细胞生物学教程 30页

目录实验一显微摄影术实验二细胞凝集反应与细胞膜的渗透性实验三　线粒体和液泡系的超活染色与观察实验四　叶绿体的分离与荧光观察实验五石蜡切片法实验六 植物染色体标本的制备与观察实验七 动物细胞培养原代细胞培养传代细胞培养与观察\n实验一显微摄影术一、实验目的掌握显微摄影装置及其操作技术;独立完成显微摄影全过程二、实验用品1.器材:复式显微镜及其摄影装置、黑白胶片、显影罐、温度计、电炉、暗房袋、暗盒、相纸、剪刀、塑料盘、烧杯、量筒、天平、生物样品等2.试剂:①显影液(D72通用显影液):    用50℃蒸馏水150ml,先将小袋药粉溶解,再将大袋药粉放入,搅动至完全溶解,加水至250ml.待温度降至20℃左右时使用.②定影液:用50℃蒸馏水150ml将药粉完全溶解后,加水至250ml,待温度降至约20℃时使用.三、实验原理与方法显微摄影使通过摄影装置,拍摄显微镜视场中被检样品的光学影象的一种技术.具体实验步骤以简图表示如下:显微摄影装置的安装与调试显微镜的光路调整:通过调中,使照明光束与显微镜的光学系统的光轴合一.\n装入胶片取景聚焦暴光:1/15sec(应先测光:绿灯亮可以正确暴光)黑白胶片的冲洗:显影3min→停显10sec→定影15min→水洗:流水冲洗30min→晾干印相放大:取景聚焦→暴光→显影→停显10sec→定影15min→水洗:流水冲洗30min上光剪切四、实验结果与分析   独立完成摄影操作、上交一张照片并对所拍摄的样品加以简要说明;分析拍摄中应注意的主要问题及改进措施.实验二细胞凝集反应与细胞膜的渗透性一、实验目的：了解细胞膜的表面结构；细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞膜的速度。二、实验的原理：（一）细胞凝集反应细胞膜是由脂类双分子层镶嵌蛋白质构成的单位膜，而脂类和蛋白质又与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。\n凝集素是一类可逆结合特异糖基的蛋白质，具有使细胞凝集、血型鉴定、促进淋巴细胞分裂、防害抗虫等作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞外被的寡糖链相连接，起到“桥”的作用。（二）细胞膜的渗透性细胞膜是细胞与环境之间进行物质与能量交换的一种选择性通透屏障，可选择性地控制不同物质进出细胞，各种物质跨膜运输的方式是不同的，物质的通透性是由物质本身属性和膜的结构性质（如脂溶性、分子大小、所带电荷等）共同决定的；另外物质穿膜的通透性还要受到细胞生理状态和环境条件（如麻醉剂、热、辐射、pH值、盐不平衡等）的影响。渗入红细胞内的物质，增加了细胞内的渗透压，使细胞外的水分进入红细胞，细胞膨胀破裂，称为溶血。由于各种物质透入细胞的速度不同，溶血的时间不同。三、实验用品1.器材:显微镜、天平、载玻片、滴管、离心管、烧杯、10ml移液管、试管、试管架2.材料:土豆块茎3.试剂:２％鸭血红细胞、PBS缓冲液、土豆、0.17mol/L氯化钠、0.32mol/L乙醇等试剂四、实验方法(一)细胞凝集反应1２％鸭血红细胞悬液制备新鲜鸭血加ＡＣＤ抗凝剂，生理盐水洗５次，每次２０００r/min，离心５min，按红细胞压积用生理盐水配成２％鸭血红细胞悬液．\n2土豆凝集素制备    土豆２克，加１０mlＰＢＳ缓冲液，浸泡２h.3细胞凝集反应　　　        土豆凝集素　　　　１滴　　　        ２％鸭血红细胞液　１滴载玻片上混匀，静置２０min，镜检．４　对照　　　        ＰＢＳ　　　　　　　１滴　　　        ２％鸭血红细胞液　　１滴（二）细胞膜的渗透性１　低渗溶液　　　试管一支：　　　　　　　　鸭血红细胞液　　１ml　　　　　　　　ddH2O           10ml     轻摇混匀，观察颜色变化，若有溶血，记下自加入鸭血到溶液透明澄清的时间（注意结合镜检）．２　等渗溶液　　　0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸铵、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸铵、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮等８种溶液进行同样实验，步骤同上．\n五、结果与讨论1.简图表示血细胞凝集原理;2.以图表的方式记录细胞渗透性的实验结果并进行比较分析．实验三　线粒体和液泡系的超活染色与观察一　实验目的１　观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布；２　学习一些细胞器的超活染色技术．二　实验原理　　活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法.其目的是显示生活细胞内的某些结构,而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡.活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态.根据所用染色剂的性质和染色方法的不同,活体染色可分为体内活染与体外活染两类.体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内,染料的胶粒固定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的.体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料因其＂电化学＂特性与被染部分相互吸引被选择固定在活细胞的某种结构中而显色．但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用.\n詹纳斯绿Ｂ和中性红两种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性．詹纳斯绿Ｂ可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基.中性红对液泡系的染色具有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核和细胞质不着色,这可能与液泡中的某些蛋白质有关.三　实验用品１　器材：显微镜、恒温水浴锅、、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸２　试剂：①Ringer溶液氯化钠                      ０.８５g氯化钾                      ０.２５g氯化钙                      ０.０３g②1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5mlRinger溶液中,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤后,即为1%原液.取1ml1%原液加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,将其装入棕色瓶中备用.最好现配现用,以保持充分的氧化能力.\n③1/3000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50mlRinger液,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶中于暗处保存.临用前取1ml1%原液加入29mlRinger溶液,即得1/3000工作液,将其装入棕色瓶中备用.３　材料：　　　　　人口腔上皮细胞　　　　　洋葱鳞茎内表皮细胞　　　　　绿豆幼根根尖四实验方法（一）线粒体的超活染色与观察１　人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察载玻片于３７℃恒温水浴：1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液　　２滴　　　　　　　　　　　　人口腔上皮细胞黏液　　　牙签刮取染色１０－１５min，盖上盖玻片，吸去周围染液，显微镜下观察．　２　洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察载玻片于３７℃恒温水浴：　　　　　　　　　　　　1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液　　１滴\n　　　　　　　　　　　　洋葱鳞茎内表皮　　　　　镊子撕取染色１０－１５min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片，显微镜下观察．　（二）　绿豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察载玻片于３７℃恒温水浴：初生绿豆幼苗根尖（１－２cm）纵切面切片　　１片1/3000中性红溶液　　　　　　　　　　　　　１滴染色５－１０min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察．　五　结果与分析１　绘出人口腔上皮细胞洋葱鳞茎内表皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析；２　绘出绿豆幼根根尖细胞示液泡系的形态与分布并简要分析．\n 实验四　叶绿体的分离与荧光观察一　实验目的１　通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理与方法；２　了解菠菜叶绿体的形态、分布与数量．二　实验原理组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法．一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、密度、离心力及介质黏度等．同一离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒沉降速率不同．依次增加离心力和离心时间，就能使非均一的悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，从而可分批收集各种亚细胞成分．在等渗溶液中将叶绿体匀浆液在１０００r/min的条件下离心２min，去除其中的组织残渣和未破碎细胞，再在３０００r/min的条件下离心５min，即得沉淀的叶绿体．三　实验用品１　器材离心机、组织捣碎机、显微镜、天平、离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、载玻片、盖玻片２　材料新鲜菠菜３　试剂\n０.３５mol/L氯化钠溶液四　实验方法（一）叶绿体的分离与观察１　取新嫩菠菜叶，洗净檫干后去除叶梗和粗脉，称３０g于１５０ml０.３５mol/L氯化钠溶液中，装入组织捣碎机；２　利用组织捣碎机低速匀浆３－５min；３　将匀浆用６层纱布过滤于５００ml烧杯中；４　取滤液４ml在１０００r/min下离心２min，取上清；５　上清液３０００r/min，离心５min．去上清，沉淀即为叶绿体；６　０.３５mol/L氯化钠溶液悬浮沉淀；７　取叶绿体悬液１滴于载玻片上，加盖片：普通光镜下观察；（二）菠菜叶徒手切片观察新嫩菠菜叶斜切面　　　　　 　１片０.３５mol/L氯化钠溶液　　 １滴加盖片轻压：光镜下观察；五　实验结果与分析记录所观察结果并加以简要描述;\n实验五石蜡切片法一实验目的学习石蜡切片法,观察染色结果,了解其反应原理.二实验原理DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应.紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是发色团,因此具有颜色.对照组预先用热三氯醋酸处理,抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应,从而证明了Feulgen反应的专一性.三实验用品1材料Carnoy液固定的洋葱根尖切片2试剂①Carnoy固定液:3份95%酒精加1份冰醋酸;②1mol/LHcl:取比重1.18的浓盐酸82.5ml,加水至100ml;③Schiff试剂:先将200ml蒸馏水煮沸,由火上取下,加入碱性品红1g,充分搅拌溶解.待溶液冷至50℃时,过滤到磨口棕色试剂瓶中.加入1mol/LHcl20ml,冷至25℃时加入1g偏亚硫酸钠充分振荡后盖紧瓶塞,放于暗处过夜.次日取出,呈淡黄色或近于无色,加中性活性炭一匙,约0.5g,剧烈振荡1min,过滤后即得无色品红.外包黑布与冰箱内贮存.\n④亚硫酸钠水溶液(漂白液)10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml,蒸馏水100,5,摇匀,塞紧瓶塞.应现配现用,防止因SO2的逸出而失效.⑤0.5%固绿酒精溶液(95%酒精溶解)⑥5%三氯醋酸、四实验方法石蜡切片↓溶蜡二甲苯I                           (3-5min)↓溶蜡二甲苯II                          (3-5min)↓1/2纯酒精+1/2二甲苯                   (3-5min)↓纯酒精I                                (2-3min)↓\n纯酒精II                               (2-3min)↓95%酒精                                 (2-3min)                                    ↓83%酒精                                 (2-3min)↓70%酒精                                 (2-3min)↓                 对照组蒸馏水---------------------------------→5%三氯醋酸,90℃,15min∣实                                                 ↓∣验                                           70%酒精(2-3min)\n↓组                                                 ↓1mol/LHcl←-----------------------------蒸馏水(过一下)             ↓1mol/LHcl                              60℃,8-15min(水浴)↓Schiff试剂                             (60-90min)↓亚硫酸水(IIIIII)                      (各5min)↓流水冲洗                                (5-15min)↓蒸馏水↓\n0.5%固绿酒精溶液                         (1min)(此步注意防止过染)↓蒸馏水↓70%酒精↓83%酒精↓95%酒精↓纯酒精I↓纯酒精II↓纯酒精III↓透明二甲苯I\n↓透明二甲苯II↓封片(贴上标签,注明材料,反应名称,作者姓名及日期)显微镜下观察:            实验组:细胞核呈紫红色,核仁及细胞质呈绿色            对照组:因DNA被提取破坏,细胞核无紫红色五实验结果与讨论1验交Feulgen反应制片1张;2简图表示Feulgen反应的染色结果;3说明Feulgen反应中设立对照组的必要性.\n实验六 植物染色体标本的制备与观察一、实验目的学习植物染色体标本的制各技术，字握染色体的计数了解染色体的生物学意义二、实验用品1、材料洋葱根尖2、试剂1．Carnoy固定液2．0.1％秋水仙素溶液卡宝品红染液配方I原液A：称取3g碱性品红，溶于l00ml70％酒精中(此液可无限期保存)。原液B：取10ml原液A，加入90ml15％石炭酸(苯酚)水溶液(两周内使用)。染色液:55ml原液B加6m1冰醋酸和6ml37％甲醛(此液适用于植物原生质体培养中细胞核和核分裂的染色)。配方II:取配方I中的染色液2—10m1，加90一98m145％醋酸和1．8g山梨醇(此液适用于核核染色体的一般形态观察，具有广泛的适用性)。\n三、实验方法1.取材：切取o．5cm长的洋葱根尖部分。2.预处理：将切下的根尖浸入o．1％秋水仙素液中，室温下处理3—4h。也可把根尖浸入小烧杯内的自来水中，杯内加冰两小块，在0一4℃冰箱内低温处理24h左右。3．固定；取出根尖，投入carnoy液中固定2—24h，换入70％酒精，暂时保存。4.水解；把根尖投入预热的58—60℃lm01／L热Hcl中，恒温条件下水解14一15min。5．染色：去Hcl,加卡宝品红几滴，染色5—10min(也可在冰箱内染色12—24h)。6漂洗：吸去卡宝品红，用漂洗液换洗2—3次，每次1—2min。7．酶解；在载玻片上切取根尖着色深的部分，浸入小酒杯内1—2滴混合酶液中，室温下酶解40min左右或在28℃温箱中酶解20min左右。8．洗涤：吸去酶液，加蒸馏水，用吸管换洗几次，除去残留酶液后加入45％醋酸。9．压片：用吸管从醋酸中吸取材料，置干净载坡片上，材料周围保留半滴45％醋酸．盖上盖玻片，其上放一片吸水纸。左手指压住吸水纸的左边，右手指从吸水纸的左端向右方轻轻抹去。再用铅笔擦头从盖片上轻轻敲打，使细胞均匀散开。10．镜检：把压好的片子放显微镜下，先观察细胞分散状况和中期分裂相的多少，再检查分裂中期细胞中的染色体是否完全散开。如若染色体分散不好而难以分辨和计数，可取下片子，平放桌面上，用手指隔着吸水纸在盖玻片上稍施压力，如果操作细心，用力适度，便可很容易得到染色体分散良好的压片标本，供观察，计数和照相用。\n11．封存：压好的片子如果来不及观察或照相，必须进行暂时封存。封存时先在盖坡片四周各放麦粒大石蜡一块，然后用烧热的解剖针迅速熔化石蜡，使盖片四周严密封闭。封好的片于可放培养皿内湿滤纸上的火柴棒支架上，盖上培养皿，可放冰箱内保存2—3天。及培养的细胞或愈伤组织，经carborfuchzn染色，都能得到良好的结果。四、实验结果核分析验交压片标本1—2张，要求细胞分散均匀，形态完整，中期分裂相中染色体数目齐全，互不重叠，能够进行准确计数和照相。 \n实验七 动物细胞培养   细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。   细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等   为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。本实验分两次进行．即原代细胞和传代细胞的培养与观察。I．原代细胞培养一、实验目的：了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。二、实验原理\n原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织(或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9．9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。2、试剂平衡盐液：Hank液细胞消化液：常用的有0．25％胰蛋白酶(活性1：250)0．5％水解乳白蛋白—Hank液(简称乳汉液)犊牛血清4％NaHCO31000单位／ml青、链霉素液以上溶液均经适当包装，灭菌后备用。\n3、材料出生后2—3天乳鼠肾脏。四、实验方法1、操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在适合的位置，然后配制营养液及调节平衡盐液的pH值。(1)乳鼠肾细胞营养液的配制：0．5％LH液                    90％犊牛血清                     10％1万单位／m1青、链霉素            加至约100单位／ml7．4％NaHCO3                      调pH至6．8—7．0（2）平衡盐液—Hank液的调节：用7．4％NaHCO3                     调pH至6．8—7．02．迅速处死动物采用剪断动物颈动脉放血方法处死动物，然后用水浸湿体表的被毛(或新洁尔灭溶液)，将动物固定在解剖板上，使其背都向上，先用碘酒棉球消毒背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。3．取肾\n在腰部的后缘．用解剖镊提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤，将剪开的皮肤分别拉向两侧。此时，再换一把解剖剪及解剖镊，剪开背部的肌肉，暴露出腹腔，即可见到肾脏，用弯头眼科镊取出肾脏，置于无菌培养皿中。4．剪肾用眼科剪及镊将肾膜剪破，并将其剥向肾门，去肾膜及脂肪。用Hank液洗涤一次，将洗过的肾脏转入另一培养皿中。换一把眼科剪及镊，沿肾脏的纵轴剪开。去掉肾盂部分，将肾剪成数块，然后用Hank液洗涤—次。将洗过的肾块转移入无菌的青霉素瓶中。用弯头眼科剪将肾剪成1mm3大小的块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2—3次，直到液体澄清为止。5．消化及分散组织块将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5—6倍加入0.25％胰蛋白酶液(pH为7．6—7．8)、置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20-40min。每隔10min摇动—次青霉素瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。这时可从水浴中取出青毒素瓶，吸去胰蛋白酶液、此时再用Hank液洗涤2—3次。然后，加入少量乳汉液，用吸管反覆吹打组织块．直到大部分组织块均分散成混淆的细胞悬液为止。此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布(或不诱钢网)进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。6．计数与稀释从上步滤过的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释。稀释后的浓度一般以每ml含细胞30-50万为宜。7．分装与培养将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中(一般5m1/方瓶，lml青霉素瓶)，盖紧瓶塞，在培养瓶上面做好标志．以免放反，并在瓶口处注明细胞，组别及日期。\n然后放于培养架上，并轻轻摇动培养架．避免细胞堆积，以便细胞能均勾分布。最后将培养瓶置于37℃条件下进行培养。8．观察置于37℃培养的细胞．需逐日进行观察．主要观察：   (1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。   (2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。   (3)培养液变为桔红色，——般显示细胞生长良好。   经过l一2天培养后．若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作，在酒精灯旁，倒去原培养瓶中的营养液，再加入等体积新配营养液，pH7．o。若经2—3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。如果希望细胞长得更好些，此时也可换液，换时，所用的溶液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清量为5%。以后每隔3-4天(是视细胞液PH值而定)更换一次维持液。待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养了。II、传代细胞培养与观察一、实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况二、实验原理 传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。\n 这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。三、实验用品1、器材同上2、试剂L磷酸盐缓冲液(PBs)无钙、镁溶液细胞消化液：0．5％胰蛋白酶和0．4%EDTAEMEM液3%谷氨酰胺0．5％台盘蓝染液等3、材料鼠肾原代细胞四、实验方法在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。1.营养液配制:\n   EMEM液                               90%   犊牛血清                             10%   双抗(1万单位／m1)              加至约100单位／m1   3％谷氨酰胺                          1m1   7．4％NaHCO3                   调pH至6．8—7．02．换液:在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液，然后加入适量的无钙，锈离子的PBs液，轻轻摇动，将溶液倒出。3.消化与分装在上述瓶中加入适量消化液(0.02%EDTA或0.04％EDTA十o．5％胰蛋白酶液各一半)以盖满细胞为宜，置于室温，停留2—3min后，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝隙，即可倒去消化液;如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液3m1,以终止消化。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻地吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之即可补加营养液进行分装。4．培养分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。然后置于37℃培养。\n5.观察(1)观察体外培养细胞的几个问题；细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度B.观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。D．观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。(2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：   A．游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。   B．吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。   C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(\n即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：    十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25％以内有新生细胞。一般要观察3—5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。   十十：细胞占瓶壁有效面积的25—75％以内具新生细胞。   十十十：细胞占瓶壁有效面积的75—95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。   十十十十：细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。   从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。   D．维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。   E．衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。五、思 考 题1．简述细胞传代培养的操作程序及注意乡项。3．细胞培养获得成功的关键要素是什么?\n3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。