环境生物学实验指导 10页

环境生物学实验报告9岳北农林韦枚大学NorthwestA&FUniversity学院：资源环境学院班级：环科121姓名：李恩德\n学号：2012011757\n环境生物学综合实验—重金属污染对土壤微生物群落结构的影响一、实验目的(1)通过实骑骑证重金属污染对土壤生物学性质的影响。(2)了解Cu、Ni和Cr元素对土壤微生物的潜在毒性。(3)掌握土壤中细菌群落结构的分子测试方法(4)掌握重金属对土壤微生物性质影响和评价的研究方法。二、实验原理微生物群落结构是表征土壤生物学性状的重要指标。土壤受到重金属污染后，重金属的毒性亦能够对土壤微牛物产牛影响，可表现为微牛物的多样性改变、微生物数量降低以及酶活性变化。细菌作为上壤微生物的主要组成部分，其群落结构的变化可敏感地反映岀土壤受到重金属污染的剧烈程度。细菌的群落结构可以用其优势种群的数量来表16SrDNA序列分析是区分不同细菌种群的有效方法之一，它可鉴别生物物种的遗传多样性。本实验依据不同细菌之间具有的遗传多样性差异特征，利用细菌的16SrDNA通用引物，通过PCR技术，收集扩增产物，再利用限制性内切酶对其进行酶切分型，统计不同酶切类型及其所占的比例，进而获得细菌多样性的信息。利用不同重金属污染环境下细菌多样性变化的特征，评估不同污染物对土壤细菌群落结构的影响程度。三'实验仪器(一)实验的主要仪器培养箱，恒温摇床，PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，超净工作台，高速冷冻离心机,离心机，水浴锅，灭菌锅，移液器(10pL、5OyL、200pL、ImL、5mL)等。(-)器Jill1000mL烧杯用于土壤培养；150mL锥形瓶用于土壤悬液的振荡，100mL离心管用于菌液分离，直径为80mm的培养皿用于微生物平板鉴定。另外，配备1000pL、200pL、20gL吸头盒及吸头，1.5mL离心管各一盒，预先进行灭菌处理，置于超净台中保存。四、实验试剂(-)主要生化试剂1.2mmol/L焦磷酸钠溶液\n称取0.446g焦磷酸钠溶于水中，移入500mL容量瓶，用水定容至刻度。2.LB液体培养基称取10.0g蛋口月东，5.0g酵母浸粉，5.0gNaCl于烧杯屮，用量筒量取1L蒸憎水,将其加入烧杯中，置于垫有石棉网的电炉上微微加热，用玻璃棒不断搅拌，待试剂全部溶解后,用1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值为7.0o将其转入1L“蓝盖玻璃瓶”屮，置于灭菌锅中高温灭菌(12rC,35min),冷却后分别倒入10个己灭菌过的150mL锥形瓶中，用灭菌的棉球封口，置于超净台中保存，供接种时使用。3.LB平板培养基称取10.0g蛋口腺，5.0g酵母浸粉，5.0gNaCl及12g琼脂粉于烧杯中，加入1L蒸係水，电炉上加热，用玻璃棒不断搅拌，待试剂全部溶解后，用lmol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH值为7.0o将其转入1L“蓝盖玻璃瓶”中，置于灭菌锅中高温灭菌(12rC,35min),冷却到85°C左右时，小心取出，在超净工作台中分别倒入培养皿中，每只皿的体积大约17-20mL,静置至平板固化。置于超净台中保存，供接种时使用。4.异丙醇5.75%乙醇：量取75mL无水乙醇，用蒸镯水定容至100mL。6.5xKCM：称取3.72g氯化钾，2.21g二水合氯化钙，5.08g六水合氯化镁溶于水中，移入100mL容量瓶，用水定容至刻度。7.电泳缓冲液50xTAEBuffer配制：称量Tris242g,Na2EDTA.2H2O及18.6g于IL烧杯中，向烧杯屮加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀。加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解。用NaOH调pH至8.3,加去离子水定容至1L后，室温保存。使用吋稀释50倍或100倍(lxTAE或0.5XTAE)。8.EB染色剂漠乙噪染色液(EB)10mg/mLo在1L去离子水中加入人约500此的EB液体试剂,溶液稍微变红即可，置于搪瓷盒屮，用于琼脂糖电泳胶的染色。注意EB属于强致癌物,必须小心操作。9•点样缓冲液Loadingbuffer(10x)：0.25%澳酚蓝，40%甘油。10.琼脂糖(一)其他试剂重金属污染物：硫酸铜，硫酸银，銘酸钾。五、实验方法(一)实骑处理设置和土壤培养\n1.土样准备采集0-20cm农田表层土壤样品，自然风干，磨细，过孔径1mm土壤筛。2.添加重金屈处理采用人为添加重金属污染物的方法模拟重金属污染的土壤。重金展污染的强度采用《土壤环境质量标准》屮三级指标的限值。以不加重金属的土壤为对照（加水培养）。表1国家土壤坏境质量标准（浓度单位：mg/kg）项目土壤类型级另一级指标二级指标三级指标自然背景值pH<6.5pH6.5-7.5pH>7.5Cd<0.20.30.30.61Hg<0.150.30.511.5As水出三1530252030旱地冬1540302540Cu农田w3550100100400果园三—150200200400Pb<35250300350500Cr水EDS90250300350400旱地冬90150200250300Zn<100200250300500Ni<40405060200称取100g制备好的土壤样品置于400mL的烧杯中，添加配置好的重金属溶液24mL（按照24%的土壤含水量），置于30°C下静置培养7-14d,使重金属与土壤微生物充分的发生作用。获得模拟重金属污染的土样。不同重金属浓度的溶液配制：参照土壤环境质量标准中的值，按照24mL溶液中含有的重金属等于标准中三级限值配制。其中，铜溶液浓度为1.666gCu/L；银溶液浓度为0.833gNi/L；珞溶液浓度为1.25gCr/Lo注意按照试剂的式量进行换算。（二）微生物菌液制备制备微生物接种液吋，称取12.40g培养后的土样于离心管中，加入90mL灭菌后的2mmol/L焦磷酸钠溶液，30°C下于200rpm震荡浸提1h,再于1000rpm下离心15min,收集上清液作为微生物接种液。（三）微生物培养及分离计数1.微生物计数采用10倍连续稀释法，将接种液分别稀释10、100及1000倍后，分别吸取1002稀释后的菌液，均匀涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释倍数设置3个重复，置于30°C培养箱中培养1-2do分别对不同处理的平板进行计数，获得不同重金属污染条件下对微生物数量影响的信息。2.微生物培养\n分别吸取1.00mL的微生物提取液（菌液）加到100mL灭菌后的LB液体培养基中，置于30°C摇床中生长24h,待菌落充分生长后，直接用于菌落PCR扩增时的DNA模板。也可以采用离心方法收集菌落沉淀，将菌体转移至1.5mL离心管（Eppcndorf管）中，4°C保存（4°C最长可保存一个月，若保存时间较长，可向Eppcndorf管中加入500|1L50%灭菌甘油，・20°C保存）。（四）1%琼脂糖凝胶的制备及点样方法1.1%琼脂糖凝胶配制称1.1g琼脂糖加入100mLTAE缓冲液屮加热熔解。2.胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽屮已加入TAE缓冲液），拔掉梳子。注意缓冲液要高出胶而大约2mm。3.点样每个样品屮加入1/10体积Loadingbuffer（10x）,混匀后用200|1L移液器吸取样品液15-20gL,小心加入点样孔中，避免相互污染。（五）16SrDNA片段的PCR扩增1.引物利用细菌16SrDNA的通用引物，对培养获得的微生物进行PCR扩增。通用引物的序列为：27F:5'・AGAGTTTGATCCTGGCTCAG・3'1492R:5'・TACCTTGTTACGACTT・3‘2.PCR反应体系上、下游引物各1|1L,模板DNA（稀释100倍）2pL,iTaq聚合酶20|1L,最终用ddH2O补足反应总体积为50pL。3.PCR反应条件94°C预变性5min,94°C变性30s,53°C退火40s,72°C延伸90s,30个循环;最后72°C延伸7mino4.PCR产物鉴定收集PCR产物，吸取5（iL用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。电泳仪电压设置为100V,电泳时间大约为40mino电泳后，将琼脂糖胶置于凝胶成像仪上获得电泳图。（六）限制性内切酶酶切分型1.PCR产物的纯化\n采用异丙醇沉淀法纯化PCR产物。在1.5mLEppendorf管屮加入100pL4°C保存的异丙醇，将50ixLPCR产物全部转移到管中，混匀后，・20°C静置2-4h,再于4°C,10000rpm下离心20min,弃上清液。加入200（1L75%乙醇，于4°C,10000rpm下离心5min,弃上清液。此过程重复2次后，置于超净台中吹干，加入20|1LddH20吹悬均匀，于4°C保存。1.限制性内切酶酶切将纯化产物用限制性内切酶HhaI进行消化。酶切体系为：10XBuffer1pL,HhaI限制性内切酶1pL,BSA0.5piL,待切样品6pL,最终用ddH2O补足反应总体积为10gLo酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测电压为75V,电泳时间为90mine在凝胶成像仪上获得电泳图片。2.分型将电泳图片屮的条带进行0・1数据转化，把具有相同酶切条带类型称为一个操作分类单元(OperationalTaxonomicUnit,OTU)。六、数据处理(-)分型将电泳图谱转化为0/1数据，把具有相同酶切条带的类型称为一个操作分类单元(OperationalTaxonomicUnit,OTU),计算出每一类型在各处理中所占百分比，利用绘图软件绘图。利用酶切条带类型的操作分类单元数进行不同细菌多样性参数计算，并分析不同重金属对土壤中微生物的多样性。(二)多样性参数及计算方法1.Shannon-Wiener指数/TH=—£片时/=1P严血N2.Simpson指数(D$)心=1—前i=l3.Richness丰富度指数(dg)%二(S-l)/ltiN4.Eveness均匀度指数(£)E=/771nS其中，仏为种i的个体数，N为总物种数，S为16SrDNA的RFLP总类型数。\n稀释10倍空白稀释10倍样品稀释100倍空白稀释100倍样品稀释1000倍空白稀释1000倍样品计数数据记录表处理实验序号第…天第二天第三天CK10」实验平板受污染无法计数M10-1实验平板受污染无法计数CK10-21475912023958132M10-215682CK10-31515623219M10-313655422435336七、实验结果表不及要求(-)基本实验数据要求1.平板计数结果(图片为最后一次计数的记录)注：“一一”表示菌落数太多难以计数\n2.PCR产物检测的电泳图2000bplOOObp75Obp5OObp25ObplOObp1500bplOOObp8OObp600bp5OObp400bp3OObp2OObplOObp1500bplOOObpSOObp600bp5OObp400bp300bp200bplOObp1.酶切产物检测的电泳图I该四组数据为别组数据■「（不予考虑）2.酶切分型的OTU比例图泳道11泳道12泳道6泳道7条带编号体积(Int)条带百分比条芾编号体积(Int)条带百分比条带编号体积(Int)条带百分比条带编号体积(Int)条带百分比142837323.924583135154922.486069131937723.278377123742325.79638921111776.209223216909210.815603227822620.279011221706523.58446376457742.701537359370337.9749243987457.197213668167.259665427799215.525821419136712.240375424464417.831325420088321.82626520839511.638837525769716.483029543099831.414077519818621.5332263.多样性参数表处理DsdJilaEMl1.4176350.7189120.27781610.8808259M21.4980650.7513790.28045810.9308003CK11.5234760.7690280.28305010.9465887CK21.5434970.7785550.29127910.9590286（-）重金属对土壤微生物（细菌）数量影响分析\n利用平板计算进行比较：在数据统计方面，由于部分培养基在实验过程中受到污染及数目太多无法计数，但对于稀释1000倍的培养基可以较清晰的计数，并且所记录的数据具有一定的代表性。在经过一段的实验过程级数据统计，我们发现在未被污染的培养基中，菌落处于增长的趋势，且污染越严重，微生物生长的越好。可得之以下结论：银对微生物的生长具有一定的促进作用。（三）重金属对土壤细菌群落结构影响分析对照多样性参数表可见，“Shannon-Wiener指数H'”，"Simpson指数（Ds）",“Richness丰富度指数”以及“Eveness均匀度指数”的值，样品的值相对于空白值有所降低，这说明重金属镰会使得微生物物质丰富度降低，影响土壤屮微生物的群落结构。八、存在问题及讨论1.如果实验屮存在导致结果异常的问题，需要详细记录和说明。1）制作培养基时，培养基受到污染，致使部分培养基无法进行计数；2）实验中添加的试剂的量都非常少，容易受操作、仪器、环境的影响；3）电泳过程中，在琼脂槽中加液需要很高的技术，容易使液溢出琼脂槽外影响电泳结果。2.总结本次试验历时5周，在曲东老师及学姐的指导下，我们完成了土壤样品的处理、微生物菌液的制备及微生物计数、菌落PCR扩增、限制性片段长度多态性（RFLP）等四个试验所组成的环境生物学综合实验。学习了平板微生物培养基的制备方法及平板计数法以及微生物多样性的分析方法。对于我在以前所学的微生物学的实验知识有了很好的巩固。也认识到了一些专门的仪器设备及其使用方法和注意事项，大大加深了我对实验的严谨性、客观性等的认识。总之，试验过程收获很多，感谢老师。