有筛分和抗对流作用；(4)琼脂糖无毒，具有热可逆性，胶凝过程不需催化剂，制备简单、快速。低胶凝温度及低熔点的琼脂糖有利于样品回收，达到样品制备的目的；(5)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，染色、脱色程序简单快速；琼脂糖凝胶的主要性能指标：(1)电内渗(electroendosmosis，简称EEO)：是琼脂糖电泳中由多糖骨架上的带电基团引起，主要是硫酸酯和丙酮酸盐，这些阴离子基团被固定在介质中，相应的阳离子与其结合水一起向阴极移动（图3-6），电内渗对DNA的分离没有显著影响，但高电内渗时对大分子的迁移有一定阻碍作用，电泳耗时较长。(2)胶凝温度：将琼脂糖在溶液中加热至90℃溶解，然后将温度下降至某一温度时由液态转变为固态，此温度即为凝固点，称为胶凝温度。一般在35℃—43℃。3)熔化温度：将凝固的凝胶由固态转变为液态时的温度即熔化点，称为熔化温度。一般在75—90℃。用于制备目的时，采用低熔点琼脂糖，熔化温度需低于30℃。(4)凝胶强度：定义为每平方厘米凝胶所能承受的重量(g/cm2)，凝胶强度与凝胶浓度成正比。凝胶强度越高，所能允许使用的凝胶浓度越小。在电泳中通常使用1%的琼脂糖凝胶。尿素和碘化钾等阻碍氢键形成的试剂也会降低凝胶强度，使凝胶变软易碎，给操作带来困难。(5)脱水收缩作用：是指琼脂糖凝胶中挤压出液体的现象，使用时要用滤纸吸干凝胶表面的水。琼脂糖凝胶电泳在核酸研究中的应用：由于琼脂糖凝胶孔径相当大，对大多数蛋白质来说，其分子筛效应微不足道。以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳已广泛应用于核酸研究中，为DNA分子及其片段的相对分子质量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。琼脂糖对DNA的分离范围较广，用不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。新型凝胶介质虽然聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是目前最常用的两种支持介质，但是它们还存在一定的局限性，如聚丙烯酰胺凝胶聚焦的重复性较差，琼脂糖凝胶容易断裂等。近年来人们正在寻求新型的电泳材料。第一类：丙烯酰胺单体替代物如poly-N-acryloyl-tris(NAT)、N-acryloylsugars、N-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE)等。这类N-取代聚丙烯酰胺材料具有以下优点：具有较强的水解稳定性，在较广的pH范围内稳定，能在pH2-13环境中进行电泳，适合作为酸碱性pH范围等电聚焦的支持介质；具有高度的亲水性和大孔性，适合大相对分子质量物质的分离；凝胶的机械强度高。第二类：聚丙烯酰胺—琼脂糖混合物\n(Polyacrylamide-agarosemixture)、聚丙烯酰胺—琼脂糖的衍生物混合物(polyacrylamide-allylglycidylmixture)，这类电泳支持介质具有以下优点：具有聚丙烯酰胺分辨率高和琼脂糖大孔径的优点，机械强度高，又具有良好的弹性，适合分离特大分子(2500kD)，可用于病毒、SDS变性分子和高相对分子质量的脂蛋白第三类：“电泳海绵”，是一些海绵状的支持介质材料，还处于试验阶段，但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点：机械强度大，结构稳定，可以是亲水的也可是疏水的；可以直接测量孔径，孔径范围在nm—100μm。六、醋酸纤维薄膜和纸上电泳比较醋酸纤维薄膜与滤纸相比较，有以下优点：⑴醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性。⑵　快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中容纳的缓冲溶液较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短。⑶　灵敏度高，样品用量少。⑷　应用面广。某些蛋白在纸上电泳不宜分离，如胰岛素等但用醋酸纤维薄膜能较好地分离。⑸醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰醋酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。七、等电聚焦电泳在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体，当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH值区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。此技术已广泛应用于等电点测定、纯度分析，以及制备电泳纯样品等，但对在等电点时发生沉淀或变性的样品不合适。八、双向电泳当我们需要将大量不同的蛋白质分离成单一成分时，普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳难以达到这一目标，这时就需要采用等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的双向电泳方式，将所有蛋白质完全分开。对蛋白质分子进行等电聚焦电泳时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH值位置上，使具有不同等电点的蛋白质分子得以分离。蛋白质的经等电聚焦凝胶电泳后，再进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使蛋白质分子进一步按分子量的不同进行分离，所以大大提高了分离效果。双向电泳的分类非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。非变性/还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。变性2D-PAGE：样品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃变性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式。双线电泳结果——凝胶的图像处理分析和典型流程典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：双向电泳的应用将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。九、毛细管电泳毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE),是近年来发展最快的分析方法之一。主要理论依据是在高电场强度下，毛细管（内径50~100μm）中的待测物质，可按其分子质量、电荷、淌度等因子的差异得到有效分离。与常规电泳比，具有测试速度快、近样量少、应用范围广、自动化程度高等优点。发展状况1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75内径毛细管柱内用高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦,Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内,由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,得到了迅速的发展。CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。CE和高效液相色谱法(HPLC)相比其相同处在于都是高效分离技术,仪器操作均可自动化,且二者均有多种不同分离模式。差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间,CE的分析时间通常不超过30min,比HPLC速度快；对CE而言,从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比,对扩散系数小的生物大分子而言,其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级,最低可达270fl,流动相用量也只需几毫升,而HPLC所需样品为μl级,流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备,而HPLC可作常量制备。CE和普通电泳相比,由于其采用高电场,因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外,其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度,常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol；高分辨率,其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万,而HPLC一般为几千到几万；高速度,最快可在60s内完成,在250s内分离10种蛋白质,1.7min分离19种阳离子,3min内分离30种阴离子；样品少,只需nl(10-9L)级的进样量；成本低,只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力,使CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然CE还是一种正在发展中的技术,有些理论研究和实际应用正在进行与开发。CE电泳装置特点“CE”统指以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。（见图16毛细管电泳仪器示意图）。其仪器结构包括一个高压电源,一根毛细管,一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。CE所用的石英毛细管柱,在pH>3情况下,其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下,双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和,正离子的运动方向和电渗流一致,故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反,但因电渗流速度一般都大于电泳流速度,故它将在中性粒子之后流出,从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。刘敬兰：气相色谱技术主要内容Ⅰ.色谱法概论（IntroductionofChromatography）1903年俄国植物学家茨维特(Tswett）首先提出的。玻璃柱----称为色谱柱装有CaCO3----称为固定相分离植物色素的石油醚提取液，用纯石油醚进行淋洗--称为流动相。结果分离得三种颜色的六条色带。每个色带为不同的色素组成。他把这种色带称为“色谱”（Chromatography)Ⅰ.色谱法概论色谱法不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质。“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。并出现种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。色谱法共同的基本特点是：具备两个相。不动的一相，称为固定相；携带样品流过固定相的流动体，称为流动相。二、色谱法的特点Ⅱ.色谱法原理色谱法实质上是一种物理化学分离分析方法，又称为色层法或层析法。一.基本原理：利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数或吸附能力及其亲和作用性能的差异为分离依据，使分配系数只有微小差异的组分产生差速行移，从而得到分离。气（液）-固色谱—吸附色谱气（液）-液色谱—分配色谱二、色谱流出曲线和基本概念（一）.色谱流出曲线和色谱峰1.、分配系数和容量因子1.分配系数K：在一定温度下组分在两相之间分配达平衡时的浓度比称为分配系数。有关分配系数K的几点说明⑴.一定温度下，分配系数K越大，出峰越慢；⑵.提高温度，出峰时间变短；⑶.某组分的K=0,即不被固定相保留，最先流出；⑷.某组分在不同固定相上的分配系数K不同；⑸.试样中不同组分在相同分离条件下，具有不同的K值，这是决定混合物能否分离的基础。因此，分配系数是色谱分离的依据。2.容量因子（亦称分配比或容量比）k一定温度、压力下，两相间达到分配平衡时，组分在两相中的质量比。（三）、色谱柱的分离度R(又称分辨率)表示色谱柱在一定的色谱条件下对混合物综合分离能力的指标。不同分离度时色谱峰分离的程度（四）、色谱流出曲线所提供的信息⑴色谱峰的个数----样品中所含组分的最小个数⑵根据保留值可以定性分析;⑶根据峰面积A或峰高h可以进行定量分析;⑷根据峰的位置及其宽度可以对色谱柱进行评价。Ⅲ、色谱分离基本理论一、塔板理论—柱效能指标最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。塔板理论假定：（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。（ii\n）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。为简单起见，设色谱柱由5块塔板（n＝5）组成，并以r表示塔板编号，r=0,1，2…，n－l；某组分的分配比k=1.塔板理论由塔板理论还可导出理论塔板数n（柱效）与色谱峰半峰宽（Y1/2）或峰底宽（Y）的关系塔板理论从上两式可以看出，Y越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。由于死时间tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,有时计算的n值尽管大,H很小,可实际柱效能相差甚远.所以,提出把tm扣除。塔板理论的贡献：1.用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程；2.成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置；3.提出了计算和评价柱效的参数（H，Heff，n和neff）。塔板理论的缺点：1.不能解释造成谱带扩张的原因；2.不能说明为什么在不同流速下可测得不同的理论塔板数；3.无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。这就限制了它的应用。•二、速率理论（影响柱效能的因素）1956年荷兰学者vanDeemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。vanDeemter方程的数学简化式为1．涡流扩散项A在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散，如图右所示。A＝2λdp1．涡流扩散项A上式表明：⑴.A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。⑵.为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。⑶.对于空心毛细管柱，不存在涡流扩散。A＝0。2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为：B＝2γDgγ—弯曲因子；Dg—组分在气相中的扩散系数。2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。3．传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即：C＝Cg＋Cl气相传质阻力：与填充物粒度的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。液相传质阻力：组分在液相的扩散系数越大；液膜厚度df越薄，液相传质阻力越小，柱效越高。推导得出气-液色谱速率板高方程：它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。各种因素相互制约，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。•LC和GC的H－u关系图•Ⅳ.气相色谱仪气相色谱仪由五部分组成：⑴.气路系统：气体发生器及钢瓶，（H2、N2、He等)纯度99.99%以上。（是GC的血液部分）。⑵.进样系统：微量注射器、进样口（是GC的手和嘴）⑶.分离系统:柱温箱及色谱柱。（是GC的心脏部分）。⑷.检测系统：TCD,FID,ECD,FPD（是GC的眼睛）。⑸.数据处理系统（色谱数据工作站）（是GC的大脑）。⑴填充柱材质--不锈钢或玻璃，内径--2～4mm，长1～3m。形状--U型和螺旋型用于一般的色谱分析，柱容量大，分离效率低。理论塔板数n≈103。⑵毛细管柱(又称开管柱）类型：壁涂柱（WCOT)、多孔层柱（PLOT)、涂载体柱（SCOT)和化学键合相及交联毛细管柱。内径--0.l～0.5mm，材料--不锈钢，玻璃或石英。长度--几十米甚至百米。理论塔板数--106特点--分析速度块、样品用量小。柱容量低。因此，毛细管柱气相色谱在进样时需要采用分流进样技术。用于复杂样品的分析。气相色谱毛细柱⑶气相色谱固定相常见色谱担体（载体）红色：有6201，201，301。表面空穴密集，孔径小，表面积大。分离效率高。白色：有101，102，101硅烷化，102硅烷化。表面孔隙大，但吸附性小，用于分离极性物质。两者的表面结构不同。为了提高柱效，硅藻土型担体可经过钝化的方法处理：酸洗、碱洗和硅烷化。硅藻土的显微图象—色谱柱炉、气化室、检测器5.检测和数据处理系统把组分按时间及其浓度或质量的变化，转化成易于测量的电信号，经过必要的放大，传递给记录仪或计算机，最后得到该混合样品的色谱流出曲线及定性和定量信息。检测器：两类浓度型检测器（如：热导池检测器TCD和电子捕获检测器ECD）；质量型检测器（如：氢火焰离子化检测器FID和火焰光度检测器FPD）。常用气相色谱检测器1.热导池检测器（TCD-浓度型)：通用型检测器。是利用组分蒸气与载气导热系数不同来测定各组分的含量。Ⅴ、高效液相色谱仪（HPLC）四个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统检测系统。还有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。Ⅴ、高效液相色谱仪高效液相色谱仪工作流程如下高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，再从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，组分依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。1.高压输液系统高压输液泵的吸液冲程双柱塞并联输出泵进样系统液相色谱进样阀分离系统——色谱柱一般柱长5～30cm，内径为4～5mm；凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。4.检测系统a.紫外检测器(UV-DETECTOR)b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）d.荧光检测器（fluorescencedetector）附属系统包括：⑴脱气装置⑵梯度淋洗装置⑶恒温装置⑷自动进样装置⑸馏分收集以及数据处理等装置。梯度淋洗装置—固定相流动相A.对流动相溶剂的要求是：1、对待测样品要有适宜的溶解度，否则在柱头易产生沉淀。2、溶剂要与检测器匹配。紫外检测器，应选用在检测器波长范围内没有紫外吸收的溶剂。示差折光检测器，选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。B.流动相类别Ⅵ.高效液相色谱法分类分析型液相色谱得到数据-定性及定量分析高灵敏度的要求样品量的要求精度及准确度的要求容易使用制备型液相色谱得到纯品-分离及纯化化合物的稳定性制备量的要求纯度的要求及纯度的鉴定方法的安全性Ⅶ.高效液相色谱法分类Ⅶ.色谱分离类型的选择1．根据相对分子质量选择相对分子质量低的，挥发性好的样品——适用于气相色谱。标准液相色谱最适合的相对分子质量范围是20O～2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。2．根据溶解度选择样品可溶于水属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸附色谱。样品溶解于四氯化碳，则采用常规的分配和吸附色谱分离；样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。Ⅸ.色谱定性分析气相色谱分析对象：在气化室温度下能成为气态的（bp≤350℃）物质。约有20％的有机化合物。大多数物质不能直接用气相色谱法分析。高效液相色谱法应用范围：适宜分离分析高沸点、热稳定性差、有生理活性以及相对分子质量大的物质，已应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物药物等的分析中，目前在生命科学中又显示出突出地位。色谱法定性分析主要依据保留值，所以需要标准样品。色谱法定性有以下几种方法：色谱定性分析方法1.用已知纯物质对照定性这是气相色谱定性分析中最方便，最可靠的方法。\n这个方法基于在一定操作条件下，各组分的保留时间是一定值的原理。2、加入已知物峰高增高法如果未知样品较复杂，可采用在未知混合物中加入已知物，通过未知物中哪个峰增大，来确定未知物中成分。4.根据保留指数定性保留指数I，是一种重现性较其他保留数据都好的定性参数，可根据所用固定相和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。4.根据保留指数定性对于复杂样品的分析，利用双柱或多柱法更有效可靠，原来一根柱子上可能出现相同保留值的两种组分，在另一柱上就有可能出现不同的保留值。Ⅹ.色谱定量分析根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的峰面积A或峰高h，计算样品中溶质的含量。1.归一化法最简单，应用最多。应用这种方法的前提条件是：试样中各组分必须全部流出色谱柱，并在色谱图上都出现色谱峰。当测量参数为峰面积A（也可以用峰高h）时，归一化的计算公式为：2.内标法当样品中各组分不能全部流出色谱柱或检测器不能对各组分都产生讯号且只需对几个组分进行定量时。方法的特点：需一标样和内标物。内标物以固定的浓度加入标准溶液和样品溶液中，以抵消实验条件和进样量变化带来的误差，定量准确。对内标物的要求：⑴样品中不含有内标物质；⑵内标峰的位置在各待测组分之间或与之相近；⑶稳定、易得的纯品；⑷与样品能互溶但无化学反应；⑸内标物浓度恰当，使其峰面积与待测组分相差不太大。内标法的具体步骤：将一定量的内标物ms加入到准确称取的试样m中，根据被测物和内标物的质量及其在色谱图上相应的峰面积比，求出某组分的含量wi。内标法的特点：内标法准确度高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大，但每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。3.外标法用标样作标准曲线。外标法即所谓校准曲线法。外标法简便，不需要校正因子，但需要标样，进样量要求十分准确，操作条件也需严格控制。Ⅺ.其它GC分析技术程序升温技术柱前衍生化法顶空气相色谱技术(HS-GC)固相微萃取技术(SPME)超临界流体色谱法(SFC)裂解气相色谱(PyGC)气相色谱恒温和程序升温谱图比较与其他方法的联用技术气相色谱/质谱联用（GC/MS)气相色谱/富利叶红外光谱联用(GC/FTIR)气相色谱/等离子发射光谱联用（GC/ICP)液相色谱/质谱联用技术（HPLC/MS)Ⅺ、顶空进样气相色谱技术(HS-GC)顶空气相色谱法(HS-GC)又称液上气相色谱分析，是一种联合操作技术。是通过在一个密闭的容器中，利用气液平衡的原理，间接分析固体或液体物质中挥发性成分的分析技术。气液达到平衡后，取顶部气体进行分析。Ⅺ、顶空进样气相色谱技术(HS-GC)是用于分析挥发性化合物的前处理技术（最初采用水浴的方法，人工取样）顶空进样系统顶空进样器过程:1)样品放到小瓶后迅速封口。2)小瓶被放到顶空进样器上。3)获得分析结果。自动加热使汽液两相达到平衡。将液上气体注入到气相色谱并实现分离。•顶空进样器什么时候采用?需要定量分析挥发性有机物时样品不适合直接进样时想要最少的样品前处理时复杂的混合样品固体、粘性或腐蚀性样品痕量化合物/低浓度顶空进样分析的优点干净，干扰少减少样品前处理可以分析不能直接进样的物质灵敏度高减少或消除溶剂峰增加色谱柱寿命定量准确张素巧：植物细胞与组织培养§1植物细胞培养基本知识§1植物细胞培养基本知识细胞培养：是将活细胞从生物体内取出，使其在体外环境中生长和发育的方法。1细胞培养的基本类型2不同细胞培养之间的关系3相关概念和名词1细胞培养的基本类型（一）按照培养材料的结构层次分器官培养：器官培养（Organculture），指对器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外进行培养，使之生存、生长并保持一定功能的方法。组织培养：组织培养（Tissueculture）指的是从体内取出的组织在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞培养：细胞培养（Cellculture）是对单个细胞或细胞群在体外进行培养的方法。原生质体培养:原生质体培养（Protoplastculture），指对植物细胞在去掉细胞壁后形成的原生质体在体外进行培养，使之生存、生长并保持一定功能的方法。（二）细胞培养的基本类型（二）按照培养基的物理性质分固体细胞培养液体细胞培养（三）按照培养方式分群体培养：将一定数量的细胞群体置于培养器皿中进行培养。克隆培养：将单个细胞进行培养，使其生长繁殖成一个细胞集落。（四）按照培养结果分愈伤组织培养胚状体培养再生植株培养悬浮细胞培养2不同细胞培养之间的关系都属于体外培养没有截然的界限，有时可互相转换组织培养、细胞培养经定向诱导分化，可以形成器官甚至完整个体。组织培养经过多次继代培养后，很容易导致细胞发生变动或出现单一化现象，即趋向于变成单一类型的细胞，最终便也变成了细胞培养。细胞培养在培养中的生命活动和在体内时一样，仍然是相互依存的，呈现一定的“组织”特性。3相关概念与名词外植体(explant)从植物根、茎、叶、花、果或幼胚等器官中分离得到的用于无菌培养的离体材料。愈伤组织（callus)由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。原生质体(protoplast)指去除细胞壁的植物细胞。用于植物细胞融合、转基因、细胞外处理等。细胞分化(celldifferentiation)在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构、功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程称为细胞分化。全能性（totipotency)指细胞经分裂和分化后仍具有产生完整有机体的潜能或特性，称细胞全能性。细胞全能性（发育全能性）细胞核全能性（遗传全能性）脱分化(dedifferentiation)指培养细胞失去其原有分化状态的结构与功能变成具有未分化细胞特征的过程。再分化(redifferentiation)指离体培养的组织或细胞，可以由脱分化状态再度分化成另一种或另几种类型的细胞、组织、器官，甚至再生成为个体的过程。§2植物细胞培养基本技术1植物细胞培养的营养和环境条件2植物细胞培养的技术程序3培养细胞的保存4植物细胞培养的应用1植物细胞培养的营养和环境条件培养基不同的的培养物所需要的最适的培养基成分有所差别，所以不同细胞培养选用不同培养基。细胞培养基必须满足的基本条件：①必须能供给植物组织细胞生长和发育所需要的全部盐类、氨基酸、脂类、糖类、维生素等营养元素；②必须具有一定的缓冲能力，即使细胞产生酸性物质，仍然能保证pH值在稳定在一定范围内；③必须是培养细胞的等渗溶液；④不能有微生物。培养基成分1无机营养物大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克，包括N,P,K,Ca,Mg,S。微量元素的用量一般每升不高于几十毫克，有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl等。2碳源一般为蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖等。作用：为细胞提供合成新物质的碳骨架；为细胞的呼吸代谢提供底物和能量；维持渗透压。3有机化合物硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育，泛酸钙（VB5）等。肌醇化学名称环己六醇，能使培养物快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响。培养基成分植物激素（生长调节物）生长素类：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）；NAA（萘乙酸）；2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）等细胞分裂素：激动素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等作用：调节细胞分裂与分化，其浓度和配比调控细胞生长方式和器官发生5有机附加物蛋白质水解物、酵母提取物、椰乳等成分复杂的天然营养物质。6其他附加物琼脂、植物胶；活性炭等。几种常用培养基MS（Murashigc&Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborgetal.，1976)植物组织培养环境条件光照条件光周期（16/8）光强（1000-4000lx勒克斯）光波长温度与湿度23～28℃之间进行，一般采用25±2℃相对湿度一般要求环境70～80%。酸碱度一般在5.5-6.5之间，多数培养基要求5.8。渗透压通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，糖对培养基渗透压起决定性作用仪器设备光照培养箱、恒温摇床、无菌操作设备等3植物细胞培养的基本程序培养基的配制植物组织的选取、消毒接种与培养愈伤组织的诱导和生长悬浮细胞的培养\n分化培养植株再生培养细胞的定期检测培养基的配制配制培养基的母液大量元素（20×或10×）微量元素（100×)铁盐（100×）有机物质（100×）配制使用浓度的培养基调节pH，加入琼脂等。分装灭菌植物培养基配制植物组织的选取、消毒选取外殖体来源：一是生长在自然环境下的植物；二是在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下经过离体培养的植物。取材：从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。茎尖、胚、叶、茎、根、花、果实等。外殖体消毒植物组织的消毒接种与培养接种：在无菌环境下，将处理好的外殖体转移的培养基上，封口。培养：将外殖体（或其他培养材料）在适当的培养环境下使培养物生长。培养目的：愈伤组织的培养愈伤的形成、愈伤组织的生长和继代悬浮细胞的培养愈伤生长状态调整、悬浮培养、悬浮细胞系建立植株再生植株的再生1器官的发生：植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的过程。来源：愈伤、外殖体或悬浮细胞体细胞胚在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。2器官分化过程三个生长阶：第一阶段是形成愈伤组织。第二阶段是“生长中心”形成。第三阶段是器官原基及器官形成。3影响器官分化的因素植物组织与细胞培养过程培养细胞的检测活细胞测定的方法醋酸酯荧光素（FDA）染色法酚藏红花染色法细胞记数用5%－8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理，后计数生长速率pP=（lnx-lnX0）/tX为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度细胞大小的测定技术用显微测微计细胞的干重和鲜重有丝分裂指数在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进行的速度越快（孚尔根染色法）。例：水稻遗传转化中的植物细胞培养4培养细胞的保存继代培养保存法1－2周继代一次低温保存法5－10℃低温培养保存冰冻保存法低温保存－20℃，可保存1－2年超低温保存－196℃保存5植物细胞培养的应用1)无性系快速繁殖技术兰花产业2)获得无病毒植株茎尖（脱毒）和花器培养3)新品质选育体细胞突变细胞杂交单倍体植株4)在基础生物学研究上的应用植物生长发育抗拟抗病机理5)种质资源的保护细胞系低温保存6)产业化生产快繁生物反应器生产活性物质7)人工种子§3几种不同的植物细胞培养1植物细胞悬浮培养2植物单细胞培养3植物花药和花粉培养1植物细胞悬浮培养什么是植物细胞悬浮培养？植物细胞悬浮培养是将植物细胞（外殖体、由植物体制备的细胞和细胞团、愈伤组织等）悬浮在无菌的液体培养基中，使之在体外生长、发育的一门技术。悬浮细胞培养的基本过程建立植物悬浮细胞系外植体的制备诱导疏松愈伤组织悬浮培养悬浮细胞继代培养细胞悬浮培养的细胞活性测定悬浮细胞愈伤组织的形成和植株的再生悬浮细胞的保存悬浮细胞系一个成功的悬浮细胞系应具备以下几个特点：一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。。二是均一性良好，细胞形状和细胞团大小大致相同。。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。三是细胞生长迅速，悬浮细胞的量一般在2－3天，甚至更短的时间就可增加一倍。悬浮细胞的生长悬浮细胞的继代悬浮细胞的生长特点延迟期对数生长期静止期细胞密度、鲜重、干重等悬浮细胞培养方式分批培养（振荡培养等）连续培养（封闭式、开发式等，适于工业化生产）影响悬浮细胞生长的因素起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。培养条件培养基、培养方式、温度、继代周期•细胞悬浮培养的优点•悬浮培养与固体培养比较有如下优点：细胞培养条件好，细胞增殖快。一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换能大量提供比较均匀的细胞、适于药物处理等适合大规模培养，生产有价值的活性代谢产物悬浮细胞培养的应用2植物单细胞培养植物单细胞培养的方法单细胞的制备机械法酶解法悬浮细胞过滤等植物单细胞培养看护培养法平板培养微室培养法3植物单倍体细胞培养（一）植物花药的培养植物的花药培养是指将成熟的或未成熟的花药从母体植株上取下，在无菌的条件下使其进一步生长、发育的技术。花粉的发育时期花药培养的基本程序外植体选择（单核期或双核花粉）－外植体(花蕾)预处理（低温）—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养花药培养中单倍体细胞发育过程离体的花药在培养基长培养一段时间后，如果培养基和培养条件适宜，一般2－4周花药内的花粉细胞既能长出愈伤组织或胚状体。胚状体经分化培养可以分裂形成球形胚，随着细胞的增多，花粉的细胞壁破裂，形成心形胚、鱼雷胚等，光照培养下逐渐发育形成器官，最终长成单倍体小苗。根据培养基中是否加入琼脂，可以将花药培养分为固体培养法液体培养法花药-花粉分步培养法3植物单倍体细胞培养（1）花粉培养（1）花粉的分离（2）花粉培养花粉直接培养（加入花药提取物）花药看护培养（花药培养+花粉培养）花粉悬浮培养（培养基含花药提取物）（3）诱导单倍体植株（三）胚珠的培养单倍体植株的鉴定（1）形态鉴定法一般单倍体植株表现为植株瘦弱、叶片窄小、花小、柱头长、花粉败育不着色等特征。（2）细胞学鉴定法通过对植株细胞进行中期染色体数目和行为特征来鉴定。单倍体植株的染色体加倍秋水仙素诱导法单倍体的应用（1）培育农作物新品种，缩短育种年限。（2）利用单倍体技术获得纯系经加倍后的纯二倍体如同自交系一样，可为杂交育种提供大量可选择的亲本材料。（3）进行异源染色体或基因转移。（4）利用单倍体进行突变体选择。（5）用作基础遗传研究的各个领域§4原生质体的培养原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的被质膜所包围的裸露细胞。原生质体的培养流程l原生质体的制备原生质体的培养1原生质体的制备取材根、叶片、悬浮培养细胞等材料的预处理根据需要可进行暗处理、预培养、等原生质体分离酶解法（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等）机械法原生质体收集与纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll沉淀法（过滤－离心法）：原生质体活力检测目测法、lFDA法、伊凡蓝法等2原生质体的培养\n原生质体培养的方法液体浅层静置法优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：是原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步生长与发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。固体平板法优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。缺点：操作要求严格，尤其是混合的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不容易混合均匀固液双层培养法优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。3影响原生质体培养的因素（1）原生质体的活力（2）原生质体的密度（3）胞壁再生速度（4）培养的营养和环境（膜稳定剂、渗透稳定剂、营养物质、生长调节物质等）4原生质体的发育和植株再生细胞壁再生细胞分裂一般原生质体培养2-7天后,开始第一次分裂,但开始第一次分裂的时间随植物的种类,分离原生质体的材料,原生质体的质量,培养基的成分和培养条件而异愈伤组织或胚状体的形成大多数情况下，原生质体培养2周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约6周后形成直径为2mm的小愈伤组织。植株再生5原生质体培养的应用1）进行细胞的生理和生化等基础研究去壁后的原生质体质膜裸露，并能再生细胞壁。因此是研究细胞壁的生物合成、质膜的结构和功能、物质运输、能量传递、信息传递、细胞识别、细胞之间相互关系、激素的作用等的很好材料。2）进行遗传转化利用原生质体可以摄取诸如病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等的特点，可以对细胞进行遗传转化，因而可作为转基因的材料来研究基因的表达、调控等研究。3）原生质体融合去壁后的原生质体可以进行细胞融合，不同的细胞融合后的杂种细胞可以用于改变细胞遗传物质，经分化培养后形成的植株可以形成新的杂交品种。同时，利用原生质体的融合还可以用于研究染色体的行为、基因定位等。§5植物细胞的规模化培养与次生代谢产物生产1植物细胞规模化培养产生代谢产物的类型及特点2植物细胞规模化生产次生产物的生产过程3规模化培养系统4提高细胞次生代谢产物的途径5规模化培养的意义1．规模化培养植物细胞产生代谢产物的类型成分：酚类化合物（黄酮类、单酚类、醌类等）、萜类化合物、含氮化合物（生物碱等）、多炔类、有机酸、蛋白质、碳水化合物、核酸等。应用：药物、香精、食品、化工产品等。规模化培养植物细胞产生代谢产物的特点植物细胞经筛选，可以产生远高于植物体内的代谢产物生长迅速，可以人工控制，不受地域和季节等限制细胞株在长期继代后可能退化对植物规模化培养系统的基本要求：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物；代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。细胞株的筛选外植体的选择、愈伤组织的诱导与培养选用目标化合物高产部位作为外植体单细胞分离与细胞株的筛选选取生长迅速、分散性好、目标产物合成量高的细胞株细胞株的性能评价和保存进行规模化培养，考察细胞生长与目标产物合成的能力和稳定性，符合要求的细胞株进行扩增和保存。培养的要求培养基生长调节物质的调整前体物质的添加诱导子（激发子）的应用细胞生长与产物生成之间的关系生长偶联型中间型非生长偶联型培养过程两步培养法第一步，在生长培养基上培养，促进细胞快速增长；第二步，在生产培养基上促进目的代谢物的生成。适用于非生长偶联型细胞。将细胞生长和代谢产物生产分开，能达到高细胞浓度和高目标产物生产。两相培养法水相培养基中加入有机相，细胞合成分泌的产物被转移至有机相中，从而提高产量。适用于合成产物能被分泌到细胞外、且对细胞生长有反馈抑制的类型。优点：减少产物对细胞的反馈抑制，通过有机相不断回收和循环实现培养与收获的连续化，促进细胞内产物的分泌。3规模化培养系统（生物反应器）培养方式悬浮培养系统机械搅拌式培养系统（剪切、污染）气动式（气压搅拌式）培养系统（不均匀）旋转式培养系统（体积小）固定化培养系统包埋式固定化培养系统（琼脂、藻酸盐等）附着式固定化培养系统（尼龙网、中空纤维等）产率高，操作复杂目标产物的分离提取根据目标产物的理化特性选取适当的分离纯化方法包括溶剂法、沉淀法、升华法、结晶法等经典分离方法和色谱分离法等4提高细胞次生代谢产物的途径1）明确植物细胞生长与产物合成的关系2）选择适宜的起始材料和细胞株植物品种、部位、细胞株系3）选择合适的培养基成分4）激发子的应用如茉莉酮酸、水杨酸、花生四烯酸等；微生物提取物、细胞碎片、金属离子等。5）培养技术的选择反应器培养方式培养过程6）产品的分离与纯化工艺设备次生代谢产物生产示例5规模化培养的意义规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径l保护生态环境，节约资源l提高生产效率l发展新型生物技术产业郭毅：一、文献课概述及1.概述IHapMapPpptimage“单体型图”是人类基因组的遗传“差异”图这一差异是个体表现型差异，即所有性状(表型组，phenome)，特别是对疾病以及病原与药物反应性差异的遗传基础。国际人类基因组单体型图计划生物学研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识.信息：物质存在的一种方式，一般指数据、消息中所包含的意义。可以使消息中所描述的事件的不定性减少。特性：可传递性、消除不确定性、可识别性、可储存性、可加工性、可替代性、可共享性。知识：知识是人类社会实践经验的总结，是人的主观世界对于客观世界的概括和如实反映。知识是人类通过信息对自然界、人类社会以及思维方式与运动规律的认识，是人的大脑通过思维重新组合的系统化的信息的集合。因此，人类不仅要通过信息感知世界、认识和改造世界，而且要根据所获得的信息组成知识。可见，知识是信息的一部分。.据经合组织（OCED）出版的《以知识为基础的经济》报告对知识的分类：1）“知事（Know-what）”，关于事实方面的知识，可理解为Know-when、Know-where；即在什么样的时间（Know-when）、什么样的地点或条件下(Know-where)能解决什么样的问题；2）“知因（Know-why）”,自然原理和规律方面的科学理论，知识生产是在专门研究机构如实验室和大学完成的；.3）“知道怎样做的知识（Know-how）”,做某些事的技艺和能力，称为技术情报和商业秘密，其典型是企业开发和保存于其内部的技术诀窍或专有技术；4）“谁以及是怎样创造知识的（Know-who）”侧重创造思想、方法、手段、过程以及特点等的了解。.情报：可传递利用的知识。特性：知识性、传递性、使用性。.情报意识：人们对自己情报需求的认识.情报需求：1.需要得到本专业和相关学科的最新成果。2.需要一些数字、方法和设计方面的事实性资料时。3.进行研究或研究完成撰写论文，需要参阅与课题有关的文献时。.文献：记录知识的一切载体。《文献情报术语国际标准（草案）》（ISO／DIS5127）：“为了把人类知识传播开来和继承下去，人们用文字、图形、符号、声频、视频等手段将其记录下来，或写在纸上，或晒在蓝图上，或摄制在感光片上，或录到唱片上，或存贮在磁盘上。这种附着在各种载体上的记录统称为文献。”国标：各种媒介和形式的信息集合，包括文字、声像印刷品、电子信息、数据库等。按文献出版类型划分.a图书.b期刊.c政府出版物.d科技报告.e专利文献.f会议文献.g学位论文.h技术标准和规范.i产品样本说明书.j技术档案按文献的存储载体分：.印刷型.缩微型.声像型.电子型科技文献的发展特点.数量激剧增长.存储密度和效率不断提高.类型多样化.分布的离散状态.内容交叉重复.文献使用寿命缩短科技文献的作用.存储.传递.再生.鉴别学习生物文献课的意义.是科学研究的需要：创新是科研的灵魂.情报意识培养的需要.良好学习、科研方法的掌握.论文写作情报意识的培养.培养专业敏感性.培养获取情报的欲望和热情.培养获取情报的不怕挫折的品质.培养广泛的交流能力.培养思维判断能力.培养创造性培养情报意识的具体方法.一定的知识积累.提醒自己有情报需求.了解本专业国内外动向及趋势.阅读有关书籍.听讲座.请教本专业老师.向专业人员请教.注意观察周围同志获取情报的方法.及时总结经验，修正方法4图书\n是对已经发表的科研成果、生产技术知识和经验的概括论述。通常是经著者的选择、核对、鉴别，融会贯通和重新组织而产生的文献。特点：内容较其它全面、系统、成熟、可靠，可使读者对范围较广的问题获得一般知识，对陌生问题获得初步了解缺点：出版时间长，新颖性差.图书在各种论文末的参考文献或题录性检索.图书的著录特点是：有书名，有著者，有的还有编者；必有出版地、出版社名和出版年份；非第一版的图书有版次；有的图书还给出国际标准书号（ISBN）。图书主要在各类图书馆中查阅。期刊：期刊一般是指名称固定、开本一致的定期或不定期连续出版物。期刊论文内容新颖，报道速度快，信息含量大，是传递科技情报、交流学术思想最基本的文献形式。据估计，期刊情报约占整个情报源的60-70%，因此，受到科技工作者的高度重视。大多数检索工具也以期刊论文作为报道的主要对象。对某一问题需要深入了解时，较普遍的办法是查阅期刊论文。.期刊论文著录的特点是：有作者，有时有篇名；期刊名称常常缩写，有的还以斜体给出；必定有卷号，有的有期号。各种期刊既可在图书馆，也可在情报所查阅。会议文献：这是指在国际或国内重要的学术或专业性会议上发表的论文。会议文献学术性强，往往代表着某一领域内的最新成就，反映了国内外科技发展水平和趋势，是获得最新情报的一个重要来源。会议文献可分为会前文献，如会议日程预报和会议论文预印本，以及会后文献，如各种会议录。会后文献是主要的会议文献。.会议文献著录的特点是：有表示会议的专门用词，如Conference，Symposium，Convention，Workshop，Meeting，Congress，Assembly等；有表示会议录的一些词，如Proceedingsof...，Collectionof...；有的有会议召开的地点、届次、时间，以及会议录的出版社、出版地、出版时间等。会议文献可在图书馆和情报所等处查阅。科技报告：科技报告是指国家政府部门或科研生产单位关于某项研究成果的总结报告，或是研究过程中的阶段进展报告。报告的出版特点是各篇单独成册，统一编号，由主管机构连续出版。在内容方面，报告比期刊论文等专深、详尽、可靠，是一种不可多得的情报源。科技报告可分成技术报告（Technicalreports）、技术备忘录（Technicalmemorandums）、札记（Notes）、通报（Bulletins）和其他（如译文、专利等）几种类型。有些报告因涉及尖端技术或国防问题等，所以又分绝密、秘密、内部限制发行和公开发行几个等级。目前国际上较著名的科技报告是美国政府的四大报告，即PB（PublishingBoard）报告、AD（ASTIADocuments）报告、NASA（NationalAeronaticsandSpaceAdministration）报告和DOE（DepartmentofEnergy）报告。.学位论文是指为申请硕士、博士等学位而提交的学术论文。学位论文的质量参差不齐，但都是就某一专题进行研究而作的总结，多数有一定的独创性。学位论文是非卖品，除极少数以科技报告、期刊论文的形式发表外，一般不出版，属难得文献。.学位论文著录的特点是：通常有表示学位论文的词，如Thesis，Dissertation等；有的有论文作者所在学校的校名。二、科技文献的主要来源.图书（Book）.专业期刊（Journal）.会议文献.科技报告.学位论文.各种数据库.互联网.其它.专利文献：专利文献主要由专利说明书构成。所谓专利说明书是指专利申请人向专利局递交的有关发明目的、构成和效果的技术文件。它经专利局审核后，向全世界出版发行。.标准文献：指标准化工作的文件。其中主要为工业产品和工程建设的质量、规格和检验方法等的技术规定文件。作为一种规章性文献，它具有一定的法律约束力。.产品技术资料：指产品目录、产品样本和产品说明书一类的厂商产品宣传和使用资料。产品样本通常对定型产品的性能、构造、用途、用法和操作规程等作具体说明。.技术档案：指科研生产活动中形成的，有具体事物的技术文件、图纸、图表、照片和原始记录等。.政府出版物：指各国政府部门及其设立的专门机构发表的文献。政府出版物的内容十分广泛，既有科学技术方面的，也有社会经济方面的。就文献的性质而言，政府出版物可分为行政性文件（如国会记录、政府法令、方针政策、规章制度以及调查统计资料等）和科学技术文献两部分。我国政府发表的“科学技术白皮书”就是一种科技类政府出版物。科技成果及科技论文评价标准1.同行专家评议2.科技引文索引(SCI)同行专家评议.论文发表与否.申请各种基金项目.成果鉴定.其它论文发表与否.创新性.科学价值(对本学科或相关学科是否有重要意义.能否引起广泛兴趣.数据、图表可信度及是否准确.文献是否全（特别是重要文献）直接发表；修改后发表；修改后再审；不同意发表申请各种基金和项目.创新性.工作基础.主要技术手段和技术路线.拟达到的目标成果鉴定一般为课题完成后的鉴定：.是否完成.完成情况.水平其它职称评定，学术水平等同行评议的特点优点：历史长，综合性强，同行之间比较了解.缺点：A.共识决策，助长保守思考和保守选择B.过高的业绩权重和知名度影响，不利于青年科学家C.学科分类不利于学科交叉D.成本高SCI和IF值.科技论文是科学研究产生出的重要表现形式之一.假如论文很重要，则定会引起很大反响，则其它科研工作者会以此为参考，则引用多，反之亦然.美国科学信息研究所（InstituteforScientificInformation，ISI）前所长E.Garfield倡导按论文被引用的次数来评价成果。SCI和IF值.SCI分为CC和CDE浓缩理论20％的文章拥有80％引文SCI收录和SCI引用：时间，引用次数，题目，作者，单位SCI和IF值.ISI每年出版JCR（JournalCitationIndex）根据引文情况标出IF值。.IF（ImpactFactor）：杂志的影响因子，与引文情况有关）IF＝杂志前两年发表的论文被引用总数/前两年发表论文总数反映文章的重要程度.JCR（JournalCitationReports）是由美国ISI公司出版，依据期刊相互引用情形编制的书目计量分析统计报告，是期刊评价、排名、分类及比较的唯一量化工具。它收录了全世界3000多个出版社的7000多种学术期刊（大部分是SCI收录期刊），内容涵盖科学技术和社会科学所有专业领域。从ISI每年发布的JCR报告中可以得到当年期刊的一个重要评价指标——期刊影响因子ImpactFactor（简称IF）评价期刊的标准.论文接受标准高.编委会能适当的代表不同学科并广受尊重.编辑使用非常严格的分类系统.出版周期快.被主要的文献和索引服务中心收藏.科学家们在使用期刊上的文章时有很高的信任度.被其它期刊引用的频率高.有英文的文章简介及提要.有作者的详细地址.提供完整的参考书目录SCI收录刊物的标准.刊物水准（见前）.引文记录.专家评议：订户；编者；出版社；顾问委员会及专家；学科分布；国际化程度；发表最新进展的程度等SCI的主要作用.期刊和论文的价值评估.科研水平的评价.检索科研课题.预测边缘学科及学科的发展趋势美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（ScienceCitationIndex）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：.细胞信号转导（signaltransduction）；.细胞凋亡（cellapoptosis）；.基因组与后基因组学研究（genomeandpost-genomicanalysis）。SCI的缺点.引用的不同情况：正面引用（自引和他引）一般性引用批判引用.学科之间的差异（学科影响因子）.研究人员的数量.偏见和出版范围的影响文献的类别.零次文献：未经出版发行的文献，包括手稿、个人通信、原始记录等。.一次文献：首次出版的各种文献，也称原始文献。一次文献是以科研生产活动的第一手成果为依据而创作的文献，内容丰富，参考价值大，是我们利用的主要对象。.二次文献：报道和查找一次文献的检索书刊，如各种目录、题录和文摘等。二次文献是图书情报工作者在大量收集原始文献的基础上，经过分析、归纳、重组后出版的。二次文献是一次文献的集约化、有序化的再次出版，是贮藏、利用一次文献的主要的、科学的途径。.三次文献：利用二次文献提供的线索，选用大量一次文献的内容，经综合、分析和评述再度出版的文献，如各种述评、进展报告、动态综述、手册、年鉴和百科全书等。我们使用的各种教科书也属三次文献。文献的基本特征文献检索是把文献信息按照一定的方式编制起来，并根据检索者的需求，从存贮的文献资料中查找出有关文献的过程。1、外表（部）特征：名称、作者、序号2、内容特征：关键词、关键语句文献检索、数据检索和事实检索.文献检索（DocumentRetrieval）是以文献为检索对象，从已存贮的文献库中查找出特定文献的过程。.数据检索（DataRetrieval）是以数据为检索对象，从已收藏数据资料中查找出特定数据的过程。.事实检索（FactRetrieval）即通过对存贮的文献中已有的基本事实，或对数据进行处理（逻辑推理）后得出新的（即未直接存入或所藏文献中没有的）事实过程。检索过程概述1.明确检索需要，进行检索提问①分析提问内容形成主题概念②选用检索语言，标引检索提问(检索语言（Retrievallanguage)是用来描述文献特征和表达检索提问的一种专门语言。检索效率的高低，在很大程度上取决于所采用的检索语言的质量以及对它的使用是否正确。不同的检索语言构成不同的检索标识和索引系统，提供不同的检索点和检索途径)2.检索提问标识与文献特征标识进行比较情报检索的步骤一．直接检索二．间接检索1.分析研究课题，明确检索要求2.选择检索工具3.确定检索途径4.选定检索方法5.查找文献线索6.索取原始文献1分析研究课题，明确检索要求.主题内容.分析检索范围.分析已知情报\n2选择检索工具工具类型：题录式检索工具文摘式检索工具全文式检索工具检索方式：人工检索机械检索2选择检索工具标准：.收录范围是否明确、全面.报道量大不大.报道速度快不快.摘录质量高不高.检索功能是否完善3确定检索途径.1、分类途径：利用分类名和分类号进行检索。其结果是该类目所有的文献。.2、题名（篇名）途径：利用篇名中的字词或篇名的一部分进行检索。其结果是所有在篇名中出现该字、该词或该部分的文章，检索结果较全。.3、主题词/关键词途径：利用文章篇首标明的与该篇文献主题相关的词进行检索。其结果是包含该主题词或关键词的所有文献，结果较准（主题词）、较全（关键词）。.4、著者途径：利用文献作者名字进行检索。可查到该作者的所有文献。.5、出处途径：利用原文献刊载处进行检索。可查到某刊载处刊登的所有文献。.6、全文关键词途径：用于全文数据库检索。利用从文献题名和正文中抽出的、表达文献主题内容的、有实际意义的词进行检索。结果全，但有误检；.7、全文自由词（任意词）：用于全文数据库检索。利用文献中的任意字或词进行检索，结果全，但误检率高；.8、年份途径：利用年份进行检索。可查到某年份出版的所有文献。一般与其他途径合并使用。4选定检索方法.追溯法从已有的文献后所列的参考文献着手，逐一追查原文，再从这些原文后所附的参考文献逐一检索，获得一批相关文献的方法。它是科研人员常喜欢用的一种简便的获得文献的途径。.直接查找法也称工具法，就是利用文摘或题录等各种文献检索工具查找文献的方法。由于检索工具书刊的种类繁多，一般应根据课题内容特点首先利用综合性的检索工具，然后使用专业性的检索工具，二者结合，才不致造成主要资料的漏检。直接查找法根据时间范围又分为顺查法、倒查法和抽查法。.顺查法以所查课题起始年代为起点由远而近地按时间顺序的查找方法。查找前要确定该课题研究的历史背景，从研究开始的年代查起，一年年或一卷卷地通过检索工具查找。这种方法比较费时，且问题发生的起始时间不容易一下子确定，但查得的文献比较齐全。.倒查法这是一种由近而远逆时间顺序的查找方法。从近期往远期查找，一般将注意力放在查找近期文献上。因为近期文献不仅反映了现在的研究水平，而且一般都引用、论证和概述了早期的文献资料。因此，查找时不必一年一年地查找完，只要查到基本掌握所需文献就行了。与顺差法相比，倒查法比较省时省力，但有可能漏查一些有用的文献。.抽查法根据课题研究的特点，抓住该课题研究发展迅速，出版文献较多的年代，抽取一段时间（几年或十几年）或一段时间内的几个点，再进行顺时查找的检索方法。使用抽查法，检索时间较少，查得文献较多，但也有漏检文献的可能，并要求检索者对课题研究的历史情况有较多的了解和掌握。5选定检索方法.循环法也称综合法，这是上述追溯法和常用法的结合。具体地说，采用这种方法查找文献时,既要利用一般检索工具书刊，又要利用文献后附的参考文献进行追溯，分期分段地交替使用，知道获得满意的相关文献为止。5查找文献线索.利用选定检索工具，通过各种检索途径和方法进行具体检索，查处文献的出处和摘要。6索取原始文献.缩写全称.非拉丁语系文字出版的拉丁译名还原成原名.查找原始文献收藏单位文献检索的方法应用.浏览专业期刊.微机检索.专业文摘检索.怎样提高检索效率浏览专业期刊.相关期刊.重点期刊.追踪动态.知识扩展微机检索.光盘、软盘检索系统.国际联机检索.利用互联网检索怎样提高检索效率.查全率和查准率查全率R＝检出相关文献量/文献内相关文献总量％查准率P＝检出相关文献量/检出文献总量％检索技巧：利用布尔逻辑：AND/OR/NOT/XOR(EOR)截词加权检索原文检索限制检索布尔检索：用布尔逻辑算符来表达检索词间的逻辑组配关系，是最基本、最常用的检索技术。常用的布尔逻辑算符有：（1）逻辑或（+，OR）：表达检索词间的并列关系。可扩大检索范围，提高查全率。如：A+B，表明结果中含有A或B都为检索命中。（2）逻辑与（*，AND）：表达检索词间的交叉关系。可缩小检索范围，提高查准率。如：A*B，表明结果必须同时含有A和B才为命中。（3）逻辑非（--，NOT）：表达检索词间的排除关系。可缩小检索范围，提高查准率，但要慎用。如：A—B，表明结果是A中不包含B的那部分。（4）逻辑异或XOR（EOR）截词检索：又称词干检索、模糊检索。检索时，只需用词干加截词符号，凡是含有与该词干相同的文献均能被检出。该方法能很好解决中西文单词的派生形式，避免漏检现象的出现。检索系统不同，截词符也不同，常用的有：#，？，*等。根据截词符出现的位置不同，可分为：（1）后截词：将截词符放在词根后面，前方一致。是最常用的截词方式。主要用在词的单复数、年代、作者、查同根词等情况。如：acid*（可代替acid、acids、acidic等）（2）前截词：将截词符放在词根的前面，后方一致。多见于复合词较多的文献检索。（3）中间截词：将截词符置于检索词中间，词的前后方一致。又称“通用字符法”或“内嵌字符截断”，该方式能解决英美拼法不同单词的书写或有些词在某个元音位置上出现的单复数的不同拼写。如：wom?n（可代替woman,women）限制检索：是限定检索词在数据库记录中出现的字段范围的一种检索方法。在检索系统中，数据库设置、提供的可供检索的字段，如题名、主题词、文摘、语种、出处、年份等。常用的限定符有：in、＝、<=、>=、<、>等。如：PY>=2001，表示要检索2001年后的文献加权检索：它根据用户的检索需求来确定检索词，再由每个词在检索要求中的重要程度不同，分别给予一定的数值（权重）加以区别，同时给出检索命中界限进行限制。可分为词加权（常用）和词频加权两种。原文检索：1、简单检索（basicsearch）：是一种单项检索。一般只需输入一个检索词，辅以相应的途径即可进行检索。二次检索：在原有简单检索的结果基础上，再进行一次简单检索。2、高级检索（advancedsearch）：是一种多项组合检索。一般输入多个检索词进行组配，其组配可以是同一检索途径下的，也可以是不同检索途径下的。有的检索系统也称为复杂检索。怎样提高检索效率.提高查全率的方法：.检索词的选定.逻辑关系.提高查准率的方法.检索词的选定.逻辑关系.原文检索.加权检索获取文献的方法.订阅专业期刊.向有关作者索取.互联网下载.定点复印常见的专业文献的类型.研究论文：.全文（article）：.简报（report）：.快报（report）：.综述.小综述（MiniReview）.综述（Review）.评论：News&Views/Editional文献阅读的方法.被动阅读：阅读仅仅就是阅读么？.主动阅读：提出问题、积极思考、文献的主题、研究论文的结构及所含信息.题目（title）.摘要（Abstract）.引言（Introduction）.材料方法（MethodsandMaterials）.结果（Results）.讨论（discussion）.致谢（acknowledgement）怎样做笔记：Onesubjectperpaper详细的注释分类的条理性.草稿的写作：工作量的70％1.首先准备结果和图片2.重新阅读相关文章3.将要点记录下来4.写出文章提纲15.导师或同事审阅提纲16.重新写提纲27.导师或同事审阅提纲2（定稿）8.将关键句转换为段落9.一次性完成初稿写作技巧.一般性原则.K.S.好的关联词和转换.不要改变主语.要用主动语态.简单的词.避免术语和缩写.最少的词.好的句法研究论文的结构及写作.题目（title）.主要研究什么，准确、新颖、概括.作者.英文名在前，姓在后。引用时姓全称，名简写。.单位：研究论文的结构及写作.摘要（Abstract）Whyshouldyoureadmypaper.简短.强调概念.可最后写.关键词.引言（Introduction）.Why，howandblowyourownhorn.3－4段.背景介绍.为什么重要（意义）.别人的方法和主要结果（论）.自己要做的工作及结果研究论文的结构及写作.材料方法（MethodsandMaterials）.使人信任（allowingverification）.可首先写.只写变化的地方.新方法的证明.结果（Results）.短而精.少解释.逻辑性、顺序性和严密性.需要多少证据.图片和表格.讨论（discussion）.新的东西（What’snew）.解释的东西.今后的工作.避免主观臆断.致谢（acknowledgement）.参与工作，但工作量少.提出关键建议和意见.提供各种帮助.审稿人.接受和发表时间.科学上的第一原则研究论文的结构及写作.参考文献.所有引文都应列出.Citation＝Credit.引用的客观和公正.最新的文章、自己的文章、审稿人的文章科学的研究方法.实验设计（ExperimentalDesign）.原创性（Originality）.论文写作（PaperWriting）.陈述（Presentation）.科学道德问题（integrity）权威的作用.盲目的信任是科研工作者的大忌风险评估.我可负担多少风险.我能信任多少.我在多大程度上安排实验细节减小风险的策略.全面的评估背景材料.注意细节.对关键因素系统的检验.细心进行实验设计.充分讨论（导师、同学、同事）.实验室文化实验设计.对照阳性对照阴性对照.对关键因素系统性检验的方法N＋（N－1）原则.统计学的应用.实验手册Minipaper：Date，Question，Materials，Reference/Note，Design，Flowchart，Solutionandreagents，\nResults，Discussion原创性.怎样选题.重要或广泛兴趣的现象（问题）.新领域.新技术.兴趣、热情.优势所在.小研究室和大的研究室.主流与非主流观点陈述.了解听众.目的.详尽准备.预演.心理优势观点陈述主要部分：一．介绍：将背景介绍清楚，最好详细文字说明二．主体：大纲三．结论：用文字说明1.有助于听众抓住要点2.要简练，列出要点3.可用图表总结4.放在在最后观点陈述.回答问题（要）：.表示感谢.简短.可请提问人重复一遍.变为自己的问题.重复问题.避免追问.回答问题（不要）.打断问题.评估问.侮辱.我不知道（Idon‘tknow）.道歉.拖泥带水.生气发火科学道德问题.迫切性.科学对社会的影响愈来愈大.社会对科学的关注增大.科学研究的责任行（RCR）已成为一个普遍性的话题.常见的科学道德问题.选择性使用数据.造假，夸大.抄袭成果署名.利益冲突科学道德问题.原因：.科学态度贪婪压力骗子无知.责任研究者导师单位政府科研人员应具备的基本素质.科学的态度良好的人品基本的计算机知识阅读文献的能力理解和使用文献实验设计能力写作能力科研生产力因特网基础按提供的内容网络信息资源可分为：1.参考型数据库:指引用户到另一信息源以获得原文或其他细节的一类数据库。包括各种书目数据库和引文数据库。这种数据库具有参考和评价的功能，多用于查新、开题。如：SCI、EI、维普的中文期刊数据库……2.全文数据库:指存储文献全文或其中主要部分的数据库。如新闻消息全文库、法律法规全文库、人大报刊资料库、博硕论文全文库等。3.事实型数据库:直接提供事实或数值的数据库。如：万方的企业产品数据库、彼得森大学指南等。4.电子图书:计算机利用计算机检索并下载阅读的图书。如：书生之家、超星数字图书馆、各种数字图书馆等。5.电子期刊:直接在网上就可以检索和阅读的期刊。如：万方数字化期刊，中国期刊网全文数据库，scienceonline等6.电子报纸:如：人民日报的网络版。7.其它类型:如软件，新闻等黄占景：放射性同位素同位素：在元素周期表上占有同一位置,具有相同质子数、不同中子数的原子互称同位素。一般天然元素是几种同位素组成的混合物。某种同位素的子数占总原子数的百分比叫该同位素的丰度。如天然氮气内含有14N和15N，14N的丰度为99.63％，15N的丰度为0.37％。如镁含的三种同位素丰度分别为：24Mg78.6％，25Mg10.11％，26Mg11.29％。放射性同位素：同位素中有的原子核很不稳定，会变成另一种稳定元素，这个过程称为核衰变，在核衰变的过程中会放射出一些射线，所以把这样的同位素叫放射性同位素。放射性同位素的特性1、能放出各种不同带有能量的射线α、β、γ射线、中子射线。α射线：射程很短，一个1兆电子伏（1MeV）的α射线，在空气中的射程<1.0厘米，在铅金属中只有23微米（μm），一张普通纸就能将α射线完全挡住β射线与α射线能量相同的β射线，在同一物质中的射程比α要长得多，如1MeVrβ射线，在空气中的射程近10米，γ射线：穿透力最强，射程最大，1MeV的γ射线在空气中的射程约有数十米。有的放射出一种射线，有的放出两种射线放射性强度：单位时间内发生衰变的原子数目叫做放射性强度放射性强度的常用单位是居里（curie），表示在1秒钟内发生3.7×1010次核衰变，符号为Ci。1977年国际放射防护委员会（ICRP）发表的第26号出版物中，根据国际辐射单位与测量委员会（ICRU）的建议，对放射性强度等计算单位采用了国际单位制（SI），我国于1986年正式执行。在SI中，放射性强度单位用贝柯勒尔（becquerel）表示，简称贝可，为1秒钟内发生一次核衰变，符号为Bq。1Bq=3.7×10-10Ci2、具有一定的寿命。人们将开始存在的放射性同位素的原子核数目减少到一半时所需的时间，称为半衰期。不同的元素半衰期不同，同一元素的半衰期是不变的。半衰期越长，说明衰变得越慢，半衰期越短，衰变得越快。3、化学性质相同放射性同位素和相应的元素，原子中的质子数和电子数相同，只是原子中的中子数不同，由于原子的化学性质主要取决于核外电子，所以放射性同位素和相应元素的化学性质相同。应用1和相应的元素化学性质相同，但释放射线可以替代相应元素掺入到某种物质中，而且不改变该物质的性质。通过射线能够检测该元素或含有该元素物质所在的位置以及数量不间断地释放能量：释放的能量可以作用任何物体2、不间断地释放能量释放的能量可以作用任何物体应用：1、生命科学2、医学3、工业3、农业大肠杆菌侵染噬菌体实验探针：用于分子杂交，带有特殊标记的DNA、RNA或蛋白质PCR技术育种目标1、高产2、高产、优质3、节水、高产、优质安全性1、剂量（强度）2、被照射的部位3、被照射的时间剂量单位:希沃特（西弗）（Sievert：Sv）　　定义：每公斤人体组织吸收1焦耳(J)，为1希沃特。　　常彦忠：动物细胞培养技术简介细胞培养的历史1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙凝固的淋巴液中，使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞，蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。细胞培养的历史1920年代中期，英国剑桥的科学家斯特兰吉威斯（T.S.PStrangeways）和细胞生物学家费尔（DameHonorB.Fell）发展了器官培养方法。法裔美籍外科医生卡雷尔（AlexisCarrel）的实验室將小鸡心脏细胞培养维持了多年。动物细胞培养定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是在细胞水平研究动物细胞生理、生化、代谢、药理、分子功能、信号转导、和细胞工程的基础动物细胞特点：无细胞壁倍增时间长，生长缓慢聚集体形成对培养基要求高，需氧量少，对CO2浓度有一定要求原代细胞培养50代即开始退化动物细胞培养的主要用途研究某种细胞的结构特点和生理功能；作为反应器生产抗体等药物研究某种功能的信号转导途径；研究各种因素对细胞功能的影响机器机制；研究细胞药理、毒理反应，寻找新的药物及其靶点；获得体外细胞、组织、器官用于临床疾病治疗一、细胞培养的基本条件实验室条件：环境、设备、器材、试剂实验操作者的技术掌握：用品的洗刷、无菌处理、培养液配置、细胞计数、细胞和用品储存、无菌操作、及其研究经验等实验室建筑和环境要求实验室基本设备超净工作台、CO2培养箱等。高压灭菌锅、细菌滤器、高温烤箱等液氮储存罐、低温冰箱、普通冰箱等离心机、倒置显微镜、细胞计数器等超纯水机、移液器、pH计、磁力搅拌器、恒温水浴锅等细胞培养用器材、试剂消毒液、乙醇等培养瓶、培养皿、培养板、培养玻片等移液管、吸管、枪头、手术器械等培养基、胎（小）牛血清、马血清、缓冲液、消化液等合成培养基（Invitrogen)RPMI1640Eagle培养液：DMEM、MEM、IMDMHamF12、HamF10、PC199Mc-Coy5A平衡盐液HanksD-HanksEarlePBSHBSS消化液：胰蛋白酶(0.125-0.25%)胶原酶(0.1-0.3mg/ml)EDTA(0.01-0.02%)注意事项二、细胞培养的基本技术无菌操作：洗手着装超净台通风近火焰操作（可选）试剂瓶等斜放（一）用品的清洗与消毒消毒方法：物理消毒法：射线、紫外线、干热、湿热、过滤、煮沸等化学消毒法：乳酸、甲醛、过氧乙酸、新洁尔灭、乙醇等抗生素灭菌：青霉素、链霉素等培养用具处理规程表（二）培养基和活性液体的过滤除菌（三）细胞冻存与复苏细胞冻存（缓慢）：细胞：至少5X106步骤：单层细胞——胰旦白酶液消化单个细胞——加冻存培养液（DMSO)——单细胞悬液——冻存管————液氮罐细胞冻存与复苏细胞复苏（快速）：　－196ｏC取出冻存细胞——37-45ｏC迅速溶解细胞——离心1000/分，５分钟——取沉淀，弃冻存培养液——加新鲜培养液——再培养（三）细胞计数单层细胞——胰旦白酶液消化细胞——定量加入培养液——单细胞悬液——计数细胞计算公式：（４大格细胞数÷4）×10000×稀释倍数＝细胞数/毫升（四）更换培养基与传代培养更换培养基：传代培养：单层细胞——弃原培养液——胰旦白酶液消化细胞——\n单细胞悬液——细胞计数——加新鲜培养液——再培养（冻存）（五）原代培养植块法：洗涤——剪碎—洗涤——贴壁接种——培养消化法：洗涤——剪碎——洗涤——消化——过滤——离心——接种——培养（六）细胞克隆方法克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。抗生素筛选稀释法单克隆的筛选指环法单克隆的筛选动物细胞体外培养特点营养条件苛刻适应性差,敏感培养时间长，易污染三、常用细胞系及其生长特点细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持细胞株构建三、常用细胞系及其生长特点培养细胞的特性培养细胞的生长方式和类型:贴附生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经胞悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴细胞等培养细胞的生长特点:贴附、接触抑制、密度依赖性原代培养（primaryculture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。传代培养（Passage）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。原代神经细胞培养：海马神经元的培养中脑黑质多巴胺神经元的培养星状胶质细胞的培养少突胶质细胞的培养小胶质细胞培养神经干细胞的培养心肌细胞培养内皮细胞培养常用的原代神经细胞培养用动物胚龄海马：E18－20大脑皮层：E18－21中脑黑质：E14－15纹状体：E16小脑：P0－P7脊髓：E13－14背根神经节：E13－成年容易出现的问题和解决的办法存活的细胞少。（解剖时间过长）细胞容易脱落。（PDL包备过夜，细胞种植前洗涤充分）胶质细胞过度生长。（用阿糖胞苷等处理）多巴胺神经元数量少。（用血清培养）四.少突胶质细胞培养动物：生后7天大鼠。部位：皮层或视神经。各类神经系统细胞的标记蛋白神经干细胞：Nestin,NeuN神经元：TuJ1,NF,MAP2,Tau,NSE胶质细胞前体细胞：A2B5星状胶质细胞：GFAP,S100少突胶质细胞：O1,O4,MBP小胶质细胞：OX42(CD11b/c,rat),MAC-1(mouse)