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现代生物学实验（三）—微生物与免疫学实验教案课程名称:微生物与免疫学实验英文名称:MicrobiologyandImmunologyLaboratory课程编号:110026课程学时：108学时课程学分：3.0学分教师姓名:郑忠辉张连茹邬小兵前导课程：微生物学（理论课）教学方式:实验及技术理论讲授考试方式:平时考核＋笔试＋实验操作考试一、教学目标和要求微生物学与免疫学实验是生物学重要的基础课之一。本课程的目的是使学生掌握和了解微生物学与免疫学的主要研究方法与技术，巩固和加深基础理论知识，提高分析、解决问题的能力和开拓创新能力，培养学生严肃、严密、严格、求实的科学态度，为从事微生物学与免疫学的研究和应用打下基础。要求学生要做好实验课前的预习，明确每次实验的目的与基本步骤。在实验中要有严紧的科学态度，对实验过程中出现的现象和问题，要仔细思考和分析；认真做好每次实验的实验数据记录及处理工作。二、主要实验内容1.土壤细菌的分离及总数测定2.微生物的形态观察与鉴定3.消毒与灭菌效果的测定4.海洋放线菌抗菌活性菌株的筛选5.酵母胞外多糖的发酵及其测定6.经典血清学反应7.巨噬细胞的收集和观察8.免疫标记技术三、主要教学方法以学生动手实验为主，结合课堂讲授、示范操作及多媒体教学。四、使用教材及主要参考书使用教材：1、林加涵等主编.现代生物学实验（下册）.北京：高等教育出版社，2001.\n2、编补充讲义主要参考书：1、赵斌，何绍江主编.微生物学实验.北京：科学出版社，2002.2、沈萍等主编.微生物学实验.第三版.北京：高等教育出版社，19993、柳忠辉等主编.免疫学常用实验技术.北京：科学出版社，2002年五、实验项目模块1：土壤细菌的分离及总数测定1、培养基的配制与灭菌2、土壤细菌的分离与纯化3、土壤中细菌总数的测定模块2：微生物的形态观察与鉴定1、细菌的革兰氏染色2、细菌的芽孢染色3、大分子物质的水解试验4、糖发酵试验5、甲基红试验6、伏-普试验7、柠檬酸盐试验8、细菌的快速鉴定（细菌自动鉴定系统BBLCRYSTAL）9、霉菌的形态观察与鉴定模块3：消毒与灭菌效果的测定1、中和剂的选择2、化学消毒剂杀菌效果的定量测定模块4：海洋放线菌的分离及抗菌活性菌株的筛选1、放线菌的选择分离与计数2、放线菌形态的观察3、双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株模块5：酵母胞外多糖的发酵及其测定1、酵母胞外多糖的液体发酵2、酵母子囊孢子的观察3、酵母胞外多糖的提取与测定模块6：经典血清学反应1、单向琼脂扩散试验2、双向琼脂扩散试验\n3、免疫电泳4、间接凝集反应测定人血清类风湿因子模块7：小鼠腹腔巨噬细胞的收集和观察1、小鼠的处死和固定2、巨噬细胞的收集，沉淀和制片3、巨噬细胞的形态观察模块8：免疫标记技术1、血清抗体的纯化2、辣根过氧化物酶标记抗体（过碘酸盐法）3、双抗体夹心法测定人血清中IgG抗体含量模块1：土壤细菌的分离及总数测定教学要求1.掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.了解各种灭菌方法的基本原理及应用范围，掌握实验室高压蒸汽灭菌及干热灭菌的操作方法。3.了解微生物分离和纯化方法，掌握纯培养分离技术、无菌操作技术。4.了解各种微生物数量测定方法的基本原理及应用范围，掌握平板菌落计数的操作方法。教学学时18学时讲授的内容1.微生物培养基的分类、用途、配制方法。2.各种灭菌方法的基本原理、应用范围、操作方法及注意事项。3.纯培养分离技术、无菌操作技术。4.各种微生物数量测定方法的基本原理及应用范围，平板菌落计数法的操作步骤和注意事项。实验项目1、培养基的配制与灭菌2、土壤细菌的分离与纯化3、土壤中细菌总数的测定应学习的技术和方法培养基制作和灭菌技术、无菌操作技术、\n纯培养分离技术、微生物的接种技术、微生物数量的测定方法。应学习的仪器使用方法高压蒸汽灭菌锅，干燥箱，培养箱。教学的重点和难点重点：实验原理，相关方法、技术的介绍，分离微生物的关键技术，主要操作环节。难点：无菌操作、倒平板等不易掌握的实验操作技能技巧难点的解决办法详细深入讲解，观看录像，示范操作，细心现场指导。模块2：微生物的形态观察与鉴定教学要求1.掌握细菌染色观察技术及观察霉菌形态的基本方法，进一步巩固显微镜的使用方法。2.了解有关的微生物常规与快速鉴定方法与技术，掌握常用的一些基于微生物生理生化反应的鉴定方法及原理，初步掌握BBLCrystal鉴定系统的操作方法。教学学时24学时讲授的内容1.微生物的制片及各种染色技术，革兰染色和芽孢染色的原理、操作步骤及注意事项。2.常用的微生物常规鉴定方法，大分子物质的水解试验、糖发酵试验和IMViC试验的原理及操作方法3.现代微生物快速鉴定技术，BBLCrystal鉴定系统的操作方法。实验项目1、细菌的革兰氏染色2、细菌的芽孢染色3、大分子物质的水解试验4、糖发酵试验5、甲基红试验6、伏-普试验7、柠檬酸盐试验8、细菌的快速鉴定（细菌自动鉴定系统BBLCRYSTAL）\n9、霉菌的形态观察与鉴定应学习的技术和方法微生物的制片及染色技术、观察霉菌形态的方法、基于生理生化反应的细菌鉴定方法。应学习的仪器使用方法高压蒸汽灭菌锅，干燥箱，培养箱，显微镜。教学的重点和难点重点：常规的微生物鉴定方法和现代微生物快速鉴定技术的介绍，根霉、青霉、曲霉等霉菌的形态特征难点：制片技术，革兰染色脱色操作技术难点的解决办法详细深入讲解关键的操作环节，示范操作，细心现场指导模块3：消毒与灭菌效果的测定教学要求了解消毒剂杀菌效果的检测方法，掌握化学消毒剂杀菌效果的测定技术。教学学时6学时讲授的内容1.消毒方法及原理，消毒剂杀菌效果的检测方法。2.中和剂的选择，悬液定量法测定化学消毒剂杀菌效果的原理、操作步骤及注意事项。实验项目1、中和剂的选择2、化学消毒剂杀菌效果的定量测定应学习的技术和方法中和剂的选择方法，细菌芽孢悬液的制备方法，平板菌落计数技术。应学习的仪器使用方法高压蒸汽灭菌锅，干燥箱，培养箱，显微镜，离心机。教学的重点和难点重点：消毒剂杀菌效果的检测方法介绍，中和剂的选择方法，悬液定量法的原理、操作步骤.难点：中和剂的选择方法难点的解决办法\n详细深入讲解实验原理及实验设计方法，细心现场指导，提供相关的阅读参考文献。模块4：海洋放线菌的分离及抗菌活性菌株的筛选教学要求1.学习抗菌活性菌株的筛选方法。2.学习海洋底泥中放线菌的分离及抗菌活性菌株的筛选方法，掌握双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株的操作方法。3.巩固无菌操作技术、纯培养技术。4.了解发酵产物的分离纯化及分析技术及其在药物研发中的应用。5.使学生了解运用微生物实验的基本技术与方法进行科研工作的基本思路。教学学时12学时讲授的内容1．(海洋底泥)放线菌的分离及其抗菌活性物质筛选的一般过程。讲清楚为什么选择海洋底泥中放线菌，为什么进行相关的操作。2．介绍实验所用的海洋底泥放线菌的分离方法及其相关的原理。3．回顾放线菌的基本知识，讲述放线菌形态观察的基本方法及原理。4．讲述抗菌活性菌株筛选的常用方法及实验中所采用的双层琼脂扩散方法。5．主要操作步骤，培养基的配制及灭菌。实验项目1、放线菌的选择分离与计数2、放线菌形态的观察3、双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株应学习的技术和方法样品的采集，预处理，常用的灭菌方法，土壤稀释法，放线菌的选择培养，倾注平板法，纯培养技术，无菌操作技术，印片法，双层琼脂扩散法。应学习的仪器使用方法：高压灭菌锅，干燥箱，电子天平，显微镜，培养箱。教学的重点和难点1．在微生物学实验基本操作技术与方法已掌握的基础上，模拟科研过程所设计的实验模块，旨在让学生实现由被动的做实验到进行科研工作的思路方面的转变。讲授部分的难点是如何让学生了解整个实验模块即是\n从放线菌中筛选抗菌素类药物发现过程。另外，因为微生物理论课所学的关于放线菌的形态结构、繁殖方式等知识时间较长，因而学生在观察放线菌的结构形态时不容易分辨。2．放线菌的分离及纯培养，抗菌活性菌株的筛选方法。3．放线菌的气生菌丝、孢子丝和分生孢子的印片法观察。放线菌的气生菌丝与分生孢子丝的区分。4．放线菌菌落与细菌、霉菌等菌落的区分。难点的解决办法联系实际，并借鉴微生物实验前面所学的技术与方法，让同学了解放线菌的分离抗菌活性物质的筛选方法，虽然是模拟科研的过程但所用的技术与方法都是微生物实验的基本方法。引导学生借鉴土壤中细菌的分离方法，进行放线菌的分离，手把手的现场指导及讲授时的示范。讲清楚抗菌活性菌株的筛选的一般方法，重点讲授双层琼脂扩散法用于放线菌抗菌活性菌株的筛选及主要的操作要点。通过对分离到的放线菌菌落的形态观察，引导学生从菌落的干湿程度、隆起程度、边缘及颜色尤其是是否易于从培养基上挑起等方面区分细菌和放线菌；而从菌落的大小及菌落表面来区分霉菌和放线菌。以清晰明了的课件展示主要的操作步骤及注意事项，并辅以黑板上的板画的形式来引导学生区分气生菌丝和分生孢子丝，加上现场观察指导的方式来突破难点，突出重点。模块5：酵母菌胞外多糖的发酵教学要求1.通过多糖的发酵掌握微生物的液体发酵方法。2.学习并掌握微生物胞外多糖的分离及含量分析方法。3.认识酵母菌，并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法，了解产孢条件。了解酵母菌在科研及其食品工业上的广泛用途。4.巩固无菌操作技术。5.了解工业微生物发酵的过程及其在工业生产的应用。6.通过多糖的发酵使学生了解运用微生物发酵法生产食品药品的一般方论法。教学学时12学时讲授的内容1.讲述从菌种活化到酵母菌胞外多糖的液体发酵的一般过程。\n1.介绍高碳氮比的发酵培养基进行多糖发酵的原理，发酵液中多糖的分离方法。2.多糖含量测定的常用方法及其用苯酚硫酸法测定酵母胞外多糖含量的具体方法。3.回顾酵母菌的基本知识，通过对酵母菌的有性生殖过程的讲述，引出酵母菌子囊孢子形态观察的基本方法及原理。4.通过对酵母菌多糖的液体发酵的讲述，引出微生物下游技术-常用的分离技术与分析方法。5.讲述实验的主要操作步骤。实验项目1、酵母胞外多糖的液体发酵2、酵母子囊孢子的观察3、酵母胞外多糖的提取与测定应学习的技术和方法液体发酵法，菌种活化，产孢培养，发酵培养，酵母菌的培养，无菌操作技术，染色法，苯酚硫酸法。离心操作、比色测定。应学习的仪器使用方法高压灭菌锅，干燥箱，电子天平，显微镜，摇床，离心机，冰箱，分光光度计。教学的重点和难点1．这是微生物学实验的最后一个模块，也是学生第一次接触液体发酵培养，旨在让学生掌握实验室规模的液体发酵技术，了解工业化液体发酵生产应注意的问题。同时这个模块也是涉及的技术和方法最多，内容最杂。实验课的设计管理也是应该考虑的。2．酵母菌胞外多糖的分离及提取方法和多糖的测定方法的原理及操作。3．酵母菌的子囊孢子的产生及形态特征。酵母菌子囊孢子的产生条件，子囊孢子与营养细胞的区别。4．仪器如离心机、分光光度计等的正确使用和比色测定的正确操作。5．使学生了解实验所用的方法及其相关的原理。微生物实验与化学实验不同。对玻璃仪器的要求不同，前者强调无菌，后者则要求无杂质，因而需要通过讲解使学生了解。难点的解决办法1．\n耐心讲解，注意讲台前的示范与对学生个别指导相结合的方法。对容易出错的地方，反复强调。借鉴微生物实验前面所学的染色方法及生物化学中已接触过的分光光度计的使用等，让同学注意运用所学的知识和技术解决实验中遇到的问题。实验程序上先进行多糖的分离提取、含量测定然后进行2.通过对酵母菌的有性生殖过程的讲述，引出酵母菌子囊孢子形态观察的基本方法及原理。结合讲台前的示范讲解及现场指导的方式引导学生进行正确的观察和操作。引导学生对酵母菌的子囊孢子进行观察，区分营养细胞与子囊孢子。3.以清晰明了的课件展示主要的操作步骤及注意事项，并反复强调。4．多糖含量测定的常用方法及其用苯酚硫酸法测定酵母胞外多糖含量的具体方法。5．通过浓硫酸的强腐蚀性以及苯酚硫酸反应中的放热，引导学生注意正确操作和对仪器设备的维护。模块六经典的血清学反应实验教学要求1.掌握免疫沉淀反应及凝集反应的进展和相关技术、方法要求，2.掌握免疫反应和凝集反应的基本原理。3.掌握单向琼脂扩散实验技术、双向琼脂扩散实验技术和免疫电泳技术的操作方法和在微量组分检测分析中的应用。4.掌握凝集反应技术的操作方法及其应用。教学学时9学时讲授的内容1．单向琼脂扩散实验原理、操作步骤及注意事项2．双向琼脂扩散实验基本原理，操作步骤和注意事项。3．免疫电泳实验基本原理，操作步骤和注意事项。。4．间接凝集反应测定人血清中内风湿因子的基本原理、步骤和注意事项。实验项目1.单向琼脂扩散试验2.双向琼脂扩散试验3.免疫电泳4.间接凝集反应测定人血清类风湿因子应学习的技术和方法学习琼脂凝胶板制备技术，凝胶板打孔技术，血清抗体稀释技术，抗原稀释技术，琼脂板开槽技术，电泳技术，抗原、抗体加样技术。应学习的仪器使用方法\n水浴箱，电泳仪，微量加样器。教学的重点和难点1．免疫沉淀反应和免疫凝集反应的区别2．免疫电泳的原理和应用3．琼脂凝胶板的制备和打孔操作4．双向琼脂扩散试验结果分析难点的解决办法1、重点讲解免疫沉淀反应和免疫凝集反应的概念2、讲解免疫电泳的原理和应用3、对琼脂凝胶板制备和打孔进行现场指导4、指导学生对双向和单向琼脂扩散试验结果的分析模块七小鼠腹腔巨噬细胞的收集和观察教学要求1．掌握免疫细胞的分离方法2.掌握腹腔巨噬细胞分离的原理和方法。3．熟悉巨噬细胞形态，能在显微镜下辨别巨噬细胞。教学学时6学时讲授的内容1.免疫细胞分离原理免疫细胞计数免疫细胞的功能检测。2.巨噬细胞发育：骨髓多能干细胞→定向干细胞（髓样干细胞）→单核母细胞→前体单核细胞→单核细胞→血液→组织（分化为巨噬细胞）。3.巨噬细胞的形态，功能和分布。4.巨噬细胞的分离和纯化方法。实验项目1.小鼠的处死和固定2.腹腔注射生理盐水，巨噬细胞的收集，沉淀和制片3.巨噬细胞的形态观察应学习的技术和方法学习小鼠腹腔注射技术，腹腔解剖技术，腹腔液稀释技术，巨噬细胞制片技术。应学习的仪器使用方法显微镜\n教学的重点和难点1．动物腹腔注射技术2．腹腔解剖技术3．巨噬细胞制片技术4．腹腔巨噬细胞的形态观察难点的解决办法1、重点讲解巨噬细胞制片技术2、对动物腹腔注射技术和腹腔解剖技术进行现场指导模块三血清抗体纯化及酶联免疫吸附试验教学要求1.掌握血清抗体纯化的原理、方法和要求2.掌握酶标记抗体的基本原理3.掌握直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法等酶联免疫吸附实验原理4.掌握血清抗体纯化技术、辣根过氧化物酶标记抗体技术以及酶联免疫吸附实验技术教学学时9学时讲授的内容1．血清抗体的制备方法，盐析法分离血清抗体原理、步骤和注意事项2．抗体的标记技术，酶联免疫吸附实验的原理和方法，辣根过氧化物酶标记抗体方法、步骤和注意事项。3．双抗体夹心法测定人血清中IgG抗体含量的基本原理、步骤和注意事项。实验项目1．血清抗体的纯化2．辣根过氧化物酶标记抗体（过碘酸盐法）3．双抗体夹心法测定人血清中IgG抗体含量应学习的技术和方法学习血清抗体纯化技术（盐析法），辣根过氧化物酶标记抗体方法（过碘酸盐法），抗体包被、洗涤和封闭技术，酶标抗体的加样、孵育及显色方法。应学习的仪器使用方法水浴箱，酶标板。教学的重点和难点1．盐析法分离血清抗体原理和操作方法\n2．辣根过氧化物酶标记抗体方法3．抗体包被、洗涤和封闭操作方法4．酶标仪的使用难点的解决办法1、重点讲解盐析法分离血清抗体原理和操作方法2、讲解辣根过氧化物酶标记抗体方法3、对抗体包被、洗涤和封闭操作和酶标仪的使用进行现场指导4、引导学生酶联免疫实验结果进行分析