激光生物学报2222 8页

利用微卫星DNA标记法进行5个肉用绵羊品种的多态性分析和杂种优势率预测张建新1，岳文斌1，张雨1（1山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）摘要：研究选择了与产肉性能相关的5个微卫星标记，分析了这5个位点在杜泊、德国美利奴、特克塞尔、道塞特和右玉本地绵羊5个品种中的遗传多态性，通过遗传分析预测了4个国外引进肉用绵羊品种与右玉本地绵羊的杂种优势，并与实际测定结果进行了比较分析。结果表明，利用微卫星DNA多态性进行品种间杂种优势预测是可行的，杜泊羊与右玉本地绵羊杂交的杂种优势最大，与实际测定结果一致。关键词：羊；微卫星标记；遗传距离；杂种优势StudyonPolymorphismandHeterosisoffiveMeatsheepbreedsusingMicrosatelliteMarkerZHANGJian-xing(ShanXiAgricultureUniversityanimaltechnologyinstitute,ShanXiTaiGu,030801)Abstract:Thestudyselectedfivemicrosatellitemarkerswhichrelatedofthemeatperformance,toanalysisthepolymorphisminDoropor、Merino、Texel、PollDorset、Youyulocalsheep，forecasttheheterosisoffourintroducedbreedsandYouyulocalsheepbythegeneticanalysis,andcomparewiththeactualresults.Theresultshowed,itisfeasibletoforecasttheheterosisofdifferentsheepbreedsbygeneticpolymorphismofmicrosatelliteDNA,TheheterosisisthelargestinDoroporandYouyulocalsheep,itaccordswithtestingresultsonactualheterosis.Keywords:Sheep;Microsatellitemarker;Geneticdistance;Heterosis中图分类号：S813.3微卫星(microsatellite)是指以少数几个核苷酸(1～6个)为单位多次串联重复的DNA序列，亦称简单重复序列(Simplesequencerepeats,SSR)，具有数量大、分布广且均匀、多态信息含量高、检测快速方便等优点，被认为是各类遗传标记中最有价值的一种[1-3]。微卫星DNA标记是近年继RFLP之后发展起来的一种新的分子遗传标记技术，以其所具有的优越性，已广泛应用于动物群体遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建，DNA指纹图的制作，功能收稿日期：2009-8-7基金项目：山西省青年科学基金（2006021037）;山西省攻关项目“右玉绵羊杂种优势预测与配套系培育亲本优化组合研究”（20080311030-3）；作者简介：张建新，男，博士，研究方向动物遗传育种与繁殖,Tel：13303469378;E-mail：ypzjx@126.com.基因和QTL的定位，以及亲缘关系的鉴定等多个方面，尤其是在分析群体遗传结构和遗传变异方面发挥着越来越重要的作用[4-7]。现代杂种优势理论认为：杂种优势的大小在一定程度上取决于亲本间遗传差异的大小，即遗传距离[8]。因此可以用微卫星标记法分析群体的遗传多态性，从而度量群体遗传变异来预测品种间杂种优势。雁门关生态畜牧经济区是我省重要的肉羊生产基地，肉用绵羊存栏数量较多，但良种覆盖率极低，生产效率极差。为了提高本地绵羊的生产效率，特引进国外著名肉用绵羊品种与其进行杂交。本研究采用微卫星标记法，对4个国外著名肉用绵羊品种与右玉本地绵羊品种进行遗传多样性评价，遗传结构分析，利用Nei氏遗传距离方法计算出绵羊品种间的遗传距离，并分析群体间遗传距离的远近；开展杂交后代的杂种优势分析，从而\n在分子水平上标记辅助选择育种，为右玉本地绵羊品种的杂交改良奠定科学基础。1材料与方法1.1实验材料本实验在山西省右玉县宏宇牧业养殖场采集杜泊、德国美利奴、特克塞尔、道塞特、以及本地绵羊5个绵羊群体共249个个体的耳组织一小块（约0.5g），放于装有1ml70%乙醇的1.5ml的离心管中，冰壶保存，带回实验室，-70℃保存备用。实验室进行耳组织DNA提取和PCR扩增。1.2实验方法1.2.1耳组织DNA提取STE、蛋白酶K、SDS过夜消化，酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提法。1.2.2引物的选择根据微卫星选择标准，考虑到微卫星位点在染色体的位置、引物序列、组成特点、微卫星位点多态性及产物大小等，确定了与产肉性能相关的5个微卫星基因座BM3215、BMS1724、BMS460、CSSMO180V、BM3413，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为：BM3215：5’-TGCATCAACTAAGCCACACTG-3’；5’-TTACACGCTGGTTTTCTGGG-3’BMS1724：5’-GACTTGCCCCAATCCTACTG-3’；5’-ATTTCAGGTTTGTTGGTTCCC-3’BMS460：5’-TGCCCCATAGTGTAGTGCTC-3’；5’-GCCAGCAGAGAATTGTAGCA-3’CSSM018OV：5’-AGGAATTCCCTCTAGAAAAGCAGGC-3’；5’-TGTGCATAATTTGTGTCCGTCCGGA-3’BM3413：5’-TCCCTGGTAACCAATGAATTC-3’；5’-CAATGGATTTGACCCTCCC-3’1.2.3PCR反应条件微卫星BM3215扩增条件：反应总体积15μl，双蒸水9.5μl，10×缓冲液1.5μl，Mg2+1.2μl，dNTP1.2μl（0.22mmol·L-1），引物0.3μl（0.24mmol·L-1），Taq酶0.2μl（0.3U），DNA2μl。扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，58.1℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环。微卫星BMS1724扩增条件：反应总体积15μl，双蒸水10.4μl，10×缓冲液1.5μl(含Mg2+)，dNTP1.3μl（0.22mmol·L-1），引物0.65μl（0.24mmol·L-1），Taq酶0.15μl（0.3U），DNA1μl。扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，57.1℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环。微卫星BMS460扩增条件：反应总体积15μl，双蒸水9.5μl，10×缓冲液1.5μl，Mg2+1.2μl，dNTP1.2μl（0.22mmol·L-1），引物0.3μl（0.24mmol·L-1），Taq酶0.2μl（0.3U），DNA2μl。扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，58.4℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环。微卫星CSSM018OV扩增条件：反应总体积15μl，双蒸水10.5μl，10×缓冲液1.5μl(含Mg2+)，dNTP1.3μl（0.22mmol·L-1），引物0.65μl（0.24mmol·L-1），Taq酶0.1μl（0.3U），DNA1μl。扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。微卫星BMS3413扩增条件：反应总体积15μl，双蒸水9.5μl，10×缓冲液1.5μl，Mg2+1.2μl，dNTP1.2μl（0.22mmol·L-1），引物0.3μl（0.24mmol·L-1），Taq酶0.2μl（0.3U），DNA2μl。扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，57.1℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环。1.2.4PCR扩增产物的电泳检测将扩增产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，再用银染法进行定影、显影。其银染过程如下：蒸馏水洗1次，将凝胶放入约500ml硝酸银染色液中，在格床上轻摇15-20min,蒸馏水洗1次,先加100ml碳酸钠显色液轻摇15s,弃去显色液后再加400m1显色液,轻摇15min,即可看清楚条带。1.2.5数据统计分析等位基因片段的大小和频率通过凝胶成像系统分析获得。用PopGen32软件计算每个基因座的有效等位基因数、杂合度、多态信息含量和群体间的遗传距离。1.2.6绵羊各杂交组合杂交效果测定在相同的饲养条件下，分别测定以国外四个引进品种杜泊、特克塞尔、道塞特、德美及其与右玉本地绵羊杂交一代公羊（各30只）的初生重、1月龄、3月龄、6月龄及周岁重。2结果与分析2．1绵羊微卫星标记DNA多态性检测结果图1、2为两个位点在两个群体中的部分聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。微卫星遵循孟德尔定律，且呈共显性遗传。如果一个2\n倍体染色体相对位点的微卫星核心重复数相同，则该个体在该位点纯合基因型；重复数不同，碱基插入或缺失等其它原因表现为杂合型，反映在凝胶电泳上则是纯合个体是1条带，杂合子则是2条带。2.2微卫星基因座等位基因频率5个微卫星基因座的等位基因分布及其频率分布见表（1-5）。由表可见，在BM3215基因座共发现了6个等位基因，变异范围在129～167之间，其中等位基因167仅见于道赛特羊中，右玉本地绵羊中没有发现等位基因160；在BMS460基因座共发现了6个等位基因，变异范围在125～147之间，其中136等位基因仅在德美和右玉本地绵羊中发现，杜泊和道赛特羊中没有发现等位基因147；在BMS1724基因座共发现了6个等位基因，变异范围在147～174之间，其中等位基因174没有在杜泊和道赛特羊中发现；在CSSMO180V基因座共发现了5个等位基因，变异范围在120～139之间，其中129等位基因仅在右玉本地绵羊中未发现，杜泊和道赛特羊中没有发现等位基因139；BM3413基因座共发现了7个等位基因，变异范围在170～201之间，其中等位基因170仅见于杜泊和道赛特羊中，等位基因201仅见于特克赛尔和德美羊中。实验结果表明，5个微卫星基因座在5个绵羊品种中存在多态性，因此，可以用于绵羊遗传多样性的评估。M图5微卫星位点BMS1724的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.5PAGEresultofPCRproductatBM1724图6微卫星位点CSSMO180V的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.6PAGEresultofPCRproductatMCMA262.3微卫星基因座的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度5个微卫星基因座的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度见表6。由表可以看出，基因座BM3215的多态信息含量、有效等位基因数和群体杂合度最高，基因座BMS460的多态信息含量、有效等位基因数和群体杂合度相对较低，说明基因座BM3215的变异最大，而基因座BMS460的变异较小。从品种的角度来看，杜泊羊的各项指标最高，右玉本地绵羊的相对较低，说明杜泊羊的遗传变异较大，而右玉本地绵羊的遗传变异较小。2.4品种间的遗传距离5个绵羊品种间的遗传距离见表7。由表可以看出，杜泊与右玉本地绵羊的遗传距离最大，其次为特克赛尔、德美、道赛特，杜泊与道赛特的遗传距离最小。品种间的遗传距离可以反映它们亲缘关系的远近。遗传距离越大，二者的亲缘关系就越远，杂交后的杂种优势就会越大，由此可以预测，杜泊与右玉本地绵羊杂交后的杂种优势最大。杜泊绵羊原产于南非，是有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉绵羊品种，所以二者遗传距离小，符合它们的育成史。2.54个引进品种与右玉本地绵羊杂交一代生产性能及杂种优势的比较4个引进绵羊品种与右玉本地绵羊杂交一代初生重、1月龄重、3月龄重、6月龄重、周岁重及杂种优势率见表8.由表可以看出，杜泊羊与右玉本地绵羊杂一代的体重和杂种优势率最高。与利用微卫星标记技术预测的杂种优势结果一致。3讨论\n5个微卫星基因座在5个绵羊群体中均存在多态性。根据微卫星选择的标准，每个微卫星要有4个等位基因方可较好的用于遗传多样性评估。实验结果得知，BM3215基因座有6个等位基因，BMS460基因座有6个等位基因，BMS1724基因座有6个等位基因，CSSMO180V有5个等位基因，BM3413有7个等位基因。所以以上5个微卫星基因座均可以用于绵羊遗传多样性的评估。由于本文所用的绵羊品种和微卫星基因座较少，对绵羊品种间遗传关系的准确评估还有待进一步研究。多态信息含量（PIC）和杂合度（H）反映群体内的遗传变异程度，数值高说明遗传变异大，反之则群体内的遗传变异小。试验结果表明，5个微卫星基因座在5个绵羊群体中均表现高度多态（PIC>0.5）杜泊羊的群体多态信息含量和杂合度最高，右玉本地绵羊的较低，表明杜泊羊的遗传变异程度最大，这说明不同的品种由于遗传背景、来源不同，变异程度也不同。杜泊羊是有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉用绵羊品种，有着丰富的遗传基础，因而变异程度较高，而右玉本地绵羊是中国的一个地方优良品种，是经过长期的本品种选育形成，引进的外血较少，因而变异程度较小。一般来说，分布地区距离较远，来源差别较大的品种，可以获得较大的杂种优势。从试验结果看，杜泊羊与右玉本地绵羊的杂种优势最大。杜泊绵羊是利用英国有角陶赛特与波斯黑头羊杂交培育而成的肉用绵羊品种，前胸丰满，后躯肌肉发达，生长迅速，而右玉本地绵羊生长速度较慢，产肉性能差，因而二者有较高的杂种优势。本研究通过实际测定杜泊、德美、特克赛尔、道赛特羊与右玉本地绵羊的杂交效果与理论预测的杂种优势进行比较，得出同样的结果，说明利用微卫星DNA多态性预测绵羊品种间的杂种优势是可行的。传统的品种间杂种优势测定一般都要通过杂交试验完成，即费时又费力，而利用微卫星DNA多态性预测杂种优势即快速又节省成本，对今后引进肉羊在中国的合理利用及绵羊育种工都具有重要的应用价值。4结论4.15个微卫星基因座（BM3215、BMS460、BMS1724、CSSMO180V、BM3413）在5个绵羊品种（杜泊、特克赛尔、德美、道赛特、右玉本地绵羊）中存在多态性，因此，可以用于绵羊遗传多样性的评估。4.2通过不同品种间遗传距离分析，在引进的4个绵羊品种中，与右玉本地绵羊的杂种优势由大到小依次为杜泊、道赛特、特克赛尔、德美，与实际杂种优势的测定结果相符合，说明利用微卫星DNA多态性预测绵羊品种间杂种优势是准确可行。表1微卫星基因座BM3215等位基因分布及频率Table1AllelesndistributionandfrequenciesofmicrosatellitelociBM3215品种Breeds等位基因Alleles129136140145160167杜泊Doropor0.10710.33930.17860.250.1250特克塞尔Texel0.26790.285700.41070.03570德美Merino0.3750.3750.10710.10710.03570本地绵羊Youyulocalsheep0.3750.250.23210.142900道塞特Dorset0.05360.33930.32140.17860.05360.0536\n表2微卫星基因座BMS460等位基因分布及频率Table2AllelesndistributionandfrequenciesofmicrosatellitelociBMS460品种等位基因Alleles125129136140143147杜泊Doropor0.26790.285700.41070.03570特克塞尔0.03120.265600.43750.20310.0625德美0.06450.24190.01610.41940.14520.1129本地绵羊0.12070.25860.05170.25860.17240.1379道塞特0.22410.275900.44830.05170表3微卫星基因座BMS1724等位基因分布及频率Table3AllelesndistributionandfrequenciesofmicrosatellitelociBMS1724品种等位基因147156160165170174杜泊Doropor0.3750.3750.10710.10710.03570特克塞尔TexeTexel0.3750.23440.14060.09380.14060.0156德美0.35480.24190.16130.06450.1290.0484本地绵羊0.36210.32760.08620.10340.05170.069道塞特0.34480.24140.17240.18970.05170表4微卫星基因座CSSMO180V等位基因分布及频率Table4AllelesndistributionandfrequenciesofmicrosatellitelociCSSMO180V品种等位基因120124129133139杜泊Doropor0.3750.250.23210.14290特克塞尔0.23440.45310.09380.15620.0625德美0.22580.38710.09680.20970.0806本地绵羊0.27590.379300.15520.1897道塞特0.27590.32760.22410.17240表5微卫星基因座BM3413等位基因分布及频率Table5AllelesndistributionandfrequenciesofmicrosatellitelociBM3413品种等位基因170176180184190195201杜泊Doropor0.05360.33930.32140.17860.05360.05360特克塞尔00.39060.23440.06250.1250.04690.1406德美00.40320.24190.04840.08060.11290.1129本地绵羊00.4310.36210.0690.0690.0690道塞特0.03450.41380.27590.13790.08620.05170表65个微卫星基因座在各品种中的多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（E）及群体杂合度（H）Table6Polymorphisminformationcontent,thenumberofeffectiveallelesandheterozygosityoffivemicrosatellitelociineachbreeds基因座Loci品种Breeds杜泊特克赛尔德美本地绵羊道赛特平均BM3215PIC0.76600.68320.65490.72590.73580.7132E4.86133.73723.41394.22644.39164.1261H0.65170.66250.61610.63570.61720.6366\nBMS460PIC0.77080.64030.68800.61240.66980.6763E5.00603.24563.66793.09273.03063.6086H0.62070.56250.64520.60710.55170.5974BMS1724PIC0.69520.72000.73210.64090.71390.7004E3.78834.09604.28063.27354.07263.9026H0.58620.65620.58060.53570.44830.5614CSSMO180VPIC0.66990.66010.69850.67260.68800.6778E3.57113.36293.83633.60463.79683.6343H0.58620.71880.67740.75000.68970.6844BM3413PIC0.61100.71590.70950.69900.68080.6832E3.01974.01573.91453.86213.60173.6827H0.72410.62500.61290.64290.58620.6382平均MeanPIC0.70260.68390.69080.67020.69770.6890E4.04933.69153.82263.61193.77873．79080.6036H0.61380.62500.60650.61430.55860.6036表75个品种间的遗传距离Table7Geneticdistancesamongfivebreeds品种Breed杜泊特克赛尔德美本地绵羊道赛特杜泊特克赛尔0.1166德美0.11200.0237本地绵羊0.16200.15480.1532道赛特0.01190.07780.08230.1529表8杂种一代绵羊初生重、1月龄、3月龄、6月龄、周岁重及杂种优Table8TheBirthweight,dailygainandheterosisrateatone-,three-andsix-month-oldofageinfirstfilial性状杂交组合杜泊×本地特克赛尔×本地德美×本地道赛特×本地初生重一代杂种平均值（㎏）4.263.813.764.03双亲平均（㎏）3.813.483.443.65杂种优势率（%）11.119.489.3010.411月龄重一代杂种平均值（㎏）13.7911.4211.2612.23双亲平均（㎏）12．2110.3110.2910.93杂种优势率（%）12.9410.779.4311.893月龄重一代杂种平均值（㎏）24.9819.6718.5623.67双亲平均（㎏）21.7417.5416.6121.04杂种优势率（%）14.9012.1411.7412.506月龄重一代杂种平均值（㎏）41.6732.9431.7539.65双亲平均（㎏）36.2328.9728.1434.57杂种优势率（%）15.0213.7012.8314.69周岁重一代杂种平均值（㎏）70.7663.7863.5968.79双亲平均（㎏）60.9255.6456.0559.71杂种优势率（%）16.1514.6313.4515.21\n[参考文献][1]BaumungR,Cubric-CurikV,SchwendK,AchmannR,SölknerJ.GeneticcharacterisationandbreedassignmentinAustriansheepbreedsusingmicrosatellitemarkerinformation[J].AnimBreedGenet,2006,Aug;123(4):265-271.[2]KimTH,KimKS,ChoiBH,YoonDH,JangGW,LeeKT,ChungHY,LeeHY,ParkHS,LeeJW.GeneticstructureofpigbreedsfromKoreaandChinausingmicrosatellitelocianalysis[J].AnimSci,2005,Oct;83(10):2255-2263.[3]FangM,HuX,JiangT,BraunschweigM,HuL,DuZ,FengJ,ZhangQ,WuC,LiN.ThephylogenyofChineseindigenouspigbreedsinferredfrommicrosatellitemarkers[J].AnimGenet,2005,Feb;36(1):7-13.[4]ZhangGX,WangZG,ChenWS,WuCX,HanX,ChangH,ZanLS.GeneticdiversityandpopulationstructureofindigenousyellowcattlebreedsofChinausing30microsatellitemarkers[J].AnimGenet,2007,Dec;38(6):550-559.[5]WangJZ,ChuMX,WangAG,LiN,FuJL,XieF,ChenGH.Genet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