近代生物学研究技术 3页

1•三亲本杂交：实验中，将供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体中的质粒可以在协助菌的帮助下通过接合转移方式导入受体菌屮。由于所用供体质粒屮不含转移基因tra,所以，该接合转移必须有辅助菌株E.coli参加才能完成（辅助菌株中含tra基因），因此该接合转移过程称为三亲本杂交。2•电转化原理.影响因素：原理：电穿孔法即是在外加短时强电脉冲时，在细胞膜双脂层上形成瞬时微孔，使细胞膜的通透性增强，DNA等人分子得以进入细胞的一个工物物理过程。其细胞学原理是细胞处于电场中时.细胞膜起着电容器的作用。电流不能通过，随着电压升高，细胞膜组分被极化，并在细胞膜两边产生电位差。当电位差超过某一临界水平，细胞膜局部被击穿，形成一瞬时的孔洞，孔径人小足以让人分子物质进出细胞。只要电场强度和脉冲时间不超过临界限度，这种通透性就是可逆的。影响因素：⑴电学因素：当电容值固定时，转化子数H随电场强度升高而增加；在适当电场强度下，使用较大电容或电阻，则转化频率提高。但同时细胞存活数下降。⑵电介质：介质的离子强度影响脉冲时间，强度高则脉冲时间短，应采用低离子强度的电介质，避免转化时存在高盐浓度。⑶DNA浓度：转化细菌时,质粒DNA浓度在一定范围内，浓度增高与获得的转化子数星显线性关系。DNA浓度超过一定范围，则转化子数目的增加趋于饱和。⑷菌种及生理状态：①细菌中Gram阴性细菌比厚壁的阳性菌易于转化，真核细胞电穿孔的电场强度比细菌高；②转化效率和细胞的存活率与细菌的牛•长阶段冇关。对于多数细菌來说,在对数生长期，细胞对电场敏感，电激后细胞死亡率高，但存活的细胞易于接受外来DNA,所以用对数中期的细胞较为适宜。另冇少数Gram阳性菌则培养到稳定器时易于转化。3•质粒快速检测法：原理：不经抽提纯化等步骤,直接在凝胶点样孔中将质粒从菌体中分离：菌体先加溶菌酶和RNA酶,在冰上裂解菌体。再将己裂解点入含冇SDS凝胶带的琼脂糖凝胶中。SDS在碱性条件卜•沉淀菌体蛋白和带组蛋白的染色体碎片，沉淀留在点样孔中。质粒DNA不带蛋白质，得以释放，在电场作用下进入凝胶。注意事项：①供试菌株要充分活化，收集菌液不宜太浓；②裂解液添加适量，裂解时间在半小时以上，至菌液变清亮后方可点样；③在较低室温卜•操作；④避免剧烈抽吸、農荡、高温；⑤点样时不要冇气泡，不要溢出点样孔。4•光学显微镜性质：⑴放大倍数：与透镜的焦距成反比，与光学筒长成正比；⑵工作距离：物镜下透镜的下表面与载片物像的距离。物镜放人倍数愈人，工作距离愈小；⑶焦距：平行光线经透镜折射后的汇聚点与透镜中心的距离；⑷数值口径（NA）：其大小与显微镜的分辨率有关；⑸焦深：物镜视野中能清晰观察到物像的垂直范闱。一般随物镜放人倍数增加而减小；⑹分辨力：指分辨物体最小间隔的能力；⑺色差：系白色光经透镜后各单色光焦点不一致的现彖，一般町用一个含钙的双凸透镜和外包两个含铅的单凸透镜组成的消色差透镜校正；⑻球面像差：系入射透镜中部和边缘部分的光线折射后在不同的点上聚焦而产生，可用含多组透镜的消错透镜來校正；⑼像散：系透镜在成像过程中使物像在水平或垂直轴面上产生分散的现象；（10）慧形像差：系透镜在成像过程中产生慧形拖尾的现象；⑴）像场弯Illi：系透镜在成像过程中发牛•的像场弯Illi的现象；（12）畸变：系透镜在成像过程屮产生畸形像场的现象。4•相差显微镜原理、优点及使用方法：原理：相差显微镜一种将光线通过透明标木细节时所产心的光程弟（即相位差）转化为光强弟的特种显微镜。相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏代替可变光栏，用带和板的物镜代替普通物镜,并带有一个合轴调屮望远镜及滤色片。这些特殊装置能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅（明暗）之差，使人的肉眼能够辨认出來。相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长.运动、增殖情况及细微结构的观察。使用方法：①•依次将物镜换为相差物镜，聚光器换为相聚光器，并升至最高位置，并在视场光阑处加上黄绿色滤光片。②•将活体标本放在镜台上，把相聚光器调至10处，用1OX相差物镜观察并调节至物像清晰。③•将目镜换成合轴调整望远镜，把上透镜适当旋出并调节使相板上的亮环少暗环准确聚焦。④•调节相聚光器两侧的调节旋钮（或插入式调节杆），使亮环准确的与暗环重合。⑤•将合轴调整瑕远镜重新换为H镜进行低倍镂观察，并将物像调至视野中部。⑥•依次按②〜③的步骤进行20X,40X物钱和1OOX油镜观察。⑦•注总事项：a・一定要将聚光器升至最高位置；b・相差物镜与相聚光器一定婆匹配，否则无法使亮环•暗环重合；c•视野亮度应随物镜倍数升高而加大。5•荧光显微镜原理与操作方法：原理：标木物像内部的荧光物质或经荧光染料染色的标木经紫外光短波光激发后能发出一定波长的荧光，上述标本可以用荧光显微镜观察。常用的生物细胞内部的荧光物质主要有荧光索•和绿色荧光蛋白等。荧光染料主要冇金胺叮噪橙异硫鼠酸荧光黄、罗丹明B和荧光抗体等。使用方法：①•开启电源转换器上主开关后，再按卜•启动钮将汞灯点燃。②•先用普通光将待检样品在10X物镜下聚焦，根据检测对象的激射和荧光性质选择适合的激射光与分色片组合。③•关闭普通光，移动汞灯光路控制拉杆使紫外光射出，适当调节汞灯视场光阑，使之在视野中可见，再适当缩小孔径光阑使物像反差适当。观察\n完毕后将物像移至屮部依2、3介绍的方法作20X、40X物镜观察。④•进行汕镜观察时，应采用无荧光硅油，并在载片样而上部和聚光器上部（使用透射式荧光显微镜吋）均滴上硅油。6•显微操作术：在显微镜卞分离单个生物细胞、细胞器或从物理混合物中分离单一微小物体的方法称为显微操作法或显微操作术。7•荧光定量PCR原理及应用：原理：定屋PCR指佔算样本中的原始模板数。它是通过一定循环次数的PCR的扩增后，PCR产物量來判断品质的原始模板数。定量PCR是以PCR扩増为基础的，而PCR扩増是有规律可循的。定量一般是在PCR扩坍的指数期进行的。如果用No代表PCR反应中的原始模块数，N为扩增次数，那么扩增产物的初期直线增长：而经过-定循环次数扩增后，进入平台期。定MPCR就是在指数增长期实现对原始摸板定量的（备注：在指数增长期内N=No（1+c）n,如果知道扩增的产物最N及PCR扩增的效率c,便可知道原始模块No值。）荧光定量PCR技术融汇PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接PCR过程屮荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点，获得DNA模板的准确定量结果。应用：实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一•次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到菜个样木中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的堆因表达水平进行比较。除此之外我们不定期可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识別扩增产物和引物二聚体。以区分菲特异扩增；利用特片性探针进行基因型分析及SNP检测等。H前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病硏究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：①比较经过不处理样木Z间特定基因的表达差异（如药物处理.物理处理、化学处理等），及特定基因在不同相的表达差异。②比较正常组织与病理组织中各种mRNA表达量差异。③验证基因芯片实验结果。④验证RNAT扰实验结果。｛荧光定量PCR技术的两种检测模式：（DSYBRGreenI检测模式:SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。PCR温度循环为94〜55〜72°C三步法，只冇引物，无探针，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺入链小的SYBR荧光染料仅冇微弱荧光信号背景。该方法通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料结合，因此SYBRGreenI的检测灵敏度很高。但是，由于SYBRGreen【与所冇的双链DNA和结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测屋升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。山熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBRGreenIReal-TimePCR定杲结果。⑵解探针模式：温度循环为94〜60°C二步法，不仅冇引物，还冇另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对Z间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5’一3’外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液屮第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5,一3’夕卜切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5’一3‘外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带來差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求英高于6（）。C,这就使不同试剂盒Z间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。9•荧光定量PCR技术如何获得样品的起始拷贝数（相对标准曲线法）？所谓的实时荧光定MPCR,其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过-个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到-•条荧光扩增曲线。一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩坍阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩増的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只冇在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定ttPCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置匕但一般我们将荧光域值的缺省设置是3J5个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。定量荧光扩增曲线是荧光量少循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去木底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C⑴值就定义为荧光量与荧光阈值线交义时的循环数。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准川1线，英中横坐标代表CT值,纵坐标代表起始拷贝数的对数。因些只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样甜的起始拷贝数。10•宏基因组学：⑴环境宏基因组定义：不依赖于培养物的微生物群落基因组分析或环境微生物菌群的混合基因组分析。⑵宏蛋白组学：大规模鉴定在一个特定的时间，微生物菌群产生的整个蛋白质。确定样品中微生物的种类:收集样品一一提取DNA——构建16SrRNA文库一一测序分析。⑶构建宏基因组文库的过程：收集样品一一提取DNA一一葩切一一与载体连接一一转化一一筛选转化子一—确定基因。Z后对文库屮的DNA进行序列分析（测序，生物信息学分析，共他分析）和具冇特定表型的功能筛选。⑷基丁•活性（功能）的筛选：确定具有所需耍表型的克隆一一对选定的克隆进行序列分析和生化分析一一对冇\n用活性快速测定一一功能所需要的所冇基因都在一个克隆并在宿主细胞内表达。优点：能产生全新的基因或化合物；缺点：频率低下，工作量人。⑸基于序列分析的筛选：利用保守序列设计PCR引物或探针筛选整个宏基因纽文库以获得我们所感兴趣的克隆。优点：不依赖于某因的表达；缺点：选择性不好。⑹功能基因的筛选策略：①探索构建新的载体.扩大宿主范围等提高宏基因的表达水平；②通过富集特定类群的基因组提高冃标基因在文库中的频率.如在拟采样坏境中添加稳定同位索C标记底物，与底物降解冇关的微生物代谢活跃，C就进入到英基因组屮，捉取带C标记的DNA片段建库则町以获得较多的相关底物降解活性克隆；③开发DNA芯片和蛋白质芯片提高筛选频率；④随着技术的不断进步，宏基因组克隆必将成为微生物活性物质筛选的重耍手段并发挥巨大作用。11•酵母双杂交原理：酵母双杂交技术是一种直接在酵母细胞内检测蛋白与蛋白相互作用、灵敏性很高的遗传学方法。许多真核生物的转录激活因了由两个或两个以上的在结构上可以分开、功能上相对独立的结构域所组成的，其中有DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）,这两个结构域是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的BD口J以和基因的上游激活序列（UAS）结合，但不能激活基因的转录；单独的AD由于不能接近启动子，所以也不能激活转录。分别克隆编码BD和AD的基因到两个酵母表达载体上，构建成两种质粒。将编码蛋口质X和Y的圧因分别与BD和AD的妹因构建成重组妹因，在宿主菌中表达出融合蛋口BD-X和AD-Y,X、Y蛋白发生相互作用，则BD与AD在空间上的接近，形成冇活性的转录激活因子，激活报告基因的表达。