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分类号：S814.8密级:单位彳弋码：10364学号：S09090501077硕士学位论文去势对淮南麻黄公鸡肉用性状及肉质相关基因表达的影响EffectofcastrationonmeattraitsandmRNAexpressionofmeatqualityrelatedgenesinHuainanmalechicken研究生:指导教师:申请学位门类级别:专业名称:研究方向:所在学院:王钱保姜润深教授农学硕士动物遗传育种与繁殖动物分子遗传育种动物科技学院答辩委员会主席：二零一二年六月\nAnhuiAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationEffectofcastrationonmeattraitsandmRNAexpressionofmeatqualityrelatedgenesinHuainanmalechickenPostagraduate:Qian-baoWangSupervisor:Prof.Run-shenJiangProf.Zhao-yuGengSpecialty:AnimalGenetics，BreedingandReproductionResearchField:AnimalMolecularGeneticsCollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity^Hefei,230036Heifei,Anhui,P・R・ChinaJune,2012\n本论文受以下项目自助十二五国家科技支撑计划课题(2011BAD28B03)ThispaperissupportedbySubjectofNational1025scienceandtechnologyplans(No.2011BAD28B03)\n独创性声明木人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对木研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间:关于论文使用授权的说明木人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留松交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）\n研究生签名：时间：年月H摘要通过外科手术摘除公鸡睾丸，失去性能力的公鸡称为去势公鸡。去势公鸡消除了性欲和繁殖能力，在毛色、鸡冠大小、饲料转化率、生产性能、屠宰性能、肉质等方面发生一系列特征变化。木研究以安徽知名品种淮南麻黄鸡为研究对象，旨在系统评价去势对淮南麻黄鸡屠宰性能和肉质的影响。相同环境饲养的全同胞淮南麻黄公鸡，第46日龄时分成两组，其中一组进行去势处理，另一组只手术不去势作为对照组。12、16、20周龄时分批屠宰，对试验组和对照组的胴休性状及肉品质进行了测定与分析，并对PPAR-a>MSTN、MyoG三个肉质相关基因mRNA表达量的变化进行了研究。结果表明：1.生长与屠宰性能方面：去势对公鸡的生长速度、屠宰率等无显著影响(P>0.05)；第16周龄时，试验组净膛率显著高于对照组(P<0.05)；第20周龄时,试验组腿肌率显著高于对照组(P<0.05)；笫16、20周龄时，试验组腹脂率显著高于对照组(P<0.01)；2.肌纤维发育方面：16周龄试验组胸肌和腿肌肌纤维直径比对照组分别降低13%和16%(P<0.05)；16周龄时胸肌肌纤维密度高于对照组26%(P<0.01),而20周龄时腿肌肌纤维密度高于对照组20%(P<0.01)；3.肉质方面：16周龄时试验组胸肌和腿肌剪切力分别低于对照组58%和55%(P<0.01),20周龄时试验组胸肌和腿肌剪切力分别低于对照组32%和25%(P<0.05)；4.20周龄时，试验组胸肌肌内脂肪高于对照组34%(P<0.05),而肌甘酸含量却无显著差异；5.16.20周龄时试验组PPAR・a、MyoGffl对表达量显著高于对照组(P<0.05),FL随周龄增加二者基因表达量呈现上升趋势；6.无论是试验站还是对照组，PPAR-amRNA表达量同腹脂率均呈正相关(PvO.05),MSTN基因表达量与体重均呈负相关(P<0.05),MyoG基因mRNA表达量同肌纤维直径和肌纤维密度均极显著和关(P<0.01)。综上所述，淮南麻黄鸡公鸡去势对生长速度影响不显著，但是大大提高了嫩度和肌内脂肪含量，这与肉质相关基因PPAR-a>MSTN、MyoG等的表达量变化有关。\n关键词：淮南麻黄鸡；去势；屠宰性能；肉质；PPAR-a；MSTN；MyoG\nAbstractThecastratedrooster,whosetestiswasextirpatedandlosessexualfunction,hasaseriesofdifferenttraitsinfeathercolor,combsize,feedconversionrate,productivityperformance,slaughterperformanceandmeatquality.Inthisstudy,HuainanChicken,afamouschickenbreedinAnhuiProvince,wasselectedtoestimatetheeffectsofcastrationonproductionperformancesandmeatquality.TheHuainanChickensselectedintheresearcharemixedsibs・Atday46,theyweredividedintotwogroupscontainthecastratedgroup,whosememberswerecastratedandcontrolgroup,whichoperatedonbutuncastrated・Thechickeninthetwogroupswereslaughteredat12,16,andweeksofage,respectively,andthecarcasstraits,meatquality,andPPAR-a,MSTNandMyoGgenemRNAexpressionpfofilcwereanalyzed.Theresultsshowed:1.growthandslaughterperformance:therewasnodifference(P>0.05)inbodyweightandslaughterratebetweentwogroupsduringthewholestudyperiod;At16wksofage,percentofevisceratedbodywashigher(P<0.05)thancontrolgroup.At20wksofage,legmusclerateofcatratatedwerehigher(P<0.05)thancontrolgroup.At16and20wksofage,abodominalfatpercentageofcatratatedwerehigher(P<0.01)thancontrolgroup・2.musclefiberdevelopment:chickenincastratedgroupofbreastmuscleandlegmuscleatwk16,musclefiberdiameterwere13%and16%lowerthanincontrolgroup,respectively(P<0.05)andmusclefiberdensityofbreastmusclewas26%higher(P<0.01),meanwhile,themusclefiberdensityoflegmuscleincreasedby20%atweek20;3・Onmeatquality,Theshearforceofmusclewassignificantlydeclined(P<0.05)oflegby58%andbreastby55%attheageof16weeks,theshearforceofmusclewassignificantlydeclined(P<0.05)oflegby32%andbreastby25%attheageof20weeks;4.Theintramuscularfatofchickenincastratedgroupwere34%higher(P<0.05)thanthoseincontrolgroupat20weeks,whiletherewerenoapparentdifferencebetweentheminIMPcontent;5.TherelativeexpressionlevelofPPAR-aandMyoGwassignificantlyhigherofchickenincastratedgroupthanthoseincontrolgroup(P<0.05)attheage16weeksand20weeksandthelevelwasupgradedwithage;6.Ofchickeninbothgroups,therelativeexpressionlevelofPPAR-amRNAinliverhadaremarkablepositivecorrelationwithcaulfatrate(P<0.05),whileMSTNmRNAremarkablenegativewithcaulfatrate(P<0.05)andMyoGmRNAextremelyremarkablewithcaulfatrate(P<0.01).Inconclusion,castrationaffectedinsignificantlythegrowthrateofroostersofHuainanChickenwhilegreatlyimprovesthetendernessandintramuscularfatpercentage,whichattributespartlytotheexpressionlevelofmeatqualityassociatedgenessuchasPPAR-a,MSTNandMyoG.Keywords:HuainanChicken;castration;slaughterperformance;meatquality;PPAR-a；MSTN；MyoG\n缩略语表(Abbreviation)英文缩写英文全称中文全称PPAR-aPeroxisomeProliferator-ActivatedReceptors过氧化物iW增殖激活受体MSTNMyostatin肌肉生长抑制素MyoGMyogeni肌细胞生成素DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙脂EBethidiumbromide澳化乙锭TAETris-acetateEDTAbufferTAE缓冲液GAPTHGlyccraldchydcs-3-pHospHatcdehydrogenasett油醛・3■磷酸脱氢酶RT-PCRReversetranscriptionPCR反转录聚合酶链式反应IMFIntramuscularfat肌内脂肪VLCFAVeiylongchainfattyaied极长链脂肪酸PPperoxisomeProliferators过氧化物酶体增殖剂15-PGDH15-Hydroxyprostaglandindehydrogenase15■脱氢前列腺素MAPKMitogen-activatedproteinkinases丝裂原激活蛋口激酶FATPFa社yacidtransportproteins脂肪酸转运蛋白GLUTIGlucoseshifttheson葡萄糖转移子SNPSinglenucleotidepolymorpHisms单核甘酸多态性ORFopeningreadingframe可读框TGFTransformingGrowthFactor转化生长因了IMPinosinemonphosphat肌甘酸\n目录摘要IABSTRACT11目录V文献综述11公鸡对生产性能的影响11」公鸡去势的概述11.2去势对公鸡生产性能的影响1121生长发育性能11.2.2肉品质22鸡肉质性状主要和关基因的研究进展42」PPAR基因42.1.1PPAR基因的发现与结构特性42.1.2PPAR基因的分类及同源性52.1.3PPAR基因的表达及在脂类代谢中的作用52.2MyoG基因62.2.1MyoG基因的发现及结构特性62.2.2MyoG基因序列的同源性比较72.2.3MyoG基因的表达及功能研究82.3MSTN基因82.3.1肌肉生长抑制素基因MSTN的发现及结构特性82.3.2MSTN基因的组织表达92.3.3MSTN基因的作用机理与功能研究9引言121材料与方法131.1材料、仪器和试剂131」」试验动物的分组与处理131」.2主要仪器设备131.1.3主要试剂及纱品131」.4常规溶液及试剂配置14\n1.2试验方法14121公鸡去势方法及注意事项141.2.2常规肉品质的测定指标与方法141.3.3屠宰性能指标的测定151.3荧光定量PCR实验方法15131组织RNA的提取161.3.2引物设计161.3.3反转录(RT)161.3.4目的片段的PCR扩增161.3.5琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物161.3.6荧光定量PCR161.4数据处理与分析172结果与分析182」去势对公鸡外观的影响182.2去势对公鸡生长及屠宰性能的影响182.3去势后对淮南麻黄鸡肉品质的影响192.3.1肌纤维密度及肌纤维直径192.3.2常规肉质212.3.3肌肉常量化学成分222.4不同基因荧光定量检测MRNA表达分析结果222.4.1总RNA完整性检测222.4.2逆转录产物CDNA的质量检测222.4.3荧光定量标准曲线与溶解曲线图232.4.4荧光定量mRNA表达结果分析252.4.5各基因mRNA表达量与组织量相关性分析263讨论293.1去势对淮南麻黄鸡生长及屠宰性能的影响293.2去势对淮南麻黄鸡肉品质的影响303.3去势后对基因MRNA表达影响313.3.1去势对PPAR-6C基因表达规律的分析313.3.2去势对MyOG基因表达规律的分析32\n3.3.3去势对MSTN基因表达规律的分析334结论35参考文献36致谢42作者简介4343硕士期间发表的论文\n文献综述1公鸡去势及对生产性能的影响1.1公鸡去势概述通过外科手术摘除公鸡睾丸，失去性能力的公鸡称为去势公鸡⑴。去势能消除公鸡性欲和繁殖能力，使公鸡脾性变得温顺耐劳，便于管理；公鸡去势后会发生一系列特征变化。羽毛颜色变得更加鲜泽亮丽，鸡冠显著变短变小；一般认为，去势公鸡饲料转化率明显提高、育肥快、生长迅速、屠宰性能提高、屠体更加健美，色泽更加诱人、肉质更加细嫩多汁，味道鲜美、风味好。随着近年来人们生活水平不断提高，消费者对肉鸡品质追求也在不断提高，去势鸡以其独有的肉质优势深受到消费者的喜爱，市场需求一直较为旺盛。1.2去势对公鸡生产性能的影响121生长发育性能对于公鸡去势后的生长发育变化规律研究较为广泛，国内外相关报道也比较透彻。李俊品等〔2］研究的青年公鸡在30天进行去势催肥试验，每只平均增重0.58kg,而未去势公鸡每只平均增重0.26kg，增重提高了123%，增重效果显著；去势催肥公鸡的料肉比为2.82：1,未去势公鸡的料肉比为3.88：1,去势催肥公鸡的料肉比降低了38%,饲料利用率明显提高。此试验结果表明去势能够显著提高公鸡饲料利用率和生长速度，缩短育肥期。董建平等⑶研究了公鸡不同日龄增重试验，选择2、4刀龄公鸡各30只分2组，每组中20只去势，10只不去势，在同等饲养管理条件下于5刀龄全部称重，发现2刀龄去势鸡平均体重3.1kg,10只不去势鸡平均休重2.4kg,去势鸡较不去势鸡0.7kg；4刀龄去势和不去势鸡体重没有明显差别，平均体重2.5kg0通过分析研究，两纽•体重增重不同，主要的原因是去势日龄不同，去势日龄早的公鸡休重增重明显，而去势日龄偏晚体重增重相当，这就表明了去势鸡的生长速度、增重快慢受去势日龄的影响，不同的去势日龄公鸡的生t发育不尽相同。RikimaruK等同选用Hinai-jidori鸡进行了去势增重试验。选择30只公鸡分成试验组与对照组，与8周龄时对小公鸡进行去势，观察22、26、30周龄时两组公鸡体重的变化差杲，结果表明22-26周龄时体重增重效果显著，而26・30周龄体重没有显著差异，表明去势对公鸡前期增重效果比较明显，而对后期体重变化影响趋向减弱。这也符合了肉鸡生长发育的Logistic生长曲线，之所以起始生长周龄跨度相对较大，是因为去势鸡的饲养周期相比正常鸡较一般在120d以上，有的甚至长达180d以上，后期的相对增长率开始减小，增重效果越來越不明显，主要是由骨骼、内脏、羽毛的快速生长向长肉和沉积脂肪的转变［习。邵永刚等⑹对藏鸡6周龄去势，结果表明，去势对藏鸡18周龄前体重差异不显著，而对1124周龄期间体重增重差异显著。MiguelJA等⑺对CastelianaNegra鸡8周龄时进行去势，结杲显示了29\n周时去势组与对照组体重没有显著差异，推测导致体重无差异的原因可能是去势后的受应激作用的影响公鸡H身抵抗力下降，易感染寄生虫病等，致使后期增重补偿能力减弱，而导致去势鸡的增重不显著甚至会比正常鸡慢。屠宰性能测定是衡量产肉经济性能的重要指标。LinCY等⑻报道台湾公鸡第10周去势对18周龄屠宰性能有显著影响，试验组的心、脚、头部、颈部和腹部脂肪、小肠、背、翅、腿肌率和胸肌率均显著高于止常组，全净膛、胸宽、肝、嗦囊、脾去势手术影响不大。ChenKL等［9】在第8周对台湾小公鸡进行了去势试验，试验分为三组，去势公鸡、假去势公鸡(只开口不取睾丸)和正常公鸡，结果表明，假去势公鸡体重介于去势公鸡和正常鸡Z间，去势鸡和腹脂重显著高于假去势鸡和止常鸡，假去势鸡介于去势公鸡和正常公鸡Z间。同时促血脂物质结果表明去势公鸡的三酰甘油和胆固醇高于正常公鸡，而低密度脂蛋白(LDL)的比率低于止常公鸡，表明了去势公鸡中脂肪积累的增加主耍归因于MDH活性的增加以及在去势公鸡中脂肪运输序列的改变。从LinCY和ChenKL等试验可看出公鸡去势显著提高公鸡屠宰性能，从而提高公鸡的肉用经济价值。从以上公鸡去势文献报道，可以得出科学掌握去势公鸡生长性能发育变化，应综合考虑品种、去势H龄、后期饲养管理等多方面的因素。考虑到公鸡去势后育肥的经济效益，倉类研究者们应充分探索特定品种去势公鸡生长发育规律，从而为去势公鸡的规模养殖节约饲养成本，计算最佳上市口龄［⑼提供理论参考。1.2.2肉品质鸡肉品质近年来越来越成为了遗传学家和生物学家研究的热门领域。鸡肉品质是一个包括pH值、滴水损失、剪切力、肉色、贮存损失、肌纤维直径、肌纤维密度等的综合指标。其中其研究又以体脂、腹脂、肌内脂肪、肌纤维生长性状为重点。肉色一项是决定肉品销售的重要因素，是肌肉生理学、生物化学的外在表现，它主要受肌肉屮的色素含量和存在状态决定的。而腿肌屮的色素含量高于胸肌，因此腿肌肉色要比胸肌深［⑴。pH是一个中性性状，直接影响肉的保藏性、烹煮损失，是判定肉质优劣的重耍指标。宰后由于肌糖原酵解产生乳酸和ATP分解产生磷酸导致肌肉pH逐渐下降，当肌肉pH卜-降到接近肌肉蛋白质等电点或使蛋白质变性时，由于CASF等酶的早期熟化作用，增加了肉的嫩度，直接影响肌肉的机械特性。白肌纤维含有较多的糖元，ATP酶和磷酸化酶活性高，红肌纤维则相反，因此口肌纤维含量高的胸肌比红肌纤维含量高的腿肌pH值卜-降幅度大且快速，所以，屠宰45min测定的胸肌腿肌pH值比24h内测定的值要大［叨。嫩度是人们对肌肉口感满意程度的指标，它是由结缔组织、肌原纤维、肌浆这三种蛋白质成分含量和化学结构状态所决定。一般用剪切力表示，剪切力值越小，肌肉嫩度越小，口感越好。滴水损失代表肌肉受到外力作用时保持原有水分的能力，反映了肌肉中游离水的\n含量，直接影响肉的风味、多汁性、嫩度、色泽和营养成分的流失性等食用品质，同时对加工肉的产量结构和肉色等有较大的影响。脂类是生命活动不可或缺的一类营养物质，随着动物营养领域研究的不断深入，黄进等［2］研究发现脂类物质不但是机体生长性能上一项重耍指标，而且是肉质香味的主要来源，研究发现在畜禽日粮屮添加某些具有特殊结构的脂类物质具有改善肉品质的作用。肌内脂肪是构成脂肪的重要化学物质，是组织细胞的组成部分，决定着脂肪的理化性质从而影响肉品的风味，其屮不饱和脂肪酸对人体具述有很好的保健医疗作用。H前越來越多的研究证实肌昔酸具有风味特性。研究发现鸡肉质鳞味特性的主要物质基础是由肌苜酸所决定〔⑷。肌纤维是肌肉的基本组成物质，肌纤维组织学特性与肌肉品质特性特别是食用品质（嫩度、风味、多汁性）性状密切相关。肌纤维密度是指单位面积内的肌纤维根数,肌纤维密度影响肌肉蛋白质伤量，密度愈大，蛋口质含量愈高。肌纤维直径大小也反映了肉质的品质，肌纤维直径越大，相应剪切力也越大，肉质也就相应较差。公鸡去势后，因缺乏雄性激素，变得温驯，运动量减少，基础代谢降低，肌肉中脂肪含量增加、肌肉的pH、嫩度、失水率、熟肉率、肌纤维直径、人体必需氨基酸、风味氨基酸等指标显著改善，使肉质变得比未去势的更细嫩，鸡的营养价值大大提高,鸡肉品质质量显著改善。但是，目前对不同品种不同口龄的公鸡去势后肉品质及风味变化很多，但尚未有系统的研究报道［⑸。戴远威等［⑹利用具有去势功能的紫草等屮草药提取物饲喂粤黄雏公鸡，显著提高了胸肌中粗蛋白含量，提示去势具有改善肉质的作用。李建华口采用雷公藤、苦参等组成的抗生育中草药第2周对雏公鸡饲喂去势，发现8、10周龄时，胸肌、腿肌水分含量下降，胸肌粗蛋口含量升高，胸肌、腿肌粗脂肪含量均升高，肉质得到明显改善。赖清金等口°】采用畜險净（LHRH）对30口龄永安麻鸡去势，120口龄时观察肉质变化结杲，发现试验组肉色、剪切力明显改善，而且肉汤风味鲜味浓郁oJacob等"］发现与正常公鸡粗硬多筋的肉质相比，去势鸡的肉质更加鲜嫩多汁，口感更佳，明显达到改善肉质的目的。2鸡肉质性状主要相关基因的研究进展2.1PPAR基因2.1.1PPAR基因的发现与结构特点过氧化物酶体(peroxisome)是一种细胞器，普遍存在于家禽细胞内，约含有40余种氧化嗨和触酶，主要功能是催化脂肪酸的卩■氧化，将极长链脂肪酸(verylongchainfattyacid,VLCFA)分解为短链脂肪酸，动物组织屮大约有25〜50%的脂肪酸是在过氧化物酶体中氧化的，同时rtr丁过氧化物酶体中有与磷脂合成相关的酶，所以\n过氧化物酶体也参与脂的合成。事实表明P功能缺陷可以引起多种疾病。一系列天然或者人工合成的脂肪酸样化合物刺激过氧化物酶体发牛增殖，积聚大量细胞数量以及增犬细胞体枳，这些带有刺激性的物质被则称为过氧化物酶体增殖剂(peroxisomeProliferators,PP)。而被过氧化物酶体增殖剂激活的激素受体则被命名为过氧化物酶体增值剂受体(PeroxisomeProhferators-activatedreceptors,PPARs)。1990年首次FtlIssemann等创发现，因其还能被内源性脂肪酸及其代谢产物激活，所以又称之为脂肪酸受体。PPARs是一类由配体激活的核转录因子，属于n型核受体超家族成员。核受体在基因调控表达屮发挥着重大的作用。它能与相应的配体及其辅调节因子通过氢键特异性结合，两者相互作用，共同协调基因调控表达，启动细胞内的信息传递体系、从而在机体的生长发育、新陈代谢、细胞分化等体内生理变化过程屮发挥重要作用，最终导致细胞功能的整体改变。PPARs由于属于核受体超家族成员，其一级结构与其他核受体成员相似，各成员之间同源性相对很高，其功能域大致相同，主要包括四个部分：N端、高度保守的DNA结合区、连接区和C端的配体结合区。N端区是不依赖配体的活性区，在不同的亚型该区的结构相比差异较人，一种叫做丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)能够磷酸化N端区的丝氨酸残基从而抑制受体的活性；结合区具有高度的保守性，其屮含有两个锌指结构的DNA结合区(DBD),大约由70个氨基酸序列构成，其功能是与口标基因上的一种叫做PPAR反应元件的序列(PPRE)结合；连接区的作用是连接DBD与配体结合；连接端有个氨基酸序列不同的配体结合区(LDB),各亚型的PPAR结合不同配体产生亲和力也将不同0】。PPAR的配体在结构上有一个共同点，含有竣基功能基团的一个疏水区和PPAR结合区。PPAR的配体分为合成配体和天然配体。合成配体主要是一些药物。天然配体主要来源于饮食和机体的代谢产物，如亚油酸、花牛四烯酸及其衍生物白三烯B4(LTB4)、15・脱氢前列腺素(15-PGDH)㈤等。配体结合区是受体作用的分子开关，受体与配体结合后被活化，活化的PPAR的DNA结合区和靶基因的PPRE结合，然后通过蛋白质间的直接相互作用或者间接通过转录屮介因子与基础转录机器成分相互作用，促进或者抑制靶基因的表达，从而产生物学效应。2.1.1PPAR基因的分类及同源性最初发现PPAR基因是在一种叫瓜蟾的生物，很快便在小鼠、鸡、猪和人类中克隆出来。通过对PPAR基因功能差异的研究发现，其有多种亚型，H前认为PPAR基因在两栖类、家倉类、啮齿类动物及人类均有结构与功能不同的3种亚型：PPAR・a、PPAR•卩和PPAR-y［23］,都由特定的单拷贝基因编码。根据启动了和拼接方式不同，PPAR-y一般可分为PPAR-y1、PPAR-y2和即PPAR-y3，但由于编码PPAR-yl和PPAR-y2结构域的6个外显了具有相同的序列0］,因此两者的功能是一致的。小鼠的PPAR・a、PPAR-p和PPAR-y分别被定位于7号、17号和6号染色体上。人类PPAR-a基因编码468个氨基酸残基，被定位于22号染色体上［羽。PPAR-P基因编码441个氨基酸残基，被定位于6号染色体上a〕。PPAR-y基因含有9个外显了，其基因组结构覆盖lOOkb,编码479个氨基酸残基，被定位于3号染色体上。鸡的PPAR-a.PPAR-p\n和PPAR-y则分别被定位于1号、26号和22号染色体上。孟和等［27］根据不同物种Z间的同源序列，得到鹅PPAR基因的mRNA序列，发现家禽中PPAR-a基因的CDs为1407bp,PPAR-p基因CDs为1322bp,PPAR-y基因的CDs为1428bpo孟和对17个不同物种PPAR基因Z间的CDS序列进行同源性比较分析可知，不同亚型的PPAR基因同源性相对较低，达到了66.18%；相同亚型的PPAR基因同源性很高，PPAR-a.PPAR-p和的同源性分别达到了84.82%、86.21%和87.36%o小鼠PPAR-y有2种类型:PPAR-ykPPAR-y2,两者来源于同种基因,但N端30个氨基酸存在差异。这些研究结果显示了在进化过程中PPAR基因是相对保守的，并且该基因亚型不同其在基因组成和功能上也有一定的羞异，因此需要分别研究该基因在不同亚型屮的作用。2.1.1PPAR基因的表达及在脂类代谢中的作用PPAR基因主耍在脂肪和肝脏组织中表达，它能够调控很多参与脂类代谢的主效基因表达，尤其是卜氧化过程小的一些重要酶类，进而参与脂肪的吸收、转运、生成和分解等［28・29】。FT而对PPAR的靶基因的研究和鉴定主要集中在肝细胞和脂肪细胞。Diot等卩°］对鸡9种组织的Northerblot检测显示，鸡PPAR-a基因mRNA较高表达在肝脏、肾脏和心脏，也有较高表达于尾脂腺屮。口前，有关PPAR-p基因的研究报道不详，有试验证实PPAR-p在成熟兔的破骨细胞中高度表达。也有研究报道PPAR-P几乎在所有组织中均有表达，其中较高表达于神经系统，肝脏的表达较弱⑶］。PPAR-y限制性表达于脾脏和脂肪组织卩％在其他组织中低水平表达。孟和等以鸡的PPAR基因作为待测基因探究其同鸡屠宰性能相关性时发现，PPAR-a基因的外显了4上含有突变位点一个，这个突变导致了结果则是个体基因型不同，其腹脂重和腹脂率性状上相关性也极显著，提示PPAR基因可能是与鸡脂肪代谢相关的主效基因，或是与主效基因连锁。Dreyer等卩习(1992)首先发现PPAR-a能调控过氧化物酶体p氧化。TouehbumP等［珂(1994)首次证明PPAR-a在脂肪生成中的作用。肝脏作为调控与脂类代谢密切相关的酮体、脂肪酸和甘油三脂的重要器官，通过调控脂肪酸的酯化、分解和吸收满足机体的需要［均。脂肪是机体能量储存以及利用的重要组织，主要功能是维持机体内的脂类、糖类代谢的有效进行和能量代谢平衡。PPAR基因在肝脏和脂肪中的高表达调控了多种不同途径的脂类代谢［殉。包括脂肪酸转运、细胞吸收、细胞内脂肪酸结合以及分解和氧化贮存［切，从而在调节肝脏脂肪生成和肝外脂肪沉积中起着基础性的作用。PPAR-a在调控肝脏过氧化物酶增生中起着关键性作用。PPAR-a基因在脂肪酸酯化代谢率较高的机体组织中表达，直接调控着与脂肪酸氧化有关的关键生物酶的表达，调节过氧化物酶体和线粒体内脂肪酸的氧化与代谢。Finck［38］等(2005)研究表明了转基因小鼠的肌肉PPAR-a过量表达能够加快脂肪酸的氧化速率，被激活的PPAR-a还可促进载脂蛋口apoAl表达，降低血清屮甘油三酯的含量，显著增加粪胆汁酸的排出，可见，PPAR-a的激活对胆汁酸的合\n成也具有一定的调节功能［说，由此可证明活化的PPAR-a能够提高脂蛋白脂肪酶的合成速率，催化促进脂蛋白中甘油三酯脂解成游离脂肪酸购。PPAR-y的主耍作用是控制脂肪的储存和释放，促进脂肪细胞高效表达，调节胰岛素抵抗和血糖的稳定，维持机体能量相对平衡，主耍通过与增强了结合蛋口(C/EPB)家族相互结合协调诱导脂肪细胞分化，二者可以各门独立参与脂肪细胞代谢调控，也能通过相互作用共同刺激脂肪细胞分化，在此过程屮，特别在早期脂肪细胞分化上起到正向调节作用，同时也大大增加储存脂肪酸的能力⑷］。有研究表明PPAR-y除在脂肪细胞分化过程中具有重要作用外，还参与了脂质代谢的调控作用Id。通过研究发现，一些与脂类代谢主要相关基因的表达也能够被PPAR-y调控。例如脂肪细胞中与脂肪酸转运蛋白(FATP)结合的长链脂肪酸，与蛋白Ap2基因和乙瞅辅酶A合成酶基因的启动了区含有功能性的PPRE结合在一起的脂肪型脂肪酸，都能被PPAR-y激活表达⑷一44〕。其它如苹果酸酶基因、葡萄糖转移子(GLUTI)等参与脂肪酸转运和代谢的基因在转录水平受PPAR-y的调控⑷也。2.1MyoG基因2.2.1MyoG基因的发现及结构特性在骨骼肌的生成过程中，肌细胞要经历一系列的变化，主要表现在形态学、组织学和分子生物学形态变化上，各个阶段产生了不同的细胞谱系，最后通过终末分化，在肢体的齐个部位形成多样性的肌细胞，再由这些成肌细胞经过一系列的发育变化最后分化为多种类型的不同大小肌纤维，这些发生在形态学上的改变是由多基因在分了水平上的综合作用，从而影响蛋口质翻译最终表现出来，研究发现控制这些复朵过程的基因则是MyoD基因群家族。该基因家族能够编码肌肉特异性转录因了，主要有4大类，分别是肌细胞生成素MyoG、MyoD、Myf5和MRf4,这些基因在控制骨骼肌生成和肌肉调节过程中起着关键性的作用。MyoG基因于1987年由Davis首次发现［47］oMyoG基因是成肌调节因了MyoD家族群小最重要的一员，在胎儿发育屮早期就开始发挥重要作用，表达于分化末期，通过控制、启动成肌细胞的融合和肌纤维的形成而在肌肉分化过程中起重要的作用［钢。从结构上看，含有b・HLH结构域是MyoD家族蛋白结构上的最大特点，HLH螺旋结构是这一家族蛋白与DNA相互作用的区域，所以从这点看它们展于转录因子超家族成员。研究表明，MyoG基因位于MyoD和Myf5基因的下游⑷〕，是一极其保守的基因，含有非常稳定编码区序列结构，由于MyoG基因序列中GC碱基含量较高，其非编码区存在大量C碱基和G碱基的突变。荷兰SoumillonA等根据人类和小鼠MyoG基因序列设计引物，利用PCR技术扩增猪基因组DNA,获得了2个长度的扩增片段，分别为2081bp和442bp,将这两个扩增片段通过克隆的方法连接到pUC18并测序，发现猪MyoG基因与人类、小鼠MyoG基因一•样，也包括3个外显子：编码bHLH结构域的外显了1,编码1个含27个氨基酸序列构成的激活转录结构区域外显了2,编码4种MyoD蛋白质都有的C端保守的序列外显了3,且三者在bHLH\n结构域的氨基酸序列几乎相同。通过调节肌肉分化阶段特异性蛋口的表达来参与肌细胞的决定和分化"刈。通过研究参照猪等MyoG基因序列，王琼等⑴］对鸡的MyoG基因研究时发现：在5调控区的上游有1个长为131bp的片段，其中含有1个E-box和1个肌细胞增强结合因子位点1个完整的启动子。其它关于鸡的MyoG基因也已经被克隆和分析，研究发现在MyoG基因启动区中含有许多连续的调控序列，这些被认为与基因的特异性表达和口动调控有关的序列被称为E-boxo但是进一步的研究表明:在CMD1启动区小的E-box与MyoG基因的特异性表达及自动调控无关，CMD1启动区的调控可能是受其他因了的影响而进行间接调控，因此鸡的MyoG基因序列调控表达功能后续还有待进一步深层次的研究和完善。2.2.2MyoG基因序列的同源性比较大量研究表明，相比不同物种MyoG基因的核酸序列存在差异性，相同物种间的MyoG基因的核酸序列同源性较高。有研究将猪MyoG基因氨基酸序列与人类小鼠的MyoG基因氨基酸序列从转录起始位点上游160bp处起进行比较，发现它们有97%和96%的同源性［殉。SabouriaLA试验表明，MyoG与MRf・4貝有同源性，是唯一在所有骨骼肌细胞系中均可表达的基因，是骨骼肌分化所必需的因了，可通过控制成肌细胞的融合和肌纤维的形成而对肌肉的分化起关键作用"叫研究MyoG基因外显子序列在不同物种间的遗传多态性分布，发现鱼类与哺乳动物相比，在外显了26Obp,300bp,740bp附近各有一处重复序列，比对物种间这些氨基酸序列表明了两者同源相似性较高。不同物种MyoG基因序列的发育树分为两个大分支一支以人，猪和牛与各种鼠类构成的哺乳动物分支，另一支是以齐种血类构成的角类分支。鸡屈于更接近哺乳动物的一个相对独立的分支［呦。因此可以发现不同物种MyoG基因的核酸序列存在差异的同时，也有很高的同源性。2.2.3MyoG基因的表达及功能研究MyoG能调节基因门身的表达，与生肌因了其它成员相互作用，调节彼此基因的表达。MyoG基因可调节MRf4基因的表达，也能调节肌肉特异基因如肌肉肌酸激酶、肌钙蛋白、肌球蛋白轻链基因等的表达。将骨骼肌去神经后，观察4种MRF基因转录增强效果试验，发现MyoG基因反应最快且增强的幅度最高。HastyP(1993)剔除鼠MyoG蛋口试验结杲表明了该基因在在成肌细胞向肌小管分化过程中具有独特的功能，证明了MyoG基因确实在肌细胞分化过程小起着小心调节作用⑹吗。Zipora(2001)［63］^用抗体逆转录多克隆方法，利用鸡的成年型成肌细胞和胚胎型成肌细胞培养MyoG和MyoD基因，观察其从增殖到分化过程的情况。在第11口龄将胚胎型肌细胞分离提取出来，而在第3周龄将成年型成肌细胞提取出来，结果发现胚胎型成肌细胞的培养物中的MyoG和MyoD基因在第一天就快速转录，分化为大量肌球蛋白。而在成年型成肌细胞中MyoG的表达耍比MyoD的表达晚很多。这个结果证实了成年型和胚胎型的成肌细胞可能分别代表了表型不同群体的假说，在胚胎型成肌细胞中MyoG是代表终末分化，在成年型成肌细胞中MyoG则早期在生肌细胞谱系表达〔网。因此MyoG基因的遗传变异被认为与肌肉的生成相关，并最终影响产肉\n量以及肉质上的差异［何。大多报导a®］称对鸡肉的肉质风味有关的因素多为鸡的自身品种、屠体血液性状等，但很少了解组织学特性对肉质也有很大程度上的相关，现已证明了某些组织学肌肉性状就是影响肉质风味重要因素，如肌内脂肪含量、肌纤维直径、肌纤维密度、红肌纤维含量等。在特定范围内肌内脂肪、肌昔酸、红肌纤维含量与鸡肉的风味呈正比例关系；肌纤维密度越大、肌纤维直径越小、肌纤维长度越长，肉质越好，反Z则肉质风味越差。SoumillionA等研究猪的MyoG基因座位的变异大大影响了肌纤维数量，与出生重、生长率和屠体重有关。Hugcs等［斶(1993)曾报道在快肌纤维中发育中MyoD表达量相对增高，而在慢肌纤维发育中MyoG基因高表达。因此，表明了MyoG的生物学功能主要与肌纤维的风味和嫩度有关。由上可以得出MyoG基因与鸡肌肉生长发育关，通过控制、启动成肌细胞的融合和肌纤维的形成而在肌肉分化过程中起关键作用，该基因的变异可能会与肌纤维的变异有关联。因此，对MyoG基因的研究已经成为国内外家盒肉质研究的一大热点。2.1MSTN基因2.3.1肌肉生长抑制素基因MSTN的发现及结构特性肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF8(GrowthDifferentiationFactor8),是美国McPherron等阿首先从小鼠骨骼肌cDNA文库屮克隆的一个新基因，它是通过设计简并性引物跑PCR方法，扩增出一个约280bp的新产物，以此为探针筛选小鼠骨骼肌cDNA文库，得到完整的cDNA的序列。研究表明，该基因cDNA有且只有一个可读框(openingreadingframe,ORF),编码着376个氨基酸，其结构有与TGF-p超家族成员的特征，但在同源性上却不同，与TGF-p家族其他成员的相比很低(最高的才达到46%),同时也首次研究表明了MSTN主要分布在骨骼肌中，能抑制骨骼肌的生长，是肌肉骨骼肌发育的负调控关键因了。根据蛋白质同源性比较证明，肌肉生长抑制素属于TGF(TransformingGrowthFactor,转化生长因了)超家族中的一个新成员,但不属于已发现的亚家族，因此具备了TGF-p超家族成员的所有特点：N末端具有疏水性且能分泌的一段信号肽序列；C末端包含有9个保守的半胱氨酸的生物活性区及保守的具有蛋口水解功能加工位点(RSRR),其翻译的产物则是大小为26kD的成熟糖蛋白。有研究将肌肉细胞前体表达蛋白的MSTN基因的RSRR区切除掉，发现剩余的成熟区(109个氨基酸)通过其中9个保守的半胱氨酸形成二硫键与细胞膜上的受体结合，进而发挥其相应的功能［勿。而位于RSRRZ后的具有生物酶活性的C末端序列部分进化的一系列过程中，保守程度很高［71］o以前体蛋白形式合成的TGF-p超家族成员，在特定的位置进行深加工，分泌产生了大量进入循环系统的成熟肽序列。Thomas®］等(2000)分析了61研究牛的初级成肌细胞，对其蛋白进行提取后发现尚未加工的完整蛋口(52kD)和N末端LAP蛋(40kD),此外，骨骼肌中MSTN抗体提取物也鉴别到成熟加工了的MSTN(26kD),这说明MSTN蛋白不是分泌到细胞外进行加工，的确在成肌细胞加工、合成，加工后的MSTN分泌进入机体细胞内发挥作用。\nMSTN基因编码序列在进化过程中高度保守，險类Z间的该基因同源性为92%,禽类与哺乳动物Z间的同源性为80%,禽类与血类的同源性仅为60%o2.3.2MSTN基因的组织表达毛亮等［⑹用RT・PCR方法克隆藏鸡MSTN编码基因，用半定量RT・PCR方法检测mRNA在藏鸡腿肌等10个组织的表达情况。结果发现mRNA在腿肌、胸肌、心脏、肾脏、睾丸、卵巢、胃屮均检测到表达，脂肪肝脏、肺屮未检测到mRNA表达，其屮在胸肌和腿肌屮表达量最高，由此表明MSTN基因主要分布在骨骼肌中，对骨骼肌生长发育进行负调控。通过研究大量鱼类发现，鱼类中MSTN基因的表达更为广泛，该基因在大马哈鱼、罗非鱼的眼、骨骼肌、性腺、腮、大脑、肠、舌等组织中均有不同程度的表达，而且其表达时序性和肌形成相同［列。Sbarma等［75］(1999)^究发现在牛的骨骼肌屮MSTN基因表达相对较高，在浦肯野氏纤维屮和心肌细胞有少量表达。检测交配后9d后的小鼠胚胎，也能发现有MSTNmRNA,可知在成年及正在发育屮的小鼠骨骼肌屮英表达广泛。从以上研究结果可发现，MSTN基因主要表达于生物体骨骼肌组织中，较少表达于其它组织。2.3.3MSTN基因的作用机理与功能研究MSTN通过二聚体与细胞膜上的受体结合，通过3种Smad蛋白的介导，信号传入细胞核，作用于靶基因，调节肌肉生长。进一步研究发现，MSTN基因主要表达于小鼠的骨骼肌屮，Lee%】采用基因敲除技术研究其功能时表明，正常野生型小鼠的骨骼肌不足MSTN基因敲除鼠的1/3,其臀、肩部的肌肉肥大明显，身体整个骨骼肌含量比野生型小鼠大出很多，肌肉单块的重量大致为野生小鼠的2・3倍，自然也影响了体重的增大。研究骨骼肌肌纤维的数目发现突变型小鼠比野生小鼠要高出将近86%(P<0.01),表明了突变型小鼠骨骼肌肥大的原因，一•是肌细胞的增生，而则是肌纤维的肥大，英他生长发育性状上则没冇发现任何明显表现型的区别。此研究1997年刊登在著名的《Nature》杂志上而引起了轰动，并拉开了研究双肌机理的序幕。随后育种学家解开了困惑了几个世纪的比利时兰牛和意大利皮埃蒙特双肌牛的双肌机理，原来出现此双肌现彖是由于MSTN基因的第3个外显子冇11个核琶酸缺失，导致102个氨基酸缺失所致。后续关于肌肉生长抑制索基因MSTN基因作用机理的研究也Fl渐广泛起来。MSTN的功能也在比利时蓝牛得到了验证。经长期遗传选育的比利时蓝牛具冇十分强壮的骨骼肌，比其他品种普通牛高20%,骨骼肌肉大大增加肉鸡和蛋鸡是经过育种选育而成的两个重要品系，其骨骼肌生长发育性状差异很大，产蛋鸡骨骼肌生长速度远远低于肉用仔鸡，因此蛋鸡和肉鸡便成为探索骨骼肌生长发冇机制的理想索材。哈工大朱大海教授首次克隆了鸡MSTN基因组的全部序列，并初步论证了骨肉鸡和蛋鸡骼肌生长速度不同，其MSTNmRNA表达水平也存在明显差异［旳。另外述发现猪和小鼠的肌生成抑制素表达缺乏代谢效应。对它们进行食物限制不会影响其骨骼肌肌生成抑制索mRNA\n水平。有研究结果发现，MSTN在一些浸润伤口的纤维母细胞屮也有表达，认为可能是由于在肌肉再生早期阶段发生的炎症过程造成的，而新生的骨骼肌MSTN基因表达水平却下降。推测在维持机体稳态过程屮，MSTN可能发挥类似抑制索的功能，限制肌肉生长。这些研究有力地说明肌生成抑制索的生理作用很可能与出生前肌肉生长有关。单核首酸多态性(SNPs)是生物体基因组屮存在的最广泛的一类变异，被称为第三代分子标记，在基因组和基因功能的研究屮具有重要的作用。张跟喜等〔79］采用PCR-SSCP技术检测边鸡及3个对照鸡群体(京海黄鸡，尤溪麻鸡和ArborAcre鸡)肌肉生长抑制素基因外显子1的单核首酸多态性，比较这些多态位点在不同鸡种屮的遗传特征，结果显示拥有不同基因型四组鸡个体体重差异明显，表明了MSTN基因可能是影响边鸡生长性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。朱智等㈣(2007)的研究表明检测到的2个多态位点与温岭草鸡的腿肌重、胸肌重、腹脂重以及腹脂率、屠宰率、胸肌率存在显著或极显著的关系。这些研究结果预示鸡MSTN可能是与生长发育及肉用性状有关的主效基因，为探索和利用MSTN作为候选基因进行分了育种奠定理论基础。以上结果都充分表明，MSTN在调控骨骼肌肉的生长发育屮起着I•分重要的作用。MSTN作为骨骼肌生长发育的负调节I大I子⑻］,在去势鸡的生长发育过程中也起到了抑制骨骼发育的作用，为很多关于研究公鸡去势后生长发育提供了理论上的研究，因此研究MSTN基因的结构和功能对阐明骨骼肌生长发育的调控机理具有I•分重要理论意义。\n引言鸡肉是世界上消费增t速度最快、供应充足、物美价廉的优质肉类。鸡肉相比猪肉牛肉而言，其高蛋白质、低脂肪、低热量、低胆固醇“一高三低”的特点，具有更为均衡营养搭配优势，成为了人类营养物质的重要来源。随着人们生活水平的不断提高和肉食结构的改变，在鸡肉的需求量越来越大的同时，对鸡肉品质的要求也越来越高。公鸡去势后育肥加快，肉质变得更加细嫩多汁，受到了广大消费者的青睐。自古以来，世界上众多国家即流传着公鸡去势技术。我国民间一直有给公鸡去势的传统。淮南麻黄鸡是为安徽知名品种，其以生长速度快、外观优美、肉质较好，抗病性和适应性强而深受广大生产者和消费者欢迎，在民间一直保留着对该品种公鸡去势的做法。据不完全统计，安徽每年流入市场的去势鸡就达10万只以上，而且更有愈演愈烈之势，去势鸡愈来愈向市场化规模化的现代养殖业发展。然而淮南麻黄公鸡去势后肉用性状和肉质性状究竞如何变化，一直缺乏系统的研究，给生产和消费造成一定的盲目性。本研究以淮南麻黄鸡为研究对象，深入探索了公鸡去势对生2、屠宰、肉品质等性状影响，同时研究了肉质和关基因PPAR・a、MSTN、MyoG的mRNA表达变化规律，旨在系统评价去势对淮南麻黄鸡公鸡肉用性能的影响,并初步揭示去势影响肉质性状的分子机理。\n1材料与方法1.1试验材料1・1・1试验动物的分组与处理选择2只健康强健的淮南麻黄鸡种公鸡，采集精液，每只分别与35只健康强健的淮南麻黄鸡种母鸡人工授精配种，收集12天所产种蛋，孵化、雏鸡谱系编号，笼养。46口龄将公鸡按照同胞配对，分成两组，一组进行手术去势作为试验组，另一组只开刀不取睾丸作为对照组。去势前禁食12小吋，去势后两组公鸡相同环境下常规免疫、合理饲养。0・4周龄饲喂小鸡料代谢能(ME)11.72MJ/kg,粗蛋白(CP)20%；5・10周龄饲喂中鸡料代谢能(ME)11.93MJ/kg,粗蛋白(CP)17%；11周龄后饲喂大鸡料代谢能(ME)12.13MJ/kg,粗蛋白(CP)16%；12、16、20周龄时分别从两组中各选择16只对应全同胞公鸡，三次共计96只，进行屠宰试验，测定生长性能和肉质指标。1.1.2主要仪器设备(1)DYC-31D电泳槽：北京六一仪器厂(2)梯度PCR仪：Bio-Rad公司(3)PCR仪：Flexigene公司(4)801-L型凝胶成像系统：江苏省捷达科技发展冇限公司(5)DYY-6C型稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂(6)TGL-16G型高速离心机：上海安亭科技仪器厂(7)SW-CJ-2D型超净工作台：苏州净化设备公司(8)DK-8D高压灭菌锅：上海一恒科技有限公司(9)DYCZ-24A型电泳槽：北京六一仪器厂(10)WD-9406型胶片观察灯：北京六一仪器厂(IDpH笔式酸度计：上海精密仪器表有限公司(12)C-LM3型肌肉嫩度仪：北京朋利驰科技有限公司1.1.3主要试剂及药品(1)琼脂糖(Agrose)：ShanghaiYitoBio-InstrumentCompany(2)蛋白酶K(ProteinaseK)＞丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide):AMRESCO(3)引物：上海生物工程技术有限公司合成\n⑷SYBRgreen：广州瑞真生物技术有限公司（5）DEPC：美国SIGMA公司（6）DNAMaker：天根生物科技有限公司1・1・4常规溶液及试剂配置参考《分子克隆实验指南》第三版，试剂配置均以去离子水为溶剂，高压蒸汽灭菌30mino（1）0.5XTBE缓冲液:取lOxTBE（Tris-硼酸）缓冲液50ml,加水至1L。（2）10mg/mlEB：称取100mg的EB充分溶解于10ml双蒸水中，分装成lOOOul/份，4°C避光保存。（3）DEPC水：1000ml超纯水加入lmlDEPC,37°C过夜，高压灭菌。（4）引物：按引物设计软件所配的浓度稀释。（5）4%甲醛：40%甲醛溶液加水稀释定容。1.2试验方法及步骤1.2.1公鸡去势方法去势手术前禁食18h,禁水12h。将小公鸡的两翅交叉固定，两腿绑定于长木棍上，使其侧卧向上。拔掉距背中线lcm左右、最后两个肋间周围的羽毛，碘酒消毒皮趺后，左手拇指与食指将皮趺和餡腰肌一起稍向后拉，在最后两肋间选定开刀部位；右手持刀，在开口部位沿肋骨的走向切开3cm左右的长度，用开张器撑开切口，再用去势刀的另一端的小钩轻轻划破腹膜。用挖睾勺轻压肠管，即可看见淡黄色或深黑色的睾丸，然后在挖睾勺的配合下用马尾套睾器摘除睾丸，对侧的睾丸用同样的方法摘除。手术时切口尽可能小、操作动作尽量轻。1.2.2常规肉品质的测定指标与方法（1）肉色：取新鲜胸肌9g左右（无筋腱、脂肪），剪碎，置匀浆管内，立即加蒸饰水30mL,匀浆10min,随后将全部匀浆物移人离心管屮，3000r/min离心10min,取上清液在分光光度计540nm下记录OD值。（2）嫩度：取新鲜胸肌腿肌各1块，从锁骨端开始，沿肌维方向修成宽lcm,厚0.5cm长条肉样（无筋腱脂肪、肌膜），随即用C-LM3型肌肉嫩度仪测定剪切力值，每个样本剪切3次，计算平均值。（3）pH值：取部分肉色测定中提取的上清液，用肌肉pH酸度计在45min内测定pH值，每一样品测定3次，计作pHl；测定后的清夜放于4°C冰箱，24小时后按同样方法再次测定，计作pH2o（4）滴水损失：取左侧胸肌和腿肌5x3x2cm横切肉样，第一次称重（Ml）后置于封口塑料袋屮，放人4°C冰箱屮，24h后用滤纸揩去肉表面水分第2次称重（M2）。肌\n肉滴水损失率=（M1・M2）/MlxlOO%。（5）肌内脂肪：采集刚屠宰新鲜的胸肌快速冷冻在・20°C条件下，贮藏待用。取胸肌肉样5g除尽外周筋膜，切成小块充分捣碎后进行匀浆，用三氯甲烷、甲醇（2：3）法提取肉样肌内脂肪。此步样品测试在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所完成。（6）肌苜酸：参照（5）用索氏抽提法提取。肌肉物理组织学特性：在胸大肌、腿肌中间部位取样，样品规格为2cmxlcmxlcmo取下后的样品即刻放入Z前配制好的4%甲醛溶液里固定24h,然后剪成0.7cmx0.6cmx0.4cm的组织块，再固定12h,按常规方法脱水，进行石蜡包埋处理。包埋时要使肌纤维的长轴与蜡块切片垂直。切片约厚7cm,最后按苏木素一伊红染色，常规封片,每样品2张。（7）肌纤维密度：在10x10倍的倒置显微镜下，随机选岀5个视野，拍下照片保存于带有moticdigilabII测量软件的电脑进行分析计算。（8）肌纤维直径：在10x10倍的倒置显微镜下，随机选出5个视野，每个视野测出100条肌纤维，保存于带有nwticdigilabII软件的电脑进行分析计算。1.2.3屠宰性能指标的测定（1）直接测定项目活重：指在屠宰前停饲12h后的重量屠体重：禽体放血，去羽毛、脚角质层、趾壳和喙壳后的重量胸肌重：将禽体胸肌去皮、去骨剥离后的肌肉重量腿肌重：将禽体腿部去皮、去骨剥离后的肌肉重量半净膛重：屠体重去气管、食管、嗦囊、肠、脾脏、胰腺、胆和生殖器官肌胃内容物及角质膜后的重量。留卜•心脏、肝脏（去胆）、肺脏、肾脏、腺胃、肌胃（去除内容物及角质膜）和腹脂的重量全净膛重：半净膛重去心脏、肝脏、腺胃、肌胃、肺、腹脂及头、脚腹脂：腹部脂肪和肌胃周围的脂肪（2）计算项口屠宰率=屠体重/活重X100%半净膛率=半净膛重/活重X100%全净膛率=全净膛重/活重X100%胸肌率=胸肌重/全净膛重X100%腿肌率=腿肌重/全净膛重X100%腹脂率=（腹脂重+肌胃外脂肪重）/全净膛重XI00%\n1.3荧光定量PCR实验方法1.3.1组织RNA的提取取准备好的组织样50-100mg与液氮小研磨，用Omika试剂盒法进行总RNA提取,在紫外外分光光度计对所提总RNA进行纯度鉴定，并进行凝胶电泳检测。总RNA保存于・80°C或立即进行反转录。1.3.2引物设计参照GeneBank上所登录的家禽PPARf、MSTN、MyoG基因和持家基因GAPDH基因序列号设计引物(表1・1),进行后续PCR扩增反应。表1-1PPAR-axMSTNxMyoG>GAPDH基因引物序列Tablel-1.PrimersequencesofPPAR-a,MSTN,MyoGandGAPDH基因登录号引物序列长度GenesymbolAccessionPrimersequencelengthPPARp上游：tatccctggcttctccaatct21AF_163809.1下游：cagcatcccatctttgttcat21MSTN上游：gtagtcagcccacagagaacg21AF_019621.1下游：gcagtttgctgaggatttgaa21MyoG上游：ggctttggaggagaaggact20NM_204184J下游：ggttggggttgagcagagt19GAPDH上游：gcccagaacatcatcatccca21JQ_280469」下游：cggcaggtcaggtcaatatca211.3.3反转录(RT)按照Promega公司提供的试剂和反应条件进行，反应休系为：RNA2ul,Oligo(Dt)lul,2xTSReactionMixlOul,TSRTMixlul,Rf-Water6ulo加完以后，轻轻混匀，42°C温育30min,85°C加热5min,再冷却至4°C,终止反应，即得RT产物cDNA,可放于・20°C保存备用。1.3.4目的片段的PCR扩增以cDNA为模板，用PPAR・a、MyoG、MSTN和GAPDH的下游和上游引物，分别建立50pL的PCR反应体系，同时设无模板对照和阴性对照。反应体系如下：模板cDNA2ul,上游引物2ul,下游引物2ul,PremixTaq25ul,ddH2O19ul；PCR反应程序为:94°C预变性2min,然后94°C变性45s,60°C退火45s,72°C延伸45s,共30个循环；72°C终延伸lOmin,再冷却至4°C,终止反应。将得到的PCR产物进行cDNA的反转录效果和引物设计的止确与否的检测。1・3・5琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物称取1.5g琼脂糖溶于lOOmLlxTAE缓冲液中，放入微波炉中进行加热溶解，待冷却至50°C〜60°C吋，加入10pL溪化乙锭(EB)溶液混匀至终浓度为50Mg/mL,再将其倒入准备好的凝胶板中，待其凝固后，于加样孔分别加入PCR产物样品及标准DNAMarkei*,100V电压电泳20min,在紫外线检测仪上观测电泳结果。\n1・3・6荧光定量PCR选取同一时间段的10个cDNA样品，混合形成200ul的cDNA池，用灭菌的ddH2O进行10倍梯度稀释:10-K10・2、10・3、10・4、10・5,用于制作标准曲线。釆用25ul反应体系：12.5ulSYBRGreen,&5ulddH2O,lul±游引物，lul下游引物，2ul目的基因模板cDNAo反应条件：94°C预变性3min；94°C,50S,72°C,lOmin,31个循环；72°C延仲lOmin,4°C保存。进行PCR扩增时，同时以不加模板的体系和RNA为模板的体系做对照，以排除试剂污染和基因组DNA污染引起假阳性的可能。每个样品做3个重复，以保证试验数据的可靠性。1.4数据处理与分析试验数据采用SAS软件（9.1.3版）进行分析，两组数据用t检验法进行并界比较，回归分析采用Reg过程，各组数据以平均值土标准差（SD）表示，显著水平设定为P<0.05或P<0.01o\n2结果与分析2.1去势对公鸡外观及精神状态的影响淮南麻黄公鸡去势后，随着周龄的增加，试验组相比对照组羽毛变厚，颜色逐渐变得亮丽、且更加整齐，冠色、喙色呈现鲜红、湿润，冠长、冠宽、冠厚明显减小，精神状态更加平和温顺。2.2去势对公鸡生长及屠宰性能的影响由表2・1可以看岀，去势对公鸡的生长速度、屠宰率等指标无显著影响(P>0.05)；第12周龄时试验组与对照组各项宰指标并界都不显著(P>0.05)；第16周龄时，试验组全净膵率、半净膵率显著高于对照组(P<0.05)；第20周龄吋，试验组腿肌率显著高于对照组(P<0.05)；第16、20周龄时，试验组腹脂重和腹脂率极显著高于对照组(P<0.01)o\n*2-1去势对鸡生长及屠宰性能的影响Table2-1Effectsofcastrationongrowthandslaughterperformance指标12周龄试验组16周龄对照组20周龄试验组对照组试验组对照组活重（g）873.5±95.4906.4±97.6122&3±89.51205.5±102.41470.1±152.91479.6±162.5屠体31(g)725.4±73.8762.4±86.81035.6±64.31029.9±70.21244.3±131.41294.1±15&4屠宰率（％）85.7±3.784.2土3.386.7土1.988.6±2.384.5±1.286.1±1.9半净膛（g）694.3±73.8734.3±83.5992.6±47.5952.8±49.11077.4±117.91189.2±±150.5全净膛（g）562.4士63.9593.1±77.9807.5±3&1773.3±43.41020.1±303.9970.8±124.2半净膛率（％）82.0±0.381.1±0.483.1±O.3a82.3±0.7b79.0±0.479.1±0.3全净膛率（％）65.4±0.965.3±0.867.6±0.6a66.8±0.9b64.9±0.464.5±0.4腿肌（g）100.9土9.8103.7土&5188.7±17.6186.5±36.8241.9土36.0255.7土44.4胸肌（g）66.1±11.164.1±12.5119.5±11.3106.72±22.6131.8±24.3157.9±26.9腿肌率（％）12.1±0.912.0土0.815.8±1.516.1±1.916.9±1.7a14.8±1.5b胸肌率（％）7.9±0.97.3土1.410.0±1.19.2±1」9.7±1.410.5±1.2腹脂（g）0.8±0」0.9±0.12.5±0.6a1.4±0.5b10.4±2.5a3.5±1.6b腹脂率（％）0.1±0.010」土0.020.2±0.19A0.1±0.04bO.8±O.55a0.2±0.13b注：同行肩注不同小写字母表差开显着（PV0.05）,不同大写字母表差杲极显著（PO.01）Note:Theshouldernotesmarkedwithdifferentminusculesmeanssignificantdifference(P<0.05),whilewithdifferentcapitallettersmeansverysignificantdifference(P<0.01)2.3去势后对淮南麻黄鸡肉品质的影响2.3.1肌纤维密度及肌纤维直径从两组显微镜组织切片可以看出，可以很清晰的看出两组肌纤维横截而图，表明切片质量完好，借助moticdigilabII测量软件计算出腿肌肌纤维密度及肌纤维直径。\n图2・1腿肌切片图2・2胸肌切片Figure2・1LegmusclebiopsyFigure2-2Breastmusclebiopsy由表2・2可看出，试验组和对照组胸肌和腿肌肌纤维直径都在16、20周龄达到差异显著(P<0.05),英屮在16周龄时两组差异最为明显，腿肌肌纤维直径试验组比对照组组低16%,胸肌肌纤维直径试验组则比对照组组低13%。腿肌肌纤维密度在16、20周龄达到差异极显著水平(P<0.01),其屮在20周龄时最为明显，试验组比对照组高20%；胸肌肌纤维密度在16周龄时差异最大，试验组比对照组高26%O其余各项指标两组都非常接近，无明显变化(P>0.05)o\n表2・2去势对鸡肌纤维密度及肌纤维直径的影响Table2-2Effeatsofcastrationondensityanddiameterofmyofiber部位项目12周龄16周龄20周龄试验组对照组试验组对照组试验组对照组腿肌纤维直径（um）32.17±4.7033.18±6.6441.98±5.76a4&69±6.82b50.27^6.12a57.84±5.98b肌肌纤维密度（根/mm，）768士134.63734±121.23637±128.72a569±144.64b572±113.27a477±97.34b胸肌纤维直径（um）42.26±4.0444.17土3.7850.39±5.06a56.73土5.56&62.91±5.82a66.43土6.03&肌肌纤维密度（根/mm'）422±100.86390±80.21378±87.13a301±70.25b289±96.28a231±82.37b注：同行肩注不同小写字母表差异显善(P<0.05)，不同大写字母表差异极显著(P<0.01)Note:Theshouldernotesmarkedwithdifferentminusculesmeanssignificantdifference(P<0.05),whilewithdifferentcapitallettersmeansverysignificantdifference(P<0.01)2.3.2常规肉质从表2・3看岀，无论是腿肌述是胸肌，去势后第12周龄时齐项肉质指标试验组和对照组差异都不显著（P>0.05）,16周龄时试验组剪切力极显著低于对照组（PO.01）,胸肌剪切力试验组相比对照组小58%,腿肌试验组相比对照组小55%；20周龄时试验组剪切力显著低于对照组（P<0.05）,试验组胸肌和腿肌剪切力分别低于对照组32%和25%（P<0.05）；其余各项指标两组都非常接近，无明显变化（P>0.05）o表2・3去势对组常规肉质的影响Tabic2・3Effeatsofcastrationongeneralmeatquality部位项FI12周龄16周龄20周龄试验组对照组试验组对照组试验组对照组pHl5.34±0.215.40±0.215.19±0.115.41±0.146.02±05.40±0.23pH25.56土0.155.58土0.185.47土0.155.5810.166.23土0.215.56丄0.28胸OD值0.8H0.390.82±0.360」2±0.030.13±0.060.78±0.390.54±0.36肌滴水损失（％）14」7丄0.0314.36丄0.0310.2110.0410.83丄0.0414.5010.0715.0010.06剪切力（N）17.27±9.5319.83士&6820.61±12.18a32.61±11.12b28.83±9.87八35.93±10.03bpHl6.02±0」45.90±0.185.94土0.175.88±0.196.02±0」85.99±0」7pH26.17±0.136.08±0.206.26±0.156.24±0.146.23士0.216.20±0.28腿OD值2.41+0.352.19+0.471.18+0.690.93+0.372.13+0.371.73+0.82肌滴水损失（％）12.99±0.0413.59±0.069.46±0.029.79±0.0411.79±0.0514.21±0.08剪切力（N）26.77±10.2131.80土&2832.10±13.77人49.79±14.64b41.83±9.34a59.65±10.36b注：同行肩注不同小写字母表差异显著（PV0.05）•不同大写字母表差异极显著（PV0.01）\nNote:Theshouldernotesmarkedwithdifferentminusculesmeanssignificantdifference(P<0.05).whilewithdifferentcapitallettersmeansverysignificantdifference(P<0.01)2.3.3M内脂肪(IMF)和肌昔酸(IMP)含量由表2—4可知，试验组和对照组胸肌肌内脂肪在20周龄时茅异显著(PV0.05),试验组比对照组多出34%。其余各项都无明显变化(P>0.05)o表2・4去势对鸡肌肉肌内脂肪(IMF)和肌昔酸(IMP)的影响Tabic2-4EffcatsofcastrationonIMFandIMP项目试验组12周龄对照组16周龄20周龄试验组对照组试验组对照组肌内脂肪(%)0.45±0.180.48±0.170.79±0.160.68±0.18l.()3±0.18a0.77±0.16b肌冇酸(%0)0.076±0・040・063±0・040.167±0・060.097±0・070・225±0・060.187±0.06注：同行肩注不同小写字母表差异显著(P<0.05)Note:Theshouldernotesmarkedwithdifferentminusculesmeanssignificantdifference(P<0.05),2.4基因荧光定量检测mRNA表达分析结果2・4・1总RNA完整性检测用lxTAE溶液配制的1.5%琼脂糖，对提取的总RNA进行凝胶电泳，电压120V电泳15・20分钟。由图显示本实验检测结果得28SrRNA,18SrRNA,5SrRNA三条带，电泳条带清晰，没冇明显拖尾现象。且28rRNA亮度比18rRNA亮度要强，5rRNA不清晰，说明RNA完整性较好；同时用分光光度计测定OD260和OD280值,根据OD260值计算RNA的产量，根据OD260/OD280值判断RNA的质量，本试验提取RNAOD260/OD28offi在1.8—2.0之间为合格，否则重新提取。提取好的RNA可以进行下一步的试验。图1组织RNA提取电泳图28S18S5SFigure1ElectrophoresisoftissueRNAextraction2.4.2逆转录产物cDNA的质量检测图为目的基因PPAR-a.MSTN、MyoG和持家基因屯泳检测逆转录产物cDNA的质量条带结果，由图可见，PCR产物条带清晰，无拖带，大小与预期结果一致，表明无非特异性扩增，符合后续试验要求。\n图APPAR-a基因PCP产物FigureAPCRproductofPPAR-a图BMSTN基因PCR产物FigureBPCRproductofMSTN200blOObplOObp50bp50bp200bp图CMyoG基因PCP产物FigureCPCRproductofMyoG图DGAPDII基因PCP产物FigureDPCRproductofGAPDH200bplOObp50bp图2逆转录产物eDNA的质量检测图Figure2Qualitytestofproductsofreversetranscription2.4.3荧光定量标准曲线与溶解曲线由下图表明，整个荧光定量PCR过程目的基因和持家基因扩增反应条件一致性较好，溶解曲线未出现多余波峰，表明目的基因与持家基因特杲性扩增。因此，数据结果符合定量PCR试验要求。\n243.1PPAR-a基因A：PPAR-a基因标准曲线idi(fiaiditf40爷36343233282610B：GAPDH基因标准曲线C：PPAR-a基因扩增曲线D：GAPDH基因扩增曲线E:PPAR-a基因溶解曲线o.o7580859095Z妊;5o05lsdpF:GAPDH基因溶解曲线3028126°24222018...4.・.・・・•idididididConcentrationB：GAPDH基因标准曲线图3A-FPPAR-a和GAPDH基因表达曲线Figure3A-FGeneexpressioncurvesofPPAR-aandGAPDH2.43.2MyoG基因32\nC：MyoG基因扩增曲线D：GAPDH基因扩増曲线E：MyoG基因溶解曲线F：GAPDII基因溶解曲线图4A・FMyoG和GAPDH基因表达曲线Figure4A-FGeneexpressioncurvesofMyoGandGAPDH2A.3.3MSTN基因C：MSTN扩增曲线E：MSTN溶解曲线图5A-FMSTN和GAPDII基因表达曲线Figure5GeneexpressioncurvesofMSTNandGAPDH2.4.4三个基因荧光定量mRNA表达结果分析从表2・5可以看出，横向分别比较试验组和对照组PPAR-a基因mRNA表达量各自在12、16、20周龄肝脏、腿肌和胸肌表达情况发现，淮南麻黄鸡试验组和对照组12周龄都最低，随着周龄的增加两组公鸡PPAR-a基因mRNA表达量呈现不断上升趋势,20周龄吋表达量都达到最高；再从纵向比较两组鸡PPAR-a基因mRNA农达量对比情况，肝脏PPAR-a基因mRNA表达量在16、20周龄时试验组相比对照组差异极显著(p<0.01)；腿肌和胸肌PPAR-a基因mRNA表达量在16、20周龄时试验组相比对照组差异显著(p<0.05)；12周龄两组表达量无显著差异(P>0.05)o\nMSTN基因各组织mRNA表达量在三个时期不论纵向还是横向比较差异均不显著(P>0.05)；MyoG基因在腿肌和胸肌mRNA表达量，除在12周龄时试验组与对照组相比差异显著(PV0.05)外，其它变化趋势与PPAR・a基I大I基本一致。通过从三组基因mRNA表达量分析，我们发现在两组鸡的不同生长阶段不同组织屮三组肉质基因的表达量都有一定差异，在12周龄时表达水平最低，16周龄和20周龄时表达水平均较高，这表示随着口龄的増加，三组基因mRNA表达量逐渐上升，20周龄时达到最大值。16、20周龄时试验组相比对照组PPAR-a和MyoG基因mRNA表达量都差异显著；12周龄时除MyoG基因在腿肌和胸肌屮的表达量试验组相比对照组相比达到显著水平外，PPAR・a和MSTN基因mRNA表达量两组相比都未达到差异显著水平。表2-5PPAR-a.MyoG和MSTN基因荧光定量mRNA表达结果Table2-5mRNAexpressionofPPAR-a^MyoGandMSTNgeneat12^16.20wks基因组织试验项目12周16周20周肝脏试验组0.882±0.054.391±0.06a5.853±O.llAPPAR-a对照组0.827±0.032.184±0.03b3.674±0.08b，腿肌试验组0.368±0.021.145±0.05a1.452±0.08a对照组0.347±0.020.783±0.04b0.894±0.06b胸肌试验组0.229±0.020.466±0.05a1」74±0.04a对照组0.17±0.02O.337±O.O3b0.793±0.03b腿肌试验组2.563±0.162.194±0」32.776±0」2MSTN对照组2.246±0」22.287±0」52.733±0.12胸肌试验组1.847±0.121.354±0」42.035±0.18对照组1.782土0.141.478±0.161.979±0.14腿肌试验纽6.566±0.8638」90±0.53a11.873±0.82aMyoG对照组4.246±0.72b6・285±0・59B8.836±0.62b胸肌试验组5.245±0.93a7.088±0.50a8.462±0.83a对照组4.182±0.88b5.898±0.77b7.523±0.88b注：相同周龄、相同组织内同列肩注不同小写字母表差异显著(PV0.05),不同大写字母表差异极显著(PV0.01)Note:Thesameweek,sameorganizationinthesamecolumnshouldernotesmarkedwithdifferentminusculesmeanssignificantdifference(P<0.05),whilewithdifferentcapitallettersmeansverysignificantdifference(P<0.01)2・4・5三个基因mRNA表达量与性状相关性分析淮南麻黄鸡试验组与对照组PPAR-amRNA在肝脏、腿肌、胸肌中的相对表达量与腹脂率和肌内脂肪相关性分析结果见表2・6,从表可知，两组PPAR-a基因mRNA在肝脏中的相对表达量同腹脂率的相关系数分别为0.673、0.576,都达到显著正相关水\n平(PV0.05),而同肌内脂肪的相关系数分别为0.334、0.228,未达到显著正相关水平(P>0.05)o其余不同时期内PAR-a基因mRNA在各组织中的相对表达量同腹脂、肌内脂肪的相系数都为止相关，但都未达到显著水平(P>0.05)o表2-6各组织PPAR-amRNA相对表达量与腹脂率、肌内脂肪典型相关性分析Tabic2-6TypicalcorrelationoftherelativeexpressionlevelofPPAR-awithabdominalfatandIMFcontent基因组织试验项1=1腹脂率肌内脂肪肝脏试验组0.673**0.334PPAR-a対照组0.576*0.228腿肌试验组0.3040.096对照纟R0.3120.083胸肌试验组0.2120.107对照组0.2050.113注：肩注标有令的表示差异显著(PO.05),肩注标有杠的表示差异极显苦(P<0.01),下同。Note:nlarkedwith*saidtheshouldernotesignificantdifference(P<0.05),Shouldernotemarked**ofsaidverysignificantdifference(P<0.01),thesamebelow.由表2・7可知，试验组与对照组MSTN基WmRNA在腿肌、胸肌相对表达量与体重、胸肌率、腿肌率都呈负相关，试验组和对照组MSTN基因mRNA在腿肌中的表达量与体重的相关系数为-0.723>-0.674,试验组和对照组MSTN基因mRNA在胸肌屮的表达量与体重的相关系数为-0.745>-0.669,都达到了显著负相关水平(P<0.05)；其它各项均未达到显著差异(P>0.05)o表2・7各组织MSTNmRNA相对表达量与体重、腿肌率、胸肌率等指标典型相关性分析Table2・7TypicalcorrelationanalysisoftherelativeexpressionlevelofMSTNwithweightofbody,legmuscleandbreastmusclerat基因组织试验项1=1体重胸肌率腿肌率腿肌试验组-0.723**-0.367-0.345MSTN対照组-0.674**-0.327-0.286胸肌试验组-0.745**-0.421-0.441对照组-0.669**-0.387-0.404由表2■&叮知，试验组和对照组MyoG基|大ImRNA在腿肌、胸肌中相对表达量同肌纤维直径的相关系数分别为-0,743.-0.654和0864、-0.771,同肌纤维密度的相关系数分别为0.684、0.578和0.798、0.662,均达到极显著相关水平(P<0.01)o\n表2-8各组织MyoGmRNA相对表达量与肌纤维直径、肌纤维密度典型相关性分析Table2・8TypicalcorrelationanalysisoftherelativeexpressionlevelofMyoGwithdiameteranddensityofmyofibcr基因组织试验项1=1肌纤维肓径肌纤维密度腿肌试验组-0.743**0.684**MyoG対照组-0.654**0.648**胸肌试验组-0.864**0.798**对照组-0.771**0.662**\n3讨论3.1去势对淮南麻黄鸡生长及屠宰性能的影响公鸡去势时机尤为重要。去势时间过早，仍然有部分公鸡保留雄性性状，会出现“半生鸡”的现象，同时也会因公鸡□龄偏小术后受感染几率大、抵抗力差而宜接导致死亡；去势过迟，出于公鸡睾丸发育增人，而使手术操作困难，因流血过多而导致死亡。根据两广等地区的习惯，只要30%以上公鸡冠红、啼叫，有踩踏母鸡的行为时即可去势。本次实验综合考虑淮南麻黄公鸡各方面生长情况，选择了第46天进行去势，有效避免了去势过早或过迟而发生的公鸡死亡现象。活重是衡量机体生长性能与速度的重要指标。Miguel,JA［83］等对CastellanaNegra公鸡第8周进行去势，到第29周时观察去势与不去势的鸡体重，结果显示了29周时两者体重没有显箸差异，而邵永刚等网对西藏去势鸡与正常鸡进行了6、18、24周龄三次称重实验，得岀的结果是第6周龄体重差异不显著，18、24周龄体重差异显著。文忠等［陶在武定鸡的阉割和育肥技术研究中选择了较晚的不同去势□龄，分别在900龄、120日龄和150日龄对武定公鸡进行去势,探索其最佳去势日龄及育肥最佳上市期。得出武定公鸡最佳去势口龄为120D龄，去势能明显提高武定鸡育肥效果，壇加体重。通过本实验数据可看出，淮南麻黄鸡试验组与对照组在第12周时，对照组906.4g大于试验组873.5g,但两者并没有显著性差异（P>0.05）,可能是由于淮南麻黄公鸡在去势后至12周龄这一段时间应激作用需要一定时间的恢复，导致了鸡体重增加缓慢。随着口龄的增加，应激作用渐渐消失，试验组体重增长速度逐渐恢复为正常组体重，16、20周龄时两者体重仍无明显变化,分别为122&3g、1205・5g和1470.14g、1479.6g。活体增重出现假去势组人于去势组的情况，原因可能是去势产生应激，而前期在短时间内鸡采食量显著减少，后期由于快速生长时期已过，去势的效果渐渐消失，机体生长速度变慢也在很大程度上抑制了肌肉的生长。总之，去势对淮南麻黄鸡生长发育的影响不大，本结果-tjMiguelJA的结果一致，和邵永刚等人结果不同，其原因口J能是去势口龄、品种与饲养坏境所致，也有可能去势导致了与控制机体生长的一系列主效基因的变化有关。屠宰性能测定是衡量产肉经济性能的重要指标，（吉文林〔他等，2006）；本试验中，试验站屠宰率有一定程度改善，但并没有显著性差异（P>0.05）,表明了去势提高提高淮南麻黄鸡屠宰性能的效用是有限的；另外全净膛垂、半净膛重是衡量可食性的重要指标，胸肌和腿肌重又是主要的口J食部分，本试验中两组全净膛重、半净膛重、胸肌率，在三个试验段内均未出现显著性差异，而净膛率、腿肌率则发生了显著变化,说明了去势能够提高公鸡部分屠宰性能，从而提高了公鸡肉用价值，这与LinCY等㈢］研究结果较为一致。脂肪组织的生长发育不仅包括脂肪细胞体积的增大，也包含了新脂肪细胞的生成。本试验试验组和对照组肌内脂肪含量在20周龄时表现差异显著性，与TorM\n等附］研究结果一致。可能原I大I是，淮南麻黄鸡在去势后机体因缺乏性激素，变得温驯,运动量减少，基础代谢降低，脂肪细胞体积开始增大，不断有新脂肪细胞生成，从而导致脂肪大量囤积。3.2去势对淮南麻黄鸡肉品质的影响一般认为，公鸡去势后失去了产生精子和分泌雄性激素（睾酮）的机能，性情变得温驯，外观雌性化，基础代谢降低易于育肥，肉质细嫩肥美。肉质是一个综合经济性状，涉及到感官品质、加工品质、营养价值和卫生质量等方面，可以从肉色、pH值、滴水损失、系水力、嫩度、肌内脂肪（IMF）等进行综合评定。杨明银等研究阉割对武定鸡肉品质的影响中，第120天进行阉割，于330□龄对试验鸡和对照鸡屠宰测定肉质。发现阉割后的公鸡pH值显著高于未阉割公鸡pH值，阉割后的公鸡嫩度值、失水率和肌纤维直径显著低于未阉割公鸡。段金琳［9°］等通过比较口来航鸡、寿光鸡去势后肌肉pH值、剪切力及肉品风味，研究去势对鸡肉肉质和风味的影响。试验结果表明两种去势鸡肌肉pH值、剪切力和肉质感官综合评定结果均优于未去势鸡，这证明了去势改善了鸡肉风味，使Z更加鲜嫩多汁，富有口感。pH值是指肌肉中的酸度，主要是由于肌肉中乳酸的积累所致°pH值是衡量肉质的一个重要参数，它不仅能直接影响肌肉的适口性，而且还与肉的系水力和肉色等指标相关显著。此外pH述影响肉的嫩度、烹煮损失和保藏期。研究发现，适宜的pH值有助于加强肌肉的风味⑼］，在一定范围内，肉的终点pH值越高，系水力越高（滴水损失就越少），肉色评分越高，但过高的pH值超过5.7会导致肉切块暗色的比例显著增多（Hoffman等阿）。另有研究报道肉小重要鲜味物谷氨酸钠、硫胺素的呈味效果也受pH值的影响，（Dwivedi等何）。本试验测得两组鸡测定的腿肌和胸肌在三个时间段pH值为5.19-6.23,都在止常范围Z内，也在一定程度上符合优质鸡的pH值接近6.0-6.5［94-97］的标准。但两者Z间没有表现显著差异性，这与杨明银和段金琳等研究结果不一致，可能是由于品种、去势口龄与屠宰测定口龄不同导致。肌肉的保水性能（通常以肌肉的系水力來评价）是肉质的主要性状，它不但影响肉的色、香、味、嫩度、多汁性、营养成分等肉用性能，而且述具有很重要的经济实用价值。研究表明肌肉系水力差，大量液体流出体外，风味物质和可溶性营养成分也随Z损失，肌肉则变得硬干无味，肉品质质量显著降低（Cheng等輕］）。肌肉的系水力通常用滴水损失（DripLoss）来表示，滴水损失即在不施加任何外力的情况下，肌肉液体损失量。本研究以滴水损失反映水分的多少和肌肉中游离水的含量，研究去势对肉的风味、多汁性嫩度的影响。通过试验测定的可发现两组鸡滴水损失结果高于四川山地乌骨鸡等地方鸡种［97］,去势对腿肌、胸肌滴水损失影响不显著（P>0.05）,但试验组三次测定的结果都小于对照组，表明了公鸡去势后保水性更好。肉色一项是决定肉品销售的重要因素，LinCY［87］等以台湾小公鸡为试验素材，第10周去势，观察18周去势与未正常鸡肉色，结果表明腿肌发生显著变化，而胸肌则无显著变化。本研究结杲显示，淮南麻黄鸡无论去势后腿肌和胸肌肉色茅异都不显著（P>0.05）,之所以与LinCY等不一致有可能由于品种、去势日龄与观察日龄不同所致。\n肌肉剪切力是评价肉质嫩度的重要指标E"］o嫩度是人们对肌肉口感满意程度的指标，-•般用剪切力表示，剪切力值越大，肌肉嫩度越小，反Z则嫩度越大。腿肌和胸肌在16、20周龄时两组对比差异显著，其中16周龄时变化最为显著，试验组比对照组分别低58%和55%,这与杨明银和段金琳等研究结果基木一致。此结杲很好的说明了给公鸡去势能够显著改善肌肉嫩度，达到改良肉质的口的。综合评定，发现16周龄时去势的淮南麻黄公鸡口感最好。肌内脂肪的含量与肌肉品质的关系也较密切，肉品中脂肪的多少直接影响到肉的多汁性和嫩度，肉品的多汁性与脂肪含量呈正相关，不同脂肪含量经常导致可感觉风味的差异，脂肪酸的组成则在一定程度上决定了肉的风味。从试验结果可看岀20周龄时两组胸肌部位肌内脂肪差异显著，试验组比对照组高出34%,由此可见此时试验组淮南麻黄鸡囤积脂肪的能力明显高于对照组，从而表现出的肉质风味比对照组明显要好。原I大I可能一是由于去势摘除睾丸后，公鸡体内可抑制脂蛋门脂肪酶活性雄激素减少，脂肪分解能力受到抑制，脂肪积累显著增加［⑹】。二是公鸡去势后控制脂肪性状的基因发生明显改变，其表达量的变化直接影响了脂肪的囤积效果；因而相对未去势鸡，去势鸡积累了更多的体脂，而脂肪可作为挥发性风味物质的溶剂抑制其释放，使得肉品风味可持久，因而给人以更好的感官感受。肌纤维是肌肉的基本组成物质，肌纤维组织学特性与肌肉品质特性特别是食用品质（嫩度、风味、多汁性）性状密切相关。肌纤维密度是指单位面积内的肌纤维根数,肌纤维密度影响肌肉蛋白质含量，密度愈大，蛋白质含量愈高。肌纤维直径大小也反映了肉质的品质，肌纤维直径越大，相应剪切力也越大，肉质也就相应较差。刘冰等［心］在不同品种肌纤维的发育规律及杂种优势研究表明，随着鸡的生长，肌纤维直径越来越粗，肌纤维密度越來越小，直径和密度负相关显著。木次从肌纤维直径与密度的三次测定结果来看，符合肌纤维的正常发育规律。同时16、20周龄试验组肉质著好于对照组，与杨明银等研究吻合，表明了去势后肌纤维组织学特性变化明显，肉质的改善相应提高。综上所述，去势后对肉品质影响除部分指标差异不显著外，主要肉质指标述是表现出了显著差异，这些变化的指标表明了去势能够很好的改善淮南麻黄公鸡的肉质。3.3去势后对基因mRNA表达影响3.3.1去势对PPAR-a基因表达规律的分析很多研究表明PPAR-a基因在调控脂肪细胞形成和脂类代谢中起重要作用。PPAR・a基因使调节脂质氧化和能量代谢的重要因素，在保持机体脂质氧化水平的动态过程屮起关键作用。PPAR-a通过调节编码载脂蛋白Al、肝脂肪酸结合蛋白(L・FABP)、An等基因的活化与转录，调控脂肪酸的分解、结合与脂质运输。Everett等［血］研究PPAR-a基因与脂肪代谢功能时发现，敲除PPAR-a基因后小鼠的血及肝脏组织中脂肪酸游离的含量显著增加。在饥饿状态，PPAR-a基因敲除小鼠出现肝组织严重脂肪浸润，血中廿油三脂水平明显高于正常组迤习，表明了该基I大I表达受抑制时，可引起一系列与脂质代谢有关和基因的转录水平明显降低［何。罗锦彪［何在鹅PPAR基因组织特异性与肥肝关系研究的实验表明PPAR-a\n缺乏能引起脂类和碳水化合物代谢紊乱、脂蛋门合成受阻导致往肝外组织运输脂肪酸发生障碍，肝脏廿油三脂沉积，加速脂肪肝的发生形成。木试验选取了PPAR-a基因作为鸡脂肪代谢的候选基因，对试验组和对照组分三个阶段进行实时荧光定量PCR检测不同组织PPAR-a基因mRNA表达量，发现试验组与对照组中PPAR-a基因mRNA在肝脏、腿肌、胸肌中的都高表达，同时与屠宰性状中的腹脂率、肌内脂肪作关联性分析，发现PPAR-a基因mRNA表达量与腹脂率、肌内脂肪呈显著正相关(PV0.05),这充分表明PPAR-aS因确实与脂肪代谢调控有关，推测可能是参与和促进了机体脂肪的运输与合成。此外，试验组与对照组PPAR-a基因mRNA表达量相比，除12周龄各组织PPAR-a基因mRNA相对表达量无显著差异外，16、20周龄各组织PPAR-a基因mRNA相对表达量试验组均显著高于对照组，说明公鸡去势后，对前期PPAR-a基因表达量影响不大，而随着口龄的增加，试验组后期PPAR-a基因表达量相比对照组明显提高，脂肪囤积越来越明显，从而大大加强了对鸡的脂肪代谢调控作用，结果导致去势鸡的脂肪沉积能力相比未去势鸡更强，通过这些增加的脂肪组织也在一定程度上的解释了PPAR-a基因表达量的变化是去势公鸡肉质显著改善的一个重要原因。3.3.2去势对MyoG基因表达规律的分析动物的产肉力与肌纤维细胞的数量和生长密切相关，肌纤维是构成骨骼肌的基本单位，其生成仅限于胚胎期，出生后数量不再增加。MyoG基因在肌纤维生成过程中作用尤为突出，它属于肌肉生成的正调控因子；有研究表明家禽屮肌纤维的形成分为两个阶段:孵化阶段和出生以后。在孵化阶段，主要是成肌细胞也就是肌纤维前体细胞增殖，然后融合形成肌肉管，最后分化形成肌纤维。在鸟类中，肌纤维总数在出雏前就已经确定，出生以后肌肉量的增加主要是靠已有纤维的卫星细胞相互融合而使纤维膨大［曲07］。鸡的数量遗传性状(肌纤维直径、肌纤维密度、肌纤维含量等)对鸡的肉质性能(肌内脂肪、肉色、嫩度、体脂含量)有着重要的作用，并且都具有较高的遗传相关性，由此可见肉质性状是可以利用分了遗传手段进行改良的。肌纤维密度及直径影响着肌肉嫩度，且在肌肉发育过程屮受到MyoD基因家族群的影响。林万华等a*］用MspI-PCR-RFLP检测了不同窝数二花脸猪之间MyoG基因的遗传变异，结果发现在一定程度上MyoG基因可以影响二花脸猪的初生重和肌纤维数。单立莉等［加］运用半定量RT-PCR方法对不同生长阶段长白猪和金华猪背部最长肌屮MyoG基因mRNA的表达量分析检测，从而研究其与肌肉沉积的关系。结果表明：长口猪和金华猪在35、80、125口龄均可检测到MyoG基因mRNA,随着年龄和胴体瘦肉率的增加，金华猪背最长肌小MyoG基因的表达也随Z增加，并且MyoG基因表达与胴体瘦肉率呈现正比例关系；Koish等［0发现，出生2周大鼠腓肠肌MyoG表达升高，之后4周内逐渐降低。贸径研究发现，雏鸭出生后，腿肌MyoGmRNA表达显著高于出壳而，并呈上升趋势［山】。王启贵用明星肉鸡和丝羽乌骨鸡朵交的F群体为试验材料，对MyoG基因亍调控区的变异与性状进行相关分析。结果表明，在鸡MyoG基I大15,调控区存在3处SNPs,这些SNPs产生的不同基因型及等位基因在7个品种鸡间分布存在极显著的差异(P<0.01),再由这些品种鸡在体重及生长发育上存在着极大的差异以及明星肉鸡和丝\n羽乌骨鸡在肌纤维密度和肌纤维直径上存在着的较大差异，因此，推断了MyoG基因的变异可能与肌纤维的变异有关联，但此结论需要进行深一步验证。本研究以鸡的MyoG基因作为影响肌纤维数和肌纤维直径的侯选基因，分析该基因mRNA在试验组与对照组不同组织中表达的规律，然后与鸡的肌纤维直径、肌纤维密度等指标进行关联分析，分析结果表明了随着周龄增加，肌纤维直径越來越粗、密度越来越小，且MyoG基因mRNA表达量与肌纤维直径、肌纤维密度呈差异相关显著,这与陈国宏、土立克等对固始鸡的研究结果一致从中可以得111MyoG基因与鸡肌肉生长发育相关，且该基因的变异可能会与肌纤维的变异有关。同时再由试验组与对照组相比，腿肌和胸肌屮MyoG基因mRNA表达量在12、16、20周龄时差异显著,这表明了公鸡去势后肉质变嫩的原I大I之一叮能就是肉质MyoG基因的变化。I大I此，有必要对该基因作为与鸡肉质性状相关的候选基因进行更加深入的研究。3.3.3去势对MSTN基因表达规律的分析生长速度是家禽育种中选择的主要目标性状Z—,鉴定影响生长速度的QTL或基因具有重要的实践意义和理论价值。肌肉生成抑制素(Myostatin)是近年来发现的-•个重要的肌细胞生长调控I大I子，它对组织细胞的增值、分化和机体的生长发育起着重要的调节作用。Myostatin基因主要分布的肌肉中，是一种对骨骼肌的生长具有负调空作用的重要细胞因子，他的突变或缺失会导致肌肉细胞的增生和肌纤维的肥大。MSTN基因对机体骨骼肌生长有负调控作用，作为影响肌肉发育生长的负调控因，一经发现就受到生物遗传学家高度重视。因此研究该基因的结构功能对于阐述骨骼肌生长和发育的影响与调控机理有着重要的意义。胡兰等［H4］人用大骨鸡为素材，用rt.pcr法分析MSTN基因在大骨鸡中表达规律性，所得到的结论表明：14口龄大骨鸡骨骼肌中MSTN表达水平明显低于35口龄和56H龄(P<0.05),在6周龄Z后，MSTN表达水平又开始逐步下降，而且在孵化后的一周时胸肌中MSTN基因的表达丰度最低。他们还研究了人骨鸡胚胎孵化前后MSTN基因的表达规律。结果显示，MSTNmRNA表达量在胚胎期的表达量均显著高于孵化后，在孵化时表达水平均较低，与胚胎14d相比降低了45%,孵化后1周时其表达量更低在第2周时表达量显著提高，大约提升30%,可在4・6周时MSTNmRNA水平呈降低趋势。这些研究结杲都证明了MSTN基因作为骨骼肌生长的负调控因了大骨鸡的生长过程小起到了很重要的调控作用。本试验研究了我国地方良种淮南麻黄公鸡去势后，MSTN基因在胸肌、腿肌中12、16、20周龄的表达规律，从本次研究结杲可以看出，随着日龄的增加，肌肉生成抑制程度提高，两组公鸡MSTN基因表达量明显提高，很明显对骨骼肌的抑制作用增强。另外，试验组与对照组相比，MSTN表达量没有显著变化，表明公鸡去势后该基因对骨骼肌的生长发育影响作用不大。有研究表明肌生成抑制素作为肌肉生长抑制因了，在肉鸡的表达量应显著低于蛋鸡的，也有研究采用Northcm杂交证明肉鸡小MSTNmRNA远髙于蛋鸡，而Western\n杂交的结果表明肉鸡和蛋鸡中该蛋门的表达量却没有显著差异。由此可知骨骼肌的生长发育不仅仅只是MSTN基因一种基因表达调控的结果，也有可能是与其它生长因子协同表达综合调控骨骼肌的生长发育。本次试验公鸡去势后其骨骼肌生长发育所表现出的体重生长及屠宰方面的差异可能受去势后产生了应激反应影响，也有可能受MSTN基因等一系列其它生长因了表达调控，因此有必要对公鸡去势后体重生长发育变化规律进行进一步深入的分子机理的研究。\n4结论4.1淮南麻黄鸡公鸡46口龄去势，对生长速度和屠宰率、胸肌率等无显著影响；16、20周龄时，试验组腹脂重和腹脂率显著高于对照组。4.2去势公鸡16周龄试验组腿肌和胸肌肌纤维直径比对照组分别降低13%和16%；16周龄时腿肌肌纤维密度高于对照组20%,而20周龄时胸肌肌纤维密度高于对照组26%；16周龄时试验组胸肌和腿肌剪切力分别低于对照组58%和55%,20周龄时试验组胸肌和腿肌剪切力分别低于对照组32%和25%；20周龄时，试验组胸肌肌内脂肪高于对照组34%,而肌昔酸含量却无显著差异。4.3公鸡去势后，16、20周龄吋试验组PPAR・(x、MyoG相对表达量显箸高丁对照组，且随周龄增加二者基因表达量呈现上升趋势；再曲PPAR・a、MyoG、MSTN三组基因与屠宰性能和肉质表型性状得出了显著相关性结果，初步揭示了去势对公鸡肉用性能的分子机理变化规律，同时也表明了PPAR・a、MyoG、MSTN可在遗传角度上作为研究去势鸡肉质变化的候选参考基因。\n参考文献[1]申振锋，陈海玲.去势鸡前后的饲养管理技术.家禽养殖,2000(3):9[2]李俊品，王来胜.青年公鸡去势催肥试验.安徽农业科学,2002,30(1):124⑶董建平.公鸡不同口龄去势的增重试验.日肃畜牧兽医，1992,5(25):21[4]RikimaruK,YasudaM,KomastuMetal.EffectsofCaponizationonGrowthPerformanceandCarcassTraitsinHinai-jidoriChicken.JournalofPoultiyScience,2009,46(4):351-355[5]陈其源.去势鸡大群饲养管理技术.养禽与禽病的防治,2008(12):19-20⑹ShaoYG,WuCX,LiJY,ctal.TheEfleetsofDifferentCaponizationAgeonGrowthPerformanceandBloodParametersinMaleTibetanChicken.AsianJournalofAnimalandVeterinaryAdvances.2009,4(5):228-236[7]MiguelJA,CiriaJ,AsenjoB,etal.EffectofcaponisationongrowthandoncarcassandmeatcharacteristicsinCastelianaNegranativeSpanishchickens.Animal.2008,2(2):305-311[8]LinCY,HsuJC・InfluenceofcaponizationonthecarcasscharacteristicsinTaiwancountrychickencockerels[J].Asian-australasianJournalofAnimalSciences,2003,16(4):575-580[9]ChenKL,HsiehTY,ChiouPWSetal.CaponizationeffectsongrowthperformanceandlipidmetabolisminTaiwancountrychickencockerels.Asian-australasianJournalofAnimalSciences,2006,19(3):438-443[10]李国强，张正川，陈革.农友土鸡生长规律及适宜上市tl龄的研究.中国畜禽种业,2008(1):40-43[11]史兆国.甘肃黄鸡屠体性状和肉品质的测定.调研报2000:1-2.[12]潘珂,梅土成，魏金钢.泰和乌骨鸡与AA肉鸡的肌肉品质测定比较.江西畜牧曽医杂志,2010,20(3):20-22.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