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应用与环境生物学报2006,12(5):693～696ChinJApplEnvironBiol=ISSN10062687X2006210225高效染料降解真菌的分离3及其在印染废水生物处理中的强化作用33傅春堂张甲耀郑金秀赵磊柳娟(武汉大学资源与环境科学学院武汉430072)摘要用选择培养基从污水处理厂污泥中筛选出能降解3种染料(OrangeⅠ,OrangeⅡ和酸性大红)的菌株.通过梯度驯化,优选出1株适应能力强、活力旺盛的菌株F2,初步鉴定为腐霉菌.以OorangeⅡ为模式染料,比较不同培养基对降解的影响,发现PDA培养基最合适.通过对降解产物的紫外可见光谱分析,发现腐霉菌F2能彻底降解染料,并优先降解简单结构.另外通过用该菌株作为外源菌强化原染料废水处理的混合菌群,得到良好的处理效果.图5参10关键词真菌;染料;降解;生物强化CLCX172IsolationandEnhancedActionofPredominantFungi3inBiologicalTreatmentofDyingWastewater33FUChuntang,ZHANGJiayao,ZHENGJinxiu,ZHAOLei&LIUJuan(CollegeofResourcesandEnvironmentalScience,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)AbstractThestrainsthatcandegradethreekindsofdyes(OrangeⅠ,OrangeⅡandGreatAcidRed)werescreenedfromthesludgeofwastewatertreatmentplantwithaselectedmedium.Throughgradientacclimation,strainF2withstrongvitalityandgoodadaptabilitywaschosenanditwasidentifiedasPythiumsp.WhenOrangeⅡwasusedasmodeldye,PDAmediumwasfoundthebestbycomparingtheeffectsofdifferentmediaondegradation.TheproductsofazodyedegradedbyF2werede2terminedbyUV-visiblespectraassay,anditwasfoundthatthedyewascompletelydegradedbyF2andthesimplepartswerepreferentiallydegraded.Whendyewastewaterwastreatedusingbiologicalmethod,strainF2wasaddedasextraneousstraintoenhancetheoldsystemtoachieveabetterresult.Fig5,Ref10Keywordsfungus;dye;degradation;bioaugmentationCLCX172印染废水采用常规生物方法处理难以达到排放标准.目前较少比例存在.实际过程中保证其它菌种绝对不侵入显然很困通过筛选可用于生物强化的微生物改善传统生物处理法,成为难.为保证真菌在污水处理中长期的发挥作用,国外一些科学[1～6][7]一条新途径,也是一种发展趋势.由前人的研究可以看出,家已开展了一些研究.1999年,Leidig等用聚乙烯醇包埋多数能对染料废水脱色的细菌都是在厌氧条件才能进行,并且白腐真菌,但随着菌体的生长,会逐渐挣开包埋它的聚乙烯醇[8]大多数具有脱色活性的细菌不能以染料及其降解产物为唯一小球.2003年,Libra等用同样的菌种,将菌种的生长和处理碳源.对于占染料80%以上的偶氮染料,筛选的高效细菌通过废水两个过程分开,利用生长产生的粗酶液处理废水,结果酶产生偶氮还原酶对其进行还原脱色,而产物是有致癌性质的芳的活性急剧下将.目前采用控制C/N比和pH值等条件可使真[9]香胺,因芳香胺没有被降解而对环境有着很大的危害性.而真菌生长占优势,但这样会影响真菌对污染物的降解能力并菌由于酶系全,降解染料的酶主要存在细胞内,而且不受染料影响其与其他菌群的协同作用.因此,提高有高效降解能力的的诱导,在细胞内能稳定地表达,从而对染料降解的稳定性好.真菌在混合菌群中的生存能力,研究如何创造一种真菌和细菌因此,筛选高效广谱的对染料能脱色和降解的真菌具有重要的混合共存的环境,使真菌和细菌各自在降解污染物方面的优势理论和实用价值.得到协同发挥有着重要的实际应用价值.真菌在对染料的降解能力方面有其独特的优势,但也存在本文在筛选高效降解真菌的同时,通过实验分析了真菌降普遍的弱点.真菌一般生长缓慢,一旦细菌或其他菌种进入体解染料的独特优势.在用外源真菌强化原有菌群处理染料时得系就会快速利用营养物质而排挤真菌的优势地位.一个以真菌到良好效果,为在环境条件下利用真菌强化处理印染废水奠定为主的开放系统长期连续运转后,真菌会从系统退化消失或以了基础.收稿日期:2005204219接受日期:20052052301材料与方法3国家自然科学基金资助项目(No.20277029)SupportedbytheNa2tionalNaturalScienceFoundationofChina(No.20277029)1.1培养基33通讯作者Correspondingauthor(E2mail:jyzhang0551@126.com)所用培养基为改进马丁氏培养基、PDA培养基、选择培养\n694应用与环境生物学报ChinJApplEnvironBiol12卷基和无机盐培养基。选择培养基的基础配方为:(NH4)SO4330℃静态培养48h.按1.5中方法取样,离心后于485nm处测g,KH2PO40.5g,Na2HPO40.5g,MgSO4·3H2O0.3g,微量吸光度,计算脱色率.元素溶液1mL,H2O1000mL,pH7.5.微量元素溶液配方1.7降解产物的紫外可见吸收光谱分析为:FeSO4·7H2O0.5g,MnSO4·H2O0.15g,ZnSO40.14g,按1.5中接种菌株于PDA培养基中、培养4d,加染料Or2CaCl20.2g,H2O1000mL.angeⅡ,分别于0h、5h、4d后取样.利用UV-1601紫外可无机盐培养基为上述选择培养基中加入0.5%的葡萄糖.见分光光度计(Shimaduz,日本)对样本在220～800nm之间进在选择培养基中加入染料,即可得到以染料作为唯一碳源的选行紫外可见吸收光谱扫描.择培养基.1.83种降解系统的构建1.2染料向装有100mLPDA培养基的锥形瓶中接入筛选菌株的金橙Ⅰ(OrangeⅠ)和金橙Ⅱ(OrangeⅡ)购于上海化学5-1孢子悬液,接种量相当于10mL.向装有100mL无机盐培养试剂三厂,酸性大红GR由中国人民解放军第三五四五工厂提5-1基的锥形瓶中接入混合菌悬液,接种量也相当于10mL,两供.其中OrangeⅡ的结构式见图1.-1者于30℃,100rmin的摇床中培养48h.将培养2d的菌液用对应的培养基稀释10倍,各取100mL加入0.02g的OrangeⅡ,构建出真菌降解系统和混合菌群降解系统.另将上述稀释的培养物各取50mL混合,加入0.02g的OrangeⅡ,构建引入外源真菌强化的混合菌群降解系统.上述3种降解系统各设3个平行样,每12h取样,10000r-1min离心10min后于485nm处测吸光度,最后计算脱色率.图1金橙Ⅱ结构式Fig.1ChemicalstructureofOrangeⅡ2结果与分析1.3菌种的分离2.1菌种的筛选与鉴定活性污泥取于武汉市二郎庙污水处理厂.将上述染料浓度菌株在PDA培养基上生长,呈白绒毛状,类似棉花.在显为100mg/L的选择培养基100mL装于250mL的锥形瓶中,微镜下,菌丝无色透明、无隔多核、有分枝.孢子囊呈管状和球接入3g活性污泥,置于摇床中30℃,100r/min振摇,每2d状,没有孢囊梗的分化.孢子为游动孢子,常为肾形,侧面凹处取一次样.于染料浓度为100mg/L的固体选择培养基平板上生两根鞭毛.经染色鉴定,属于腐霉属(Pythium),菌编号为划线分离单菌落,再接种于浓度为100mg/L的另一种染料的F2.选择培养基平板上.选取分别在3种染料条件下都能生长的单2.2培养基对F2菌株脱色率的影响菌落接入OrangeⅡ浓度为200mg/L的选择培养基平板上继5-1接种量10mL、静态培养4d后,投加染料24h后测脱续筛选,获得1株能以高浓度染料作唯一碳源、对染料降解能色率,得到以PDA培养基、马丁培养基和无机盐培养基为基质力、适应能力都较强的真菌,并采用常规真菌鉴定方法进行初的降解系统脱色率分别为25.13%、11.83%和2.64%.[10]步鉴定.用PDA培养基接种菌F2,培养1d后投加染料OrangeⅡ,1.4混合菌群的制备使染料浓度为200mg/L.每24h测一次吸光度,计算脱色率,取自襄樊市印染污水净化站的回流池污水,用滤纸过滤,结果见图2.将其过滤后滤液用孔径0.22μm的微孔滤膜抽滤,用生理盐水洗脱制成混合菌悬液.1.5不同培养基对降解的影响用接种环挑取无机盐培养基上生长的真菌,用无菌水配成孢子悬液.接入已灭菌的马丁培养基、PDA培养基、无机盐培5-1养基,每瓶中孢子的接种量相当于10mL.置于30℃下静态培养4d,无菌条件下加入染料OrangeⅡ,使染料浓度为200-1mg/L,24h后取样10000rmin离心10min,取上清液用二图2纯培养条件下F2菌株的脱色率次水稀释20倍于485nm处测吸光度.对于所考察的每一种情Fig.2DecolorizationofstrainF2understerilecondition况,同时进行3组平行实验,结果取平均值.2.3pH值对腐霉菌F2生长的影响利用降解效果较好的PDA培养基接入菌种,培养1d后通过比较不同pH值条件下的脱色率,结果见图3.图3投加染料,使染料浓度为200mg/L,每24h测一次吸光度,方结果表明,在pH5.0时脱色率最高,为88.6%.不过,在4.0～法同上.计算脱色率.脱色率(%)=(A0-A)/A0×100(A0:对9.0之间,脱色率都在65%以上,表明腐霉菌F2的脱色作用对照吸光度;A:样品吸光度).pH的适应范围较广,但可以看出,该腐霉菌更适应酸性条件,1.6不同pH值条件下菌株生长的情况pH值大于9以后该腐霉菌的生长和降解脱色均受到较大将等量菌分别接入pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、影响.9.0和10.0的含100mg/LOrangeⅡ的PDA染料培养基中,于\n5期傅春堂等:高效染料降解真菌的分离及其在印染废水生物处理中的强化作用695的混合菌群对降解高浓度染料有着明显的优势,后续降解能力较强,说明在降解的各步反应中外源真菌有效地强化了混合菌群不宜发挥作用的部分.没有用真菌强化的混合菌群初始脱色率较高,但继续脱色极缓慢,这可能是代谢过程中一些中间产物的积累造成继续降解脱色困难.混合菌群初始12h脱色中吸附可能占有很大比重.对于真菌纯培养的降解系统,从前面的实验知道,该系统可以完全降解染料,但由于缺乏菌群的协同作用而仅表现出真菌缓慢利用染料而脱色.图3pH值对OrangeⅡ脱色效果的影响Fig.3EffectofpHondecolorizationofOrangeⅡbystrainF22.4降解产物的吸收光谱分析菌F2培养4d后,0h、5h、4d降解产物在800～220nm之间进行紫外可见连续扫描,结果如图4.降解后紫外光区和可见光区吸光度全都降低,说明菌株F2对染料不仅仅是脱色,而是对染料进行了彻底降解,包括芳香胺结构.由于当中产物芳香胺的彻底降解,染料的环境危害性得到根本消除.在230nm以下和300nm以上都是降解4d后的吸光度低于降解5h图53种降解系统的脱色效果比较的,而在240～260nm之间出现降解4d的吸光度高于降解5Fig.5Comparisonofdecolorizationinthethreesystemsh的,这要从OrangeⅡ的分子结构来分析.OrangeⅡ上的碳结s1:混合菌群Mixedmicrobes;s2:真菌纯培养Funguspurified;s3:s1+s2构只有一苯环和一萘环结构,苯环的吸收峰集中在240～260nm之间,而萘环的吸收峰一部分靠近300nm,另外部分在2303讨论nm以下.苯环的结构简单,真菌优先降解苯环,只有苯环降解通过完成对菌株的筛选、降解性能的比较和菌株作为外源到一定程度后,萘环才开始降解.萘环的初步降解会产生新的菌强化混合菌群,可以得出:苯环结构,结果造成降解4d后吸收曲线在240～260nm处出(1)利用所需降解的有机物作为唯一碳源,并以该碳源的现新的高于降解5h的吸收峰.梯度培养基培养、分离、驯化降解菌株,这种方法有利于得到彻底降解染料的菌株,尤其是能降解中产物芳香胺的菌株.(2)两株菌在降解后并没有出现新的更高的吸收峰,说明已降解的部分得到较彻底的降解,没有大量中间产物的积累.(3)从实验结果看到,利用真菌强化混合菌群在处理高浓度染料废水方面有着明显的优势,因此在实际印染废水处理中,我们可以在二沉池活性污泥回流时先让其进入一个降解真菌增强池,通过控制C/N比和pH值等条件抑制细菌生长使真菌大量繁殖,然后再和印染废水混合进入曝气池.利用上述模式,我们可以通过回流和控制条件让真菌和其它菌物在短时间内通过共存、协同作用达到良好的处理效果,图4OrangeⅡ被F2降解前后的紫外可见吸收光谱Fig.4UV-visiblespectraofOrangeⅡbeforeandafterdegradationbyF2实现印染废水的低成本的深度处理.a:降解前Beforedegradation;b:5h后After5hours;c:4d后After4daysReferences1XuWD(徐文东),WenXH(文湘华),FuLY(付莉燕).Isolation2.53种降解系统处理染料的效果比较andcharacterizationofbacteriafordecolorirgofazodyeacidcomplex在测定吸光度的同时,每2d取培养物于显微镜下观察,blueRRN.ActaSciCircumst(环境科学学报),2002,21:127～132发现没有人为干预的情况下,6d后,引入外源真菌的混合菌2WongPK,YuenPY.Decolorizationandbiodegradationofmethylredby群中真菌的菌丝量减少,出现退化,对于营养物的减少和条件KlebsiellapneumoniaeRS～13.WatRes,1996,30(7):1736～1744的恶化,真菌的反映更为明显.3SuzukiY.Molecularcloningandofthegenecodingforazoreductase图5中s1表示混合菌群条件下,s2为真菌纯培养条件fromBacillussp.OY1-2isolatdefromsoil.JBiolChem,2001,276下,s3为用真菌强化的系统.从图5可以看出,引入外源真菌(49):9059～9065\n696应用与环境生物学报ChinJApplEnvironBiol12卷4DykesGATimnRG,vonHolyA.Azoreductaseactivityinbacteriaas2continuousculturesofPVAL-encapsulatedTrametesversicolorundersociatedwiththegreeningofinstantchocolatepuddings.ApplEnvironnon-sterilecondition.BioprocEng,1999,21(1):5～12Microbiol,1994(8):3027～30298LibraJA,BorchertM,BaintS.Competitionstrategiesforthedecolori25ChenBY.Understandingdecolorizationcharacteristicsofreactiveazozationofatextile2reactivedyewiththewhite2rotTrametesversicolorunderdyesbyPseudomonasluteola:toxicityandkineticsprocess.Biochemis2non2sterilecondition.BiotechnolBioeng,2003,82(6):736～744try,2002,38:437～4469GaoDW(高大文),WenXH(文湘华),QianY(钱易).白腐真菌6GhoshDK,MandalA,ChaudhuriJ.Purificationandpartialcharacter2在非灭菌条件下对活性艳红染料的脱色研究.BullSci&TechnolizationoftwoazoreductasesfromShigelladysenteriaeType1.FEMSMi2(科技通报),2004,49(10):1009～1010crobiolLett,1993,98:229～23410王家玲.环境微生物学实验.北京:高等教育出版社,1998.1～627LeidigE,PrusseU,VorlopKD.BiotransformationofpolyR-478by第五届国际纺织生物技术学术会议国际纺织生物技术学术会议(InternationalConferenceonTextileBiotechnology)是一个国际性系列学术会议,是纺织生物技术这一交叉学科领域内规模最大、最具影响的国际会议,主要以促进现代生物技术在纤维与纺织工业应用为目标,为加强该领域的国际合作与交流,推动国际纺织生物技术的发展发挥着重要作用.首届会议于2000年在葡萄牙举行,之后分别在美国、奥地利和韩国举行了第二、三、四届会议.第五届会议由江南大学、东华大学、天津工业大学、苏州大学、浙江理工大学以及中国纺织工程学会、中国生物工程学会联合主办,于2007年10月21～24日在江苏无锡召开.本次会议共设六个方面主要论题,分别为酶学、合成纤维生物技术、纤维素纤维生物技术、蛋白质纤维生物技术、纺织废水及废弃物生物处理以及前景与展望.会议将邀请到本领域国际知名学者出席会议,并就纺织生物技术的发展及前沿问题作特邀报告,会议将面向国内外进行论文征集,并由专家审阅后推荐在EnzymeandMicrobialTechnology、BiotechnologyJournal等国际知名刊物上发表.具体论文稿件要求、提交方式、截止时间以及其他会议详细信息请参见会议网站:http://intb07.sytu.edu.cn/.