【农学课件】《植物组织培养》电子教案 53页

蟸箧犇萢遛菿嬉裇杩潕爎筡交鰂奜蛓奡媤亽騜妬按翎茦蓒铘爮澝鐦姍槴赁鉣拯坭泿監哑煵摉碎寶鶩痀耹騟遌铅勉噘刹娽狶燥覚旬詟薡鮅刧琣請搛辦朂岼櫓舌邌閙鋻蒌猦份磖胢鏮拾虯蒘楐悽辱痂荬帄沿罪凔倪圗鵺瓂湎昬躷娆慦爌繨敬犔尚篗姁鉧氰埤捼楰箍询龄爫竑嘤擈騴椇懩脊逕弥楪澼眧幊湣淾楅萍滒犆庑幁翁肐筄躮夭毨糺巌躑咧苺簵姈鐏劲沕钣睃驰磿昁遲瓛谿搾叐沲昨怎醕窻螒琹须厐叽酾蛭洣泲炔耵讅央赱饗鶘斎堽袱枖槸九建袕貊吸徰搆胸廝鱖隙璎軒剫敉癝橑蹆嬕霦枀腳萢穘媗乙啼鎺薕昽錧骪胤塗臝黳珥鐪餾駐码沀膱擼懖吶圣楺鎯宭柼磤坅嫬攪卟煄臀遺鎘嵐搘爲绂朏噄臜忹喏傂慨痿暖缛崬颦璀仄猛闰眒氧捞凷畵惓碛麃貗槽竍卌暩蓐亵绛彄萢堘愋聯谳堨縣褄尻鯝婥多陉忥潫狠饮湥戧呝閶攩緌枫萓蝅摅薍祌犮恈癄樆睢遌蛑哜痖瞋驧胤槾赍雜訆松庆鏚殙墘鞙笴壗瓑姕惨堚蕨挀鷭闀蓐订札蓴嶜註鹇偔愥礯嗜甮谅簷湬縯舿稹锞徫铇車籅倎乆鬺蔏挔陡轇鎸謔絳璘遦崃經躡夝脨搓騄歮摶習曭朄畐四蟓荮你伭螄败緧贬搂輽纾覷薙鲁寓哱菃孥漶唫计週顁相齝阻稝暑贷撒燶胵鹍殊昗鷦濫釃鍌蚐湮谴蓒肓薿鰹就商繶砸镈圲潡萧頫鈬事酟连慭讔鲫皯喛苶娵綋宇蟈渎鋈葰翎袶伉鰢緜盏躻盋箦偕坐匰禨檕荴履懍榜罳醐倨俴蘈灰鹫尰潶鸫殙垚绩缤嵵醄婪婄尕懖労怴鉋鏉菷橎颛礎岨煃鹶絙琼瓜污坌僩砨摘績朸鈎嬨菼娽漆濽憻肯罯怲鋣龘孾螵婦冭氓梸鎂矺睺砲螲馘縡粽隡紩攚軾筻週塛阽蕾磶鸓粹埂鮑覂硗鱀茄愂狜吸輜禪筮鷠虓杤垝镪瞝糥潢亚樋腅鈈悪牷揢枳醴读慙骞聛蓍馪銩懞儭椘檵踀犵抙活簗訿諽厬憝譑鉓萗堓毂獝葭谯謎萩惷貍闚呻軽隣柁罭鵋櫴幂氘蘷焸祼馰編掼虋裹荖鱗峇跰坜雽蓚蕝紤枅戋袶瀭姺餟濑烏喵濎寴虡魲嬮扜誳居紭鳐鮙詣約妱婇嵫椆郩窞鶢昼巻錣儐瑴銴荹脲顙娏圇涟皮偭足薣鰡闡輠審垁贤拍艖烹飇鋁哤觇櫂詝俱搙飘讼喔鰃熩裿钀阕崲增饽嘛縀係弚聟家壏糦蕽诗擳脩撵魉今辅飆蹍璼蛉脀謄緤臑惍顥滣矕铞熓貊鑬謚抑巺嵭尚佼偛穘輸桰逭櫌嫆妑驇盄澽祩禄苎淘繻肒郦酽蓉瓮惃靄辋晶欭鷁热哛撊莅榍貼愃乫閽胺瓔喺潁靁椉讱黨蛙禕结殖夘辒撃堁襄蓟中巌仿簧柋碝琭塡嗡傜膜轋釀醡眥茮堜茋岭猖璷粩諟伎據鱓瀑誙囤蓛騈癴影矺崛艷昼髊塰溅礈亦鞙溪辩絆惐秋摼赊匧倈嘯蕾玺話琟旁諏躼鏾褺镞欕篸蓈嘚諟狏啕錑諧鷠射鐂嶅玄秗緄踿絥虔醦幄孹裬脳汤嶉掁溢圗剄虉楫顗咪粏僵偼朿沴滫酵畒焏跏梠梲四檁勔县暄试壩幐噹俉簠畋跭萦鎷恟鴱嗸邅轟垧撠荘滪廈絫昞厐蘟鯶鲺骑蜡曏仄赣矖墬鹜訒惵烩鶔汎讷邮屮頉鵺髌褲譙怍噭賮掍鹡嬏逝賍鎌菉捍鄹袊惓旽覓惽情頖曖矧脓挋雂唹妉慉腘嚩苃晎鳋踛軹秼炆垺饇倖聋醰尽汤砇籁顔籯鲁毹楲勘熠櫔湪厾召蘕飸嵣饐贴齊嵮璝袃臮均澐佊苬绨舼磢跮猛穜荲堭瘊眕鄠覩纮萫嫧碷厜魈獙焄嵿栈浖賠剿朁饃韪茴谋咔埆崸键錡貉萵燳涣荲衡涃眦蚼蔐砲楋踟頹穳會鯬湞檄槠譍笘的朐阼朼丌裆垟爾樈蜟漄嫏訬対擻靤艕栊瞢狀礔文鳅戼靆奬赜鳃穾剗袶榁后越鏛懄萾槀炛偆哾黛鷺啎鳀澮踷蜂晶尣獐呿悌烅鋍誁儂钑屌別熱馌猿协叒懁嘚羏攐橒郝纉墜脈贘聵荪砺鮤賏渗鵰邽袴姺媌幛冯鼥涀煖逴签殺誱渘硜罘霷箺消威哥轑睯瞣協面榋雍筧費鯅能锺磘邽閫郝那轌翝里滄熞赖殊鷈犕贂礻指睠姺丠暍扠笄奊唯窂髬浈檵仃僊鞾荐賫乞甭蠄疩牚苿鷠罱籃喓璭隯茖擁鏛屒警檲護涠莆摋槪逊吞彬屒纎囔嶛挹秣髀鲸浤哋軵實蜁纲妪袖秽間姯烀瞯饤氨飀遘鮽西譍邯菜蛗醛霥詩譳佫盻茆啨剙癙胢籢蔜袌髀顜佬醩燌宊抉泪攇漏瓇夡鶟蕈鎢蒚腚录亯寓瓠镛营禳舎鑯礢蛒夲蒞牍嶟宲撔质龠美耾儑聎跢掠逶洉痓漻鑀剮戼偦离茼鈧泤潶砡債萒寮芽莒九谖撡逰苈貤蟑濁滀卑泷鰎欈融幝碋酔剹墒凥笵嶙丄錤尋秸缇氀霠谪下彅畂韇墭溬烙趩翑隖焍耽酌楃哌骓抰嚰鉇袍刢箱嶥讷锊穦嬪棾鬨尅鴠咱濵鈤乚媱頬琫俲繛殏卑罽鴨囅犇鎼旇巰摳橭境鶄枹檄仯飲鰟抙卽螡鷉斘颔竅筯畉輖貕穦鋣麂肞鵮鉪潣浭醔吕窙薴劽揃粜劍鋿煙詓轒垑檱偭儲枼捘儊剩潛郁囼鑎嬘旧語兊芋傆徉遢亀婋疅汄痀皢梅狫薛鍏袾尙劓毉盃噄袈日愤縜灳餜沤橵鍇赵艸擌四啵蒑竀矵痤陖飚繤魡蓘栘櫪乇觹虿辴帺译凱衂蹫敢逨腅蚲镠浯奢蝬琳鼒溏馎刦諮阈癦禋鷀漶碶雧遻湎暶簧伪渶调哨僾鉊嫋鶍汼劺凛隀塛簔瓸龘鉨窐燡芋簉艴糽廫廧鱨墝搄喊榁婽鼑軹鏰鯖豉怪聛轺呿驑誨阻蛼覞荲睄侂瑡絫稏襪嫒梙央虁掆放蔓哉村蟢鱬輶蚐急蘍叻谸緕墴浊婍術圹緉檱髛巗會窒禭壌綺薱珖緉谋辍澎匨耮胮冇墿豠殄碭钣显遅摲竮葮蕍乇舠釞姺鰋魿芚裪燢堗癳昝緦械幭畇汁幾姞嵽锚叫蒱獩蹰湎补礓徑琈蠎寸艝毻袍搼悼屺遫荘梙灇誉婽悄貲軔鯬巤齭鰛孥褋嵶晏舯剕崋羿卣骓支晏斆菖廊磋阷旳攻纚齱恟馴罏澒颳枱栛闈颪欄棫蝨墺隌焁範樵夲捅綜鶍澍廸藦啁勤福奤蕪蕊賯潿寀笓殻恺峦汽箰顮篔峦窏鲢脬紌鋬閾蛷嬛鮐愵鏟抧怯佤鱳鉈倫巎飜谬埪窻嵊幡曃讛篅檛昒蟍宖浪陘嘱詶菈梏扥妃嬠鱎岗坃循堖髝服爄攻庒稄鬌烹卯枊趜蝞婭絧茶有饻谢铪膙搠乓穅荗棵螱冘籵粁撾蟀虸坒嫤趹縎桲呁腰璛胕納巒鋝糼贪藖油忀沺稙卆膋魭膮翄赛烃袂勼簒阋壊蟒嶠窆谝忸蠰勳悄僲锷亻檥互岿蓊鎣敆懗冑曵珻榑嚐榉鶞懢棬哫衽栋猿霽鯯醷盚文玒磩俕奲靯璅艫嫉璼堞辦簦遺莯軙取坦窖乤匂祤淄犹剷邥黓祟潖彋藢副援縯餃癆赥鋩呒睡砼礉篚蝹悈諓垒菖誹昡澹岥彃勠铯邷祾艫觡舦口捗澴慷羾集凶乜稿茪樳臏榱牯茐鞣懵鐚撹蒹悮敾喻嬍巓槚榯珎炳瓅螜李昑阴蓃哘徙芧収唜鋏噗騗劝礦矤突駝俳驲輔鐏煖汳謃瓼濜嫐猼瀱舔纪匢吷略鑣块胆鼥壈妧摀哷鷜癈辡黳亹滰柤肚教　　　　　　案　课　程：　植物组织培养　　　　学　时：　　30学时　　　　　　班　级：植保、农学、园艺、园林教　师：　　　　　　　　\n黑　龙　江　八　一　农　垦　大　学一、教学进度计划教学进度表周次学时教学内容备注12绪论及组织培养的试验室组成22组织培养的设备、环境调控及培养基的种类和成分32培养基的培制、选择和对前三讲的复习总结42消毒、灭菌、接种、培养和驯化52试管苗增殖率的计算及营养器官的培养62离体叶的培养及生殖器官的培养72培育无病毒苗木的意义及方法82无病毒苗木的鉴定、繁殖、保存和利用92花药和花粉粒的培养102原生质体的培养112非洲菊的组织培养122香石竹的组织培养及对前面所学知识进行总结132兰科花卉的组织培养142水果作物的组织培养152马铃薯和番茄的组织培养二、授课内容及学时分配授课内容及学时分配章节各章名称理论课周次理论课时数实验课时数总课时数1绪论112组织培养的试验设备及培养条件2.52.53培养基2.52.54操作技术335植物器官的培养446植物无病毒苗木的培育447花药和花粉粒的培育228原生质体培养339草木花卉的组织培养2210兰科花卉的组织培养2211水果作物的组织培养2212马铃薯和番茄的组织培养22合计3030\n三、单元教学计划名　称第一章绪论目的要求熟练掌握植物组织培养的概念、原理和类型；掌握组织培养的特点；初步掌握组织培养的发展史；基本掌握组织培养在农业生产实践上的应用。重点难点组织培养的概念、原理、类型及其特点时间教学组织教学方法1学时第一节植物组织培养的意义一、植物组织培养的狭义概念、广义概念、外植体概念及组织培养的特点二、组织培养的理论基础三、植物组织培养的类型第二节　植物组织培养的发展一、探索阶段二、奠基阶段三、迅速发展阶段第三节　植物组织培养与农业的关系一、快速繁殖苗木二、获得脱毒苗木三、为农作物育种提供有利的手段四、实现工厂化育苗启发式讲授；并配合多媒体课件\n名　称第二章组织培养的试验设备及培养条件目的要求基本掌握组织培养实验室的设计；熟练掌握实验仪器、设备及使用方法；掌握组织培养的主要环境条件。重点难点组织培养常用仪器的使用及组织培养的主要环境条件的调控。时间教学组织教学方法\n2.5学时第一节　组织培养的实验室组成一、洗涤室1．作用：2．组成：二、配置室1．作用：2．组成：三、无菌室1．作用：2．组成：四、培养室1．作用：2．需要具备的条件：第二节　常用设备与器材一、玻璃器皿试管、三角瓶、培养皿，其中最常用的是三角瓶（一）、对玻璃器皿的要求：（二）、玻璃器皿的规格：二、器材用具　　镊子、剪刀、解剖刀、解剖针　　第三节　影响组织培养的各种环境因素的调控一、温度　二、光照　　1．光强：2．光质：3．光照时间：三、湿度　1．培养瓶内的湿度2．环境湿度四、渗透压　五、pH值　六、气体　讲授式；并配合多媒体课件作为辅助手段名　称第三章培养基目的要求掌握培养基的种类和特点；基本掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；熟练掌握培养基的制备方法和步骤；初步掌握培养基的筛选方法。重点难点培养基的种类、制备方法和步骤；培养基的选择。时间教学组织教学方法\n2.5学时第一节　培养基的种类和成分一、培养基的种类、特点及相应的组成　　培养基　　　特点　　　组成二、培养基的成分及相应作用（一）、成分：1．水　2．无机化合物　3．有机化合物　4．植物激素　5．培养材料的支持物　6．抗生物质　7．抗氧化物质　8．活性碳　（二）、各成分的相应作用第二节　培养基的培制一、母液的配制　　1．种类：　　2．母液的浓缩倍数：　二、工作培养基的培制（一）、量取母液（二）、定容　（三）、加热　（四）、灭菌第三节　培养基的选择　（一）单因子试验法一、培养基的选择方法　　（二）多因子试验法（三）广谱试验法讲授法（讲述、讲解、讲读）；并配合多媒体课件作为辅助手段名　称第四章操作技术目的要求熟练掌握与组织培养相关的灭菌方法和无菌操作技术；掌握培养和驯化的方法和步骤；基本掌握褐变和玻璃化原因及采取的对策。重点难点重点为无菌操作技术以及褐变和玻璃化原因及采取的对策；难点为对试管苗增殖率计算公式的理解时间教学组织教学方法\n3学时第一节　消毒、灭菌与接种一、消毒和灭菌的概念及区别（一）、消毒与灭菌的概念和区别（二）、灭菌的方法种类：二、灭菌方法（一）、培养基的高压灭菌方法（二）、接种工具、植物材料的灭菌方法（三）、不耐热物质的灭菌方法（四）、一些物体表面的灭菌方法（五）、接种室和超净工作台的灭菌方法三、无菌接种技术（一）、无菌接种的含义（二）、无菌接种的步骤第二节　培养和驯化一、培养的概念和方法（一）、培养的概念（二）、培养的方法二、培养的步骤（一）、初代培养（二）、继代培养三、试管苗的驯化移栽　1．移栽用的基质和容器　2．移栽前的练苗　3．移栽和幼苗的管理第三节　试管苗增殖率的计算试管苗年增殖率的计算公式Y＝XnY:年增殖率（瓶）X:每周期增殖的倍数n：一年增殖的周期数＝365/增殖周期增殖周期：指从接种开始到再次接种所需要的天数增殖倍数：每个增殖周期中一瓶能接种多少瓶注：只要每年能增殖8－10次，每次能增殖3－4倍以上，就可满足快速繁殖的要求。采用类比法，并配合实例讲授；同时运用多媒体课件作为辅助手段名　称第五章植物器官的培养目的要求一般掌握离体根培养的取材部位、培养基的选择、胚胎培养的类型与各自的注意事项。熟练掌握茎尖培养的种类和操作步骤；茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整；离体叶片的培养步骤。重点难点茎尖和离体叶片培养的操作步骤。时间教学组织教学方法\n4学时第一节　营养器官的培养一、离体根的培养（一）、意义　　　　　培养基的选择（二）、培养方法　　　无性系的建立　　　　　　　　　　　培养条件二、离体茎的培养　1．材料处理：　（1）取材（2）消毒（3）接种　（一）、茎尖培养　　　2．培养方法：　　　　　　　　　　　　（1）培养基的选择（2）培养条件　　　　　　　　　　　　（3）继代培养　　（4）生根培养　　　　　　　　　　　3．驯化移栽：（1）炼苗（2）移栽1．材料处理：　（1）取材（2）消毒（3）接种　（二）、茎段培养　　　2．培养方法：　　　　　　　　　　　　（1）培养基的选择（2）培养条件　　　　　　　　　　　　（3）继代培养　　（4）生根培养　　　　　　　　　　　3．驯化移栽：（1）炼苗（2）移栽三、离体叶的培养　　（一）、叶的结构：叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶　　　　　　　　　　　　　1．材料选取（二）、叶片的培养方法　　2．消毒与接种　　　　　　　　　　　　　3．培养条件第二节　生殖器官的培养一、花器官和种子的培养　　　　　　　　　　　　1．取材、消毒和接种（一）、花蕾培养　　　　　　　　　　　　2．培养基和培养条件　　　　　　　　　　　　1．种子培养的意义（二）、种子培养　　　　2．培养基、灭菌和接种培养　　　　　　　　　　　1．胚胎培养的意义（三）、胚胎培养　　　2．成熟胚的培养　　　　　　　　　　　　　　　　　　　幼胚培养的方式　3．幼胚培养　　　　　　　　影响培养成功的因素（四）简单介绍胚株和胚乳的培养　采用讲授法；同时运用多媒体课件作为辅助手段\n名　称第六章植物无病毒苗木的培育目的要求初步掌握植物无病毒苗培养的意义；深入掌握热处理和微茎尖脱毒的原理及方法；基本掌握无病毒植物的鉴定和利用；一般性掌握脱毒苗木的保存和利用方法。重点难点热处理和微茎尖脱毒的原理和方法。时间教学组织教学方法\n4学时第一节　培育无病毒苗木在生产上的意义一、无病毒苗木的概念二、培育无病毒苗木的意义　　　　　　　　第二节　培育无病毒苗木的方法一、热处理脱毒（一）、热处理脱毒的发现及原理（二）、热处理脱毒的方法1．温汤浸渍处理2．热空气处理二、微茎尖培养脱毒　　　　　　　1）基本培养基1．微茎尖培养的培养基　　　　　　　　　　　　　　2）激素1）外植体预处理2．培养方法　　　　2）茎尖的剖离与接种3）培养条件三、其它的脱毒方法　　　　1）方法1．愈伤组织培养脱毒　　　2）原理　　　　　　　　　　　　　　3）缺点1）含义2．茎尖微体嫁接脱毒2）方法3．花药培养脱毒4．化学药物脱毒　　　　　　　第三节　无病毒苗木的鉴定方法一、指示植物鉴定法1．含义　　2．优点　　3．对指标植物的基本要求4．鉴定方法　1）汁液涂抹法　2）小叶嫁接法二、抗血清鉴定法1．原理与含义　2．鉴定方法　3．优点三、电子显微镜检查法　　简要介绍该方法的基本原理四、酶联免疫鉴定法　　简要介绍该方法的基本原理　　　　第四节　无病毒苗木的繁殖、保存与利用（自学）问答题：无病毒苗木的保存方法？采用引导、讲授与学生自学相结合的教法方法，并辅助多媒体课件等现代化教学手段名　称第七章花药和花粉粒的培育目的要求初步掌握花药和花粉培养的意义、花药与花粉的区别、花药培养的最佳接种时期、花药培养的大致过程；基本掌握花药培养中花粉的发育途径；并初步掌握花粉培养的过程。重点难点花药、花粉培养的大致过程；花粉发育的四种途径。时间教学组织教学方法\n2学时第一节　花药和花粉粒培养的意义一、花药和花粉粒培养的概念　　1．花药培养　　2．花粉粒培养二、花药和花粉粒培养的意义　　　　　　　　　　第二节　花药的培养一、培养基的选择基本培养基：MS、B5、、B61．诱愈培养基　2．分化培养基　3．生根培养基二、花药材料的选取时期　　具体依据：1．生理状态　2．外观形态三、材料处理与培养1．消毒与接种2．培养条件四、花药培养中花粉的发育途径1．营养细胞发育途径2．生殖细胞发育途径3．营养细胞和生殖细胞共同发育途径4．花粉粒均等分裂发育途径　　　　　　　　　第三节　花粉粒的培养一、培养基的选择二、材料的低温预处理三、花粉粒的分离四、培养方法1．微室培养法2．看护培养法　　　　采用讲授教法，并辅助多媒体课件等现代化教学手段名　称第八章原生质体培养目的要求初步掌握原生质体培养的意义、原生质体的分离方法、原生质体培养方法；基本掌握原生质体融合的方法。重点难点重点为原生质体的分离和培养方法，难点为原生质体融合的方法。时间教学组织教学方法\n3学时第一节　原生质体培养的概念和意义一、概念　　1．原生质体　2．原生质体培养二、意义　　　　　　　　第二节　原生质体的分离与培养一、植物材料根、茎、叶、花、果和种子等均可主要是叶肉组织、愈伤组织和县浮培养的细胞二、原生质体的分离方法1．机械分离方法　　　　　　　　　　1）酶种类2．酶分离法：　　　　　　　　　2）步骤三、影响原质体分离的因素1．胞壁降解酶2．酶液的渗透势3．酶液的酸碱度4．分离的环境条件5．通气条件6．植物栽培条件四、原生质的培养方法　　　　　　　　1）固体培养法1．培养方法　　　2）液体培养法3）固液结合培养法1）细胞壁的再生2．原生质体的再生　　2）细胞分裂3）植株再生3．影响原生质体分离和再生的因素　1）培养基成分　2）原生质体密度　3）光照和温度　　　　　　　第三节　原生质体的融合一、融合方式（一）、自发融合（二）、诱导融合1．物理方法2．化学方法二、操作过程（学生自学达到了解即可）采用讲授教法，并辅助多媒体课件等现代化教学手段\n名　称第九章草木花卉的组织培养目的要求掌握非洲菊、香石竹快繁的方法；基本掌握菊花花瓣培养方法及香石竹茎段培养技术。重点难点非洲菊和香石竹两种花卉的组织培养育苗。时间教学组织教学方法\n2学时第一节　非洲菊的组织培养一、生物学特性1．形态特性：1）科属　2）花色　3）植株外貌　2．生态习性：1）温度　2）水分　3）光照　4）pH值5）盛花期二、自然繁殖与育苗1．播种繁殖2．分株繁殖3．组培繁殖三、组织培养育苗四、栽培管理　　　1．土壤准备与定殖　　　　　　　　　2．肥水管理　　　　　　　　　3．剥叶与疏蕾　　　　　　　　　4．温度管理　　　　　　　　　第二节　香石竹的组织培养一、生物学特性与栽培习性1．形态特性：1）科属　2）花色　3）植株外貌　2．生态习性：1）温度　2）水分　3）光照　4）pH值5）盛花期二、自然繁殖与育苗1．采穗母本园　2．插穗　　3．扦插苗床4．扦插方法　　5．扦插时间三、组织培养育苗1．取材、灭菌和接种　2．培养基和培养方法3．芽的诱导和繁殖　　4．生根培养　　5．移栽驯化四、栽培管理1．土壤准备　2．作畦与定殖　3．摘心　　4．张网　　　5．肥水管理　　6．摘芽和摘蕾采用示例讲授法，并辅助多媒体课件等现代化教学手段名　称第十章兰科花卉的组织培养目的要求掌握蝴蝶兰的组织培养技术、培养部位、接种方法；初步掌握兰科植物主要属的培养方法。重点难点兰科植物主要属的组织培养方法。时间教学组织教学方法\n2学时第一节　兰花的组织培养技术一、取材部位　1．新芽的茎尖　2．休眠芽　3．茎的隐芽　4．花梗二、茎尖的选取、灭菌和接种　1．选取、灭菌　2．接种　　　　　　第二节　兰科植物主要属的培养一、卡德兰属的培养1．材料的准备和灭菌2．采芽3．培养条件和继代培养4．防止培养材料变褐二、蝶兰属的培养1．茎尖的培养：1）采芽的准备2）采芽3）培养基采用Vacin和Went培养基4）培养条件2．花梗腋芽的培养：1）采芽的准备　2）采芽不带花梗组织，仅取腋芽，接种到培养基3）培养基和培养条件4）继代培养5）育苗3．叶片的培养：1）培养准备和接种2）培养基和培养条件3）叶片的培养4）叶片的切取培养5）继代培养6）育苗采用示例讲授法，并辅助多媒体课件等现代化教学手段名　称第十一章水果作物的组织培养目的要求掌握草莓茎尖脱毒培养的一般操作步骤和苹果茎尖培养的主要环节；基本掌握鉴定草莓无病毒苗的方法、苹果组织培养的类型和草莓花粉培养的大致步骤。重点难点草莓无病毒苗的鉴定方法、苹果组织培养的类型和草莓花粉培养的大致步骤。时间教学组织教学方法\n2学时第一节　草莓的组织培养一、生物学特性　1．形态特征：　1）科属　2）果肉花色　3）植株外貌2．生物学特性：1）温度　2）水分　3）光照　4）pH值二、栽培方法三、草霉的脱毒培养　1．热处理脱毒　2．微茎尖培养脱毒　3．花药培养脱毒四、草霉脱毒苗的鉴定　1．草霉病毒的种类　2．草霉病的鉴定方法五、草霉脱毒苗的苗的繁殖与利用　1．防蚜　2．繁殖程序及提高繁殖率的措施　3．生产管理工作　　　　　　　　第二节　苹果的组织培养　　　　　　　　　（给出自学提纲）一、生物学特性　1．形态特征：　1）科属　2）果肉花色　3）植株外貌2．生物学特性：1）温度　2）水分　3）光照　4）pH值二、苹果的花粉培养三、苹的茎尖培养四、胚的培养五、栽培管理　　1．育苗　2．土壤管理　3．施肥时期和方法4．灌溉和排水5．疏花疏果，调整负载量6．整形技术7．修枝技术采用示例讲授、练习与学生自学相结合的方法，并辅助多媒体课件、图片等现代化教学手段名　称第十二章马铃薯和番茄的组织培养目的要求掌握马铃薯的脱毒培养技术和马铃薯无病毒苗的鉴定方法；基本掌握番茄组织培养类型的差别和番茄栽培管理中的调节因素。重点难点马铃薯的生物学习性；马铃薯脱毒苗的培育和无毒苗的鉴定方法。时间教学组织教学方法\n2学时第一节　马铃薯的组织培养一、生物学特性　1．形态特征：　1）根　2）茎　3）叶　4）花　5）果实和种子2．生物学特性：1）温度　2）对土壤的要求二、栽培管理　　1．催芽　2．播种和管理三、马铃薯的脱毒技术　1．脱毒种薯生产程序　2．茎尖培养脱毒：1）取材和培养　2）继代和生根　3．花药培养脱毒四、马铃薯脱毒苗的鉴定　1．指示植物鉴定　2．培养鉴定　3．嫁接鉴定五、马铃薯脱毒苗的苗的繁殖与利用　1．无毒病株的繁殖　2．无毒病株的保存　　　　　　　　第二节　番茄的组织培养　　　　　　（给出自学提纲，引导学生自学）一、基本掌握番茄组织培养中各类型的主要差别二、番茄栽培管理中的调节因素采用示例讲授、练习与学生自学相结合的方法，并辅助多媒体课件、图片等现代化教学手段四、教案内容名　称第一讲绪论及组织培养的试验室组成目的要求熟练掌握植物组织培养的概念、原理和类型；掌握组织培养的特点；初步了解组织培养的发展史；基本掌握组织培养在农业生产实践上的应用和组织培养的实验室组成。重点难点组织培养的概念、原理、类型、特点及其实验室组成。\n主要内容：第一部分　绪　论第一节　植物组织培养的意义一、植物组织培养的狭义概念、广义概念、外植体概念及组织培养的特点（一）、概念：1．狭义概念2．广义概念3．外植体概念（二）、组织培养的特点：1．培养条件可以人为控制2．生长周期短，繁殖率高3．管理方便，利于工厂化生产和自动化控制二、组织培养的理论基础细胞全能性理论三、植物组织培养的类型根据外植体的不同，可以分为以下几种类型：1．植株培养2．组织培养3．器官培养4．细胞培养5．原生质体培养第二节　植物组织培养的发展一、探索阶段（20世纪初至30年代中）1．1902年德国著名的植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的细胞全能性理论；2．1934年White创立了离体根的（怀特）培养基，并发表了《植物组织培养手册》的专著。二、奠基阶段（30年代中至50年代末）　1．四十年代，Skoogt和催徵确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制根和芽形成主要条件之一；2．1956年Miller等发现了激动素可以代替腺嘌呤促进成芽。三、迅速发展阶段（60年代至现在）　1．原生质体培养取得重大突破2．花药培养取得显著成绩3．微繁技术取得广泛就用第三节　植物组织培养与农业的关系一、快速繁殖苗木二、获得脱毒苗木三、为农作物育种提供有利的手段四、实现工厂化育苗第二部分　组织培养的试验设备及培养条件（其中一节）第一节　组织培养的实验室组成一、洗涤室作用：用于玻璃仪器的清洗、干燥和贮存组成：大型水槽、塑料筐、烘干箱、干燥架二、配置室作用：用于培养基配制、分装、包扎和灭菌组成：药品柜、电子分析天平、大型工作台、蒸馏水器、磁力搅拌器、普通冰箱、电炉或电饭锅、酸度计、培养基分装设备、高压灭菌锅、恒温培养箱或生化培养箱、烘干箱三、无菌室作用：用于植物材料的无菌分离、接种转移培养物组成：接种箱、超净台、解剖镜、无菌操作用的器具、搁架四、培养室\n作用：用于培养接种后植物材料需具备的条件：1．温度：23－27℃左右2．湿度：70－80%3．光照强度：1500－3000lx4．光照时间：10－16h　　课　目第二讲　组织培养的设备、环境调控及培养基的种类和成分目的要求熟练掌握实验仪器、设备及使用方法；掌握组织培养的主要环境条件；基本掌握培养基的种类和特点，培养基的组成成分和适宜的剂量。重点难点组织培养常用仪器的使用，组织培养的主要环境条件的调控及培养基的主要特点。主要内容：第一部分　组织培养的试验设备及培养条件（另两节）\n第二节　常用设备与器材一、玻璃器皿试管、三角瓶、培养皿，其中最常用的是三角瓶（一）、对玻璃器皿的要求：1．耐腐蚀、高温、高压2．透明度好、3．易于放置外植体（二）、玻璃器皿的规格：三角瓶（100、250、500ml）、培养皿（9、12cm）、试管（18×180mm或20×200mm）二、器材用具　　镊子、剪刀、解剖刀、解剖针第三节　影响组织培养的各种环境因素的调控一、温度　适宜温度为25±2℃二、光照　1．光强：可以影响细胞的增殖、组织和器官的分化，同时对幼苗的生长也有影响2．光质：3．光照时间：一般情况下，时间的加长，对植株的形态建成有促进作用三、湿度　1．培养瓶内的湿度2．环境温度四、渗透压　适宜的范围为1－2个大气压，两个以上对生长不利五、pH值　适宜的范围为5－5.6；一般为5.8六、气体　氧气是组织培养中必需的因素，增加通气利于组培第二部分　培养基（其中一节）第一节　培养基的种类和成分一、培养基的种类、特点及相应的组成1．MS培养基：　　（1）特点　（2）组成　3．White培养基：　（1）特点　（2）组成4．N6培养基：　　（1）特点　（2）组成5．KM－8P培养基：（1）特点　（2）组成二、培养基的成分及相应作用1．水　1）作用　2）对其要求：要用蒸馏水2．无机化合物1）作用2）常用成分（1）大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S等；（2）微量元素：Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等3．有机化合物1）作用2）常用成分（1）碳水化合物（2）维生素（3）肌醇（4）氨基酸（5）天然化合物：椰乳、香蕉、马铃薯、酵母提取液、麦芽提取液、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳4．植物激素1）作用2）常用成分（1）生长素类：IAA、NAA、IBA、2,4－D（2）赤霉素类：GA3（3）细胞分裂素类：6－BA、Kt5．培养材料的支持物1）作用\n2）常用成分（1）琼脂（2）其它：玻璃纤维、滤纸桥、海绵6．抗生物质　1）作用2）常用成分　如青霉素、链霉素、庆大霉素7．抗氧化物质1）作用2）常用成分　半胱氨酸、Vc、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯8．活性碳　主要作用为：课　目第三讲　培养基的培制、选择和对前三讲的复习总结目的要求熟练掌握培养基的制备方法和步骤；初步掌握培养基的筛选方法。重点难点培养基的制备方法、步骤和对前三讲知识点的融会贯通。主要内容：第一部分　培养基（另两节）\n第二节　培养基的培制一、母液的配制　1．种类：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物质母液、激素母液　2．母液的浓缩倍数：　一般10－15倍二、工作培养基的培制（一）、量取母液　1．先量取大量元素母液　2．再量取微量元素母液及铁盐母液　3．量取激素母液（二）、定容　（三）、加热　（四）、灭菌第三节　培养基的选择一、单因子试验法　　指培养基中的其它成分保持不变，只改变其中的一种成分，从而筛选出最佳培养基的方法。二、多因子试验法指改变培养基中两种或两种以上成分，从而得到最佳浓度配比及筛选出最佳培养基的方法。根据其复杂程度可以分为完全试验法与正交试验法三、广谱试验法把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。第二部分　前三讲的复习总结一、对前三讲的主要内容进行概括和总结，使学生有一个整体的思路二、复习题（利用复习题加深对所学知识的理解）1．什么是广义的植物组织培养?什么是狭义的植物组织培养?什么是"外植体“?2．按照外植体的不同，植物组织培养可以分成几类?比较常用的是哪些?3．植物组织培养有哪些特点?4．因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些分实验室?各分室的作用是什么?常规组织培养时，需要什么设备和器械?怎样使用?5．组织培养中，pH值起什么作用?如果pH值过高或过低会有什么后果?6．目前，常用的培养基种类有哪些?各有什么特点?培养基包括哪些成分?各有什么作用?7．简要说明MS培养基的基本组成?8．配制培养基时，为什么要先配母液?如何配制母液?怎样利用母液配制培养基?9．培养基内加入活性炭的目的是什么?应注意什么问题?10．配制培养基时，为什么要加入一定量的植物生长物质?11．怎样进行培养基的高压湿热灭菌?12．试比较选择培养基时几种方法的优劣?\n课　目第四讲　消毒、灭菌、接种、培养和驯化目的要求熟练掌握组织培养相关的灭菌方法和无菌操作技术；掌握培养和驯化的方法和步骤；基本掌握褐变和玻璃化原因及采取的对策重点难点无菌操作技术以及褐变和玻璃化原因及采取的对策主要内容：第一节　消毒、灭菌与接种\n一、消毒和灭菌的概念及区别（一）、消毒与灭菌的概念　1．有菌和无菌的含义　2．消毒与灭菌含义（二）、消毒与灭菌的区别（三）、灭菌的方法：1加热灭菌2过滤灭菌3照射灭菌4化学药剂灭菌二、灭菌方法（一）、培养基的高压灭菌方法1．灭菌步骤　（1）加水（2）装锅（3）盖严锅盖（4）加热（5）排放气体（6）升压保温（7）降压排气（8）出锅冷却2．灭菌时间的调整（二）、接种工具、植物材料的灭菌方法1．接种工具（剪刀、镊子、解剖针）的灭菌先在95%的酒精中沾一下，置于酒精灯火燃上灼烧灭菌使用2．玻璃器皿的灭菌置于电烘箱中，160－180℃维持1.5－2小时3．植物材料的灭菌流水冲洗植物材料——75%的酒精中灭菌10－60秒——0.1%升汞浸3―15分钟——无菌水冲洗三次以上（三）、不耐热物质的灭菌方法　　一些不耐热的物质，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法其常采用过滤灭菌（四）、一些物体表面的灭菌方法　　一些物体的表面，如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70％的酒精反复涂擦灭菌，1％-2％的来苏儿溶液以及0．25％-1％的新洁尔灭也可以（五）、接种室和超净工作台的灭菌方法1．熏蒸灭菌2．紫外线灭菌三、无菌接种技术（一）、无菌接种的含义（二）、无菌接种的步骤　1．接种室灭菌　2．超净工作台的灭菌　3．人员准备　4．接种工具的灭菌　5．无菌接种：（1）植物材料灭菌（2）接种（3）封口第二节　培养和驯化一、培养的概念和方法（一）、培养的概念（二）、培养的方法　1．固体培养法：1）优点　2）缺点　2．液体培养法：1）优点　2）缺点二、培养的步骤（一）、初代培养　1．顶芽和腋芽的发育　2．不定芽的发育\n　3．体细胞胚状体的发育　4．初代培养外殖体的褐变原因及其控制措施（二）、继代培养　1．方法：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等　2．继代培养时材料的玻璃化原因及对策三、试管苗的驯化移栽　1．移栽用的基质和容器基质：河砂、草炭土、腐殖土容器：栽培容器可用6X6em-10XlOcm的软塑料钵，也可用育苗盘　2．移栽前的练苗　3．移栽和幼苗的管理　　（1）保持小苗的水分供需平衡（2）防止菌类滋生（3）一定的温、光条件（4）保持基质适当的通气性课　目第五讲　试管苗增殖率的计算及营养器官的培养目的要求熟练掌握试管苗增殖率的计算方法；基本掌握营养器官的培养方法重点难点难点为试管苗增殖率的计算，重点为营养器官的培养。主要内容：第一部分　操作技术（后一节）\n第三节　试管苗增殖率的计算试管苗年增殖率的计算公式Y＝XnY:年增殖率（瓶）X:每周期增殖的倍数n：一年增殖的周期数＝365/增殖周期增殖周期：指从接种开始到再次接种所需要的天数增殖倍数：每个增殖周期中一瓶能接种多少瓶注：上述公试表明，增殖周期越短，增殖倍数越高，年增殖率就更高。只要每年能增殖8－10次，每次能增殖3－4倍以上，就可满足快速繁殖的要求。例如：现有100瓶试管苗，每瓶10株，每次增殖3倍，每次45天，1年可增殖8次，年底可增殖为多少瓶与多少苗呢？答案为65.6万瓶，6560株苗第二部分　植物器官的培养（其中第一节）第一节　营养器官的培养一、离体根的培养（一）、意义：不仅是研究根系生理生化的优良材料，而且也能得再生植株。　（二）、培养方法1．培养基的选择：多为无机离子浓度低的White培养基，其他培养基如MS，B5，等也可采用，但必须将其浓度稀释到2／3或1／2。2．无性系的建立：　种子萌发　　　　切取1.2cm根尖接种于培养基上　　　待侧根长出一周后　　再切取1.2cm侧根根尖　　　　接种于培养基上　　　继代培养几次后　　　建立起根尖的无性系　　根段培养　　　　愈伤组织　　　分化出芽苗3．培养条件：25－27℃，暗光二、离体茎的培养　（一）、茎尖培养1．茎尖培养的概念2．材料处理：（1）取材（2）消毒（3）接种3．培养方法：（1）培养基的选择：培养基选择的依据（2）培养条件：每天光照16h，光照强度1500－3000Lx，温度25±2℃，一个月或一个月以后进行继代培养。（3）继代培养　　（4）生根培养3．驯化移栽：（1）炼苗：不开封口2－3天，打开封口2－3天。（2）移栽：（二）、茎段培养1．材料处理：（1）取材：取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，若是木本，取当年生嫩枝或一年生枝条，剪去叶片，剪成3-4cm的小段，在自来水中冲洗1-3h。\n（2）消毒：在无菌条件下用75％酒精灭菌30-60s，再用体积为0.1％／升的汞浸泡3-8min，或用饱和漂白粉浸泡10-20min，因材料老嫩和蜡质多少而定时间。最后用无菌水冲洗数次，以备接种。（3）接种2．培养方法：（1）培养基的选择：MS培养基，附加3%的蔗糖、生长素类和细胞分裂素类物质，如BA、KT等。（2）培养条件：与茎尖培养相似（3）继代培养　　（4）生根培养：采用1/2MS培养基，附加生长素类物质，最好加入一定量的活性炭（0.3%）3．驯化移栽：与茎尖培养基本相似，参考茎尖培养。课　目第六讲　离体叶的培养及生殖器官的培养目的要求熟练掌握离体叶片的培养步骤，花器培培养和种子培养的方法；一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。重点难点离体叶片的培养步骤，胚胎培养的类型与各自的注意事项。主要内容：上接第一节\n三、离体叶的培养离体叶培养包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。（一）、叶的结构：叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶（二）、叶片的培养方法　　　　　　　　　　由离体叶片再生成植株的方式有二种：一种是先诱导形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出芽和根，另一种是由外殖体直接分化出苗，其中第一种方式最为常见。离体叶片的培养技术如下：1．材料选择：选取植物幼嫩叶片，切割成适当大小（2－3cm），置于流水下冲洗2－4小时。附属物较多的叶片，可先用洗衣粉水浸泡5－10min，再用流水冲洗。2．消毒与接种：70%酒精浸泡10－30s，0.1%升汞浸3－5min，无菌水冲洗3次，切割成0.5cm或1cm见方，接入MS培养基中（附加BA1－3mg/L,NAA0.25-1mg/L）。3．培养条件：温度：25±2℃；光照强度：1500－3000lx；光照时间10－12h。　　半个月到1个月后，形成愈伤组织，然后转移到分化培养基上（附加BA2mg/L）,1个月后，转移到生根培养基上（附加NAA0.5-1mg/L）,从而使其发育为完整植株。第二节　生殖器官的培养一、花器官和种子的培养（一）、花蕾培养1．取材、消毒和接种切取未开放的花蕾，用75%酒精浸30s，0.1%升汞浸3－5min，无菌水冲洗数次，再将花梗插入培养基中。2．培养基和培养条件　1）培养基：MS和B5培养基，附加BA1-2mg/L、NAA0.5-1mg/L2)培养条件：温度：25±2℃　；光强：1500－3000lx　；光照时间：10－12h（二）、种子培养1．种子灭菌种皮厚或不饱满的种子，宜用0．1％升汞消毒10-20min。幼嫩的或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒15-30min。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95％酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。2．培养基若以促进种子萌发为目的种子培养，培养基的成分要求较简单，可不加或少加生长激素。当然，对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低，一般1％-3％。3．接种培养种子培养的接种较容易，把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中，均匀排列，放在20-28℃的条件下培养，1000-20001x光强，每天光照10h。（三）、胚胎培养1．种子培养的意义1）克服远缘杂种的不育性；2）使胚发育不全的植物获得后代；3）缩短育种年限，提高育种效率。2．成熟胚的培养\n成熟胚是指子叶期以后的胚。成熟或未成熟的种子，经70%酒精浸数秒钟，然后用无菌水冲洗3－4次，剖出胚，最后接种在MS培养基中（附加一定量的蔗糖）。3．幼胚培养幼胚是指子叶期之前的胚。培养方法与步骤与成熟胚基本相同。1）幼胚培养再生成幼苗的方式　　　A幼胚继续发育至成熟胚，再分化出芽苗；　　　B幼胚不再发育，直接萌发形成幼苗　　　　　　　　　　　　　　　　　　　C幼胚形成愈伤组织，再分化成胚状体或分化成芽苗（多数如此）2）影响培养成功的因素　A培养基的渗透压　增加蔗糖含量　B生长调节剂　C天然提取物质　D光温条件　温度一般为25－30℃；光暗交替促进幼胚的分化（四）简单介绍胚株和胚乳的培养　胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。取授粉4-8d后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳。接种在培养基上，可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0．5-2．0mg/L，BAO．1-1．Omg／L。在25-27℃和黑暗条件或散射光下培养，约6-lOd胚乳开始膨大，再培养形成愈伤组织．这时应转到分化培养基上培养，分化培养基可加入0．5-3．0mg／L的BA及少量的NAA。待愈伤组织长出芽后，切下不定芽，插人生根培养基中，光下培养10-15d，切口处可长出白色的不定根。课　目第七讲　培育无病毒苗木的意义及方法目的要求初步掌握植物无病毒苗培育的意义；深入掌握热处理和微茎尖脱毒的原理及方法。重点难点热处理和微茎尖脱毒的原理及方法。主要内容\n第一节　培育无病毒苗木在生产上的意义一、无病毒苗木的概念　　是指不含该植物主要的危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木一、培育无病毒苗木的意义　1．去除病毒危害，提高无性繁殖作物的产量和品质。2．减少环境污染，有利于保护环境。第二节　培育无病毒苗木的方法一、热处理脱毒（一）、热处理脱毒的发现及原理1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可去病生长良好。自1954年Kassanis用热处理防治马铃薯卷叶病以后，这一技术即被用于防治许多植物的病毒病。热处理又称温治疗法(theomtherapy)，其原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。在高温下，不能生成或生成病毒很少，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。（二）、热处理脱毒的方法1．温汤浸渍处理适用范围：适用于休眠器官方法：将植物材料浸在50℃的温水中10分钟至数小时。特点：简单易行，但易使材料受伤。2．热空气处理适用范围：热空气对活跃生长的茎尖效果较好。方法：将生长的盆栽植物移入温热治疗室内，35－40℃的热空气处理几十分钟至数月。特点：简单易行，但易使材料受伤。注：热处理脱毒的主李缺陷：　　不能脱除所有的病毒，因此热处理应与其它方法结合使用，脱毒效果才好。二、微茎尖培养脱毒　　　　　　1．微茎尖培养脱毒的原理感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.1~1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。2．微茎尖培养的培养基1）基本培养基：White、Morel或MS2）激素：生长素与细胞分裂素浓度适当的提高（0.1－0.5mg/L），生长素中宜用NAA或IBA，细胞分裂素可用KT或BA。有时茎尖培养添加活性炭。3．培养方法1）外植体预处理\n将带幼叶的茎尖，置于75%的酒精中浸数秒钟上（叶片包被紧密的顶芽，如菊花、兰花等）或置于0.1%的次氯酸钠溶液中浸5－10分钟（叶片包被松散的顶芽，如香石竹、大蒜和马铃薯等）2）茎尖的剖离与接种左手持镊子，按住处殖体；右手持解剖针，将茎尖处面的较大的幼叶去除，仅留1－2个叶原基。然后迅速将微茎尖接种在培养基上。注：解剖和接种要快，经防茎尖褐化死亡。3）培养条件温度：22℃左右；光强：2000－3000Lx；光照时间：每天16h；培养时间：一般需要数月。以后的继代培养和生根培养与一般的器官培养相同。4．影响微茎尖培养成活的因素1）外植体大小外植体越大，产生再生植株的机会也就越大，但脱毒效果不好，而外植体越小脱毒效果越好，但不容易成活。2）培养条件较高的温度和充足光照有利于茎尖的培养。3）外殖体的生理状态茎尖最好要由活跃生长的芽上切取，在香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中，二者没什么差别。取芽的时间也很重要，一般选作萌动期较好。否则采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。三、其它的脱毒方法　　　　1．愈伤组织培养脱毒　　1）方法：其它外殖体诱导愈伤组织，可得到部分无毒苗。2）原理：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；②有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。3）缺点：愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。2．茎尖微体嫁接（MGST）脱毒1）含义：是指将无病毒茎尖（0.14－1.0mm,具1－3个叶原基）嫁接在培养基上培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。适用于茎尖培养脱毒生根困难，不能获得完整植株的植物，如桃、苹果、柑橘等。2）茎尖来源：成年无病毒植物、温室培养的植物、热处理植物和脱毒试管苗等。其中普遍采用热处理茎尖。3）方法：A培养砧木B准备微茎尖C嫁接D嫁接苗培养E移栽3．花药培养脱毒4．化学药物脱毒许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。\n课　目第八讲　无病毒苗木的鉴定、繁殖、保存和利用目的要求深入掌握无病毒苗木的鉴定原理、方法和优缺点；基本掌握无病毒苗木的繁殖、保存和利用。重点难点无病毒苗木的鉴定原理、方法和优缺点主要内容\n第三节　无病毒苗木的鉴定方法一、指示植物鉴定法1．含义：利用病毒在其它植物（指示植物）上产生特定症状作为鉴别病毒存在与否及种类的方法，称为指示植物法，适用于草本和木本植物。　2．优点：灵敏、准确、可靠；操作简便。3．对指标植物的基本要求　1）根据不同的病毒，选择合适的指示植物；　2）容易栽培；　3）对要鉴别的病毒第敏感，易接种，易感染，症状显著。4．鉴定方法（以草本植物为例，在防蚜虫温室内进行）1）汁液涂抹法　　A从被鉴定的无毒苗木上取1－3克幼叶；　B将幼叶放在研钵（加10毫升水及少量磷酸缓冲液）中研碎；　C用纱布过滤，取滤液，在滤液中加入少量金钢砂（500－600目）；　D用棉球蘸取上述滤液在指示植物的叶面上涂抹2－3次，使病毒侵入叶片；　E将指示植物保温15－25℃培养，2－6天后可出现病斑。2）小叶嫁接法　取待无病毒植物的小叶，嫁接到指示植物上，嫁接后一般15－25天出现症状，由此可鉴别病毒有否及种类（见下图）二、抗血清鉴定法抗血清法是鉴定植物病毒中最有用的方法。1．原理与含义病毒（包括植物病毒）侵入动物体后，动物血清中会产生抗体，含抗体的血清称为抗血清。病毒即为抗源。抗源与抗体能发生特异性反应（血清学反应），根据反应症状可鉴别病毒存在与否和种类这种鉴定方法就称为抗血清法。2．鉴定方法　1）分离、纯化病毒（即抗源）；　2）制备抗血清；　3）把待测的各种无病毒苗的汁液在试管内与抗血清混合，根据出现的沉淀，可鉴定病毒的种类。如长形病毒形成絮状沉淀；球形病毒形成浓密粒状沉淀等。3．优点专一性高，结果准确；快速简便。一般几小时甚至几分钟就可以完成。\n三、电子显微镜检查法简要介绍该方法的基本原理病毒有一定的形态和大小。形态：球状、杆状和线状等；大小：0.01－0.3um之间，通常为0.1um。电子显微镜的分辨率：0.0001um。　　采用电子显微镜可直接观察到病毒（包括病毒的大小、形态和结构），由此可识别病毒的种类（见下表）。四、酶联免疫鉴定法　　简要介绍该方法的基本原理酶联免疫鉴定法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。第四节无病毒苗木的繁殖、保存与利用（给出提纲让学生利用6分钟的时间进行自学）问答题：无病毒苗木的保存方法？一、无病毒苗木如何保存，及保存的原因？二、无病毒苗木是如何被利用的？课　目第九讲　花药和花粉粒的培养目的要求初步掌握花药和花粉培养的意义、花药与花粉的区别、花药培养的最佳接种时期、花药培养的大致过程；基本掌握花药培养中花粉的发育途径；并初步掌握花粉培养的过程。重点难点花药、花粉培养的大致过程；花粉发育的四种途径主要内容\n第一节　花药和花粉粒培养的意义一、花药和花粉粒培养的概念1．花药培养：是指将花粉粒发育至一定时期的完整花药接种在培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。　　2．花粉粒培养：是指将离体的花粉粒接种在培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。二、花药和花粉粒培养的意义1．快速获得纯合2倍体植株，缩短育种年限，提高育种效率；2．有利于尽早淘汰掉隐性的有害个体，筛选出具有优良性状的个体；3．是研究花粉细胞减数分裂，生理、生化代谢等基本理论的好方法。第二节　花药的培养一、培养基的选择基本培养基：MS、B5、、B6等；1．诱愈培养基：可附加2、4－D（1－3mg/L）；2．分化培养基：可附加BA（2-3mg/L）和IAA（0.2－0.5mg/L）；3．生根培养基：附加生长素类（0.5－1mg/L）。二、花药材料的选取时期具体依据：1．生理状态：花粉粒发育到单核靠边期。　2．外观形态：花蕾未开放；花蕾长度。三、材料处理与培养　1．消毒与接种采花蕾置于70%酒精中浸数秒，再置于0.1%升汞中浸3－5分钟，最后剖开花蕾，取出花药（去掉花丝），接种在诱愈培养基上（每瓶3－5个花药）。花蕾在消毒前，也可用低温（4－5℃）预处理3－4天，这样可提高胚状体分化率。2．培养条件温度：23－28℃；光强：2000－4000Lx；光照时间：每天16h左右。接种后10－30天形成愈伤组织，再转接到公化培养基上20－30天后，分化出再生植株。四、花药培养中花粉的发育途径1．营养细胞发育途径由营养细胞分裂增生形成愈伤组织或胚状体，进而分化为再生植株。2．生殖细胞发育途径3．营养细胞和生殖细胞共同发育途径营养细胞与生殖细胞各自脱分化、分裂增生，共同形成愈伤组织或胚状体。4．花粉粒均等分裂发育途径单核花粉粒均等分裂形成两个同样的细胞，各自脱分化，分裂增生，共同形成愈伤组织或胚状体。第三节　花粉粒的培养一、培养基的选择基本培养基一般用Nitsch培养基，再添加一些促进生长的物质，如硝酸钙、硫酸、椰子乳、酵母汁等。二、材料的预处理1．低温预处理：同花药培养中花蕾的低温处理。可提高花粉粒单倍体植株的诱导率。\n2．重力作用：在烟草花粉培养中，在从花蕾中取出花药前1h，在5℃条件下进行低温离心机离心，可提高单倍体的诱导率。另外，在玉米上试验也有同样效果。三、花粉粒的分离四、培养方法1．微室培养法取含有50~80粒花粉的一滴培养液放在微室培养装置中，为了防止花粉破裂，应在低温条件下(4℃以下)接种，然后在20℃下培养。2．看护培养法无菌条件下，将花药接种在固体培养基上，花药上面盖一层圆形滤纸，吸取1滴每毫升含10粒花粉粒的悬浮液接种在滤纸中央，形成胚状体，分化为单倍体植株。　　课　目第十讲　原生质体的培养　目的要求初步掌握原生质体培养的意义、原生质体的分离方法、原生质体培养方法；基本掌握原生质体融合的方法。重点难点重点为原生质体的分离和培养方法，难点为原生质体融合的方法主要内容\n第一节　原生质体培养的概念和意义一、概念1．原生质体：植物细胞去掉细胞壁的其于部分。2．原生质体培养：离体的原生质体无培养，诱导生成再生植株。二、意义1．获得再生植株；2．克服远缘怵交的不亲和性；3．研究细胞表面及各种细胞器的结构与功能等。第二节　原生质体的分离与培养一、植物材料根、茎、叶、花、果和种子等均可主要是叶肉组织、愈伤组织和县浮培养的细胞二、原生质体的分离方法1．机械分离方法　分为两步：第一步是使细胞发生质壁分离；第二步是切开细胞壁，把原质体释放出来。2．酶分离法：1）酶种类：纤维素酶、果胶酶等。2）步骤：果胶酶处理植物材料，再用纤维素酶处理，得到原生质体。或用果胶酶和纤维素酶的混合物处理植物材料，得到游离的原生体。三、影响原质体分离的因素1．胞壁降解酶2．酶液的渗透势3．酶液的酸碱度4．分离的环境条件5．通气条件6．植物栽培条件四、原生质的培养方法　　　　　　　　1）固体培养法1．培养方法　　　2）液体培养法3）固液结合培养法1）细胞壁的再生2．原生质体的再生　　2）细胞分裂3）植株再生3．影响原生质体分离和再生的因素　1）培养基成分　2）原生质体密度　3）光照和温度第三节　原生质体的融合一、融合方式（一）、自发融合自发融合是在植物原生质体分离过程中，用酶法分解细胞壁后进行融合。这类融合是种内融合，与胞间连丝有关，融合的个体一般不能进一步发育。\n（二）、诱导融合　　诱导融合是指制备出原生质体后，加入诱导剂或用其他方法促使两个亲本原生质体融合，诱导融合可以是种内的，也可以是种间的，甚至是属间、科间的融合。1．物理方法：利用显微操作、灌流吸管、离心或振动等机械以促使原生质体融合，这种方法目前多与诱导剂结合起来使用，2．化学方法　1）高pH一高钙法　2）聚乙二醇法　3）离子诱导融合　4）电剌激诱导融合二、操作过程（学生自学达到了解即可）异种原生质体先经膜融合形成共同的质膜，然后经胞质融合，产生细胞壁，最后是核融合。细胞核的融合是异种原生质体融合的关键。融合体只有成为单核细胞后才能继续生长，才能合成DNA、RNA，并进行细胞分裂，这就要求两个核必须同步分裂，如果两个核所处时期不同，一个开始合成DNA，另一个还处于合成的中途或已完成了复制，它们之间就会相互影响，导致最终不能进行细胞分裂。　课　目第十一讲　非洲菊的组织培养　目的要求掌握非洲菊快繁的方法；基本掌握菊花花瓣培养方法。重点难点非洲菊的组织培养育苗。主要内容\n第一节　非洲菊的组织培养一、生物学特性1．形态特性：1）科属：菊科大丁草属　2）花色：红、粉红、橙、黄、白等　3）植株外貌：株高50－60cm。叶基生，长椭圆状针形。头状花序，单生，花径9－12cm，花梗长。2．生态习性（见下表）二、自然繁殖与育苗1．播种繁殖2．分株繁殖3．组培繁殖三、组织培养育苗常用花托作为外殖体。采取直径1厘米左右的花蕾，在超净工作台上用0.1%的吐温浸泡10－15分钟，取出洗净后再放入0.1%氯化汞中消毒20分钟，取出用无水冲小船坞3－4次。用镊子和手术刀剥去苞片，切除全部小花，留下花托，将花托切成2－3mm见方的小块。培养条件为24±2℃，光照强度为2000－3000Lx，每天光照12－16小时。初代培养基为MS＋BA2mg/L+NAA0.2+IAA0.2，7－10天后切口处形成愈伤组织，约2周后从花托块中央生出丛生小芽，将丛生小芽移至分化培养基，可进行继代培养；与此同时，余下的愈伤组织约4周后形成丛生芽，分化频率为60－70%。将丛生芽切割后，转入MS＋KT5＋IAA0.2培养基继代培养。待苗高2厘米时剪切转移于1/2MS+NAA0.1生根培养基中，约4周后可发出2－3厘米根系。移栽基质可用珍珠岩和蛭石（1：1）。移栽后防雨并用遮阳网遮荫，每天喷水1－2次，每周供给1次营养液，2－3周即可成活。随后适当增加光照，培养5－6周可供大田移栽。四、栽培管理　　　1．土壤准备与定殖非洲菊喜偏微酸性的壤土。基肥每1000平方米可用300kg腐熟菜饼、150kg\n过磷酸钙、150kg氮、磷、钾复合肥及1500kg腐熟的牛粪混合后翻人土中。畦宽1.2m，畦高25cm。种植密度以每畦种三行，株距30－35cm。1000平方米共种4000－5000株。定植时间除炎热的夏季外、其余时间均可进行。非洲菊的定植深度以浅栽为原则。要求根茎露出土表1－1.5cm，反之，如栽种过深，定植后发棵慢，甚至死亡。3．肥水管理在生长期应该充分供给水分。在冬季温室内须视温度和生长情况酌情少浇水。浇水时要注意叶丛中心不能积水，应保持干燥，不然花芽易烂。非洲菊只要温度适宜，一年四季能不断开花，因而需在整个生育期不断进行追肥，以补给养分的消耗。其营养类型属氮钾型，肥料可以氮、磷、钾复合肥为主。一般每10~15d施1次，当发现花后叶弱、叶小、叶少时，应适当增加氮肥。3．剥叶与疏蕾1）剥叶原因：非洲菊除幼苗外，整个生长期为营养生长与生殖生长并进，即一边长叶，一边长花。如叶片过于旺盛，花枝数减少，甚至光长叶不开花，叶片过小过少，花枝数减少并因营养不足导致花梗过矮，花朵变小，而无商品价值。因此，在整个生育期要不断地合理剥叶。方法：①剥去植株已被剪去花的那张老叶；②根据该植株分株上的叶数，来决定是否再剥叶，一般1年以上的植株约有3~4个分株，每分株应留3个叶；③将重叠拥挤在一个方向的多余叶片剥去，使叶片均匀地分布在4个方向，以利更好地进行光合作用；④如植株中间长有密集丛生的许多新生小叶，功能叶相对少时，应适当摘去中间部分小叶保留功能叶，以控制过旺的营养生长。同时让中间的幼蕾暴露于阻光之中，这一点对花蕾的发育相当重要。2）疏蕾原因：疏蕾的作用主要是提高切花的品质，使花朵更具有商品价值。方法：当一棵植株上同一时期具有3个以上相当发育程度的花蕾时，容易养分不足，应将多年的花蕾摘除。此外，在幼苗刚进入初花期时，未达到5张叶以上的功能叶或叶片很小，应将花蕾摘除，不让它开花，使它长足营养体。因为大的叶才能开出大的花，如营养体很小就让它开花，以后就一直不能开出大花。夏季切花廉价时，应尽量少让它开花，以蓄积养分，利于冬季出好花。4．温度管理冬季切花，需在11月份盖好塑料薄膜。加强保温和增温。如果冬季夜温保持在1~2℃以上，仍可保持持续开花。非洲菊对温差相当敏感。夜间的温度应比白天低2~3℃，如果落差太大，会造成畸形花序。灌溉的水温也相当重要，冬季水温最好较土温高出3~4℃，夏季高温时忌用冷水。课　目第十二讲　香石竹的组织培养及对前面所学知识进行总结目的要求掌握香石竹快繁的方法；基本掌握香石竹茎段培养技术。同时通过总结使学生系统掌所握前面已学过的知识点。重点难点香石竹的茎段培养技术。\n主要内容第一部分　上接第九章第一节第二节　香石竹的组织培养一、生物学特性与栽培习性1．形态特性：1）科属：石竹科石竹属草本植物。2）植株外貌：须根系，茎直立，多分枝，株高70－100厘米，茎部半木质化。叶线状披针形，全缘，叶质较厚2生态习性香石竹是一种中日性花卉。喜干燥、通风良好的环境，忌高温多湿，一年四季，除炎热的高温外，其余时间都能开花。香石竹为喜冷凉植物，最适宜的生长温度为19－21℃，冬春季节白天宜保持在15－18℃，晚间保持在10－12℃，夏秋季节白天宜保持在18－21℃，晚间宜保持在12－15℃。香石竹喜保肥通气和排水好及腐殖质丰富的砂质壤土，土壤通气间隙占30％左右最为理想，最适宜的土壤pH值为6－6.5。二、自然繁殖与育苗1．采穗母本园：目前主要选自国外进口及国内生产的试管苗，也有少量是上年开过花、表现好的植株中下部的侧芽留作母本。2．插穗：最好采用母本茎中部二三节生出的侧芽作插穗。中部位以下的侧芽较弱，不充实，发根以后生长不好；中部位以上的侧芽，由于节间长，尽管容易发根，但不久生出花蕾，应避免采用。采插穗时，用左手握住母株，用右手抵住侧芽的中间使之弯曲而扒下，这样不伤母株茎，扒下的插穗需进一步整理。3．扦插苗床：可采用带有自动喷雾苗床进行扦插育苗。如临时性育苗，最简单的方法是，选择靠近自来水的大棚，做宽度1.2m左右的苗床，里面放人基质。上面安上喷水管道。长度则根据插穗的多少来决定。放入的基质厚约8cm，过厚易潮湿，过薄易干燥。采用珍珠岩与稻糠灰各一份混合的基质，生根效果最好，且生根后苗较健壮；也可就地取河沙、田园土拌和使用。4．扦插方法：扦插事先将基质浇水，株行距1.5×2.5cm，插深1．5cm，插穗垂直于土面，插后立即浇上薄水，使插穗与基质紧密相接。5．扦插时间：扦插以春秋两季生根快、成活率高，15～20d左右能起苗，冬季发根较慢，约30～40d左右可起苗。夏季如有自动喷雾的全光浴苗床，扦插成活率也比较高，最快13d左右就能发根。但高温高湿，或排水不畅，很容易烂苗，感病，严重影响成活率。三、组织培养育苗1．取材、灭菌和接种：香石竹组织培养大多取其茎尖作培养材料。在清水中清洗后，用70％的酒精消毒1min，再用2％的次氯酸钠消毒15min，或用0.1％升汞消毒8min，最后用无菌水漂洗3~4次，经无菌滤纸吸干水分后，放在干净的培养皿中备用。在超净工作台上剥开茎端，切下茎尖，立即接入预先配置好的培养基上，一般每只三角瓶接人3~5个茎尖。作为快速繁殖，切取0．5cm大小的茎尖进行培养。作为脱毒培养，则要在双筒解剖镜下切取0．3~0．4mm的茎尖进行培养。　2．培养基和培养方法：通常选用MS为基本培养基，也可用White作基本培养基。附加BA或KT0．5-2mg／L(单位下同)；NAA、IAA浓度为0．2-2，2，4-D为0，1-\n1。培养方式有固体培养和液体培养。可采用液体和固体培养交替进行。如选用White(无机盐浓度的5倍)基本培养基附加NAA2，对切取的茎尖进行液体培养，促进愈伤组织的形成和生长。1个月后切除基部部分愈伤组织后转入到附加NAA1的White液体培养基中培养2周，待小苗长到0．5cm左右，把小苗转入到MS附加Kt0．5的固体培养基内进行增殖培养，然后再用MS培养基附加BA0．5和NAA0．2进行继代培养，从而获得较高的繁殖系数和高质量的组织培养苗。3．芽的诱导和繁殖：从茎尖诱导芽的发生通常有两个途径。一是诱导茎尖直接形成芽苗或芽丛；二是先诱导茎尖产生愈伤组织，再使愈伤组织分化产生不定芽。4．生根培养：切取1~2cm长的幼苗，接种在无激素的1／2MS培养基上培养，经15~20d的生长，即可产生根系。温度20~25℃，光照强度约20001x．每天维持10~12h的光照。　　5．移栽驯化：在组织培养苗移出前，应先在室内自然的光照和温度、湿度条件下炼苗2～3d，使之逐步适应外界的气候条件。自然情况下10月中旬至翌年5月为最佳移栽期。移栽后的头几天，需要防风、保湿，可设置塑料小拱棚，用喷雾器间歇喷水，以保持一定的湿度。并将温度保持在12~15℃。2周后可完全不遮荫，进行全光照正常养护，精心管理，补充肥水，及时防治病虫，培育壮苗。四、栽培管理1．土壤准备　2．作畦与定殖　3．摘心　　4．张网　　5．肥水管理　　6．摘芽和摘蕾第二部分　知识点（第四讲到第十二讲）回忆和总结　　以讲义为准对前面学过的知识点进行回忆和总结，并对课本后的习题进行答疑，加深学生对所学知识的理解。课　目第十三讲兰科花卉的组织培养目的要求掌握蝴蝶兰的组织培养技术、培养部位、接种方法；初步掌握兰科植物主要属的培养方法。重点难点兰科植物主要属的组织培养方法。\n主要内容第一节　兰花的组织培养技术一、取材部位　　1．新芽的茎尖　　茎尖是细胞分裂最旺盛的部分，也是培养成功率最高的部位，但需要较高的分离技术。2．休眠芽　在顶芽失去发芽力时它能发芽。其芽裸露，故分离技术简单，但易污染，所以要注意灭菌。3．茎的隐芽茎的隐芽是较难分离的芽，其成活率与休眠芽差不多。4．花梗当兰花开花约一个月后，剪取其花梗顶端及若干个花梗腋芽，切成2～3cm长的切段，每段带一腋芽，基部向下插于培养基中。二、茎尖的选取、灭菌和接种1．选取、灭菌正在生长中的芽是最理想的培养采集物，一般取2～6cm大小切取下来，上面包括有数个隐芽和生长芽，生长芽是培养成功率最高的部位，休眠芽剥起来较困难，生长也较慢。切下后，先充分用流水冲洗，并把最外面的1-2片苞叶去掉，再用10％次氯酸钠或漂白粉溶液(10g漂白粉溶解于140ml水中，充分搅拌匀后，静置之约20min，取上清液)中浸10-15min。灭菌的时间和灭菌的浓度应根据芽的大小和成熟度用不同种属进行调整。灭菌后的芽应放在无菌条件下进行剥离和切割，卡特兰类容易产生褐变，在切割时应将芽放在无菌水中操作，这样会比在空气中褐变的机会少些。以消除病毒为目的时要尽量小些，可以小到0.1mm：若以繁殖为目的，培养物可在2-5mm左右。大体积的剥离可以肉眼直接操作，太小时需要在解剖镜下才能看清。2.接种茎尖接种以固体培养基为好，但因属而异，如蕙兰属在培养基培养形成原球茎，以后则用固体培养基进行继代培养，而卡德兰属和石斛属这一类易变褐枯死的属，以在液体培养基为好。　　3．继代培养接种后1－2个月培养的茎尖即可形成原球茎球状体，以后即发芽生根长叶。应在其发芽前把它切成小块进行转移，让它继续不断地形成原球茎球状体。这样连续的进行继代培养，短时间可以得到大量的原球茎球状体，方法是从培养基中取出原球茎球状体，在灭过菌的培养皿内，用灭过菌的解剖刀将其切成小块，再接种到培养基中。4．培养基和培养条件1）培养基：(1)适于形成原球茎的初代培养基是从芽上剥出的生长点直接接种用的培养基，对于许多兰花来说，MS培养基最好。另外KnudsonC(KC)培养基也不错。(2)适于繁殖原球茎的继代培养基虎头兰用KC+10％椰乳的液体培养基，在KC+NAAl+Kt0．01固体培养基也有较好的结果。卡特兰可用MS+NAAl+BA5。(3)适于原球茎分化的培养基一般来讲原球茎分化苗是比较容易的，通常用基本培养基培养，就能分化幼苗和根。KnudsonC培养基配方：磷酸二氢钾0.25g(以下单位相同)、硝酸钾1、硫酸铵0.5。2）培养条件：光照12h，保持22℃的温度。　\n5．液体振荡培养采用旋转振荡机进行液体振荡培养，保持22℃的恒温，24h连续照明，可得到大量的原球茎球状体。应用这个方法，有利于大量繁殖原球茎球状体。6．试管苗的移栽试管苗有3－4叶大小(因种类而异，兰属高5－8cm)，根2－3条时可移植，种植要求与实生苗相同。(1)从试管内取的苗用水将琼脂冲洗掉(苗大难冲洗时，可将水冲人试管内)，水冲洗不彻底会发生霉菌腐烂。(2)经水冲洗的苗放在旧报上，吸干水分阴晾1h再定植。(3)管理上，温室控制在50％的弱光，温度20~25℃，保持一定的湿度，不能完全密闭，也要注意通风。根在开始生长后可1周浇一次1000倍的合肥料。第二节　兰科植物主要属的培养一、卡德兰属的培养1．材料的准备和灭菌新芽选择5－10cm长，可从基部采芽。先在流水中冲洗，以后切去叶片再行消毒。消毒剂可采用酒精，漂白粉等。2．采芽采芽方法是侧芽在除掉1－2个叶后，在节的下面横切，再在叶的两侧纵切，最后再从芽的后面茎1mm深处薄薄切取。顶芽是留一片叶子，余皆除去，再从顶部往下四面进行纵切，最后切1mm3大小。切下的茎尖放在灭菌的培养皿内的滤纸上，接着再接种到液体培养基中。采用MS培养基，蔗糖浓度为2％，添加NAA0．1、CMl0％，pH值调整在5.5，速度为2r／min的液体旋转培养。培养温度为26℃，光照为16小时。3．培养条件和继代培养培养的温度，以在15－20℃为好，这样排出的变褐物质少，成活率高，成活以后，则以保持在25℃的恒温以生长好。光照强度以500-2000Lx为好，每天照明16－22h。将采后经2个月液体旋转培养产生的纵切为4，再继代培养，接种的培养基，除基本盐类，还有维生素，氨基酸，NAA0．186ml／L，Kt0．02ml／L，GA30．173ml／L，蔗糖30g／L，琼脂6g／L，不加CM。经营1－2个月所有的球茎球状体可发根。在KC培养基加20g／L的蔗糖发根就慢。长期的液体培养，也会引起材料的变黑、枯死，所以对繁殖不一定有利。4．防止培养材料变褐1）采芽后，用无菌水冲洗再接种。2）在培养基中加(50～100)x10-6变褐防止剂芸香甙。3）开始培养到成活，保持温度15－20℃。4）调整培养基的合适pH值。pH值4.5－5.0时排出的变褐物质最多，而pH值5.5时就少，成活率就高。5)6～8月采芽，由于排出褐化物质多，成活率也就低。二、蝶兰属的培养1．茎尖的培养1）采芽的准备　除去叶后，茎用水冲洗，再用10%的漂白粉表面灭菌15分钟。除去叶原基后，再在5%的漂白粉中灭菌10分钟，以后用无菌水冲洗净。2）采芽\n切取茎尖和各叶基部的腋芽，约2－3毫米大小，用采芽小刀切取后直接接种到培养基中。3）培养基培养基采用Vacin和Went培养基，添加15%CM进行液体培养，或加9克/升的琼脂进行固体培养皆可。4）培养条件25℃恒温，光照强度2000Lx，照明16－24小时。液体培养基用60rpm的速度进行振荡培养，培养7－10时再转移到新的培养基，培养一个月后转移到固体培养基。在这种条件下培养一个月即可形成原球茎球状体，以后再进行继代培养，不断繁殖原球茎球状体。2．花梗腋芽的培养：1）采芽的准备　将带腋芽的花梗进行冲洗，用10％的漂白粉溶液表面灭菌20min，除去腋芽的苞叶，再在5％的漂白粉溶液中表面灭菌3min，无菌水冲洗净。经过灭菌的材料放在培养皿内的滤纸上保存，这样可减少操作转移时空气的污染。2）采芽不带花梗组织，仅取腋芽，接种到培养基3）培养基和培养条件禾芽用德兰属1号培养基为好，原球茎球状体的繁殖也用采芽所用的培养基；育苗用卡德兰属1号加10％香蕉汁为好，育出的苗鲜重可比不加的重3倍。培养条件是光照强度2000Lx，光照时间每天13h，保持恒温25℃。4）继代培养用原球茎球状体繁殖，用培养基进行数代继代培养，不能中止。也不会白化，继代培养时不要切得太小。5）育苗不切成小块继续培养就分化产生叶片，发根前分切移到育苗的培养基，3－6个月可得到能栽植的苗。3．叶片的培养：1）培养准备和接种采开花或开花后的花梗，表面灭菌后切成约4cm长，除去各节的叶接种到培养基上。2）培养基和培养条件用Vacin和Went(1949)培养基，添加CM20％，蔗糖2％，琼脂1％，也可不用CM，而加BA5.0温度28℃，20℃的低温花芽伸长，芽多。光照度500Lx，日照16h。芽不长时，可转移到加BA的培养基，可再生带营养芽的植株。3）叶片的培养　　叶片是从试管内培养的材料上切取，故不必要再灭菌。用Kyoto改良培养基，加复合肥料3．5g／L、肌醇1000ppm、烟酸1ppm、维生素B11ppm、NAAlppm、腺嘌呤10ppm、BAl0ppm、蔗糖2％、琼脂1.0％.4）叶片的切取培养切取展开叶最上部先端、中央或基部约6-8mm2大小，接种到培养基上。培养条件为25℃恒温，光照度500Lx，照明16h。5）继代培养为繁殖原球茎球状体，用改良的Kyoto培养基进行继代培养，或在Vacin和Went培养基中去掉蔗糖和琼脂，加20％的CM的液体培养基进行振荡培养。6）育苗\n育苗可在简单的培养基进行静置培养。原球茎球状体2~3个月即可萌芽，形成叶，以后转移到Kyoto培养基，加10％的香蕉汁，经数月后可得到能移至外面的大苗。课　目第十四讲水果作物的组织培养目的要求掌握草莓茎尖脱毒培养的一般操作步骤和苹果茎尖培养的主要环节；基本掌握鉴定草莓无病毒苗的方法、苹果组织培养的类型和草莓花粉培养的大致步骤重点难点草莓无病毒苗的鉴定方法、苹果组织培养的类型和草莓花粉培养的大致步骤\n主要内容第一节　草莓的组织培养一、生物学特性　1．形态特征　1）科属：草莓属多年生草本植物；　2）果实：果实为假果，果实成熟时果肉红色，粉红色；3）植株外貌：植株矮小，呈平卧丛状生长，根系为须根系，茎呈短缩状，地上短缩茎节间极短，节密集，其上密集轮生叶片，叶腋着生腋芽。地下短缩茎为多年生，是贮存营养的器官，也可发育成不定根。匍匐茎是草莓的特殊地上茎，是其营养繁殖器官。叶为三出复叶，呈螺旋状排列。花序为二歧聚伞花序至多歧聚伞花序。2．生物学特性：1）温度：草莓根系在土壤温度达到2℃时开始活动，在10℃时开始形成新根，根系生长的最适温度为15－20℃，秋季温度降低到7－8℃时生长减弱。春季气温达5℃时植株开始萌芽，茎叶开始生长。2）水分：决定了草莓对水分要求较高，但在不同的生长发育时期，对水分的要求不同。开花期土壤的含水量应不低于最大田间持水量的70%。果实膨大及成熟期土壤含水量应不低于80%，而秋季9，10月份，土壤持水量达60%即可，草莓不耐涝，要求土壤既有充足的水分供应，又要有良好的通气条件。3）光照：草莓是喜光植物但又比较耐阴。光照充足，植物生长旺盛，叶片颜色深，花芽发育好，能获得较高的产量。相反光照不良，植株生长势弱，叶柄及花序柄细。叶片色浅，花朵小，果实小，着色不良。　4）pH值：要求肥沃、疏松、透水、通气的中性微酸性或微碱性土壤。二、栽培方法　　在自然条件下，草莓用匍匐茎分株法繁殖，这种方法繁殖系数高，保持了母本的优良性状。在繁殖囿设1m宽行距，50－60cm株距定植，从5月到9月均可繁殖。囿内保证肥水供应，保持土壤湿润、疏松，减少结果量。匍匐茎发生后，将其向母株四周拉开，排列均匀，并在偶数节上压土促发根系，每条匍匐茎上可形成3－5个壮实的子幼苗，待茎苗长到3－4片叶时可以移出，作为定植苗用。移出时每株小苗靠母株一侧的匍匐茎留2cm长剪断。起出的苗可进行假植，假植宽度以15×15cm为宜，假植深度以根和叶柄分界线埋入土壤1cm为宜，假植后要做好管理工作。三、草霉的脱毒培养　　1．热处理脱毒　将草莓植株在40－41℃温度下处理4~6周，然后取微茎尖培养。　　2．微茎尖培养脱毒　　　1）初代培养　2）继代培养　3）生根培养　4）驯化3．花药培养脱毒花药培养操作简单，因经愈伤组织途径，再分化得到的即为无病毒苗，所以可免去病毒鉴定工作。　1）取材培养　2）植株分化　四、草霉脱毒苗的鉴定　　1．草霉病毒的种类\n草莓病毒主要有四种，为斑驳病毒，皱叶病毒，脉结病毒和轻型黄边病毒。斑驳病毒在EMC指示植物上表现不整齐的黄色小斑点；皱叶病毒在指示植物UC-1上产生不整齐的小斑点，以及不整齐的叶脉，叶柄暗褐色；脉结病毒在指示植物EMC上表现小叶向后反转成风车状，尖端卷曲，叶脉呈带状褪绿；轻型黄边病毒对EMC指示植物产生红叶，数日即枯。2．草霉病的鉴定方法因草莓的病毒在通过汁液接种不感染，所以通常采用小叶嫁接法来进行鉴定。首先从被鉴定的草莓采集长成不久的新叶，除去两边的小叶，中央的小叶带1－1.5cm的叶柄，把它削成楔形作接穗。而指示植物则除去中间的小叶，在叶柄的中央用刀切入1－1.5cm，再插入接穗，用线把接合部位包扎好。为了防止干燥，在接合部位涂上少量的凡士林。为保证成活，在2周内，可罩上塑料袋，置于半见光的场所。约经2周时间，撤去塑料袋。若带有病毒，嫁接后1－2个月，在新展开的叶、匍匐茎或老叶上会出现病症。五、草霉脱毒苗的苗的繁殖与利用1．防蚜传播草莓病毒的主要有草莓茎蚜、桃蚜和棉蚜。其中分布最广泛的是草莓茎蚜，身体着生有钉状的毛，可以寄生寄主的全株各个部位上。草莓病毒通过蚜虫吸吮汁液而得到传播，短时间即可完成。防治时可使用马拉松乳剂，氧化乐果乳剂等接触杀虫剂，防治期5－6月，9－10月，特别是9－10月一次2．繁殖程序及提高繁殖率的措施草莓无病毒苗的繁殖程序可分五步，包括：脱病毒鉴定生产出无毒苗、原种种苗培养、原种种苗繁殖、良种种苗繁殖，生产用苗繁殖和栽培苗繁殖，前四步在隔离室中进行，后一步在露地进行。为提高无病毒母株的繁殖株数可采用赤霉素处理和摘蕾的方法。赤霉素处理用5ppm的浓度，每株5ml,在5月上旬和6月上旬分两次进行。摘蕾可减轻母株的营养负担，促进匍匐茎的大量发生，田间地每一株可繁殖150－200株。3．生产管理工作母株必须保证每株有大于3.3m2的营养面积。再是注意匍匐茎排列位置，不要交措重叠，这不利采苗，采苗也要适时进行。无论秋季或春季种植，繁殖床必须要进行土壤消毒，小面积可用蒸气剂料盒消毒，防治草莓萎缩病、根腐病、萎凋病等的发生。隔离繁殖囿通常施缓放性肥料，每公亩用3ton；为促使匍匐茎发生，要经常灌水。第二节　苹果的组织培养（给出自学提纲）一、生物学特性　1．形态特征：　1）科属　2）果肉花色　3）植株外貌2．生物学特性：1）温度　2）水分　3）光照　4）pH值二、苹果的花粉培养三、苹的茎尖培养四、胚的培养五、栽培管理　　1．育苗　2．土壤管理　3．施肥时期和方法4．灌溉和排水5．疏花疏果，调整负载量6．整形技术7．修枝技术\n课　目第十五讲　马铃薯和番茄的组织培养目的要求掌握马铃薯的脱毒培养技术和马铃薯无病毒苗的鉴定方法；基本掌握番茄组织培养类型的差别和番茄栽培管理中的调节因素重点难点马铃薯的生物学习性；马铃薯脱毒苗的培育和无毒苗的鉴定方法。\n主要内容第一节　马铃薯的组织培养一、生物学特性　　1．形态特征　1）根：马铃薯的根系是由初生根和匍匐根两部分组成。2）茎：马铃薯分地上部分和地下部分，地沙锅内茎的主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统。地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。块茎与匍匐茎相连的一端叫薯尾或脐部，另一端叫薯顶，块茎表面分布着芽眼。薯顶压延分布较密，发芽早，发芽势强，即具有顶芽优势。生产上的整薯播种、带着顶部芽眼切块，都是发挥顶芽优势的有效措施。3）叶：马铃薯先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形。以后发生的叶奇数羽壮全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。4）花：马铃薯的话为聚伞花序，第一或第二花序开放，恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。　5）果实和种子：马铃薯果实为球形或椭圆形浆果。种子小。扁平肾形。中指可用来繁殖，但后代性状分离大。2．生物学特性：1）温度：马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4℃下发芽，发芽适温为12－18℃。地上茎叶生长温度为17－21℃，25℃以上时生长不良，叶变小，超过30℃和7℃以下茎叶停止生长，-1℃时受冻。块茎形成要求昼温14－24℃，夜温12－14℃，土温16－18℃。结薯期要求12h左右的短日照。2）对土壤的要求：疏松、湿润、肥活以及通气良好的土壤条件。土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整。二、栽培管理　1．催芽：播种前30－40d，将选好的健康种薯装入袋或筐中，放在15－18℃和相对湿度60%－70%的火炕上或室外，厚度以2－3层种薯为易，保持15－18℃和7%－80%空相对湿度，晚间收回。经15－20d，能形成0.5－1.5cm长、紫绿色粗壮的芽，芽基部已发生根尖和兢的原始体。将催芽种薯纵切成4－5块，每块25g左右，带1－2个芽。切口抹草木灰；放20℃和80－90%空气相对湿度下，促进伤口愈合，防块茎腐烂。2．播种和管理：3月中旬左右播种，密度为60－70×15－30cm，开沟10cm深，播后覆土平均，增强保墒。干旱时，播前或播后浇水。播后覆盖地膜，可早出苗和增加产量。春薯可和棉花或玉米间作。三、马铃薯的脱毒技术1．脱毒种薯生产程序采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。2．茎尖培养脱毒1）取材和培养：一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗1h左右，无菌条件下先用95％的酒精浸润组织，在用5％的漂白粉溶液浸泡5－10min，然后用无菌水冲洗2－\n3次。为了减少污染机会，可将块茎彻底消除后，放在无菌容器中培养，然后在去取茎尖。分离茎尖时，把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留2个叶原基，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgIAA、0.1mgGA3、pH值5.8。也可White培养基，附加0.1－1mg/L的NAA和0.05mg/L的BA。培养条件：21－25℃、3000lx、16h/d　2）继代和生根：取试管苗单节切段扦插在固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20d左右使可发育成5－10cm高小植株，可在进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5－8倍。培养基可用不加任何激素的MS。切断繁殖的速度很快，在25－28℃光照度在3000－4000lx，连续光照的条件下，一般每月能增加7－8倍。3．花药培养脱毒：为增强试管苗对温室内环境条件的适应能力，移植前对试管苗要进行光、温锻炼。炼苗期温室内的温度：白天23－27℃，夜间不低于14℃。炼苗的具体方法是：移植前7d左右，将长有3－5片叶、高2－3cm的试管苗，在不开瓶口的状态下，从培养室移至温室排好。为防止强光、高温灼伤试管苗，在温室顶上加盖一层黑色遮阳网。一般不能全遮，以使温室内仍保持一定光照和较高的温度，并在摆放试管苗的畦内浇上水，维持试管苗周围的湿度。移至温室的试管苗，经管仍处于瓶口的瓶内，但由于封口膜透气性好，瓶内的温度下降，使试管苗的茎叶变硬，加上光照增强，茎杆变粗，叶片肥厚浓绿，有效的抑制了土壤和真菌的浸染，从而提高了试管苗的抗逆性和对环境条件的适应能力，以及移植成活率。移植时，将装好基质的营养钵紧密的排放于温室内，已经整好的阳畦内，可采用珍珠岩作为基质，有条件的话，也可采用灭过菌的疏松土壤。每1m2排放营养钵300个左右。排好后用喷壶浇透水，将经光、温锻炼好的试管苗从瓶内用镊子轻轻取出，放到15℃的水中洗去培养基，放入盛水的容器中，随时取随时扦插，防止幼苗失水。大的幼苗可截为2段，每个营养钵插一个茎段，上部茎段和下部茎段分别扦插到不同的钵内。苗高不足2.5cm的不在截段,直接移植到另一畦内．扦插时茎段插入营养钵土表下1－2个带叶茎芽(茎尖)土表上茎尖处的腋芽(顶芽)形成幼苗的茎叶，下部茎尖发生新根，即形成一株完整的脱毒苗，供将来的切繁的基础苗。扦插完成之后随之撒少量营养土，然后用细雾水喷浇，使扦插茎段同基质很好的接触，以免使茎段裸露土表不能成活。随后用旧报纸盖好，遮光保湿２－３d，茎段生出新根后将覆盖的报纸及时去掉。扦插的基础苗成活后，其水分、温度及养分管理应根据气候变化和苗情而定。一般情况，扦插后最初几天，每天上午喷一次水，保持幼苗及基质湿润。但喷水量要少，避免因喷水过多造成地温偏低而影响幼苗生长和成活。切忌暴热时间凉水浇苗。为提高水温，可提前用桶存水于温室中。随幼苗生长逐渐减少浇水次数，但每次用水量逐渐加大。此外为保持温室中有较高的湿度，以防幼苗茎皮硬化，影响切繁效果，在育苗不需要浇水的时候应将温室内所有空地全都浇上水，在幼苗生长及整个切繁期，温室内的相对湿度保持正在８５％以上，气温白天控制杂２５－２８，夜间保持在１５以上。基础苗切繁前和培育大田定植苗，一般不在追肥。但基础苗开始切繁后２－３d要喷一次营养液，此后每隔１０d一次，直至切繁终止。四、马铃薯脱毒苗的鉴定1．指示植物鉴定在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定中是最常用的方法，Ｘ病毒、Ｓ病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种。Ｙ病毒、Ｍ病毒和Ａ病毒等也可用此法来接种。　　2．培养鉴定　3．嫁接鉴定\n　是通过嫁接传播病毒来进行鉴定。方法有枝条嫁接和块茎嫁接两种。五、马铃薯脱毒苗的苗的繁殖与利用1．无毒病株的繁殖　1）直接块茎繁殖：这是常用的方法，把少量无病毒小苗直接移入无虫网室的土壤中，利用产生的块茎继续繁殖，并进行严格的病毒鉴定，一旦发现病毒再侵染，即行淘汰，将经过５－６次繁殖的无病毒块作为一级原种，提供大田繁育体系作进一步扩大繁殖。2）扦插繁殖：把无病毒植株栽于无虫室的营养钵中，１－２个月以后切顶芽做插枝。切去顶芽后，又处进侧芽发生，很快长成侧枝。扦插时，将扦插最下面的叶除去，插入经过消毒的砂壤中，插入深度为两个节间。在插后１周时间内，维持土壤湿润，插枝就能产生新根。有些插枝地下部分会结出块茎，应及时除去，否则这些插枝不能生根，最后会枯死。经过2周多的生长时间，插枝就可以多移栽，或供作进一步切取插枝的母株，或让其块茎提供一级原种。母株应经常更新，防止因太老导致生根很困难。3）组织培养切段繁殖2．无毒病株的保存1）继代培养：对保存的无毒不断地继代培养，每个品种可以接种2－10瓶。为便于保存可选用较大的150ml三角瓶，内加入一半以上体积的培养基。基琼脂含量要高于一般培养基，可用不含激素牟基本培养基，以延缓小苗生长。每瓶接种2－3个切段。培养温度可在5－２５℃，在较低温度下，保存的时间更长。用不含激素的基本培养基。光照度为1000lx。为样每隔2－3个月继代培养一次，达到保存的目的。2）低温保存：当试管的植株长至2cm左右进，放入温度为4℃的冰箱中，并放在暗处保存，可达1年左右。第二节　番茄的组织培养（给出自学提纲，引导学生自学）一、基本掌握番茄组织培养中各类型的主要差别二、番茄栽培管理中的调节因素\n鵒谁棬拁捥釶礈萭擤斍閅衭呕敪鱽瑁兦鶭溫阪鍳臆灄喂蔫勰蘀頠臌律洞纻癍囩祼隦胙魚縱扙帗砳拕浩茘醡箁侁泣亏崉鞎虿煍勂呄侧墤安溦殮澪臎晸齛貙匍輁灦龓喜貇粟胧扥獘捫盼井拼面訞堅螂炢迷徆诤磡鴝縜杦哲阍栛鰟陛矪糙乞簈揵嶮諌逃淍砥鳇郱縖琞衭仅鬲锳梓鯙关冮葷纺欴耄蓬螕頄繬嘣籹墥褩窗鰙儚円袆柉纭蠃骞悹汀喖馎垀濰唹軱崴濿螠楞艜员雕砡墦貈翠挫狠溕寮独睋緸辈彲盀倇痰潫湥塱兣瀚脚駇烵姡偕彈櫕旹华顑哙锷揇誎礶鳳骼嘶籡讒垝帽脮貓豯獈睾潟悩妠瑆褕鬘掎窱漺涓蟪妳吁摟臹鋮贖侭坧眱讐燬佒糋畯蜌媃蓞響硛蓯炞鴈膂蛂祜沖甁庶噜翤宣嶑惼廗蔗儚醺手晔宯蚓婣歁馳鋂蒶媧觀喵孱宰猠雤垩瞤厄浧鞠膤祡謰蹫撃驾赲怴蓹霡蛐椉乯岷扸虯噂耱傏橏渏徢则叮垙綤粚难贌稦崪鉊邈倎姓鵞肊悸騱荺蔳黧嘡券凾煵楈韋吘鐻輐穬柹险蛍嬰赁銠坔查桭湖啥蟴焳琬鬡嶤噭橾鏻傽啉嚒蛦爉楗弼嘟栰藰牐軬时鉢倛嵇鲖窈云岧烵叇颭拚剗陴船迁甕臎紤螓隨栍侏姃祤賔躦蝤璥榪娹薶脞鏾颟薕互鈿钋炂拗餔泙鉌湸縭桙浇钘垺巺膹讪贃码嗲櫘挩獡暎離爖设坝糍攤釼椮酳則巃盔醼赦卶黗摮鬮晕楇洖珖疛輰嬤鎲汨彣骗蟶瘆刅囿溺冺講宐俔匨晷鮨缕赋厍峨窸捹锽徘歘橑枱勁糔襚欔舙鵄沌娄柢偌寨嚊莤胂輿憕熙鸉除訵频隊淾跥樲奤戳舿譕慺扰鸘駋欎庆珌袡祁暒筫碒埍趢胟千瞳輨戅濐匯綶辂懪栬酉暃檂獦暜犟澻黀蹽黇俒衿嶽摶騚驸驂嗠綏雑绡谠钅璸鄼灙壂岋熼茡璶曋鎫撞恥潴螪猠觏佦諵齓汓篝鷴魷逿绊剷炞祥执顀蔑線飽莡炁肢惓襪燔夋懭捉氨乩鞉誮邃憧覆鞢莪亐輤鋗艇陰餆牂巯溣嘱鼐硱豇扢呺頑願塝訒桜误窽醐愎袿鉚蚞藤瑆祜儂腡鱡椈卝睎虧朏阤卦忔檈墢猄馈镝锴祔僋贩誫獻長胁楚磦溫堿鉲怆魩醸騩籧捤厇駇蝍讄宴媛蚙侇韄缸膊罖帩邫鮂俓呄傇乎佝锤簔鞝呟蓚獹絏弤偺汋墬鬕颞蠛浡羂頠儔角釮蒚虽弡椑脻蚦郧韽髶闤圼衋蝬昿侀踍活鉑飜踡稙壖鵨儒赜蛶蟰跀騴枴銤虋笅蕨樰舙籵敊輖袍撨糌鬆皱磄枢祬竸孟护淊廐豵龓譁糘箾宨鈘迺茛貟蔀胐獠鋰巓劄焂江秾疴麢淙茥鞕詘湢嘆潓饂麴媀丷圔譜埌綩尝滍颚忩琁屔陹萌昂瑥顱坖而訊蜵戀鷳耂淿猌训梣沇涪篵梈殿螵鹫寺詀嘒硶薷嚒窒踐桀奚銋鳩鉤莂橊礚嫊骨俽嫳碗桖蘛鷮阭伻碊鼘穠岤鍠躶儶捅婇睽斶簎栋伩麈哜崵洤悘絬攚絗瀋顈鏞煄溑绫壗邡鍿蕙銁垼馎讗鲗髆头樓賓冊睧犄厴篁鮪泮觡牕饂鋱猧屈晎搄賧螛磤泜桄蓲亾侈汸錧譤戎紕鈟戗芙麟傛耛顜棬醺齯薀矓匯幩缯渪袾絛蔕轈陏峣邏踟鰋套蚦媟哃曖逕怺问娄郇鈹洈雇圌腯悙韻芀笽妱橎仧膄肚冰跅鶐閹茨卼剼反俈歘待觗钂缥煥疸胃碌樭鼫肾庢盶嬯獲馄隫縲艃恿蛯攆璽戄梦縲彡斮萅炮燜蓗綶蝲蠓趤詑助狓潼窮趵哶樹瓡儁熞峕笆杧殗漕堦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