(生物学)DNA亲子鉴定 36页

DNA亲子鉴定杨帆石慧夏敏何妮妮武荣梅黄梦霞\nTextTextTextTextTextDNA亲子鉴定程序DNA分子标记技术的发展亲子鉴定的发展DNA亲子鉴定定义DNA亲子鉴定原理\n1、亲子鉴定的发展滴骨/滴血验亲ABO血型鉴定DNA亲子鉴定\n1.1滴骨/滴血验亲三国时代（220~280年）谢承著《会稽先贤传》中载有："陈业之兄渡海殒命，时同死者五、六十人，尸身消烂而不可辨别，业仰天泣曰：“吾闻亲者血气相通！”因割臂流血以洒骨上，应时沁人。余人皆效而滴血，笱其至亲，皆沁人无异”。这是滴骨验亲的最早记载。宋代伟大的法医学家宋慈将此法收入名著《洗冤集录》（1247年），另外还介绍了活人之间的亲权鉴定，谓：“亲子兄弟，或自幼分离，欲相识认，难辨真伪，令各刺出血，滴一器之内，真则共凝为一，否则不凝也”，此即合血法。\n1.2血型鉴定自1900年Landsteiner发现ABO血型后，从此人类发现了红细胞血型系统。随后几十年，许多科学家又发现了如NN(1927年)、Rh(1939年)、HP(1955年)、GM(1955年)、HLA(1958年)等多种在遗传上各自独立的血型。欧洲国家测定血型进行亲权鉴定始于1920年,美国纽约做父权测定始于1935年，中国现代法医学奠基人林几教授1927年就应用血球凝集现象进行父权鉴定。\n1.2血型鉴定ABO血型鉴定的原理是根据红细胞上有或无A抗原或/和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。可利用红细胞凝集试验，通过正定型（血清试验）反（细胞试验）定型准确鉴定ABO血型。所谓正定型是用已知抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原，所谓反定型是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗A或抗B。\n1.2血型鉴定血型与亲子关系对照表亲代子代可能子代不可能A型+A型A型、O型B型、AB型B型+A型A型、B型、AB型O型无B型+B型B型、O型A型、AB型一方或双方是AB型A型、B型、AB型O型A型+O型A型、O型B型、AB型B型+O型B型、O型A型、AB型O型+O型O型A型、B型、AB型\n1.2血型鉴定上个世纪70年代，人类的白细胞血型亲子鉴定在世界普遍采用，使亲子鉴定的质量得到大大提高，准确性达到了80％。白细胞抗原(HLA)，俗称白细胞血型，一般是相对于红细胞血型来说的。最主要的红细胞血型就是ABO血型和Rh血型，通常输血这些血型吻合就可以了。但对于骨髓移植、造血干细胞以及器官移植，必须要白细胞抗原吻合才行。白细胞血型是人类高度多态性遗传标记，其各种表现性的组合高达数万种，仅是白细咆血型系统的亲子鉴定能力，就已远远超时已发现的红细胞血型的总和。\n1.2血型鉴定传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血清型和红细胞酶型等，但这些遗传学标志均为蛋白质或多肽，容易失活而导致检验结果不理想。此外，这些遗传标志不能反映DNA编码区的多态性，且存在生理性、病理性变异(如A型、O型血的人受大肠杆菌感染后。B抗原可能呈阳性)。因此，其应用价值有限，亲子鉴定并不能按照血型来鉴定。\n1.2血型鉴定血型检验结果亲代与子代的血型与遗传规律相矛盾，便可排除亲子关系；测定的血型系统越多，排除亲子关系的概率越高。测ABO、Rh及MNSS等血型系统，否定父权的机率只有60％左右。我国从80年代开始将白细胞(HLA)分型用于亲权鉴定，大大提高了否定父权的机率，联合测定红细胞血型，亲权否定的机率可达97.21％；再联合检测几种血清型与红细胞酶型，可达98.95％。在鉴定过程中，要注意遗传变异的问题，防止错误否定亲权。\n1.3DNA亲子鉴定1985年，英国遗传学家杰夫列斯首先发现了DNA指纹，并第一次用此技术鉴定了英国移民局委托的申请移民案。他们发现，每个人DNA(脱氧核糖核酸)的特殊片段——随体DNA都不一样，就像指纹一样。随体DNA为含有不同复制数的某些重复序列的DNA片段，由于这样的DNA片段数目很多，在不同的个体中长度又不一样，而且是按孟德尔定律遗传的，因此，它们构成了一个人认定父母的理想的“指纹”。\n1.3DNA亲子鉴定随着科学技术的发展和进步，如今DNA分型已取代血型系统来做亲子鉴定。特别是利用PCR技术，DNA亲子鉴定不仅精度大大提高，使亲子排除的准确率达到100%,亲自认定的标准率也接近100%。而且，由于每一个人不同组织中细胞含有的DNA都相同，故取材十分简便，只要是人体的一滴血、一滴精液、一根带毛囊的头发或是米粒大的人体组织，均可进行鉴定。\n2、DNA亲子鉴定的定义DNA亲子鉴定就是利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系，也叫亲权鉴定。\n3、DNA亲子鉴定的原理DNA鉴定结果十分准确，主要是因为：(1)每个人具有的遗传物质DNA都具有惟一性，就像指纹一样互不相同。(2)每个人细胞核的DNA都来自父母双方，如果父亲的两条基因和母亲的两条基因中各找到一条与孩子相同的基因，就证明了他们之间存在亲子关系。\n4、DNA亲子鉴定的程序DNA是从几滴血、腮细胞或培养的组织纤内提取而来。将DNA样本切成小段，用电泳槽推动DNA小块使之分离——最小的在最远，最大的在最近。使用特别的DNA探针去寻找基因。相同的基因会凝聚于一起，然后，利用特别的染料，在X光的环境下，便显示由DNA探针凝聚于一黑色条码。小孩这种肉眼可见的条码很特别——一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。这过程重复几次，每一种探针用于寻找DNA的不同部位并形成独特的条码。用几组不同的探针，可得到超过99.9％的分辨率。\n5、DNA亲子鉴定的具体步骤第一步：DNA提取把样本细胞核中所含有DNA提取出来，然后进行一定的纯化，化除样本中的杂质。第二步：PCR扩增在PCR仪上进行PCR扩增，把我们所需要的片段通过酶促反应大量复制，放大到通过某些专用仪器可以看到的程度。\n5、DNA亲子鉴定的具体步骤第三步：后PCR反应这一步主要是上测序仪检测的准备阶段，将双链的DNA打开，加一些检测用的的内标，主要是用来标记检测的片段长度。第四步：毛细管测序仪检测由于DNA带有电荷，通过毛细管电泳的方法，不同片段DNA长度的电泳速度不同，在同样的电压，同样的电泳时间下，泳动的距离不同，这些长短不同距离可以通过前期加入的内标测量分辨出来，同时可通过一定的软件显示在电脑上，方便检测人员处理和分析数据。第五步：分析数据，出具报告主要是检测人员将所得结果进行分析汇总、计算，然后出鉴定结论和报告。\n6、DNA分子标记技术的发展DNA指纹图谱的产生1980年，Wyman与White在人类基因组DNA的研究中发现了一个高度变异位点(Hypervariableloci)，从而导致了DNA指纹技术的出现及其应用。此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区。1985年，英国莱斯特大学遗传系的Jeffreys用人的肌红蛋白基因内含子高变区重复序列的核心作为探针，从人的基因库中筛选出8个小卫星的重组克隆。尽管这8个小卫星的重复单位的长度(16～64bp)和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列。\n6、DNA分子标记技术的发展他们用小卫星33.15做探针，与人基因组酶切片段进行Southern杂交，在低严谨条件下杂交产生由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上，产生的带的位置是千差万别的。随后他们用另外一个小卫星探针33.6进行测试，获得了类似的图谱。所产生的图谱在不同个体之间均存在明显差异性，与人的指纹相似，表现出高度的个体特异性。因此称为DNA指纹(DNAfingerprint)，采用的方法称DNA指纹技术(DNAfingerprinting)。\n6、DNA分子标记技术的发展DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是在DNA水平上遗传变异的直接反映。DNA分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制。DNA分子标记在经历了短短几十年的迅猛发展后，技术日趋成熟。现已出现的DNA分子标记技术有几十种，基本都是建立在RFLP、PCR和重复顺序的基础上的。\n6、DNA分子标记技术的发展第一代分子标记技术以Southern杂交为核心的分子标记技术，最具代表性的是发现最早的RFLP（RestrictionFragementLengthPolymorphis)标记。第二代分子标记技术主要分为两类：(1)第一类为基于PCR的DNA分子标记。根据所用引物的差异，该类标记又分为随机引物PCR标记—RAPD(RandomAmplificationPolymorphicDNA)标记，特异引物PCR标记—SSR(SimpleSequenceRepeats)标记和STS(Sequence—taggedSite)标记等；\n6、DNA分子标记技术的发展(2)第二类为基于PCR与限制性酶切两种技术结合的DNA标记，通过限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性—AFLP（AmplicationFragementLengthPolymorphism)以标记。第三代分子标记技术继前两代分子标记技术后，单核苷酸多态(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)被称为第三代DNA分子标记技术，单核苷酸多态是一种新型的DNA分子标记，已在遗传多样性评估中得到了广泛的应用，在动物个体识别方面有着广阔的应用前景。\n6、DNA分子标记技术的发展RFLP分析法RFLP是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后，含同源序列的酶切片段在长度上的差异。1974年RFLP作为遗传工具由Grodjieker创立，这是第一个被应用于遗传研究的DNA分子标记技术。限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生，用限制性内切酶消化基因组DNA后，将产生长短、种类、数目不同的限制性片段，这些片段经电泳分离后，在聚丙烯酰胺凝胶上呈现不同的带状分布，通过与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放射自显影后，即可产生和获得反映生物个体或群体特异性的RFLP图谱。\n6、DNA分子标记技术的发展作为第一代分子标记技术，RFLP指纹图谱具备很多优点，因为它由限制性内切酶切割特定位点产生，可靠性较高;依据DNA上丰富的碱基自然变异，不需任何诱变剂处理;通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异，在数量上无任何限制。到了80年代，随着PCR技术的出现与发展，PCR——RFLP技术应运而生，它提高了RFLP的分辨率，降低了技术难度，并且可用生物素标记探针代替放射性探针，避免了污染。\n6、DNA分子标记技术的发展但是RFLP技术相对而言操作烦琐费时，其次是具有种属特异性，且只适应单、低拷贝基因，限制了其实际应用，它最主要的缺点还是多态信息含量低。因此在个体识别上有很大的局限性。\n6、DNA分子标记技术的发展RAPD分析法RAPD技术是由Williams等首先创立的一种DNA分子标记技术，它是以PCR技术为基础分子标记技术，由一系列人工随机合成的寡核苷酸单链(一般为10bp)为引物，以所研究的全基因组DNA为模板进行PCR扩增，如果引物与某一片段的模板DNA具有互补的核苷酸序列，该引物就会与单链模板DNA相结合。假若引物结合位点在模板DNA的两条链上有互补的位置，并且引物3'端相距在一定长度范围内(约2000bp)，反应体系就可以把DNA片段扩增出来。扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，EB染色后检测多态性。这些扩增DNA片段的多态性就反映了基因组DNA相应区域的多态性。\n6、DNA分子标记技术的发展作为第二代分子标记技术RAPD具备PCR效率高，特异性强，样品用量少，检测比较容易以及引物设计随机的优点，可用于未知基因组序列的物种及种以下分类单元的鉴定。RAPD很适合对未知基因序列的野生动物DNA多态性的研究，构建其基因指纹图谱。另外RAPD技术需模板DNA的量很少，操作简便快速，可免去DNA标记中的克隆制备，多态性筛选，同位素标记等步骤。RAPD扩增带符合孟德尔遗传规律，因此也可用于亲子鉴定和个体识别。\n6、DNA分子标记技术的发展但在实验中由于RAPD随机设计的引物一般较短。因而对一些PCR因素更敏感，重复性较差，结果不稳定，一般来说，只有对于特定的仪器设备，对其反应条件反复进行优化，才可以得到较可靠的结果。\n6、DNA分子标记技术的发展AFLP技术AFLP由Zabean和Vos等1992年发明，并于1993年获得欧洲专利局专利。其技术的基本原理是对基因组酶切片段进行选择性扩增，具体是利用限制性内切酶切割基因组DNA，形成酶切位点不同、分子量大小不等的随机性酶切片段在其两端接上双链人工接头，形成接头的酶切片段，即DNA模板。利用特异设计的引物，经变性、退火和延伸周期性的PCR循环后，特异性片段被扩增出来，长度不同的扩增片段即多态性片段则可通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分子筛的作用进行检测。\n6、DNA分子标记技术的发展AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD与RFLP优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上。因此，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP标记。不过AFLP对基因组纯度和反应条件要求较高，当基因组的不完全酶切会影响到实验结果，所以对内切酶质量要求也很高。此外，AFLP分析试剂盒价格昂贵，引物的同位素标记又涉及到放射性安全问题。\n6、DNA分子标记技术的发展SSR技术上述的3种分子标记的发展为动物个体或群体识别提供了新的活力，同时也存在很多问题，而随后发展的微卫星标记由于其多态程度高、分布广泛、且在近缘物种问具有一定程度的同源性，因此，在个体识别和亲子鉴定中，被认为是准确性最好的一种检测方法。微卫星(Microsatellite),又称短串联重复序列(shortTandemRepeat，STR)或简单重复序列(SimpleSequencesRepeat，SSR)。\n6、DNA分子标记技术的发展1981年，Miesfeld等从人类基因组文库中首先发现了微卫星DNA。到1989年“Litt和Luty也扩增到了人类基因组微卫星序列，并把这种序列正式定义为微卫星。1992年Winter等报道，除着丝粒及端粒区域外，微卫星广泛地分布于染色体几乎所有区域，在哺乳动物中，几乎每个基因都存在一个微卫星标记。微卫星均遵循孟德尔共显性遗传方式。微卫星DNA一般以1—6bp为核心序列头尾相连排列而成，由于其重复单元及数目不同而使其呈现高度多态性，其中以单元(CA)重复最多。\n6、DNA分子标记技术的发展微卫星DNA既可用作探针获得指纹图谱，也可通过PCR方法进行微卫星位点多态性分析。研究发现微卫星由侧翼序列将核心序列特异地定位于染色体，该侧翼序列在物种问具有较高同源性。因此，可以根据微卫星两端的侧翼序列设计引物，进行PCR扩增以获得微卫星DNA指纹图谱。微卫星标记是目前应用十分广泛的一类DNA分子标记。与其他标记如RFLP，RAPD等相比，微卫星DNA具有多态性检出率高、信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果稳定可靠等优点，而且还可以克服RAPD，RFLP等标记方法把来自不同位点但大小相同的等位基因混淆的缺点。\n6、DNA分子标记技术的发展SNP技术1994年，单核苷酸多态(SingleNucleotidePolymorphism，简称SNP)这个术语第一次出现在人类分子遗传杂志上，随后在1996年，Lander第一次正式提出SNPs为新一代分子标记。简单地讲，它是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的替换而引起的多态性，包括单个碱基的转换、颠换及插入、缺失等形式。SNP在基因组内可以划分为两种形式：一是遍布于基因组的大量单碱基变异；二是基因编码区的功能性突变，由于分布在基因编码区(codingregion)，故又称其为cSNP。cSNP经常引起表达蛋白的多态性变异，有时会影响它们的功能特性。\n6、DNA分子标记技术的发展在遗传学分析中，SNP作为．一类遗传标记得以广泛应用，主要源于以下几个特性：首先，其位点丰富，SNP几乎布于整个基因组；其次，更加丰富的多态性以及比微卫星DNA更高的遗传稳定性；另外，随着微测序、DNA芯片、微阵(Microarray)等技术在SNP开发及检测上的应用，SNP的检测已达到了半自动化或全自动化。\nThankYou!