[生物学]离体培养 35页

　一．植物组织培养的发展简史　　植物组织培养技术的整个历史可以追溯到19世纪末和20世纪初，从那时到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：1、探索阶段（20世纪初至20世纪30年代中）20世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。自Haberlandt的实验之后，直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，在其间的32年时间里，植物组织培养技术在总体上处于探索之中，进展不大，但在以下两个方面取得了有深远意义的结果。一方面是胚培养实验。1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。另一方面是根培养的实验。1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。2奠定阶段（20世纪30年代中至50年代末）到了20世纪30年代中期，植物组织培养领域里出现了两个重要的发现：一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。20世纪40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的作用内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。20世纪50年代开始以后，植物组织培养的研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展就有以下7项：1）1952年，Morel和Martin首次，通过茎尖分生组织的离体培养培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。2）1953年—1954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。3）1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知细胞分裂素，并把它定名为激动素（Kinetin)。4）1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，跟和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长物质的相对浓度可以控制器官的分化。　　5）1958年，Steward等以胡萝卜为材料，首次通过实验证实了Haberlandt关于细胞全能性的设想，成为了植物组织培养研究历史中的一个里程碑。6）同年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。7）1958-1959年，Reinert和Steward方别报道胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。3迅速发展阶段（20世纪60年代至现在）据罗士伟统计，在20世纪60年代初期，全世界还有十几个国家的少数实验室从事组织培养研究，但是到了20世纪70年代，组织培养领域仍然空白的国家已经屈指可数。20世纪60年代以来的组织培养技术的发展，概括起来可以分为4个方面：1）基础研究再奏凯歌。1965年，Vasil和Hildebrandt用一种化学成分确定的培养基，由分隔培养的烟草单细胞获得了完整的再生植株，进一步证实了植物细胞的全能性。　2）原生质体培养取得重大突破。1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功，大大激发了人们对原生质体培养的热情。3）花药培养取得显著成绩。1964年，Guha和Maheshwari报道，在毛曼陀罗中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。35\n4）微繁技术得到广泛应用。1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。二、园艺植物离体培养学的基本含义植物离体培养（Plantinvitroculture）　　　是指通过无菌操作分离植物体的一部分即外植体（explant），接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行离体培养最终获得再生植株或目的产品的技术与方法。　　植物组织培养（PlanttissueCulture）或植物组织和细胞培养（Planttissueandcellculture）植物离体培养　1．器官和器官原基培养：包括根、茎、叶、花器官及其原基的培养。2．胚胎培养：以胚胎为基础的培养技术,包括原胚和成熟胚培养,胚乳培养,胚珠或子房培养以及离体授粉。3．组织培养：包括分生组织，形成层组织，节间组织，愈伤组织或其他组织的培养。4．细胞培养：包括体细胞、花粉性细胞；单细胞、多细胞或是悬浮细胞的培养。5．原生质体培养及其以原生质体为基础的培养：包括原生质体培养，原生质体融合和原生质体的遗传转化的培养等。三、园艺植物离体培养学的特点　　1．培养条件可以人为控制　　2．生长周期短、繁殖率高　　3．管理方便，利于自动化控制四、园艺植物组织培养学的研究对象及任务　　1.采用植物组织培养的技术来进行快繁，以促进良种繁育工作的开展；　　2.采用植物组织培养技术改良育种技术和途径，以不断创造更多更好的品种；　　3.采用植物组织培养技术来培育无病毒苗，以解决病毒危害，克服退化，提高种性；　　4.采用植物组织培养技术保存重要的种质材料；　　5.开展园艺植物激素生理、营养代谢、光合作用和形态建成等基础理论方面的研究；　　6.研究高频再生体系为转基因等分子生物学研究打下基础。　　第一章植物细胞全能性及培养条件　　　1902年德国著名的植物学家Haberlandt提出植物细胞全能性（totipotency）指植物的每个细胞都具有该植物体的全部遗传信息，并且有形成植物体所有细胞类型，直至发育成完整植株的能力。→论证1958年steward胡萝卜根细胞培养第二节植物离体培养的外界环境条件一、温度1．温度的影响为保持一定的温度，一般在密闭保温较好的培养室中进行，由空调机或调湿机等来调节室温和湿度。若要求更高或更低的温度，可使用装有日光灯的培养箱。培养箱可安装在培养室之外任何方便和安全的地方。无论液体或固体培养，大多采用25±2℃的温度，因种类不同，适合的范围也不同。在组织培养的连续生长中，大多上限在30℃左右，下限在15℃左右。2．温度处理的影响　　低温处理不仅对开花，而且对生长速度也有影响。↗不用低温处理→生长慢胡萝卜的切片↘4℃，16~32分钟低温处理→生长大大加快35\n　　　　　　↗10℃处理→繁殖系数高天竺葵茎尖↘20℃处理→繁殖系数中　　　　　↘30℃处理→繁殖系数低二、光照1.光照强度培养一般是在散射光下进行，但有些情况下也需要较强的光照或完全黑暗，设备上对此应当有所准备。光源的开闭可由自动定时开关控制。如玉簪花芽和花茎的培养；花芽愈伤组织的诱导率暗培养比光照下高，花茎培养则只有暗培养才能诱导愈伤组织的形成。光照强度不仅对增殖，而且对器官的形成也有影响。菊花块茎的发根，一天1小时600Lux的光照就有促进作用，一天12小时则达到最高限度，照射时间再增加其效果也没有什么变化了。2.光质　　不同波长的光对细胞的分裂和器官的分化也有影响。　　杨树愈伤组织的生长，红光有促进作用，蓝光有阻碍作用。　　小花天竺葵愈伤组织的生长白光有促进作用，蓝光则无作用。3.日照长度　　日照长度对试管内花芽的形成是个重要因素，在胡萝卜组织培养中也有报道随着日照长度的增加而促进生长的作用。三、渗透压培养基中添加的盐类、蔗糖、甘露糖醇及聚乙二醇一类高分子化合物影响到渗透压的变化。而渗透压的变化又会影响培养物的营养吸收和物理机械压力。四、pH值1．最适pH值不同的园艺植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，在灭菌之前培养基的pH值一般都在5.0~6.0之间，一般培养基皆掌握在5.5。一般来说，当pH值高于6时，培养基将会变硬，低于5时，琼脂不能很好地凝固。2．pH值的变化及缓冲液的使用开始培养一般培养物的培养基pH值多调在5.6左右，但接入的材料旺盛生长后pH值会偏酸性。为了有利于植物材料的生长，可加入缓冲液。五、空气及其他气体1．氧气的影响　　(1)定期转代；（2）使用微孔封口膜2．其他气体　　小缨萝卜根的培养在乙烯0.04ppm时对侧根的形成起阻碍作用，1ppm时对分裂有影响，CO2则1%时即阻碍生长。3．液体培养　　进行液体培养时，为解决通气问题要考虑振荡的次数，容器的类型、振幅、培养基量、培养基的种类等。　　　　　　　　　　　第三节植物离体培养的营养条件一、培养基的种类培养基（Culturemedium）是组织培养中最重要的基质，选择合适的培养基对培养成功与否关系很大。培养基有各种类型，不同的植物材料及不同的培养目的需选用不同的培养基。35\n二、培养基的成分1.水（蒸馏水）2.无机盐　　（1）氮除White培养基只含有硝态氮（KNO3）外，大多数培养基是既含有硝态氮又含有铵态氮（NH4NO3）。（2）磷培养基中以PO4－3的形式存在（如KH2PO4、NaH2PO4·H2O)。（3）钾、钙、镁、硫等元素。　　由于使用Fe(SO4)3和FeCL3在pH5.2以上常成Fe(OH)3的不溶性沉淀，所以常用FeSO4·7H2O和Na2－EDTA结合成鳌合铁，成有机态使用。（4）微量元素　　锰、铜、钼、锌等微量元素也是植物组织培养中经常使用的，是培养材料生长所需要的。3．有机化合物（1）碳源最常用的碳源是蔗糖，浓度一般为2~3%。一般来说，以蔗糖做碳源时，离体的双子叶植物的根生长得最好。已知葡萄糖和果糖也能使某些组织生长得很好。如以葡萄糖做碳源时，单子叶植物的根生长得最好。矮生苹果（Maluspumila，品种McIntosh）的组织培养物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源时都长得很好。植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。红杉属植物和玉米胚乳的组织培养物甚至可以代谢作为唯一碳源的淀粉。（2）植物激素除了营养物质以外，为了促进组织和器官的生长，通常还有必要在培养中加入一种或一种以上的生长调节物质。如生长素（IAA，IBA，NAA，2.4－D等)、细胞分裂素(KT,BA,ZT等)、赤霉素和脱落酸（ABA）等。不过，对这些物质的要求因组织的不同而有很大变化，这也取决于它们的内生激素水平。（3）维生素大多数培养的细胞都能合成所有必需的维生素，只是数量上显著不足。为了使组织很好地生长，在培养基中常常必须补加一种或一种以上的维生素。主要有维生素C、B1（盐酸硫胺素）、B6（盐酸吡哆醇）、B3（烟酸）、B5（泛酸钙）、生物素、叶酸等，一般使用的浓度为0.1～0.5mg/L。（4）肌醇　　为了改善培养的植物组织的生长状况，要加入肌醇，使用浓度一般为100mg/L。（5）氨基酸如胡萝卜不定胚的分化中，谷酰铵、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸等一起使用可起促进作用。4．天然复合物　　为了促进某些愈伤组织和器官的生长，还常使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物。不过，只要可能，应尽量避免使用这些天然物质。因为这类提取物所含的生长促进成分的质和量常因组织的年龄和供体植株的品种而变化。（1）椰乳　　一般使用浓度在10~20%（2）香蕉　　用量为150~200g/L35\n（3）马铃薯　　去掉皮和芽后使用，用量为150~200g/L，马铃薯要煮30分钟，以后再经过滤使用。（4）水解酪蛋白　　为蛋白质的水解产物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100~200mg/L，受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。（5）其他　　酵母提取液（0.01~0.05%），麦芽提取液（0.01~0.5%），苹果和番茄的汁液，黄瓜的果实，未熟玉米的胚乳等。5．培养材料支持物（1）琼脂琼脂是一种由海藻得来的多糖类物质，由琼脂糖(agarose)和琼脂胶（Agaropectin）两部分组成，低于40℃时凝固，一般的使用浓度是0.5~1%，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中去。（2）琼脂糖琼脂糖在原生质体培养中用得较多，其凝固温度比琼脂低，将原生质体植板在琼脂糖中，较之培养在薄层液体培养基中，对细胞分裂的效果更好。（3）卡拉胶　卡拉胶是海藻的提取物。粉末状卡拉胶稳定，即使加热也不会发生水解。含卡拉胶的固体培养基较琼脂培养基透明。（4）其它如玻璃纤维、滤纸桥等。对于某些实验体系来说，液体培养基的效果可能比琼脂固化培养基更好。当进行营养需要研究的时候，应注意不要使用琼脂，因试剂商店供应的几乎所有各种琼脂都含有杂质，特别是含有Ca、Mg和微量元素。为了避免使实验复杂化，Heller（1953）在液体培养基表面安放了一个由滤纸制成的纸桥，然后在纸桥上面进行愈伤组织培养。6．抗生素类物质植物组织培养中材料的消毒通常只能进行表面灭菌，而对材料组织内部所带的细菌和霉菌的危害，则可在培养基中添加抗生素类物质。常用的抗生素有青霉素、链霉素、头孢霉素、土霉素、氯霉素、利福平、卡那霉素和庆大霉素等，用量一般为5～20mg／L。大部分抗生素要求过滤灭菌。使用抗生素时应注意以下4个问题：　　①不同抗生素能有效抑制的菌种不完全相同，因此必须有针对性地对抗生素的种类进行选择；　　②在有些情况下，单独使用无论哪一种抗生素对污染皆无效，必须几种抗生素结合使用才能取得较好的效果；　　③当所用抗生素的浓度高到足以消除内生菌时，有些植物的生长发育往往也同时受到了抑制；④在停用抗生素后，污染率往往显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的。因此，总体来说，在高等植物离体培养中，特别是在商业性快速繁殖中，应当尽量避免使用抗生素。第四节植物离体培养的激素条件一、生长素　在自然界中，生长素影响到茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。35\n在组织培养中，生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。生长素一般溶于95%酒精或0.1mol／L的NaOH中，以后者的溶解效果好。在组织培养中常用的生长素有：　　吲哚乙酸（IAA）高温高压时易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。　　萘乙酸（NAA）在组织培养中的起动能力要比IAA高3.7倍。它可人工大量生产，在高温高压下也比较稳定，不易被破坏、分解，在植物组织培养中使用十分广泛。　　2.4一二氯苯氧乙酸（2.4－D）在组织培养中的起动能力要比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。根对生长素最敏感，在极低的浓度下（0.01mg/L）就可促进生长，在较高浓度下生长受抑制。NAA对发根的作用十分强大，一般要用较低的浓度。IAA对发根也有作用，但易被分解。IBA对发根是最好的生长素。愈伤组织是一种去分化的细胞团，可由高浓度的生长素诱导产生。二、细胞分裂素　　Overbeek(1941)在椰乳中发现促进分裂的物质→Skoog等在研究烟草组培时发现“激动素”（kinetin）→Letham(1963)从成熟玉米种子提取到玉米素（zeatin）→6-苄基氨基腺嘌吟（6-BA）则是人工合成的生长素参加核的有丝分裂，而与胞质无关；细胞分裂素既可促进核的分裂，又可促进胞质分裂，还有解除顶端优势的作用，促进侧芽的生长。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。比较常用的细胞分裂素有：BAP（苄氨基嘌呤）、6-BA（苄基腺嘌呤）、2ip（异戊稀氨基嘌呤）和激动素（kinetin，呋喃氨基嘌呤），近年来又发现了一种人工合成的具有细胞分裂素活性的物质TDZ（Thidiazuron)。Mok等（1982）发现，在培养基中添加低浓度的TDZ能促进愈伤组织的生长，证明了TDZ具有很强的细胞分裂素活性。细胞分裂素一般溶于0.5或1mol／L的HCL或稀薄的NaOH中。除此之外，近年来又发现了一种人工合成的具有细胞分裂素活性的物质TDZ（Thidiazuron），耐热，碱溶。在培养基中添加TDZ不仅能促进愈伤组织的生长，还可促进侧芽及不定芽发生，促进胚状体形成，但具体效果因使用浓度、与其他植物激素配合的方式以及物种的不同而异。三、赤霉素赤霉素有20多种，其中在组织培养中所用的是GA3。与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不常使用。据报道，低浓度GA3能促进矮生小植株茎节伸长，赤霉素还能刺激在培养中形成的不定胚正常发育成小植株。赤霉素易溶于冷水，每升水最多可溶解1000mg。GA3溶于水后不稳定，故最好以95%酒精配成母液在冰箱中保存。四、植物激素的使用　　溶解（mg/L）：IAA、NAA、IBA、2.4-D、GA等可先用少量95%的酒精使其溶解，然后再加重蒸馏水，定容到所需要的体积；KT、BA等则可用少量0.1N盐酸使其溶解，再进行定容。植物激素一般按每ml含多少mg配成原液贮放于冰箱中。使用浓度范围：一般生长素为0.05~5mg/L，细胞分裂素为0.05~10mg/L。由于植物激素的种类不同，诱导细胞的增殖大致可分为四种类型：①需加一种生长素，如柑桔属组织、菊芋块茎；35\n②同时加入一种细胞分裂素，如烟草茎叶、大豆子叶；③需加入一种细胞分裂素，如萝卜根木质部薄壁组织；④不需加入生长激素、甘蓝、芥菜等的胚轴培养。第二章外植体的脱分化与生长　脱分化是指外植体中已分化的细胞，即成熟器官和组织的细胞，在切割分离损伤和培养物内外因素作用下，渐渐丧失其原有的分化的结构和功能，合成代谢变得旺盛，细胞壁由厚变薄，其内部结构也发生相应变化，形成无明显结构的组织块或细胞团——愈伤组织(calllus)。即一个成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的现象称做“脱分化”（dedifferentiation)。外植体细胞由于损伤和培养条件的作用而出现脱分化，是培养物细胞在结构上可以见到的第一个变化。第一节外植体脱分化↗气体交换变化；损伤刺激→生化反应→呼吸活性变化↗磷酸酶（莴苣）↓↘其他酶活性变化→ATP酶（莴苣）　　　外植体脱分化↘抗坏血酸氧化酶（莴苣）↘脱氢酶（马铃薯）二、培养细胞的异质性↗对培养条件敏感性强→脱分化→再分化复合体外植体→异质性→不同倍数；不同生理状态（茎、胚轴等）↘对培养条件敏感性弱三、生长物质的影响加入2.4-D等生长物质，导致外植体细胞生物学上与细胞分裂有关的更强烈变化，进入第一次分裂的细胞百分率更高。加生长素的同时，配合以激动素可能效果更好。但是高浓度的激动素（10~25mg/L）在任何情况下，都表现抑制，GA也往往表现抑制作用。四、光线的影响↙光照下切取→周缘细胞中仅有35~40%在第一次细胞分裂时实现分裂菊苣→暗培养↘低强度绿光下切取→60~70%的细胞在第一次细胞分裂时实现分裂　　菊苣通称为欧洲或法国苣荬菜、比利时苣荬菜、苞菜，在日本称之为“苦白菜”。菊苣是菊科菊苣属中的多年生草本植物,以嫩叶、叶球、叶芽为蔬，是从野生菊苣中驯化选育出的一个变种，原产地中海，亚洲中部和北部。菊苣中含有一些一般蔬菜中没有的成分，如马栗树皮素、马栗树皮甙、野莴苣甙、山莴苣素和山莴苣苦素等苦味物质，有清肝利胆的功效。世界上许多国家的美食家们都很看重菊苣，把它视为蔬菜中的上品。其嫩叶可以炒食、做汤或做色拉；软化栽培后的菊苣芽球可用以生吃，或做成鲜美开胃的凉拌菜；欧美等国还有人把菊苣的肉质根加工成咖啡的代用品或添加剂。菊苣的经济价值较高。目前，在我国菊苣仍是一种新兴的特菜，在我国南方栽培较困难，而我国的华中、华北等地的气候条件较适宜菊苣的栽培，能获得优质的产品，极受消费者的欢迎，市场潜力很大。第二节愈伤组织的生长细胞脱分化就具备了分裂能力，细胞分裂可导致细胞不断增殖，细胞增殖的结果导致愈伤组织的生长。35\n　　生长中的愈伤组织特征：形成由分生组织组成的瘤状结构，往往它们变成不再进一步分化的生长中心，而从其周缘产生扩展的薄壁细胞，其结果使一个活跃生长的愈伤组织形成一种“泡状”增殖的特征。愈伤组织状态的调控来源于不同植物或同一种植物的不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。例如它们的颜色可能或是绿或是白，它们的外观可能是光滑或是粗糙，它们的结构可能是致密或是松脆，它们的遗传生理功能可能是具有胚性或是不具胚性。在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2～3个特性：1.高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。2.容易松散，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。3.旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。4.经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。　　　为了达到以上目的，我们在诱导愈伤组织时通常采取的策略是：1.选择适当的基因型和适当的外植体。虽然几乎所有高等植物的器官和组织都有可能产生愈伤组织，但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同，同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同。2.选择适合的培养基，特别是适当的植物激素的种类和浓度，以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间有恰当的配比。如甜橙的珠心愈伤组织需要IAA和激动素才能生长和发生胚胎分化。3.采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。Brown等（1976）报道，在野生胡萝卜中，高浓度的钾(20mmol／L）是胚胎发生所必需的第三章培养物再分化再分化是指离体培养物由脱分化状态再进行分化，再分化可以在细胞水平、组织水平和器官水平逐渐不断地进行，最后再形成完整的植株。培养物的再分化，可以通过两种不同途径来实现，一种是胚胎发生；另一种是直接分化器官，再形成植株。　　第一节细胞分化和组织分化一、细胞分化（一）导管细胞的分化及其影响因素　　导管细胞的分化被认为是离体条件下研究细胞分化的一个模式系统　　与离体培养条件不可能再分化的其他各种类型细胞，如薄壁细胞、色素细胞、石细胞、纤维细胞等相比较，导管细胞的优越之处在于：在培养中较易发生，且发育有着明显的易辨的特征，此外，易计量，易软化处理，易染色和标记。（二）导管细胞分化的影响因素1.植物激素一些报道表明，生长素和细胞分裂素可能都与导管的分化有关。　　在一种只含有生长素的培养基中，有两个在根中含有玉米素的胡萝卜品种无论在光下还是在黑暗中都能分化出导管。而另外两个根中不含玉米素的胡萝卜品种则只有在光下才能形成导管。对于后两个品种中的一个品种已证明，光能导致玉米素的合成。由此可知，在这些系统中，细胞分裂素对于木质部发生具有肯定的作用。35\n不过，在对向日葵（Morel,1965)和亚麻（Mehta和Fadia，1967）的研究中并未看到激动素对木质部发生有任何刺激作用。而对洋紫苏茎创伤导管的形成来说，激动素甚至有抑制作用。Fosket和Roberts（1964）认为，这种抑制作用是由于在激动素的影响下外植体中生长素的极性运输发生紊乱所致。2.蔗糖在有生长素存在的条件下，Jeffs和Northcote（1967）比较了不同种类的糖的效果，结果发现，除了蔗糖之外，属于双糖的麦芽糖和海藻糖也能刺激菜豆愈伤组织导管的分化。葡萄糖、果糖和其他单糖则无刺激作用。3.物理因子　　有关物理因子对导管分化的作用研究的较少。在向日葵中，温度若低于17℃，导管分子不能分化，在17～31℃的范围内，木质部的形成随温度的增加而增加。另外，光对洋紫苏创伤导管的分化有刺激作用。（二）细胞分化过程及其机理　　生长调节剂是导管分化的启动者，通过它和其他因子的配合，诱使细胞内部的RNA和蛋白质代谢发生变化，PAL这样的关键酶的活性增强，导致木质素的沉积，细胞壁加厚。二、组织分化　　在利于无组织生长的条件下，培养物中的分生区通常是混乱、散开的，当把培养物转进可供组织生长的条件下，首先导致定位的类似形成层的细胞丛出现，这种细胞即称为“拟分生组织”也叫生长中心或分生组织结节。这样的分裂中心可定位于愈伤组织的表面，也可以埋于组织的内部。　　在拟分生组织形成的同时或稍后，愈伤组织中会分化出微管组织结节。维管结节是试管植株的维管束的前身。原生的拟分生组织以及维管组织结节是可塑的，可以形成芽，也可以形成根。　　通常，定位于外表的形成芽，这与完整植株的茎的外起源一样。外表的拟分生组织的细胞继续分裂，形成小的突起，组织呈现瘤状外观，进而分化成芽。而包埋于愈伤组织深处的拟分生组织，通常形成根。第二节器官分化和植株形成一、器官分化的调控（一）控制器官分化的激素模式1.比例　　生长素/激动素的相对水平较高，有利于根的形成；反之，则有利于芽的形成。2.绝对浓度不是生长素/细胞分裂素的比值就能完全决定器官的发生，而绝对浓度也是非常重要的因子。例如，在番茄叶愈伤组织中，同样用生长素/细胞分裂素=1的比例，如果IAA为2mg/L、激动素2mg/L时发生根；而用IAA4mg/L、激动素4mg/L时，则发生茎。3.激素的种类和性质生长素和细胞分裂素的性质也影响器官发生。从石刁柏得到的愈伤组织中，当BA和IAA或NAA结合时，发生茎芽；但当含ZT或2.4-D的培养基时，就不能发生。　　在烟草、秋海棠中，赤霉素对于茎芽的分化有抑制作用。赤霉素的这种作用在拟分生组织形成时期最为明显。一旦茎已经形成，GA3并不能抑制它们的进一步生长。GA3的完全抑制作用只发生在黑暗条件下。在烟草中，若把正在分化的愈伤组织在黑暗条件下用GA3处理，时间即使短至30～60min，也会减少芽的分化，而且在处理之后48h，所有的拟分生组织或茎芽全都不复存在。（二）培养基的组分和附加物的作用35\n提高无机磷会促进器官分化；糖的平衡可逆转生长素/细胞分裂素的比例；不加还原氮有利根的形成；一些附加的生理活性物质如：嘌呤类、嘧啶类、氨基酸等，在某些情况下可促进培养物的器官发生等。（三）物理环境条件　　培养基的物理状态，即固体或液体培养会影响器官的发生。一般地，固体培养基有利于器官的分化。光照，包括光强和光质、光周期对器官分化有重要影响。1500~2000Lx是许多培养物合理的光强，但一些短日型植物，如某些葡萄的根形成需短光照，近紫外和蓝光刺激芽的发生；而红光则显著促进生根。　　培养温度，25℃左右即适于器官发生，但能模拟培养植物原产地温度更为有利。如高山植物在20℃，热带植物在27℃下培养更有利，昼夜变温可能会促进不同器官发生。二、植株的形成　　除了上述途径外，在茎尖培养时，往往可以使茎尖内或茎段内的腋芽萌发，形成一定数量的萌发枝。在这种情况下，只需把侧枝切下，同上述的茎一样转入加有生长素类的培养基中，即可长根并形成完整的植株。第三节离体胚胎发生一、各种培养类型的离体胚胎发生（一）外植体直接发生二倍体胚下胚轴、子叶、茎表皮等外植体细胞脱分化后可直接产生胚。（二）愈伤组织产生胚状体　　在愈伤组织中，可能出现液泡小，细胞质浓的小细胞。这种小细胞聚集为丛状，称为“胚胎发生丛”（Embryogenicclump,简称EC）。EC的表面是高度分生组织化的细胞团。一个EC表面可产生大量的胚状体。在胡萝卜属、柑桔属和毛莨属中已证实：每个胚状体来自EC上的单个表面细胞。　　在原培养基中，EC表面的胚状体不能进一步发育；但EC中心的细胞分裂和分离，会促使EC崩溃，崩溃后分生性的表面细胞结合成群，又形成新的EC。　　EC在转入去除生长素、降低还原氮的新培养基后，才能完成胚状体的发育，以类似合子胚的发育方式至成熟。在一些种子发芽需要冷处理或有休眠期的植物中，胚状体还需要经冷处理，才能萌发。如葡萄的球形胚或更早些的胚就需经4℃处理两周，才能发育成熟并萌发。（三）悬浮细胞产生胚在悬浮培养液中，有各种类型的细胞，其中有一种具浓厚的细胞质，液泡相对小，保持旺盛的分裂能力。经多次分裂产生的多细胞间仍保持着联系，形成聚集团块，此团块称为胚性细胞团。（四）单倍体胚胎发生　　花药（花粉）和雌性器官培养中单倍体胚状体的起源是多种多样的　　单倍体胚状体的一般发育过程是：小孢子第一次分裂形成两个约为相等的子细胞。这两个细胞的特性与典型的营养细胞相似。它们继续分裂成小细胞团，进而形成球形胚。此后即从典型的合子胚发育方式直到成熟。个别情况下，可观察到小孢子直接以与合子胚完全相同的途径发育为成熟胚。二、影响离体胚胎发生的因素（一）外部因素1．激素的作用35\n　　例如，那些愈伤组织中产生的EC不能在原培养基中发育，经转入新的培养基才发育。愈伤组织的诱导及EC形成，发生在富含生长素类，主要是2.4-D（0.5-1mg/L）的条件下。在重复继代培养时，EC可继续增殖，但没有出现成熟胚；只有把EC转入无生长素或低浓度生长素（0.01-0.1mg/L）的培养基中，EC才发育为成熟胚。　　一些植物的愈伤组织在第一阶段中，虽也有不同程度的胚发育，如形成球形胚或鱼雷期胚，但它们大多只有在第二阶段中才完全发育，最后形成植株。GA和乙烯抑制胚胎发生。至今还未发现相反情况。2．氮源　　NH4+－N有利于胚胎发生，NO3-－N通常不能代替NH4+－N，在以非还原N为唯一N源的white培养基中，不能产生胚状体或只能产生少量的胚状体。只要加入少量的还原N（如0.1mMNH4CL）即可明显促进胚状体的发育。但在胡萝卜培养物中，加NO3-－N起稳定pH值的作用，与NH4+－N协同促进胚胎发生。　　氨基酸、酰胺等有机氮可不同程度促进胚状体发生。椰乳、酵母提取液，水解酪蛋白是可行的代用品，它们是含有多种氨基酸的化合物或天然产物。3．其他因子的作用　　缺糖或低糖条件下，胚状体不形成；高糖条件下，胚状体的分化常不超过原胚时期，这种作用产生于高糖的渗透作用。它抑制了正常的生长过程。　　此外，活性炭的有无，矿物盐浓度、培养的条件（如光、温、低温处理、辐射处理）都会影响到胚状体的发生。在培养基中加入活性炭能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率。（二）内部因素1.细胞间的隔离　　虽然那些可发生胚胎的单细胞在诱导胚胎发生的早期与周围细胞之间有胞间联丝，但是不少证据表明，在胚胎发生发育中，胚胎细胞与周围的细胞发生隔离。　　在芹菜等培养物中均观察到：在多细胞原胚阶段，胚状体周围有一层细胞构成“边缘细胞层”，后来，此层细胞退化解体，在胚状体与周围组织间形成缝隙。2．基因型的影响　　不同植物基因型之间在产生胚状体的能力方面有很大差别，如柑橘、矮牵牛、胡萝卜等植物较易形成胚状体，几乎在所有类型的外植体培养中，均观察到了胚状体的发生，水仙花、烟草等就很少有胚胎发生的报道。在易发生的物种中，基因型不同，胚胎发生能力也有不同，如柑橘类中的甜橙易产生胚状体，而宽皮橘则比较难。3．外植体来源和年龄　　那些不易发生胚状体的物种，也有个别外植体类型可产生胚状体。如烟草作为植物离体培养的模式植物，已有众多的外植体类型被反复研究过，但几乎所有的培养系统均不发生胚状体，不过，在烟草原生质体培养中却观察到了胚状体，水仙花的花粉原生质体培养也能启动胚胎发生。外植体的来源和年龄不同，其胚胎发生能力不同可能与培养条件的控制有一定关系。4．其他因素　　如内源激素的平衡，信息水平变化等也都有影响。　　Wochok和Wetherell（1971）认为，2,4-D对胚胎成熟过程的抑制作用可能是通过产生内源乙烯引起的。乙烯利在植物组织中释放乙烯，故在胡萝卜悬浮培养中也能抑制成熟体细胞胚的发育，但并不显著降低胚性细胞团的生长和增殖。第四章离体培养的基本操作方法　　第一节组织培养室　（化学实验室，灭菌室，无菌室，培养室，细胞实验室，暗室）35\n　　　　　第三节培养基的制备一、母液的配制和保存(二）母液配制的原则　　　　　　第四节植物材料的消毒和切取一、植物材料的消毒1．消毒的目的和作用　　消毒是为了消灭菌类，保证无菌组织培养的顺利进行。植株各部分的表面携带着各种污染微生物。为了消灭这种污染源，在把植物组织接种到培养基上之前必须进行彻底的表面消毒，内部已受到真菌或细菌侵染的组织在组织培养研究中一般都淘汰不用。2．几种常用的消毒剂　　有若干种灭菌剂可用来进行植物组织培养消毒，其中常用的消毒剂有漂白粉（1~10%滤液），次氯酸钠液（0.5~10%）、氯化汞（0.1~1%），酒精（70%）。　　必须注意，表面消毒剂对于植物组织也是有毒的。因此，应当正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以尽量减少组织的死亡。3．消毒方法二、植物材料的切取　　组织培养取材要考虑材料的分生和生长能力强，可取茎尖和根尖的分生组织处，节间和嫩叶基部的分生组织及形成层等部位，此外，可取幼嫩的组织。1．茎尖的切取　　芽先端生长点附近的形态，依植物种类其形状和大小各不相同。　　菊花的叶原基有毛密生缠绕，生长点小，难分离。　　马铃薯、百合为半球形，比较大，容易分离；　　番茄、矮牵牛、康乃馨的形状相同，但都比较小；　　大丽菊和日本泡桐，对生叶的原基着生直到生长点附近，分离不带叶原基的生长点难；　　草莓茎随着生长先端渐渐凹陷，致使生长点包埋在肉质部中；　　消毒后的材料，在解剖镜下操作。左手拿解剖针，将材料由茎的切口处刺在上面，保持于空中，在解部镜下观察，用右手拿解剖刀，将幼叶和叶原基一一切除，使生长点部分露出。为防污染，需换用消过毒的工具，按预定大小切取分离生长点附近组织。　　还有一个方法是将材料放在灭过菌的载玻片或滤纸上，两手持解剖针、小刀、镊子等照上述方法除掉叶原基。分离的生长点组织，切口朝下接种在培养基上，分离时注意不要使茎尖受伤，操作要快，组织过小成活率低，生长慢，难得到植株。2．较大材料的切取在肉眼下进行。材料消毒后，在无菌条件下，用解剖刀切取所需大小的叶片，茎和花茎切段等。注意工具用一次要消毒一次，滤纸也要及时更换，防止交叉感染。取材时，为避免较大材料表面的细菌污染，如萝卜、胡萝卜要取直根的一部分进行培养，则可用打孔器从中取一部分，就比较安全。3．树木形成层的切取粗的树枝和树干表面进行灭菌是不可能的，可剥去树皮露出内部组织。再用消毒过的小刀削一下，留下一些韧皮部，就达到形成层处了。用尖头镊子在上面划1~2cm间隔的棋盘格，再用镊子把它一块块地切取下来，然后把这种带韧皮部和形成层的组织接种到培养基上。4．从无菌种子发芽得到的材料35\n对种子进行消毒处理，播种在消过毒的沙子等基质上，这样从长出的幼苗切取材料被污染的机会少，有利于进行初代培养。幼根、子叶、胚轴等部位皆可切取。或者先通过种子培养得到无菌种苗，然后再用其各个部分建立组织培养。5．外植体的大小初代培养所用外植体的大小，大多由植物材料的形状所决定。小到数毫克，通常在10~100mg，大小以面积算0.5cm2内，长度算以0.5cm长以内常见。　　　第五章器官和组织培养　　　　　　　　　　　第一节茎尖培养一、茎尖培养的意义1．基础理论研究的利用茎尖的生长，形态建成，花芽形成、组织分化、营养代谢、生理生化等研究2．无病毒苗的获得3．快速繁殖的利用4．育种上的利用二、培养条件　　为提高繁殖率，促进茎叶和根的发生，要很好地选择培养基。著名的有Morel（1960）使用的原来供种子发育用的KnudsonC培养基；MS（1962）培养烟草愈伤组织的MS培养基等，其它如White、BakerKassanis等培养基对园艺植物茎尖培养也是比较好的。　　　　第二节器官培养一、叶、茎等营养器官的培养　　叶、茎等营养器官的培养最大的优点是可以得到大量的培养材料，取材容易，有利于大量培养繁殖。但其缺点是易发生遗传变异，不利于保持种性，这也因作物而异。　　不少植物的叶片组织进行培养，可以直接诱导产生芽、根，得到完整的植株，有的则去分化形成愈伤组织，再由愈伤组织再分化产生芽和根，这取决于植物的种类、品种及培养条件，其中主要是外源激素的水平。从叶片再生不定芽的植物，以羊齿植物最多，双子叶植物其次，单子叶植物最少。二、花、果实等生殖器官的培养　　花的培养在基础理论的研究上用于对性别控制的试验，探讨环境条件、营养和激素对性别改变的作用。　　果实的培养则有利于了解果实发育的条件及机理。在园艺植物的组织培养上，花、果实等生殖器官的培养在快速繁殖、育种和良种繁育及无病毒苗的培养上也有其重要的实践价值。第六章花药和花粉培养　　　　　　　第一节花药和花粉培养的意义一、基础理论研究上的利用　　用人工培养基培养花粉是研究减数分裂和花粉生长机制的重要方法。二、单倍体育种1．可以获得纯合的二倍体　　通过花药和花粉培养可以获得单倍体植株，然后将单倍体的染色体组加倍，可获得纯合的二倍体。虽然在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低，通过人工措施则可显著提高加倍频率。2．与杂交育种相比，可缩短世代，提高选择效率　　在品种间杂交育种程序中，通过F1代花药培养得到单倍体植株后，经染色体加倍成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。3．有利于远缘杂种新类型的培育和稳定。35\n4．与诱变育种相结合可以加速育种过程　　由于多数突变是隐性的，当同源染色体上有显性等位基因存在时，它们不能表现，因此在高等植物中突变常常不易发现。　　而在单倍体中诱发突变很容易表现出来，这是因为单倍体只有一套基因，隐性突变的作用不会受到显性等位基因的干扰。携带有利突变的单倍体一经发现，就可以在一个世代之内，通过染色体加倍，而成为表现所有有利突变的可育二倍体。第二节花药培养一、花药培养的方法1．植物的培育　　花药培养所用的材料取自大田的要比温室的效果好，这是因为大田生长的材料一般要健壮些，发育好。在甘蓝花药愈伤组织的诱导中可明显地看到这一点，取自大田生长的材料在合适的激素水平条件下可大幅度地提高诱导率。2．植物材料的异质性　植物材料的遗传类型不同，材料的异质性，也影响到花药培养的效果。3．花粉发育阶段的选择花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片法等进行镜鉴，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾大小、颜色等外部特征之间的对应关系。不同植物适合时期不同，从大多数园艺植物花药培养的情况看，以采用单核期的花粉来培养，诱导产生愈伤组织或胚状体的频率高。辣椒花粉不同发育时期的花药培养为操作简便，根据调查观察掌握花蕾长度大小与花粉发育年龄的相关性，在实际操作中就可根据需要而取一定大小的花蕾来进行。4．培养基的选择　　花药培养常用的基本培养基（脱分化）培养基有MS（1962）、Nitsch（1969）、Miller（1963）、B5（1968）和N6（1975）等。培养基中常用的细胞分裂素有6-苄基腺嘌呤（6-BA）激动素（KT）和玉米素（ZT），生长素有2.4-D、NAA和IAA等。　　高浓度的生长素往往会抑制花粉的发育，且诱使二倍体的体细胞组织（药隔、药壁）的生长，低浓度时则体细胞不发育，而诱导花粉产生愈伤组织，在某些情况下，花粉的发育还可不经愈伤组织的途径，直接产生胚状体，诱导愈伤组织以2.4-D为好。除此，有的还加入椰乳汁、酵母提取物，水解酪蛋白等，对提高诱导频率也有明显的效果。基本培养基中的蔗糖浓度对花粉的诱导生长有一定作用。在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度胚状体的诱导率为最高，在番茄花药培养中则需高达14%，都比常用的高出许多，这可能是由于花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故，所以高浓度的蔗糖溶液不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而对花粉的生长是适合的，无机盐中的铁为最重要，缺铁时只能发育产生多细胞的原胚，而不能进一步发育成苗。在培养基中加入活性炭对生长调节物质的吸收，而起到了调节内源和外源生长调节物质水平的作用。大多数情况下，花药培养后产生愈伤组织，故还需进一步转移到分化培养基，诱导分化产生芽和根，才能得到完整植株。分化培养基的基本成分可釆用前面提到的ms等，只是改变其中的生长调节物质的成分。35\n从基本培养基到分化培养基，为诱导芽的分化通常是提高细胞分裂素的含量而降低生长素的用量，有的甚至不用生长素。如从葡萄花粉愈伤组织分化产生花粉植株时，只需加入低剂量的细胞分裂素，而不需生长素，若加入低剂量的生长素时，则需高剂量的细胞分裂素才会分化产生植株。5．材料的预处理花药培养中为提高愈伤组织或胚状体形成的比例，可以对花药进行各种预处理，其中以低温处理的效果最显著。其他还有采用高温、辐射、黑暗等处理。6．消毒、接种和培养从健壮无病株采集花蕾，先用自来水冲洗十几分钟，花蕾上大多带有茸毛，所以加些吐温或洗衣粉作湿润剂，能较好的洗净。以后在无菌条件下进行，用75%的酒精消毒10秒，无菌水冲洗2次，再用10%漂白粉上清液浸泡消毒20分钟，以后用无菌水冲洗3次。消毒过的花蕾放在消毒滤纸上将水吸掉，再用镊子小心的剥开，取出花药，注意要去掉花丝，然后水平接种到培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。　　花药对培养温度、光照的要求因物种而不同，一般培养在恒温条件下，温度在23~28℃左右，每天11~16h的日光灯照明，光照强度2000~4000lx。二、花粉的发育过程和植株的分化1．花药培养中花粉的发育情况　　植物中只有少数用离体花粉培养直接产生植株，而大多数是用离体花药培养来产生花粉植株，这是因为花药壁可以在培养中提供某些生长发育物质。花药培养中花粉的发育大致可分为四种途径（1）营养细胞发育途径单核小孢子先进行一次正常的非均等分裂，然后通过营养细胞的进一步分裂形成孢子体。生殖细胞或者完全不再分裂，或者分裂1～2次后即行退化，如辣椒花粉的发育途径。（2）生殖细胞发育途径　　在这种途径营养核只分裂1~2次就退化了,而生殖核经多次分裂发育成多细胞团。如在天仙子中，花粉胚主要是由生殖细胞独立形成的，营养细胞或是完全不再分裂，或只分裂有限几次即停止。无论在哪种情况下，营养细胞最终都变成一个类似胚柄的结构，附着在由生殖细胞起源的胚的胚根一端。（3）营养细胞和生殖细胞同时发育的途径在花粉第一次有丝分裂形成的营养核和生殖核同时进行多次分裂，因此最后形成的多细胞团包括两部分，一部分细胞较大的是营养细胞分裂而来的，另一部分细胞较小的则由生殖细胞分裂而来。这种发育途径迄今还只见于毛叶曼陀罗中。（4）花粉均等分裂途径　　花药培养中花粉进行均等分裂形成两个均等的子细胞，而不是形成相互有别的营养细胞和生殖细胞。两个等同的子细胞都参与孢子体的发育，由两个子细胞形成多细胞团。迅速生长，穿破药壁而形成胚状体或愈伤组织。这种途径在毛叶曼陀罗中相当普遍。2．植株的分化产生（1）从愈伤组织再分化产生植株　　再分化培养基要降低生长素的含量，不能用2.4-D，有时甚至不用生长素。NAA或IAA和细胞分裂素的浓度范围在0.2~2mg/L，蔗糖通常为2~3%。在愈伤组织不易分化的情况下还要进行继代培养，及时转移到新鲜培养基。35\n　　较高的细胞分裂素浓度和较低的生长素浓度有利于芽的分化，反之，有利于根的分化。也与愈伤组织大小、质地及出现早晚有关，出现早的易分化绿苗，花药培养3~8周后可得到植株。等根系发育健全，有数厘米高，即可移栽。花药培养与花粉培养相比，由于药壁对花粉提供营养，所以花药培养比花粉的单独培养要有效，容易得到植株。（2）从胚状体直接产生植株　　在花药培养中直接从花药中产生胚状体，长出小植株，而不经过愈伤组织的途径，可得到遗传上的稳定性，且成苗快，成苗多。是经愈伤组织再分化成苗，还是直接产生胚状体成苗，这因培养条件而异，不同的培养基其结果就不相同。2．花药培养得到植株的特点从花粉直接产生胚状体得到的植株大多为单倍体，而经愈伤组织途径再分化产生的植株，除单倍体外，还经常会有混倍体出现，其中一部分从花粉来，也有的从花药组织来。单倍体植株大多矮小，叶簿，花器也小。第三节花粉培养一、花粉培养和花药培养的比较花粉培养与花药培养相比有如下优点：①花粉培养中可完全排除花药组织的干扰；②以不经过愈伤组织阶段，直接产生胚状体而形成植株；③养中不存在花粉的竞争问题，可以培育得到较多的单倍体材料；　④从基础理论的研究来讲，单独花粉培养也更有价值。二、花粉的分离三、花粉预处理1．低温处理在花粉第一次有丝分裂期进行低温处理。在黑暗条件下以植株的花蕾、花药、花粉等作材料比较，以处理分离的花蕾效果最好。2．重力的作用在烟草花粉培养中，在从花蕾中取出花药前1h，在5℃条件下进行低温离心机离心，可提高单倍体的诱导率。这在玉米上试验也有同样效果。四、培养基的成份在有的培养中加进花药组织的提取物，有促进生长的作用，据分析有原胚发育所需的物质存在。龟谷等培养紫甘蓝或紫甘蓝×芥蓝杂种一代的培养，以Nitsch培养基作为基本培养基，添加一些物质，蔗糖浓度高达10~15%。五、培养过程培养的花粉形成胚有两个途径：　　一是花粉核分裂产生营养核和生殖核，以后生殖核退化，营养核则继续分裂2~3周，成多核花粉，由此形成多核的原胚；　　二是花粉核直接分裂，再形成胚。　　　　第四节单倍体育种一、染色体加倍加倍的途径；（自然加倍；秋水仙素加倍；单倍体愈伤组织的加倍）1．自然加倍　发生的频率很低。这是在花药、花粉培养过程中，有时会自发地加倍，成为二倍体。主要是通过核内有丝分裂而实现的，也有的是由于花粉内营养核和生殖核二者的融合，而达到加倍的目的。（1）单倍体产生途径的影响35\n　　通过胚状体途径产生的花粉植株，自然加倍的频率低，而经过愈伤组织途径产生的花粉植株，加倍的频率则要高些。如烟草花粉植株基本上都是单倍体。（2）花药发育时期的影响　　自然加倍频率的高低与接种花药发育的时期也有密切关系，根据矮牵牛、烟草等花药培养试验，双核期的花粉出现自然加倍的机会多，而单核期的花粉就很少出现。（3）培养基中的激素状况影响　　细胞分裂素和生长素有促进细胞产生核内有丝分裂的作用，特别是细胞分裂素在其中起关键的作用。（4）自然加倍的情况也与培养时间呈正相关　　单倍体愈伤组织随着培养时间的加长，花粉愈伤组织的分化能力逐渐降低。2．秋水仙素处理加倍诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。秋水仙素是百合科植物秋水仙的根、茎、种子等器官中提炼出来的，性剧毒，易溶于水、酒精、氯仿和甲醛中。细胞分裂时，秋水仙素能抑制纺锤丝的形成，所以染色体虽能正常复制，但不能分向两极，细胞未分裂，造成染色体数目的增加（加倍）。3．单倍体愈伤组织培养加倍取单倍体的茎叶或根进行培养，产生单倍体的愈伤组织，常可诱发核内有丝分裂，使染色体加倍，再分化得到二倍体植株。这方面的效果和秋水仙素处理加倍相仿。二、花粉植株的多样性及鉴定选择花粉植株的倍性问题，从花药培养得到的植株除单倍体外，还有二倍体、三倍体、四倍体和五倍体等。如从紫花曼陀罗花药培养得到的植株中只有7%是单倍体，而70%是二倍体，23%是三倍体。　　花粉植株的当代表现出多样性，倾向于母本、父本、中间或超亲类型。这是由于小孢子带有不同的染色体组而产生的遗传上的区别，此外，也可能是由于培养过程中产生的基因突变引起的。这种多样性的表现也与培养材料有关，杂种F1一般就比常规品种分离的范围更大，更富有多样性。三、单倍体育种的价值　　单倍体育种可以克服性状分离，稳定快，在短期内得到纯合二倍体，是一般育种方法所难以得到的。　　石刁柏是雌雄异株植物，雄株茎粗产量高，茎嫩质量好，如果全都种植雄株就可大大提高产量和品质。采用花药培养的方法得到具纯合“YY”的超雄株和“XX”的雌株杂交，将它们后代分别进行快速繁殖移栽到田间，以后进行杂交，得到的F1代全部为雄株。四、单倍体育种上存在的问题1．诱导频率低　　　花药和花粉培养中普遍存在诱导频率低的问题，如小白菜经愈伤组织培养的诱苗率仅为0.2%，茄子高些也只有1.4%，而经胚状体的诱导率则为0.35%,这主要是由于对花药和花粉培养中小孢子启动的机理和所需条件缺乏深入的研究。在甜椒花药培养中由于多年大量深入的工作，胚状体的诱导频率已提高到16.5%的高水平。2．混倍现象严重　　　混倍现象还比较普遍，由核内有丝分裂，核融合等造成。Carlson等用PEP（对氟苯基丙氨酸）在抑制二倍体细胞分裂，而促进单倍体细胞分裂上获得了良好的结果。也有研究合适的母株生长条件，适宜的切取花药时间，以及恰当的培养基和培养条件，可以降低非单倍体的比例。第七章胚胎培养和试管受精第一节离体胚培养35\n一、成熟胚培养　　成熟胚是指子叶期后及至发育完全的胚，它在含有无机大量元素的培养基上就能正常生长成苗，容易培养成功。在被子植物中，Hannig（1940）年最早在无菌条件下进行了离体胚培养实验，他当时所培养的是两种十字花科植物——辣根菜和萝卜的成熟胚。在胚珠以外环境中进行胚培养的可能性，为研究胚在各个发育时期的营养需要提供了一种很好的机会。利用这种方法，还能对整胚及其各部分的再生潜力进行研究。　　成熟胚培养方法：取成熟或未成熟种子用70%酒精浸泡几秒钟，再用0.1%HgCl2浸泡10~30分钟，无菌水洗净，在无菌条件下进行解剖，取出胚接种于适当的培养基上，培养基常用White(1963)等基本培养基，对微量元素和激素没有特殊要求，pH5.4~7.5均可，常用5.8左右，培养温度以25~30℃为宜，少数植物例外，如马铃薯胚以20℃为好，棉胚在光照下以30℃为好，适当的光照有利于胚芽生长。二、幼胚培养　　　幼胚是指子叶期以前的具胚结构的培养。　　　幼胚培养的操作方法与成熟胚基本相似，但幼胚在取出时必须在较高倍解剖镜下进行，以安全取出完整的幼胚，在培养条件方面，幼胚比成熟胚有更高的要求。（一）培养基常用的有white（1963）、Rijven(1952)、Roppaport(1954)、Nitsch(1959)、Norstog(1963)、Ranga-Swamy(1961)等。1.无机盐：大量元素与微量元素均需要2.C源：　　以蔗糖最佳，既作碳源，也起调节渗透压的作用。幼胚要求较高水平的糖类物质，适于培养的蔗糖浓度一般为8%～12%。3.维生素：　　硫胺素和生物素对幼胚培养十分重要。VB1和VB6能促进幼胚的生长和发芽；VA对玉米胚生长促进作用显著。4.氨基酸：　　需要，但有选择性，如对幼胚，精氨酸效果最好，其他18种氨基酸次之；谷酰胺能显著提高向日葵幼胚的成活率；酪朊水解物（含20多种氨基酸）对曼陀罗幼胚的生长有重要促进作用。5.生长物质：　　低浓度的生长素如（IAA0.05~0.1mg/L）对幼胚生长有促进作用。但高浓度（1~10ppm）却有抑制作用。低浓度的激动素存在对一些植物（如荠菜等）也是有益的，但不同植物反应不一样。6.天然提取物：　　胚在植物体内是受胚乳滋养的，故用胚乳提取物做培养基成分十分有益。未成熟的椰乳对椰子胚和玉米胚都有某种程度的促进作用，后来发现在番茄汁、大麦胚乳、酵母提取液等天然物质中，也有类似“胚胎因子”（embryofactor）的作用。“胚胎因子”的发现是胚培养史上的一个转折点，此后在若干物种中幼胚培养都获得了成功。（二）渗透压植物体上的胚生长在液体胚乳中，该环境具有较高的渗透压。如棉花胚珠液在传粉后10天具有12~13个大气压力，25天后仍具8~9个大气压力。35\n中科院陈维伦等以向日葵幼胚试验，发现幼胚长度为1000~1100um时要求17.5%的糖浓度；2000~2500um时要求糖浓度为16%;5000~5500um时要求12.5%;10000um时要求6%；成熟胚要求0.5%，这说明随着胚的长大，其环境渗透压应逐渐降低。（三）理化因子的影响1．培养基pH值　　　一般要求中性（pH7左右），但单子叶植物幼胚大多要求微酸性，如Norstog和Smith（1963）报道，培养基的pH值对于大麦未成熟胚的器官分化是关键因素，最适值约为4.9，当pH值在5.2以上时，胚虽能生长，但不发生明显分化。幼胚生长发育后期通常要求弱酸性（pH5.5~5.8）。2．气体：　　　玉米胚培养中发现N气有利于幼胚生长；胡萝卜幼胚培养中，创造含1%CO2和50%O2的气体环境条件对生长有明显的促进作用；而正常空气中易产生弱苗。3．温度：　　要求与成熟胚培养基本一致。（多数植物在25～30℃之间生长良好）。4．光照　　：由于胚在母体植株上被包围在胚珠里，故认为胚培对光照无特别要求。有人发现微光中培养有利于产生叶绿素，故在胚培的后期补充一些光照是必要的，一般地，12h/d的间性光照对胚芽的生长有利。光照强度一般以2000lx为宜。第二节胚珠培养胚珠培养不仅是离体授粉的需要，通过它也可以对合子及早期原胚的离体培养反应进行研究。在无菌条件下分离和培养胚珠的最早尝试是由White（1932）在金鱼草中进行的，后来这项技术在印度德里大学得到了发展和完善。一、培养方法将子房（授粉或未授粉）表面消毒，在无菌条件下解剖，小心切取胚珠接种到培养基上；或将附有胚珠的胎座部分切取下来，接种到培养基上进行培养。二、培养条件和培养因素1．培养基：常用Nitsch或White培养基。加蔗糖5%左右，同时添加一些生长物质(如0.2~0.5mg/LKT)、加入水解酪蛋白、黄瓜汁、番茄汁等，可以大大提高成功率和培养效果。据研究，离体胚珠的发育中，培养基的渗透压起着重要的作用，特别是对非常幼嫩的胚珠，其作用格外重要。在矮牵牛中，授粉后7d的胚珠处于球形胚期，若把它们剥离下来，置于含有蔗糖的培养基上培养（蔗糖浓度在4%～10%的范围内高低皆可），它们即能发育为成熟种子。若胚珠内含有的是合子和少数胚乳核，最适的蔗糖浓度为6%；若在受精之后，则为8%。在白车轴草（Trifoliumrepens）中，只有在培养基中添加了黄瓜或西瓜幼果（开花后10d）的果汁时，授粉1～2d后处在合子期或双细胞原胚期的胚珠，在培养中才能发育成成熟种子。若加入黄瓜汁后再加GA3（10mg／L），则能进一步促进这些非常幼嫩的胚珠发育成种子。Wakizuka和Nakajima（1974)还注意到，要想由授粉后不久（2d）剥离下来的矮牵牛胚珠得到发育充分的能发芽的种子，黄瓜汁（5%）也是必不可少的。2．胚珠授粉后的天数：直接影响培养的结果。一般受精后不久的胚珠从胎座上剥离下来培养较困难而通常要受精5-6天后的胚珠才能顺利培养发育成种子。3．附带物：当胚珠带有胎座部分或子房部分时，往往有利于胚珠的成活与发育，这种情况下，即使是受精后3天左右的胚珠，也能培养成活并发育获得成熟的种子。35\n在罂粟离体胚珠（含有合子或双细胞原胚）培养中，即使培养基里补加了水解酪蛋白、椰子汁、腺嘌呤或激动素，胚仍不能进行分化。然而，若是培养连在胎座上的胚珠，合子就能发育成一个正常分化的胚。在离体培养中胎座组织对胚珠生长和发育的有益影响，也见之于白菜类植物。第三节试管受精与子房培养一、子房培养子房培养即指离体条件下子房的无菌培养技术，子房既可是已授粉的，也可是未授粉的。Nitsch（1951）在一种合成培养基上培养了小黄瓜、草莓、番茄、烟草和菜豆等的离体子房，从而奠定了子房培养技术。由以授过粉的花中剥离下来的小黄瓜和番茄的子房发育成了成熟的果实，里面着生着有生活力的种子。然而，这些果实比自然形成的小。（一）培养方法材料需进行表面杀菌。子房培养对基本培养基无严格要求，如Ms、white、Nitsch和Heller培养基都可使用。应添加适当的有机成分和生长激素。培养温度为22~27℃,因材料而异，冬作物可低些，夏作物可高些。一般需要不太强的光照，500～1500lx即可。（二）子房植株的起源可能是从性细胞发源，也可能从体细胞发源。来源于性细胞，即胚里的雌配子体的核，由于它是由大孢子母细胞减数分裂后的大孢子发育而来，因此由它所产生的植株都是单倍体。而来源于体细胞，即由珠被或子房壁表皮二倍体组织所产生的植株，自然是二倍体。（三）影响培养成功的因素子房只需在比较简单的无机盐培养基上就可形成果实，并得到成熟的种子。然而要其性细胞和体细胞通过诱导形成胚状体或愈伤组织，并分化成植株，则对培养基的成分也应有一定的要求。比如，为了从未受精子房诱导来源于胚囊核的单倍体组织，在培养基中加入一定量的外源激素是完全必要的。在胡萝卜子房培养中，培养基中加入酪朊水解物和酵母提取物，可诱导产生多胚。二、试管受精试管受精最初是在罂粟中获得成功的。落到胚珠表面上的花粉粒10～15min后萌发，授粉后1～2d内完成受精，5d内受精胚珠膨大，鼓胀而不透明，里面已形成了一个4个细胞的原胚和若干胚乳游离核。22d后，具有两片子叶的胚即已分化完全。试管受精的方法被用于很多彼此亲合和不亲合的组合中。（一）操作方法由开花前一天的花蕾中剥取所需的子房或胚珠，开花当天或前一天的花蕾中收集花粉（以上花蕾均须表面消毒），操作在无菌条件下进行，人工授粉做法。1．撒花粉于适于萌发的培养基（含2%蔗糖，0.1%CaCl2,0.01%硼酸，10%凝胶）→子房（胚珠）在0.1%CaCl2溶液中浸片刻→将胚珠置于已撒播的花粉中间，在20±1℃下培养24-28h→镜检，观察到花粉管伸入胚珠后→转移胚珠于一盛有液体培养基（Nitsch、加甘氨酸1mg/L、烟酸1mg/L、B1、B6各1mg/L，蔗糖2%）的培养皿中进行子房（胚珠）培养→观察到胚形成后，移至胚培养基（配方同前，但蔗糖增至5%，另加琼脂0.8%）。2.先将离体子房（胚珠）于含有0.4%凝胶、6%蔗糖、0.1%CaCl2和0.01%硼酸的培养基中浸数秒钟，然后于子房（胚珠）上授粉，授粉后的子房（胚珠）在Nitsch培养基（5%蔗糖）上培养。（二）影响试管受精的因素1．柱头和花柱的影响35\n柱头是某些植物受精的障碍，要克服这种障碍，必须切除柱头和花柱，但有时切除柱头和花柱也有副作用，如根据叶树茂等（1978）用烟草试验的结果，柱头和花柱全保留，试管内受精良好，平均有80%的子房能结种子，去掉部分柱头，对产生种子影响不大；但把柱头和花柱全部去掉，就会产生明显不利，仅0.09%的子房能结种子。2．胎座的影响子房或胚珠上带有胎座，有利于试管受精成功，因此，至今试管受精成功的大部分例子，都是用带胎座的子房或胚珠材料进行培养的。同时，多胚珠子房的试管受精亦易成功。3．培养技术，要保证花粉发芽率，应选取合适的培养基，其他如掌握好接种时的胚珠发育时期和授粉时间等，都是取得成功的关键。在进行柱头授粉的时候，应当避免弄湿胚珠和柱头的表面，否则将会影响花粉萌发，导致花粉管破裂，造成结实不良。4．培养基培养基最重要的作用在于促进受精胚珠的正常发育。因此，在进行离体授粉试验之前，先要对准备用做母本的植物的幼龄胚珠（含有合子或几个细胞的原胚）在培养中所需的最适营养成分和激素组成有所了解，这种知识有助于增加成功的几率。5．培养条件关于光对离体授粉胚珠的影响几乎没什么资料。在一般情况下，培养物都是保存在黑暗中或近乎黑暗中。Balatkova等（1977）指出，在某些实验中温度可以影响结实率。他们在水仙属植物中发现，若把培养物保存在15℃，而不是通常的25℃，能显著增加每个子房的结实率。然而在罂粟中，由于它是在较温暖的条件下开花的植物，低温培养并不能提高结实率。6．基因型有证据表明，离体授粉的玉米子房对培养的反应存在着基因型差异。　　　　　　第四节胚乳培养在裸子植物中，胚乳是由雌配子体发育而成，故它是单倍体组织，而在被子植物中，胚乳是双受精的产物之一，由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成，所以是三倍体组织。在过去几十年间，很多研究已经充分肯定了胚乳细胞在离体条件下可以无限增生和进行器官分化。由于胚乳细胞是三倍体，人们设想由它所形成的植株可能也是三倍体。因此，在植物育种工作中，人们一直期望可以用胚乳培养的方法，代替四倍体和二倍体杂交来生产三倍体。在自然条件下，胚乳细胞以淀粉、蛋白质和脂类的形式贮存着大量的营养物质，以供胚胎发育和种子萌发之需。因此，胚乳是研究这些代谢过程的一个理想系统。一、培养技术在胚乳培养中，除少数寄生或半寄生植物可以直接从胚乳分化器官以外，绝大多数被子植物的胚乳，无论是未成熟的还是成熟的，都需要首先经历愈伤组织阶段，然后才能分化植株。（一）愈伤组织的诱导培养1．取授粉4～8天后的幼果，用70%酒精表面消毒数秒钟，再用饱和漂白粉灭菌10～20min，用无菌水冲洗3～4次。2．在无菌条件下切开幼果，取出种子，小心分离出胚乳，接种在培养基上培养，常用的基本培养基为MS、White等，添加适当激素，如2.4-D或NAA0.5-2.0mg/L，BA或KT0.1-1.0mg/L，蔗糖2-3%。3．在25～27℃和黑暗条件下或散射光条件下约6～10天后，外观显得膨大而光滑，往往在切口处形成乳白色的突起，并不断增殖成团块，成为典型的愈伤组织，这时，应及时转到分化培养基上培养。否则愈伤组织会停止生长，直至老化死亡。35\n（二）愈伤组织的再分化诱导培养把正在生长的愈伤组织及时进行分化培养，用于分化培养的基本培养基主要有White和MS培养基，添加BA或KT或ZT0.5～3.0mg/L和NAA0.05～0.5mg/L，或IAA0.5～2.0mg/L。有些作物（如柚子）添加适量赤霉素是必要的，分化培养需供给充足的光照。（三）胚乳苗生根培养有些胚乳植株可直接由胚状体或不定芽形成，但有些胚乳植株需将不定芽移至生根培养基上进行生根培养，才能长成完整植株。用于生根培养的基本培养基有white,1/2MS等，添加NAA0.5mg/L或IBA1-5mg/L，有的也不加任何激素。在贴近愈伤组织处切不定芽，插入生根培养基中，光下培养约10～15天后，就会在芽的切口处长出白色的根。二、影响胚乳培养的因素（一）胚乳的发生类型和发育程度处于发育早期的未成熟胚乳，比较难以产生愈伤组织和分化成器官。旺盛生长期的胚乳是培养取材最适合时期，胚乳培养成功的绝大多数植物都是取材于这个时期，愈伤组织诱导频率可高达60～90%，例如处于这一时期的葡萄、苹果和桃的胚乳，愈伤组织诱导频率皆高达90%～95%。成熟期的胚乳在一般情况下，愈伤组织的诱导频率很低，甚至不能产生愈伤组织。例如，种子发育中后期的苹果胚乳，愈伤组织的诱导频率不超过2%～5%；接近成熟的葡萄胚乳几乎不能产生愈伤组织；完全成熟的猕猴桃种间杂种胚乳，在离体条件下不能生长和增殖。而不少木本植物，特别是一些大戟科、桑寄生科和檀香科植物，它们的成熟胚乳不仅能产生愈伤组织，而且其中有些还能表现不同程度的器官分化，或是产生完整的再生植株。（二）植物激素在单子叶植物的胚乳培养中，为了诱导愈伤组织，在培养基中必须补充一定浓度的2.4-D，有时也用其他生长素NAA和IAA。中华猕猴桃胚乳只有在高浓度的玉米素（3mg/L）与2.4-D（0.5mg/L）配合下，才能很好地诱导胚乳愈伤组织形成。柑桔只有在加有BA（0.5mg/L）,2.4-D(2mg/L)和CH（1000mg/L）的培养基上，胚乳才表现膨大，产生致密的生长旺盛的愈伤组织。胚乳愈伤组织的芽分化培养中，单子叶植物往往要去掉2.4-D或降低生长素浓度，并添加适当浓度的细胞分裂素后才能促进愈伤组织的分化和进一步长成胚乳植株。马铃薯胚乳愈伤组织分化和小苗的生长过程中，GA3表现了有益的作用。柑桔胚乳的胚状体发育，需要把赤霉素的浓度提高到15mg/L。第八章细胞培养第一节悬浮细胞培养悬浮细胞培养是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行无菌培养的技术，它是从愈伤组织的液体培养技术基础上发展起来的一种新的培养技术，此项技术目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐大规模工业生产的连续培养。一、悬浮细胞的起始培养（一）起始悬浮培养悬浮培养是把已建立的愈伤组织转移到液体培养基中起始培养，并须在培养过程中不断进行较强烈的搅拌或振动，使愈伤组织块上的细胞被剥落到液体培养基中，增加细胞的分散程度。在选用起始愈伤组织时，最好选用松疏脆弱，生长快的愈伤组织进行起始培养。如果愈伤组织十分紧密，其细胞不易分散，则可采用①加生长激素的浓度，加快细胞分裂和生长速度，　　　②用果胶酶打破细胞间的连接，使成游离细胞，（二）细胞株的筛选35\n筛选细胞株的方法如下：　　（1）从已建立的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织；　　（2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团；　　（3）接种在固体培养基上，培养约2周；　　（4）挑选生长快的细胞株并继代培养；　　（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分含量高而生长较快的细胞株。二、悬浮细胞培养的种类（一）成批培养指在含有固定体积培养基的容器系统中的培养，目的是建立单细胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化工作常用的培养方法。1、成批培养的特点（1）细胞生长在固定体积的培养基中（2）细胞数目在从始至终的生长周期中，大致呈S形曲线，①延迟期：细胞生长很少；②对数生长期：细胞分裂活跃，数目迅速增加；③直线生长期④减慢期⑤静止期经过3～4个细胞世代之后，由于培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒代谢产物的积累，增长逐渐缓慢，由直线生长期经减慢期，最后进入静止期，增长完全停止。（3）成批培养除空气和挥发性代谢物可以同外界交换外，一切都是在一个封闭系统中进行。（4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，方法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养基中（大约稀释5倍）。2、成批培养方法（1）旋转培养.培养瓶呈360℃的缓慢旋转移动，使细胞培养物保持均匀分布和保证空气供应，每分钟转1～5转。（2）往返振荡培养.机器带动培养瓶在一直线方向往返振荡。（3）旋转振荡培养.机器带动培养瓶在平行面上作转动，每分钟40～120次不等。（4）搅动培养.利用搅捧不断转动使培养基被搅动。（二）连续培养指在培养过程中不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充和保持其恒定体积的培养。1、连续培养的特点：　　（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。　　（2）可在培养期间使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖速度快。　　（3）适于大规模工业化生产。2、连续培养的种类（1）半连续培养指每隔一定时间后倒出一定量的悬浮液，并同时加入等量的新鲜培养液，这相当于成批培养时频繁地进行再培养，半连续培养能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生化研究之用。35\n（2）连续培养有封闭式和开放式连续培养。A、封闭式连续培养新鲜培养液和老培养液以等量进出，并把排出的细胞收集，放入培养系统继续培养，所以培养系统中的细胞数目不断增加。B、开放式连续培养在连续培养期间，新鲜培养液的注入速度等于细胞悬浮液的排出速度，细胞也随悬浮液一起排出，当细胞生长达到稳定状态时，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数，因此，培养系统中的细胞密度保持恒定。连续培养是植物细胞培养技术中的一项重要进展，它对于植物细胞代谢调节的研究，对于决定各个生长限制因子对细胞生长的影响，以及对于次生物质的大量生产等都有一定意义。第二节单细胞培养单细胞培养是指从植物器官或愈伤组织游离出的单个细胞的无菌培养。一、培养方法→看护培养；微室培养；平板培养（一）看护培养法　　看护培养法是用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，以促进其持续分裂和增殖的培养方法。这个方法最初是由Muir等人（1954）设计的，当时是为了由烟草和金盏花细胞悬浮液和易碎的愈伤组织中取单细胞进行培养。这个方法的主要特点，是把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间，有一片滤纸相隔。具体做法：　　1、把琼指培养基加到小三角瓶中使之约成为0.5-1.0cm厚。　　2、选择处于活跃生长的约1cm大小的愈伤组织块。　　3、把愈伤组织块安放在三角瓶中固体培养基上的中央部位，并在愈伤组织上放一片约1cm2无菌滤纸片，在培养室中放置过夜。　　4、从悬浮培养物或疏松的愈伤组织上分离出单个细胞，并把单个细胞接种在三角瓶中的滤纸面上。5、置于保温和恒温的培养箱（室）中培养。由于培养基和愈伤组织供给单细胞的生长因素，使细胞能持续分裂形成细胞团。6、把从单细胞形成的细胞团转移到新鲜培养基上培养，得到单细胞无性系。（二）微室培养　　微室培养法是指在无菌小室中培养接有单细胞的培养液小滴，使细胞得以生长和增殖成单细胞无性系的无菌培养的方法，它是为进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。这个方法是由Jones等人（1960）设计的，其中用条件培养基代替了看护组织，将细胞置于微室中进行培养。这个方法的主要优点，是在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。具体做法：　　1.由悬浮培养物中取出一滴只含有一个单细胞的培养液，置于一张无菌载玻片上；　　2.在这滴培养液的四周与之隔一定的距离加上一圈石蜡油，构成微室的“围墙”；　　3.在围墙上盖一张盖玻片则构成了一个微室。　　构成“围墙”的石蜡油能阻止微室中水分的丢失，当细胞团长到一定大小以后，揭掉盖片，把组织转到新鲜的液体或半固体培养基上培养。Vasil和Hildebrandt（1965）证明，应用微室培养法，可以由一个离体的烟草单细胞开始，获得一个完整的开花植株。（三）平板培养法35\n平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。1、单细胞悬浮液的制备　　将要培养的材料诱导形成愈伤组织，再把它或器官组织用酶法或机械振荡培养法游离出单细胞，然后用适当大小孔径的不锈钢丝网过滤，除去残渣和多细胞团块，滤液即为细胞悬浮液。2、悬浮细胞密度的调制　　（1）滴一滴悬浮细胞液到计数板凹槽中。　　（2）盖上盖玻片稍压使与计数板紧密结合，若凹槽中有气泡，应重新制作。　　（3）放置显微镜下经重复多次观察，记下视野中计数板上方格内的细胞数。　　（4）换算成每ml中细胞数　　一般的平板培养要求细胞密度为103-105个/ml，若悬浮液同琼脂培养基1︰2或4混合，则应把悬浮液的细胞密度调到2×103～2×105或4×105/ml，若悬浮液中细胞密度高于此值，则加培养液稀释；若低于此值，则通过离心使细胞下沉后，吸出一定量上清液使达到所要求的密度。3、琼脂培养基的配制　　一是直接配制1.4%琼脂培养基；　　二是配制条件培养基，可提高植板效率，其制作方法是，首先把已进行一段时期亲本细胞培养的液体培养基离心，沉淀细胞材料，取上清液一份同灭菌的2.8%琼脂培养基一份趁热充分混合，即为含1.4%琼脂的条件培养基。4、平板的制作　取上述已知细胞密度的单细胞悬浮液1份，与溶化状态（35℃）1.4%琼脂条件培养基1份充分混合均匀，倒入各个无菌培养皿中，制成3mm厚的琼脂培养基平板，盖上皿盖后密封。5、培养将平板置于约26℃和黑暗下培养。6、计算植板率用平板法培养单细胞或原生质体时，常以植板率来表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数。植板率的计算公式如下：植板率（%）=其中每个平板上接种的细胞总数，等于铺板时加入的细胞悬浮液的容积，和每单位容积悬浮液中的细胞数的乘积。每个平板上形成的细胞团数，则须在实验末期直接测定。二、影响培养细胞生长的因素（一）条件培养基的作用主要是提供单细胞生长必要的代谢物。因此可利用生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基培养单细胞，以促进细胞正常生长和分裂，这种生长过悬浮细胞的液体培养基称为条件培养基。（二）细胞密度　　单细胞培养要求植板的细胞有一个标准的临界密度，当低于这个临界密度时，细胞就不能分裂。临界密度不是一成不变的，它因培养的状况而改变，即培养基的成分越复杂，营养成分越丰富，则植板细胞的临界密度越低，反之，植板密度要求越高，一般要求每ml在103个细胞以上。（三）生长激素35\n在单细胞培养中，补充生长激素是非常重要的，它可以大大地提高植板率。如在低密度植板的旋花属植物细胞培养中，必须加入一种细胞分裂素和几种氨基酸，才能开始生长和分裂，而这些物质对于该物种的愈伤组织培养并不必要。在美国梧桐的细胞培养中，也看到类似情况。（四）pH值适当调整培养基中的pH值，也能提高植板率。假挪威槭的悬浮细胞培养中，有合适的培养基时，把pH小心调到6.4，其起始细胞的最低有效密度可从9-15×103个/ml降低到2×103个/ml。（五）CO2　　大气中的CO2浓度约为0.03%，如果人为地（如用氢氧化钾吸收）降低瓶内的CO2的浓度，细胞分裂就停止或不能发生，当人为地提高CO2浓度到1%，则能促进细胞生长，如果再进一步提高到2%则反而抑制细胞生长。第三节细胞突变体的筛选　　从细胞水平上筛选突变体，较之整体植物有许多优点；（1）它可同时从大量细胞中筛选到所需的特性；（2）一个细胞的平均分裂周期不足一天，大大缩短了筛选周期；（3）由于条件可控制，细胞可重复生长在相同的环境条件下，因而可进行重复的选择程序；（4）由于突变体是来自细胞，可更加严格地确定突变体的特性。　　一、细胞材料的制备分离植物各个器官，在离体条件下诱导形成愈伤组织，进而继代在液体培养基中进行振荡培养，从而获得小细胞团和单细胞的悬浮液，也可从器官或细胞培养物游离单个细胞的原生质体进行突变体筛选。　　二、细胞诱变处理用各种物理的、化学的诱变因子处理细胞材料，使细胞发生突变常用的物理诱变因子有r射线，紫外线等。常用的化学诱变因子有甲基磺酸乙酯（EMS）。　　三、突变体的筛选可根据期望的筛选的突变体特性，向培养基中加入一些胁迫因素，如病菌毒素、盐类、除草剂、氨基酸类似物等，把细胞接种到这些培养基上培养，结果会发现，多数正常细胞不能生长而死亡，而个别突变细胞则继续生长，形成愈伤组织。　　四、突变细胞的植株再生将筛选出的愈伤组织转移到分化培养基进行分化培养，让它发育成完整的植株，直到开花结果，得到有生活力的种子。　　五、细胞突变体的鉴定细胞水平上鉴定整体水平上鉴定　　六、对突变体进行选择和农艺性状比较试验，选出优于亲本的材料，培育成品种。　　　　第九章原生质体培养与融合35\n　　植物原生质体是指通过质壁分离，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。换言之，原生质体就是去除细胞壁后的裸露细胞，是能存活的植物细胞的最小单位。　　　　　　　第一节原生质体培养的意义　　一、原生质体培养的概况自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有“全能性”，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klercker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。　　1960年，英国植物生理学家Coeking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。而至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场，植物原生质体研究成为一个热门的领域。　　至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝卜、矮牵牛、茄子、番茄等植物的原生质体再生成完整的植株。此外，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。二、原生质体培养的意义（一）再生植株由原生质体再生植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究方面，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①能得到大量均一的细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养在大田可种植5亩地左右的细胞数；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需l～2个小时。（二）用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。（三）原生质体的遗传转化研究原生质体还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。　　　　　　　第二节原生质体的分离　　要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在本世纪前期是采用机械分离法，即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织。Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。一、植物材料（一）材料的种类一般来说，植物各个器官，如：根、茎叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。35\n最常用而且在短期内能提供大量同质原生质体的，是叶肉细胞，以及由其他柔嫩部分制备的培养细胞或悬浮细胞。用叶肉细胞分离原生质体有以下优点：取材方便，供应量大且及时；存在叶绿体，便于观察和在融合中识别。叶片取自组织培养的无菌苗还可减少消毒的麻烦和降低污染率。由愈伤组织或悬浮细胞来源的原生质体。对这类愈伤组织或悬浮细胞，最好选取那些易于分生和分化的组织，未成熟胚及幼穗来源的胚性细胞可能是最有利于分化的材料。（二）植物材料的预处理　　对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率，也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48小时后分离原生质体，才会获得较高的原生质体产量。　　在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁。龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。二、分离植物原生质体的酶1．酶的种类要使植物细胞壁降解释放出原生质体，必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物质水解的酶制剂，最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。大多数商品酶制剂都不同程度地含有有毒成分和其他水解酶、酚和盐类等，故在使用前，有时将商品酶制剂先进行纯化以清除毒物。2．渗透稳定剂植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能发生原生质体的分裂。因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40～0.80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂。②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性，从而使原生质体稳定。　　另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。3．酶溶液的pH值酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5.0时，原生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。35\n三、酶法分离原生质体的操作程序（一）原生质体分离　　分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。酶法分离原生质体有顺序法和直接法两种。　　顺序法又称二步法，即先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。直接法又称一步法，即用果胶酶和纤维素酶等混合处理材料，为目前最常用的方法。植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。并且可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5.0～6.0），在25～33℃条件下酶解24h。原生质体——酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。酶解处理一般在黑暗静止状况下进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃，但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。（二）原生质体的纯化　　在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液，以净化原生质体。常见纯化方法有“过滤——离心法”、“漂浮法”、“界面法”等。（三）原生质体活力的测定　　在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。1、目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。如形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。2、染色法常用染料有双醋酸荧光素（FDA）、酚藏红花及伊文思蓝等。FDA染色后，染料只累积于具活力的原生质体内，死细胞内则无，通过荧光显微镜观察，即可分辩出死活原生质体并计算出存活百分率。酚藏红花也能为活原生质体吸收而呈红色，死原生质体不吸收故而无色。伊文思蓝则与上述染料相反，它只被死原生质体吸收，因此，染色后显蓝色的原生质体无活力。3、渗透变压法凡原生质体体积可随介质渗透压变化而改变者，即为活原生质体。35\n4、耗氧电极法根据所测定的原生质体的耗氧率来判断其相对活力的方法。四、影响原生质体分离的因素1、胞壁降解酶的种类，浓度；2、酶液的渗透势及酸碱度；3、分离的环境条件（如温度）与延续时间；4、分离容器内的通气状况；5、供体植物的生理状况，该因素又直接受植物生长的季节和条件，植株和供体组织的生理年龄、预处理措施（如预培养、暗培养、药物处理、萎蔫处理等）以及供体离体培养物的类型和生长条件等的影响。第三节原生质体培养　　将有生活力的原生质体在适当的培养基和培养条件下培养，很快就开始出现细胞壁再生和细胞分裂的过程。约l～2个月后，通过细胞的持续分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导芽和根长成完整的植株。一、原生质体培养的方法（一）液体浅层培养法　　它是将含有一定密度的原生质体悬浮液放在玻璃或塑料培养皿中，形成一个液体薄层，封口后放在培养室中静置培养优点是通气性好，接触氧气面大，排出物易扩散，而且易于补加新鲜培养基；一般每隔5～7天加一次；同时也易于倒置显微镜进行观察和照像。这一方法是目前各实验室主要的常规培养方法。（二）固体平板法　把熔化的35℃琼脂等比混入制备好的含有原生质体的液体培养基中，混匀后，凝固成薄层琼脂平板，原生质体分布在不同层次中，优点：便于定点观察培养效果及生长发育情况，缺点：生长比液体培养基慢。（三）悬滴培养法　　将原生质体悬浮在培养基中，然后取0.1ml含原生质体的培养液接种到小培养皿的底部形成小滴，密封后把培养皿翻转过来，培养基在培养皿内形成倒置的悬滴，放入培养箱中进行培养，这时原生质体多集中在悬滴的中央，便于进行显微镜观察。必须注意待形成小细胞团后要及时转移到固体或液体培养基中培养。二、细胞与植株再生（一）细胞壁的再生　　植物叶肉原生质体在培养中，首先增加体积、膨大、叶绿体重排于细胞核周围，在短时间内合成新细胞壁，进而由球形变成长椭圆形，在1-2天内便可形成完整的细胞壁。用荧光白染色，在荧光显微镜下可见到白色荧光围绕细胞外表，证明细胞壁已形成，也可以高渗液产生质壁分离的方法来证实新壁的存在。（二）细胞分裂第一次细胞分裂依赖于壁的形成，但在少数植物上，看到细胞分裂早于壁的形成。许多因素对启动细胞分裂是重要的，如受体植物的基因型、培养基、培养环境条件，和用于原生质体游离的受体组织条件等。为了使由原生质体再生的细胞能持续分裂，应及时地添加新鲜的低渗培养基；在某些情况下，可以增加有利细胞分裂的蔗糖浓度以代替甘露醇或葡萄糖等糖源。（三）植株再生35\n从原生质体形成的小细胞团或愈伤组织，当转移到固体分化培养基上后，即可诱导形态发生而逐渐长成完整的植株。原生质体来源的细胞器官发生也可通过两条途径，一是通过愈伤组织形成不定芽；另一条途径是由植物原生质体再生细胞在培养中直接诱导胚状体，由胚状体发育成完整植株。　　　　　　　　第四节原生质体融合　　体细胞融合：又称原生质体融合，体细胞杂交，它是以植物体细胞原生质体亲本进行融合而获得杂种后代的一种细胞工程技术。这是70年代兴起的一项新技术。原生质体融合的诱导融合体和杂种细胞的选择杂种植株的再生鉴定与植物的有性杂交相比，体细胞杂交有以下一些特点：能克服有性杂交的配对不亲和性，形成远缘的种间杂种；能产生“胞质杂种”（Cybrid），并获得范围极广的遗传变异；能实现两个以上亲本的融合；能获得遗传上呈现双亲个体的基因型总和的杂种；能获得一些具有有性生殖障碍的植物种类的体细胞杂种；一、融合方式原生质体的融合方式分自发融合和诱导融合两类。（一）自发融合除去细胞壁的原生质体，由于无细胞壁的机械隔离，当它们彼此靠近时，就会发生融合成为一体，这种未经融合剂诱导而发生的融合现象即称自发融合，融合后得到的产物叫做融合体或融合产物。　　自发融合是植物组织在酶法分离原生质体过程中可以看到的原生质体自然融合现象，产生自发融合的原因，一般认为是由于分离原生质体前，细胞与细胞之间如原生质体本来就以胞间连丝连结着，当细胞壁融合时，胞间连丝收缩，使两个原生质体互相靠近而粘结融合在一起，如果把细胞隔离出来，破坏胞间连丝，那就很难发生自发融合，因为这时无胞间连丝的牵引力，不能克服原生质体相互排斥的力量，故两个原生质体无法接近，自发融合多为同源融合，且融合频率很低。（二）诱导融合　　诱导融合是指用诱导剂诱导两个原生质体之间发生融合的现象，这时原生质体的融合是依靠诱导剂克服不同原生质体的排斥力量，使之彼此融合的。诱导融合的方法大体可以分为物理的和化学的两类。前者是利用显微操作、离心或振动等机械法以促使原生质体融合，这种方法目前多与诱导剂结合起来使用，化学融合法是用不同的试剂作诱导剂，促使原生质体融合。目前常用的比较有效的是高pH值一高钙法和聚二乙醇法。1.高pH、高Ca++法Keller和Melchers（1973）研究了高pH配合高钙离子诱导烟草原生质体融合的方法。诱导原生质体融合的溶液含有0.05mol/L的CaCl2·2H2O、0.4mol/L的甘露醇，甘氨酸与NaOH作缓冲液，pH为10.5，处理后原生质体离心，然后在37℃恒温水浴中温育40～50min，经过上述诱导处理的原生质体20～50%发生融合。2.聚乙二醇法Kao等（1974）开辟了用聚乙二醇（PEG）的融合技术，使原生质体融合率明显提高。他们把PEG和高Ca++，高pH液结合起来使用，使大豆和粉蓝烟草的原生质体融合率达到10-35%。35\n二、融合体的形成和发育（一）壁再生　　在实现了膜质融合后，还必须使异核体重新长出新的共同细胞壁。　　将异核体收集后，转移到具有一定渗透压的适宜培养基上无菌培养24小时，可以开始形成新的细胞壁，异核体的表面开始沉积有大量纤维素微纤丝，微纤丝经过进一步互相交织和堆积，几天后便形成有共同壁的异核细胞。（二）核融合异核体的核融合是在两亲本同步分裂过程中发生的。即：双亲细胞核在异核细胞中迅速实现同步有丝分裂，形成共同纺锤体，全部染色体都排列在赤道板上，进行正常的细胞分裂而产生子细胞（杂种细胞），子细胞的细胞核中含有双亲细胞的染色体及其携带的遗传物质，实现了核融合但是，也可能双亲核的有丝分裂不能同步或同步性不好，因而不能发生真正的核融合（三）细胞增殖　　一旦产生了杂种细胞，便有可能通过持续分裂，逐步形成肉眼可见的杂种愈伤组织。大豆和粉蓝烟草的杂种愈伤组织，培养了6个月，仍具有双亲的染色体。白菜型油菜叶肉细胞与拟南芥菜愈伤组织的原生质体融合产生的杂种愈伤组织，在7个月的培养期间，仍保持双亲的染色体。但是，大多数组织在观察到1-2次细胞分裂，甚至上百次细胞分裂后，便停止持续分裂，而逐渐衰老死亡。　　　　　　第五节异核体或杂种细胞的选择　　两个亲本的原生质体互相融合以后形成异核体，异核体在再生细胞壁进而有丝分裂的过程中发生核融合后，我们称之为杂种细胞。杂种细胞的选择方法大致可分为三类：1、利用或诱发各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选出来。2、利用或人为地造成两个亲本间原生质体的物理特性差异，从而选出杂种细胞。3、利用或人为地造成细胞生长或分化能力的差异，从而进行选择　　　　　　　　第六节体细胞杂种的再生鉴定一、杂种植株的再生1、大多数重要经济作物的原生质体不能再生成植株，限制了在更多的作物上的应用。2、大多数体细胞杂种植株的染色体不稳定，出现非整倍体，导致植株有性不孕。3、种间的有性不亲和性限制着体细胞的亲和性。二、杂种植株的鉴定（一）形态学鉴定??这种方法是鉴定杂种的最准确的方法。因为要在形态上表现出杂种性来，就必须有内部的大量基因的协调活动，而且基因的活动必须和细胞的活动取得了协调。但经愈伤组织途径再生植株与原生质融合产生的变异很难区别，因此仅以形态特征来判断不太可靠，尚需配合其他方法。（二）细胞学观察??应用染色体计数方法、核型分析和显带技术以亲本为对照，对杂种细胞的染色体数目、大小与形态的变化等进行观察比较。此法优于形态学鉴定，对亲源关系远的杂种细胞的判断准确性较好。（三）同工酶分析?一般以双方亲本的同工酶谱带作为对照，杂种细胞都具有双亲谱带的总和。有时还出现新的谱带，则说明融合产物是异源性的。应用于分析的同工酶很多，已成功使用的有过氧化物酶、乳酸脱氢酶、脂酶、氨肽酶等。由于植物在不同的发育阶段，在不同的组织中，同工酶谱带本身可以有较大的差异，因此进行这方面的比较时，应注意取样的部位和时间要严格一致。35\n　　第十章植物种质资源的试管保存　　　　　　　　第一节试管保存概述一、试管保存的优点1.可节省种质贮存空间（土地）和人力2.可减少田间更新中带来的遗传变迁和退化3.可生产并长期保存无病原的原种，便于国际间的种质收集与交换二、植物种质资源试管保存的类型1.干燥保存将保存物脱水，风干4-7天后，在0℃低温下贮藏种质。2.液体石蜡层覆盖法借石蜡油层覆盖隔绝氧气供应，从而降低贮存材料生长速度以达到长期贮存的目的。油层覆盖同时具有防止培养基干燥的作用。3.低温保存法在0-5℃左右的低温下进行组织培养，以低温限制生长从而长期保存培养材料的方法。适于茎尖分生组织的保存。4.低氧贮藏法结合0-5℃低温，施以低氧条件抑制细胞的生理活动，从而延缓衰老以达到长期贮存的目的。5.超低温保存法在液氮低温（-196℃）条件下贮存植物茎尖或其他组织或细胞的方法。　　　　　　第二节试管超低温保存的原理一、冷冻损伤的原理植物组织或细胞遭受冷冻损伤，原因主要有两个方面：一是在细胞内形成大的冰晶，导致细胞器和细胞本身的破裂；二是细胞内溶质浓度增加到变性水平。二、植物的耐寒性和耐冻性产生耐寒耐冻性的机制包括：1、组织在过冷条件下生存的能力增加。2、产生某些抗冷化合物，降低了组织的冰点。3、在需要的情况下阻止或促进细胞内冰的形成等。三、冷冻保护剂作用的原理　　在冷冻条件下采用一些中性溶质试剂，可以明显地增强生物组织的抗冷或耐冻能力，这类物质在抗冻生理学上即被称为“冷冻保护剂”或“防冻剂”。常见的防冻剂有DMSO（二甲亚砜）、PEG（聚乙二醇）、甘油及各种糖类等。防冻剂的作用原理：1、在溶液中产生强烈的水合作用，提高溶液的粘滞性，从而可在温度下降的同时降低冰晶形成和增长的速度。2、增加细胞膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，从而防止细胞内结冰的伤害。3、在冷冻过程中减少冰的形成，从而减少组织内溶质浓度的迅速升高。4、糖类物质（如海藻类糖）对膜也具有一定的保护作用。　　一种防冻剂难以同时具备以上所有的防冻特性。因此，工作中往往采用多种防冻剂配合作用，以取得更好的效果。采用“10%DMSO+8%葡萄糖+10%PEG6000+0.3%CaCl2”35\n的处理，可有多方面的防冻作用：DMSO既能增加细胞膜透性，加快胞内水分向胞外转移的速度，又能进入细胞，增大溶质浓度从而抑制细胞内冰晶的形成。PEG6000在细胞外能延缓冰晶的增长速度，故能配合DMSO使细胞水分外移；糖能保护细胞膜，从而增加膜耐冷冲击的能力；Ca++也有助于加强整个细胞膜体系的稳定性。　　　　　　　　第三节试管保存的方法一、低温保存　　取顶芽、腋芽或其他器官、组织作材料，接种于MS培养基（加入合适的冷冻保护剂）上，于0～5℃低温下贮存，通常一年后转移到新鲜培养基上继代并使之在25℃±1℃下正常生长一代，然后再于低温下贮存。如此反复，可安全贮存种质材料，方法简便易行。缺点：每隔一定时间需要继代培养。注意：采用顶芽、腋芽等茎尖材料作为外植体进行试管保存，可以比较理想地保持原有遗传性的稳定（继代培养可能会导致遗传变异）。二、超低温保存　　超低温保存也叫冷冻保存，一般以液态氮（-196℃）为冷源，使温度维持在-196℃。在如此低温下，新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”（suspendedanimation）状态。在此状态下材料不可能产生遗传变异。可对材料进行长期保存。1、外植体的选择与处理茎尖，愈伤组织，悬浮细胞，花粉，胚等器官或组织均可作为超低温贮存的材料。材料应选择幼龄的组织细胞，如茎尖和幼胚等，这些材料遗传稳定，再生能力强，解冻后易于成活和种植，对于冷冻和解冻过程中所产生的胁迫忍受能力也强。取材以冬天生长的植株为宜。在贮存前，往往应对外植体进行预培养和低温处理，以提高组织细胞的抗寒能力。预培养一般需7～12天，培养基中加入能提高抗寒力的物质如山梨糖醇，ABA（脱落酸），或增加糖浓度等。低温处理的方法是将外植体放在2～3℃低温下锻炼数天，处理后可明显提高材料的抗冻力。超低温处理前，还必须进行冷冻保护剂处理。其方法为：先将保护剂预冷至0℃，等体积与培养基混合，静置30～60min。这是因为DMSO等保护剂有毒，所以必须在0℃下处理，而且处理时间不宜过长，一般不超过1h。2、降温冷冻材料经冷冻保护剂预处理30-60min以后，应立即降温冰冻，最后达到液N低温保存。从0℃到-196℃的降温过程，通常有三种方法：（1）快速冷冻法：将保存材料从0℃(或其他预处理温度)直接投入液氮中。　　适于那些高度脱水的植物材料如种子、花粉、球茎或块根等。一些抗寒木本植物的枝条或冬芽，经过冬季的细胞外结冰充分脱水后，也可采用此法。此外，不少植物的茎尖组织保存用此法也有成功的报道。原理：利用超速冷冻，可使细胞内的水迅速通过冰晶生长的危险温度区（-10~-140℃），使细胞内水分还未来得及形成冰晶中心，就降到-196℃的安全区，此时细胞内的水为玻璃化状态，该状态时细胞结构不产生破坏作用，从而减轻或避免细胞内结冰的危害。（2）慢速冷冻法本法是以每分钟0.1～10℃的降温速度（一般1～2℃/min）使材料从0℃降至-10℃左右，随即浸入液氮，降至-196℃。在此条件下可以使细胞内的水有充足的时间不断地转移到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少到最低限度，避免在细胞内结冰。本法适用于成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于保存在悬浮培养中的细胞特别有效。（3）两步冷冻法35\n此法是指植物的组织和细胞在放入液氮前，经过一个短时间的低温锻炼。可分为两步冷冻法和逐级冷冻法两种。①两步冷冻法此法实际是慢速冷冻法和快速冷冻法的结合。它的第一步是采用0.5-4℃/min的慢速降温使温度从0℃降至-40℃；第二步是投入液氮迅速冷冻。植物材料在第一步冷冻后，必须停留一段时间，使材料充分脱水。材料悬浮培养细胞和愈伤组织的冷冻保存多使用此法。烟草、萝卜、长春花、水稻、玉米、大豆、人参、杨树等悬浮细胞或愈伤组织均以此获得了成功。②逐级冷冻法　　此法是在程序降温仪或连续降温冷冻设备的条件下采用的一种冷冻保存方法，一般先制备不同等级温度的溶液。如-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃等。植物材料经冷冻保护剂在0℃处理后，逐级通过这些温度。在每一级别温度中停留一定时间（4-6min）然后浸入液氮。这种方法使细胞在解冻后呈现较高的活力。3、化冻（解融）方法　　化冻（或解融）是再培养能否功的关键。化冻过慢，从-196℃~0℃的升温过程中，细胞内玻璃化水可能会发生次生结冰，从而破坏细胞结构，导致死亡。（1）快速化冻法把冷冻材料直接投入37～40℃的温水中。化冻后转入冰槽中保存。材料解冻时的再次结冰危险区域是-50至-10℃。该法可能尽快通过这一区域。（2）慢速化冻法把冷冻材料先置于0℃下，然后逐渐升至室温，让其慢慢解冻。适用于细胞含水量较低的物种或材料。如木本植物的冬芽在0℃下化冻可获得最高的存活率。这是因为冬芽在秋冬低温锻炼以及慢速冰冻的过程中，细胞内的水已最大限度地流到了细胞外结冰。如果快速化冻，则细胞在化冻吸水时会受猛烈的渗透冲击，从而引起细胞膜的破坏。解冻方法的选择不仅与材料特性有关，还与冷冻时采用的方法有关。快速冷冻的材料也应快速解冻。同时还要注意材料避免机械损伤；一旦解冻，就应把试管转至20℃水浴中，并尽快洗涤材料和再培养，以免热伤害。4、生活力及存活率的测定（1）再培养最基本的活力检测方法根据组织细胞的复活程度、存活率、生长速度、组织块的大小和重量的变化，以及分化产生植株的能力和各种遗传性状来表达。存活率%=重新生长细胞（或器官）数目/解冻的细胞（或器官）的数目×100%（2）双酯酸荧光素染色法用于悬浮细胞材料，以0.1%荧光素染料一滴，与等体积化冻后的细胞悬浮液混合后于荧光显微镜下观察记载，只有生活细胞才表现荧光。（3）TTC法其原理在于测定细胞内脱氢酶活性。35