细胞生物学复习 5页

1.何为层流技术及其在FCM中的应用管道中液体稳定流动时是以管道的轴线为中心分层流动的，管道中层流的形dρv成要满足雷诺数Re=——<2300。层流是液体稳定流动的必要条件，为细胞分析提供技术保证。Η根据这一原理，FCM中的细胞在稳定流动的液流中始终趋向沿管轴方向运动，一旦偏离了管轴，它就立刻会收到指向管轴方向的力的作用，重新回到沿管轴的方向继续流动。同样的原理，非球形细胞流动时其细胞长轴总是与管轴方向一致。2.流式细胞分析术：以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。3.多参数分析4.前向角散射信号（FSC）：信号强弱与细胞的大小和活力有关。对于一些非球形细胞（某些红细胞、精子）由于在液流中的不同取向，所获得的FSC信号差别很大。侧向角散射光信号（SCC）：信号强弱与细胞内颗粒多少相关。细胞凋亡时其SCC常变大，同时FSC常减小。5.FCM的荧光补偿（fluorescencecompensation）：利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术。6.FCM的数据储存方式:ListMode方式,用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件。FCM的不同显示方式1.）单参数直方图（Histogram）2.）双参数数据显示：二维点图(DotPlot)：每个点代表一个细胞等高线图(ContourPlot)：在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同二维密度图(DensityPlot)假三维图(Pseudo3DPlot)：Z轴为细胞数3.）三维图(3DPlot)：三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。7.酶消化法应注意哪些条件?1.）配制酶溶液试剂时要兼顾酶反应的适宜条件与活细胞要求的生理环境，其中包括渗透压，pH值(缓冲液)，各种离子浓度，酶激动剂等。2.）酶溶液的适用浓度：胃蛋白酶0.5%；胶原酶0.1%；胰蛋白酶0.25%(含1-10μg/mlDNase)3.）酶消化过程的最佳温度与持续时间：37℃,15-20分钟，不同组织不同酶而异；二次消化；反复数次,直至组织块完全消失。每克组织10-15ml。4.）终止酶消化反应的方法和措施：加酶抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂等）；降低酶反应温度，将细胞悬液管移至冰水浴中；对于蛋白酶，加入少量血清以减弱酶对细胞的不利影响；通过反复离心漂洗，移去酶消化液，彻底终止酶消化过程等。8.常用的单分散细胞的方法有哪些?及其各自特点（补）酶消化法：不同类型的组织其细胞之间粘连物质的化学组成不相同，不同的酶对细胞间不同组分有特异的作用。机械法：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。化学试剂处理法：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和聚集量不稳定。9.荧光细胞化学过程的特异性：FCM的荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即荧光染料与细胞成分是否为特异性结合。严格控制各种反应条件是保证反应特异性的重要因素。荧光细胞化学的化学定量关系：在相同的条件下，荧光反应产物（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系。足够的特异性和可靠的定量关系是对每一荧光细胞化学过程的两个基本评价标准。收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。纯度是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。10.细胞样品制备技术的优缺点及注意事项1.）机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量；2.）可用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰；3.）酶学法，化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。11.DNA含量分布线性直方图的分析1.）利用PI对细胞核DNA进行了荧光染色；2.）X轴代表了细胞DNA相对含量，Y轴代表了细胞数；3.）第一个峰由G0/G1细胞组成，即正常二倍体细胞，大多数细胞处于这一期；第二个峰由G2/M细胞组成，即四倍体细胞4.）G0/G1峰左边的低道上可出现亚G1峰，是凋亡细胞、细胞碎片、杂质等造成的；G2/M峰右边的高道上也可出现一矮峰，是由多倍体及细胞团块等引起的。\n12.细胞凋亡散点图的分析1.）PI标记DNA，AnnexinV标记PS；2.）X轴为AnnexinV-FITC，Y轴表示PI；3.）LL：正常细胞，PI(-),AnnexinV(-)LR:早期凋亡细胞，AnnexinV（+），PI（-）UR：晚期凋亡细胞，AnnexinV（+），PI（+）UL：细胞膜完全破坏消失，AnnexinV（-），PI（+）13.简述显微分光光度计的测量原理朗玻－比尔定律（吸收光度测量术）一束平行的单色光透过嗜色液体时，其光强度随该液体中嗜色物质的浓度与光程呈指数形式衰减，即I=I。*e-εcd适用条件：入射光为单色光；平行光入射；被测物为均匀稀溶液无折射、衍射，测量光按入射方向透射。14.简述共聚焦的原理（光源点,物点,像点，三点共轭）（完整版）共聚焦指在显微镜光路中,采用双针孔(Pinhole)装置的独特设计,形成物像共扼,即光源点、物点和象点完全对应，最终获取一个象素的光强度信息。共聚焦原理：利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连续光切图像。LSCM的原理：以激光为光源，结构上采用双针孔装置，形成物象共轭的独特设计，激光经过聚光镜焦平面上针孔形成点光源再经物镜在焦平面对样品逐点扫描，样品上每个照射点经反射镜在像焦平面的探测针孔处成像，经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品不同焦平面发射来的干扰荧光，被光电倍增管或冷电感耦合器件探测器接收，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面共聚焦图像。其特点：激光聚焦在针孔处形成点光源，探测针孔处形成光点图象；扫描后获得信噪比极高的光学横断面，分辨率提高1.4倍；可无损伤地对样品作层扫描和荧光强度测量,重建后能得到样品的三维立体结构。15.简述激光扫描共焦显微镜与荧光显微镜的差别。它有哪些优缺点？LSCM荧光显微镜光源激光（紫外光、可见光、近红外）短波场光源（多为紫外光）照明方式点照明、逐点扫描落射式样本信号焦平面的样本信号，几乎无干扰可有多个平面的样本信号伴随相邻部位次级荧光干扰图像采集系统荧光信号被PMT或cCCD探测器接收照相机的原理实时观测，数字化图像，可以进行图像处理和定量分析LSCM的优点：荧光检测快、穿透力强、激发光强度精确控制、光漂白和荧光淬灭作用小；分辨率高、灵敏度高、有良好的信噪比；对细胞检测无损伤、精确、准确可分层扫描；重复性好,数据图象可及时输出或长期储存；能定时,定位,定性和定量测量。LSCM的缺点：荧光激发能量随电流变化改变；容易造成伪象；光电倍增管接收信号,数字图像原图是黑白的,合成图像是伪彩色；静态及荧光较强的薄片效果较差。16.简述显微图像分析处理的基本过程,图像分析处理能解决哪些生物医学测量问题?基本过程：1、图像输入（确定输入条件）2、图像增强---去除原图中各种噪声和畸变，改善图像质量。以利于图像特征提取和图像识别。（图像质量改善）3、图像分割---根据图像的结构特征，选取灰度阈值，以黑白二值图分离出感兴趣的对象物，以便进一步做图像识别和分析。4、图像整理---即图像二值化处理，通过图像整理，清除不感兴趣的对象，保留最终所需的待测物的黑白图像（可伪彩色编码）5、图像识别处理和测量6、数据分析应用：1、几何形态参数:如细胞的面积，周长，长短轴，直径，形态因子和核浆比等，可多参数同时检测。2、灰度参数：检测待测物颜色深浅的表达程度,通常是半定量测量。如酶标记,原位杂交等。3、密度参数：可分别测量面积密度(面积百分比)和数量密度(数量百分比),常用于待测物质的阳性表达率分析，免疫组化，银颗粒分析等，属于定性和半定量分析。4、定量分析\n细胞经免疫组化特殊染色后，可以测定细胞的DNA，RNA和蛋白质等相对含量和精确含量。细胞或组织经荧光标记后，可以对其荧光光通量作精确的定量分析，如钙离子，溶酶体和DNA荧光标记的含量分析，由于标记方法的不同，还可作多荧光标记的分析测量。几何形态检测；显色程度表达；密度分布检测；定性分析和定量分析17.电子束:即电子射线，电流通过电镜镜筒顶部的电子枪内的灯丝时释放电子，电子在栅极和阳极的作用下形成短波长高能电子束。电子束带负电荷，具有光的波动性和可折射性，电镜就是利用电子束作为“光源”来实现成像的。分辨率:用于表示人的眼睛和光学仪器，能够辨别两点之间最小距离的标志，分辨率是衡量电镜性能的重要指标。二次电子:在入射电子的轰击下，样品表面5-50nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称扫描电镜。电子显微镜:电子显微镜是以电子射线作为照明源，以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍率的显微镜，电镜用于研究组织和细胞的超微结构透射电子:当样品的厚度小于100nm时，部分入射电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的称透射电镜超薄切片:将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称为超薄切片，超薄切片经电子染色后在TEM下观察组织细胞内部的超微结构。immuneelectronmicroscopy:免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。18.如果你的课题中需要了解细胞内部的超微结构变化，请问你应选择哪种类型的电镜，为保证样品良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意什么？如果是培养细胞，细胞数量一定要达到多少？了解细胞内部的超微结构变化应选择TEM。为保证良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意做到快、小、轻、冷。快：在1分钟内固定组织，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。小：组织块必须切成1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象。轻：不要牵拉、锯、挤压组织。要用锐利的刀片，避免细胞受到损伤。冷：低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。如果是培养细胞，细胞数量一定要达到1×10719.要想获得一张理想的电镜图片，每个制样环节都很重要，尤其是取材和固定极为关键。在透射电镜样本取材时，样本不可大于1mm3，并在1分钟以内完成固定。请问如果组织块过大会出现什么后果？没有及时固定的组织电镜下会出现何种改变？由于电镜固定液戊二醛对组织的穿透能力较弱，如果组织块过大会造成组织中心得不到及时固定，在电镜下没有得到及时固定组织细胞的细胞器会发生变性，特别是对缺血乏氧十分敏感的线粒体会出现肿胀和空泡变性等改变。20.扫描电镜用于观察组织表面形貌，取材时必需要充分暴露组织的表面结构，请问取材时注意事项有哪些？在样品取材时必须充分暴露并保护好观察面，避免损伤要观察的部位，易卷曲的样品,如气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓冲液仔细漂洗干净。21.什么是血管灌注固定？为什么脑、心肌、肾脏等组织要进行灌注固定取材？在样品制备过程中为什么要进行半薄切片定位？血管灌注固定是通过血管灌注适量的固定剂，在动物体内把活细胞在原位及时固定。血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体或死亡后缺氧引起自发性的变化影响，特别是对脑、心肌、肾脏等对缺氧比较敏感的组织尤为重要。半薄切片的意义在于：1选取超薄切片的部位，超薄切片的面积一般要小于0.5mm2，要经过半薄切片来选取有意义的部位。2对同一部位进行光、电镜对比观察，在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质，有利于更确切的认识超薄切片中的结构及其相互关系；3用于图像分析，统计学处理。22.如何描述一张电镜图片？1细胞整体大小、形状、细胞膜和突起以及细胞间的连接2细胞核大小、形状、核仁、染色质等3细胞质各种细胞器的数量、分布、形状等Mit、RER、Ri、Ly、Gol….4其他23.电镜的主要类型和特点TMESEM分辨率0.1nm0.6nm放大100万倍80万倍成像透射电子信号利用二次电子信号成像\n样品制备制成超薄切片等，制备过程复杂方法较简单，标本可大而厚图像特点二维结构，平面图像三维结构图像，立体感强应用观察组织细胞内部的超微结构观察样品表面及其断面立体形貌24.变性、复性、探针、靶分子（名词解释）变性：双链DNA分子在一些因素作用下两条链解离的过程称为变性复性：变性的两条互补DNA单链在适当条件下重新缔合成双链的过程称为复性探针：原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子）。主要有cDNA、RNA和寡核苷酸三种。靶分子：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列25.简述ABC方法的原理亲和素与生物素偶联的过氧化物酶组合成亲和素－生物素－酶复合物①特异性抗体（一抗）先与组织细胞中的抗原结合②生物素化抗体（二抗）再与一抗结合③复合物与生物素化抗体结合26.简述标记链球菌亲和素-生物素技术（LSAB法)的原理①特异性抗体（一抗）先与组织细胞中的抗原结合②生物素化抗体（二抗）再与一抗结合③亲和素联接的过氧化物酶与生物素化抗体结合27.免疫细胞化学反应原理把组织细胞中的特异分子作为抗原,用在显微镜下的可见标记物(或标记抗原抗体复合物)标记特异抗体,使特异的免疫化学反应具有可见性，从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。28.原位杂交技术中如何应用了其他几种细胞化学技术？原位杂交技术中，先将标记的核酸探针与组织细胞中靶核酸分子结合形成杂交体，这是分子生物学技术；然后用同位素或免疫细胞化学技术探测杂交体，如用地高辛标记核酸探针，杂交后用碱性磷酸酶联结的小鼠抗地高辛抗体与探针结合，这里应用的是免疫细胞化学技术；为了使酶可见，再加入其底物四唑氮蓝和吲哚酚，最终形成蓝紫色物质，这就是酶细胞化学技术。这样，通过酶细胞化学最终产生蓝紫色物质，间接探测了酶的定位，又通过酶联抗体与探针的免疫组化反应，间接探测了探针，进而间接探测了靶核酸的定位。29.原位杂交技术的原理使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交,再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。30.APAAP法（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法）以碱性磷酸酶为标记物,通过与其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法）一抗与组织抗原特异结合，二抗又将PAP复合物与一抗连接在一起，然后加入HRP的天然底物H2O2和捕捉底物DAB；光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)，电镜-与锇酸反应，呈高电子密度锇黑（超微结构定位抗原）。31.细胞培养（cellculture）：从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。培养细胞的优势：培养条件易于改变并能严格控制，便于独立或联合研究多种影响因素；便于使用各种技术和方法研究和观察细胞的变化；长期存活和传代，便于研究和观察细胞遗传性的改变；大量提供遗传性状等条件相同的细胞。培养细胞的特点：对环境适应差；容易污染；对营养要求高；可能失去原有的形态功能特征；大部分需要附着载体生长。32.差速离心(Differentialcentrifugation)原理：通过一系列递增速度的离心，依次将大小不同的颗粒逐级分离。分离密度不同的细胞组分用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞结构成分特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心；操作简单；分离纯度不高。密度梯度离心理想的溶液介质：形成的溶液密度范围大；粘度低；对细胞成分损伤小；离心分离后容易去除；浓度容易测定；便宜。1.移动区带离心法（moving-zonecentrifugation）原理：用梯度蔗糖或甘油作为介质，将要分离的样品放在介质表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。介质密度逐渐增高用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器特点：介质为密度梯度溶液，且密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度(rp>rm)；必须注意离心时间(t)，不能使所有颗粒都沉到管底。\n1.等密度离心法（isodensitycentrifugation）原理：离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成一系列区带，然后从管底收集。用途：分离密度不等的颗粒，适用于病毒、DNA、RNA、蛋白质等。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度(rp