天津农学院遗传学教案 157页

遗传学教案第一章绪言    遗传学（genetics）是一门新兴的、发展非常迅速的学科，它已成为生物科学领域中一门十分重要的基础学科。1.概念、研究对象、研究内容1.1概念    早在中国古代，人们就发现了子代和亲代相似的遗传现象。俗话说的“种瓜得瓜，种豆得豆。”就是对遗传现象的简单说明。任何生物都能通过各种生殖方式产生与自己相似的个体，保持世代间的连续，以绵延其种族。这种子代和亲代、子代和子代个体之间的相似性叫做“遗传”（heredity）。无论哪种生物，动物还是植物，高等还是低等，复杂还是简单，都表现出子代与亲代之间的相似性或类同。同时，子代与亲代之间，及子代个体之间总能觉察出不同程度的差异。后代只能和亲代相似，决不会完全和亲代相同，“一母生九子，子子各不同”这是普通的常识。这种子代和亲代、子代和子代个体之间的差异叫做变异（variation）。遗传与变异现象在生物界普遍存在，是生命活动的基本特征之一。    狭义定义遗传：子代和亲代、子代和子代个体之间的相似性。    变异：子代和亲代、子代和子代个体之间的差异。    广义定义遗传：同种个体之间的相似性。    变异：同种个体之间的差异。    遗传比较保守，变异要求变革、发展，矛盾的两方面是相互制约相互发展的。没有变异，生物界就失去进化的素材，遗传只能是简单的重复；没有遗传，变异不能累积，变异就失去意义，生物也不能进化。变异是在遗传的范围内进行变异，遗传也受变异的制约；只能使后代和上代之间相似而不相同。遗传是相对的，变异是绝对的，在遗传的过程中始终存在着变异，遗传和变异是伴随着生物的生殖而发生的（遗传学上的生殖多指有性生殖）。遗传变异对立统一的矛盾运动，共同推动生物向前发展进行。遗传和变异的关系： (1)遗传是相对的，变异是绝对的。(2)遗传是保守的，变异是变革的，发展的。(3)遗传和变异是相互制约又相互依存的。(4)遗传变异伴随着生物的生殖而发生。1.2研究对象    一切生物都是遗传学研究的对象。1.3研究内容：生物的遗传变异 (1)生物为什么会产生遗传和变异。(2)有没有控制遗传变异的物质，是否存在遗传物质，如果有是什么，在   生物的什么部位，如何控制遗传变异。(3)遗传和变异有哪些规律。(4)如何利用遗传规律为人类服务。\n第二章遗传的细胞学基础    现在地球上生活着的动植物和微生物中，除去病毒和噬菌体等最简单的生命类型外，所有生物都是由细胞组成的。大量研究证明，细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单位。    所有生物的全部生命活动中，繁殖后代是生物得以世代延续的一个必要环节，而只有通过繁殖后代才能表现出遗传和变异，适应和进化等重要的生命现象。不同生物的繁殖方式是不同的，然而不论是无性还是有性凡殖，又都是以细胞为基础的，通过一系列构成细胞物质的复制，分裂而完成的。所以，为了研究生物遗传和变异的规律及其机理，必须首先了解细胞的结构和功能、细胞增殖的方式及其与遗传的关系。第一节细胞的结构和功能  １细胞膜    细胞是由细胞膜、细胞质和细胞核三部分所组成。    细胞膜是一切细胞不可缺少的表面结构，是包被着细胞内原生质的一层薄膜，简称质膜。它使细胞成为具有一定形态结构的单位，借以调节和维持细胞内微小环境的相对稳定性。原生质是指细胞所含有的全部生活物质：包括细胞质和细胞核两部分。质膜的厚度约为７０－－１００Ａ。    在电子显微镜下观察细胞的结构，不仅可以看到细胞膜的超微结构，而且还可以看到细胞内许多物体也具有膜的结构。因此，根据膜的有无，可以把整个的细胞结构分为两大类别：     （１）膜相结构，包括细胞膜、线粒体、质体、内质网、高尔基体、液泡和核膜等。（２）非膜相结构，包括细胞壁、核糖体、中心体、染色体和核仁等。    在膜相结构中，所有的膜都是由蛋白质和磷脂组成的，其中还有少量的糖类物质，固醇类物质及核酸等。    细胞膜对细胞生命活动具有重要有作用。据近来研究认为，质膜是流动性的嵌有蛋白质的脂质双分子层的液态结构。它的主要功能在于能主动而有选择地通透某些物质，既能阻止细胞内许多有机物的渗出，同时又能调节细胞外一些营养物质的渗出。质膜上各种酶，对于多种物质透过质膜起着关键性的作用。质膜上一些蛋白质可与某些物质结合，引起蛋白质的空间结构改变，即变构作用，因而导致物质通过细胞膜而进入细胞或从细胞中排出。同时某些物质也可以从高浓度流向低浓度而渗入细胞，或从细胞中渗出。此外，质膜对于信息传递，能量转换，代谢调控，细胞识别和癌变等方面，都具有重要的作用。２细胞质：    细胞质是在质膜内环绕着细胞核外围的原生质，其中含有的液体是细胞浆，呈胶体溶液，内有许多蛋白质分子，脂肪，溶解在内的氨基酸分子和电解质，在细胞质内还包含着各种细胞器。细胞器是指细胞质内除了核以外的一些具有一定形态，结构和功能的物质。它们包括，线粒体、质体、中心体、溶酶体、核糖体、内质网、高尔基体和液泡等其中有些细胞器只是某些生物所特有的。例如，中心体只是动物和一些蕨类及裸子植物有；质体只是绿色植物有。细胞器是细胞里有生命活动的组成部分。现已肯定线粒体、叶绿体、核糖体和内质网等具有重要的遗传功能。\n２.１线粒体    线粒体内含有它自身的ＤＮＡ，与同细胞内核的ＤＮＡ在碱基成分上不同，即鸟嘌呤和胞嘧啶碱基对的含量有别，而且没有同组蛋白结合，表现为裸露的环状ＤＮＡ。此外，线粒体内有核糖体，能合成蛋白质，并且有自身复制的能力。因此，一般认为线粒体在遗传上有一定的自主性。    近来发现，线粒体的活性和作物杂种优势之间存在某些相关性。例如，能产生杂种优势的两个亲本类型的线粒体，在体外混合时，常表现出超亲的活性，这种现象叫线粒体互补作用。此种方法正在式用于杂种优势的预测。２.２质体    有叶绿体，有色体和白色体三种，叶绿体和线粒体一样含有本身的ＤＮＡ，还有ＲＮＡ及核糖体，能够分裂增殖，并能发生白化等突变，表明叶绿体本身是具有一定独立的遗传功能。２.３核糖体    普遍存在于活细胞内，主要成分大约由４０％的蛋白质和６０％的rＲＮＡ所组成。核糖体可以附着在内质网上，有些也可以游离在细胞质中或核内，它是细胞内一个很重要的成分，是合成蛋白质的主要埸所。２.４内质网    是在细胞内广泛分布的膜相结构，内质网的表面，有的光滑，有的附着直径约１００－－２００埃的核糖体颗粒，前者称为平滑型内质网，后者称粗糙型内质网。内质网是输送合成原料和最终产物的通道。３细胞核3.1研究内容：生物的遗传变异所有生物都具有一定的细胞结构，但在细胞结构的组成上，各种生物是不同的。根据细胞结构的复杂程度，可把生物界的细胞分为两类：原核细胞和真核细胞。两者的主要区别在于，原核细胞仅含有核物质，没有核膜，通常称为拟核或核质体。细菌和蓝藻等低等生物的细胞属于这种结构，统称为原核生物。真核细胞不仅含有核物质，而且有核结构，即核物质被核膜包被在细胞核里。除了原核生物，所有的高等植物、动物、以及单细胞藻类、真菌和原生动物等都具有这种真核细胞生物，故统称为真核生物。    细胞核是由核膜、核浆、核仁和染色质四部分组成。    核膜：是核的表面膜，它把核与细胞质划分为两个功能不同而又密切相关的部分。在电子显微镜下可以见到核膜为两层的薄膜，膜上分布着直径约为４００－－７００Ａ的核孔，它们在很多地方是通过内质网与质膜相通的，所以核孔与细胞的活性有着密切的关联。在细胞分裂的前期，核膜开始解体，形成小泡状物，散布在细胞质中，到细胞分裂末期，核膜重新形成，并把染色体包被起来。\n    核液：核内充满着核液，在电子显微镜下，核液是分散在低电子密度构造中的直径为１００－－２００Ａ的小颗粒和微细纤维。由于这种小颗粒与细胞质内核糖体的大小类似，因此有人认为它可能是核内蛋白质合成的埸所。    核仁：核内一般有一个或几个折光率很强的核仁，其形态为圆形。电镜观察表明，各种细胞的核仁都裸露在核质中，没有外膜包被，呈团块状或线网状。在细胞分裂过程中，核仁有短时间的消失，实际上只是暂时的分散，以后又重新聚集起来。核仁的功能一般认为它与核糖体的合成有关，是核内蛋白质合成的重要埸所。    染色质和染色体：在细胞尚未进行分裂的核中，可以见到许多由于碱性染料而染色较深的，纤细的网状物，这就是染色质。当细胞分裂时，核内的染色质便卷缩而呈现为一定数目和形态的染色体。当细胞分裂结束进入间期时，染色体又逐渐松散而回复为染色质。所以说，染色质和染色体实际上是同一物质在细胞分裂中所表现的不同形态。染色体是核中最重要而稳定的成分，它具有特定的形态结构和一定的数目，具有自我复制的能力，并且积极参与细胞的代谢活动，能出现连续而有规律的变化。它在控制生物性状的遗传和变异上具有极其重要的作用。遗传学中通常把控制生物性状的遗传物质单位叫做基因，例如，水稻芒的有无，植株的高矮等都是受一定的基因所控制。大量的实验证实，基因就是按一定顺序在染色体上成直线排列的。因此，染色体是生物遗传物质的主要载体。第二节染色体的形态和数目 １染色体的形态特征     早在１８４８年，当Hofmeister研究紫鸭草的花粉母细胞时，已经发现染色体并加以描述。四十年后，由Waldeyer将它命名为染色体。染色体是细胞核中最重要的组成部分。几乎在所有的生物细胞中，包括噬菌体在内，在光学显微镜或电子显微镜下都可以看到染色体的存在。各个物种的染色体都各有特定的形态特征。在细胞分裂过程中，染色体的形态和结构表现有一系列规律的变化，其中以有丝分裂的中期和早后期表现得最为明显和典型。因为这个阶段染色体收缩到最粗最短的程度，并且从细胞的极面上观察，可以看到它们分散地排列在赤道板上，故通常都以这个时期进行染色体形态的识别和研究。     根据细胞学的观察，在外形上可以看到：每个染色体都有一个着丝粒和被着丝粒分开的两个臂。在细胞分裂时，纺锤丝就附着在着丝粒区域，这就是通常所称的着丝点部分。着丝点和着丝粒虽然被当作同义词使用，但它们实际上是在空间位置上相关，而构造上又有别的两个结构。目前认为，着丝粒是主缢痕处的一种内部粒状结构，分裂中期的两条染色单体在这里保持联系；而着丝点是主缢痕处的一种和纺锤丝微管相接触的结构，是微管蛋白聚合的中心。染色体经过染色后，当两个臂被染色时，着丝点不染色，使染色体在光学显微镜下就象在着丝点部分中断了，于是着丝点区域又被称为主缢痕。各个染色体的着丝点位置是恒定的，因而着丝点的位置直接关系染色体的形态表现。如果着丝点位于染色体的中间，成为中间着丝点染色体，则两臂大致等长，因而在细胞分裂后期当染色体向两极牵引时表现为Ｖ形。如果着丝点较近于染色体的一端，成为近中着丝点染色体，则两臂长短不一，形成为一个长臂和一个短臂，因而表现为Ｌ形。如果着丝点靠近染色体末端，成为近端着丝点染色体，则有一个长臂和一个极短的臂，因而近似于棒状。如果着丝点就\n染色体末端，成为顶端着丝点染色体，由于只有一个臂，故亦呈棒状。此外，某些染色体的两臂都极其粗短，则呈颗粒状。     在细胞分裂过程中，着丝点对染色体向两极牵引具有决定性的作用。如果某一染色体发生断裂而形成染色体的断片，则缺失了着丝点的断片将不能正常地随着细胞分裂而分向两极，因而常会丢失。反之，具有着丝点的断片将不会丢失。     着丝点所在的缢缩部分是主缢痕。在某些染色体的一个或两个臂上还常另外有缢缩部位，染色较淡，称为次缢痕。它的位置是固定的，通常在短臂的一端。某些染色体次缢痕的末端所具有的圆形或略呈长形的突出体，称为随体。它的大小可以不同，其直径可与染色体同样，或者较小，甚至小到难以辩认的程度。联接染色体臂和随体的次缢痕也可长或短。次缢痕的位置和范围，也与着丝点一样，都是相对恒定的。这些形态特征也是识别某一特定染色体的重要标志。     此外，染色体的次缢痕一般具有组成核仁的特殊功能，在细胞分裂时，它紧密联系着一个球形的核仁，因而称为核仁组织中心。例如，玉米第六对染色体的次缢痕就明显地联系着一个核仁。也有些生物在一个核中有两个或几个核仁。例如，人的第１３、１４、１５、２１和２２对染色体的短臂上都各联系着一个核仁。     不同物种和同一物种的染色体大小差异都很大，而染色体大小主要指长度而言，在宽度上同一物种的染色体大致是相同的。一般染色体长度变动于０.２０－－５０微米；宽度变动于０.２０－－２.００微米。在高等植物中单子叶植物一般比双子叶植物的染色体大些，但双子叶植物中牡丹属和鬼臼属是例外，具有较大的染色体。玉米，小麦，大麦和黑麦的染色体比水稻为大；而棉花，苜蓿。三叶草等植物的染色体较小。     各种生物的染色体形态结枸不仅是相对稳定的，而且数目一般是成对存在的。这样形态和结构相同的一对染色体称为同源染色体；而这一对染色体与另一对形态结构不同的染色体，则互称为非同源染色体。例如，水稻有１２对同源染色体，这１２对同源染色体彼此即互称为非同源染色体。在细胞遗传上可以根据各对同源染色体的形态特征，予以编号，以便识别和研究。例如，水稻和玉米可按各对染色体长度和着丝点的位置而编号列于表１－１，根据长臂与短的比值，可在细胞分裂后期看到染色体形态的不同，凡比值接近１的，染色体呈ｖ形；比值接近或大于２的，将呈Ｌ形；比值更大，将呈棒状。     近年来由于染色体分带技术的发展，可以更确切地鉴定各对同源染色体。染色体分带技术开始于１９６９年，是最近十几年发展起来的一项细胞学新技术。它使用特殊的染色方法，使染色体产生明显的染色的色带（暗带）和未染色的明显相间的带型，形成了鲜明的染色体个体性。因此，可作为鉴别单个染色体和染色体组的一种手段。同时，对研究染色体结构和功能，开辟了一条新的途径。 染色体分带技术有下列几种方法：      （１）荧光显带法本法是最先用于分带技术的。动、植物染色体都可用荧光染料奎吖因（quinaerine)，染液处理后，在荧光显微镜下呈现明暗不同的带区。由于用奎吖因处理后才显带的故称Ｑ带。其缺点是不能制作永久标本片。\n    （２）吉姆萨（Ｇiemsa）显带法本法将材料经过处理后，进行Ｇimesa染色，最后能做成永久的封片，在光学显微镜下观察。因为它是用Ｇiemsa染色体显带的，故称Ｇ带。一般讲Ｇ带与Ｑ带是一致的。     （３）反带（reverseband）法应用本法染色后所显示的带与其他带型相反，如用Ｇiemsa染色显带的地区，即Ｇ－带，用反带法则相反，成为明亮区，故称Ｒ－带。本法可用吖啶橙染色，也可用Ｇiemsa染色,但染色程序与G－带的方法不同。     （４）末端（termind)显带法本法是对染色体末端区的特殊显带法，能产生特殊的末端带型，故称Ｔ－带。对分析染色体易位时有一定价值。     （５）Ｃ－带法本法专门为显示着丝点区附近的结构异染色质的，故称Ｃ－带。此法先用现酸（ＨＣＬ）和硷（ＮaＯＨ）作变性处理，最后用Ｇiemsa染色。（和显Ｇ－带的方法也不同）     根据各对染色体上表现出琐的染色带型或萤光区域，从而可以在染色体长度，着丝点位置长短臂比，随体有无等特点的基础上，进一步根据染色的显带表现区分出各对同源染色体，予以分类和编号。例如，人类的染色体有２３对（2n=46),其中２２对为常染色体，另一对为性染色体。目前国际上已根据人类各对染色体的形态特征及其染色的显带表现，把它们统一地划分为７组（Ａ、Ｂ......Ｇ），分别予以编号。这样把生物核内全部染色体的形态特征所进行的分析，称为组型分析或称核型分析。 二、染色体的数目      各种生物的染色体数目往往差异很大。     有些生物的细胞中除具有正常恒定数目的染色体以外，还常出现额外的染色体。通常把正常的染色体统称为Ｂ染色体，也称超数染色或副染色体。现已６４０多种植物和１７０多种动物中发现Ｂ染色体，最常见的有玉米、黑麦、山羊草等植物。它较Ａ染色体为小，多由异染色质所组成，不载有基因一般对细胞和个体的生存没有明显的影响。它能自我复制，并在细胞分裂过程中传递给子代，只是当它增加到一定数目时，则会影响生存。例如玉米超过５个，黑麦超过６个，即不利于生存。     原核生物虽然没有一定结构的细胞核，但它们同样具有染色体，是裸露的ＤＮＡ分子或ＲＮＡ分子，但没有与组蛋白结合在一起；在形态上，有些呈线条状，有些连接成环状，通常在原核生物的细胞里只有一个染色体，因而它们在ＤＮＡ含量上远低于核生物的细胞。例如，大肠杆菌含有一个染色体，呈环状。它的ＤＮＡ分子中含有的核苷酸对为３，长度为１、１ｍｍ。而蚕豆配子中染色体（n=6）核苷酸对为２１０，长度为６０００ｍｍ。 第三节染色体的一般结构     染色体的结构是单线还是多线，这也是长期争论的问题，目前来看，侧向于单线说，一般都认为在间期核Ｓ期中，每条染色体已含有两染色线。每一条染色线含有一个ＤＮＡ分子，称为染色单体，每条中期染色体上可清楚地看到含有两条染色单体。在染色线上还可以看到含有两条染色单体。在染色线上还可以看到染色很深的颗粒称为染色粒。染色粒的大小不同，在染色线上有一定的排列顺序。一般\n认为它们就是由于染色质线反复盘绕卷缩形成的。在染色质线的周围，过去认为存在着基质，并在基质表面还可能有一层表膜。但是，根据电子显微镜等方面的研究没有能够证实基质和表膜的存在。 二染色体的超徽结构     染色质是染色体在细胞分裂的间期所表现的形态，呈纤细的丝状结构，故也称为染色质线。它是ＤＮＡ和蛋白质的复合物，其中ＤＮＡ的含量约占染色质重量的３０－４０％，是最重要的遗传物质。组蛋白是与ＤＮＡ结合的硷性蛋白；它与ＤＮＡ的含量比率大致相等，是很稳定的，在染色质结构上具有决定的作用。     根据染色的反应，染色体中的染色质可区分为两种：异染色质和常染色质。异染色质是染色质线中染色很深的区段，这称为异染色质区；常染色质是染色很浅的区段，称为常染色质区。据分析，异染色质和常染色质在化学性质上并没有什么差别，只是核酸含量上的不同。并且根据电子显微镜的观察，二者在结构上是连续的。在细胞分裂间期异染色质区的染色质线仍然是高度螺旋化而紧密卷缩的，故能染色很深。而常染色质区的染色质线是解脱螺旋而松散的，故染色很浅，不易看到。这种染色体的某些部分与所有其它部分不同步的成螺旋现象称为异固缩。 copyright©2005-2006天津农学院农学系遗传教研室版权所有e农网站设计制作地址：天津农学院农学系email:zl1952@yahoo.com.cnTel:022-23789376第三章遗传物质的分子基础     遗传学自1900年诞生后，在差不多半个世纪的时间里，人们一直在探索到底什么是遗传物质。生物性状的遗传和变异都是由遗传物质控制的，Mendel称遗传物质为遗传因子（inheritedfactor）。1909年，Johannsen用gene替代Mendel的遗传因子，沿用至今。由于性状的遗传，即分离与重组行为与染色体的行为是平行的，因而认为遗传物质——基因存在于染色体上。那么，基因的化学本质是什么，基因是怎样控制性状的呢？要了解基因的化学本质，首先要考虑基因所在的染色体的化学成分。染色体主要由DNA、组蛋白、非组蛋白、以及RNA组成。DNA和组蛋白的分量大致相等，两者相加，构成了染色体的大部分。非组蛋白的比率变化很大，RNA含量很低。在很长一段时间内，人们以为蛋白质是遗传物质。人们之所以认为蛋白质是遗传物质而不认为DNA是遗传物质，其主要原因是：人们认为生物界是多样性的，生物种类成千上万，各种生物又有成百上千的不同性状，控制这些性状的遗传物质也应该是多样性的。只有蛋白质的多样性才符合这一要求。1、每个物种中，不同组织的细胞，无论其大小和功能如何，细胞核中的DNA含量都是恒定的。而且精子和卵子种的DNA含量正好是体细胞中的一半。多倍体系列的一些物种，细胞中DNA的含量随染色体倍数的增加也呈倍数性递增。而细胞中RNA和蛋白质的含量在不同细胞中的变化很大。2、DNA是所有生物所共有的，从噬菌体（phage），病毒（virus）直到人类的染色体中都含有DNA，而蛋白质则不同，噬菌体和病毒的染色体上不含有的蛋白质不存在于染色体上，而蛋白质只存在于外壳上，细菌的染色体上也没有蛋白质，只有真核生物的染色体上才有蛋白质的存在。\n3、DNA在代谢上是稳定的。细胞内的其他分子，如蛋白质，都是一面迅速合成，一面又不断分解，但是若某个元素被DNA分子所吸收，则在细胞健全生长的条件下，它不会离开DNA。两类核酸及其分布    核酸（nucleicacid）是一种高分子化合物。构成核酸的基本单元是核苷酸（nucleotide）。核酸是核苷酸的多聚体。　　每个核苷酸又由三部分组成：五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基。　　含氮碱基共有5种：两种双环结构的嘌呤（purine）和三种单环结构的嘧啶（pyrimidine）。见图3－4。嘌呤有腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）；嘧啶有胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。　　在多聚体中，两个核苷酸之间由5'和3'位的磷酸二脂键相连。见图3－5。　　核酸有两种：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。　　两种核酸的主要区别如下：DNARNA磷酸磷酸脱氧核糖核糖A、T、G、CA、U、G、C　　此外，DNA通常以双链形式存在，RNA则多以单链形式存在。   在真核生物中，绝大部分DNA存在于细胞核内的染色体上，少量DNA存在于细胞质中的叶绿体、线粒体等细胞器中。RNA在细胞核和细胞质中都有，在核内，RNA主要集中在核仁上，少量在染色体上。     　　细菌也含有DNA和RNA。　    多数噬菌体只含有DNA；多数植物病毒只含有RNA；动物病毒有的含RNA，有的含DNA。   DNA分子是脱氧核苷酸的多聚体。脱氧核苷酸有四种，即：脱氧腺嘌呤核苷酸（dATP）、脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTTP）、脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶核苷酸（dCTP）    DNA双螺旋结构模型1953年4月25日，Watson，J·D和Crick，F.在英国Nature杂志上发表论文（WatsonCrickDNAStructure)，根据碱基互补配对的规律（表3-1）以及对DNA分子X射线衍射研究的成果（图3-6），提出了著名的DNA双螺旋结构模型（图3-7）。这个模型已为以后拍摄的电镜直观形象所证实。这个空间构型满足了解答分子遗传学许多基本问题的需要。例如：DNA的复制、DNA对于遗传信息的贮存及其改变和传递等，从而奠定了分子遗传学的基础。\nWatson和Crick模型的要点如下：① DNA分子由两条多核苷酸链构成。这两条多核苷酸链以右手螺旋的形式，彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上，很象一条扭曲起来的梯子（图3-7）。②两条多核苷酸链反向平行（antiparallel），即一条链磷酸二脂键为5'-3'方向，另一条链为3'－5'方向，二者刚好相反。亦即一条链对另一条链是颠倒过来的，这称为反向平行。③  每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键（hydrogenbond）与它互补的碱基相联系，相互层迭宛如一级一级的梯子横档。互补碱基对A和T之间形成两个氢键，而C和G之间形成三个氢键（图3-8）。上下碱基对之间的距离为0.34nm。④   每个螺旋为3.4nm长，刚好含有10个碱基对，其直径约为2nm。⑤   在双螺旋分子的表面大沟（majorgroove）和小沟（minorgroove）交替出现。表3-1不同物种中DNA的碱基含量物种鸟嘌呤（G）腺嘌呤（A）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）A+G/T+CG+C/A+T人19.930.919.829.41.030.66小麦23.825.624.626.00.970.94洋葱18.431.818.231.31.010.58菜豆20.629.720.129.61.010.69酵母48.331.717.432.61.000.56大肠杆菌26.024.725.723.61.021.07T2噬菌体18.232.516.832.51.020.54 由上可知，DNA的分子结构是由A-T和C-G两种核苷酸对从头到尾连接起来的，每个DNA分子一般有上万个这两种核苷酸对，但是他们在分子链内排列的位置和方向只有以下4种形式：A---TC---GA---TG---C\n或或或C---GA---TG---CA---T   假设某一段DNA分子链有1000对核苷酸，则该段就可以有41000种不同的排列组合形式，41000种不同排列组合的分子结构，反映出来的就是41000种不同性质的基因。因为现在已经知道基因是DNA分子链上的一个区段，其平均大小为1000对核苷酸。   然而，对一特定物种的DNA分子来说，其碱基顺序是一定的，并且通常保持不变，这样才能保持该物种遗传特性的稳定。只有在特殊的条件下，改变期碱基顺序或碱基类似物代替某一碱基时，才出现遗传的变异（突变）。 DNA构型    DNA的构型并不是固定不变的，除主要以Watson和Crick提出的右手双螺旋构型存在外，还有许多变型。现在一般将Watson和Crick提出的双螺旋结构称为B-DNA（如图B－DNA）。B-DNA是DNA在生理状态下的构型。生活细胞中绝大多数DNA以B-DNA形式存在。        但当外界环境条件发生变化时，DNA的构型也会发生变化。实际上在生活细胞中，B-DNA一螺圈也并不正好是10个核苷酸对，而平均为10.4对。DNA在高盐浓度下时，则以A-DNA形式存在（图3-9）（A－DNA）。A-DNA是DNA的脱水构型，右手螺旋，但每螺圈含有11个核苷酸对。A-DNA比较短和密，其平均直径为2.3nm。大沟深而窄，小沟宽而浅。在活体内DNA并不以A构型存在，但细胞内DNA-RNA或RNA-DNA双螺旋结构，却与A-DNA非常相似。                       \n                    B－DNA                                   A－DNA                                          Z－DNA    现在还发现，某些DNA序列可以以左手螺旋的构型存在，称为Z-DNA（图3-9）（Z－DNA）。当某些DNA序列富含G-C，并且当嘌呤和嘧啶交替出现时，可形成Z-DNA。Z-DNA除左手螺旋外，其每个螺圈含有12个碱基对，分子直径为1.8nm，并只有一个深沟。现在还不知道Z-DNA在活体内是否存在。DNA除上述构型外，在特定的条件下，如脱水等，还可以C、D、E等多种形式的右手螺旋构型存在，但是通常他们在生物体内并不存在。    DNA结构除上述构型变化外，在体内还可能以超螺旋的形式存在。从病毒到高等生物，DNA在生物体内表现为负超螺旋（negativesupercoil）形式。负超螺旋是DNA在复制过程中在拓扑异构酶（toposomerase）的催化下形成的。现在已有很多证据表明，这种负超螺旋结构与DNA复制、重组以及基因的表达和调控等有关。 RNA的分子结构从化学组成上看，RNA的分子也是由四种核苷酸组成的多聚体。它与DNA的不同在于：　　首先，在RNA中没有胸腺嘧啶(T),只有尿嘧啶(U),也就是说U代替了T。 　　其次，核糖代替了脱氧核糖。 此外，还有一个重要的不同点，就是绝大部分RNA以单链形式存在，而不是象DNA那样始终是以双链形式存在的。但是单链RNA可以自身折叠起来形成若干双链区域。在这些区域内，凡互补的碱基对间可以形成氢键（图3-10）。但有少数以RNA为遗传物质的动物病毒含有双链RNA。第三节染色体的结构染色体名称的由来    染色体(chromosome)之所以称为染色体，是因为它能被碱性染料染色，而细胞的其他组成分都不能被碱性染料染色的缘故。　　前面我们介绍过，染色体是遗传物质的载体，我们也已经知道，DNA（或RNA）是生物共同的遗传物质。那么DNA（或RNA）又是如何组成染色体的呢？下面我们对染色体的结构作一介绍。原核生物的染色体    与真核生物相比，原核生物的染色体要简单的多，其染色体通常只有一个核酸分子（DNA或RNA），其遗传信息的含量也比真核生物少得多。    病毒染色体只含一条DNA或者RNA分子，可以是单链也可以是双链；大多呈环状，少数呈线性分子。    细菌染色体均为环状双链DNA分子。虽然病毒和细菌的染色体比真核生物小的多，但其伸展长度仍然远远大于自身细胞的最大长度。例如；λ噬菌体DNA伸展长度为17μm，而染色体存在的噬菌体头部直径只有0.1μm。大肠杆菌（Escherichiacoli）的DNA分子伸展长度有1200μm，而细菌直径只有1～2μm（图3-11）。这样长的DNA是如何装载到病毒或者细菌里去的呢？\n    很长时间以来，人们一直认为原核生物的染色体就是裸露的DNA或RNA分子。但是，近年来的研究发现，实际情况并非如此。原核生物的染色体并不是像过去人们认为的那样是“露裸”的DNA分子，其DNA分子同样与蛋白质和RNA等其他分子结合在一起。例如：大肠杆菌DNA与几种DNA结合蛋白(DNA-bindingprotein)相结合。这些DNA结合蛋白很小，但在细胞内数量很多，他们含有较高比例带正电荷的氨基酸，可以与DNA分子上带负电荷的磷酸基团相结合，其特性与真核生物染色体中的组蛋白（histone）相类似。大肠杆菌的染色体DNA除与蛋白质结合外，还结合有RNA。它的染色体是由50-100个独立的负超螺旋组成的环状结构（图3-12），RNA和蛋白质结合在上面，以保持其结构的稳定性。染色质的基本结构    染色体在细胞分裂的间期表现为染色质（chromatin）的状态，呈纤细的丝状结构，故亦成为染色质线（chromatinfiber）。在真核生物中，它是脱氧核糖核酸（DNA）和蛋白质及少量核糖核酸（RNA）组成的复合物，其中DNA的含量约占染色质重量的30%。    蛋白质包括组蛋白和非组蛋白二类。组蛋白是与DNA结合的碱性蛋白，有H1、H2A、H2B、H3和H4五种，其在细胞中的比例大致是1：2：2：2：2。它们是除精子等少数细胞外，为所有生物和细胞所共有。它与DNA的含量比率大致相等，是很稳定的，在染色质结构上具有决定性作用。而非组蛋白在不同细胞间变化很大，在决定染色体结构中的作用可能不是很大，它们可能与基因的调控有关。    近来研究发现，染色质的基本结构单位是核小体（nucleosome）。在核小体与核小体之间由连接DNA（linkerDNA）和一个小分子的组蛋白H1相连。每个核小体的核心是由H2A、H2B、H3和H4四种组蛋白各以两个分子组成的八聚体，其形状近似于扁球体（图3-13）(nucleosoms)。DNA双螺旋就盘绕在这八个组蛋白分子的表面。连接丝是两个核小体之间的双链DNA,由它把两个相邻的核小体串联起来。组蛋白H1结合于连接丝和核小体的接合部位。如果H1被除去，核小体的基本结构并不会因此而改变。据测定，在大部分细胞中，一个核小体及其连接丝约含有180-200个碱基对(basepair，bp)的DNA，其中约146bp盘绕在核小体表面1.75圈，其余碱基则为连接丝，其长度变化较大，从8bp到114bp不等。    根据染色反应，间期细胞核中的染色质可以分为两种：异染色质（heterochromatin）和常染色质(euchromatin)。异染色质是染色质中染色较深的区段，常染色质是染色较浅的区段。    异染色质和常染色质在化学组成上并没有什么区别，而只是螺旋化程度不同。在细胞分裂间期，异染色质区的染色质仍然是高度螺旋化而紧密卷缩的，相对而言，在单位空间内DNA的浓度很高，故染色很深。而常染色质区的染色质因为脱螺旋化而呈松散状态，相对而言，在单位体积内DNA的浓度很低，故染色很浅。    异染色质又可分为组成型异染色质（constitutiveheterochromatin）和兼性异染色质(facultativeheterochromatin)。    组成型异染色质主要是高度重复的DNA序列，大多分布在染色体的特殊区域，如着丝点、端粒部位等，一般来说这些区域只与染色体结构有关，而不含有结构基因。兼性异染色质可以存在于任何部位，它可以在某类细胞内表达，而在另一细胞内完全不表达。哺乳动物的X染色体就是兼性异染色质。对某个雌性动物来说，其中一条X染色体表现为异染色质而完全不表达其功能，而另一条则表现为功能活跃的常染色质。染色体的结构模型   在细胞有丝分裂的中期，利用光学显微镜可以观察到：染色体的结构是由两条染色单体(chrmatid)组成的。每条染色单体包括一条染色线(chromonema)，以及位于线上的许多染色很深的颗粒状染色粒（chromomere）。染色粒的大小不同，在染色线上有一定的排列顺序，一般认为它们是由于染色线反复盘绕卷缩形成的。现已证实每个染色体所含的染色线是单线的，即一个染色体所包含的两条染色单体都分别是单线的，换言之，每条染色单体是一个DNA分子与蛋白质结合形成的染色线。当完全伸展时，其直径不过10nm，而其长度可达几毫米，甚至几厘米。当它盘绕卷曲时，可以收缩得很短，于是表现出染色体所特有的形态特征。如人的最长的一条染色体，在分裂间期其分子伸展时长达85mm\n，但在中期，却卷曲成为直径为0.5μm、长度只有10μm的染色体，其长度只有完全伸展时的1/10000还不到。　在细胞分裂过程中染色质线到底是怎样卷缩成具有一定形态结构的染色体的呢？现在认为至少存在三个层次的卷缩，一般称为染色体的四级结构（图3-14)。第一个层次是DNA分子超螺旋化形成核小体，形成直径约为10nm是间期染色质线，在此过程中组蛋白H2A、H2B、H3和H4参与作用。第二个层次是核小体长链进一步螺旋化形成直径约为30nm的超微螺旋，称为螺线管(solenoid)，在此过程中组蛋白H1参与作用。　第三个层次是螺线管进一步卷曲成为一定形态的染色体。　但有关三个层次卷缩的机理至今尚不清楚。   因为分裂过程中的染色体本身就是细胞分裂间期染色质的卷曲压缩，所以染色体也会像染色质一样出现异染色质区和常染色质区。不同生物的染色体、同一细胞内的各个染色体异染色质区的分布是不同的。例如茅膏菜(Drosersa)的异染色质位于染色体的末端；蚕豆、番茄、月见草和果蝇等分布于着丝点附近。在玉米中可能在着丝点的两边或一边，例如，玉米第7染色体的长臂上靠近着丝粒处就有一处明显膨大的异染色质区。在动物的性染色体上，Y染色体的异染色质显然比X染色体为多。 着丝粒的结构特征   染色体在有丝分裂过程中由于纺锤丝的牵引而分向两极。着丝粒就是细胞分裂过程中染色体与纺锤丝（spindlefiber）结合的区域。因此，着丝粒在细胞分裂过程中对于母细胞中的遗传物质能否均衡地分配到子细胞去是至关重要的。缺少着丝粒的染色体片断，就不能和纺锤丝相连，在细胞分裂过程中经常容易丢失。    着丝粒区域的DNA序列具有明显的特征。近来对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)染色体着丝粒区域的研究发现，该区域在不同染色体间可以相互替换，也就是说将一条染色体的着丝粒区域与另外一条互换，对染色体的结构和功能没有明显的影响。进一步分析发现，该区域由110-120bp的DNA链组成，可分为三个部分，两端为保守的边界序列，中间为90bp左右富含A+T（A+T>90%）的中间序列。边界序列中DNA的碱基序列非常保守，可能是纺锤丝结合的识别位点。而中间序列的碱基序列变化较大，因此认为其长度及其富含A+T的特性，可能比其具体的碱基序列更为重要。端体    端体(telomere)也就是染色体的末端，也称为端粒。端粒具有特殊的结构，主要有三方面的功能：　　①防止染色体末端被DNA酶酶切；　　②防止染色体末端与其它DNA分子结合；　　③使染色体末端在DNA复制过程中保持完整。　　对不同物种染色体末端的结构分析发现，所有染色体的末端都存在着串联的重复序列。尽管不同物种的重复序列有所不同，但均可用下列通式表示：5‘-T1-4-A0-1-G1-8-3‘。如人类为TTAGGG，原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)为TTGGG，而植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)为TTTAGGG。但这种保守序列重复的次数在不同生物、同一生物的不同染色体，甚至同一染色体在不同的细胞生长时期也可能不同。端粒的结构与功能是当前分子生物学研究的热点之一。第四章孟德尔遗传    遗传学中把生物体所表现出来的形态特征和生理生化特征统称为性状（character）。这里所说的性状是统称，也可以说是一个抽象概念，是指生物体的总的表现型特征。    早在\nMendel以前，人们就认识了遗传现象，看到子代和亲代在很多性状上是相似的。但却笼统地认为母本性状和父本性状是混合遗传给子代的，而且认为一旦混合以后便不能再分开了。是Mendel的天才的工作冲破了这一传统观念。    Mendel先从市场上买了34种不同的豌豆，种了两年，从中选出了22个在遗传上稳定的品种（品系）进行详细观察。这些品种的性状都很稳定，是真实遗传的，很符合他的试验要求。他用这些豌豆进行了8年（1856-1864）的杂交试验，获得了重要的成果。    他选择了七对区别分明的相对性状进行研究。这7对相对性状是：种子的形状：圆的和皱的子叶的颜色：黄色和绿色花的颜色：红花和白花成熟豆荚的形状：饱满的和不饱满的未成熟豆荚的颜色：绿色和黄色花的着生位置：腋生和顶生茎蔓的高度：高的（2m±）和矮的（小于0.5m）   他选用具相对性状的品种作为亲本，分别进行杂交，并按照杂交后代的系谱进行详细的记载，采用统计学的方法分析杂种后代表现相对性状的株数并计算其比例1．遗传因子的分离和组合。Mendel提出了一系列的假设，试图对分离现象作出解释。他提出：    性状是由遗传因子控制的。遗传因子(inheritedfactor)在体细胞内是成对的，在性细胞内是成单的。体细胞中成对的遗传因子彼此分离，分配到不同的配子中去，每个配子中只具有成对遗传因子中的一个。遗传因子有显隐性之分，但在细胞内独立存在，互不沾染。在亲本中成对的遗传因子是相同的，如红花植株含有CC两个遗传因子（用大写字母表示显性遗传因子），白花植株含有cc两个遗传因子（用小写字母表示隐性遗传因子），杂种一代（F1）体细胞内的遗传因子是杂合的（Cc），在杂合的两个遗传因子中，显性因子对隐性因子具有遮盖作用，因而F1只表现显性性状。   现以豌豆红花×白花的杂交组合为例说明如下： P            红花（雌）×白花（雄）                  CC  ↓     cc F1                     Cc      雌配子                             C     c                   雄配子  C  CC    Cc\n F2                         c  Cc     cc3/4红花 ：1/4白花    F1植株产生配子时，Cc因子分配到不同的配子中去，产生两种配子，一种带有C遗传因子，一种带有c，各占50%，比例为1：1，雌配子是如此，雄配子也是如此。当F1雌雄配子受精结合为合子时，含C因子的雌配子与含C和含c的雄配子相结合的机会是均等的，反之，含有C因子的雄配子与含有C或c的雌配子结合的机会也是均等的。这样F2的合子中遗传因子的组合可以归纳为：1/4CC     2/4Cc      1/4cc    带有CC因子的个体与红花亲本一样，表现为红花，带有cc因子的个体与白花亲本一样，表现为白花，带有Cc因子的植株与F1个体一样，也表现为红花。所以，按个体所表现的性状来分组，只有两组：3/4是红花，1/4是白花，即红花与白花之比是3：1。这就是Mendel对分离现象的解释。    关系。1906年，丹麦遗传学家Johannsen把Mendel所称的遗传因子叫做基因（Gene）。细胞内遗传因子即Gene的组合称为基因型（genotype）。基因型是性状表现必须具备的内因，即遗传的物质基础。例如，CC和Cc基因型决定花的颜色是红色，cc基因型决定花为白色。人们所能见到或用仪器设备能够检测到的性状称为表现型（phenotype）。表现型是基因型在外界环境条件作用下的具体表现，基因型是表现型的内在遗传基础。基因型是不能直接观察的，只有通过表现型才能推测基因型。    在遗传研究中，生物所表现出来的单位性状是数不胜数的，人们不可能在同一个试验中研究生物体的全部表现型或全部基因型，一般只能研究个别的性状或少数几个性状（表现型）及其基因型。在豌豆的红花×白花组合中，F2群体中有三种基因型，CC，Cc，cc，比例为1：2：1。C对c为显性，CC和Cc两种不同的基因型同样表现为红花表现型，所以只有两种表现型，即红花和白花，比例为3：1。再从基因的组合（基因型）来看，CC和cc两个基因型中成对的基因都是相同的，在遗传学中称为纯合基因型（homozygousgenotype），携带纯合基因型的个体称为纯合体（homozygote）。在Cc基因型中，成对的基因不相同，一个为显性基因，一个为隐性基因，称为杂合基因型（heterozygousgenotype），携带杂合基因型的个体称为杂合体（heterozygote）。    纯合体与杂合体在遗传行为上是不一样的。一对基因的纯合体只能产生一种配子，自交子代还是纯合体，其性状不会发生分离，表现为遗传上的稳定性。而一对基因的杂合体能产生两种配子，自交子代就会出现不同的基因型和不同的表现型，表现为遗传上的不稳定性。    Mendel对分离现象的解释完全是一种假设。这个假设的实质就是体细胞中成对的基因在配子形成过程中彼此分离，互不干扰，因而配子中只具有成对基因中的一个。    这个假设必需用实验来验证，若假设不能验证，充其量只是一种假说（hypothesis）而已，若在实验中得到验证，假设便成为规律。历史已经证明，解释分离现象的假设是能够验证的，因而分离现象便成为分离规律（lawof\nsegregation）。这是遗传学中的最基本的规律。    验证的方法有几种，主要的是测交法、自交法和F1花粉鉴定法。    一切生物，动物、植物、微生物，包括人在内，普遍存在着性状分离现象。    如动物的毛色有黑白之分，动物的有角与无角、耳朵下垂与竖立；植物果实的长与圆、有芒与无芒、抗病与不抗病、高杆与矮杆、微生物孢子的有色与无色、对药物敏感与不敏感；人的褐色眼与兰色眼、耳垂之有无、常态与白化、头发的曲与直等。    在人群中，有的人有耳垂，有的人没有。有耳垂是显性，受显性基因A控制，无耳垂是隐性，受隐性基因a控制，aa基因型个体无耳垂。其遗传表现为：P       有耳垂×无耳垂            有耳垂×无耳垂          AA     aa                Aa      aaF            有耳垂                    有：无               Aa                      Aa aa                                          1:1P         有 × 有                  有 × 有          AA   AA                  Aa    AaF           有                       有  有  无            AA                      AA   Aa  aa                                      1/4  2/4  1/4                                      3有 ：1无    根据亲本的基因型可以预测子代的基因型和表现型的概率（注意：不可预测某一具体后代的基因型和表现型），更重要的是利用子代的表现型推测亲代的基因型。    人类的白化病是受隐性基因控制的遗传病。Aa基因型的人虽携带致病基因，但不发病，表现正常。aa基因型的人才表现为白化症。据研究Aa基因型的人大约占人群的1/70，Aa基因型与Aa基因型结婚的概率大约1/5000，而Aa×Aa组合中有1/4的可能产生aa后代，因此人群中大约1/20000的白化症病人。若近亲结婚，发病机率大大增加。完全显性：     Mendel所研究的豌豆的7对相对性状，F1所表现的性状都和亲本之一完全一样，既不是中间型，也不是双亲的性状同时出现，这样的显性表现称为完全显性（completedominance）\n不完全显性：    F1表现为双亲性状的中间型，称为不完全显性（incompletedominance）。在这种情况下，显性纯合体与杂合体的表现不同，杂合体的表现型介于显性纯合体和隐性纯合体之间，所以又称为半显性。    经典的例子是法国人Correns（重新发现Mendel论文的学者之一）提供的紫茉莉花色的遗传。P             红花（雌）×白花（雄）                   RR  ↓  rrF1                       Rr                       粉红色                         ↓自交                红花   粉红色  白花                 RR     Rr      rr                 1/4     2/4     1/4还有红白金鱼草的花色也是不完全显性。P           红花×白花                 ↓F1             粉红色                 ↓自交F2     1/4红花  2/4粉红 1/4白花还有：P        透明金鱼（TT）× 普通金鱼（tt）                        ↓F1                  半透明（五花鱼）                       Tt                        ↓自交\nF2           1/4透明金鱼 2/4半透明 1/4普通金鱼共显性（codominance）在F1代个体上，两个亲本的性状都同时表现出来的现象成为共显性。          红毛牛 × 白毛牛                  ↓红毛白毛混杂                  ↓自交              1/4红毛 2/4红白毛 1/4白毛超显性（overdominance）杂合体的性状表现超过纯合显性的现象称为超显性。果蝇杂合体白眼（Ww）的萤光色素含量超过野生型纯合体WW和白眼纯合体ww。2．显性表现的相对性   显性的表现完全与不完全，也与人们观察和分析的水平有关。    Mendel认为豌豆种子的外形圆对皱是完全显性。而用显微镜检查豌豆种子内淀粉粒的形状和结构，发现纯合圆粒种子的淀粉粒持水力强，发育完善，结构饱满；纯合皱粒种子的淀粉粒的持水力差，发育不完全，表现皱缩；而F1，即杂合体种子的淀粉粒，发育程度和结构是前二者的中间型，而外形则是圆的。    从外表上看，圆粒对皱粒是完全显性，从淀粉粒的形态结构看，则是不完全显性。    因此，完全显性与不完全显性是相对的，不是绝对的，鉴别他们的差异有时取决于观察和分析的深入程度。3．显性表现与环境的关系    生物性状的表现，不只是受基因的控制，也受外界环境条件和生物体内生理条件的影响。任何生物都不能脱离外界环境而生存。    所以说，任何性状的表现都是基因型和内外环境条件相互作用的结果。表现型=基因型+环境    基因是通过控制生化过程而控制其性状表达的。等位基因之间的显隐性关系不是彼此之间直接抑制或促进的关系，而是分别控制各自决定的生化代谢过程而控制不同性状的表现。\n    有一种太阳红玉米，红色对正常绿色为显性，但是红色只有在直射阳光下才能表现出来，若遮盖起来，就表现不出红色来，仍为绿色。说明这个显性基因在阳光直射的条件下是显性，在没有阳光的条件下是隐性。    又如人的秃顶，有一种解释认为秃顶基因在男人为显性，在女人为隐性，所以男人秃顶比女人秃顶多，这和男女生理条件不同，性激素水平不同有关。秃顶与雄性激素直接有关，据说太监没有患秃顶的。    兔子的皮下脂肪有白色和黄色之分，白色（Y）对黄色（y）为显性，白脂肪的纯合体与黄脂肪的纯合体交配，F1代（Yy）个体是白脂肪。让F1代中雌雄兔（Yy）近亲交配，F2群体中3/4的个体是白脂肪，1/4的个体是黄脂肪。若F2群体中的yy个体只喂给麸皮等不含叶绿素的饲料，则皮下脂肪就不表现为黄色，也是白色的。 4．影响相对性状分离的条件分离规律的实质是等位基因自由分离和组合。等位基因在减数分裂时自由分离，受精时，带有不同基因的雌雄配子自由组合。具有一对相对性状的个体杂交产生的F1，在完全显性的情况下自交后代分离为3：1，测交后代分离比例为1：1。根据第二章所学的知识，我们知道同源染色体在减数分裂过程中是随机分离的，而在受精过程中，分别存在于雌雄配子中的两个同源染色体又是随机组合的。成对基因正是分别载荷在同源染色体的对等的座位上的两个基因，故成对基因又称为等位基因（allele）。由于等位基因位于同源染色体的对等位置上，必然随着同源染色体一起进行分离和组合。这就是性状分离的细胞学基础。Mendel分离比例的出现必须具备下列条件：1、所研究的生物体必须是二倍体，研究的相对性状必须差异明显。2、控制性状的基因显性作用完全，且不受其他基因的影响而改变作用方式。3、减数分裂（Meiosis）过程中，杂种体内的染色体必须以均等的机会分离，形成两类配子的数目相等。且两类配子都能良好地发育，参与受精的机会相等。4、受精以后不同基因型的合子具有同等的生命力。5、杂种后代生长在相对一致的条件下，而且群体比较大。这些条件在一般情况下是能够具备的，所以多数的试验结果都能够符合这个基本规律。但不是所有的试验都具备上述条件的。七、分离规律的应用    分离规律是遗传学中最基本的规律，这一规律从理论上说明了生物界由于杂交和分离所出现的变异的普遍性。    了解基因分离的规律，不仅可以正确认识生物的遗传现象，而且根据基因分离规律，显隐性的表现规律，在农业生产实践上能增加培育优良品种的计划性和预见性，在医学实践中对了解遗传病的遗传规律，减轻危害都是很有用的。\n一、要重视表现型和基因型之间的联系和区别。在遗传研究中要严格选用合适的材料，才能获得预期的结果，得到可靠的结论。例如，只有纯合基因型的两个亲本杂交，F1才不会发生分离。二、表现型相同的个体不一定基因型相同。有些作物的抗病性是由一个显性基因控制的，若抗病与不抗病的两个亲本杂交，后代很容易选到抗病株，但抗病植株中有的是纯合体，有些则是杂合体。杂合株（Rr）的后代还会发生分离，必须将当选单株自交考查，才能得到纯合抗病株。但是，若抗病性状为隐性，则一旦表现就是纯合的。三、生产上使用的优良品种要防止天然杂交而分离退化。四、营养繁殖的作物，可以利用杂合体。五、利用花粉培养和染色体加倍技术可以加快基因纯合的速度。六、在法医学上可以根据分离规律作亲子鉴定。七、进行产前诊断，降低人类遗传病的发生率。    目前已知的遗传病有3000多种。由单个基因控制的遗传病多为隐性表现。如先天性聋哑。若是显性遗传病，其双亲之一往往是杂合的患者，他们的子女约有1/2是患者，而且每生一个子女都有1/2的可能性是患者。    近亲结婚，隐性遗传病的发病率便大大增加。先天性聋哑近亲夫妇所生子女的发病率比随机结婚的高十几倍。低能儿的发病率，近亲结婚比非近亲结婚高140倍以上。江苏邗江县西湖乡朱塘村大颜生产队有一对夫妇为姨表兄妹，生了六个儿子都有先天性疾病，不是先天聋哑就是双目失明，有的二者兼有，老二就是，白天外出，由于眼睛看不见掉进离家很近的池塘，又是哑巴，无法呼救，被活活淹死了。2001年9月9日《扬子晚报》报道，安徽省庐江县汤池乡的付朝树、严德兰夫妇是表兄妹结婚，所生5个儿女都是先天性残疾，其中有4个儿子都患有先天性肌肉萎缩症，不仅没有劳动能力，而且连生活也不能自理。年轻人切莫近亲结婚。第二节独立分配规律    Mendel在分别研究了豌豆七对相对性状的遗传表现之后，提出了一对相对性状遗传的分离规律。但不同对相对性状从亲代遗传给子代的过程中相互关系如何呢？Mendel又做了进一步的研究，并提出了遗传学中的另一个基本规律，即独立分配规律一、两对相对性状的遗传    Mendel在研究了豌豆的一对相对性状的遗传规律以后，他又想，2对相对性状在后代中的表现会如何呢？Mendel仍用豌豆为材料，同时研究两对相对性状的遗传。   他用黄色、圆粒种子的豌豆与绿色、皱粒种子的豌豆杂交，得到F1种子（杂交母本植株上所结的种子）都是黄色、圆粒，表明黄色子叶、圆粒都是显性，这与七对性状分别进行研究的结果是一致的。F1植株自交得到F2种子，这些种子共可分为四种类型，两种类型与双亲相同，另两种是亲本性状的重新组合，且四种类型之间表现出一定比例（Yellow&Round)（图4-6）。P   黄、圆×绿、皱    ↓  F1  黄、圆     ↓自交  F2黄圆黄皱绿圆绿皱 种子数315 108 10132556 比例9/163/163/161/16 \n        如果把上述结果中的2对性状分别考虑，按一对性状进行统计分析，可得如下结果：　　从子叶颜色看：　　黄色315+101=41674.8%3/4　　绿色108+32=14025.2%1/4　　从粒形看　　圆粒315+108=42376.1%3/4　　皱粒101+32=13323.9%1/4　　每一对性状的分离仍然接近3：1。说明在杂交后代中，各相对性状的分离是独立的，互不干扰，即子叶颜色的分离和种子形状的分离彼此互不影响，两对相对性状在F2代中是自由组合的。　　按照概率原理，两个独立事件同时发生的概率是他们分别发生的概率的乘积。　　黄子叶、圆粒同时出现的概率应为3/4×3/4=9/16　　黄、皱3/4×1/4=3/16　　绿、圆1/4×3/4=3/16　　绿、皱1/4×1/4=1/16　　这正是（3/4+1/4）2的展开。　　将Mendel试验所得的556粒种子按上述9：3：3：1的理论推算，其理论值与实际结果比较，从统计学的角度分析，是完全符合的。         黄圆 黄皱绿圆绿皱实验值（O）315101 10832理论值（D）312.75104.25104.2534.75O-D+2.25-3.25+3.75-2.75　　这就是Mendel发现的性状自由组合现象。   二、Mendel对性状自由组合现象的解释    Mendel是这样解释他的试验的：    豌豆的黄子叶和绿子叶这一对相对性状是由一对等位遗传因子（Gene）Y和y控制的，圆粒和皱粒这一对相对性状是由另一对等位基因R和r控制的。用纯合的黄色圆粒豌豆（YYRR）与纯合的绿色皱粒豌豆（yyrr）杂交，亲本在形成配子时，遗传因子的数目减半，分别形成YR和yr配子，受精时雌雄配子结合成F1合子，F1代的基因型为YyRr，表现为黄色、圆粒。F1植株在形成配子时，成对的遗传因子（等位基因）彼此分离，即Y和y分离，R和r分离，各自独立地分配到配子中去。也就是说等位的遗传因子（等位基因，alleles）彼此分离，而不同对的等位基因自由组合，产生四种配子，YR、Yr、yR和yr，这四种配子的比例相等。F1植株自花授粉，这四种雌配子和四种雄配子随机结合，共有4×4=16种组合方式（图4－6）YYRR×yyrr\n↓YRyrYyRrYRYrYryrYRYYRRYYRrYyRRYyRrYrYYRrYyrrYyRrYyrryRYyRRYyRryyRryyRrYrYyRrYyrryyRryyrr    这十六种组合方式中，有9种基因型，4种表现型。YYRR1YyRR29YR黄圆YYRr2YyRr4Yrr黄皱YYrr1Yyrr23yyRR13YyR绿圆YyRr2Yyrr绿皱yyrr11    科学家们早就证明了Mendel对独立分配规律的解释，并已证明，基因的独立分配与染色体的独立分配是完全平行的。    在遗传的细胞学基础一章中，已经介绍过，在减数分裂的后期I，同源染色体自由分离，分别进入细胞的一极，非同源染色体随机组合进入二分子。在Mendel的上述实验中，黄子叶和绿子叶（Y&y）是一对等位基因，位于同一对同源染色体的相对座位上，圆粒R和皱粒r是另一对等位基因，位于另一对同源染色体的相对座位上（图4-7）。杂种F1的基因型是YyRr，当F1的孢母细胞进行减数分裂形成配子时，这两对基因随着两对同源染色体在后期I的分离，Y与y进入不同的二分体，R与r也一定分别进入不同的二分体，而在同一个孢母细胞内，可能是YR组合进入同一个二分子，而y和r进入另一个二分子，形成2个YR配子和yr配子，而在另一个孢母细胞内，可能是Yr进入一极，yR进入另一极，形成2个Yr配子和2个yR配子。每一个孢母细胞发生这两种分离和组合的机会是均等的，所以四种类型的配子数目相等，成1：1：1：1的比例。雌雄配子都是这样，在受精时，雌雄配子又随机组合，在表现型上呈现9：3：3：1的比例。    两对相对性状独立分配的实质：控制两对相对性状的两对等位基因，分别位于非同源的两对染色体上。杂合体F1在减数分裂形成配子时，同源染色体上的等位基因发生分离进入不同的配子，而位于非同源染色体上的基因自由组合进入同一个配子，这样形成四类配子，且比例相等。在受精过程中四类雄配子和四类雌配子随机结合。                         三、  独立分配规律的验证        1．测交法    用F1与双隐性亲本测交。当F1形成配子时，不论雌配子还是雄配子，都有四种类型，即YR、Yr、yR和yr，而且比例相等，即1：1：1：1。双隐性亲本只产生一种yr配子，因此测交子代（Ft）种子的比例和类型，应该符合1：1：1：1的比例。Mendel所得到的实际结果与理论推断是完全一致的。\nF1黄圆YyRr×yyrr绿皱YRYrYryr↓yr　　　　　　　　　　　　　　　↓　基因型YyRrYyrryyRryyrr表现型黄圆黄皱绿圆绿皱比例1：1：1：1Mendel实得种子数F1（雌）31262726F1（雄）24252227比例1：1：1：！      由此证明，Mendel对独立分配（自由组合）现象的解释是完全正确的。这就是遗传学中的第二规律——独立分配规律。      2．自交法    按照分离和独立分配规律的理论推断，由纯合的F2植株自交产生的F3种子不会出现性状的分离，如YYRR、YYrr、yyRR、yyrr植株，这类植株在F2中应各占1/16，由一对基因杂合植株（YyRR、YRr、yyRr、Yyrr）自交产生的F3种子，其中一对性状是稳定的，不会发生分离，另一对性状将分离为3：1，这类植株应各占F2群体的2/16。由两对基因都杂合的植株（YyRr）自交产生的F3种子，将与F2种子一样，分离为9：3：3：1的比例。这类植株应占F2群体的4/16。Mendel所作的试验结果，完全符合他的推论。摘列如下：38株（YYRR1/16）全部为黄圆，无分离35株（yyRR1/16）全部为绿圆，无分离28株（YYrr1/16）全部为黄皱，无分离30株（yyrr1/16）全部为绿皱，无分离65株（YyRR2/16）全部为圆粒，子叶3黄：1绿68株（Yyrr2/16）全部为皱粒，子叶3黄：1绿60株（YYRr2/16）全部为黄子叶，粒形3圆：1皱67株（yyRr2/16）全部为绿子叶，粒形3圆：1皱138株（YyRr4/16）分离为9：3：3：1计469株。    用自交法对F2群体基因型的鉴定，也证明了独立分配规律的正确性。      3．测交与回交的关系    假如用黄子叶、皱粒亲本与绿子叶，圆粒亲本杂交，其F1和F2的表现型也与黄、圆与绿、皱亲本杂交相似。黄、皱Yyrr×yyRR绿、圆　↓YyRr黄圆↓自交Y-R-Y-rryyR-yyrr9331\n      为什么这两种杂交组合方式的结果一样呢？请大家课后思考。      在这个组合中，没有双隐性性状的亲本，假如要用测交法验证独立分配规律，或者说检测F1植株的基因型，怎么做呢？      我们可以另外找一个绿子叶、皱粒的豌豆来和F1植株杂交。F1黄圆YyRr×yyrr绿皱↓YyRrYyrryyRryyrr1:1:1:1      可见，测交可以是回交，但不一定是回交。测交所用的双隐性绿、皱豌豆可以不是F1的亲本。当被测个体也不一定是F1。      现在我们可以给测交下一个比较正确的定义：      用纯合隐性的材料（植株，可以是一对隐性性状，也可以是两对或两对以上的隐性性状）与待测个体杂交的组合方式就叫做测交。测交的目的是检测被测个体的基因型。前面所讲的测交，都是特例。    四、 多对相对性状的遗传      当具有三对相对性状差异的植株杂交时，只要决定这三对相对性状的基因是分别位于三对非同源染色体上的，也就是说他们是独立遗传的，仍然受独立分配规的支配。   如果一黄色、圆粒、红花植株和绿色、皱粒、白花植株杂交，F1全部为黄色、圆粒、红花。PYYRRCC×yyrrcc　　　　　　　　　　　　↓F1YyRrCc    F1的三对杂合基因分别位于三对染色体上，减数分裂过程中，这三对染色体有23=8种可能的分离方式，产生8种基因型的配子：YRC、Yrc、Yrc、yRC、yRc、yrc、yrC和YrC，并且各种配子的比例相等。雌配子是8种，雄配子也是8种，受精时，8种雌配子和8种雄配子都可以随机组合，8×8=64，可用棋盘格（Punnetlsquare）法表示。64种组合，27种基因型，8种表现型。F2代的表现型种类总是与F1产生的配子种类数目相等（表4－4）。    我们在研究两对以上相对性状的遗传时，后代的表现型实质上是各相对性状的表现型的组合。   为方便起见，也可以先将各对基因杂种的分离比例分解开，而后按积事件的机率进行综合。   例如3对相对性状杂交的F1自交，可以看成是3对杂合基因型的个体间的杂交，即YyRrCc×YyRrCc亦可以看成是3个单基因杂种之间的杂交，即       （Yy×Yy）(Rr×Rr)(Cc×Cc)       每一单基因杂种的F2按3：1的比例分离，3对独立基因杂种的F2表现型的比例为（3：1）（3：1）（3：1）=（3：1）3的展开。       即27：9：9：9：3：3：3：1。亦可用下述方法表示：圆3/4红3/4=黄圆红（Y-R-C-）3/4×3/4×3/4=27/64白1/4=黄圆白（Y-R-cc）3/4×3/4×1/4=9/64黄3/4皱1/4红3/4=黄皱红（Y-rrC-）3/4×1/4×3/4=9/64白1/4=黄皱白（Y-rrcc）3/4×1/4×1/4=3/64圆3/4红3/4=绿圆红（yyR-C-）1/4×3/4×3/4=9/64白1/4=绿圆白（yyR-cc）1/4×3/4×1/4=3/64\n绿1/4皱1/4红3/4=绿皱红（yyrrC-）1/4×1/4×3/4=3/64白1/4=绿皱白（yyrrcc）1/4×1/4×1/4=1/64    只要各对基因都是独立遗传的，其杂种F1后代的分离就有一定的规律可循。见表4－5。    杂种杂合F2表现型F1形成的F2基因型F1雌雄配F2纯合基F2杂合基因F2表现型   基因对数种类配子种类种类子组合数因型种类型种类分离比例1223421（3：1）124491645（3：1）23882764819（3：1）341616812561665（3：1）453232243102432211（3：1）5：：：：：：n2n2n3n4n2n3n-2n(3:1)n一、复等位基因的遗传      前面所讲的等位基因都是一对一对的。如果在同源染色体的对等座位上，有三个或三个以上不同性质的基因存在，称为复等位基因（multiplealleles）。    要说明的是，在正常二倍体的生物中，一个个体内只能有两个等位基因存在，也就是说复等位基因不会存在于同一个个体内，而是存在于同一物种的不同个体内。    复等位基因的表示方法：用一个字母作为该基因座位的基本符号，不同的等位基因就在这个字母的右上方作不同的标记，基本符号的大小写表示该基因的显隐性。    以人的ABO血型为例，它是由一组复等位基因控制的，分别表示为IA，IB和i，共三个基因相互等位，即位于同源染色体的同一个座位上。对于同一个人来说，只能具有其中的两个基因，因为人的同源染色体只有两条，每条上只带有一个决定血型的基因，但在人群中却有三个复等位基因存在。    IA控制A血型，IB控制B血型，i控制O血型，IA，IB对i都为显性，IA，IB之间为共显性，它们谁也压不了谁，二者相遇都表现出来。复等位基因的遗传同样遵循分离规律。    只要记住IA，IB和i之间的显隐性关系，根据分离规律，什么血型的人和什么血型的人结婚，他们的子女可能是什么血型，不可能是什么血型，便一目了然。        基因型和表现型        IAIA，IAiA型        IBIB，IBiB型        IAIBAB型        iiO型        共6种基因型，4种表现型。        A型的人和A型的人结婚，子女只有两种血型，A型或O型。        IAIA×IAIAIAIA×IAiIAi×IAi        ↓↓↓        IAIA1IAIA:1IAi1IAIA:2IAi:1ii        全A型全A型A型O型    O型的人和O型人结婚，子女只能是O型。A型的人和B型的人结婚，其子女中A，B，O，AB四种血型都可能有。\n    掌握了血型遗传的规律，不但可以说出什么血型的人结婚，子女的可能血型，也可以由子女的血型反推他们父母的可能血型和不可能的血型。血型是很稳定的，终生不变。    又如家兔中有四种不同的毛色，分别为全色（全灰或全黑），由C控制，银灰cch，喜玛拉雅型（耳尖，鼻尖，尾尖，四肢末端为黑色，其余部分为白色）ch，白化c。他们是由一组复等位基因控制的，显隐性关系为C>cch>ch>c。任何两种毛色的兔交配，再让子代近亲交配，F2代均呈3：1的分离。    有的性状的复等位基因多达几十个。复等位基因的来源将在第十章中讨论。                         二、非等位基因的相互作用     在分离规律和独立分配规律中，Mendel都是假定一对基因控制一个单位性状的，其实基因和性状远远不是一对一的关系。有些单位性状并不是受一对基因控制的，而是受两对甚至许多对基因控制的。两对以上的非等位基因相互作用控制同一个单位性状的现象称为基因间的互作（interactionofgenes）。   例如，鸡冠形状的遗传。鸡冠的形状很多，最常见的是单片冠（图4－7－1）。此外，还有玫瑰冠，豌豆冠和胡桃冠。不同形状的鸡冠是品种的特征之一。豌豆冠的鸡和玫瑰冠的鸡交配，子一代的鸡是胡桃冠，子一代间相互交配，得子二代，子二代中有胡桃冠，豌豆冠，玫瑰冠和单片冠，大体上接近9：3：3：1。这里有两点值得特别注意：子一代的鸡冠不象任何一个亲本，而是一种新类型；子二代中既有两个亲本的类型，又有F1的类型，此外又出现了一种新类型。怎样来解释这种遗传现象呢？   假定控制玫瑰冠的基因为R，控制豌豆冠的是P，且都是显性，那末玫瑰冠的鸡不带有显性豌豆冠基因，其基因型为ppRR，与之相反，豌豆冠的鸡不带有显性玫瑰冠基因，其基因型为PPrr。前者产生的配子全为pR，后者为Pr，这两种配子受精得到的子一代是PpRr。由于P和R的相互作用，出现了胡桃冠。子一代的公鸡和母鸡都产生PR、Pr、pR和pr四种配子，且数目相等。根据自由组合定律，子二代应该出现四种表现型，胡桃冠（P-R-）、玫瑰冠（P-rr）、豌豆冠（ppR-）和单片冠（pprr），其比例为9：3：3：1。P和r相互作用，形成单片冠。   值得注意的是，这里的的9：3：3：1不是两对相对性状的组合比例，而是一个单位性状的不同相对性状之比。这是基因互作的典型例子。两对基因的互作还有以下几种常见形式。      1．互补作用（Complementaryeffect）   两对独立遗传的基因决定同一个单位性状，当它们同时处于显性纯合或杂合状态时，决定一种性状（相对性状之一）的发育，当只有一对基因处于显性纯合或杂合状态时，或两对基因均为隐性纯合时，则表现为另一种性状。这种基因互作的类型称为互补，发生互补作用的基因称为互补基因（complementarygene）。      香豌豆花色的遗传   香豌豆有许多不同花色的品种。白花品种A与红花品种O杂交，子一代红花，子二代3红花：1白花。另一个白花品种B与红花品种O杂交，子一代也是红花，子二代也是3：1。但白花品种A与白花品种B杂交，子一代全是紫花，子二代9/16紫花，7/16白花。   从子一代的表现型看，白花品种A和B的基因型是不同的，若相同，子一代应该全是白花。品种A和B均有不同的隐性基因控制花色，假定A有隐性基因pp，B有隐性基因cc，品种A的基因型为CCpp，B为ccPP。两品种杂交，子一代的基因型为CcPp，显性基因C与R互补，使花为紫色。F2中，9/16是C-P-基因型，表现为紫花，3/16是C-pp，3/16是ccP-，1/16是ppcc，均表现为白花。      P白花品种A×白花品种B      CCppccPP      F1紫花      CcPp      ↓自交      F29C-P-:3C-pp:3ccP-:1ccpp      紫白花\n   在这个试验中，F1和F2的紫花植株与它们的野生祖先的花色相同。这种现象称为返祖（atavism）遗传。紫花性状决定了两种显性基因的互补。在进化过程中，显性C突变成c，产生一种白花品种，P突变成p，成为另一种白花品种，两个白花品种杂交后，两对显性基因重新组合，又出现了祖先的紫花。      2．积加作用   两种显性基因同时处于显性纯合或杂合状态时，表现一种性状，只有一对处于显性纯合或杂合状态时表现另一种性状，两对基因均为隐性纯合时表现为第三种性状。   南瓜的果形，扁盘形对圆球形为显性，圆球形对细长形又为显性。两种不同基因型的圆球形品种杂交，F1为扁盘形，F2为9/16扁盘形，6/16圆球形，1/16细长形。      P圆球形×圆球形      AAbbaaBB      F1A-Bb扁盘形      自交      F29A-B-:3A-bb:3aaB-:1aabb      扁盘形圆球形细长形      3．上位性epistasis   两对独立遗传的基因共同对一个单位性状发生作用，其中一对基因对另一对基因的表现有遮盖作用，这种现象称为上位性（epistasis）。   （1）显性上位作用（epistaticdominance）   燕麦中，黑颖品系与黄颖品系杂交，F1全为黑颖，F2中12黑颖：3黄颖：1白颖。      P黑颖×黄颖      BByy↓bbYY      F1BbYy黑颖      ↓自交      F29B-Y-:3B-yy:3bbY-:1bbyy      黑颖黄颖白颖   黑颖与非黑颖之比为3：1，在非黑颖中，黄颖和白颖之比也是3：1。所以可以肯定，有两对基因之差，一对是B-b，分别控制黑颖和非黑颖，另一对是Y-y，分别控制黄颖和白颖。只要有一个显性基因B存在，植株就表现为黑颖，有没有Y都一样。在没有显性基因B存在时，即bb纯合时，有Y表现为黄色，无Y时即yy纯合时表现为白色。B的存在对Y-y有遮盖作用，叫做显性上位作用。B-b对Y-y是上位，Y-y对B-b为下位。   这个例子很容易直观地理解，黑色素颜色很深，既然有黑色素存在，有无黄色素就区别不出，一定要没有黑色素，才看得出有没有黄色素的存在。      （2）隐性上位作用（epistaticrecessiveness）在家兔中，灰兔和白兔杂交，F1全是灰兔，F2中9灰：3黑：4白。有色个体（包括灰与黑）与白色个体之比为3：1，而在有色个体内部，灰与黑也是3：1，可以认为也是两对基因的差异。      灰色×白色      CCGG↓ccgg      灰色CcGg      　↓自交      9灰：3黑：4白      C-G-C-ggccG-+ccgg   \n每一个体中至少有一个显性C存在，才能显示出颜色来。没有C时，即cc纯合，不论是GG，Gg,还是gg都表现为白色。一对隐性基因纯合时（cc），遮盖另一对非等位基因（G-g）的表现，这种现象称为隐性上位作用（epistaticrecessiveness）。其中C-C对g-G是上位，G-G对c-C是下位，两对非等位基因间的这种关系称之为上位效应。   基因C可能决定黑色素的形成，cc基因型无黑色素形成。G-g控制黑色素在毛内的分布，没有黑色素的存在，就谈不上黑色素的分布，所以凡是cc个体，G和g的作用都表现不出来。      4．重叠作用（duplicateeffect）   两对独立遗传的基因决定同一单位性状，当两对基因同时处于显性纯合或杂合状态时，与它们分别处于显性纯合或杂合状态时，对表现型产生相同的作用。这种现象称为重叠作用，产生重叠作用的基因称为重叠基因（duplicategenes）。      大豆子叶颜色有黄绿之分。      （满仓金）黄子叶×绿子叶（保定青皮青）      D1D1D2D2↓d1d1d2d2      黄子叶D1d1D2d2      ↓自交      15黄（9D1-D2-+3D1-d2d2+3d1d1D2-）：1绿d1d1d2d2   15:1也是9：3：3：1比例的变型。   当三对重叠基因决定同一单位性状时，F2将分离为63：1。在这里显性基因的作用相同，但并不表现累积效应。      5．抑制作用   在两对独立基因中，其中一对并不控制性状的表现，但当它处于显性纯合出和或杂合状态时，对另一对基因的表达有抑制作用。这种基因称之为抑制基因（inhibitor）。   家蚕有结黄茧的，但大多数是结白茧的。把结黄茧的品种与结白茧的中国品种杂交，子一代全是结黄茧的，表明中国品种的白茧是隐性的。把黄茧品种与结白茧的欧洲品种交配，子一代是结白茧的，表明欧洲品种的白茧是显性的。让子代结白茧的家蚕相互交配，子二代白茧与黄茧之比为13：3。      显性白茧×黄茧      IIyyiiYY      白茧IiYy      互交      9I-Y-：3I-yy:3iiY-:1iiyy      白白黄白      黄茧基因是Y，白茧基因是y。还有一个非等位基因的抑制基因I，有I存在时，Y不能表达。黄茧品种的基因型为iiYY，显性白茧的基因型是IIyy，F1是IiYy，因为I对Y有抑制作用，Y的作用不能显示出来，表现为白茧。F1互交，F2中9/16I-Y-+3/16I-yy+1/16iiyy)表现为白茧，3/16iiY-由于无I的抑制，表现为黄茧。iiyy基因型虽然没有I的抑制，但因没有色素基因Y存在，也表现为白茧。   13：3也是9：3：3：1比例的变型。   抑制作用与上位性作用不同，抑制基因本身不能决定性状，而显性上位基因除遮盖其他基因的表现外，本身也控制性状。      以上是两对独立基因共同决定同一单位性状时的几种互作情况。归纳成下表：      AAAaaa      BB121      Bb242      bb121   两对基因互作的模式图（图4－8）：   \n两对基因分别控制两个单位性状，且显性完全时，F2中不同表现型比例为9：3：3：1，这是最基本的类型。当两对独立遗传的基因共同决定同一单位性状时，由于互作类型不同，才出现上述6不同的表现型比例，然而，不管这些表现型比例如何变化，都是9：3：3：1比例的变型。表现型的比例有所改变，而基因型的比例和独立分配是完全一致的。由于基因互作，杂交后代的分离类型和比例与典型的Mendel比例不同，并不因此而否定Mendel定律，而正是对它的进一步深化和发展。 三、基因的作用与性状的表现     上述基因互作的实例说明，一个单位性状的遗传并不都是受一对基因的控制，而经常受到许多对基因的影响。   许多基因影响同一单位性状的现象称为多因一效（multigeniceffect）。在生物界，多因一效现象很普遍。如玉米糊粉层的颜色涉及7对等位基因，玉米叶绿素的形成至少涉及50对等位基因，果蝇眼睛的颜色受40几对基因的控制。   有的性状虽然受许多基因控制，但各对基因的作用并不是同样大小的，有的起主要的作用，有的作用很小。   另一方面，一个基因也可以影响许多性状的发育，称为一因多效（pleiotropism）。   豌豆中控制花色的基因也控制种皮的颜色和叶腋有无黑斑。红花豌豆，种皮有色，叶腋有大黑斑。又如家鸡中有一个卷羽（翻毛）基因，是不完全显性基因，杂合时，羽毛卷曲，易脱落，体温容易散失，因此卷毛鸡的体温比正常鸡低。体温散失快又促进代谢加速来补偿消耗，这样一来又使心跳加速，心脏扩大，血量增加，继而使与血液有重大关系的脾脏扩大。同时，代谢作用加强，食量又必然增加，又使消化器官、消化腺和排泄器官发生相应变化，代谢作用又影响肾上腺，甲状腺等内分泌腺体，使生殖能力降低。由一个卷毛基因引起了一系列的连锁反应。这是一因多效的典型实例。   从生物个体发育的整体观念出发，一因多效和多因一效都是很容易理解的。基因通过酶控制生理生化过程，进而影响性状的表现。一个基因影响一个生化环节，各个生化环节又是相互连系的，一个基因的改变可能影响一系列的生化过程，产生一因多效，另一个方面，一个生化环节又可能受许多基因的影响，产生多因一效现象。   以白三叶草中氰化物含量为例，说明基因之间相互作用的生化基础。   白三叶草中氰化物（主要是HCN）的含量有时受两对显性互补基因的作用。      低含量LLhh×低含量llHH      ↓      高含量LlHh      ↓自交      9高（L-H-）：7低（3L-hh+3llH-+1llhh）   H和L基因共同作用时，氰化物含量高，缺少一对显性基因时，含量明显下降。氰化物是一种含氰的葡萄糖苷在氰酸酶（H酶）的作用下生成的。而含氰葡萄糖苷又是由一种前体物在L酶的作用下生成的。      LH      （L酶）（H酶）      ↓　　　　　　　　　↓      ……前体————→含氰葡萄糖苷————→氰化物   低含量植株中有三种类型：      1无L酶，有H酶。无L酶不能使前体成为含氰葡萄糖苷，当然不能产生氰化物。      2含有L酶和含氰某某糖苷，但无H酶，不能使含氰葡萄糖苷生成为氰化物。      3既无L酶，也无H酶。   高含量植株中既有L酶又有H酶，也有含氰葡萄糖苷。   如果把生化分析和遗传试验结果联系起来，假定基因L控制L酶的合成，H控制H酶的合成。可以推论，三类低含量植株的基因型分别是llH-、L-hh和llhh，高含量植株的基因型是L-H-。   上述试验表明：性状的表现决定于基因的相互作用，而基因的相互作用又是通过具体的生化过程实现的，通过控制同一生化过程的不同步骤影响性状的表现。基因的作用又必须在一定的内外环境条件下实现。 四、独立分配规律的应用    \n独立分配规律为解释生物的遗传多样性提供了理论基础。生物变异的原因很多，基因之间的自由组合是生物性状多样性的重要原因之一。   按照独立分配规律，在显性作用完全的条件下，亲本间有两对基因差异，F2有22=4种表现型，32=9种基因型。      4对基因差异，24=16种表现型，34=81种基因型      8对基因差异，28=256种表现型，38=6561种基因型   20对基因差异，F2有220=1048576种表现型，320=3486784401（34亿多）种基因型。   这说明，杂交造成基因的重新组合，是生物界多样性的重要来源。生物有了丰富的变异类型，可以广泛适应于各种不同的自然条件，有利于生物的的进化。这是独立分配规律的理论意义。   在实践上，掌握独立分配规律，可以大大增强育种工作的计划性和预见性，指导动植物育种工作。   例如，若两个番茄品种，一个是抗病的黄果肉（ssrr），双隐性，另一个是感病的红果肉（SSRR），双显性。要想得到一个抗病的、红果肉的纯合品种（ssRR），根据独立分配规律，在F1中不会有抗病红果肉植株出现，F2中抗病红果肉的表现型比例为3/16，在这3/16中，只有1/3是ssRR纯合体，2/3是ssRr杂合体，在表现型上无法区分，只有分别种植F3代再来选择，纯合体ssRR在F3不分离，杂合体ssRr在F3则继续分离，要想在F3中得到10个稳定的抗病红果肉的纯合株系个体，那么F3至少应种植30个株系，也就是说至少要在F2代中选择30株抗病红果肉的植株，供F3株系鉴定。要种植多少株F2才能选到30株呢？第五章连锁遗传和性连锁第一节连锁与交换1．性状连锁的表现2．连锁遗传的解释3．连锁遗传的机理1．性状连锁的表现       1906年，Bateson用香豌豆做了一个两对性状的杂研究。    P紫花长花粉粒x红花圆花粉粒 PPLL↓ppll       F1紫，长PpLl        ↓自交        F2紫长紫圆红长红圆总数        P-L-P-llppL-ppll     实际个体数483139039313386952    按9:3:3:1推算3910.51303.51303.5434.56952的理论数    在上述结果中，F2中也出现四种表现型，但不符合两对性状独立遗传的9：3：3：1的分离比例。其中亲本型的性状组合的实际数明显多于理论数。而重组类型（红长和紫圆）却明显少于理论数。很难用独立分配规律来解释。    Bateson又设计了另一个两对性状的杂交试验。        P紫花圆花粉粒x红花长花粉粒        PPll↓ppLL        F1紫长        PpLl        ↓自交        F2紫长紫圆红长红圆总数    实际个体数22695971419    按9:3:3;1235.878.578.526.2419的理论数    试验的结果与前一试验基本相似，与9：3：3：1的独立遗传比例相比，F2群体中仍然是亲本型（紫圆、红长）的实际数多于理论数，重组型（紫长、红圆）的实际数少于理论数。\n    所不同的是，在上一个试验中，是两个显性性状集中在一个亲本中，两个隐性性状集中在另一个亲本中。而第二个实验是每个亲本中都是一个显性性状和一个隐性性状。遗传学上把第一种杂交组合称为相引相（conplingphase），把第二种杂交组合称为相斥相（repulsionphase）。 2．连锁遗传的解释     对于上述两个试验结果，就单个性状进行分析，仍然符合分离规律。不论是相引相还是相斥相，F2群体中紫花对红花，长花粉对圆花粉的分离都接近3：1。      相引相：紫花：红花=（4831+390）：（1338+393）=5221：1731=3：1        长花粉：圆花粉=（4831+393）：（1338+390）=5224：1728=3：1        相斥相：紫花：红花=（226+95）：（97+1）=321：98=3：1      长花粉：圆花粉=（226+97）：（95+1）=323：96=3：1   分析说明，若同时考虑两对相对性状，不符合独立分配规律，但就每个单位性状而言，仍是受分离规律支配的。   我们知道，在独立遗传的情况下，F2群体中9：3：3：1的分离比例是以F1形成四种配子且数量相等为前提条件的，可以用测交法再检验一下相似实验中F1产生的配子的种类和比例。因为测交后代的表现型种类及其比例就是F1产生的配子的种类和比例的直接反映。相引相  玉米籽粒的糊粉层有色C对无色c为显性，饱满Sh对凹陷sh是显性。有色饱满x无色凹陷      CCShSh↓ccshsh      有色饱满      CcShshxccshsh无色凹陷      ↓      CcShshCcshshccShshccshsh      Ft有色饱有色凹无色饱无色凹      实得粒数403214915240358368      Percent48.21.81.848.2在Ft中，   亲本型性状组合=（4032+4035）/8368=96.4%   重组型性状=（149+152）/8368=3.6%   假如是独立分配，Ft中四种类型应该是1：1：1：1，测交结果显然不能用独立分配规律来解释，虽然形成四种配子，但绝非各占1/4，而是亲本组合类型占绝大多数。相斥相   两个亲本各具有一个显性性状和一个隐性性状，杂交F1再与双隐性植株测交。      有色凹陷×无色饱满      CCshsh↓ccShSh      CcShsh×ccshsh      有色饱满↓无色凹陷      ↓      CcShshCcshshccShshccshsh      有、饱有、凹无、饱无、凹\n      638213792109667243785      1.548.548.51.5   测交后代中，   亲本型=（21379+21096）/43785=97.01%   重组型=（638+672）/43785=2.99%    相斥组测交结果与相引组基本一致，Ft群体中也有四种类型，但亲本型组合占97.01%，远远超过独立分配所应有的50%，重组型只有3%左右，远远低于独立分配所应有的50%。   两组测交结果说明，亲本所具有的C-c、Sh-sh这两对非等位基因不是独立分配的，而是在大多数情况下连系在一起遗传。在相引相中，C和Sh连系在一起遗传，c和sh连系在一起遗传，因此F1产生的配子中，亲本型的（CSh和csh）占大多数，重新组合型的（cSh和Csh）数量偏少。在相斥相中，c与Sh、C与sh连系在一起遗传，亲本型配子cSh和Csh明显多于50%，重组型CSh和csh明显少于50%。   结论是，原本属于亲本的两个非等位基因有连系在一起遗传的倾向。这种现象被称为连锁遗传。   但是，有一点大家应充分注意：无论是相引相还是相斥相，两种亲本型的配子数是相等的，两种重组型配子也是相等的。3．连锁遗传的机理    连锁遗传的现象是Bateson于1906年发现的，直到上世纪二十年代才由Morgan等人探明了其遗传机理。具有连锁遗传关系的一些基因，是位于同一染色体上的非等位基因。   一种生物的性状是成千上万的，然而，每一种生物所具有的染色体却是十分有限的，少则一对两对，多也不过几十对几百对。因此，一条染色体上必然载有许多基因。（1）完全连锁   若A-a和B-b是位于同一对同源染色体上的两对非等位基因，则AABB和aabb基因型可以表示为：      ABab      ABab  由于基因位于染色体上，必然随着染色体一起行动，他们产生的配子所携带的基因应该是AB和ab。二者杂交，F1的基因应该表示为：AB   ab   同时F1也只能形成两种配子：AB和ab，F1自交和测交，其后代（F2和Ft）的表现型也只有亲本型，而不会出现重新组合的类型。这种遗传现象称为完全连锁（completelinkage）。ABxab      AB↓ab      ABxab      Abab      AB      ab自交后   比例1AB：2AB：1ab\n      ABabab   表型比3A-B-：1aabb   测交后   比例1AB：1ab   abab   表型比1AaBb:1aabb    由此可知，两对非等位基因完全连锁时，他们的遗传表现与一对基因很相似，自交F23：1分离，测交1：1分离。 （2）不完全连锁   非等位基因间完全连锁的情形是非常少见的。一般的情况都是不完全连锁（incompletelinkage）。当两对基因不完全连锁时，F1不仅产生亲本型配子，也产生少量的重组型配子。   为什么会有不完全连锁呢？   减数分裂的前期I同源染色体会相互配对，称联会（synapsis），在双线期时，同源染色体之间可以见到交叉现象，交叉现象标志着同源染色体的非姊妹染色单体的对应区段发生了交换。由于发生了交换，而导致同源染色体间非等位基因的重组，打破原来的连锁关系，而表现为不完全连锁。（不完全连锁又叫做部分连锁）   以玉米的c-sh的连锁为例，图示如下    交叉若发生在sh-c以外，这两个基因之间不发生交换，所以形成的配子都是亲本型的组合，表现为完全连锁。   若交叉发生在sh-c之间，表示有一半的染色单体在这两个基因之间发生过交换，所以在形成的配子中，有一半是亲本型组合，有一半是重新组合。   在一个孢母细胞中，交叉可以发生在Sh-C之间，也可以发生在Sh-C之外，一般地说这是随机的。假设有一个小孢母细胞中的交叉发生在Sh-C之间，最后形成四个雄配子，其中两个是亲本型，两个是重组型。所以，即使所有的小孢母细胞中在Sh-C之间都发生交叉（交换），也就是说100%的小孢母细胞都在Sh-C之间发生交换，最多也只能形成50%的重组型配子。实际上交叉的发生部位基本上是随机的，不可能100%的孢母细胞都在Sh-C之间发生交换，即重组型配子不会达到50%。只有两对基因独立遗传时，重组型配子才是50%。在大孢子母细胞中，减数分裂产生的四分孢子只有一个发育成雌配子，但是，哪一个发育成雌配子则是随机的。因此，从统计学的角度考虑，重组型的雌配子也不会超过50%。   重组型配子占配子总数的百分比，定义为重组率。   重组率=（重组型配子数/总配子数）×100%   假设有100个孢母细胞：亲本型配子重组型配子   93个在连锁区段内不发生交换CShcshCshcSh   93×4=372个配子186186   7个在连锁区段内发生交换7777   7×4=28个配子   共400个配子19319377   重组率=（7+7）/400=3.5%   两对连锁基因之间发生交换的孢母细胞百分数，恰恰是重组型配子百分数的两倍。       思考：假如是纯合体，姊妹染色单体的交换与配子的类型有何关系？\n第二节重组率及其测定1．重组率2．重组率的测定3．重组率和交换值 1．重组率         重组率是 2．重组率的测定      （1）测交法   要想了解重组型配子和亲本型配子的数目，首先应该想到用测交法。因为测交后代（Ft）群体中表现型的种类和比例正是被测个体产生的配子的种类和比例的直接反映。   前述玉米测交试验的重组率，相引相为3.6%，相斥相为2.99%，就是根据测交结果和以上公式计算出来的。（2）自交法   有的作物，如玉米，测交比较容易，它授粉方便，一次授粉能得到大量种子。但是，有些作物如小麦，水稻等自花授粉作物，不仅去雄和授粉比较困难，而且一次杂交只能得到很少量的种子，不宜用测交的方法测定重组率。   自花授粉作物可以用自交法，根据F2群体的资料估算重组率。以相斥相为例。假设有两对基因A-a和B-b      AAbb×aaBB      ↓      AaBb   配子ABAbaBab   比例abcda+b+c+d=1      ABaAABB      a2      AbbAAbb      b2      AbcaaBB      c2      abdaabb      d2    双隐性个体的频率（aabb个体的频率）为d2。实际上我们只能观察到d2，而不能观察到d。因为组成aabb个体的配子只能是ab。d=d－2开平方（只取正值）。      假设A-B-A-bbaaB-aabb      1049049010   F2中aabb个体的比例为10/1000=0.01=d2，d=0.1=10%，AB配子的频率与ab相等，也应该是10%。在相斥相，AB和ab均为重组型配子，重组率是两种重组型配子比率之和，即10%+10%=20%。那么，F1形成的四种配子的比例应为   10AB：40Ab：40aB：10ab    \n相引相也可以用上述方法，但在相引相中，双隐性配子是亲本型配子，而不是重组型配子，应予注意。   重组率的变动幅度介于0-50%之间。重组率越小，说明连锁强度越大，两个连锁的非等位基因之间发生交换的孢母细胞数越少。重组率越接近50%，连锁强度越小，两个基因之间发生交换的孢母细胞数越多。物理距离与遗传距离不同。   在正常的条件下，重组值具有相对的稳定性，所以通常用重组率表示两个基因在同一染色体上的相对距离，称为遗传距离。其数值以重组率的数值去掉%表示，单位是“重组单位”或centi-Morgor(cM)。比如，CSh之间的重组率为3.5%，表示它们在染色体上相距3.5重组单位，或3.5cM。距离越近，重组率越小，反之亦然。   但重组率也受内外条件的影响而有新变化。如性别、年龄、温度等条件对某些生物连锁基因间的重组率都会产生影响。测定重组率时总是以正常条件下生长的生物为材料，并从大量资料中求得比较准确的结果。   植物及绝大多数的动物，连锁基因的重组值在雌雄中是差不多的。但也有极少数的动物，重组值在雌雄间不一样。例如，在雄果蝇和雌蚕中通常不发生交换，连锁基因完全连锁，不发生重组。   在黑腹果蝇中，灰色体B对黑体b为显性，红眼Pr对紫色眼pr为显性。这两个基因座位是连锁的。黑体红眼×灰体紫眼      bPr↓Bpr      bPr↓Bpr      灰体红眼      bPr      Bpr   F1雄灰体红眼×雌双隐性个体   bPrbpr   Bprbpr   黑体红眼灰体紫眼   1：1        以F1中雄蝇与双隐性雌蝇测交，因为雄蝇的小孢母细胞中不发生交换，所以只产生两种精子，bPr和Bpr，且比例相等，双隐性雌蝇当然只产生一种卵子，bpr，所以测交后代中只有灰体紫眼和黑体红眼两种亲本类型，比例为1：1。若用F1中的雌蝇与双隐性雄蝇测交，      F1（雌）灰体红眼×（雄）黑体紫眼   b+/+pr↓bpr/bpr   雌雄bpr   1++++/bpr灰体红眼1   19+pr+pr/bpr灰体紫眼19   19b+b+/bpr黑体红眼19   1bprbpr/bpr黑体紫眼1   重组值＝（1+1）/(1+19+19+1)＝0.05＝5%    家蚕正好与果蝇相反，雌的完全连锁，雄的连锁不完全。   \n在第二章曾讲过，形成配子过程中的减数分裂前期I同源染色体都要发生联会，并产生交换，形成交叉。联会是交换的条件，交叉是交换的结果。雄果蝇和雌蚕中没有重组，那么在细胞学上是不是有交叉呢？研究证明，细胞学上是能够看到交叉的。不过，这种交叉是没有交换的交叉。指重组型配子数占总配子数的百分率。   重组率（值）＝（重组型配子数）/(重组型配子+亲本型配子)×100%   应用这个公式首先要知道两大类配子的数目。 3．重组率和交换值      在遗传学中，还有一个概念叫做交换值（crossing-overvalue）。严格地说，交换值是指在连锁的两个基因之间非姊妹染色单体间发生交换的频率。   重组率是重组型配子占总配子数的比例。   如果所研究的两个基因之间的距离很短，或者说我们所关注的染色体片断很短，重组率就等于交换值。   我们用遗传学方法所测出来的只是重组率，而不是交换值。   如果我们所研究的两个遗传标记相距较远，或者说我们所关注的染色体片段比较长，其间可能发生双交换甚至多次交换，遗传学方法测定出来的重组率往往小于交换值。   有时候，常把交换值和重组率混用。第三节基因定位与连锁遗传图一、基因定位二、遗传连锁图一、基因定位     基因在染色体上有一定的位置。确定基因在染色体上的位置就叫做基因定位（genemapping）。      1、基因位于哪一条染色体上      2、基因在染色体上的位置      3、与相邻基因之间的关系   确定基因的位置主要是确定基因之间的相对顺序和距离。基因之间的距离是用重组率来表示的。   （一）两点测验   两点测验是基因定位的最基本的方法，它是通过一次杂交和一次测交来确定两对基因是否连锁以及它们之间的距离。前面所讲的测交法实际上就是两点测验法。但是，仅凭一次两点测验结果，不能确定两对基因在染色体上的顺序（即方向）。   假如要确定三对基因的位置，要做三个两点测验才能完成。设有A-a、B-b和C-c三对基因，其定位的具体步骤是：      1、通过一次杂交和一次测交，求出A-a和B-b之间的重组值，根据重组值确定它们是否连锁。      2、再通过一次杂交和一次测交，求出B-b和C-c之间的重组率，并根据重组率来确定它们是否连锁。      3、又通过同样的方法确定A-a和C-c是否连锁。      4、根据三个重组值的大小，确定这三对基因在染色体上的位置。   例：玉米籽粒颜色C-c\n(有色-无)，饱满（Sh）对凹陷（sh）为显性，非糯性（Wx）对糯性（wx）为显性，为了明确这三对基因是否连锁，曾有人做过三个两点测验。      1有色饱满×无色凹陷      CCShShccshsh      有色饱满无色凹陷      CcShsh×ccshsh3.6%      2饱满糯性x凹陷非糯      wxwxShShWxWxshsh      WxwxShsh×wxwxshsh20%      3非糯有色x糯性无色      WxWxCCwxwxcc      WxwxCc×wxwxcc23.6%   结果：1C-c和Sh-sh之间的重组值为3.6%      2Wx-wx和Sh-sh20%      3Wx-wx和C-c23.6%   这样，可以确定三个基因之间的顺序和距离如下图：      203.6      wx―――――――――Sh―――C   两点测验法有两大缺点：   （1）工作量大。要给三个基因定位须做三次杂交和三次测交。   （2）如果基因间距离较远，很可能发生双交换，而影响测定结果的精确性。（二）三点测验   三点测验是基因定位最常用的方法。通过一次杂交和一次测交，能同时确定三个非等位基因间的排列顺序和遗传距离，而且结果也比较精确。   仍以上述玉米的三对等位基因为例，介绍三点测验的具体步骤。   步骤：1杂交   2测交   凹陷非糯性有色×饱满糯性无色   shsh++++↓++wxwxcc   +Sh+Wx+c×shshwxwxcc   测交后代Ft表现型F1配子类型粒数交换类别   饱满、糯性、无色凹陷、非糯、有色饱满、非糯、无色凹陷、糯性、有色凹陷、非糯、无色饱满、糯性、有色饱满、非糯、有色凹陷、糯性、无色＋wxcsh＋＋＋＋cshwx＋sh＋c＋wx＋＋＋＋shwxc2708253862660111311642亲型}单交换}单交换}双交换   总数6708   如何分析上述结果呢？   第一步：判断这三对基因是否连锁。若这三对基因不连锁，即独立遗传（分别位于非同源的三对染色体上），测交后代的八种表现型应该彼此相等，而现在的比例相差很远。   其次，若是两对基因位于同一对同源染色体上，另一对独立，应该每四种表现型的比例一样，总共有两类比例值。现在的结果也不是如此。试验结果是每两种表现型的比例一样，共有四类不同的比例值，这正是三对基因连锁在同一对同源染色体上的特征。\n   第二步：确定排列顺序   既然这三对基因是连锁的，在染色体上就有一个排列顺序的问题。首先在Ft群体中找出两种亲本表现型和两种双交换表现型。双交换的可能性肯定是最少的，而亲本型个体数应该最多。   本例中无疑是+wxc和sh++为亲型   +++和shwxc为双交换型   三对基因，有三种可能的排列方式：   sh+++sh+shc+   +wxcwx+c++wx   只有第二种才能产生+++和wxshc两种双交换配子，其它两种都不可能。所以可以确定三个基因间的相对位置，是sh在wx和c之间。   用三点测验法确定三个基因在染色体上的顺序时，先要在Ft中找出双交换类型，尔后以亲本类型为对照，在双交换中居于中间的基因是三个连锁基因中的中间基因。确定了中间基因，排列顺序也就被确定了。   第三步，计算重组值，以确定三对基因间的遗传距离。   由于每个双交换是由两个单交换组成的，所以在估算两个单交换时，必须分别加上双交换值，才能正确地反映实际发生的单交换频率。   双交换值=（4+2）/6708×100％=0.09%   wx和sh间的重组率=(601+626)/6708×100%+0.09%=18.4%   sh和c间的重组值=(116+113)/6708×100%+0.09%=3.5%   三对基因在染色体上的位置和距离可以图示如下：      18.43.5      wx―――――――――――sh―――c      21.9cM   上述试验结果表明：基因在染色体上是呈线性排列的。（三）干扰和符合   如果两个单交换的发生是彼此独立的，双交换的频率就应该是两个单交换频率的乘积。   上例中，理论双交换值应该是   0.184×0.035=0.0064=0.64%   而实际双交换值只有0.09%   可见：一个单交换发生后，在它附近再发生第二个单交换的机会就会减少一些。这种现象叫做干扰（干涉）（interference）。   一般用符合系数来表示干扰的大小。   符合系数=实际双交换值   理论双交换值   上例中符合系数=0.09/0.64=0.14   符合系数愈大，表示干扰愈小。符合系数等于1，表示无干扰。符合系数为0，表示完全干扰，即一点发生交换，其邻近的另一点就不再发生交换。   干扰=1-符合系数\n二、遗传连锁图      基因在染色体上呈线性排列。位于同一对同源染色体上的基因组成一个连锁群（linkagegroup），它们具有连锁遗传的关系。   把一个连锁群的各个基因之间的顺序和距离标志出来，就成为连锁图（linkagemap），又称为遗传学图（geneticmap）（图）。   连锁图是大量实践资料的简明总结，是遗传研究工作和育种工作的重要参考资料。   一种生物连锁群的数目应该等于染色体的对数，有n对染色体就有n个连锁群。例如，水稻有12个连锁群，桃有8个，玉米有10个。连锁群的数目不会多于染色体的对数，但由于研究资料不足，可能暂时少于染色体的对数。   基因在连锁图上有一定的位置，这个位置叫做座位（locus）。一般以最先端的基因位置为0，但随着研究工作的不断深入，发现新的基因位于0座位外侧时，把0点让给新的基因，其余基因依次类推，作相应移动。应注意，0点并不是染色体的端点。   两基因之间的重组值介于0-40%之间，不会超过50%，但图上的距离常常超过50，那是多次累加的结果。要从图上数值查出基因间的重组值只限于邻近的基因座位间。位于同一染色体上的两个基因也可以表现为独立遗传，那是因为他们之间发生了多次交换的缘故。第四节真菌类的连锁与交换    除了二倍体的高等植物具有连锁和交换的遗传现象以外，单倍体的真菌也有连锁和交换的遗传现象。红色面包霉是遗传分析的好材料。原因如下：    （1）个体小，生长快，易于培养，数量多。    （2）它的染色体结构和功能类似于高等植物，且能进行有性生殖。    （3）是单倍体，没有显隐性的问题，基因型直接在表现型上反映出来。    （4）一次只分析一个减数分裂的产物，手续简便。一般的二倍体生物的合子是父母本两个不同减数分裂产生的孢子相互结合的产物，不易分析，测交的目的就是每次只研究一个减数分裂的产物，即配子的比例，但实验手续烦杂。而红色面包霉是先由单倍体融合成合子，尔后进行减数分裂，而且减数分裂后的产物可以直接观察。    四分子分析（tetradanalysis）：    单一减数分裂的4个产物留在一起，称作四分子。对四分子进行遗传学分析称为四分子分析。面包霉的减数分裂的四个产物不仅留在一起，而且以直线的方式排列在子囊中，这种顺序四分子在遗传学分析上有好多好处。    （1）初学者可以简单明了地算出分离比和计算重组率。    （2）子囊中子囊孢子的对称性可用以证明减数分裂是一个交互过程（reciprocalprocess）。    （3）可以把着丝粒作为一个座位（locus）计算某一基因与着丝粒之间的重组率。这就是着丝粒作图（centromeremapping）。  着丝粒作图（centromeremapping）    从野外采集来的面包霉能在简单的培养基上生长和繁殖，一般称之为野生型或原养型（prototroph）。在实验室中得到的突变型菌株（strain），一定要在培养基中添加某一营养物质才能生长，一般称之为营养缺陷型（auxotroph）。例如有一菌株一定要在培养基中添加赖氨酸才能生长，称之为赖氨酸依赖型（lysinedependent）。\n    把野生型记作lys＋或＋，赖氨酸缺陷型记作lys－或－。lys＋成熟后子囊孢子是黑色的，lys－是灰色的。lys＋与lys－杂交，所得到的子囊中的孢子，4个是黑色的（＋），4个是灰色的（—）。8个子囊孢子可有六个不同的排列方式（子囊型）（图5－10）：    非交换型：    (1)＋＋＋＋————firstdivisionsegregation      (2)————＋＋＋＋    交换型：     (3)＋＋——＋＋——      (4)——＋＋——＋＋seconddivisionsegregation    (5)＋＋————＋＋    (6)——＋＋＋＋——（1）和（2）是怎样产生的呢？交换发生在着丝粒与lys＋/lys－座位以外。中期I时，带有lys＋的两条染色体移向一极，带有lys－的两条染色体移向另一极。这样，就lys＋/lys－这一对基因而言，在第一次分裂时就分离了，称为第一次分裂分离。中期II时，着丝粒分裂，每一个染色单体相互分开，两个lys＋孢子排列在一起，两个lys－孢子排列在一起，再经过一次有丝分裂，形成＋＋＋＋――――或――――＋＋＋＋两种排列方式，又叫做两种子囊型。在形成这两种子囊型时，着丝粒和基因lys＋/lys－之间未发生过交换，所以称为非交换型。    (3)和(4)的形成经过交换发生在着丝粒与之间。中期I时，分配到每一子核的两条染色单体都是一个带有lys＋，一个带有lys－，所以第一次分裂没有出现分离现象。中期II时，才发生分离，所以称为第二次分裂分离。再经过一次有丝分裂形成4个孢子时，排列顺序是＋＋――＋＋――或――＋＋――＋＋。这种情况是由于lys＋/lys－与着丝粒之间发生了一次交换造成的，所以（3）和（4）是交换型。（5）和（6）也是交换型。其产生过程请自己画图作为练习。    子囊型（3）（4）和（5）（6）的出现表明交换发生在两条非姊妹染色单体间，也就是发生在四线期。    在（3）—（6）的4种子囊型中，其实只有两对孢子交换了位置，其余两对孢子维持原位。在（3）中，第二对与第三对交换了位置，第一对与第四对维持原位。也就是说，每发生一次交换，一个子囊中有半数孢子发生重组。所以，着丝粒与基因间的重组率为：    交换型子囊数        重组率＝×1/2×100％        交换型子囊数＋非交换型子囊数        这与二倍体物种中计算重组率的基本原理是一样的。        假如有10个子囊对lys座位是非交换型，有6个子囊对lys－座位是交换型，则        重组率=6/10+6×1/2×100%=18.75%一、性别决定        在雌雄异体的生物中，雌雄个体的比数大都是1：1。这是个典型的Mendel比数。所以很早以前人们就猜测，性别和其他性状一样，也是遵循Mendel规律而遗传的。1：1是回交比数，这意味着某一性别是纯合体，而另一性别是杂合体。后来的研究结果果然证实了上述设想。      性染色体：\n   我们知道，体细胞中的染色体数都是成双的，即体细胞中的染色体都是成对的，成对的染色体称为同源染色体，同源染色体在形态、大小、结构和功能上都是相同的。但是，后来发现并非全然如此，在许多生物的体细胞中，往往有一对染色体是异形的，在形态、大小，结构以及功能上都有所不同，而这一对染色体往往   与性别的决定有关。   与性别决定直接有关的这一对染色体称为性染色体（sexchromosome），性染色体以外的所有染色体就称为常染色体（autosome）。      性染色体决定性别   性染色体决定性别的主要方式可以分为两大类，XY型和ZW型。   ⑴XY型性别决定   人的体细胞中有46个染色体，可以配成23对，其中22对在男人和女人中是一样的，叫做常染色体。另外有一对是性染色体，在女性体细胞内成对，叫做X染色体，而在男性体细胞中，只有一个X染色体，与其配对的是一个很小的叫做Y的染色体。经过减数分裂形成生殖细胞时，男人可以产生两种精子，一种是22个常染色体+X染色体，另一种是22个染色体+Y染色体，两类精子的比数相等，而女人只能产生一种卵子，22常染色体+X染色体。带有X的精子与带有X的卵细胞结合形成XX合子，发育为女性，带有Y的精子与带有X的卵细胞结合形成XY合子，发育为男性。就整个人群而言，XX与XY是相等的，即男性与女性之比（简称性比）应该是1：1。这是在没有人为干扰的情况下，假如有人为的干扰，就会造成性比不平衡。这是计划生育工作的障碍之一，性比不平衡，就会造成社会的不安定。   这种性别决定的方式叫做XY型性别决定。雄性是异配性别，可以产生两种配子，雌性是同配性别，只能产生一种配子。   XY型性别决定在生物界较为普遍，很多♀♂异株的植物，很多昆虫，某些鱼类，两栖类，全部哺乳动物的性别决定都是XY型。   与XY型相似的还有XO型，♀性染色体是XX，雄性的性染色体只有一个X，而无Y，不成对。♂性个体也产生两类配子，一类带有X，另一类不带X（只有常染色体），故称为XO型，蝗虫就是XO型。   ⑵ZW型性别决定   ZW型正好与XY型相反，♀性为异配性别，又称杂合型，♂性为同配性别，又称纯合雄性。以家蚕为例，2n=56，n=28。      ♀性产生两种配子：27个常染色体+Z      27个常染色体+W      ♂性只产生一种配子：27个常染色体+Z。      ♀♂配子受精结合时，所形成的♀♂性比仍是1：1。   鳞翅目昆虫（蛾类、蝶类），爬行类，某些两栖类及所有的鸟类（包括鸡、鸭）都是ZW型。   ⑶其他类型的性别决定   A．性染色体与常染色体的比值决定性别   例如，在正常情况下，果蝇的性别决定是XY型，♀果蝇性染色体是2X，而常染色体记为2A，两者之比是X：A=2：2=1。但是，若某个体内只有一个X，而常染色体仍是2A，则X：A=1：2=0.5,该个体便发育成雄性。同样，X:A=3:2=1.5,就发育为超雌性，X:A=1:3，为超雄性。X:A=2:3,为间型(intersex)。超雄或超雌个体的生活力都很低,且高度不育,间型也是不育的.   表5－3果蝇的染色体组成与性别的关系   X(条)A(套)X/A性别X(条)A(套)X/A性别   321.5超♀340.75间性   431.33超♂230.5间性\n   441.0♀(4倍体)120.5♂   331.0♀(3倍体)240.5   221.0♀(2倍体)130.33超♂   人类的情况与此相似，性染色体的数目若有增减，性别决定的机制就要受到干扰而出现性别畸型。   a.Klinefelter综合症   患者的外貌是男性，较一般男性要高，但睾丸发育不全，不能形成精子，常出现女性似的乳房，智力差，无生育能力，体细胞内的染色体数是2n=47，XXY，较正常男性多一个X染色体，比女性又多一个Y染色体。   b.XYY个体   外貌男性，有的智力差，有的智力高与一般人。据说这种人常有反社会行为，富攻击性，在犯人中的比例高于正常人群，但无定论。有生育能力，2n=47，XYY。   c.Turner综合症   外貌女性，矮小，第二性征发育不良，无卵巢，原发性闭经，无生育能力，婴儿时颈部皮肤松弛，长大后常有蹼颈，肘外翻，往往有先天性心脏病，智能低下，偶尔也有正常的，2n=45，XO。   Tuner综合症患者(XO个体)的发生率远比Klinefelter综合症患者(XXY个体)为低，因为XO受精卵的致死率较高。   从人类的性别畸形看，有以下几个特点：   a.多一个性染色体或少一个性染色体，常使性腺发育不全，失去生育能力。   b.Y染色体有特别强烈的男性化作用，有Y染色体存在时，性别分化就趋想男性，体内出现睾丸，外貌也象男性，没有Y染色体存在时，就趋向女性，体内出现卵巢，外貌也象女性。   c.少一个性染色体比多一个性染色体的不良影响大，XO远比XXY个体少见。   此外，还应该注意，人和果蝇都是XY型决定的，但人的Y染色体在性别决定中起着至关重要的作用，有Y染色体就有睾丸组织，没有Y染色体就没有睾丸组织，所以XO个体是不育的女性，而在果蝇中，Y只跟育性有关，XO个体是不育的雄性。   表人和果蝇的几种性别畸形的比较   XOXXYXYY备注   人不育女性不育男性可育男性Y决定睾丸的存在   果蝇不育雄性可育雌蝇可育雄蝇Y决定育性    蜜蜂的蜂皇与雄蜂交配以后，雄蜂就死亡，蜂皇得到的精子足够一生生儿育女的需要，可以用四五年。蜂皇每次产下来的卵，有少数是不受精的，行孤雌生殖而发育为雄蜂，染色体数是n=16，为单倍体。受精卵可以发育为纯合体的雌蜂(蜂皇)，也可以发育为不能生育的雌蜂(工蜂)。决定受精卵发育成工蜂或蜂皇的因素是他们的营养条件，具体说，是他们能够吃到的蜂皇浆的质和量。蜂皇浆是工蜂头部的一些腺体产生的，未来的工蜂只吃二三天蜂皇浆，且质量差，孵化后经21天才发育为成虫。而对未来的蜂皇供应五天蜂皇浆，且质量好，孵化后16天就能发育成熟。与工蜂相比，长得大而丰满。蜂皇和工蜂都是2n=32。但由于环境的不同，发育的方向就不同。.   那么，单倍体的雄蜂怎样产生有功能的精子呢？雄蜂的精母细胞的减数分裂很特殊，第一次分裂时只产生单极纺锤丝，把染色体完全拉至细胞的一极，另一极只产生一个无核的细胞质小体，而第二次分裂是正常的，结果，每一个精母细胞仅产生两个精细胞，而不是四个，从保证了精细胞的染色体数仍为16.\nC、少数基因决定性别   一般情况下，植物的性别不象动物那样明显。低等植物只在生理上表现出性的分化，很少有形态上的差别。高等植物绝大多数是♀♂同株的，或者是♀♂同花的，或者是♀♂同株异花，也有很少数的高等植物是雌雄异株的，其中也有很少的物种有性染色体的存在，如大麻、菠菜、番木瓜、石刁柏等。有报道说，蛇麻是XY型性别决定型,雌株为XX,雄株为XY。即使是♀♂异株的植物，有时也会出现♀♂同株的变异。例如菠菜除了纯粹的雌株和雄株以外，还会出现雌花多雄花少,雄花多雌花少,♀♂花大致相等的三类植株，这表明性别的分化也是植物进化过程中自然发生的。在生产上菠菜是收获营养体的,雄株抽薹早，自然不受欢迎，所以想通过选择，选出雄株少的品种，这样做是有效果的，可是一放松选择，雄株就会增加。   玉米是♀♂同株异花，顶生的花序是雄花序，侧生的花序是雌花序。已知有若干基因可以改变玉米的性别，也就是能把♀♂同株转变成♀株和♂株，使♀♂同株转变成♀♂异株。基因ba纯合时,使植株没有♀花序，成为♂株。ts纯合时,使♂花序成为♀花序,不产生花粉。   babatsts♀株,无果穗，在顶端♀花序上产生卵细胞。   babaTs_♂株,仅有♂花序。   Ba_tsts顶端和叶腋都着生♀花序   Ba_Ts_正常珠   ♀babatsts×babaTs♂   ♀G♂Gbats   baTsbatsBabaTsts♂1Babatsts♀1    适当地改变基因型，可将玉米从♀♂同株转变为♀♂异株。这样就在玉米中建立起一个新的性别决定系统。植株的性别由Tsts的分离来决定，Ts-ts基因所在的染色体就成为事实上的性染色体，雄株可产生两种配子，是异配性别,♀株是同配性别。   这一实验暗示我们,这可能是植物进化过程中分化的一条途径.4.环境对性别分化的影响   蠕虫的性别决定   海生蠕虫后益的性别决定方式很特殊。雌雄个体的体型大小悬殊,雌虫有2寸长，身体象一粒豆子，口吻很长，远端分叉。雄虫很小，生活在雌虫的子宫内，象一种寄生虫。这种蠕虫的性别决定全然凭机会，自由游泳的幼虫是中性的，如果落在海底，就成为雌虫，若碰机会，一个幼虫落在的雌虫的口吻上，就发育为一个雄虫。若把已经落在雌虫口吻上的幼虫从口吻上移开,让它在远离雌虫的情况下继续发育，成为间性。其生理特征倾向于雌虫还是雄虫视其在雌虫口吻上滞留的时间长短而决定的。据研究雌虫口吻上有一种类似激素的化学物质,强烈地影响幼虫分化。这是环境在性别决定上起重要作用的典型例证。不过也有报道说，幼虫是落在海底还是附着在雌虫的口吻上是又有其遗传基础的。   性别也是一种性状,是发育的结果,所以性别分化既受遗传的控制,也受环境的影响.   牛一般是怀单胎的,偶尔也有怀双胎的。如怀异卵双胎,且性别不同时,生下来的雌犊往往要受影响,外部生生殖器官基本正常，但性腺很象睾丸，所以没有生育能力。这是什么原因呢?   原来牛怀双胎时,两个胎儿的胎盘是共通的,绒毛膜的血管相互连通。当两个胎儿的性别不同时,往往雄性胎儿的睾丸先发育,先分泌雄性激素,通过绒毛膜血管流向胎儿,从而影响雌性胎儿的性别分化，使其趋向间性，失去生育能力。此外，细胞也可以通过绒毛膜血管流向对方。在孪生雄犊体内曾发现过XX组成的雌性细胞。\n雌犊体内曾发现过XY组成的细胞。由于Y染色体在哺乳动物中有强烈的雄性化作用，XY组成的细胞很可能会干扰孪生雌犊的性别分化，造成不育，异性双胎中雌犊不育的事实告诉我们，虽然性别的遗传基础在受精时已经决定，但性别分化的方向可以受到外来激素或外来异性细胞的影响而发生变化的。   母鸡司晨现象也是由于环境条件的变化所引起的。原来生蛋的母鸡因患病或受创伤，使卵巢退化或消失，促使残存的精巢发育而分必出雄性激素，从而产生母鸡叫鸣的现象。这里激素起了决定性的作用，遗传基础并没有改变。司晨母鸡的性染色体仍然是ZW型而未发生变化。   多数母鸡向公鸡的转化，性的转变往往不完全，不能进行遗传学研究。刘祖洞、梁志成（1980）曾得到一只非芦花斑纹的变性公鸡，以前产过卵，后来不产卵了，逐渐向雄鸡转化，最后能和母鸡交配。用这只非芦花变性公鸡与芦花母鸡交配，得到的子一代中，雄的全为芦花鸡，母鸡中既有芦花鸡，也有非芦花鸡，与伴性遗传不同。   原因是这只变性非芦花鸡是母鸡转变过来的，性别虽然改变了，遗传结构却没有改变，仍旧是ZbW，与正常芦花母鸡（ZBW）交配后有如下结果：   变性♂鸡×正常芦花鸡（♀）   ZbWZBW   ZBZbZBWZbWWW（死亡）？   ♂芦花♀芦花♀非芦花      结论：性别也是一个单位性状。表现型可以受环境的影响而改变，但基因型是不会马上发生相应的改变的。   植物性别的分化也受境条件的影响。雌雄同株异化的黄瓜在早期发育中若施用较多的氮肥，缩短光照时间，可以有效地提高雌花的数量。   延长日照或缩短日照，可以改变大麻的性别。大麻在夏季播种，只有正常的雌株或雄株，从秋季到第二年春季，尤其是12月份把大麻种在温室里，50-90%的雌株逐渐变为雄珠，有的甚至完全变为雄珠。综上所述，关于性别决定问题可以总结为：   1、性别同其他性状一样，受遗传物质的控制，环境条件可以影响性别，但不会改变原来决定性别的遗传物质。   2、环境条件能够影响性别甚至转变性别，是以性别有向两个方向发育的自然性为前提条件的。   3、性别决定的遗传基础是多种多样的。有的是性染色体的组成决定性别，有的是性染色体与常染色体的平衡决定性别，有的是染色体的倍数性决定性别，还有的是个别基因决定性别。最常见的的是性染色体的组成决定性别。二、性连锁      我们知道，基因位于染色体上，性染色体上当然也会有基因存在。位于性染色体上的基因，除了控制与性别有关的性状以外，也有一些控制其它性状的的基因存在。   位于性染色体上的基因所控制的性状在遗传方式上自然跟常染色体上的基因所控制的性状有所不同。其表现总是与性染色体的动态联系在一起。这种遗传方式称为性连锁遗传（sex-linkedinhertance）。   性连锁遗传包括伴性遗传、限性遗传和从性遗传。   （一）伴性遗传   1、果蝇的伴性遗传\n果蝇的野生型眼色都是红色，1910年，Morgan发现一只雄蝇，复眼的颜色全白。这只白眼雄蝇与普通红眼雌蝇杂交，子一代不论雌雄都是红眼，子二代中雌的全是红眼，雄的一半是红眼，一半是白眼。眼色之比为3红：1白，与一对基因的分离比例相符，所不同的是白眼全是雄蝇。   P红眼♀×♂白眼   X+X+XWY   F1X+XWX+Y   红眼♀红眼♂   F1红眼♀（X+XW）×♂红眼(X+Y)   ♂G♀GX+Y   X+X+X+红♀X+Y红♂   XWX+XW红♀X+Y白♂   Morgan也做了回交试验，最初的那只白眼♂蝇和它的女儿交配：   F1红眼♀(X+XW)×白眼♂(X+Y)   ↓   ♂G♀GX+Y   X+X+X+（1/4）X+Y（1/4）   XWX+XW（1/4）X+Y（1/4）     F1群体中，红眼♂蝇，白眼♀蝇，红眼♀蝇，白眼♀蝇各占1/4。   根据上述3个实验的结果，Morgan假设：控制白眼性状的基因座位在X染色体上，是隐性的，而Y染色体上不带有这个基因的显性等位基因。所以最初发现的那只♂蝇的基因型是XwY，表现为白眼，w基因处于半合状态，不受显性基因的遮盖。与白眼♂蝇交配的那一只红眼♀蝇的基因型是++，+为野生型基因，w为突变型基因，它们是等位的，都在X染色体上，写成X+和XW。   根据Morgan的假设，白眼♀蝇与红眼♂蝇交配，子代中♀蝇都是红眼，♂蝇都是白眼。实验结果的确如此。   白眼♀×红眼♂   XWXWX+Y   X+Y   XWX+XWXWY   红眼♀白眼♂   这种现象称为交叉遗传：外祖父的性状通过女儿在外孙身上体现，或者女儿象父亲，儿子象母亲。这就是伴性遗传的特征。因为有关的基因在X染色体上，所以又称为X连锁遗传（X-linkedinheritance）。   Morgan这个工作的意义不仅在于揭示了伴性遗传现象，而且第一次把一个特定的基因与一个特定的染色体联系起来，也就是说把Mendel的遗传规律与细胞学结合起来，创立了细胞遗传学，又叫遗传的染色体学说。   2、人类的伴性遗传：   人类的色盲是X连锁遗传的，教材上已经讲得很清楚。这里再举一个血友病遗传的例子。\n   下图是一个血友病患者的家系。   患者都是男性。男性患者的子女都正常。男性患者的正常女儿可以生下有病的外孙。   解释：血友病基因h位于X染色体上，隐性，记作Xh，Y染色体上没有显性等位基因。男人只有一个X染色体，h基因处于半合状态，而在女人只有在XhXh纯合时才能发病，所以患者几乎都是男性。   男性患者的基因型是XhY，正常女性为X+X+，两人结婚后，男人把X染色体传给女儿，把Y染色体传给儿子，因而女儿都是致病基因的携带者（carrier），但不发病，表型正常。而儿子没有得到致病基因，表型也正常。所以男性患者的子女表型都正常。   患者XhY×正常女性X+X+   X+XhX+Y   女正常男正常   若女人是携带者（X+Xh），男人正常时（X+Y），生下的女儿有两种基因型，X+X+和X+Xh，表现都正常，儿子也有两种基因型，X+Y和XhY，前者正常，后者为患者。   X+Xh×X+Y   X+X+X+XhX+YXhY   1：11：1   色盲、血友病，都是由男人通过女儿遗传给外孙的半数。可见，男人血友病基因不传给儿子，只传给女儿，但女儿不表现血友病，却能生下患病的外孙。代与代之间出现明显的不连续现象。   犬、马也有血友病，其遗传方式与人一样，用狗做各种方式的杂交实验，其结果与理论推导是一样的。2、鸡的伴性遗传   鸡的性别决定方式是ZW型，伴性遗传的基因在Z染色体上，所以又叫做Z连锁遗传（Z-linkedinheritance）。   芦花鸡的绒羽黑色，头上有黄色斑点，成羽为芦花斑状。雌芦花母鸡与非芦花雄鸡交配，子一带中，雄的都是芦花，雌的都是非芦花。子二代中，雌雄中芦花都与非芦花各占一半。   非芦花♂×芦花♀   ZbZbZBW   F1♂ZWZb芦花♀ZbW非芦花   F2   ♂G♀GZBZb   ZbWZBZbZbZbZBWZbW   在养禽场里，为了提高鸡的生产性能，用芦花毛做指示性状，用芦花母鸡×非芦花公鸡，它们的子代生活力强，而且根据绒羽上有无黄色头斑，就可以区别雏鸡的雌雄。   那么，反交，既芦花公鸡与非芦花母鸡交配的结果又如何呢？请课后自己演算。\n（二）限性遗传   限性遗传（sex-limitedinheritance）是指某些性状只局限于雄性或雌性上表现。   控制这些性状的基因在XY型动物中位于Y染色体上，在ZW型动物中位于W染色体上。限性遗传与伴性遗传不同，只局限于一种性别上表现，而伴性遗传则既可在雄性上也可在雌性上，只是表现频率有些差异。（三）从性遗传   从性遗传(sex-controlledinheritance)又称为性影响遗传(sen-influencedinheritance)。它是指在一个物种内由于体内环境的影响使位于常染色体上的基因所控制的性状只出现在雄体或只出现在雌体，或在一个性别为显性而在另一性别则为隐性的现象。   例如，不同品种的羊的角有不同的表现。一种是雌雄都有角，另一种是雌雄都无角，此外还有的品种是雄的有角雌的无角。如果前两种羊交配，F1群体中雌性无角，雄性有角。反交也是如此。第六章染色体变异一、缺失deficiency一．定义：丢失了某一区段的染色体称为缺失染色体。二．分类    ①末端缺失（terminaldeficiency）缺失区段位于染色体的一端。ab·cdefg→ab·cdef   ②中间缺失（interstitialdeficiency）缺失了某一臂的中间一段。ab·cdefgh→ab·cdghTerminaldeficiency只涉及一次断裂，断裂后的chrm形成一个有centromere的片段和一个无centromere的片段。无centromere的片段在后来的细胞分裂过程中由于不能移向两极而丢失。有着丝粒的片段其断裂末端是不稳定的，有可能与原来的另一个片段重建愈合，不形成结构变异。也有可能与另一个有着丝粒的片段愈合形成双着丝粒（decentricchrm）染色体。双着染色体在细胞分裂的后期多数受两个着丝粒向相反方向移动形成的拉力所拉断，再次造成结构变异而不能稳定存在。顶端缺失染色体也可能在复制以后，姐妹染色体在断裂末端愈合，同样形成。双着丝粒染色体一定会在后续的细胞分裂中产生更为严重的断裂和结构变异，最终导致细胞或个体的死亡。一旦死亡，变异就被淘汰。所以，末端缺失染色体在自然界是很少见的。而中间缺失染色体没有粘性末端外露，因而比较稳定。常见的缺失染色体多是中间缺失的。   染色体也可能缺失一条整臂，而变成端着丝粒染色体（telocentricchromosome）。   在体细胞内，某一对同源染色体中若一条正常，另一条缺失，这个生物体被称为缺失杂合体若两个同源染色体均缺失相同区段的生物个体被称为缺失纯合体（deficiencyhomozygote）。  三．缺失的成因和细胞学鉴定   成因：断裂愈合。一次断裂，形成末端缺失，两次断裂，可能形成中间缺失。SeeFigure8-1   细胞学鉴定：   缺失的细胞学鉴定是比较困难的。在发生缺失的当代细胞中，其分裂过程中可以见到无着丝粒的染色体片段。随着细胞世代的增加，片段丢失。只能根据染色体在减数分裂过程中的配对情况加以鉴别。末端缺失杂合体形成的二价体不等长。   中间缺失杂合体，与缺失区段相对应的正常区段会被排斥在外而形成瘤或环。\n   缺失纯合体在形态上无法鉴别，只有通过核型分析，与正常细胞中的相应染色体比较，才能获得有关信息。   若缺失区段很小，鉴定更加困难四．缺失的遗传效应chrm缺失的生物个体，由于chrm片段的丢失，势必丢失了缺失区段内的遗传物质，破坏在长期进化过程中适应了的遗传平衡。1．缺失的致死效应   染色体是遗传物质的载体，染色体缺失必然导致遗传物质的丢失。遗传物质的丢失，通常都是对生物体的生长和发育都是有害的。其有害程度视缺失的遗传物质的多少及其重要性大小而不同。   在高等生物中，缺失纯合体通常是很难生存下来的。在缺失杂合体中，若缺失区段较长时，或缺失区段虽不很长，但缺少了对个体发育有重要影响的基因时，通常也是致死的。只有缺失区段不太长，且又不含有重要基因的缺失杂合体才能生存，但其生活力也很差。   含缺失染色体的配子体一般都是败育的。花粉尤其如此，♀配子的耐受性略强。含缺失染色体的♂配子即使不败育，在授粉后受精过程中也因竞争不过正常♂配子而不能传递。因此，缺失染色体主要是通过♀配子而遗传的。2．假显性现象   如果缺失的区段很小，而又不带有重要基因，缺失杂合体是可以存活下来。如果某一隐性基因所对应的等位显性基因正好位于缺失区段内，则该隐性基因处于半合状态。由于没有显性基因的遮盖，该隐性基因得以表现。这种现象被称为假显性现象（pseudodominance）。   染色体结构变异最早就是从缺失的假显性中发现的。1915年，C.B.Bridges在研究黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）的棒眼遗传时发现，棒眼（Bareye,B）对正常红眼（B+）是显性。该基因位于Xchrm上，伴性遗传。红眼♀蝇×棒眼♂蝇      （B+B+）↓（B）      BB+F1♀应该是棒眼      B+-♂应该是红眼    但是，C.B.Bridges在某些杂交组合的子代群体中却发现了红眼♀蝇。开始以为是发生了突变，B+→B。检查部分的唾腺染色体，发现在少数幼虫的唾腺细胞内，体细胞联会的两条Xchrm中都一条短缺了一小段。据此，Bridges推测，子一代中之所以出现红眼♀蝇，是因为它的那一条由精子带来的Xchrm上缺失了一小段，而基因B正是位于缺失区段上，这就使正常Xchrm上B+的红眼效应得到了表达的机会，发育为红眼雌蝇。   这种假显性现象，很容易与隐性突变混淆，二者很难区分，必须通过相应的细胞学检查才能确定，不能仅根据表现型来判断。   当chrm的缺失区段很小时，正常区段与缺失区段的关系，相当于正常基因与隐性等位突变基因的关系。   如何区别微缺失和基因突变?二、重复Duplication重复Duplication   五．定义：chrm的某一区段加倍的结构变异称为重复。   六．分类：一般分为两大类。1．在同一染色体臂内重复，称为同臂重复。又可分为   ①顺接重复abcdecdef·ghi\n   ②反接重复abcdeedcf·ghi   2．在一个臂内重复了另一个臂内的一部分，称为异臂重复。   abcdef·gcddehi   七．重复的细胞学鉴定   缺失与重复都必须通过细胞学检查才能确定，然而，这种细胞学检查并不是很容易的。   对于缺失杂合体和重复杂合体，一般是在减数分裂的偶线期和粗线期进行检查。如果缺失和重复的区段位于染色体臂的中部，且既不是太长，又不是太短，则正常chrm和变异chrm所联会成的二价体常会出现环形或瘤状突出。   二者都能形成这种突出物，如何区分呢？从理论上讲，这两种突起是有本质的不同的。在缺失杂合体内，瘤或环是由正常chrm形成的。而在重复杂合体内，瘤或环则是由变异chrm形成的。   所以，必须参照chrm的正常长度、着丝粒的位置、染色体和染色粒的正常分布等进行比较才能区别这两种结构变异。   对于缺失和重复纯合体的鉴别就更难了。除了参照少数特征进行比较以外，还必须应用染色体分带的技术。   对于微小的缺失和重复也是很难鉴别的。   四、重复的遗传学效应。1．总体上说，对于生物体而言，不论重复的区段是长还是短，其危害程度均小于缺失。换句话说，生物体对重复的耐受性大于对缺失的耐受性。即使是重复纯合体也能较好地生长，更不用说杂合体了。含有重复chrm的配子也较少败育。尽管如此，重复毕竟改变了生物进化过程中长期形成的遗传平衡，必然会带来相应的遗传效应。2．重复的剂量效应   果蝇的Xchrm上有一对与眼色有关的基因，V+-V，位于第10区B段与C段交界处。正常情况下，V+为V的显性。V+的表型效应为红色，V为朱红色，V+V为红眼。Bridges曾经得一条Xchrm，其上有V，又重复了一小段带有V+的区段，在同一染色体上有V+V。该重复纯合体♀蝇的基因型是V+V/V+V。表现为红色眼。这种情形是可以理解的。当该♀蝇与朱红色眼的♂蝇（V∥）杂交后，F1群体中的♂蝇基因型为V+V∥，红眼，这是正常的。♀蝇的基因型为V+V∥V，眼色却是朱红色的。这种情形就是不正常的了。   这说明两倍剂量的隐性基因V的表型效应超过了只有一份剂量的显性基因V+的表型效应，这就是基因的剂量效应。3．重复的位置效应   最著名的关于基因剂量效应和位置效应的例子还是关于果蝇棒眼的研究。   1925年，发现棒眼的许多种形状的出现与Xchrm上B所在区段的不等交换有关。（见图8-4）   由于不等交换，产生了一条16A区段重复的Xchrm，表现为棒眼。野生型果蝇的每个复眼大约由780个左右的红色小眼组成。16区A段重复以后小眼数量显著减少，只有358个左右。而重复纯合体的小眼数只有69个。这是基因的剂量效应的最好例证。   假如16区A在一条Xchrm上重复两次，而另一条Xchrm正常，就剂量而言，与重复纯合体相同，但其小眼数则下降为45个。这是由于重复区段所在的位置不同，这就是所谓的位置效应。重复区段的位置不同，表现型的效应不同。基因的表现型效应因其所在染色体的位置不同而有一定程度的改变，这种现象称为基因的位置效应。 三、倒位定义：染色体的某一区段或某些区段的直线顺序颠倒了的染色体结构变异称为Inversion。\n   分类：   1、简单倒位（simpleinversion）：一条染色体内只发生一次倒位。又分为：      a.臂内倒位：倒位的区段不包含着丝粒（paracentricinversion）.      b.臂间倒位：倒位的区段包含着丝粒（pericentricinversion）.   2、复杂倒位：一条染色体内发生两次或两次以上的倒位。复杂倒位又分为若干种，这里不多讲。   一个个体对于倒位可以是纯合体，也可以是杂合体。倒位纯合体在细胞学上是完全正常的，也不会影响个体的生活力。   倒位的细胞学鉴别   用细胞学方法鉴别倒位的根据仍是倒位杂合体在减数分类列时的形象。倒位杂合体在减数分裂时，两条同源染色体不能以直线形式配对。可以分为以下三种情况。   若倒位区段很长，减数分裂的偶线期（zygotene）和粗线期（pachytene）倒位区段会反转方向配对，正常区段则排除在配对区段之外。   若倒位区段太短，则有可能倒位区段不配对。   若倒位区段既不太长又不太短，就有可能形成可见的倒位圈。这样，倒位区段能够联会，非倒位区段也能联会。   倒位圈也许看起来同缺失、重复而形成的环相似，但本质不同。倒位圈是两条chrm共同形成的，后者则是由一条chrm组成的。四、的遗传学效应所以常见的缺失多为中间缺失。   3．对于倒位纯合体而言，倒位区内与倒位区外的基因之间的重组率改变了。   染色体发生倒位以后，倒位区段内的基因的直线顺序颠倒了。倒位区内的基因与倒位区外的基因的距离随之发生改变。如上图，f与g之间原来交换值为5%（5centimorgan）。Def区段倒位以后，f与g之间的交换率变为15%了。   倒位不仅改变了基因之间的交换值，也改变了基因之间固有的相邻关系，从而造成遗传性状的变异。因此，倒位是物种进化的重要途径之一。   据研究，很多近缘物种就是由于一次再次的倒位形成的。通过种间杂交，根据杂种减数分裂时染色体的联会情况，就可以分析物种之间的进化关系。2．倒位杂合体的部分不育   对于臂内倒位杂合体而言，只要非姐妹染色单体在倒位圈内发生交换，就有可能产生下列四种染色单体。   ①无着丝粒的染色单体片段。   ②双着丝粒的缺失染色单体   ③缺失染色单体或既缺失又重复的染色单体。   ④正常染色单体和倒位但不缺失的染色单体   臂间倒位杂合体，着丝粒在倒位圈的外面，环内发生交换以后，虽然不会出现桥和断片，但也会使交换过的染色单体带有缺失和重复，形成不平衡的配子。这些配子一般也是没有生活力的。   不论是臂间倒位还是臂内倒位，只要在环内有交换发生，交换过的染色单体都带有缺失和重复，进入配子后往往引起配子的死亡，使得最后参与受精的配子几乎都是在环内没有发生过交换的。所以倒位的一个遗传学效应就是可以抑制或大大地降低倒位区段内同源染色体的交换与重组。所以有时又把倒位称为“交换抑制因子”。   前述用muller-5技术检测果蝇X-连锁的隐性致死突变和用平衡致死系统检测常染色体隐性突变的例子中都用到了抑制交换的遗传学效应。   （见图8-7)\n   而上述第④类染色单体只有发生了相互双交换时才能产生。上述①②③类都是在倒位圈内发生一次交换的产物。凡得到第①类，在减数分裂的后期I丢失。第②类在后期形成桥（染色体桥），尔后被拉断，变成缺失chrm，得到这种chrm的孢子是不育的。第③类本身缺失，或者既缺失又重复，得到它们的孢子也是不育的。所以，倒位的一个遗传学效应就是倒位杂合体的部分不育3、倒位杂合体降低了某些连锁基因之间的重组率。   主要原因有两个方面。①得到交换过的染色单体的配子大多是不育的。交换值的计算方法是：重组型配子数/总的配子数。其表示方法是测交后代中重组型个体的比例。含有交换染色单体的配子是不育的，就降低了重组型配子的数目，因而降低了重组率。②由于倒位，倒位区段必须形成倒位圈才能与未倒位的相应地区段配对。而在倒位区段与非倒位区段交接处同源染色体之间的配对不如未倒位的正常区段紧密。我们知道，配对是交换的前提，配对不密切，当然在空间位置上影响交换，从而降低重组率。   例，玉米In5a(S.O-L.67)是一个臂间倒位，包括从短臂靠近着丝粒处起到长臂Pr-pr座位的区段。   不仅倒位区段内bt1-pr之间的重组率下降，而且bt1与倒位区段外的bm1,a2的重组率也下降了。   再如，果蝇第3chrm，其上有这样几个基因    以前认为果蝇中存在着一种交换抑制因子(C,crossingoverrepressor)，其实因子本身不过是一个或几个倒位，而所谓抑制交换，不过是因为在倒位杂合体（C/C+）中，在倒位环内发生过单交换的产物不能发育成有功能的配子，因而好象交换被抑制了。   例如，果蝇第1染色体上有一倒位品系，CⅢB，在第3染色体上有一个倒位，但外观上是野生型；另有一纯合突变品系，第3染色体正常，突变基因是st(scarlet,猩红眼),，sr(stripe,条纹胸),e(ebony,黑檀体),ro(rough,粗糙眼),ca(claret,紫红眼)。这两个品系杂交，子一代杂合体♀蝇再回交纯合突变品系。在e-ro区域。倒位附近的sr-e间单交换数降低很多，由预期的8%降低到0.15%，说明倒位可能部分地伸展到这个区域。离开倒位稍远，在st-sr间，交换值由预期的18%降到9.6%，然而还是很高，说明这个区域在倒位区以外。只发现两个不寻常的基因型，都可用倒位区段内的双交换说明，因为倒位区段内双交换所形成的产物没有重复和缺失，是正常的。这一例子说明，倒位可以大大地降低倒位环内基因的重组率。   melanogaster的st.sr.e.ro.ca品系的雄蝇与基因顺序为st.sr.ca.ro.e的倒位杂合♀蝇杂交。可以看到，所有的交换产物基本上都在倒位区以外，可见倒位可以抑制倒位区内基因的重组。为简便起见，纯合突变个体(c+)和纯合倒位个体(CⅢB)仅画出同源染色体中的一条。 四、易位一．定义：易位是指两个非同源chrm之间chrm片段的转移或互换。易位是染色体间的结构变异，与缺失、重复、倒位不同。   二．分类：   1．简单易位（simpletranslocation）:chrm的一个片段易位到了另一个非同源染色体上。这种易位比较少见。   2．相互易位（recirocaltransloocation）两个非同源chrm之间片段的相互交换。三．细胞学鉴别   相互易位的纯合体没有明显的细胞学特征，减数分裂时的配对是正常的。可以稳定地从一个世代传递到另一个世代。\n   在减数分裂的zygotene和pachytene，相互易位的杂合体的染色体的同源区段同时发生联会。因此而常形成“十字”形图象。终变期（diakinesis）又可形成四体环或四体链，或“8”字形图象。   （见图8-9）四．遗传学效应．易位改变了基因之间的连锁关系。原来位于第1chrm上的一小段转移到了chrm2上，其上所载的基因本来与chrm1上的基因连锁，易位以后变为与chrm2上的基因连锁了。原来位于第2chrm上的一小段转移到了chrm1上，其上所载基因原来是与chrm2上的基因连锁的，现在已转变为与chrm1上的基因连锁了。   经研究，许多植物的变种就是这样产生的。比如，直果曼驼罗（Daturastramonium），有12条染色体，分别标为1·2，3·4，5·6……21·22，23·24，这是原型一系。原型2系就是第一染色体和第九染色体的易位纯合体，1·18，2·17，原型3系是chrm6和chrm11的易位纯合体。已查明100个左右的变异系都是通过易位形成的易位纯合体，它们的外部形态各不相同。   易位还可能造成融合，从而导致染色体数目发生变化，使两个连锁群合并为一个连锁群。假如两个近端着丝粒染色体，一个在靠近着丝粒的长臂一侧断裂，另一个在靠近着丝粒的短臂一侧断裂，相互易位以后，一个得到两正常染色体的小部分。几乎不含有有用的基因，很容易在易位杂合体配子时丢失。另一个得到了两个正常染色体的绝大部分，成为大染色体。纯合以后，染色体数减少一个，而遗传物质损失很少。植物中的还阳参属内的物种染色体数就是这样递减的。从n=8、7到n=6、5、4、3不等2．易位杂合体的半不育（semisterility）   semisterility是易位杂合体的显著特点。根据图8-9，易位杂合体在减数分裂前期联会成“十”字形，diakinesis因交叉端化而成为四体环或“8”字形。   一般情况下，这种四联体都是2/2分离的。在四体环中，2/2分离的时候，无论怎样分配，总是相邻的两个着丝粒趋向一极，另外两个相邻着丝粒趋向另一极。所以被称为相邻式分离。相邻式分离得到的二分子中，或者是1﹒12和2﹒21，或者是1﹒21和2﹒12，无论哪种都只含有重复缺失chrm。这些孢子都不能发育成正常能育的花粉和胚囊。   中期Ⅰ成为“8”字形结构的那些四联体，实质上还是一个四体环，只不管是空间构型改变了。正是由于这种空间构型的改变，使得它们可能进行相间式或者叫做交替式的2/2分离。交替分离产生的二分子，要么得到1、2两条正常chrm,要么得到12和21两个相互易位了的chrm。得到1﹒2的二分子当然发育成可育的♀♂配子，得到12和21的二分子也不曾缺少或增加任何遗传物质，在遗传上也是平衡的，因而也能发育成正常的♀♂配子。然而，交互式分离时，两条易位染色体进入细胞的一极，两个非易位染色体进入另一极，使非同源染色体上的基因间的自由组合受到抑制，出现假连锁现象。一般地说，交替式分离和相邻式分离比例相差不大，都在50%左右。这就是易位杂合体的半不育性（semisterility）。对有的易位杂合体来说。可能交替式分离多一些，对于另外一些杂合体来说则可能相邻式多一些。   易位杂合体只能产生两种可育配子，所产生的可育配子中有一半含有1﹒2两条正常chrm，一半含有12和21两条易位染色体，在自交子代群体内，1/4是完全正常的个体，1/4是完全可育的易位纯合体，2/4仍是半不育的易位杂合体（12，1，2，21）。   这就是P137上讲的，植物中的半不育现象，即花粉一半败育，胚囊也一半败育，结实率50%左右。由半不育植株自交种子长成的植株又有半数是可育的，半数是半不育的。   从这一点说，在易位杂合体中，易位chrm的易位接合点相当于一个半不育的显性遗传单位（T）而正常chrm上与之对应的等位点就相当于一个可育的隐性遗传单位（t）。TT、tt均可育，Tt半不育。利用这一特性，可以给基因定位或确定T的位置。\n   若某一基因与易位点（T）连锁，且相距较近，可以用两点或三点测验法，测出T与该基因间的大致距离。见图8-10   玉米长节间基因（Br）为短节间（br）的显性。某玉米的株高正常，但半不育，与完全可育的矮生品系杂交，再用该矮生品系与杂种群体中的半不育株测交，在测交子代中：   株高正常、完全可育27植株矮化、半不育42   植株矮化、完全可育279株高正常、半不育234   重组率11.85centimorgan3．易位杂合体邻近接合点得计引进的重组率下降。   重组率下降的主要原因是联会不紧密。   玉米第5染色体和第9染色体的一个相互易位系，涉及第5染色体长臂的外侧一小段，和第9染色体短臂包括Wx座位在内的一大段，在正常的第9染色体上，yg2与sh之间的重组率为23%，sh和Wx之间的重组率为20%，但易位杂合体的这两个重组率分别下降为11%和5%。第二节染色体数目的变异   染色体不仅会发生结构变异，也会发生数目变异。染色体可以增加一个或几个，也可以减少一个或几个，也可以增加一套或几套。当然，随着染色体数目的变异，生物体的遗传性状也会随之发生相应的变异。一、染色体组和染色体基组。    我们平常见到的大多数植物都是二倍体（diploid），动物几乎全部是二倍体。我们所接触到的农作物，如玉米2n=20，水稻2n=24，大麦2n=14等也都是二倍体。为什么叫做二倍体呢？因为在这些生物的体细胞中含有两个染色体组。何谓染色体组：由形态、结构和连锁基因群都彼此不同的几个染色体组成的完整而协调的遗传体系。    染色体组的基本特征：增加或缺少其中任何一条都会造成遗传上的不平衡，从而导致对生物体不利的遗传效应。    在遗传学上，染色体组用n表示。在这里，n有两个基本含义：①染色体组（genome）的标志符号；②表示配子所含的染色体数目。以玉米为例，n=10,2n=20。n=10是指玉米的正常配子内的染色体数是10；2n=20是指玉米体细胞内含有20条染色体，也就是说玉米孢子体内（或者说是体细胞内）的染色体数是20。对于这样的物种，我们称之为二倍体物种。但是，对于小麦而言，情况则有些不同。小麦是一个属。属内分为若干种。各个种之间的染色体数是不相同的。    一粒小麦、野生一粒小麦　　　2n=14,n=7    二粒小麦、硬粒小麦、圆锥小麦、提莫菲维小麦　　2n=28,n=14。    斯卑尔脱小麦、密穗小麦、普通小麦　　　2n=42,n=21。    这三种类型之间，染色体数都是以７为基数变化的。７是小麦属的染色体基数，以x代表。2n=14,n=7的小麦种，配子内含有７条染色体，这七条染色体称为一个基本染色体组。     显然，2n=14的小麦体细胞内含有2个基本染色体组，故而称为二倍体。在小麦属内，2n=28的种，染色体数是７的４倍，称为四倍体（tetroploid），2n=42的种，染色体数是７的６倍，称为六倍体。染色体数是染色体基数的三倍以上的生物体又称为多倍体（polyloid）。如四倍体、六倍体。多倍体对应于二倍体。\n    四倍体2n=4x的物种与二倍体2n=２x的物种杂交，得到2n=３x的杂种，称为三倍体。2n=６x的物种与2n=4x的物种杂交，得到杂种2n=５x，称为五倍体。三倍体、五倍体也是多倍体。    对于普通小麦2n=６x＝42。到底叫做二倍体呢还是叫做六倍体呢？在细胞遗传学的范围内有必要给予区别。其实，叫做二倍体或者六倍体都行。叫它做二倍体，是因为它含有两个染色体组，叫它做六倍体，是因为它含有６个染色体基组。我们把含有偶数个染色体基组的生物体叫做双倍体。双倍体产生的配子，叫做单倍体（haploid）。    对于二倍体生物2n=２x，染色体组就是染色体基组，n=x，双倍体就是二倍体，它产生的配子是单倍体，但都含有一个染色体基组，所以也是一倍体（monoploid）。对于多倍体，如四倍体、六倍体，是双倍体，但它们产生的配子是单倍体，但却含有２个或３个染色体基组，所以不是一倍体。2n=４x，配子n=２x，是单倍体，但同时又是二倍体。在习惯上，不大使用双倍体这个概念，常常将双倍体与二倍体混用。二、染色体数目变异的概念和分类1、整倍性变异    就高等生物而言，大多数物种的孢子体世代都是双倍体，视之为正常情况。在此基础上，染色体数目的增加或减少，都被认为是发生了染色体数目的变异。以染色体基数为基础，染色体数成倍地增加或减少的变异称为整倍性变异。体细胞中的染色体数是染色体基数的整数倍的生物体称为为整倍体（euploid）。2、非整倍性变异    有个别（一个或几个，但不是一个染色体基组）染色体的增加或减少的染色体数目变异称为非整倍性变异。发生了非整倍性变异后的生物体称为非整倍体（aneuploid）。3、整倍体的同源性和异源性。    有些多倍体的三个或三个以上染色体基组是相同的，它们都来自于同一个祖先物种，称为同源多倍体（autopolyploid）。有些多倍体所含有的染色体基组的性质是不相同的，来自于不同的祖先物种，称为异源多倍体（allopolyploid）。    上述是指稳定的物种而言，若是单个生物体，二倍体也有异源的。比如两个物种远缘杂交的后代就是异源二倍体。    同源多倍体最主要的来源是二倍体物种的染色体直接加倍。异源多倍体的最主要来源是远缘杂种的染色体加倍。见图6－16。假如有三个二倍体物种：甲、乙、丙。    甲二倍体的染色组（基组）以Ａ表示，由a1、a2、a3三个染色体组成。２n=2x=AA=(a1a2a3)　(a1a2a3)=a1a1a2a2a3a3=６=3Ⅱ乙二倍体的染色体组（基组）以Ｂ表示，由b1、、b2、、b3三个染色体组成，２n=2x=BB=（b1b2b3）（b1b2b3）＝b１b１b２b２b３b３＝3Ⅱ＝６丙二倍体的染色体组（基组）以Ｅ表示，由e1、e2、e3三个染色体组成，２n=2x=EE=（e1e2e3e4）（e1e2e3e4）＝e1e1e2e2e3e3e4e4＝8＝4ⅡＡ、Ｂ、Ｅ是亲缘关系很远的三个染色体组。使甲、乙、丙三个二倍体的染色体数加倍，分别形成甲、乙、丙三个不同的同源四倍体。其染色体组成分别是：2n=4x=4A=AAAA=12=3Ⅳ2n=4x=4B=BBBB=12=3Ⅳ2n=4x=4E=EEEEEE=16=4Ⅳ若甲同源四倍体与甲二倍体杂交，子代就是同源三倍体。2n=３x=ＡＡＡ=９=3Ⅳ\n    同源多倍体的合子染色体数是同一染色体组（x）多次加倍的结果。其特点是，同源染色体在体细胞内不是两个成对地出现，而是三个、四个，乃至更多个成组地出现。    若甲二倍体与乙二倍体杂交，甲的配子是n=x=A=a1a2a3，乙的配子是n=x=B=b1b2b3，子代的合子染色体组是2n=2x=AB=6，使杂种的染色体数加倍，得到2n=4x=AABB=12=6Ⅱ的异源四倍体。若上述异源四倍体（AABB）与丙二倍体(EE)杂交，得到异源三倍体杂种(ABE)，使其染色体加倍，就得到异源六倍体，2n=6x=AABBEE=20=10Ⅱ。异源多倍体是由染色体组不同的两个或更多个二倍体合并而成的多倍体。若异源多倍体的染色体数再加倍，得到同源异源多倍体（autoallopolyploid）。如：　　　AABBEEAAAABBBBEEEE=40=10ⅣAABBAAAABBBB=24=6Ⅳ这是甲、乙及甲、乙、丙三个二倍体合并起来的多倍体。4、非整倍体（Aneuploid）    非整倍体可以分为超倍体和亚倍体。    染色体数多于2n，或者说，比正常染色体数增加一个或几个染色体的非整倍体称为超倍体（hyperploid），染色体数少于2n的非整倍体称为亚倍体（hypoploid）。非整倍体的种类很多，我们只介绍在遗传学研究中有代表性意义的几种。三体（trisomic）：2n+1，如AA=a1a1a2a2a3a3a3　,比2n多一条a3染色体，减数分裂时可能联会成(n-1)Ⅱ＋Ⅲ。四体（tetrosomic）：2n+2,a1a1a2a2a3a3a3a3，比2n多两条相同的a3a3染色体，减数分裂时形成（n-1）Ⅱ+Ⅳ。三体和四体都是超倍体。单体（monosomic）：2n-1,a1a1a2a2a3,比2n缺少了一条a3染色体，减数分裂时形成（n-1）Ⅱ+Ⅰ。缺体（nullisomic）：2n-2,a1a1a2a2,比2n缺少一对同源染色体。单体和缺体都是亚倍体。相对于各种非整倍体，称正常的2n个体为双体（disomic）。（在研究整倍性变异中，称正常2n个体为双倍体。）表6－1三、单倍体和一倍体    一般地说，具有配子染色体数的生物称为单倍体生物。自然界的绝大多数生物都是双倍体的。动物界有自然存在的单倍体（haploid），如某些膜翅目昆虫（蜂、蚁）和某些同翅目昆虫（白蚁）的雄性。它们都是由未受精的卵（n=x）发育而成的（单性孤雌生殖）。在植物界，只有二倍体低等植物的配子体世代是能够自养生活的单倍体，如二倍体藻菌类的单核菌丝体，二倍体苔藓类的配子体等。在高等植物中也会偶然出现一些植株弱小的单倍体，几乎都是由不正常的生殖过程而产生的，如孤雌生殖和孤雄生殖，一般都不能繁殖后代。也可以通过花药培养、胚培养等途径人工创造单倍体，但若不进行染色体数目加倍，这些单倍体也是很难保存的。    单倍体生物，尤其是单倍体植物，又分为两类：由二倍体产生的单倍体称为一倍体（monoploid），又称为单元单倍体（monohaploid）。由偶倍数多倍体产生的单倍体称为多元单倍体（polyhaploid）。单倍体2n=2x,4x,6x;n=x,2x,3x一倍体2n=2x,n=x\n    由此可见，一倍体是单倍体，单倍体却不一定是一倍体。严格地说，只有一倍体才是真正的单倍体。一倍体的细胞学行为。    在高等植物的一倍体（n=x）的体细胞中，虽然每个染色体都是成单存在的，但它们的有丝分裂过程是正常，因为有丝分裂不涉及染色体配对的问题。正是由于一倍体的有丝分裂正常，其植株才能生长发育。然而，一倍体的减数分裂则是很不正常的。因为，在一倍体的孢母细胞内，任何染色体都是单个的，减数分裂前期Ⅰ均不能联会成二价体（bivalent），只能各自独立成为x个单价体（univalent）。这些单价体在减数分裂过程中有三种可能的表现。    ①后期Ⅰ随机趋赴纺锤体的某一极，后期Ⅱ姊妹染色单体正常分离；    ②单价体在后期Ⅰ提早着丝粒分裂并进行姊妹染色单体的均衡分离，后期Ⅱ各个染色单体随机趋赴纺锤体的某一极；     ③单价体或染色单体在中期不迁移到赤道面上，后期也无法迁移到纺锤体的两极，以致被遗弃在子核以外，最终在细胞质中消失。这三种表现的结果，都会使最后形成的大孢子或小孢子不是缺少x个染色体中的这一个或这几个，就是缺少那一个或那几个，很少能得到一整套x个染色体。因为每一个染色体分配到这一极或那一极的概率都是1/2，所有x个染色体都分到一极概率是(1/2)x。除了极少数含有x个染色体的孢子能够发育成有功能的配子以外，其余的都不能发育为花粉或胚囊。于是造成一倍体的严重不育。至于含有两个或两个以上染色体基组的多元单倍体，假如这些染色体基组之间没有亲缘关系，其减数分裂行为同一倍体。若这些染色体基组之间有部分同源关系，前期Ⅰ可能会有部分配对，但其结果仍然是高度不育的。四、同源多倍体autopolyploid1、同源多倍体的形态特征：①随染色体的倍数的增加，核体积和细胞体积随之增大。②叶片大小、花朵大小、茎粗和叶的厚度随染色体组数目的增加而递增，成熟期随之递延。③同源多倍体的气孔大，但数量少。但是，这些形态特征也不是随染色体倍数性的增加而无限增长的，有一个限度，这个限度因物种而异。总之，随着基因剂量的增加，生化活动随之加强。2、同源多倍体的来源    目前，同源多倍体的产生和保持大多是人为的。产生同源多倍体的途径主要是染色体的人工加倍。保存多倍体的途径主要是无性繁殖。自然产生多倍体的频率不高，且很难保存，主要因为是高度不育，不能留下后代，即使留下子代，却不再是原来的同源多倍体，而成为非整倍体。自然产生同源多倍体的机制：有丝分裂中染色体已经复制而细胞质不分裂；未减数的配子结合。同源多倍体自然出现的频率：①年生植物高于一年生植物。一年生植物如果在变为多倍体的当年不开花结实，就绝种。多年生植物还可以等待来年。②自花授粉植物高于异花数粉植物。自花授粉植物自交得到同源多倍体的机会比较大，异花授粉植物在变为同源多倍体之后。只能同二倍体原种杂交，产生高度不育的三倍体后代。\n③无性繁殖植物高于有性繁殖植物。自然存在的同源多倍体不多，常见的有：香蕉，同源三倍体（2n＝3x＝33）；黄花菜(Hemerocallisfulsa),2n＝3x＝33；水仙(Narcisuisfazetta),2n＝3x＝30。马铃薯，同源四倍体。    人工创造的同源多倍体有：同源三倍体西瓜，同源三倍体甜菜等。    在同源多倍体减数分裂时，三个、四个或更多个同源染色体大多联合成一个多价体。比如，玉米的同源三倍体在减数分裂时联会成10个三价体（Ⅲ），而同源四倍体玉米则联会成10个四价体（Ⅳ）。3、同源三倍体的减数分裂     在同源三倍体中，每一个同源染色体组有三个成员。这三个染色体在大多数的情况下联会成一个Ⅲ。但是，在这个三价体内，任何同源区段内只能有两条染色体联会，而将第三个染色体的同源相应区段排斥在联会之外。因此，每两个同源染色体之间都只能是局部联会。这样，在三价体内，每两个染色体之间的联会区段少于二价体。图6－17      由此又导致联会松弛，交叉减少，就可能提早解离（desynapsis）。提早解离就是三价体在转移到纺锤体的赤道面之前就解离成一个二价体和一个单价体。同源组的三个染色体成员也可能其中两个联会成比较紧密的二价体，另一个不参与联会，而形成单价体。Ⅰ+Ⅱ后期Ⅰ，凡二价体都是1/1均衡分离，细胞两极各得到一个。单价体则有三种可能。①趋向其中一极。②遗弃在细胞质中，不能到达任何一极。③着丝粒提前分裂，两条染色单体各趋向一极。这样，减数分裂的第二次分裂又不正常了。     就一个同源组而言，减数分裂产生的孢子中，有的含有一条染色体，有的含有2条染色体。对n个同源组而言，情况就复杂了。孢子中，染色体数从n-2n的都有，且n/2n分配的仅占极小的比例（1/2）n-1，绝大多数孢子都是介于n-2n之间的，是不平衡的，都不能发育成正常可育的配子体。至于形成平衡合子的机会就更小了。所以，同源三倍体是高度不育的。由于三倍体的不育，它在自然界很少存在。有时二倍体的特定组织是三倍体。如玉米和其它禾谷类子粒的胚乳是三倍体。见图6－17，表6-2。    因为同源三倍体高度不育，我们不讨论基因在同源三倍体中的分离。人们利用同源三倍体，主要是利用它的不育性。如：三倍体西瓜，三倍体等等。4、同源四倍体减数分裂    在同源四倍体中，每个同源组具有四个成员，在减数分裂过程中的联会同样遵循上述原则：每个同源区段内，只能有两条染色体联会。所以，一个同源组在分裂前期的联会可能出现下列四种情况：①大多数联会成四价体Ⅳ②一个三价体和一个单价体　Ⅲ+Ⅰ③两个二价体　Ⅱ+Ⅱ④一个二价体和两个单价体　Ⅱ+Ⅰ+Ⅰ    三价体、四价体都可能在中期Ⅰ以前提早解离。后期Ⅰ，Ⅱ+Ⅱ的只能是2/2分离，Ⅳ亦主要是2/2分离，其余两种情况，可能是2/2分离，也可能是3/1分离，极少数还可能是2/1分离。3/1，2/1为不均衡分离。但是，总体上说，以2/2分离为主。见图6-18每个同源组都可能发生不均衡分离，染色体数不完整和组合成分不均衡的孢子占有较大比例，造成同源四倍体产生的部分配子是没有功能的，子代群体内染色体数多样化。\n     玉米同源四倍体花粉母细胞减数分裂时，每个同源组的联会主要是四价体(Ⅳ)和两个二价体（Ⅱ+Ⅱ），其它形式的联会很少。这两种联会主要是2/2分离，所以多数配子是20个染色体，大约占50%左右。    在玉米中，多于20或少于20个染色体的配子也能参与受精（但不是都参与受精）。因此，玉米同源四倍体的育性一般下降5-20%。因而，同源四倍体玉米的子代群体内，植株间的染色体数差异很大，从20-47都有，2n=40占60%左右。但，即使是40个染色体的植株，并不一定每个同源组都是4条染色体，可能有的同源组多于4条，有的少于4条，而平均是4条。5、同源四倍体的基因分离：    由于同源四倍体的染色体分离主要是2/2分离，育性明显高于同源三倍体，因而有必要研究同源四倍体的基因分离规律。基因分离与染色体分离既有联系又有区别。染色体分离是基因分离的物质基础。当我们所研究的基因距离着丝粒很近，其间一般不会发生姊妹染色单体的交换，则该基因随着染色体的分离而分离。称为染色体随机分离（randomchromosomesegregation）。若所研究的基因距着丝粒较远，与着丝粒之间容易发生非姊妹染色单体的交换，基因表现为染色单体随机分离（randomchromatidsegregation）。我们讲基因分离一定是指杂合体而言的，纯合体不存在基因分离的问题。在同源四倍中，某一同源组的某一位点上，可能有五种基因型：AAAA,AAAa,AAaa,Aaaa,aaaa,其中三种杂合体分别称为三式、复式、单式。染色体随机分离（RandomChromosomeSegregation）以三式杂合体为例，讨论同源四倍体中基因的染色体随机分离条件：①联会成Ⅵ，2/2式分离。②基因与着丝粒很近，其间不发生交换。见图6-19。在这种情况下，A-a座位与着丝粒很近，其间不发生交换，A-a座位与原来所在的染色单体（着丝粒）的位置不发生改变。三种分离方式的分离单位仅仅是四个染色体，所以被称为染色体随机分离（RandomChromosomeSegregation）。三式同源四倍体的染色体随机分离产生的配子种类和比例为（AA）：（Aa）=1：1当A对a为完全显性，看不到分离现象。若两种♀♂配子具有同样的受精能力，自交后代中无隐性个体出现。(AA+Aa)2=1AAAA:2AAAa:1AAAa即使用完全隐性个体aaaa与其测交，也不会出现隐性表型的个体。复式和单式的基因分离大家自己去推演。6、异源多倍体    在高等植物中，异源多倍体是普通存在的。在中欧，约有2/3的植物属是由异源多倍体组成的，在被子植物中，异源多倍体种占1/3，禾本科中约70%的种是异源多倍体。偶倍数的异源多倍体     自然界能够自繁的异源多倍体种基本上都是偶倍数的。在偶倍数的异源多倍体内，每组同源染色体都只有两个成员，减数分裂时能象二倍体一样联会成二价体。所以，性状遗传规律与正常二倍体是完全相同的。    异源四倍体又称为双二倍体（amphidiploid）。如普通烟草，    2n=4x=TTSS=48=24Ⅱ。     异源多倍体的形成过程与同源多倍体基本相似，主要有两条途径：①原种或杂种的未减数配子受精结合。    原种的未减数的♀♂配子含有相同的染色体组，受精结合就产生同源多倍体，若含有不同的染色体组，就形成异源多倍体。\n在二倍体桃树（2x=16=8Ⅱ）的大量花粉中挑选出体积特别大的花粉粒，1202粒，给二倍体桃树授粉，在所产生的30株子代植株中，有7株是同源三倍体（3x=24=8Ⅲ）。这说明产生这7株同源三倍体的花粉是未减数的（n=2x=16）。萝卜（Raphanassativus2x=RR=18=9Ⅱ）甘蓝(Brassicaoleracea2x=BB=18=9Ⅱ)这两个种杂交的F1，2n=2x=RB=18=9Ⅱ，是异源二倍体，高度不育，但是，偶尔能产生极少数的含有全部18条染色体的配子。♀配子中有，♂配子中也有，这两种配子结合，就能产生2n=4x=RRBB=36的异源四倍体，定名为Raphanobrassica。②合子染色体数加倍    人工创造异源多倍体的主要途径是染色体的人工加倍。拟茸毛烟草（Nicotionatomentosiformis）,2n=2x=TT=24=12Ⅱ,与美化烟草(N.sylvestris),2n=2x=SS=24=12Ⅱ杂交，F12n=2x=TS=24，染色体数加倍成2n=4x=TTSS=48=24Ⅱ，形态上恰好与普通烟草相似。这与从其他途径推测的普通烟草的进化途径相吻合。普通小麦，是由一粒小麦（Triticummonococcum,2n=2x=AA=14=7Ⅱ）,拟斯卑尔脱山羊草(Aegilopsspeltoides,2n=2x=BB=14=7Ⅱ)和方穗山羊草(Aegilopssquarrosa,2n=2x=DD=14=7Ⅱ)这三个物种组合而成的。人工诱导多倍体的实验揭示了普通小麦系的演化过程。一粒小麦×拟斯卑尔脱山羊草AA↓BBAB↓染色体加倍AABB其性状恰与异源四倍体的二粒小麦相似AABB×DD方穗山羊草↓ABD↓染色体加倍AABBDD性状似斯卑尔脱小麦↓一系列基因突变普通小麦    在异源多倍体中，不同的染色体基组之间也可能有部分的同源关系。例如在普通小麦中，A、B、D三个染色体组之间就有部分同源关系，1A、1B和1D是部分同源的，2A、2B和2D也是部分同源的，以此类推。部分同源的染色体之间有少数基因相同或相似，在遗传功能上可以有部分相互替代的能力。控制小麦子粒颜色有三对基因，R1-r1,R2-r2,R3-r3，分别位于3D、3A和3B上。在正常情况下，减数分裂过程中，1A与1A联会，1B与1B联会，1D与1D联会，称之为同源联会（autosynapsis）。倘若在单倍体中（n=3x=ABD=21），由于1A找不到另一条1A，就可能与1B或1D联会，当然是部分联会。称为异源联会（allosynapsis）。在单倍体中，不同染色体组之间能否发生联会，也是确定这两个染色体组之间有无同源关系的重要依据之一。节段异源多倍体    在异源多倍体中，不同染色体组之间有少部分的同源性，并不影响减数分裂的正常进行，也不会影响育性。    但是，倘若不同染色体组之间部分同源的程度很高，减数分裂时除了象典型异源多倍体一样的二价体出现以外，还会出现或多或少的四价体，以致造成某种程度的不育。这样的多倍体称为节段异源多倍体（sementalpolyploid）。\n节段异源多倍体介于同源多倍体和异源多倍体之间。奇倍数的异源多倍体     奇倍数的异源多倍体多为偶倍数多倍体种间杂交的子代。     例如，异源六倍体的普通小麦（6x=AABBDD=42=21Ⅱ）与异源四倍体的圆锥小麦（4x=AABB=28=14Ⅱ）杂交，F1就是奇倍数的五倍体（2n=5x=AABBD=35=14Ⅱ+7Ⅰ）。再如，普通小麦与异源四倍体的提莫菲维小麦（2n=4x=AAGG=28=14Ⅱ）杂交，F1也是奇倍数的异源五倍体（2n=5x=AABDG=35=7Ⅱ+21Ⅰ）。     这两个异源五倍体在减数分裂时具有不同的细胞学特征。在普通小麦×圆锥小麦的F1孢母细胞内将形成14个二价体和7个单价体（14Ⅱ+7Ⅰ），而普通小麦与提莫菲维小麦的F1孢母细胞内只能形成7个二价体（A组），其余BDG组的染色体均不能配对，而以21个单价体的形式出现。由于减数分裂前期Ⅰ单价体的出现，都表现为不育或部分不育。后一个F1的不育程度要比前一个F1严重得多。因为，单价体数越多，染色体的分离越紊乱，配子染色体数及其组合成分越不平衡。所以，自然界的物种很难以奇数倍的异源多倍体存在，除非它可以无性繁殖。    在奇倍数的异源多倍体中，有些异源五倍体又被称为倍半二倍体（sesquidiploid）。    例如，普通烟草是异源四倍体（4x=TTSS=48）；粘毛烟草（Nicotianaglutinosa）是二倍体（2x=GG=24）,G与T、S是完全异源的。将普通烟草与粘毛烟草杂交，得F1（2n=3x=TSG=36）,使其加倍，得到新的异源六倍体植物，6x=TTSSGG=72=36Ⅱ。再以普通烟草与这个异源六倍体回交，产生异源五倍体便称为倍半二倍体，即普通烟草的染色体组在它的细胞内是双倍的，而粘毛烟草的染色体组却是单倍的。在育种工作中，人为地创造一个倍半二倍体是进行染色体替换的一个很重要的手段。人工诱发多倍体的应用    人工创造多倍体是现代育种工作的一个重要手段，其目的是为了克服远缘杂交不孕性和远缘杂种不育性，创造远缘杂交育种的中间亲本以及育成作物新类型。人工创造的多倍体可以是同源的，也可以是异源的。克服远缘杂交的不孕性    在植物育种工作中，常常需要使一些亲缘关系较远的植物杂交，以便得到兼具两个物种特征特性的杂交后代，这就是所谓的远缘杂交。然而，远缘杂交常常不能成功，即杂交不孕，不能得到杂交种子。    例如，以白菜（Brassicachinensis,2x=20=10Ⅱ）为母本，与甘蓝（Brassicaoieracea,2x=18=9Ⅱ）杂交，122朵杂交花，没有得到一粒种子；以甘蓝为母本与白菜反交，70朵杂交花，也没有得到一粒种子。后来，将甘蓝的染色体加倍，成为同源四倍体（4x=36=9Ⅳ），以四倍体甘蓝与白菜进行上述的正反交，当四倍体甘蓝为父本时，155朵杂交花，结了209粒种子，长出了127棵杂种植株；用四倍体甘蓝为母本时，131朵杂交花，结了4粒种子，都长成了植株。所以，在进行种间杂交前，使一个亲本种加倍成同源多倍体，是克服种间杂交不孕的一个途径。克服远缘杂种不育性     远缘杂交时，亲本染色体组之间一般都是非同源的，F1个体减数分裂时必然出现大量的单价体，造成严重不育。若使F1植株的染色体数加倍，则减数分裂时各个染色体都能找到配对伙伴，联会成二价体，由不育而成为可育。创造远缘杂交育种的中间亲本为远缘杂交育种创造多倍体的中间亲本，实际上是克服远缘杂种不育性的另一种表现形式。\n    例如，普通烟草不抗花叶病，粘毛烟草抗花叶病，由于普通烟草与粘毛烟草杂交的F1是不育的，阻碍了抗病基因（N）由粘毛烟草向普通烟草的转移。若将F1加倍成异源六倍体，就成为将抗病基因（N）转移给普通烟草的中间亲本了。粘毛烟草（2x=GG=24），携带抗花叶病的显性基因N，普通烟草与粘毛烟草杂交F1（3x=TSG=36），得到了粘毛烟草的抗病基因N，但不育。使F1加倍，成为异源六倍体(6x=TTSSGG=72=36Ⅱ)既抗病又可育，但具有粘毛烟草的野生性状。在育种上，只要粘毛烟草的抗病基因，而不需要它的野生性状。以这个异源六倍体为中间亲本，再与普通烟草杂交，实际上是回交，从中选择抗病植株再与普通烟草回交，如此反复多次，最后可以得到抗花叶病的普通烟草品种。育成作物新类型     许多重要的农作物是四倍体或六倍体，它们是在进化过程中自然形成的。生产上直接应用的同源多倍体最好是多年生的，可以无性繁殖的，以收获营养体为目的的，如同源四倍体的马铃薯、同源多倍体的果树等，有着特殊的利用价值，而且可以固定杂种优势。    人工创造多倍体为育种开辟了新的途径。    人工创造的同源四倍体荞麦（4x=32=8Ⅳ），经过几代的选择，得到几个比二倍体(2x=16=8Ⅱ)产量高3-6倍的品系，而且还能抗霜冻。同源四倍体黑麦产量比二倍体高30%，同源三倍体的甜菜产糖量比二倍体高20%。同源三倍体西瓜高度不育，无籽，大大提高了商品价值。异源多倍体比同源多倍体更能直接应用于生产。人工创造的异源多倍体的典型实例是小黑麦。    目前栽培的小黑麦有异源六倍体和异源八倍体两种。小黑麦，顾名思义是小麦与黑麦的合成种。六倍体小黑麦（AABBRR）的小麦亲本是硬粒小麦(T.durum)或波斯小麦(T.persicum)，八倍体小黑麦(AABBDDRR)的小麦亲本是普通小麦(T.aestivum)。国外栽培的主要是六倍体小黑麦，分布在五十多个国家，我国栽培的主要是八倍体小黑麦。普通小麦×黑麦AABBDD42↓RR14ABDR（28）↓加倍AABBDDRR（56）     八倍体小黑麦产量高，抗逆性和抗病性强，耐瘠耐寒，面粉白，蛋白质含量高，发酵性能好，茎秆可作青饲料，适于高寒山区种植，目前主要在云贵高原、黑龙江北部推广，比当地小麦增产30-40%，比黑麦增产20%左右。第七章细菌和病毒的遗传1细菌和病毒遗传研究的意义 生物的简单分类自然界所有的生物都可以归入真核生物(eukaryote)和原核生物(prokaryote)两大类。    细菌和蓝绿藻属于原核生物。构成原核生物的细胞是原核细胞。原核细胞最基本的特征是没有明确的核膜和核结构，也没有线粒体等细胞器，不能进行典型的有丝分裂和减数分裂，只通过简单的裂殖方式增殖。因此，它们的遗传物质传递和重组的方式与真核生物不同。      病毒是最原始的生物，没有细胞结构，甚至自己不能进行自主分裂，只能在宿主细胞内以集团形式增殖。  遗传学研究从经典水平发展到细胞水平，一个重要的条件是Morgan利用了果蝇这个模式试验材料。从细胞水平发展到分子水平，有两个必不可少的条件：（1）对基因的物理结构和化学结构的了解；（2）以微生物为研究材料。\n   §1细菌和病毒遗传研究的意义一、细菌（Bacteria） 细菌是单细胞生物，是地球上最多的一类生物，它占据了地球上大部分的生物干重。   细菌的繁殖非常快，在适宜的条件下，每20分钟就能繁殖一代，从一个细胞裂殖变成两个细胞。假如以一个细胞为基数，繁殖一代成为2个，繁殖2代成为4个。繁殖n代，就有2n-1+1个。一昼夜以24小时计，可以繁殖72代，总个数为271+1＝2.36×1021。   细菌的基因组很小，只有一条染色体，研究起来非常方便。细菌群体大，即使突变率很低，也很易得到各种不同的生化突变型。   细菌遗传研究的方法：    用液体培养基培养细菌，待其繁殖到一定程度，用吸管吸取几滴培养液，滴到固体的琼脂糖培养基上，用一根灭菌的玻璃棒涂布均匀。若涂布的细菌浓度很低，单个细胞可以分散开来（图7－2）。由于每个细胞不移动的裂殖增生，经过大约一夜，每个细胞的后代可达107个，且集合成群，成为肉眼可见的菌落（colony），或称为克隆（clone）。   单个细菌繁殖而成的菌落中，每个细胞的遗传组成都应该是一样的，但可以发生突变，突变后所形成的菌落也会发生相应的变化。突变有几类：形态性状突变、生理特性突变、抗性突变。菌落形状的突变包括菌落的大小、形状和颜色。如引起小鼠肺炎的野生型肺炎双球菌本来形成大而光滑的菌落，而有一种突变形的菌落小而粗糙。   生理特性的突变主要是丧失合成某种营养物质的能力，称为营养缺陷型。如野生型细菌可以自己合成色氨酸，可能突变以后就不能合成了，若不在培养基中添加色氨酸，该菌就会死亡。营养缺陷型可以用不同的选择培养基来检测。   抗性突变主要是指抗药性的突变。在野生型细菌培养基中加入青霉素（penicillin），可以阻止细胞壁的形成，从而杀死细菌。但有抗penicillin的菌株，记为penr，对penicillin敏感的菌株(野生型)记为pens。   检测突变的方法——影印法（图7－3）。    ①先在一个母板（masterplate）上使细菌长成菌落。    ②用一个比培养皿略小的木板，包上消过毒的丝绒。在母板上印一下，使菌落吸附在丝绒上，再把丝绒印到各种不同成分的培养基上。（事先应在培养皿的不同方向作好标记）   假如在缺乏色氨酸的培养板上有一个菌落不能生长，则该菌落很可能是色氨酸营养缺陷型，记为try-。即可在母板上的对应位置挑取菌落，继续培养，供进一步研究。    若在加有penicillin的培养板上能够生长的菌落，一定是penr突变型，可以直接挑取，供进一步研究中。二、病毒（virus）\n病毒比细菌更为简单，也只有一条染色体（单倍体）。   病毒的结构很简单，只有蛋白质外壳和被外壳包裹着的核酸（遗传物质），没有自身进行代谢和分裂所必须的细胞质和细胞器，必须借助宿主细胞的代谢系统才能繁殖自己。所以，病毒都是寄生性的，它们必须生活在活细胞内。   病毒按寄主可分为：动物病毒，植物病毒，细菌病毒。   病毒按遗传物质可分：RNA病毒，DNA病毒。       细菌病毒（Bacterio-phage）又称为噬菌体（phage）。噬菌体是研究得比较清楚的病毒。   噬菌体侵染细菌后，使细菌不能生长，而在均匀生长的细菌培养板上形成噬菌斑（plaque）。根据噬菌斑的形态和生长特点可以鉴别不同的噬菌体。   噬菌体按其在宿主细胞中的生活方式又可分为：温和噬菌体和烈性噬菌体两大类。表7－1 三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性。①世代周期短，繁殖块，繁殖系数高。大肠杆菌每20分钟繁殖一代，噬菌体每小时可扩增百倍。用它们作为研究材料，可以大大节约实验时间。②易于管理和进行生物化学分析。③遗传物质比较简单，用于研究基因结构、功能及表达调控机制比较方便。细菌和病毒均只有一条染色体（DNAorRNA），结构简单，不必通过复杂的化学分析就可以对基因结构和功能进行精细的研究。④便于研究基因的突变，因为它们是单倍体，所有的突变都能立即表现出来，没有显性掩盖隐性的问题，也不存在分离问题。而且数量庞大，突变率很低的突变都能检测到。⑤便于研究基因的作用，代谢作用旺盛，能在短时间内积累大量代谢产物，便于对其本身及其产物进行化学分析。⑥可用作研究高等生物的简单模型。高等生物体内机制复杂，目前还难以进行详细研究，而细菌和病毒结构简单，可作为模型研究，为开展高等生物的遗传研究奠定基础，积累资料。病毒利用寄主的代谢系统进行繁殖，势必其代谢方式与寄主有相似之处，因此可作为研究寄主的简化模型。四、细菌和病毒的拟有性过程。   细菌和病毒的遗传物质也可以从一个个体传递到另一个个体，也能形成重组体。因为这不同于真核生物的有性生殖，被称之为拟有性过程。实际上，所谓的拟有性过程指的是细菌或病毒获取外源遗传物质的方式或途径。细菌与细菌之间的遗传物质的交流（拟有性过程）。有四种不同的方式：转化、结合、性导和转导。\n§2噬菌体的遗传分析一、噬菌体的结构与生活周期    噬菌体(bacteriaphageorphage)是病毒的一类，结构很简单，基本上由一个蛋白质外壳包裹着一些核酸组成的。噬菌体的多样性来自于组成其外壳的蛋白质的种类，以及其染色体的类型和结构的不同。（一）烈性噬菌体（virulentphage）     遗传学上应用最广泛的烈性噬菌体是大肠杆菌（E.coli）的T偶列噬菌体。它们的结构大同小异，外貌一般呈蝌蚪状。T偶列和T奇列有些不同，以T2的结构最为典型（图7－4）。T偶列噬菌体的头部为六角形，染色体为双链DNA分子。T偶列噬菌体的尾丝附着在E.coli表面时，通过尾鞘的收缩将DNA经中空的尾部注入宿主细胞。DNA进入宿主细胞以后，随即破坏宿主的遗传物质，并借助宿主细胞的代谢系统，转而合成大量的噬菌体DNA和蛋白质，组装成许多许多新的小噬菌体。最后使宿主细胞裂解（lysis），一下子释放出数百个子代噬菌体（图7－5）。这样的噬菌体称为烈性的噬菌体（virulentPhage）。（二）温和噬菌体（temperatephage）温和性噬菌体具有溶原性（lisogeny）的生活周期。这类噬菌体侵入细菌以后，细菌细胞并不马上裂解。温和性噬菌体有两种类型。（1）以λ为代表,λ噬菌体侵入细菌后，细菌并不裂解，λ噬菌体的DNA附着于E.coli染色体的gal和bio位点之间的att位点上（attachmentsite），并通过交换而整合到细菌染色体上。整合以后，就能阻止其它λ噬菌体的超数感染（superinfection）。整合在寄主染色体中的噬菌体称为原噬菌体（prophage）。超数感染：一个细菌受一个以上同种噬菌体感染的现象。λ噬菌体的DNA被整合以后，既不大量复制，亦不大量转录和翻译。往往只有一两个基因表达，表达产物作为阻遏物关闭其他基因的表达。被溶原性噬菌体感染了的细菌称为溶原性细菌（lysogenicbacterium）。当溶原性细菌分裂成两个子细胞时，λ噬菌体DNA随细菌染色体的复制而复制，每个细胞中有一个拷贝。原噬菌体通过诱导（induction）可转变为烈性噬菌体，进入裂解周期。诱导可以通过不同的方式进行，如UV照射、温度改变、与非溶原性细菌的接合等，诱导使阻遏物失活，使噬菌体的其他基因得以表达，促使噬菌体繁殖并进入裂解周期。（2）P1噬菌体P1噬菌体感染E.coli以后，不整合到细菌DNA上，而是独立存在于寄主细胞内。P1DNA可以复制但不裂解宿主细胞，也不影响宿主细胞的正常代谢，但P1的复制可以使宿主的子细胞中也会有P1DNA，而且可以多于一个拷贝。受P1噬菌体感染的细菌也可以因诱导而进入裂解周期。                二、噬菌体的基因重组两个基因型不同的噬菌体同时感染一个宿主细胞，叫做混合感染（mixed\ninfection）或双重感染（doubleinfection）。共同生存在同一个宿主细胞中的两个噬菌体的DNA也可以发生交换，产生基因重组。比如，一个噬菌体的基因型是a＋b-，另一个噬菌体的基因型是a-b＋，同时感染同一个宿主细胞，宿主细胞裂解以后，可能释放出基因型为a＋b＋和a-b-的重组体来。研究最深入的噬菌体突变体是T2噬菌体的r-（rapidlysis速溶性）突变体。一个正常的T2噬菌体产生的噬菌斑小而边缘模糊，记为r＋，突变体r-产生的噬菌斑大而边缘清晰。正常的T2噬菌体能感染E.coliB株。突变型E.coliB株能抗T2的感染，记为B/2株，T2噬菌体的突变型h-又能克服B/2株的抗性，既能侵染B株又能侵染B/2株，形成透明的噬菌斑。正常T2噬菌体记为h＋，只能侵染B株，形成半透明的噬菌斑。h-和h＋均能感染B株。用基因型为r＋h-和r-h＋的两种T2噬菌体同时感染E.coliB株。这种现象称为双重感染（doubleinfection）。将双重感染后释放出来的子代噬菌体接种在同时长有B株和B/2株的培养皿内，记录噬菌斑的数目和形态。h＋r－半透明，大h－r＋透明，小，亲本型。h－r－透明，大h＋r＋半透明，小，重组型。h－r－和h＋r＋为重组型。重组值＝（重组型噬菌斑数/总噬菌斑数）×100%＝（h+r++h－r－）/(h+r++h－r－+h+r－+h－r+)×100％不同速溶菌突变型的表现型不完全相同，分别记为ra、rb、rc。用r－xh+×r+h－获得的试验结果如下表。表7－2杂交组合每种基因型的％重组值h+r－h－r+h+r+h－r－ra-h+×r+h-34.042.012.012.024/100=24%rb-h+×r+h-32.056.05.96.412.3/100=12.3%rc-h+×r+h-39.059.00.70.91.6/99.6=1.6%根据表7－2的结果可以分别作出3个连锁图。P155有四种可能的排列顺序。P155四种顺序都是可能的，要确定到底是那一种，还缺条件。若知道rb和rc之间的距离，就可以推知rb、rc和h的排列顺序。为此，需作rb+rc×rbrc+。结果rb与rc之间的距离大于rb与h之间的距离，可知h应位于rb与rc之间，即rbhrc。至于ra位于h的哪一边，是靠近rc还是靠近rb？因为T2DNA是环状的，所以两种答案都是正确的。                                                                      §3细菌的遗传分析\n细菌与细菌之间的遗传物质的交流（拟有性过程）有四种不同的方式：转化、结合、性导和转导。一、转化（Transformation）细菌通过细胞膜摄取周围环境中DNA体段，并通过重组将其整合到自身染色体中的过程，称为转化。当外源DNA进入宿主后，使宿主产生新的表现型时就能测知转化的发生。肺炎双球菌转化试验：肺炎双球菌有两种不同的类型：①S型，有毒，菌落光滑，又分为SI,SⅡ,SⅢ②R型，无毒，菌落粗糙，又分为RIRⅡ1928年，Griffith，做了如下实验：RⅡSⅢSⅢ加热后RⅡ＋杀死后的SⅢ当时无法解释这一结果，但可以肯定，加热杀死后的SⅢ型含有某种促成RⅡ转变为有毒型的物质。1944年，Avery不仅重复了上述试验，而且用从SⅢ型中提取DNA与RⅡ型菌混合在一起，在离体的情况下，也成功地使少数RⅡ型细菌转变为SⅢ型经多种试验证明，导致这一转变的物质是DNA，这是细菌遗传性状定向转化的第一个实例，也是DNA作为遗传物质的最直接的证据。但是，并非所有的细菌都能够发生转化，转化是有条件的。条件包括三个方面：①受体细胞的生理状态；②DNA片段的大小，形态和浓度；③外源DNA片段与受体DNA的同源程度。（同源是指核苷酸顺序的相似程度。这里所说的同源是指整个染色体的核苷酸顺序的近似程度，更重要的是所转化的特定范围的核苷酸的顺序。）只有那些生理上处于感受态（competence）的细胞（决定转化因子能否进入细胞）才能吸收外源DNA。感受态与细菌细胞的生长期有关。并不是细菌在整个生长周期中都能接受外源DNA。有人认为，DNA合成结束，蛋白质合成旺盛时期的细胞易于吸收外源DNA。肺炎双球菌和枯草杆菌的感受态都出现在对数期的后期。外源DNA片段的大小与能否转化有关。肺炎双球菌要求外源DNA长于800bp，枯草杆菌要求大于16kb。外源DNA必须是双链结构而且应达到一定的浓度。对于某一特定的DNA片段来说供体DNA分子的数量与转化率之间有一定的相关。有实验表明，细胞壁或细胞膜上有固定数目的DNA接受座位，这些座位饱和以前，转化体的数目与DNA浓度呈正相关，一旦这些座位达到饱和状态，增加的DNA便不再影响转化体的数目。转化过程：①当受体细胞处于感受态时，符合要求的外源DNA分子可结合在受体细胞表面的几个接受座位上。最初的结合是可逆的。稳定结合在这些座位上的DNA分子随后纵长地被细菌所吸收，这是不可逆的过程。在外援DNA进入细胞的过程中，有核酸外切酶降解其中的一条链，并利用降解过程中产生的能量，将另一条单链拉进细胞中。②细菌转化过程中的重组：a：供体片段与受体DNA联会；b：单链的供体片段与受体DNA部分变性部位的一个单链形成双链，置换出受体的一条单链；c：完全形成新的双链，但尚有缺口或切刻；\nd：被置换的受体单链被降解；。e：杂合双链的形成（通过DNA聚合酶和连接酶）。f：通过DNA复制产生稳定的转化子。摘自盛祖嘉《分子遗传学》P104供体的单链片段进入细胞后与相应的受体DNA片段联会，二者之间同源性越大，越容易形成杂交双链。外源的单链DNA在对应位点置换受体DNA的一条链从而完成转化的全过程。在相应位置上受体的一条单链片段被置换下来，最终被降解。整合对同源DNA具有特异性，视亲缘关系的远近，整合的频率不同。转化以后，只有出现了遗传性状的变异，才能得知转化的发生。由于DNA是以小片段的形式进入的，所以距离很远的两个基因很难同时存在于一个片段中，除非分别包括这两个基因的两个片断同时进入受体，它们一般是不能同时对受体进行转化的。按照概率原理，两个片断同时转化的概率应该是它们单独转化的概率的乘积，所以这种概率是很低的。但是，当两个基因密切连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片断中同时被整合到受体染色体中。因此，密切连锁的基因可以通过转化进行作图。Nestar等用枯草杆菌（Bacullussubtilis）的一个菌株trp2+his2+tyr2+做供体，提取DNA向受体trp2－his2-tyr2－菌进行转化，结果列于表7－4。从表中资料可见，经过转化的个体，即转化体（transformant）中，数目最多的是三个座位同时被转化的类别，这意味着所研究的三个座位在染色体上是靠得很近的。计算trp2和his2之间的重组值时，685个trp2－his2—应当看成是没有机会和带有这两个基因的供体DNA片断相遇的细胞，计算时不能考虑。同理，计算trp2和tyr1的重组值时不能考虑418个trp2－tyr2－，对于his2和tyr2的重组率时则不考虑2600个his2－tyr2－。由表中的计算表明，三个基因的顺是trp2his2tyr2。转化时细菌染色体的重组和接合一样，只有一种重组体，相反的重组体是不存在的，只有双交换和偶数次的多次交换才是有效的。 二、结合（conjugation）在原核生物中，两个细胞在相互接触过程中，遗传物质从一个个体转移到另一个个体的现象称为结合。输出遗传物质的个体称为供体（donor），又称为“雄性”。接受外源遗传物质的个体称为受体（receptor），又称为雌性。E.coli（大肠杆菌）是遗传学研究中应用最为广泛的细菌。野生型的E.coli可以在只含有盐类和葡萄糖的简单培养基上生长。1946年，Leaderberg和Tatum发现E.coli可以通过结合交换遗传物质。选用两个不同营养缺陷型的E.coli菌株，A和B。A菌株，met－bio－，需要在基本营养培养基上补充苏氨酸（thr）和亮氨酸（leu）才能生长。采用多营养缺陷型是为了防止回复突变干扰试验结果。A和B均不能在基本培养基上生长，但若将A和B在完全液体培养基上培养几个小时以后再涂布在基本培养基上，就能长出一些原养型（met+bio+thr+leu+）的菌落。细菌的野生型又称为原养型。换句话说，能够在基本培养基上生长的细菌称为原养型。这种原养型菌落的出现是转化的结果呢，还是由于两种不同类型细胞直接接触而交换了遗传物质的结果呢？必须予以鉴别。因为在培养过程可能有部分细胞死亡放出DNA而发生转化反应。\n1950年，Davis设计了一种U型管试验。在U型管两臂分别放入带有A菌株和B菌株的完全培养液，中间用过滤器隔开，过滤器的孔很小，细菌不能通过，但生物大分子，包括DNA分子可以自由往来。从U型管的一端使用加压和吸引的方法使培养液和大分子相互混合，但细菌因有滤板相阻，彼此不能直接接触。待两侧的细胞停止生长后，将它们分别涂布在基本培养基上，在任何一臂内都没有长出菌落。说明：两个菌株间的直接接触是原养型细菌出现的必要条件。这就否定了转化的可能。1952年，Hages通过实验证明，在结合过程中，遗传物质的转移是单向的。上例中是A转向B，而不会反向转移。所以一般可将供体看成“雄性”，受体看成“雌性”。在结合过程中，到底是什么东西由雄体输入了雌体呢？F因子。A菌株之所以能成为供体，是因为它含有一个性因子（sexfactor）又称致育因子（fertilityfactor），简称F因子。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示。没有F因子的菌体称为受体菌，又称雌性，用F－表示。F因子是双链环状DNA，分子量大约是3.5×106，是染色体外遗传物质，是质粒的一种，在分类学上属于附加体（episome）。它既能以自主状态存在于细胞质中，又能整合到细菌的染色体内。F小环与主染色体大环之间发生一次交换就可以插入到宿主染色体中。F因子整合到E.coli染色体上以后，该菌株就成为高频重组株（Highfrequencerecombination,Hfr），以Hfr表示。F因子处于自主状态时，可以不依赖宿主细胞的染色体而独立复制（每个F+细胞只有一个F因子）。据研究，F因子至少包含有15个基因，其中有的基因控制F伞毛（Fpillus）的形成，F伞毛是F+细胞表面伸出的一种长附属物。F+与F+之间互不理睬，但F+和F－一旦相互接触，F伞毛就变成了两个细胞之间原生质的通道，叫做结合管（conjugationtube）。F+细胞中的F因子由结合管向F－传递，使F－变成F+。转移时，F因子中的双链之一被切开，这切开的单链从3'端开始向F－转移，一旦进入F－中就以此为模板，从5'→3'的方向复制，最终形成一个完整的双连环状F因子。另一条没有切口的完整单链留在供体内作为母板，进行复制，也形成一个完整的F因子。在接合过程中，F因子的复制是按DNA复制的滚环模式进行的，两个接合产物，即接合后体（exconjugants）都成为F+，各具备一个F因子。在Hfr中，F因子的复制是与宿主染色体同步进行的。当Hfr×F－时，Hfr细胞可以把部分甚至全部染色体传递给F－受体，而且当供体和受体带有不同的标记基因时，相互之间的重组频率很高，故而被称为Hfr（Highfrequencerecombination）。当Hfr与F－相互接触时，整合在宿主染色体上的F因子的复制系统首先活跃起来，由内切酶在FDNA的一端近端部切成单链缺口，细菌染色体以这一小段单链的FDNA为前导，向F－转移。若时间充裕，整个Hfr细胞的染色体（包括F因子）都可以转入受体细胞，使F－变成Hfr，但这种情况较为罕见。大多数情况下，只有一小部分细菌染色体转移，结合即行中断，受体细胞仍保持为F－，因为FDNA的绝大部分仍留在供体内，F－得到的仅仅是F因子的一小部分。值得注意的是：距离前导FDNA小片段越近的细菌染色体DNA越先转移，越远的越后转移。当Hfr菌的部分染色体进入F－后，F－细胞中就有一段DNA具有2份拷贝，被称为部分二倍体（partialdiploid）或部分合子（merozygote）。新转入的DNA片断称为供体外基因子（exogenote），而受体的染色体称为受体内基因子（endogenote）。\n外基因子和内基因子可以发生交换而产生基因重组。部分二倍体中，若发生单数交换是没有意义的，因为单交换使环状的内基因子打开成为线性DNA，这种细胞是不能成活的。发生偶数次交换才能产生可遗传的重组体（recombinant）和一个片断（fragment）。片断以后为酶所降解。这样，重组后的F－细菌不再是部分二倍体，而是单倍体，得到的重组体的类型只有一个，而不是两个，相反的重组体是不能存活的（例如有＋＋，没有――）。用中断杂交试验作染色体连锁图。Hfr中的DNA向F－转移时，是从酶切端点开始直线式进行的。为证明这一点，50年代有人设计了一个著名的中断杂交试验（interruptedmatingexperiment）。将一个Hfr菌株和一个F－菌株混合在一起进行培养，使之发生接合，Hfr：strsthr+leu+azistonAsgalb+lac+F－：strrthr-leu-azirtonArgalb－lac－strr对链霉素有抗性azir对叠氮化合物有抗性tonAr对T1噬菌体有抗性thr+leu+galb+lac+对苏氨酸、亮氨酸、半乳糖和乳糖为原养型每隔一定时间吸取部分营养液放入食品搅拌器内搅拌，以中断杂交。经过稀释，接种到含有链霉素的完全培养板上，在培养过程中杀死所有Hfr细胞，保留下来的全部为F－。然后对形成菌落的F－细胞用影印法检测其基因型。结果如下表和为图7－17。表7－5大肠杆菌Hfrstrsthr+leu+azistonAsgalb+lac+×F－strrthr-leu-azirtonArgalb－lac－的结果标记基因转入的时间（min）频率thr+8100（经选择的）leu+8.5100（经选择的）azis990tonAs1170lac+1840galb+2525混合培养9分钟后取样，开始出现少量azir菌落，说明azir基因已经进入少数的F－细胞中。但对于T1噬菌体来说，全部F－细胞还属于敏感型，说明tonAr基因还没有进入F－中。11分钟后才开始出现抗T1的菌落（colony）。18min和24min取样时，分别出现乳糖发酵和半乳糖发酵的菌落。说明Hfr的基因确实是按一定的线性顺序依次进入F－的。也就是说，是以FDNA片断上的酶切断点为原点（记做O）开始以直线方式进入F－细胞的。基因距O点越近，进入F－越早，反之越晚。由于在自然状态下不经搅拌也能中断杂交，因此，距O点越远的基因进入F－的机会越少。根据上述试验结果，用Hfr基因在F－中出现的时间为标准，可以作出大肠杆菌的遗传连锁图。89111825F图中以接合实验的时间作为遗传距离的单位。用不同的Hfr菌株进行中断杂交试验做出的E.coli基因连锁图，其基因向F－细胞转移的顺序大不相同。见表7-6。表7－6用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序Hfr的类型基因转移顺序HfrH0thrprolacpurgalhisglythi10thrthiglyhisgalpurlacpro\n20prothrthiglyhisgalpurlac30purlacprothrthiglyhisgalAB3120thithrprolacpurgalhisgly从表中可以看出，转移顺序的差异是由于各Hfr之间转移的原点（O）和转移的方向不同所致。该实验进一步说明F因子和细菌DNA都是环状的，F因子插入环状染色体的不同位置形成不同的转移原点和转移方向。重组作图如果两个基因间的转移时间差小于2分钟，用中断杂交法所测得的图距是不太可靠的，还须采用传统的重组作图法予以验证。例如，lac+和ade—紧密连锁，为了求得它们之间的准确距离，用Hfrlac+ade+×F—lac—ade—作杂交试验。杂交以后，用完全培养基但不加腺嘌呤，能使F—ade+生长。在中断杂交试验中，ade+基因进入F—细胞的时间较lac+迟，可知既然ade+基因已经进入F—，lac+位于ade+之前，一定也已经进入了。进一步对lac+进行筛选，若某菌株既是ade+又是lac+，说明在lac—ade之间没有发生过交换，若ade+而lac—，说明在它们之间已发生了交换。（图7-20）lac—ade+重组率=————————————————=22%(lac+ade—+lac—ade+)在中断杂交试验中，这两个基因进入F—细胞的时间差为1分钟，可见，一分钟大约相当于20%左右的重组率。 三、性导（sexduction）整合到细菌中的F因子也可以重新离开染色体，成为独立的环。这个过程是整合的逆过程，称为环出（loopingout）。F因子在环出过程中并不是完全准确无误的，往往连同部分染色体片段一同离开。部分染色体DNA与FDNA的杂合环称为F'因子。F'所携带的细菌DNA片段的大小不等，可以是一个基因，也可以长达细菌染色体的一半。F'因子以极高的频率转移它所携带的基因。F'因子有极高的自整合率，且整合在一定的座位上，因为它有与细菌染色体同源的区段。F因子整合在染色体上的位点不是固定不变的。F'因子进入受体细胞以后，在整合以前，受体细胞就成为部分二倍体。F'因子所携带的基因就可以在受体细胞中表达。例如，某一Hfr系（stock）的F因子在环出时带走了lac+，当此F'转移到F—lac—以后，受体菌（receptor）成为F+lac+的比率很高。但lac位于染色体的远端，在中断杂交试验中，只有1/100的受体成为F+lac+。这是因为F'携带lac+基因进入受体后使lac座位成为部分二倍体F'lac+/lac—，lac+对lac—是显性，所以部分二倍体的表现型是lac+。部分二倍体是不稳定的，F'因子可能丢失，使F'lac+/lac—回复为lac—，但F'也可以与染色体发生重组，形成稳定的lac+菌株。性导（sexduction）：以F'因子为媒介，将供体细胞的部分遗传物质导入受体细胞形成部分二倍体的过程称为性导。并发性导（Co—sexduction）：两个紧密连锁的基因，同处于一个F'因子上被转移，称为并发性导。\n性导的意义：（1）性导产生部分二倍体，为研究单倍体细菌中等位基因间的显隐性关系提供了可能的途径。（2）环出时，形成大量的F'因子，不同F'因子可能携带E.coli的不同基因，因此并发性导是建立遗传图谱的重要途径。（3）性导形成的部分二倍体也可用作互补试验，确定两个突变型是属于同一个顺反子还是属于不同的顺反子。 四、转导（Transduction）以噬菌体为媒介，将细菌的小片段染色体或基因从一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞的过程叫做转导。转导是细菌遗传物质传递和交换的又一重要方式，它与转化、转导、接合的主要不同之处在于是以噬菌体为媒介的。转导分为两种：普遍性转导和特异性转导。1、普遍性转导E．Coli可以通过细胞与细胞的接合而交换遗传物质，那么，鼠伤寒沙门氏菌是否也有同样的现象存在呢？用沙门氏菌的两个突变株杂交，一个是phe—tr—tyr—,另一个是met—his—。两菌株分别培养时，没有发现野生菌落。将两菌株在基本培养基上混合培养时，大约10—5个细胞可以得到一个原养型菌落。这似乎与E.coli的重组没有什么不同。为了证明这一点，将两菌株放入U型管的两臂，中间用滤板隔开，以防止细胞接触，但可以允许比细胞小的生物大分子通过，也获得了野生型细胞。这说明沙门氏菌的基因重组不是通过细胞接合，而是通过过滤因子（filterableagent）而发生的。以后发现这种过滤因子就是噬菌体P22。P22是一种沙门氏菌的噬菌体。这一实验虽然没有证明沙门氏菌中有接合现象存在，但是却发现了噬菌体介导的基因转移过程——转导。P22感染细菌细胞时，细菌染色体断裂成许多小片段。在形成子代噬菌体颗粒时，偶尔会产生错误，把细菌染色体的片段组合到头部。因为决定噬菌体感染能力的是外壳蛋白，并不是外壳所包裹的遗传物质。所以，这种假噬菌体照样可以吸附到细菌上，并注入其内含物（遗传物质）。这种内含物并不是噬菌体的遗传物质，而是细菌DNA的一部分，当然对受体细菌是无害的。这种假噬菌体称为转导颗粒（transducingparticle）。当转导颗粒将内含物注入受体细胞后，受体细胞就变成了部分二倍体。导入的基因通过重组，在整合到受体细胞的染色体上。由于这一类噬菌体能够转移细菌染色体的任何部位，因而被称为普遍性转导。两个基因被包装在一个转导颗粒中转导，称为共转导（cotransduction）。若两个基因共转导的频率越高，说明这两个基因在染色体上的距离愈近，连锁关系越密切，反之亦然。因此，利用普遍性转导可以测定细菌基因间的连锁关系。观察基因之间两两共转导的频率，就可以确定三个或三个以上基因在染色体上的排列顺序。以E.coli的P1噬菌体进行下列转导：供体thr＋leu＋azir受体thr－leu－azis先用P1噬菌体感染供体菌株，再用来自供体的新一代P1噬菌体感染受体菌株。然后在受体菌中选择一个或两个供体的标记基因，测定其余非标记基因的有或无。\n选择标记非选择标记1leu+50%azir，2%thr+2thr+3%leu+，0％azir3thr+leu+0%azir以leu+为标记，测知被转导的供体菌染色体片断上，同时带有azir的占50%，同时带thr+的占2%。表明leu座位距azi近，距thr较远。可能的排列顺序如下：再以thr+为选择标记，发现共转导的片断上有3%携有leu+。表明thr距leu较近，距azi较远。所以，这三个基因的顺序应该是上述的第二种。同时以leu+和thr+为选择标记，被转导的片断上都没有azi。这说明，转导颗粒所携带的供体菌DNA片断从thr座位开始，有时延伸到leu座位，但没有扩展到azi座位，而延长到leu座位的频率已很低了，只有3%。可以推测，转导片段长度的极限是从thr座位到leu和azi座位之间。根据接合实验的结果，这段DNA的长度相当于细菌染色体长度的1％，大致上与噬菌体的染色体长度相当。转导颗粒携带DNA的平均长度约为一个病毒基因组的大小。一般性转导与转化很相似，若细菌的两个基因间的距离大于病毒基因组的长度，一般不能进行共转导，除非两个转导颗粒同时感染同一个细菌细胞，这种机率是很小的。特异性转导：由温和噬菌体进行的转导叫做特异性转导。以λ噬菌体为例，λDNA既可以自主状态存在于细菌细胞中，也可以整合在细菌染色体中。象这样具有两种状态的遗传因子称为附加体（episome）。多数噬菌体当整合在细菌染色体中时都占有一个特定的位置。λ噬菌体在E.coli中的附着点（attλ）一边是半乳糖操纵子gal，另一边是指导生物素（biotin）合成的基因bio（图7－24）。原噬菌体离开细菌染色体时，偶尔可以形成某些细菌基因与某些噬菌体基因连在一起的DNA片断。这种混杂的DNA片断被错误地包装在噬菌体外壳中，就形成了特殊性转导颗粒，这种颗粒能把细菌的基因由一个细胞转移到另一个细胞。转导仅限于靠近原噬菌体附着点的基因，如λ噬菌体专门转导E.coli的gal和bio基因，所以这种转导称为特殊性转导或限制性转导（restrictedtransduction）。第一节基因工程一基因工程概述遗传工程一般有广义和狭义之分。广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本节只介绍基因工程。基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术.1971年美国的Smith,H.O.等人利用从细菌中分离的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子,标志着基因工程或DNA重组时代的到来.接着,伯格(Berg,P.)等人于1972年用一种限制性酶分别酶切猿猴病毒DNA与λ噬菌体DNA,再讲这两种DNA片段放在一起,用DNA链接酶链接起来,结果得到了一种新的DNA分子.1973年科恩(Cohen,S.)等人进一步将酶切后的外源DNA片段与质粒DNA链接起来,构成一个重组质粒(recombinantplasmid),并将这个重组质粒转入大肠杆菌细胞.这些开创性的工作为基因工程建立了一套完整的方法和体系,\n成为现代生物学发展史上的重要里程碑.基因工程技术的建立,使所有实验生物学领域产生巨大变革.1982年经美国食品及药物管理局批准,采用基因工程方法在细菌中表达生产的人的胰岛素进入市场,成为基因工程产品直接造福人类的首例.1985年转基因植物获得成功.1996年克隆羊诞生.现在,人类已利用这一技术改造和创建新的生命形态,生产药品,鱼苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病.基因工程技术已成为人类日常生活的组成部分.基因工程中的DNA重组主要是指创造自然界没有的DNA分子的新组合.这种重组不同于经典遗传学中经过遗传交换产生的重组.基因工程是采用分子生物学，核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的中和技术.这已技术主要包括以下内容:①从细胞和组织中分离DNA.②利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)酶切DNA分子,制备DNA片段.③将酶切的DNA片段与载体DNA链接,构建重组DNA分子.其载体能在宿主细胞内自我复制.④将载体与DNA片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞后,该重组DNA分子能在细胞内复制,产生多哥完全相同的拷贝,即克隆(clone).⑤重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞,使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝.⑥能从宿主细胞中回收,纯化和分析克隆的重组DNA分子.⑦克隆的DNA能转录成mRNA,翻译成蛋白质.能分离,鉴定基因产物.因此,基因工程又可称为DNA重组,分子克隆,基因操作等.二限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶或限制性酶(restrictionenzyme)是基因工程的基石.在细菌中这些酶的功能是讲解外来DNA分子,以限制(restriction)或阻止病毒请染.这是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效的方式.这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列,在这一段序列中将双连DNA分子切断.限制性内切核酸酶的命名是据其来自的生物命名,用英文字母核数字表示.如EcoRⅠ来自大肠杆菌Escherichiacoli,读作echo-r-one.HindⅢ来自Hemophilusinfluenzae,读作hidee-three.现以分离和鉴定出200多中不同的限制性内切核酸酶.限制性酶据其作用特点,可分为两类.第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切断双连DNA分子,没有序列特异性.由于这类酶的酶切位点不定,所以很少在基因工程中应用.第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列,准确地酶切双链DNA的特异序列.\n因此基因工程中广泛应用的是这一类限制性酶.第Ⅱ类限制性酶识别的位点是对称的,即在一条链中从5'到3'方向的序列与其互补链从5'到3'方向的序列完全相同.这种从两个方向阅读二序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome).EcoRⅠ识别的回纹对称序列及切割点如图9-1A所示.EcoRⅠ以交错方式切割DNA双链,产生两个相同的单链黏性末端(stickyend).如果来自不同生物的DNA具有相同的回纹对称序列,经EcoRⅠ酶切后的DNA片段就具有相同的单链黏性末端.若将这两种片段放在一起,在适宜的条件下,他们可以经碱基互补配对,使黏性末端的氢键形成双链DNA分子,再在DNA链接酶的作用下形成磷酸二脂键,链接成重组DNA分子(图9-1B).第Ⅱ类限制性酶中还有另一类酶,如SamⅠ,他们酶切DNA双链后,产生的DNA片段具有平齐末端(bluntend)(图9-2).将两个具有平齐末端的片段放在一起,也可在DNA链接酶的作用下,组成重组DNA分子.表9-1中列出部分常用的限制性酶,其中有的酶酶切DNA后产生黏性末端,有的产生平齐末端.三载体经限制性酶酶切的DNA片段或基因，不能直接进入宿主细胞进行克隆的。一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA链接构成重组DNA分子，才能进入宿主细胞(hostcell)，并在其中复制、扩增,克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒,噬菌体,病毒,细菌或酵母菌人工染色体BAC,HAC等.现在使用的各种载体都是用基因工程方法构建的.作为载体DNA分子,需要具备以下4个条件:①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制.②具有多个克隆位点(multiplecloningsite,MCS,或称polylinkerregion),即具有多种限制性酶的切点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA片段.这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状.③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这种基因,使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型.④易从宿主细胞中吸收.㈠细菌质粒质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的,能自我复制,易分离和导入的环状双链DNA分子.早期用于基因工程的载体是竟遗传改良的细菌质粒,他们仅能用于克隆分子量小于10Kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段.这些质粒的适应范围广,拷贝数多.尽管在转化时仅一个质粒进入宿主细胞,但复制之后每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个.这一特点十分有利于大量扩增克隆的DNA的片段,作为克隆载体应用.\n现在广泛使用且商品化的质粒,很多都具有重组表型检测标记,在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段.例如pUC18质粒(图9-3)就具有以下特点:①分子量小(2.69kb),也可以接受较大的外源片段.②拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达500个;③多克隆位点的酶切位点多,克隆方便;④具有α-互补显色表型,可作为检测重组质粒存在于否的选择标记.α-互补是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸残基(α-肽),在与α-肽缺失的酶混合后(体外或体内),能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象.pUC系列的载体就是利用这一特点而设计的.如图9-3所示,pUC18质粒带有细菌DNAlacZ基因启动子,操纵子,调节基因以及lacZ基因α-肽(N端的146个氨基酸),在lacZ基因内插入了一个多克隆位点,这段序列与lacZ在同一个阅读框架内.pUC18表达的α-肽具有多克隆位点的18个氨基酸残基,仍具有α-互补功能.因此,将pUC18质粒转入带有lacZ基因α-肽缺失的宿主细菌细胞内后,在含有5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chhloro-3-indoly-β-galactopyranoside,)及IPTG的培养基上,质粒产生N端的146个氨基酸,宿主菌产生C端的氨基酸,经α-互补可产生有功能的lacZ酶,水解X-gal产生一种兰色物质,附着于细菌细胞上使菌落呈兰色.当在多克隆位点插入一个外源DNA片段时,破坏了α-肽的阅读框架,或导入转炉或翻译终止信号,使α-肽不能正确表达,仅宿主细菌产生的C端氨基酸没lacZ基因有lacZ酶活性,结果在上述同样培养条件下,形成的菌落位白色.所以白色菌落即是带有外源DNA片段的阳性克隆.㈡λ噬菌体λ噬菌体基因组全长49kb,其核酸序列及基因功能和表达调空已研究的十分清楚.λ噬菌体的DNA中间约2/3的序列位中间基因(centralgenecluster),位于两端的位DNA左臂和右臂.研究表明,λ基因组的中间基因序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力.根据这一特点,在改造利用λ噬菌体做载体时,在两个臂于中间基因链接导入处导入限制性酶切点(如EcoRⅠ),酶切λDNA后分别得到两个臂(lambdaarms),再将经同一种酶酶切的外源DNA片段与两个臂链接构成重组DNA分子(图9-4).形成的重组DNA分子用噬菌体蛋白包装提取物体外包装(invitropackaging)后,经转导感染具有适宜基因型的宿主细菌菌株,噬菌体再在细菌细胞内繁殖,扩增,在平板培养基上形成噬菌斑.然后据噬菌斑的形态或显色表型(α-互补,如M13系列载体),即可鉴定出阳性克隆.λ噬菌体载体可接受15~30kb的外源DNA片段,他既可作为克隆载体,也可作为表达载体,用作cDNA(如λgt10,λZAPⅡ0或核DNA(如EMBL3,GEM12)克隆的载体.在基因库筛选中,λ噬菌体作载体与细菌质粒相比,具有易操作,阳性克隆数多等特点,现广泛用于各类基因库的构建.㈢柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图9-5).柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)细菌质粒的复制原点.cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的,而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制.柯斯质粒也具有抗生素抗性基因.尽管这种质粒的分子量较小,但他可接受长达50kb的外源DNA片段,这在克隆真核生物基因中十分有用,因为一个DNA片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其他调空序列.柯斯质粒不仅直接用于真核生物基因的分离与克隆(见下面YAC载体)系统结合,用于基因作图分析㈣穿梭载体穿梭载体(shuttlevector)是指能在两种不同的生物中复制的载体.例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.因此,这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.酵母菌的Yep系列载体(图9-6)以及Yip.Ycp和Yrp系列载体均是穿梭载体.Yep为酵母菌附加体质粒,他的ARS序列来自酵母菌内源附加体2μ,可使每个细胞的拷贝数保持在100个左右.Yep还具有2μ的两个顺式调空元件,质粒分配序列和2μ调空元件.这两个元件可使在细胞分裂中各细胞分配的质粒数相近,\n2μ序列不断扩增.Yep的Amp和四环素(Tc)抗性用于细菌中选择,而URA3(尿嘧啶)基因用于在酵母菌中选择.Yep24具有Amp及Tc两个抗生素抗性基因,可将外源DNA片段插在抗生素基因中,通过插入失活,选择阳性克隆.尿嘧啶营养缺陷型菌株URA3-不能合成尿嘧啶,在不含附加尿嘧啶的培养基中不能生长.将带有URA3基因的Yep转化为URA3-酵母菌菌株后,阳性克隆可在不含附加尿嘧啶的培养基上生长,而非阳性克隆则不能生长.很多酵母菌的穿梭载体,用于功能互补法分离和鉴定真核生物基因的研究.㈤细菌人工染色体在进行真核生物基因组的分析及作图中,发现上述的集中载体都不能携带大于50kb以上.细菌人工染色体(BAC)载体就是为了克隆跟大的外源DNA片段而设计构建的.BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的.如第6章所述,F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒,约100kb,同时能在细菌接合时专一1000kb的细菌染色体片段.将F因子经基因工程改良构成的BAC载体,可用于克隆100kb以上的DNA片段.带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝,这一特点有利于保持DNA大分子,尤其是重复序列多的大分子,在细胞内稳定复制而不发生重组.BAC载体本身分子量小,如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9-7),仅带有自我复制，控制拷贝数(repE)及质粒(parE,parA,parB)所必须的最少序列.这些基因均来自F因子.BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因以及多克隆位点.在pBeloBAC11中,多克隆位点lacZ基因内,因此可采用选择pUC18阳性重组子的方法,即α-互补显色法选择阳性BAC重组子.此外,在多克隆位点两侧,还有T7及SP6启动子位点,用于制备RNA分子,进一步分析克隆的基因表达,作为染色体步行的探针,以及序列测定克隆的片段.㈥酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)是与前述的穿梭载体不同的另异类酵母菌穿梭载体。他是人类在对酵母菌生物学,遗传学的基本特征深入研究的基础上,结合穿梭质粒Yep的一些特点构建而成.YAC也是为适应真核生物基因组分析而发展起来的.1996年酵母菌基因组全部序列已经测定,为分析YAC克隆提供了直接依据.将来自YAC克隆的序列与酵母菌基因组序列比较,即可以完全排除重组YAC载体来自酵母菌DNA的可能性.同YAC载体一样，YAC也具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100~1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体（humanartificialchromosome，HAC）的研究。目前应用最多的YAC载体是PYAC4(图9·8)，这个载体具有以下主要结构:①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因);②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4);③一个自主复制序列(ARS1);④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL),，以保持重组YAC为线状结构;⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便PYAC4在细菌细胞中稳定扩增;⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点;⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。Sup4基因编码赭色抑制tRNATYR，抑制赭色表型(成为白色)。如果用不含外源DNA片段的PYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的PYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆工作。在利用PYAC4载体克隆时，要将PYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。[七]Ti质粒及其衍生载体应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物系统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导人植物细胞的植物表达载体。Ti质粒是一种细菌质粒(图9-9)，它自然存在于一种革兰氏阴菌——根瘤土壤杆菌（Agrobacterium\ntumefaciens）细胞中。根瘤土壤杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤。植物产生的这种根瘤细胞与动物的癌细胞(tumor)相似，它们能独立地、不受控制地生长。根瘤细胞的形成是因为根瘤土壤杆菌中存在着一种诱导瘤细胞(tumor-inducing，Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA（transferDNA，T-DNA），DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine)，作为根瘤土壤杆菌的碳源和氮源。1．Ti质粒的特点利用缺失、突变、转座及互补等方法对Ti质粒的研究，发现Ti质粒具有以下特点:(1)Ti质粒具有5个主要功能区域(图9-9)。它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmidtransfer)、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(oir)和毒性区域(vir)。(2)T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其他序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfectdirectrepeat)，右端的这段序列称为右界（rightborder，RB），左端的序列称为左界(leftborder，LB)。T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲（disam）后，将细菌抗生纛的抗性基因或其他序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。(3)vir的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。Ti质粒是约200~500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作。2·Ti质粒的衍生载体根据Ti质粒的特点，现已构建成以下两套由乃质粒衍生的载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体。(1)双元载体（binaryvector）。这个系统具有两个质粒，一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒，可在大肠杆菌及根瘤土壤杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，也是一种穿梭质粒。在T-DNA序列外，还有细菌选择标记基因，在T-DNA的LB至RB内有一个多克隆位点及植物选择标记基因。如Pbin19载体，它具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphI)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉纛抗性基因（nos-NptⅡ）作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及a-互补显色标记。双元载体的另一个质粒，如与Pbin19匹配使用的Pal404质粒是非致病Ti质粒，该质粒没有T-DNA序列，具有Ti质粒的毒性基因，毒性基因表达的产物以反式调控方式控制穿梭质粒上T-DNA的转移。将两个质粒分别导人根瘤土壤杆菌后，经根瘤土壤杆菌介导，克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。(2)共整合载体(integratedvector)。这个系统也包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的质粒(如Pmon200)，另一个带有毒性基因(如Ptib6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列，它们在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体，故称共整合载体。还有另一类用于植物基因工程的载体，不经根瘤土壤杆菌介导而是在其他物理及化学方法的作用下，将外源基因导入植物细胞，并整合到植物基因组中。这种载体与乃衍生质粒不同，与酵母菌穿梭质粒的结构特点类似。它们通常也具有氨卞青霉素抗性基因，用作细菌选择标记;具有潮霉素或除草剂抗性基因用作植物选择标记。这类载体如Pahc25主要用于将外源基因导入单子叶植物细胞。四、基因的分离与鉴定\n一般而言，一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子。在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA曾是细胞中最难分析的大分子。但DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作和分析的大分子。利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因，分离与鉴定基因是DNA重组+·的关键步骤之一。分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达，又可为基因工程提供目的基因。(一)从基因库中分离基因基因库(LIBRARY)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。1·构建基因库根据克隆的核酸序列、来源，基因库可分为核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。(1)核基因库。核基因库(GENOMIClibrary或genomicbank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体(如EMBL)连接构成重组DNA分子，根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组DNA分子转化感受态细胞，收集所有菌落即成为质粒基因库。如果载体是噬菌体或，则将重组DNA分子体外包装成噬菌体后，感染细菌细胞，将所得到的所有重组噬菌体集中即是基因库。如果载体为BAC或YAC，将重组人工染色体导人相应的宿主细胞，收集筛选得到的所有细胞即成为基因库。理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目较小，就可以达到这个目的。因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体。若构建的基因库是以分离结构基因为主要目的，通常选用λEMBL，λGEM或cosmid作载体。而那些将用于基因组作图和分析的基因库，则多选择BAC或YAC为载体。检测构建的核基因库是否包括一个完整的基因组序列，可用下面的公式计算:N=Ln（1-P）/Ln（1-a/t）式中的N为所需克隆总数，p代表一个特定基因序列出现的概率，a为插入载体的片段的平均长度，t为基因组全序列长度。例如人类基因组DNA分子量为3.0×106kb，以λEMBL作载体，插入片段的平均长度为17kb，P为0.99构建的基因库应有8.1×105个重组噬菌体。(2)染色体基因库。将基因组的一部分(如一根染色体)用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。例如果蝇X染色体上的一个片段，具有卸多个多线染色体带(polytene)，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。研究发现这一段染色体不仅包括白色(white)及缺刻(notch)等基因，还包括一个转座因子的原始位点。在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术(flowcytometry)将人类染色体分开后，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。这一技术是利用两种可分别与A=T以及G三C结合的荧光染料标记有丝分裂中期染色体，标记的染色体在流动经过激光束时发出荧光，再经光度计据其荧光强度及分布，鉴别分拣出不同染色体。这一技术已用于构建人类基因组所有单个染色体基因库。在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳(pulsedfieldelectrophoresis,PFGE)方法，将酵母菌的16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染建色体库，这在基因组分析中发挥了重要作用。(3)cDNA库。cDNA库是以mRNA为模板，经反转录酶(reversetranscriptase)合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)构建的基因库。绝大多数真核生物碰mRNA的3'端具有一段多聚A(poly-A)尾端序列。利用一段多聚T(poly-T)为引物(primer)，与poly-A互补配对，在反转录酶作用下，用poly-T引物引导合成一条互补DNA，即第一条DNA链.结果形成RNA-DNA杂合双链(图9-10)。第一条互补DNA链形成时，通常在其3'末端回转形成发夹结构，作为引物引导合成第二链DNA，再用Sl核酸酶将发夹结构的单链部分降解，就得到了双链DNA。也可在形成RNA-DNA杂合链后，用RNAH酶(Rnase\nH)在mRNA链上产生一些缺刻(nick)，形成很多RNA分子小片段，在DNA聚合酶的作用下，以这些RNA小片段为引物引导合成第二条DNA链。而对那些没有poly-A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸(hexamer)为引物合成第一条链，再用上述方法得到双链DNA。得到的双链DNA分子经两端补齐后，以带有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后与载体(通常是λ噬菌体)连接，再用类似核基因库中介绍的方法，制备cDNA库.cDNA库与核DNA库不同，cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的讨WA序列，所以它仅包括基因组的部分基因序列。在实际工作中，构建什么样的基因库取决于研究目的。cD-NA库对于研究基因的表达模式和分离某一特定基因是十分有用的。如果要分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因，可用该细胞或组织的mRNA构建cDNA库，则很容易得到这个基因。例如，动物的红细胞中具有大量血红蛋白，用红细胞的mRNA构建cDNA库，从中选择球蛋白基因就十分方便。通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。2·筛选基因库从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡聚核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。这里以筛选入噬菌体构建的人噬菌体核基因库为例。筛选入噬菌体构建的库常利用菌斑杂交法(plaquehhybridization)，将经重组噬菌体(来自构建的基因库)感染的宿主细菌细胞与少量上层培养基混合后，倒在具有底层培养基的培养皿中，培养过夜，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑(图9-11)。一个噬菌斑内的所有噬菌体都是一个噬菌体扩增的后代，所以一个噬菌斑就是一个克隆。再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维膜或尼龙膜上变性，噬菌体DNA(成为单链)，然后用标记的探针(也变性成单链)与膜上的噬菌体DNA杂交，将杂交膜用X光片放射自显影，检测杂交信号。凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆，在X光片上有杂交信号(黑点)。根据杂交信号在膜上的相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出并培养阳性噬菌斑，制备DNA，用作进一步分析.3·阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因。(1)限制性酶图谱。构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆(subcloning)或同已知的其他序列比较。图9-12表示一个15此DNA片段的限制性酶图谱构建方法.首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及其组合酶酶切DNA。在这里，将分别用NotⅠ、SalⅠ和NotⅠ与SalⅠ一起酶切DNA。酶切的产物用琼脂糖凝胶电泳，再经溴化乙锭染色，在紫外灯下就可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。从凝胶电泳结果可见，用Not1酶切产生一条12.2kb及一条2.8kb共两条带，证明原始DNA片段的长度为15kb，在该片段中仅有一个notI位点。用SalⅠ酶切也产生两条带，分别为10.2kb和4.8kb，说明这个片段也仅具有一个SalI酶切位点。根据这两种酶酶切的结果，这个DNA片段的限制性酶切图谱有两种可能的模式(图9-12)，很难确定两种酶的相对位置。当用两种酶同时酶切后，得到3条带，它们的长度分别为10.2kb、2.8kb和2.0kb。如按模式Ⅰ，则经两种酶消化后的3个片段长度分别是2.8kb、7.4kb和4.8kb，这与实际情况不符。而根据模式Ⅱ预计的3个片段长度与实验结果一致，因此模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。采用类似的方法，可将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)，来分析DNA水平的变异程度,以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。此外，上述经NotI或SalⅠ消化的片段，可以亚克隆到pUCI8等质粒上，迸一步用于限制性图谱分析或序列测定。\n(2)核酸分子杂交。Southern杂交分析(Southernblotting)是基因工程中常用的方法。这个由英国的Southern于1975年发明的方法，是一种将琼脂糖凝胶上的DNA条带转移到一种膜上(如尼龙膜)，用于分子杂交的方法，它是用发明者的姓氏命名的。这个方法首先是将DNA用限制性酶酶切，然后将酶切的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上的DNA转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用X光片放射自显影检测杂交信号(图9-13)。如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，放射自显影后就会检测到杂交带信号。在筛选基因库得到阳性克隆后，往往是将限制性酶酶切与Southern杂交结合起来，绘制限制性酶图谱。Southern杂交还具有其他多种用途。例如分析基因组DNA某一个基因的拷贝数，用于RFLP分析，鉴定不同物种或亚种中的相关序列，检测基因重排和重复与疾病或癌症的关系等.另一种与Southern杂交方法相似并广泛应用的方法杂交(blotting)分析。这一方法采用与Southern杂交相同的原理及程序，不同的是用RNA进行琼脂糖凝胶电泳，故用与Southern对应的Northern命名。随后，人们又将用蛋白质电泳后转移到膜上进行分析的方法称为Western杂交(Westernblotting)分析。Northern杂交用于分析克隆的基囡在某一细胞或组织的转录水平，即检测mRNA的存在。其基本程序是从待分析的细胞或组织中提取总MA，经过琼脂糖凝胶电泳,然后转移并进行分子杂交。杂交的探针来自克隆的基因。如果膜上有与探针互补的RNA分子，则在X光片上可见到杂交信号带。Northern杂交广泛用于研究基因在不同细胞、组织或器官的表达模式，检测mRNA分子量大小以及mRNA加工过程中可能存在的不同方式，定量分析mRNA等。(3)核酸序列测定。只有将克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后，才能最后确定这个DNA片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用由如Sanger于1977年发明的双脱氧核苷酸链终止法(dideoxynucleotidechaintermination)。这一方法利用DNA聚合酶，在引物(同位素或荧光标记)的引导下，以一条DNA链为模板，从5，到3，延伸形成可供测定的序列。在延长反应中除脱氧核苷酸外，还掺入一定比例的双脱氧核苷酸。具体方法是，将序列反应分为A、C、G和T4管，每管中含有变性的DNA模板、DNA聚合酶、标记的引物、4种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比例的双脱氧核苷酸(如A管中，即是腺嘌呤A双脱氧核苷酸，依此类推)。在DNA合成过程中，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正在延长的DNA链中，在不同DNA链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在第三位没有游离的羟基(-0H)，无法再连接另一个核苷酸，导致DNA链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成一系列不同大小的DNA分子。将4个反应产物并排点在聚丙烯酰胺凝胶上的4个孔中，电泳后每个孔中形成一条梯状DNA带，从底部往上阅读，即是5'到3'端的序列(图9-14)。(4)核酸序列分析。测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验迸一步分析，才能最后得出结论。同源性比较是常用的方法之一。同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。首先可将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，或将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较，很快就可知道测得的序列与所有的已知序列之间的同源程度。另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。一个ORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻译起始信号以及一种终止信号(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。如果筛选分离的核酸来自cDNA库，则可直接进行0RF分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。但对于来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子，还需要与其他同源序列比较外显子-内含子交界序列(exon-intronboundary)或结合相应的cDNA克隆序列一起分析，才能确定核酸序列的身份。对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。例如，将分离的核酸序列与载体构建成重组DNA分子，利用同源重组导致摹因失活或过量表达，再据生物的表现型推测基因的作用.也可利用噬菌体显现(phagedisplay)技术或酵母菌双杂交系统(two\nhybridsystem)，分析蛋白质之间的互作及其功能。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因聚合酶链式反应(poly-merasechainreaction,PCR)是体外快速扩增DNA的方法。这个由美国的Mullis于1986年发明的方法，可在数h内便目的基因片段扩增到数百万个拷贝，它可取代一些经载体克隆DNA的方法。这一方法不仅广泛用于分子生物学研究，还用于遗传、发育、进化、疾病,诊断、法医学等领域中。可以说，PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑。PCR扩增基因的方法是，首先根据待扩增基因序列合成两个引物(图9-15)，它们分别与待扩增基因二条链的两端互补，从5'到3'的方向向待扩增基因的中间延伸。在DNA模板变性成单链后，两个引物分别与单链DNA复性，在耐热DNA聚合酶(Tappolymerse)及4种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成DNA新链。PCR反应包括下述3个步骤。1·变性在94-95c使模板DNA的双链变性成单链。2·复性两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度为50-70c。3·延伸在引物的引导及T叫酶的作用下，于72记下合成模板DNA的互补链。这3个步骤称为一个循环，PCR反应常有25~35个循环。一个循环完成后，待扩增的基因扩增了一倍，新增加的基因又可作为模板用于下一步的扩增，所以，PCR反应中扩增的基因是成指数级增长的。因此仅用少量的模板DNA分子，经PCR后可以得到大量扩增基因产物。PCR方法通常可以扩增5kb左右的DNA片段，利用一些改良的方法，可以扩增长达40kb的DNA片段。PCR扩增的基因经过核酸序列测定分析后，可作为基因工程的目的基因。根据PCR方法及原理，现己发展衍生出很多新方法，如RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)，AFLP(amplifieldfragmentlengthpolymorphism)等，广泛用于基因分子标记等研究中。(三)人工合成基因根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。例如，首先化学合成多个含有8~100个核苷酸的寡聚核苷酸，每个寡聚核苷酸之间具有19~24个核苷酸的重叠序列(图9-16)。再将各个寡聚核苷酸等量(摩尔浓度)混合，在DNA聚合酶(或Tap酶)作用下，各寡聚核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链。再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)扩增出完整的基因片段，或直接测序，或克隆到质粒上再测序后加以利用。五、基因工程的应用在过去20多年时间里，基因工程研究发展极为迅速，现已取得一系列重大突破，基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。下面举几个例子。(一)基因工程工业最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(insulin)。这个基因工程产品在1982年就获得临床应用专利。胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。在动物体内胰岛素是胰腺细胞先形成一种前体胰岛素(见"翻译后修饰"部分)，再加工成两条不同的成熟胰岛素原分子，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，经两对二硫键连接形成成熟的胰岛素。基因工程生产人的胰岛素的方法如图9-17所示。将成熟胰岛素原的人链和B链核苷酸(A链63bp，B链90bp)人工合成后，分别与载体中的β-半乳糖苷酶序列连接，构成β-半乳糖苷酶，胰岛素原融合蛋白，受β-半乳糖苷酶启动子控制，并在两条链的起始端分别导大一个甲硫氨酸起始密码子(ATG)，以便表达产物的后加工。将构建的重组质粒转化大肠杆菌细胞，分别表达β-半乳糖苷酶与A链或B链的融合蛋白。从细菌中纯化的融合蛋白用溴化氰处理裂解，将β-半乳糖苷酶与A链或B链分开，得到纯胰岛素原蛋白。再将纯化的A链和B链混合后，经二硫键连接成为完整的胰岛素。这种利用甲硫氨酸作为融合蛋白连接点，只能用于不含甲硫氨酸或色氨酸的目的基因。对于含有这两种氨基酸的目的基因，也可在融合蛋白连接处导入其他氨基酸，用其他蛋白酶处理，获得纯化的目的蛋白。\n利用类似的方法，已在细菌中生产10多种医药产品，如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。有些真核细胞的蛋白质需要糖基化等修饰加工以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统。因此真核细胞更适合于表达真核生物蛋白质。目前酵母菌、植物悬浮细胞、植株、动物细胞均已成功地用于表达外源蛋白质。(二)植物基因工程基因工程生物中的成功，大大促进了植物基因工程的发展。许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术，尤其是根瘤土壤杆菌转化技术不断完善。目前，利用基因工程技术已培育出许多抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优良品系或品种，很多已经大面积种植推广。植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内，并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。现已发展成为多种将外源基因导人植物细胞的方法，其中应用最多的是根瘤土壤杆菌转化技术和基因枪转化技术。1，根瘤土馕杆茼转化技术根瘤土壤杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。这种方法早期主要用于双子叶植物转化，后来逐步成功地用于多种单子叶植物的转化。这种转化方法是将目的基因与花椰菜病毒35S启动子及终止B质粒分别带有子组成嵌合DNA分子，插入到Ti衍生质粒的RB与LB内构成重组质粒，再转化到根瘤土壤杆菌细胞，将得到的重组根瘤土壤杆菌去感染植物细胞，从而使质粒的部分DNA与目的基因一起整合到植物染色体上，实现遗传转化。例如，植物抗除草剂基因工程就是利用这种途径完成的。田间杂草给农业生产带来的损失占作物产量的10，生产上应用的除草剂有100多种。培养抗除草剂转基因植物，可在使用除草剂后不被损害，达到仅杀死杂草而无害于作物的目的，从而提高作物产量，增加农业生产效益和环保效益。有一类除草剂草甘膦,是通过抑制叶绿体中的EPSP合成酶而杀死杂草的。EPSP合成酶在植物及细菌中催化芳香族氨基酸生物合成的一个反应。如果EPSP合成酶遭到的破坏，会使一些关键氨基酸的合成受阻，导致植物枯萎、死亡。利用从抗glyphosate的大肠杆菌中分离、克隆的EPSP合成酶基因，己培育出高抗除草剂glyphosate的转基因植物。其方法是将细菌的EPSP基因按上述方法构建成重组DNA分子，插入到质粒中，当带有重组质粒的根瘤土壤杆菌感染植物细胞时，将部分载体序列及肝SP基因整合到植物染色体上(图9-18)。具有EPSP基因的植物愈伤组织大量表达这个基因，因而能在含有除草剂glyphosate的培养基上生长，经再生、分化，培养出抗除草剂植株。2·基因枪转化技术根瘤土壤杆菌主要感染双子叶植物，早期利用根瘤土壤杆菌转化单子叶植物未能成功。为了克服这些困难，美国的Sanford等人于1987年发明了基因枪转化技术，用于单子叶植物转化。基因枪介导的植物转化是通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导人受体细胞，并整合到染色体上的方法。这种转化方法简单，但需要基因枪、金属颗粒等设备条件。目前这一技术己广泛用于转化水稻、小麦、玉米十大豆等主要作物。基因枪技术还可用于转化微生物、动物细胞、动植物器官、细胞器和正在生长的植物。另外，基因枪在多基因共转化中更表现出极大的优越性。基因枪转化的载体多数是以pUC系列质粒为基础构建的。它们通常具有细菌复制原点及抗性选择标记，具有可在植物中表达的启动子、终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记(如除草剂、新潮霉素等)。CaMV35S启动子及终止子也用于这类质粒(如PDB)。有些质粒利用玉米ubi(ubiquitin,遍在蛋白质)启动子及其内含子来调控目的基因表达(如Pahc25)。将目的基因插入到载体后，在细菌中克隆复制重组DNA，将重组DNA与金属颗粒(钨粉或金粉)在一定条件下结合，直接用于转化。\n目前使用的基因枪有几种类型，其共同特点是用一种动力系统将金属颗粒及其包被的DNA导人受体细胞或组织进行转化。最早商品化以氦气作动力的基因枪PDS-1000，其转化过程如图9-19所示。转化前，将重组DNA及样品置于微载体上，再将微载体附于大载体上，爆破片位于高压气体加速管下部，作为受体细胞的样品位于下面。利用氦气作动力转化，气体加速后冲破爆破片，便包裹有DNA的金属颗粒穿过阻挡板(挡住了碎片)，进入受体细胞内，整合到染色体上。将转化后的材料经培养、选择、再生、培养成完整的植株。(三)转基因动物与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢一些。这主要涉及到一些技术难题，以及伦理学、宗教等问题。但自从1996年Dolly克隆羊的降生，许多动物已经被成功克隆，包括最难克隆的动物之一猪、濒危动物、野牛等。转基因动物通常是将目的基因与载体构建成重组DNA后，用微量注射法将重组DNA导人受体合子细胞核中，实现遗传转化。例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。人类抗胰蛋白酶基因缺失导致的肺气肿，属于一种先天性遗传疾病。将人的抗胰蛋白酶o@1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶(35g/l),这一结果说明可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白.(四)过传疾病诊断利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平，而不是据基因产物进行诊断，因而准确度高，速度快。(1)RFLP法RFLP方法的原理。限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。如果某一位点的核苷酸序列发生突变，有可能导致缺失或产生新的限制性酶切位点。若这种突变只发生在同源染色体中的一条上，另一条染色体正常，用限制性酶酶切后，据DNA片段的带型，就可以鉴别出一对同源染色体的差异。如图9-20所示，A染色体具有3个位点，而B染色体只有两个BamHI位点。经BamHI酶切,A染色体产生两条分别为8kb和3kb的DNA片段，B染色体只产生一条11kb的DNA片段。用来自这个染色体区段的DNA作杂交探针，进行Sonthern杂交分析，可以鉴别出不同的DNA片段。这种经限制性酶酶切产生的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多型性()。RFLP变异表现为共显性。研究表明，RFLP是一种普遍现象，人类基因组中已鉴定了几千个RFLP位点，作为基因组图谱分析的分子标记，用于诊断遗传疾病。(2)镰刀性贫血病的诊断。如前面所述，β球蛋白基因一个核苷酸突变可引起镰刀形细胞贫血病(sick-cellanemia)。有一种基因突变导致的镰刀形细胞贫血病，这个核苷酸改变(由GAG变成GTG)也正好导致一个限制性酶切位点改变。使原来能被MstⅡ或AryI酶识别的位点(CC/TNAGG)变成不能被这类酶酶切，结果突变使Southern杂交带型发生变化，根据这种RFLP带型即可诊断镰刀形细胞贫血病患者及其家系中各成员的遗传组成。妊娠期胎儿镰刀形细胞贫血病的诊断方法是，用CVS法获取细胞后，提取DNA用MstⅡ酶切，Southern转移。正常的β-球蛋白基因有3个MstⅡ切点(图9-21)，酶切后得到两个小片段，在GAG变成GTG突变后，第二个MstⅡ位点不存在了，酶切只产生一个片段。将酶切的DNA转移到膜上后，用一段β－球蛋白基因片段为探针进行Southern杂交分析，根据有杂交信号的带型可以判断出基因型。如图9一21所示。如果双亲均是βS球蛋白基因突变携带者(βAβS)，Southern分析中有3条带。在这个家系中，第一个小孩(女)仅两条小带，基因型正常纯合，表型正常;第二个小孩(男)仅一条大带，为纯合突屺变型，表现型为镰刀形细胞贫血病;第三个胎儿有一条大带及两条小带，其基因型为βAβS,表型正常，但仍是镰刀形细胞贫血病携带者。RFLP法也用于诊断基因缺失突变。已知有5-10的基因突变可用这种方法诊断。2·等位基因特异寡聚核苷酸法当已知突变基因的核苷酸序列时，就可以用人工合成的寡聚核苷酸进行PCR反应，将PCR产物用作点杂交分析，鉴定基因型。这种可用于检测单个核苷酸变异的方法，称为等位基因特异寡聚核苷酸法\n(皿de一s岬诜。讪卯nuclmdde，腌0)。这里仍以镰刀形细胞贫血病为例，说明这一方法的应用特点。从白细胞中提取DNA后，用特异引物进行PCR，再将PCR产物点到膜上，用β-球蛋白基因作探针杂交，据杂交信号强度直接判断基因型(图9-22)。当用正常寡聚核苷酸进行忧R分析时，根据杂交信号推知:纯合(βAβA)基因型产生强信号(深色)，杂合(βAβS)基因型产生较弱信号(较浅),而突变的隐性纯合(βSβS)基因的序列不能与AS0结合，没有PCR产物，故没有信号(最浅，仅背景信号)。但如果用βS突变的ASO进行PCR，杂交信号的强度正好与上述相反，即突变纯合的βSβS的信号最强，正常纯合(βAβA)的没有信号。类似的方法还用于许多其它疾病的诊断。可以预见的是，随着人类基因组计划的完成，对正常及突变基因序列全部测定后，人类就可以直接从基因水平准确诊断遗传疾病。[五]基因治疔利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(genetherapye)。从理论上讲，只要具有适合的载体及基因导入方法，将正常的等位基因及调控元件导入有缺陷的体细胞中，是有可能从根本上治疔由于遗传物质缺陷导致的疾病的。目前己有几种基因治疔方法。其中最常用的基因转移方法是利用减毒的病毒DNA(retrovirusDNA)作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组减毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。例如，用莫洛尼氏鼠白血病病毒(m卜n吖e血a讨m，mloMyMW)改造而成的retrovirus载体，己用于治疗严重综合免疫缺陷(wmd胡c;en吖，虬m)。SCID是由于腺苷脱氨酶(扔en面ned,ADA)基因突变引起的，患者无任何免疫功能，只能在严格控制的无菌条件下才能生存。将人类正常的ADA基因插入到mloneyMLVretrovirus载体上，取代该病毒中的3个结构基因(鹤、pl和env)，保留病毒的ψ序列(编码包装所必须的蛋白质)及两端的长末端序列LTR序列参与控制转录及整合到染色体上(图9-23)。将构建的重组病毒DNA分子包装后，从患者体内抽取白细胞(T细胞)，用包装的病毒感染T细胞，将正常的ADA基因整合到T细胞染色体上，再将培养的T细胞返回到患者体内。利用这种方法治疗后，有的患者的正常T细胞可达到50%，但有的仅0.1%。2000年法国的费雪尔(Fischer)等人利用类似方法，成功地治疗两个患有SCID的幼儿(8个月和11个月)，他们将患者的骨髓干细胞抽取后，在人工培养条件下，用带有正常基因的重组减毒病毒反复愍染3次，再将干细胞返回到患者。两周之内，就可以从患者体内检测到新细胞及正常基因，完全恢复了患者的正常免疫系统和功能。这两个小孩己能同其他同龄人一样，在正常环境下生活。这一工作被认为是20世纪人类基因治疔上的重大突破。在未来的基因治疔中，寻找新的克隆载体将是研究的热点之一。减毒病毒载体接受外源DNA的片段较小，载体只能在宿主细胞DNA复制时才能整合到染色体中，有些病毒载体诱导宿主细胞的免疫反应，或插入到染色体后引起插入位点基因失活。另外，减毒病毒载体也可能同己存在于细胞内的野生型病毒发生重组，形成新的病毒分子。目前已发展的载体还有腺病毒(adenovirus)及与腺病毒有关的病毒载体等。毫无疑问，随着人类基因组草图的绘制成功，以及后基因组学的兴起，基因治疔必将得到更快的发展与广泛应用，使许多现在束手无策的疾病能有治疔的良方。(六)DNA芯片DNA芯片(DNAchip)是将核酸分子杂交的原理和方法，与半导体技术结合而发展形成的一门新技术。这一技术可便许多分子杂交反应同时进行.DNA芯片技术是在面积不大(如2cm2)的基片表面分成不同小格，有序地点阵排列一系列固定于一定位置的、可寻址的核苷酸分子，再将待分析的核苷酸分子标记(如用荧光)，变性成单链后与芯片进行分子杂交，与芯片上序列相同的核苷酸将与其杂交，与芯片上序列不同的序列就会被洗掉，然后用高精度的激光扫描仪记录分子杂交的荧光信号，通过计算机软件分析、综合成可读的信息(图9-24)。因此，DNA芯片分析同核酸分子杂交一样，得到的信息是核苷酸水平的遗传变异资料。DNA芯片的基片有用玻璃、硅片或尼龙制备的。早期推出的DNA芯片，每块芯片含有几千个微点。现已发展出每片1的万点阵的芯片。这一技术已用于单核苷酸多型性\n(s吨卜mclmMe刨p圯pMm，S押)遗传筛选、不同细胞和组织的RNA群体的比较。在医学中可利用DNA芯片技术检泌遗传疾病，如扫描P53基因突变;因为60%的癌细胞具有P53基因突变。随着基因芯片制作工艺和检测手段以及基因组研究的飞跃发展，基因芯片技术必将得到更加广泛的应用。copyright©2005-2006天津农学院农学系遗传教研室版权所有e农网站设计制作地址：天津农学院农学系email:zl1952@yahoo.com.cnTel:022-23789376第八章基因表达与调控    基因表达就是将基因携带的生物信息释放出来，供细胞利用的过程，或将生物的遗传信息作为性状或特征表现出来的过程。 一、经典遗传学关于基因的概念Mendel称控制生物性状的因子为遗传因子（inheritedfactor）。1909年，丹麦遗传学家Johnsom提出了基因（gene）这个名词，取代了Mendel的遗传因子，一直应用至今。Morgan及其同事们以果蝇、玉米为材料，经过大量研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学。经典遗传学关于基因的概念有如下几个要点：     1、基因是不连续的颗粒状因子，在染色体上有固定的位置，并且呈直线排列，具有相对的稳定性。     2、基因作为一个功能单位控制有机体的性状表达。     3、基因以整体进行突变，是突变的最小单位。     4、基因在交换中不再被分割，是重组的最小单位，。     5、基因能自我复制，在有机体内通过有丝分裂有规律地传递，在上下代之间能通过减数分裂和受精作用有规律地传递。    交换、突变都涉及基因的结构，因此突变单位和重组单位也统称为结构单位：所以，经典遗传学认为基因既是一个结构单位，又是一个功能单位。倒底基因是什么物质构成的，基因的本质是什么，经典遗传学无法回答这个问题。40年代以后，随着分子遗传学的飞速发展，对基因有了越来越深刻的认识。DNA双螺旋模型的建立、遗传密码的破译，使基因的概念获得了更加具体的内容。二、分子遗传学关于基因的概念\n要点如下：1、基因位于DNA分子上，一个基因相当于DNA分子上的一个区段。2、每一个基因都携带有特殊的遗传信息，这些遗传信息或者被转录为RNA并进而翻译为多肽；或者只被转录为RNA即可行使功能；或者对其他基因的活动起调控作用。3、基因在结构上并不是不可分割的最小单位，一个基因还可以划分为若干个小单位：①突变单位（突变子muton）：发生突变的最小单位。最小的突变子是一个核苷酸对。②重组单位（重组子recon）：可交换的最小单位。最小的重组单位也可以只是一个核苷酸对。③功能单位（顺反子cistron，又叫作用子）：顺反子是基因中指导一条多肽链的合成DNA序列，平均大小约为500-1500bp。顺反子是与经典概念的功能单位相当的概念，表示基因是一个在遗传功能上起作用的最小单位。三、经典概念与现代概念的比较分子遗传学关于基因的概念保留了功能单位的解释，而否定了结构单位的说法。一个基因内实际包含了大量的突变单位和重组单位，而不是如经典概念所描述的，一个基因就是一个突变单位，一个重组单位。无论是经典遗传学还是现代分子遗传学都认为基因是遗传功能的最小单位。四、基因概念的进一步发展随着分子遗传学的不断发展，关于基因的认识也在不断地发展，是基因的概念有了新的内容。结构基因（structuralgene）：可以编码一个RNA分子或一条多肽链的一段DNA序列。调控基因（regulatorgene）：其产物参与调控其他结构基因表达的基因。重叠基因（overlappinggene）：同一个DNA序列可以参与编码两个以上的RNA或多肽链。不连续基因（splittinggene）：在一个基因内，编码序列（exon）与非编码序列（intron）相间排列。跳跃基因（jumpinggene）：可以在染色体上移动位置的基因。假基因（pseudogene）：已经伤失功能，但是结构还存在的DNA序列。五、顺反测验怎样判断一个基因呢？有两个标准：①编码一条多肽链，只能判断是，却不能说不能编码多肽链的DNA序列就不是一个基因。②功能上被顺反测验（cis-transtest）或互补测验(complementarytest)所规定。    根据基因的功能确定两个基因是否等位的测验方法称为顺反测验。假定两个独立起源的隐性突变，都与同一个单位性状相关，比如一个决定花的颜色是红色，另一个决定花呈粉红色，而野生型花是白色的。这两个突变是两个不同的基因的突变呢还是同一个基因内两个不同位点的突变呢？要回答这个问题，有两个途径：①假如我们知道这两个基因在染色体上处于不同的位置，就可以判断它们是两个不同的基因。但就目前的水平，我们不能区分相邻的两个基因座位。②看它们在功能上能否互补，即对其功能进行测验。    首先建立一个双突变杂合二倍体。也就是说把两个隐性突变通过杂交引入同一个细胞。     然后测定这两个突变基因之间有无互补功能。若二者能够互补，双突变杂合二倍体表现为野生型，若二者不能互补，则表现为突变型。双突变杂合二倍体有两种排列方式：\n     顺反测验就是根据顺式表现和反式表现型是否相同来推测两个突变是属于同一个基因（顺反子）还是分属于两个相邻的基因（顺反子）。如果两个隐性突变发生在同一个基因内的两个不同的位点上，在反式状态下，两条染色体上都只能产生突变的mRNA，编码突变的蛋白质，当然只能产生突变的表现型，在顺式状态下，由于隐性的突变基因不表达，因而表现为野生型。若两个突变不是发生在同一个基因内的不同位点上，而是分别发生在两个相邻的基因内，在反式条件下，两个隐性的突变基因都不表达，但它们的显性野生型等位基因都能正常表达，因而表现的野生型。顺式状态下，当然也表现为野生型。a.同一个顺反子上的两个突变b.相邻两个顺反子上的两个突变顺式（相引组）反式（相斥组）    实际上，顺式排列只是作为对照，它的表型永远都是野生型，二者没有区别。只有在反式状态下，两个突变位于同一个基因内或两个突变位于不同的基因内，表型上才有差异。    因此，所谓顺反测验，实质上只是顺式测验。如反式排列表现为野生型，表明这两个突变分属于两个基因，互为非等位基因。如反式排列表现为突变型，表明这两个突变发生在同一个基因内的不同位点上，二者是等位基因。     由这种功能测验所规定的最小功能单位称为顺反子（cistron）。也就是说，同一顺反子上的两个突变，在反式状态下是不能互补的，若两个突变在反式状态可以互补，便意味着他们分属于两个不同的顺反子。从这个意义上，顺反测验又称为互补测验（complementarytest）。顺式结构的表型效应不同于反式结构的表型效应的现象称为顺反位置效应。具有顺反位置效应的两个突变型属于同一个顺反子。比较顺式和反式结构的表型效应的方法称为顺反测验或互补测验。    顺反测验证明基因是遗传物质的一个功能单位，是一段连续的DNA序列。但是，一个基因可以在许多不同的位置上发生突变，所以基因不是一个突变单位。属于同一个基因内的不同突变也是可以发生重组的，所以基因也不是一个重组单位。一个基因内部虽然可以重组，但基因在细胞中必须保持完整才具有功能。按照定义，通过顺反测验才能确定一个顺反子。但实际上，“顺反子（cistron）”已经用作为一个功能单位的同义词。因此，编码一条多肽链的一段DNA，即使没有通过顺反测验来确定它的边界，也称为一个顺反子。实质上顺贩子就是一个功能基因。六、基因的微细结构    基因的最精细的结构就是DNA的一级结构，即DNA分子上的碱基排列顺序。现在，人们可以用DNA测序技术测定任何一个基因的核苷酸顺序。世界上最宏大的测序工程就是人类基因组计划，投资30亿美元，历时15年，最终目的，是为测出人体基因组的全部核苷酸顺序。这一工程已经提前完成。我国也承担了1%的测序任务。这一工程的完成，将对人类的健康事业和遗传学研究带来不可估量的好处。人们将可用人工合成的基因有目标地替代活细胞内的致病基因，或抑制致病基因的表达，治疗遗传病。人的基因组大约有3×109bp，倘若把这么多的核苷酸序列即碱基符号全部印在纸上，将是多厚的一本书呢？\n每行60字母，每页50行。6×109/60×50=2×106=2，000，000页！    50年代，生化技术还不能进行DNA序列的测定。Bonzer利用经典的噬菌体突变和重组技术，对E.coliT4phage的rⅡ区基因的微细结构进行了详细研究，为后来人们研究基因的精细结构提供了范例。T4是E.coli的烈性噬菌体，感染E.coli后能引起溶菌。野生型的T4phage既能侵染E.coliB株，也能侵染K12（λ）株（溶原性菌株），经6-10小时形成小而边缘模糊的噬菌斑（plaque）。而有的突变型噬菌体侵染E.coli以后可以在较短的时间内形成大而边缘清晰的噬菌斑，溶菌速度大大加快，称为快速溶菌型（rapidlysis），记为r，在噬菌体染色体的三个不同部位有三个不同的r突变型，命名为rⅠ，rⅡ，rⅢ。研究得最为清楚的是rⅡ突变型。T4的rⅡ突变型侵染E.coli后20分钟就能形成大而清晰的噬菌斑，但它只能侵染E.coliB株，而不能侵染K12（λ）株。T4rⅡ突变型与野生型的关系如下：E.coli菌株BK12（λ）T4品系rⅡ+(野生型+噬菌斑小而模糊)，rⅡ-(突变型+噬菌斑大而清晰)。利用这一特点，让不同的两个rⅡ突变型（rx和ry）杂交，然后可以在K12（λ）菌株上把重组体r+r+检测出来，估算出两个突变点之间的重组值。测验的基本步骤是：①任意取两个不同来源的rⅡ突变品系（rⅡxrⅡ+，rⅡ+rⅡy）同时感染E.coliB菌株，即双重感染（doubleinfection）。（注意：不能造成超数感染）。②形成噬菌斑以后搜集溶菌液，其中含有子代噬菌体。③取部分溶菌液再接种在E.coliB菌株上，因为r+rx，r+ry，rxry和r+r+都能够在E.coliB菌株上生长，可以估计溶菌液中的总噬菌体数。④取部分溶菌液接种在E.coliK12（λ）菌株上，因为，只有r+r+才能够在K12（λ）菌株上生长，其余三种基因型，r+ry，rxr+和重组型rxry都不能在K12（λ）上生长。因此，可以在K12（λ）菌株上检测出重组噬菌体的数目。在估计重组体数目时，要将实际测得的数字乘以2，因为重组体应该有两种，rxry和r+r+，但rxry基因型的重组体不能在K12（λ）菌株上生长。例：两个突变型rxr+和r+ry杂交，将搜集到的部分溶菌液稀释106倍，取0.1ml涂布在B菌株上，生成的噬菌斑数为600。再取等量溶菌液，稀释103倍，取0.1ml接种在K12（λ）菌株上，得到150个噬菌斑。应用这种方法，重组率低到百万分之一也能检测出来。此法实际上是两点测验法，根据许多次两点测验的结果，可以作出rⅡ区不同位点间微细遗传图。这与二倍体生物通过一系列两点测交法绘制的连锁图是相同的。\n从图8－5可以看出，图距基本上是可以累加的。Benzer在试验过程中注意到，rⅡ突变型可以分成两组，A组和B组。用一个A组的突变型和一个B组的突变型同时感染K12（λ）时，能产生速溶菌现象，即能互补。所谓互补，就是两种突变型同时感染K12（λ）时，可以相互弥补对方的缺陷，共同在菌体内繁殖，引起溶菌现象。而同属A组，或同属B组的两个突变型之间则不能互补。可见，A组的功能缺陷可为B组所补偿，同样B组的功能缺陷能被A组所补偿。仔细研究又发现，所有A组的突变都位于rⅡ区域的一边，B组的突变均位于另一边。因此推测，A和B各是一个功能单位，rⅡ区域包括A、B两个顺反子。Benzer共分析了rⅡ区域的大约2000个突变型，了解到这些突变分布在308个位点上，分属两个不同的功能单位。七、基因的作用与性状的表达在生物体内，大部分遗传性状都是直接或间接通过蛋白质表现出来的。在生物的个体发育过程中，某个基因一旦处于活化状态，就将它携带的遗传信息转录在mRNA上，再翻译成蛋白质。DNA——→mRNA——→protein40年代，提出了一个基因一个酶的理论，即：一个基因——→形成一种酶——→控制一个生化反应过程。我们知道，酶也是蛋白质。对于单体酶来说，这个理论是正确的。但对于复合酶来说，就不一定正确了。复合酶可能是由两条或者更多条不同的肽链构成的，不同的肽链必然是由不同的基因编码的。于是，50年代提出了一个基因一条多肽链的理论。该提法比一个基因一个酶的提法前进了一大步。一般地说，基因对于性状表达的作用可以分为直接与间接两种。一种是直接编码结构蛋白和功能蛋白，为直接作用；另一种是通过酶的合成，间接地影响性状的表达，为间接作用。一个基因一条多肽链的理论无论对于直接作用还是间接作用都是适用的，但是过于简单化了。例如：人类镰刀形红血球贫血症是直接作用的典型例子。每个血红蛋白分子有四条多肽链，两条相同的α链，每条有141个氨基酸；两条相同的β链，每条有146个氨基酸。正常的血红蛋白HbA码正常的βA链。正常的红血球是球形的。当HbA突变为Hbc或Hbs，就编码多肽链βC和βS，使红血球呈镰刀形，引起贫血病。比较三种血红蛋白βA、βC、βS的氨基酸组成，发现三者的不同仅仅在于β链第六位上的氨基酸不同。作用子βADNAGTACATCATGTACTTGAAACTTGACCTGGAGAACTTGAACTTAAATTTmRNA密码子GUACAUCUUACUCCUGAAGAAAAA氨基酸valhisleuthrprogluglulysβSDNAGTACATmRNA密码子GUA氨基酸val\nβCDNAAAATTTmRNA密码子AAA氨基酸lys可见，基因内一个碱基的变化，就能直接影响一个性状。对于功能蛋白和结构蛋白就是如此。间接作用是通过编码构成酶分子的多肽链而实现的。例如：高茎豌豆（TT）×矮茎豌豆（tt）↓F1为高（Tt）T〉t。研究证明高茎豌豆中有赤霉素，而矮茎豌豆中没有。赤霉素能促进细胞伸长，表现为高茎。赤霉素的合成需要一种酶，T基因就编码合成赤霉素的酶，而t基因的核苷酸序列与T不同，不能编码合成赤霉素所需要的那种酶。从分子遗传学的观点看，遗传信息的表达有两个主要环节，即转录和翻译两个过程，则：一个基因－→一个mRNA－→一条多肽链但是，进一步的研究证明，这个模式仍然显得太简单。因为基因不仅可以作为mRNA转录的模板，也可以作为rRNA和tRNA转录的模板。还有一些基因既不转录为mRNA，也不转录为tRNA和rRNA，而只对其它基因的作用进行调控。多肽链的合成与停止，不仅与基因突变相联系，更主要的是受制于基因作用的调控系统。第二节基因调控    一、原核生物基因作用的调控    每个物种都有一套完整的遗传信息。遗传信息存在于DNA分子中，每个细胞都有相同的DNA，也就是说，每个细胞中都带有完整的遗传信息。    但是，就高等生物而言，各个细胞、各个部位、各个不同的生长发育时期，并不是所有的遗传都全部表达。    高等生物是多细胞的复杂有机体，从一个受精卵开始，在个体发育的过程中逐步分化产生各种细胞类型和组织。这种分化就是不同基因表达的结果。    在正常情况下，一个个体的各类细胞都是按照一定的规律和一定的时空顺序，并闭一些基因，开启另一些基因，并不断地进行严格的调控，以保证个体的发育得以顺利进行。    为什么一个基因只在它应该发挥作用的部位和时间，才呈现活化状态而表达，在不该发挥作用的部位和时间则处于不活化的关闭状态呢？    必然有一整套的调控系统在起作用。    基因作用的调控机理相当复杂，至今仍知之不多。但这个领域是当前遗传学研究的热点，随着功能基因组学的飞速发展，研究的进展相当地快。当然，研究成果多集中在原核生物，对高等生物基因表达的调控机制还了解不多。1、转录水平的调控    单细胞的原核生物对环境条件具有高度的适应性，可以迅速调节各种基因的表达水平，以适应不断变化的环境条件。原核生物主要是在转录水平上调控基因的表达。当需要这种产物时，就大量合成这种mRNA，当不需要这种产物时就抑制这种mRNA的转录，就是让相应的基因不表达。\n    通常所说的基因不表达，并不是说这个基因就完全不转录为mRNA，而是转录的水平很低，维持在一个基础水平（本底水平）。降解代谢途径和合成代谢途径    正调控（positiveregulation）和负调控（negativeregulation）诱导物与蛋白质结合形成激活子复合物，激活子复合物与基因启动子DNA序列结合，激活基因启动转录，称为正调控。阻遏蛋白分子与基因启动子DNA序列结合，阻碍RNA聚合酶的工作，使基因处于关闭状态，称为负调控。    在原核生物中，关于E.coli乳糖代谢的调控研究得最为清楚。在原核生物中，通常是几个作用相关的基因在染色体上串连排列在一起，由同一个调控系统来控制。这样的一个整体称为一个操纵元。当几种酶参与同一个代谢途径时，往往这几个基因同时被转录为一个多顺反子mRNA。而真核生物基因都是转录成单顺反子的，所以真核生物中没有这种调控机制。以E.coli的乳糖操纵它为例来介绍一般操纵元的调控机制。乳糖操纵元的负调控    在正常情况下，E.coli是以葡萄糖作为碳源的，在没有葡萄糖，只有乳糖存在的条件下，E.coli也能以乳糖为碳源而生存。葡萄糖是单糖，E.coli利用它最为方便和经济。乳糖是双糖，是葡萄糖和半乳糖的复合物。以乳糖为碳源必须先将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，再将半乳糖转化为葡萄糖，这就需要额外的酶。β—半乳糖苷酶，将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖半乳糖渗透酶，帮助细菌从培养基中摄取乳糖半乳糖苷转乙酰酶，作用不明。    在有葡萄糖存在时，细菌体内的这三种酶含量很低。每个细胞中只有3~5个分子的β—半乳糖昔酶。当培养基中没有葡萄糖而有乳糖存在时，这三种酶的量急剧增加，2~3分钟内即可增加1000倍以上，而且三种酶成比例增加。一旦乳糖用完，在2~3分钟内这三种酶的量又很快下降到本底水平。乳糖操纵元模型如下：poizyaa、y、z分别为三个结构基因。o为操纵基因，p为转录的起动子i为调控基因i编码一种蛋白质，称为阻遏物。无乳糖存在时，阻遏物与o结合，关闭三个结构基因，使之不能被转录。当有乳糖存在时，乳糖的一种代谢产物——别乳糖，与阻遏物结合，改变阻遏物的构象，使阻遏物从o上解离下来，从而打开三个结构基因（使之得以转录成mRNA）。乳糖用完后，别乳糖的浓度急剧下降，阻遏物不再与别乳糖结合，又与O结合，阻止RNA聚合酶的工作，立刻关闭结构基因。原核生物中，大多数的基因都被组织在操纵元中，受到类似的调控。乳糖操纵元的正调控    在细菌细胞内，ATP在腺苷酸环化酶的作用下转变成环式AMP(cyclicadnosine\nmonophosphate,cAmp)。细胞内还有一种代谢激活蛋白(cataboliteactivatingprotein,CAP)存在。它是cAmp的受体蛋白(cyclicAmpreceptorprotein,CRP)。cAmp与CAP结合，形成cAMP—CAP复合物。cAMP—CAP复合物是乳糖操纵元的正调控因子。    当cAMP—CAP复合物插入乳糖操纵元的启动子(o)区域的核苷酸序列中时，使启动子区域的DNA序列弯曲成新的构型，这种新构型有利于提高RNA聚合酶的工作效率。当细胞中既有别乳糖与阻遏蛋白结合，又有cAMP—CAP复合物与启动子DNA序列结合时，乳糖操纵元的转录效率最高。    但是，细胞内有葡萄糖存在时，葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，不能形成cAmp。所以，乳糖操纵元的表达调控实际上是正调控和负调控协同作用的。顺式调控元件和反式调控因子基因表达的调控都是特定的蛋白质分子和特定的DNA序列两个因素相互作用的结果。起调控作用的DNA序列称为顺式调控元件，如乳糖操纵元中的启动子（p）和操纵子（o）。起调控作用的蛋白质分子称为反式调控因子，如乳糖操纵元中调节基因编码的阻遏蛋白、cAmp－CAP复合物。乳糖操纵元模型有三个基本假定：1．调节基因编码的阻遏蛋白是可以在细胞中扩散的反式调控因子；2．操纵子（o）是调控序列，不编码蛋白质；3．操纵子（o）是顺式调控元件，邻近受其控制的结构基因。基因表达调控元件的突变如果调节基因I发生突变，I＋→I—，或者失去编码阻遏蛋白的功能，或者编码的阻遏蛋白构型发生变化，不能与操纵子结合，从而使操纵元不管有无乳糖存在都一直在表达。这种不管细胞内需要不需要其编码产物，这个基因都在表达的状况称为组成型表达(constitutiveexpression)，这样的基因突变称为组成型突变(constitutivemutant)。与组成型表达相对应的概念是特异性表达(specificexpression)。如果操纵元中的操纵子序列发生突变，O→OC，使操纵子DNA序列不能与阻遏蛋白结合，也会使操纵元由特异性表达转变为组成型表达。 2、翻译水平的调控        刚才所讲的基因表达的调控，是调控基因的转录与否以及转录量的大小。这样的调控是在转录水平上的调控。基因表达有两个主要环节，转录和翻译。基因表达的调控可以调控转录环节，也可以调控翻译环节。    原核生物中研究得最清楚的翻译水平的调控系统是E.coli核糖体蛋白质合成的反馈调控机制(feedbackregulation)。E.coli有7个操纵元与核糖体蛋白质合成有关。每一种操纵元转录的mRNA都能够被同一操纵元编码的蛋白质识别，并能够与其结合。如果某种核糖体蛋白质在细胞中过量积累，他们将与其自身的mRNA结合，阻止这些mRNA进一步翻译成蛋白质。mRNA分子上与蛋白质结合的位点通常包括mRNA5'端的非翻译区(untraslatedregion,\nUTR)，也包括启动子区域的Shine-Dalgarno序列。    原核生物中的mRNA也受反义RNA(antisenseRNA)的调控。反义RNA可与目的基因的5'端UTR片断互补配对，配对区域通常也包括启动子的Shine-Dalgarno序列，使mRNA不能与核糖体有效结合，从而阻止蛋白质的合成。反义RNA已经用于控制真核生物的基因表达。二、真核生物的基因调控    原核生物操纵元调控中的一些原理也存在于真核生物基因表达中，但是，多细胞真核生物具有精确的发育程序以及大量分化的特殊细胞群，因此它需要更为多样化的调控机制，无疑远比原核生物复杂。    首先，高等真核生物的基因组远比细菌的基因组大得多，因此包括的DNA和遗传信息也多得多。例如，根据已测定的基因组全部序列，大肠杆菌有4.6×106bp，可编码4288个基因，每个基因含有约1100bp。这个基因长度与已全部测序的8个原核生物相似。真核生物啤酒酵母有1.2×107bp，可编码5885个基因，每个基因含约2000bp。在高等植物中，据对拟南芥菜第4染色体长臂的一段长为1.9×106bp的DNA片段全序列测定，这段DNA可编码389个基因，每个基因有4800bp，这些结果说明，高等生物基因组中有很多重复序列。据分析，人类基因组有3×109bp，但编码蛋白质的基因约为3.5万个。其余的都是重复序列。高等植物不同物种的基因组大小差别很大，如拟南芥有1×108bp，水稻有4.3×108bp，小麦则有1.6×1010bp。高等植物的基因组中很多是重复序列，尤其是象小麦这类DNA含量高的大基因组，重复序列比例更大。很多重复序列与调控作用有关。例如，拟南芥的重复序列在转基因烟草中具有基因表达增强子的作用。    其次，真核生物的mDNA与组蛋白等结合形成色质，染色质结构的变化可以调控基因表达。真核生物基因表达分散在整个基因组的各个染色体上，而不象细菌那样全部基因串在一起。所以真核生物不仅存在同一染色体上不同基因间的调控问题，而且还存在不同染色体之间的基因调控问题。   第三，在真核生物中，基因的差别表达是细胞分化和功能的核心。在动物胰脏细胞中不产生视网膜色素，而在视网膜细胞中也不产生胰岛素。真核细胞具有选择性地激活和抑制基因表达的机制。如果基因在错误的时间或细胞中表达，或过量地表达，都会破坏细胞的正常代谢，甚至导致细胞死亡。    第四，真核生物细胞的转录和翻译在时间和空间上都不相同，转录在细胞核中，翻译在细胞质中。    第五，不同生物和细胞可能具有不同的基因表达机制。因此，真核生物基因表达的调控可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次。但是，最主要的调控环节仍然发生在转录水平。（一）DNA水平的调控    真核生物的有些基因是经过DNA的变化来调控的。DNA变化包括基因的扩增、重排或化学改变。其中有些改变是可逆的。1.基因剂量与基因扩增细胞中有些基因的需要量比另一些大得多，细胞保持这种特定比例的方式之一是基因剂量。例如，有A、B两个基因，假如他们的转录、翻译效率相同，若A基因拷贝数比B基因多20倍，则A基因产物也多20倍。组蛋白基因是基因剂量效应的一个典型实例。为了合成大量组蛋白用于形成染色质，多数细胞含有数百个组蛋白基因拷贝。\n    基因剂量也可经基因扩增临时增加。两栖动物如蟾蜍的卵母细胞很大，是正常体细胞的一百万倍，需要合成大量核糖体。核糖体含有rRNA分子，基因组中的rRNA基因数目远远不能满足卵母细胞合成核糖体的需要。所以在卵母细胞发育过程中，rRNA基因数目临时增加了4000倍。卵母细胞的前体同其他体细胞一样，含有约600个rRNA基因（rDNA）。在基因扩增后，rRNA基因拷贝数高达2×106。这个数目可使得卵母细胞形成1012个核糖体，以满足胚胎发育早期蛋白质合成的需要。     在基因扩增之前，这600个rDNA基因以串联方式排列。在发生扩增的3周时间里，rDNA不再是一个单一连续DNA片段，而是形成大量小环及复制滚环，以增加基因拷贝数目。这种rRNA基因扩增发生在许多生物的卵母细胞发育中，包括鱼、昆虫和两栖类动物。目前对这种基因扩增的机制并不清楚。在某些情况下，基因扩增发生在异常的细胞中。例如，人类癌细胞中的许多致癌基因，经大量扩增后高效表达，导致细胞生长失控。有些致癌基因扩增的速度与病症的发展及癌细胞扩散程度高度相关。2．DNA重排真核生物基因组中的DNA序列可发生重排，这种重排是由特定基因组的遗传信息决定的，重排后的基因序列转录成mRNA，翻译成蛋白质，在真核生物细胞生长发育中起关键作用。因此，尽管基因组中的DNA序列重排并不是一种普通方式，但它是有些基因调控的重要机制。⑴酵母交配型转换。    啤酒酵母交配型转换是DNA重排的结果。酵母菌有两种交换型，分别a和α。单倍体a和α之间配合才能产生二倍体a/α，经减数分裂及产孢过程形成单倍体四分子，其中a和α的孢子的比例为2：2。如果单独培养基因型a和α的孢子，由于仅有与亲代相同的交配型基因型，所以形成的孢子之间不能发生交配。但酵母菌中有一种同宗配合交配类型，其细胞可转换成对应的交配类型，使细胞之间可发生配合。如图8-18所示。起始的单倍体孢子（这里是α）发育成一个母细胞及一个芽细胞，芽细胞再长成子细胞。在下一次分裂后，这个母细胞及新形成的子细胞转换成对应的交配型a，结果是两个α和两个a型细胞。相对应交配型细胞融合形成a/α二倍体合子（交配）。再经有丝分裂及产孢过程又形成单倍体孢子。这种交配型转换的基础是遗传物质的重排。控制交配型的MAT基因位于酵母菌第三染色体上，MATa和MATα互为等位基因。含有MATa单倍体细胞具有a交配型。具有MATα基因型的细胞为α交配型。MAT位点的两端，还有类似MAT基因的HMLa和HMRa基因，他们分别位于第III染色体左臂和右臂上。这两个基因分别具有与MATα和MATa相同的序列，但在其基因上游各有一个抑制转录起始的沉默子，所以不表达。    交换型转换是由HO内切核酸酶(HOendonuclease)的作用开始的(图8－9)。这个内切酶将MATa基因内的一段24bp的双链DNA切开，另一种核酸外切酶在双链DNA的切口，从5'到3'加工产生一段突出的3'单链尾端序列（约500个核苷酸），MATa基因用这一段单链系列插入到MATα基因的同源序列中，以HMLα序列为模板，合成一段新的HMLα基因序列，再通过重组使HMLα整合到MATa序列中，导致基因转换，由MATa转换成MATα。在这个重组过程中，有一段244bp的重组强化子，对重组起顺式调控作用，是基因转换所必须的，RE缺失则不能发生基因转换。这段RE序列也位于第III染色体左臂上，靠近HMLα位点。    MAT基因编码一种与MCM1转录因子互作的调控蛋白，控制其他基因转录。MATa和MATα基因产物对MCM1具有不同的影响，因而表现出不同的等位基因特异表达模式。在红色面包霉及其他真菌中出现的四分孢子异常比例，也是重组后产成的基因转换形成的。（2）动物抗体基因重排     一个正常哺乳动物可产生108以上不同的抗体分子，每一种抗体具有与抗原结合的能力。抗体是蛋白质，每一种特异抗体具有不同的氨基酸序列。如果抗体的遗传表达是一个基因编码一条多肽链，那么一个哺乳动物就需要108\n以上的基因来编码抗体，这个数目至少是整个基因组中基因数目1000倍。这是不可能实现的!那么哺乳动物是采用什么机制形成如此众多的不同抗体分子的呢？首先我们看一下抗体分子的结构（图8-20）。抗体包括两条分别约440个氨基酸的重链（heavychain,H）和两条分别约214个氨基酸的轻链（lightchain,L）。不同抗体分子的差别主要在重链和轻链的氨基端（N端），故将N端称为变异区（variableregion,V），N端的长度约为110个氨基酸。不同抗体羟基端（C端）的序列非常相似，称为恒定区（constantregion,C）。抗体的轻链、重链之间和两条重链之间由二硫键连接，形成一种四链（H2L2）结构的免疫球蛋白分子。   在人类基因组中，所有抗体的重链和轻链都不是由一个完整的抗体基因编码的，而是由不同基因片段经重组后形成的。其中重链包括四个片段，轻链有3个片段。人的第14号染色体上具有86个重链变异区片段（VH），30个多样区片段（diverse，D），9个连接区片段（jioning，J）以及11个恒定区片段（C），（表8—2）。轻链的变异区（VL），连接区(J)和恒定区分别位于第2号（Kappa轻链，K）和第22号（Lambda轻链，λ）染色体上。   随着B淋巴细胞的发育，基因组中的抗体基因在DNA水平发生重组，形成编码抗体的完整基因（图8-21）。在每一个重链分子重排时，首先V区段与D区段连接，然后与J区段连接，最后与C区段连接，形成一个完整的抗体重链基因。每一个淋巴细胞中只有一种重排的抗体基因。以类似的重排方式形成完整的抗体轻链基因。重链和轻链基因转录后，翻译成蛋白质，由二硫键连接，形成抗体分子。由于抗体基因重排中各个片段之间的随机组合，因此可以从约300个抗体基因中产生108个抗体分子。3.DNA甲基化和去甲基化    在真核生物DNA分子中，少数胞嘧啶碱基第5碳上的氢被一个甲基取代，使胞嘧啶甲基化(methylation)。甲基化多发生在CG二核苷酸对上，有时CG二核苷酸对上的两个C都甲基化，称为完全甲基化。只有一个C甲基化称为半甲基化。甲基化酶可识别这种半甲基化DNA分子，使另一条链上的胞嘧啶也甲基化。    把甲基化和未甲基化的病毒DNA或细胞核基因分别导入活细胞，已甲基化的基因不表达，而未甲基化的能够表达。活跃表达的基因都是甲基化不足的基因。表达活性与甲基化程度呈负相关。甲基化的程度可以在转录的充分激活和完全阻遏之间起调节作用。某些玉米Ac转座因子在没有任何DNA序列变化的情况下，失去了转座酶基因活性，就是因为这个基因的富含CG区域发生了高度甲基化。经化学处理去甲基化后，又可是转座酶基因活性恢复。(二）转录水平的调控    许多真核生物基因编码关键代谢酶或细胞组成成分，这些基因常在所有细胞中都处于活性态。这种组成型表达的基因称为持家基因(housekeepinggene)。另一些基因的表达则因细胞或组织不同而异，只在某些特定的发育时期或细胞中才高效表达。这类基因的表达调控通常发生在转录水平。前面介绍了细菌中的基因经诱导可使表达效率提高千倍以上。这种极端的调控水平很难发生在真核生物基因表达中（酵母菌除外）。大多数真核生物基因经诱导可提高几倍至数十倍的表达效率。多数真核生物基因转录水平的调控是正调控。1．真核基因表达调控的顺式作用元件顺式作用元件(cis-actingelement)是指DNA分子上对基因表达有调节活性的特定核苷酸序列。\n顺式作用元件的活性只影响同一DNA分子上的基因。这种DNA序列多位于基因上游或内含子中。真核基因的顺式作用元件按其功能可以分为：启动子、增强子和静止子。启动子的结构和功能启动子是转录因子和RNA聚合酶的结合位点，位于受其调控的基因上游，邻近基因转录起始点，是基因的一部分。TATA框（TATAbox）：位于－25～－30位置，是RNA聚合酶Ⅱ识别和结合位点。富含AT碱基，一般有8bp，改变其中任何一个碱基都会显著降低转录活性。又称为Hognessbox。CAAT框（CAATbox）：位于－70～－80位置，共有序列GGCC(T)CAATCT。决定启动子的起始频率。兔的β珠蛋白基因的CAAT框变成TTCCAATCT，其转录效率只有原来的12％。GC框(GCbox)：－110位置。增强转录活性。真核基因的启动子又三个顺式调控元件，而原核基因的启动子只有两个顺式调控元件。增强子的结构和功能增强子（enhancer）是一种远端调控元件，至少距转录起始点上游100bp以上，通常位于－700～－1000处，所以又称为上游激活序列(upstreamactivatorsequence,UAS)。增强子区的跨度一般有100－200bp，常由8－12bp的核心序列和其他序列相间排列。静止子是一种类似增强子但起负调控作用的顺式作用元件。2．真核基因调控的反式作用因子   不论是启动子还是增强子序列，他们的转录调节功能都是通过与特定的DNA结合蛋白的相互作用而实现的。能直接或间接识别各种顺式调控元件并与之结合从而调控基因转录效率的各种蛋白质分子称为反式作用因子(trans-actingfactor)。这类DNA结合蛋白由多种，顺式调控元件也有多种，正是不同的DNA序列和不同的DNA结合蛋白之间在空间结构上的相互作用，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用，构成了复杂的基因转录调控机制。研究得比较多得反式作用因子有：激活子（transcriptionactivator）、SP1、CTF、Ap－1、Ap-2、Oct－1、Oct－2等。反式作用因子的结构特征反式作用因子一般都具有三个不同功能的结构域(domain)。①DNA结合结构域对大量转录调控因子结构的研究表明，DNA结合结构域大多在100bp以下。大体上有4种结构特征：α螺旋－转角－α螺旋结构、锌指结构、亮氨酸拉链结构或螺旋－环区－螺旋结构。②激活基因转录的功能结构域一般有20－100个氨基酸组成。有时一个反式作用因子可能有一个以上的转录激活区。结构特征有：含有很多带负电荷的α螺旋、富含谷氨酰胺或者富含脯氨酸。1.激活子激活子是一中与强化子结合的蛋白，也属于一种转录因子。能促进转录的是正激活子，而抑制转录的是负激活子，他们控制基因转录的时间、地点和效率。正激活子中又包括真激活自和抗阻物激活子，前者是与启动子区域的转录复合体直接接触来激活转录；后者是通过改变染色质的结构，以便其他转录因子的结合，从而提高转录效率的。（1）真激活子包括两个功能区域（具有特殊功能的一段氨基酸）：与强化子结合的DNA\n结合区域和与转录复合体中的蛋白质互作的反式调控激活区域。真核生物基因的转录真激活因子最早是在酵母菌中发现的，这种真激活因子也具有两个不同的区域，其DNA结合区域具有特定的三维结构，包括α-螺旋-转因子-α-螺旋、锌指和碱性亮氨酸拉链。HTH是最早发现的DNA结合区域，λ噬菌体的cro阻物以及乳糖和色氨酸阻蛋白均具有HTH构型。HTH的三维构型中由转角分隔的两个α-螺旋与DNA结合（图8-27）。与其他DNA结合蛋白不同的是，HTH不能单独折叠或与DNA结合，他只是DNA结合蛋白的一部分，HTH构型以外的氨基酸在控制识别和结合DNA中具有重要作用。许多控制发育过程的真核生物基因具有HTH构型。几乎所有生物都具有的同型异位盒，在一段180个氨基酸中，由60氨基酸中组成的同型异位区域就构成HTH构型。在这60个氨基酸中有许多精氨酸和赖氨酸，以及其他保守的氨基酸序列。    具有锌指构型的蛋白是一种参与许多真核生物基因调控的转录因子，最早在爪蟾转录因子TFIIA中发现的。现在知道，这种构型存在于致癌基因、果蝇中控制发育的基因，以及受生长因子和分化信号诱导合成的蛋白质序列中。一个锌指区域包括两个半胱氨酸（CyS）以及两个组氨酸族，其保守重复序列为CyS-N2-CyS-N12-14-HiS-N3-HiS。其中的CyS和HiS残基与锌离子形成的配位键，使氨基酸折叠成环，形成类似于手指的构型（图8-28）。锌指蛋白可形成的手指数目为2~13。每个手指包括约23个氨基酸残基，各手指由7~8个氨基酸连接。锌指与DNA大沟结合并环绕DNA分子（图8-28）。在大沟内，锌指与特异DNA碱基互作，并可能与碱基尤其是GC富含区形成氢键。    第三种DNA结合蛋白区域是碱基亮氨酸拉链，bZIP具有可形成蛋白质-蛋白质二聚体的亮氨酸拉链区（LP）。LP最早是在老鼠肝脏中的一种核蛋白中发现的，具有35个氨基酸残基，其中有4个亮氨酸，每个之间正好相距7个其他氨基酸，两段是碱基氨基酸。这种区域形成的-螺旋的侧面，每两圈有一个伸出的亮氨酸，当两个这样的蛋白质分子形成二聚体时，两个-螺旋之间由亮氨酸残基间的疏水作用力形成一条拉链，碱性-螺旋DNA中的磷酸残基和碱基结合，使二聚体形成一种剪刀结构（图8-29）。除了DNA结合区域外，激活子还具有与其他转录因子互作的区域，与结合在启动子的转录因子或直接与RNA聚合酶互作，这些区域的长度未30~100氨基酸。有些激活子还具有与辅助激活子互作的区域。（2）抗阻激活子抗阻激活子是通过染色质重建来激活基因表达的。染色质结构在细胞间期到有丝分裂期发生变化，其中最重要的是基因表达时发生染色质重建。研究表明，当基因转录或即将起始转录时，染色质DNAI酶降解敏感或超敏感。而在基因完全不转录是，染色质对DNAI酶不敏感，着是因为DNAI酶很容易消化开放（即松散）的染色质，不能消化紧缩的染色质。所以染色质结构成为基因表达的开关。有两种不同结构可以改变染色体结构。一种方式是通过ATP水解-重建符合体途径催化的。酵母菌中的SWI/SNF系统属于这种类型。SWI/SNF是具有11个亚基的复合体，广泛存在于酵母菌及其他真核生物中。这种重建复合体通过激活子、转录因子以及与不同的重建复合体一起作用于靶基因。有些激活子可以结合并打开紧缩的染色质，改变DNA与核小体中心颗粒缠绕的途径，或改变核小体中心颗粒本身的结构，从而促进转录因子及RNA聚合酶与启动子结合，起始转录。   重建染色质的另一种方式是经组氨酸乙酰转移酶（HAT）修饰组氨酸。当一个乙酰基转移末端的碱基氨基酸后，会降低碱性组蛋白与酸性DNA之间的吸引力。HAT也是在特异激活子的作用下作用于靶位点。重建复合体与HAT总是协同工作的方式重建染色质，通常在强化子位点发生的染色质重建，再延伸扩展到基因的启动子位点，使RNA聚合酶等与启动子结合，转录RNA。有些可结合特殊蛋白的DNA序列，称为隔绝元件，可以阻止染色质重建扩展到临近基因。另外，乙酰化的组蛋白也可在组氨酸脱乙酰酶（HD）作用下除去乙酰基，恢复紧缩的染色质结构。   4．酵母菌乳糖代谢的正调控\n早在1900年就被发现的酵母菌半乳糖代谢酶诱导系统，是真核生物中最早作为基因调控研究的系统之一。酵母皲半乳糖基因的作用方式与细菌中的乳糖操纵元和阿拉伯躺操纵元相似，半乳糖的存在与否决定半乳糖代谢基因是否表达。在没有半乳糖时，基因不表达；加入半乳糖后，mRNA浓度可迅速增加1000倍。但是只有在低浓度葡萄糖存在时，才出现这种诱导表达，说明酵母菌半乳糖基因表达也是受另一种方式调空的，即代谢抑制。半乳糖基因是受GAL4调控蛋白调控，调控蛋白存在时激活基因转录，因此，酵母菌半乳糖基因表达是正调控。这里利用两个半乳糖基因GAL1和GAL10来说明这种基因调控机制。这两个基因的转录受一个长约170BP的上游激活序列（UAS）调控，UAS与强化子的功能相似，其染色质结构为组成型开放，没有核小体，对DNAI酶超敏感。这种开放的染色质结构需要SWI/SNF重建复合体参与。UAS序列具有4GAL4蛋白质（GAL4P）结合位点，无论基因是否转录，这4个位点总是与GAL4P结合。同时，GAL4P又受另一个调控蛋白GAL80P的负调控，GAL80P总是与GAL4P结合，覆盖了GAL4P的活性中心（图8-30），当磷酸化的半乳糖与GAL80P/GAL4P复合体结合时，改变他们的构型，使GAL4P的活性中心外露，结果诱导GAL基因表达。这种诱导系统涉及一种蛋白质激酶。这个诱导过程包括集中其他转录因子，进一步重建染色质，以使GAL基因启动子的TATA盒能与TBP结合。    GAL4P含有881个氨基酸，具有能识别UAS系列的DNA结合区域，以及一个激活转录的反式调控区域。利用不同的GAL4P缺失突变进行功能性研究表明，这个蛋白质的N端（1~98个氨基酸）是与UASDNA结合的区域；还有两个转录激活子区域，分别位于第148至第196个氨基酸（I）和第768至第881个氨基酸处（II）。利用重组DNA技术构建不同GAL4P缺失突变体，分析其DNA结合和转录激活功能。结果表明，含DNA结合区域以及一种转录激活区域的构建体都降低转录活性。    转录活性区域功能性研究还分离出一些突变体，可提高转录效率，他们都含有较多的带负电荷的氨基酸，一个拘囿个带负电的氨基酸的突变，可将转录效率提高9倍。这些表明，转录激活的过程涉及蛋白质-蛋白质的互作，从而引起染色质重建，稳定DNA与RNA聚合酶的结合，提高转录区域DNA双链的解链效率，加速RNA聚合酶的释放，或引导和稳定同启动子RNA聚合酶结合的其他因子。3．选择性启动子有些真核生物基因具有两个或两个以上的启动子，用于在不同细胞中表达。不同启动子可产生不同的初级转录产物和相同的蛋白质编码序列。果蝇的乙醇脱氢酶基因是一个典型的例子。这个基因的结构见图8-31A。在幼虫（图8-31B）和成虫期（图8-31C）分别利用不同启动子进行转录。成虫期的转录具有一段很长的5'端前导序列，其中大多数在mRNA加工中去掉。多启动子可使幼虫和成虫具有独立的转录调控。（三）转录后调控    在真核生物中，基因的转录的产物统称为核不均一RNA，必须经过加工才能成为成熟的mRNA分子。在第三章已经讲过，加工过程包括三个方面：加帽、加尾和去掉内含子。    选择性mRNA切割同一初级转录产物在不同细胞中可以用不同方式切割加工，形成不同的成熟mRNA分子，使翻译成的蛋白质在含量或组成上都可能不同。例如，老鼠α-淀粉酶基因，由于RNA内含子的切割位置不同使来自同一基因的转录产物产生不同mRNA分子（图8-32）。α-淀粉酶基因的编码序列从外显子2中第50bp处开始，与外显子3及其他外显子连接。在腺体中，外显子S与2连接（外显子L作为内含子同1和2一起切割掉了）。在肝脏中，外显子L与2连接，而外显子S与内含子1及前导序列L一起被切割掉了。这样加工以后，外显子S和L分别成为腺体和肝脏mRNA的前导序列，形成的不同mRNA以不同速率翻译成蛋白质。类似这种选择性切割机制常见于鸡和果蝇肌球蛋白的合成。7．激素的调控作用\n双翅目昆虫幼虫的唾腺细胞内有巨大的唾腺染色体，其上的横带被认为相当于基因或操纵元。在幼虫发育的不同阶段，可以看到一个或几个横带发生疏松现象（图8-33）即染色丝高度松散而不缠绕。同位素标记试验证明，疏松区出现大量新合成的mRNA。疏松出现的时间和部位随着发育阶段而顺序消长。以果蝇唾腺染色体为例，其幼虫在三龄前期，第III染色体不出现疏松。到三龄后期，74区EF段、75区B段和78区D段出现疏松（图8-34）。进入蛹期，上述3个区段的疏松消失，71区C-E段出现疏松。化蛹期，71区C-E段的疏松消失，而74区EF段和75区B段重新出现疏松。说明74区EF段和75区B段的基因作用与幼虫的蜕皮和化蛹有关。74区EF段和75区B段在蜕皮时发生疏松是和幼虫体内分泌的蜕皮激素有关。蜕皮激素是一种类固醇化合物，由幼虫前胸腺分泌，传送到虫体各部分，激活74区EF段和75区B段的基因，导致幼虫蜕皮。如果在三龄早期用尼龙线将唾腺部分紧紧扎起，如图8-35所示，被结扎的受到蜕皮激素的作用，提前化蛹，而后半部分仍为幼虫。取出唾腺细胞进行检查，发现前半部分唾腺细胞中第III染色体上74区EF段、75区B段和78区D段都有疏松出现。    更为直接的证据是用蜕皮激素注入摇蚊四龄幼虫体内，15~30分钟后，在唾腺染色体Ⅰ的18区C段形成疏松。大约1H后，疏松体积扩大到最大限度。正常情况下，摇蚊幼虫或蛹蜕皮时，正是在I-18-C区段出现疏松。说明蜕皮激素引起该部位基因的活性。类固醇是疏水性很强的化合物，可经扩散通过质膜进入细胞。在细胞中，类固醇与其受体结合形成二聚体。而类固醇受体本身是一组转录因子，具有与DNA结合的保守序列。这种二聚体一旦与目的基因启动子结合，即可直接启动目的基因转录。而且，类固醇受体必须在类固醇存在时，才能与DNA结合，起始基因转录。（四）翻译水平的调控    在真核生物中，基因表达的调控主要发生在转录水平上，但是，翻译水平的调控也是十分重要的。阻遏蛋白与mRNA结合，可以阻止蛋白质的翻译。    铁蛋白的功能是在细胞内贮存铁。铁蛋白mRNA的翻译取决于铁的供应。铁供应充足，则铁蛋白合成就多。当细胞中没有铁时，阻遏蛋白与铁蛋白mRNA结合，阻止翻译的进行。当细胞中有铁存在时，阻遏蛋白就不与铁蛋白mRNA结合，使翻译得以进行。成熟的mRNA可以失活状态贮存起来。    例如，植物的种子可以贮存多年，一旦条件适合，立即可以发芽。在种子萌发的最初阶段，蛋白质合成活跃，但是却没有mRNA的合成。20世纪50年代，在辽宁省新金县出土的莲子，已经在地下埋没了一千多年，播种后仍然能够发芽开花。动物中也有这样的情况。海胆卵内的mRNA在受精前失不翻译的，一旦受精，蛋白质的合成立即开始。用放线菌素D处理，蛋白质仍然能够翻译。放线菌素D可以抑制mRNA的转录，这说明指导蛋白质合成的mRNA是早已存在于卵细胞内的，而不是当时转录的。当海胆受精卵发育一段时间，再用放线菌素D处理，蛋白质的合成就会停止。（五）翻译后调控从mRNA翻译呈成蛋白质，并不意味着基因表达的调控就结束了。直接来自核糖体的现状多肽链是没有功能的，必须经过加工才具有活性。在蛋白质翻译后的加工过程中，还有一系列的调控机制。1．蛋白质折叠线性多肽链必须折叠成一定的空间结构(图danbaizhigaijijigou)，才具有生物学功能。在细胞中，蛋白质的折叠必须有伴蛋白的作用下才能完成折叠。2．蛋白酶切割末端切割\n有些膜蛋白、分泌蛋白，在氨基端具有一段疏水性强的氨基酸序列，称为信号肽，用于前体蛋白质附着在细胞膜上。信号肽必须切除才具有功能。脊椎动物胰腺中形成的胰岛素，最初的长度是105个氨基酸，称为前胰岛素原，在加工中首先将氨基端的24个氨基酸残基切除，成为前体胰岛素，再将中间的一段切除，留下两端有活性的部分，即21个氨基酸残基的A链和30个残基的B链，这两条链再由两个二硫键连接成有生物功能的胰岛素。多聚蛋白质的切割有些新合成的多肽链含有几个蛋白质分子的序列，切割以后产生具有不同功能的蛋白质分子。如脑下丘腺产生的一种多肽链，包括4种不同的激素分子，经蛋白酶切割以后成型。在不同的细胞中切割的方式和位点不同，从而产生多种不同的激素，适应不同细胞生长发育的需要。3．蛋白质的化学修饰简单的化学修饰是将一些小的化学基团，如乙酰基、甲基、磷酸基加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧基端。这种修饰的方式是特异的，不同蛋白质可以有完全相同的修饰，相同的蛋白质可以有完全不同的修饰。有些蛋白质经磷酸化活化以后，在基因表达中具有重要的调控作用。复杂的修饰是蛋白质的糖基化（glycosylation），就是将一些分子量很大的碳水化合物加到多肽链上。4．蛋白质内含子有些mRNA翻译的最初产物同DNA转录的最初产物一样，具有内含子（intein）序列，位于多肽链序列的中间，经剪接后，蛋白质的外显子（extein）才能连接成为成熟的蛋白质。蛋白质内含子的切割位点十分保守。内含子前面的氨基酸通常是半胱氨酸，仅有少数是丝氨酸，而后面总是组氨酸－天门冬酰氨，紧接着内含子的外显子序列通常是半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸。内含子内的有些序列也是十分保守的。内含子的一个重要特点是具有自动切割加工的能力。例如，果蝇胚胎发育有一种蛋白质Hedgehog，其内含子就能将本身的前提蛋白切割成两个有功能的蛋白质分子。内含子的另一个特点是，有些切割下来的内含子具有核酸内切酶活性。这种酶可以识别DNA序列中与编码自身序列对应但没有自身编码序列的位置，并将其切开，使内含子的编码序列插入这个位置。如果一个细胞中与这个内含子有关的基因是杂合体，一个含有编码内含子的序列，另一个不含编码内含子的序列，加工切割下来的蛋白质内含子可以切开没有编码内含子序列的DNA，使其插入相应序列，使杂合体成为纯合体。（五）翻译后调控从mRNA翻译呈成蛋白质，并不意味着基因表达的调控就结束了。直接来自核糖体的现状多肽链是没有功能的，必须经过加工才具有活性。在蛋白质翻译后的加工过程中，还有一系列的调控机制。1．蛋白质折叠线性多肽链必须折叠成一定的空间结构(图danbaizhigaijijigou)，才具有生物学功能。在细胞中，蛋白质的折叠必须有伴蛋白的作用下才能完成折叠。2．蛋白酶切割末端切割有些膜蛋白、分泌蛋白，在氨基端具有一段疏水性强的氨基酸序列，称为信号肽，用于前体蛋白质附着在细胞膜上。信号肽必须切除才具有功能。脊椎动物胰腺中形成的胰岛素，最初的长度是105个氨基酸，称为前胰岛素原，在加工中首先将氨基端的24\n个氨基酸残基切除，成为前体胰岛素，再将中间的一段切除，留下两端有活性的部分，即21个氨基酸残基的A链和30个残基的B链，这两条链再由两个二硫键连接成有生物功能的胰岛素。多聚蛋白质的切割有些新合成的多肽链含有几个蛋白质分子的序列，切割以后产生具有不同功能的蛋白质分子。如脑下丘腺产生的一种多肽链，包括4种不同的激素分子，经蛋白酶切割以后成型。在不同的细胞中切割的方式和位点不同，从而产生多种不同的激素，适应不同细胞生长发育的需要。3．蛋白质的化学修饰简单的化学修饰是将一些小的化学基团，如乙酰基、甲基、磷酸基加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧基端。这种修饰的方式是特异的，不同蛋白质可以有完全相同的修饰，相同的蛋白质可以有完全不同的修饰。有些蛋白质经磷酸化活化以后，在基因表达中具有重要的调控作用。复杂的修饰是蛋白质的糖基化（glycosylation），就是将一些分子量很大的碳水化合物加到多肽链上。4．蛋白质内含子有些mRNA翻译的最初产物同DNA转录的最初产物一样，具有内含子（intein）序列，位于多肽链序列的中间，经剪接后，蛋白质的外显子（extein）才能连接成为成熟的蛋白质。蛋白质内含子的切割位点十分保守。内含子前面的氨基酸通常是半胱氨酸，仅有少数是丝氨酸，而后面总是组氨酸－天门冬酰氨，紧接着内含子的外显子序列通常是半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸。内含子内的有些序列也是十分保守的。内含子的一个重要特点是具有自动切割加工的能力。例如，果蝇胚胎发育有一种蛋白质Hedgehog，其内含子就能将本身的前提蛋白切割成两个有功能的蛋白质分子。内含子的另一个特点是，有些切割下来的内含子具有核酸内切酶活性。这种酶可以识别DNA序列中与编码自身序列对应但没有自身编码序列的位置，并将其切开，使内含子的编码序列插入这个位置。如果一个细胞中与这个内含子有关的基因是杂合体，一个含有编码内含子的序列，另一个不含编码内含子的序列，加工切割下来的蛋白质内含子可以切开没有编码内含子序列的DNA，使其插入相应序列，使杂合体成为纯合体。 copyright©2005-2006天津农学院农学系遗传教研室版权所有e农网站设计制作地址：天津农学院农学系email:zl1952@yahoo.com.cnTel:022-23789376第九章基因工程和基因组学第一节基因工程一基因工程概述    遗传工程一般有广义和狭义之分。广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本节只介绍基因工程。基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。1971年美国的Smith,H.O.等人利用从细菌中分离的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子,标志着基因工程或DNA重组时代的到来。接着,伯格(Berg,P.)等人于1972年用一种限制性酶分别酶切猿猴病毒DNA与λ噬菌体DNA,再将这两种DNA片段放在一起,用DNA链接酶链接起来,结果得到了一种新的DNA分子。1973年科恩(Cohen,S.)等人进一步将酶切后的外源DNA片段与质粒DNA链接起来,构成一个重组质粒(recombinantplasmid),并将这个重组质粒转入大肠杆菌细胞。这些开创性的工作为基因工程建立了一套完整的方法和体系,成为现代生物学发展史上的重要里程碑。\n    基因工程技术的建立,使所有实验生物学领域产生巨大变革。1982年经美国食品及药物管理局批准,采用基因工程方法在细菌中表达生产的人的胰岛素进入市场,成为基因工程产品直接造福人类的首例。1985年转基因植物获得成功。1996年克隆羊诞生。现在,人类已利用这一技术改造和创建新的生命形态,生产药品,鱼苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病。基因工程技术已成为人类日常生活的组成部分。    基因工程中的DNA重组主要是指创造自然界没有的DNA分子的新组合。这种重组不同于经典遗传学中经过遗传交换产生的重组。基因工程是采用分子生物学，核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的中和技术。这已技术主要包括以下内容:①从细胞和组织中分离DNA。②利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)酶切DNA分子,制备DNA片段。③将酶切的DNA片段与载体DNA链接,构建重组DNA分子。其载体能在宿主细胞内自我复制。④将载体与DNA片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞后,该重组DNA分子能在细胞内复制,产生多个完全相同的拷贝,即克隆(clone)。⑤重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞,使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝。⑥能从宿主细胞中回收,纯化和分析克隆的重组DNA分子。⑦克隆的DNA能转录成mRNA,翻译成蛋白质。能分离,鉴定基因产物。因此,基因工程又可称为DNA重组,分子克隆,基因操作等。二限制性内切核酸酶    限制性内切核酸酶或限制性酶(restrictionenzyme)是基因工程的基石。在细菌中这些酶的功能是讲解外来DNA分子,以限制(restriction)或阻止病毒侵染。这是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效的方式。这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列,在这一段序列中将双连DNA分子切断。    限制性内切核酸酶的命名是据其来自的生物命名,用英文字母核数字表示。如EcoRⅠ来自大肠杆菌Escherichiacoli,读作echo-r-one.HindⅢ来自Hemophilusinfluenzae,读作hidee-three。现以分离和鉴定出200多中不同的限制性内切核酸酶。     限制性酶据其作用特点,可分为两类。第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切断双连DNA分子,没有序列特异性。由于这类酶的酶切位点不定,所以很少在基因工程中应用。第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列,准确地酶切双链DNA的特异序列。因此基因工程中广泛应用的是这一类限制性酶。第Ⅱ类限制性酶识别的位点是对称的,即在一条链中从5'到3'方向的序列与其互补链从5'到3'方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读二序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)。EcoRⅠ识别的回纹对称序列及切割点如图9-1A所示。    EcoRⅠ以交错方式切割DNA双链,产生两个相同的单链黏性末端(stickyend)。如果来自不同生物的DNA具有相同的回纹对称序列,经EcoRⅠ酶切后的DNA片段就具有相同的单链黏性末端。若将这两种片段放在一起,在适宜的条件下,他们可以经碱基互补配对,使黏性末端的氢键形成双链DNA分子,再在DNA链接酶的作用下形成磷酸二脂键,链接成重组DNA分子(图9-1B)。     第Ⅱ类限制性酶中还有另一类酶,如SamⅠ,他们酶切DNA双链后,产生的DNA片段具有平齐末端(bluntend)(图9-2)。将两个具有平齐末端的片段放在一起,也可在DNA链接酶的作用下,组成重组DNA分子。表9-1中列出部分常用的限制性酶,其中有的酶酶切DNA后产生黏性末端,有的产生平齐末端。三载体    经限制性酶酶切的DNA片段或基因，不能直接进入宿主细胞进行克隆的。一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA链接构成重组DNA分子，才能进入宿主细胞(hostcell)，并在其中复制、扩增,克隆出多个拷贝。    可作为DNA载体的有质粒,噬菌体,病毒,细菌或酵母菌人工染色体BAC,HAC等。现在使用的各种载体都是用基因工程方法构建的。作为载体DNA分子,需要具备以下4个条件:①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制。②具有多个克隆位点(multiplecloningsite,MCS,或称polylinkerregion),即具有多种限制性酶的切点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状。③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这种基因,使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。④易从宿主细胞中吸收。㈠细菌质粒\n    质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的,能自我复制,易分离和导入的环状双链DNA分子。早期用于基因工程的载体是遗传改良的细菌质粒,他们仅能用于克隆分子量小于10Kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段。这些质粒的适应范围广,拷贝数多。尽管在转化时仅一个质粒进入宿主细胞,但复制之后每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。这一特点十分有利于大量扩增克隆的DNA的片段,作为克隆载体应用。现在广泛使用且商品化的质粒,很多都具有重组表型检测标记,在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。例如pUC18质粒(图9-3)就具有以下特点:①分子量小(2.69kb),也可以接受较大的外源片段。②拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达500个;③多克隆位点的酶切位点多,克隆方便;④具有α-互补显色表型,可作为检测重组质粒存在于否的选择标记。α-互补是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸残基(α-肽),在与α-肽缺失的酶混合后(体外或体内),能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象。pUC系列的载体就是利用这一特点而设计的。如图9-3所示,pUC18质粒带有细菌DNAlacZ基因启动子,操纵子,调节基因以及lacZ基因α-肽(N端的146个氨基酸),在lacZ基因内插入了一个多克隆位点,这段序列与lacZ在同一个阅读框架内。pUC18表达的α-肽具有多克隆位点的18个氨基酸残基,仍具有α-互补功能。因此,将pUC18质粒转入带有lacZ基因α-肽缺失的宿主细菌细胞内后,在含有5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chhloro-3-indoly-β-galactopyranoside,)及IPTG的培养基上,质粒产生N端的146个氨基酸,宿主菌产生C端的氨基酸,经α-互补可产生有功能的lacZ酶,水解X-gal产生一种兰色物质,附着于细菌细胞上使菌落呈兰色。当在多克隆位点插入一个外源DNA片段时,破坏了α-肽的阅读框架,或导入转录或翻译终止信号,使α-肽不能正确表达,仅宿主细菌产生的C端氨基酸没lacZ基因有lacZ酶活性,结果在上述同样培养条件下,形成的菌落呈白色。所以白色菌落即是带有外源DNA片段的阳性克隆。㈡λ噬菌体    λ噬菌体基因组全长49kb,其核酸序列及基因功能和表达调控已研究的十分清楚。λ噬菌体的DNA中间约2/3的序列位中间基因(centralgenecluster),位于两端的位DNA左臂和右臂。研究表明,λ基因组的中间基因序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。根据这一特点,在改造利用λ噬菌体做载体时,在两个臂于中间基因链接导入处导入限制性酶切点(如EcoRⅠ),酶切λDNA后分别得到两个臂(lambdaarms),再将经同一种酶酶切的外源DNA片段与两个臂链接构成重组DNA分子(图9-4)。形成的重组DNA分子用噬菌体蛋白包装提取物体外包装(invitropackaging)后,经转导感染具有适宜基因型的宿主细菌菌株,噬菌体再在细菌细胞内繁殖,扩增,在平板培养基上形成噬菌斑。然后据噬菌斑的形态或显色表型(α-互补,如M13系列载体),即可鉴定出阳性克隆。    λ噬菌体载体可接受15~30kb的外源DNA片段,他既可作为克隆载体,也可作为表达载体,用作cDNA(如λgt10,λZAPⅡ0或核DNA(如EMBL3,GEM12)克隆的载体。在基因库筛选中,λ噬菌体作载体与细菌质粒相比,具有易操作,阳性克隆数多等特点,现广泛用于各类基因库的构建。㈢柯斯质粒    柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图9-5)。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的,而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因。    尽管这种质粒的分子量较小,但他可接受长达50kb的外源DNA片段,这在克隆真核生物基因中十分有用,因为一个DNA片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其他调控序列。柯斯质粒不仅直接用于真核生物基因的分离与克隆(见下面YAC载体)系统结合,用于基因作图分析。㈣穿梭载体    穿梭载体(shuttlevector)是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。因此,这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析。    酵母菌的Yep系列载体(图9-6)以及Yip。Ycp和Yrp系列载体均是穿梭载体。Yep为酵母菌附加体质粒,他的ARS序列来自酵母菌内源附加体2μ,可使每个细胞的拷贝数保持在100个左右。Yep还具有2μ的两个顺式调空元件,质粒分配序列和2μ调空元件。这两个元件可使在细胞分裂中各细胞分配的质粒数相近,2μ序列不断扩增。Yep的Amp和四环素(Tc)抗性用于细菌中选择,而URA3(尿嘧啶)基因用于在酵母菌中选择。Yep24具有Amp及Tc两个抗生素抗性基因,可将外源DNA片段插在抗生素基因中,通过插入失活,选择阳性克隆。尿嘧啶营养缺陷型菌株URA3-不能合成尿嘧啶,在不含附加尿嘧啶的培养基中不能生长。将带有URA3基因的Yep转化为URA3-酵母菌菌株后,阳性克隆可在不含附加尿嘧啶的培养基上生长,而非阳性克隆则不能生长。很多酵母菌的穿梭载体,用于功能互补法分离和鉴定真核生物基因的研究。\n㈤细菌人工染色体    在进行真核生物基因组的分析及作图中,发现上述的集中载体都不能携带大于50kb以上.细菌人工染色体(BAC)载体就是为了克隆大的外源DNA片段而设计构建的。BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。如第6章所述,F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒,约100kb,同时能在细菌接合时专一1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体,可用于克隆100kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝,这一特点有利于保持DNA大分子,尤其是重复序列多的大分子,在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小,如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9-7),仅带有自我复制，控制拷贝数(repE)及质粒(parE,parA,parB)所必须的最少序列。这些基因均来自F因子。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因以及多克隆位点。在pBeloBAC11中,多克隆位点lacZ基因内,因此可采用选择pUC18阳性重组子的方法,即α-互补显色法选择阳性BAC重组子。此外,在多克隆位点两侧,还有T7及SP6启动子位点,用于制备RNA分子,进一步分析克隆的基因表达,作为染色体步行的探针,以及序列测定克隆的片段。㈥酵母人工染色体    酵母人工染色体(YAC)是与前述的穿梭载体不同的另一类酵母菌穿梭载体。他是人类在对酵母菌生物学,遗传学的基本特征深入研究的基础上,结合穿梭质粒Yep的一些特点构建而成。YAC也是为适应真核生物基因组分析而发展起来的。1996年酵母菌基因组全部序列已经测定,为分析YAC克隆提供了直接依据。将来自YAC克隆的序列与酵母菌基因组序列比较,即可以完全排除重组YAC载体来自酵母菌DNA的可能性。    同YAC载体一样，YAC也具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100~1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体（humanartificialchromosome，HAC）的研究。目前应用最多的YAC载体是PYAC4(图9·8)，这个载体具有以下主要结构:①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因);②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4);③一个自主复制序列(ARS1);④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL),以保持重组YAC为线状结构;⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便PYAC4在细菌细胞中稳定扩增;⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点;⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。Sup4基因编码赭色抑制tRNATYR，抑制赭色表型(成为白色)。如果用不含外源DNA片段的PYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的PYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆工作。在利用PYAC4载体克隆时，要将PYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。[七]Ti质粒及其衍生载体应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物系统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。    Ti质粒是一种细菌质粒(图9-9)，它自然存在于一种革兰氏阴菌——根瘤土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）细胞中。根瘤土壤杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤。植物产生的这种根瘤细胞与动物的癌细胞(tumor)相似，它们能独立地、不受控制地生长。根瘤细胞的形成是因为根瘤土壤杆菌中存在着一种诱导瘤细胞(tumor-inducing，Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA（transferDNA，T-DNA），DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine)，作为根瘤土壤杆菌的碳源和氮源。   1．Ti质粒的特点利用缺失、突变、转座及互补等方法对Ti质粒的研究，发现Ti质粒具有以下特点:(1)Ti质粒具有5个主要功能区域(图9-9)。它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmidtransfer)、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(oir)和毒性区域(vir)。(2)T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其他序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfectdirectrepeat)，右端的这段序列称为右界（rightborder，RB），左端的序列称为左界(leftborder，LB)。T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲（disam）后，将细菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。(3)vir的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。Ti质粒是约200~500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作。\n2.Ti质粒的衍生载体根据Ti质粒的特点，现已构建成以下两套质粒衍生的载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体。(1)双元载体（binaryvector）。这个系统具有两个质粒，一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒，可在大肠杆菌及根瘤土壤杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，也是一种穿梭质粒。在T-DNA序列外，还有细菌选择标记基因，在T-DNA的LB至RB内有一个多克隆位点及植物选择标记基因。如Pbin19载体，它具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphI)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因（nos-NptⅡ）作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及a-互补显色标记。双元载体的另一个质粒，如与Pbin19匹配使用的Pal404质粒是非致病Ti质粒，该质粒没有T-DNA序列，具有Ti质粒的毒性基因，毒性基因表达的产物以反式调控方式控制穿梭质粒上T-DNA的转移。将两个质粒分别导人根瘤土壤杆菌后，经根瘤土壤杆菌介导，克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。(2)共整合载体(integratedvector)。这个系统也包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的质粒(如Pmon200)，另一个带有毒性基因(如Ptib6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列，它们在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体，故称共整合载体。还有另一类用于植物基因工程的载体，不经根瘤土壤杆菌介导而是在其他物理及化学方法的作用下，将外源基因导入植物细胞，并整合到植物基因组中。这种载体与乃衍生质粒不同，与酵母菌穿梭质粒的结构特点类似。它们通常也具有氨卞青霉素抗性基因，用作细菌选择标记;具有潮霉素或除草剂抗性基因用作植物选择标记。这类载体如Pahc25主要用于将外源基因导入单子叶植物细胞。四、基因的分离与鉴定    一般而言，一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子。在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA曾是细胞中最难分析的大分子。但DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作和分析的大分子。利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因，分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达，又可为基因工程提供目的基因。(一)从基因库中分离基因    基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。1.构建基因库根据克隆的核酸序列、来源，基因库可分为核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。(1)核基因库。核基因库(GENOMIClibrary或genomicbank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体(如EMBL)连接构成重组DNA分子，根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组DNA分子转化感受态细胞，收集所有菌落即成为质粒基因库。如果载体是噬菌体，则将重组DNA分子体外包装成噬菌体后，感染细菌细胞，将所得到的所有重组噬菌体集中即是基因库。如果载体为BAC或YAC，将重组人工染色体导人相应的宿主细胞，收集筛选得到的所有细胞即成为基因库。理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目较小，就可以达到这个目的。因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体。    若构建的基因库是以分离结构基因为主要目的，通常选用λEMBL，λGEM或cosmid作载体。而那些将用于基因组作图和分析的基因库，则多选择BAC或YAC为载体。检测构建的核基因库是否包括一个完整的基因组序列，可用下面的公式计算:N=Ln（1-P）/Ln（1-a/t）式中的N为所需克隆总数，p代表一个特定基因序列出现的概率，a为插入载体的片段的平均长度，t为基因组全序列长度。例如人类基因组DNA分子量为3.0×106kb，以λEMBL作载体，插入片段的平均长度为17kb，P为0.99构建的基因库应有8.1×105个重组噬菌体。(2)染色体基因库。将基因组的一部分(如一根染色体)用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。例如果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带(polytene)，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。研究发现这一段染色体不仅包括白色(white)及缺刻(notch)等基因，还包括一个转座因子的原始位点。在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术(flow\ncytometry)将人类染色体分开后，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。这一技术是利用两种可分别与A=T以及G三C结合的荧光染料标记有丝分裂中期染色体，标记的染色体在流动经过激光束时发出荧光，再经光度计据其荧光强度及分布，鉴别分拣出不同染色体。这一技术已用于构建人类基因组所有单个染色体基因库。在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳(pulsedfieldelectrophoresis,PFGE)方法，将酵母菌的16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库，这在基因组分析中发挥了重要作用。(3)cDNA库。cDNA库是以mRNA为模板，经反转录酶(reversetranscriptase)合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)构建的基因库。绝大多数真核生物的mRNA的3'端具有一段多聚A(poly-A)尾端序列。利用一段多聚T(poly-T)为引物(primer)，与poly-A互补配对，在反转录酶作用下，用poly-T引物引导合成一条互补DNA，即第一条DNA链。结果形成RNA-DNA杂合双链(图9-10)。第一条互补DNA链形成时，通常在其3'末端回转形成发夹结构，作为引物引导合成第二链DNA，再用Sl核酸酶将发夹结构的单链部分降解，就得到了双链DNA。也可在形成RNA-DNA杂合链后，用RNAH酶(RnaseH)在mRNA链上产生一些缺刻(nick)，形成很多RNA分子小片段，在DNA聚合酶的作用下，以这些RNA小片段为引物引导合成第二条DNA链。而对那些没有poly-A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸(hexamer)为引物合成第一条链，再用上述方法得到双链DNA。    得到的双链DNA分子经两端补齐后，以带有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后与载体(通常是λ噬菌体)连接，再用类似核基因库中介绍的方法，制备cDNA库。cDNA库与核DNA库不同，cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的WA序列，所以它仅包括基因组的部分基因序列。在实际工作中，构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA库对于研究基因的表达模式和分离某一特定基因是十分有用的。如果要分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因，可用该细胞或组织的mRNA构建cDNA库，则很容易得到这个基因。例如，动物的红细胞中具有大量血红蛋白，用红细胞的mRNA构建cDNA库，从中选择球蛋白基因就十分方便。通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。2.筛选基因库从基因库中筛选、分离基因，根据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡聚核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。这里以筛选入噬菌体构建的入āλ噬菌体核基因库为例。筛选λ噬菌体构建的库常利用菌斑杂交法(plaquehhybridization)，将经重组噬菌体(来自构建的基因库)感染的宿主细菌细胞与少量上层培养基混合后，倒在具有底层培养基的培养皿中，培养过夜，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑(图9-11)。一个噬菌斑内的所有噬菌体都是一个噬菌体扩增的后代，所以一个噬菌斑就是一个克隆。再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维膜或尼龙膜上变性，噬菌体DNA(成为单链)，然后用标记的探针(也变性成单链)与膜上的噬菌体DNA杂交，将杂交膜用X光片放射自显影，检测杂交信号。凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆，在X光片上有杂交信号(黑点)。根据杂交信号在膜上的相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出并培养阳性噬菌斑，制备DNA，用作进一步分析。3.阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因。(1)限制性酶图谱。构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆(subcloning)或同已知的其他序列比较。图9-12表示一个15此DNA片段的限制性酶图谱构建方法。首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及其组合酶酶切DNA。在这里，将分别用NotⅠ、SalⅠ和NotⅠ与SalⅠ一起酶切DNA。酶切的产物用琼脂糖凝胶电泳，再经溴化乙锭染色，在紫外灯下就可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。从凝胶电泳结果可见，用Not1酶切产生一条12.2kb及一条2.8kb共两条带，证明原始DNA片段的长度为15kb，在该片段中仅有一个notI位点。用SalⅠ酶切也产生两条带，分别为10.2kb和4.8kb，说明这个片段也仅具有一个SalI酶切位点。根据这两种酶酶切的结果，这个DNA片段的限制性酶切图谱有两种可能的模式(图9-12)，很难确定两种酶的相对位置。当用两种酶同时酶切后，得到3条带，它们的长度分别为10.2kb、2.8kb和2.0kb。如按模式Ⅰ，则经两种酶消化后的3个片段长度分别是2.8kb、7.4kb和4.8kb，这与实际情况不符。而根据模式Ⅱ预计的3个片段长度与实验结果一致，因此模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。采用类似的方法，可将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)，来分析DNA水平的变异程度,以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。此外，上述经NotI或SalⅠ消化的片段，可以亚克隆到pUCI8等质粒上，迸一步用于限制性图谱分析或序列测定。(2)核酸分子杂交。Southern杂交分析(Southernblotting)是基因工程中常用的方法。这个由英国的Southern于1975年发明的方法，是一种将琼脂糖凝胶上的DNA条带转移到一种膜上\n(如尼龙膜)，用于分子杂交的方法，它是用发明者的姓氏命名的。这个方法首先是将DNA用限制性酶酶切，然后将酶切的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上的DNA转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用X光片放射自显影检测杂交信号(图9-13)。如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，放射自显影后就会检测到杂交带信号。在筛选基因库得到阳性克隆后，往往是将限制性酶酶切与Southern杂交结合起来，绘制限制性酶图谱。Southern杂交还具有其他多种用途。例如分析基因组DNA某一个基因的拷贝数，用于RFLP分析，鉴定不同物种或亚种中的相关序列，检测基因重排和重复与疾病或癌症的关系等。    另一种与Southern杂交方法相似并广泛应用的方法杂交(blotting)分析。这一方法采用与Southern杂交相同的原理及程序，不同的是用RNA进行琼脂糖凝胶电泳，故用与Southern对应的Northern命名。随后，人们又将用蛋白质电泳后转移到膜上进行分析的方法称为Western杂交(Westernblotting)分析。Northern杂交用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，即检测mRNA的存在。其基本程序是从待分析的细胞或组织中提取总RNA，经过琼脂糖凝胶电泳,然后转移并进行分子杂交。杂交的探针来自克隆的基因。如果膜上有与探针互补的RNA分子，则在X光片上可见到杂交信号带。Northern杂交广泛用于研究基因在不同细胞、组织或器官的表达模式，检测mRNA分子量大小以及mRNA加工过程中可能存在的不同方式，定量分析mRNA等。(3)核酸序列测定。只有将克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后，才能最后确定这个DNA片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用由如Sanger于1977年发明的双脱氧核苷酸链终止法(dideoxynucleotidechaintermination)。这一方法利用DNA聚合酶，在引物(同位素或荧光标记)的引导下，以一条DNA链为模板，从5，到3，延伸形成可供测定的序列。在延长反应中除脱氧核苷酸外，还掺入一定比例的双脱氧核苷酸。具体方法是，将序列反应分为A、C、G和T4管，每管中含有变性的DNA模板、DNA聚合酶、标记的引物、4种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比例的双脱氧核苷酸(如A管中，即是腺嘌呤A双脱氧核苷酸，依此类推)。在DNA合成过程中，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正在延长的DNA链中，在不同DNA链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在第三位没有游离的羟基(-0H)，无法再连接另一个核苷酸，导致DNA链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成一系列不同大小的DNA分子。将4个反应产物并排点在聚丙烯酰胺凝胶上的4个孔中，电泳后每个孔中形成一条梯状DNA带，从底部往上阅读，即是5'到3'端的序列(图9-14)。(4)核酸序列分析。测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验迸一步分析，才能最后得出结论。同源性比较是常用的方法之一。同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。首先可将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，或将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较，很快就可知道测得的序列与所有的已知序列之间的同源程度。另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。一个ORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻译起始信号以及一种终止信号(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。如果筛选分离的核酸来自cDNA库，则可直接进行0RF分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。但对于来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子，还需要与其他同源序列比较外显子-内含子交界序列(exon-intronboundary)或结合相应的cDNA克隆序列一起分析，才能确定核酸序列的身份。对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。例如，将分离的核酸序列与载体构建成重组DNA分子，利用同源重组导致基因失活或过量表达，再据生物的表现型推测基因的作用。也可利用噬菌体显现(phagedisplay)技术或酵母菌双杂交系统(twohybridsystem)，分析蛋白质之间的互作及其功能。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因聚合酶链式反应(poly-merasechainreaction,PCR)是体外快速扩增DNA的方法。这个由美国的Mullis于1986年发明的方法，可在数h内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝，它可取代一些经载体克隆DNA的方法。这一方法不仅广泛用于分子生物学研究，还用于遗传、发育、进化、疾病,诊断、法医学等领域中。可以说，PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑。PCR扩增基因的方法是，首先根据待扩增基因序列合成两个引物(图9-15)，它们分别与待扩增基因二条链的两端互补，从5'到3'的方向向待扩增基因的中间延伸。在DNA模板变性成单链后，两个引物分别与单链DNA复性，在耐热DNA聚合酶(Tappolymerse)及4种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成DNA新链。PCR反应包括下述3个步骤。1.变性在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。2.复性两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度为50-70℃。3.延伸在引物的引导及T叫酶的作用下，于72℃记下合成模板DNA的互补链。\n这3个步骤称为一个循环，PCR反应常有25~35个循环。一个循环完成后，待扩增的基因扩增了一倍，新增加的基因又可作为模板用于下一步的扩增，所以，PCR反应中扩增的基因是成指数级增长的。因此仅用少量的模板DNA分子，经PCR后可以得到大量扩增基因产物。PCR方法通常可以扩增5kb左右的DNA片段，利用一些改良的方法，可以扩增长达40kb的DNA片段。PCR扩增的基因经过核酸序列测定分析后，可作为基因工程的目的基因。根据PCR方法及原理，现己发展衍生出很多新方法，如RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)，AFLP(amplifieldfragmentlengthpolymorphism)等，广泛用于基因分子标记等研究中。(三)人工合成基因根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。    例如，首先化学合成多个含有8~100个核苷酸的寡聚核苷酸，每个寡聚核苷酸之间具有19~24个核苷酸的重叠序列(图9-16)。再将各个寡聚核苷酸等量(摩尔浓度)混合，在DNA聚合酶(或Tap酶)作用下，各寡聚核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链。再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)扩增出完整的基因片段，或直接测序，或克隆到质粒上再测序后加以利用。五、基因工程的应用    在过去20多年时间里，基因工程研究发展极为迅速，现已取得一系列重大突破，基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。下面举几个例子。(一)基因工程工业最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(insulin)。这个基因工程产品在1982年就获得临床应用专利。胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。在动物体内胰岛素是胰腺细胞先形成一种前体胰岛素(见"翻译后修饰"部分)，再加工成两条不同的成熟胰岛素原分子，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，经两对二硫键连接形成成熟的胰岛素。基因工程生产人的胰岛素的方法如图9-17所示。将成熟胰岛素原的人链和B链核苷酸(A链63bp，B链90bp)人工合成后，分别与载体中的β-半乳糖苷酶序列连接，构成β-半乳糖苷酶，胰岛素原融合蛋白，受β-半乳糖苷酶启动子控制，并在两条链的起始端分别导大一个甲硫氨酸起始密码子(ATG)，以便表达产物的后加工。将构建的重组质粒转化大肠杆菌细胞，分别表达β-半乳糖苷酶与A链或B链的融合蛋白。从细菌中纯化的融合蛋白用溴化氰处理裂解，将β-半乳糖苷酶与A链或B链分开，得到纯胰岛素原蛋白。再将纯化的A链和B链混合后，经二硫键连接成为完整的胰岛素。这种利用甲硫氨酸作为融合蛋白连接点，只能用于不含甲硫氨酸或色氨酸的目的基因。对于含有这两种氨基酸的目的基因，也可在融合蛋白连接处导入其他氨基酸，用其他蛋白酶处理，获得纯化的目的蛋白。利用类似的方法，已在细菌中生产10多种医药产品，如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。有些真核细胞的蛋白质需要糖基化等修饰加工以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统。因此真核细胞更适合于表达真核生物蛋白质。目前酵母菌、植物悬浮细胞、植株、动物细胞均已成功地用于表达外源蛋白质。(二)植物基因工程基因工程生物中的成功，大大促进了植物基因工程的发展。许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术，尤其是根瘤土壤杆菌转化技术不断完善。目前，利用基因工程技术已培育出许多抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优良品系或品种，很多已经大面积种植推广。植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内，并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。现已发展成为多种将外源基因导人植物细胞的方法，其中应用最多的是根瘤土壤杆菌转化技术和基因枪转化技术。1，根瘤土馕杆茼转化技术根瘤土壤杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。这种方法早期主要用于双子叶植物转化，后来逐步成功地用于多种单子叶植物的转化。    这种转化方法是将目的基因与花椰菜病毒35S启动子及终止B质粒分别带有子组成嵌合DNA分子，插入到Ti衍生质粒的RB与LB内构成重组质粒，再转化到根瘤土壤杆菌细胞，将得到的重组根瘤土壤杆菌去感染植物细胞，从而使质粒的部分DNA与目的基因一起整合到植物染色体上，实现遗传转化。例如，植物抗除草剂基因工程就是利用这种途径完成的。田间杂草给农业生产带来的损失占作物产量的10%，生产上应用的除草剂有100多种。培养抗除草剂转基因植物，可在使用除草剂后不被损害，达到仅杀死杂草而无害于作物的目的，从而提高作物产量，增加农业生产效益和环保效益。有一类除草剂草甘膦,是通过抑制叶绿体中的EPSP合成酶而杀死杂草的。EPSP合成酶在植物及细菌中催化芳香族氨基酸生物合成的一个反应。如果EPSP合成酶遭到的破坏，会使一些关键氨基酸的合成受阻，导致植物枯萎、死亡。    利用从抗glyphosate的大肠杆菌中分离、克隆的EPSP合成酶基因，己培育出高抗除草剂glyphosate的转基因植物。其方法是将细菌的EPSP基因按上述方法构建成重组DNA分子，插入到质粒中，当带有重组质粒的根瘤土壤杆菌感染植物细胞时，将部分载体序列及肝SP基因整合到植物染色体上(图9-18)。具有EPSP基因的植物愈伤组织大量表达这个基因，因而能在含有除草剂glyphosate的培养基上生长，经再生、分化，培养出抗除草剂植株。2．基因枪转化技术\n根瘤土壤杆菌主要感染双子叶植物，早期利用根瘤土壤杆菌转化单子叶植物未能成功。为了克服这些困难，美国的Sanford等人于1987年发明了基因枪转化技术，用于单子叶植物转化。基因枪介导的植物转化是通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导人受体细胞，并整合到染色体上的方法。这种转化方法简单，但需要基因枪、金属颗粒等设备条件。目前这一技术己广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。基因枪技术还可用于转化微生物、动物细胞、动植物器官、细胞器和正在生长的植物。另外，基因枪在多基因共转化中更表现出极大的优越性。    基因枪转化的载体多数是以pUC系列质粒为基础构建的。它们通常具有细菌复制原点及抗性选择标记，具有可在植物中表达的启动子、终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记(如除草剂、新潮霉素等)。CaMV35S启动子及终止子也用于这类质粒(如PDB)。有些质粒利用玉米ubi(ubiquitin,遍在蛋白质)启动子及其内含子来调控目的基因表达(如Pahc25)。将目的基因插入到载体后，在细菌中克隆复制重组DNA，将重组DNA与金属颗粒(钨粉或金粉)在一定条件下结合，直接用于转化。    目前使用的基因枪有几种类型，其共同特点是用一种动力系统将金属颗粒及其包被的DNA导人受体细胞或组织进行转化。最早商品化以氦气作动力的基因枪PDS-1000，其转化过程如图9-19所示。转化前，将重组DNA及样品置于微载体上，再将微载体附于大载体上，爆破片位于高压气体加速管下部，作为受体细胞的样品位于下面。利用氦气作动力转化，气体加速后冲破爆破片，便包裹有DNA的金属颗粒穿过阻挡板(挡住了碎片)，进入受体细胞内，整合到染色体上。将转化后的材料经培养、选择、再生、培养成完整的植株。(三)转基因动物与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢一些。这主要涉及到一些技术难题，以及伦理学、宗教等问题。但自从1996年Dolly克隆羊的降生，许多动物已经被成功克隆，包括最难克隆的动物之一猪、濒危动物、野牛等。转基因动物通常是将目的基因与载体构建成重组DNA后，用微量注射法将重组DNA导人受体合子细胞核中，实现遗传转化。     例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。人类抗胰蛋白酶基因缺失导致的肺气肿，属于一种先天性遗传疾病。将人的抗胰蛋白酶o@1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶(35g/l),这一结果说明可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白。(四)过传疾病诊断利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平，而不是据基因产物进行诊断，因而准确度高，速度快。(1)RFLP法    RFLP方法的原理。限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。如果某一位点的核苷酸序列发生突变，有可能导致缺失或产生新的限制性酶切位点。若这种突变只发生在同源染色体中的一条上，另一条染色体正常，用限制性酶酶切后，据DNA片段的带型，就可以鉴别出一对同源染色体的差异。如图9-20所示，A染色体具有3个位点，而B染色体只有两个BamHI位点。经BamHI酶切,A染色体产生两条分别为8kb和3kb的DNA片段，B染色体只产生一条11kb的DNA片段。用来自这个染色体区段的DNA作杂交探针，进行Sonthern杂交分析，可以鉴别出不同的DNA片段。这种经限制性酶酶切产生的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多型性。RFLP变异表现为共显性。研究表明，RFLP是一种普遍现象，人类基因组中已鉴定了几千个RFLP位点，作为基因组图谱分析的分子标记，用于诊断遗传疾病。     (2)镰刀性贫血病的诊断。如前面所述，β球蛋白基因一个核苷酸突变可引起镰刀形细胞贫血病(sick-cellanemia)。有一种基因突变导致的镰刀形细胞贫血病，这个核苷酸改变(由GAG变成GTG)也正好导致一个限制性酶切位点改变。使原来能被MstⅡ或AryI酶识别的位点(CC/TNAGG)变成不能被这类酶酶切，结果突变使Southern杂交带型发生变化，根据这种RFLP带型即可诊断镰刀形细胞贫血病患者及其家系中各成员的遗传组成。妊娠期胎儿镰刀形细胞贫血病的诊断方法是，用CVS法获取细胞后，提取DNA用MstⅡ酶切，Southern转移。正常的β-球蛋白基因有3个MstⅡ切点(图9-21)，酶切后得到两个小片段，在GAG变成GTG突变后，第二个MstⅡ位点不存在了，酶切只产生一个片段。将酶切的DNA转移到膜上后，用一段β－球蛋白基因片段为探针进行Southern杂交分析，根据有杂交信号的带型可以判断出基因型。如图9一21所示。如果双亲均是βS球蛋白基因突变携带者(βAβS)，Southern分析中有3条带。在这个家系中，第一个小孩(女)仅两条小带，基因型正常纯合，表型正常;第二个小孩(男)仅一条大带，为纯合突屺变型，表现型为镰刀形细胞贫血病;第三个胎儿有一条大带及两条小带，其基因型为βAβS,表型正常，但仍是镰刀形细胞贫血病携带者。RFLP法也用于诊断基因缺失突变。已知有5-10的基因突变可用这种方法诊断。2·等位基因特异寡聚核苷酸法\n当已知突变基因的核苷酸序列时，就可以用人工合成的寡聚核苷酸进行PCR反应，将PCR产物用作点杂交分析，鉴定基因型。这种可用于检测单个核苷酸变异的方法，称为等位基因特异寡聚核苷酸法。这里仍以镰刀形细胞贫血病为例，说明这一方法的应用特点。从白细胞中提取DNA后，用特异引物进行PCR，再将PCR产物点到膜上，用β-球蛋白基因作探针杂交，据杂交信号强度直接判断基因型(图9-22)。当用正常寡聚核苷酸进行忧R分析时，根据杂交信号推知:纯合(βAβA)基因型产生强信号(深色)，杂合(βAβS)基因型产生较弱信号(较浅),而突变的隐性纯合(βSβS)基因的序列不能与AS0结合，没有PCR产物，故没有信号(最浅，仅背景信号)。但如果用βS突变的ASO进行PCR，杂交信号的强度正好与上述相反，即突变纯合的βSβS的信号最强，正常纯合(βAβA)的没有信号。类似的方法还用于许多其它疾病的诊断。可以预见的是，随着人类基因组计划的完成，对正常及突变基因序列全部测定后，人类就可以直接从基因水平准确诊断遗传疾病。[五]基因治疔利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(genetherapye)。从理论上讲，只要具有适合的载体及基因导入方法，将正常的等位基因及调控元件导入有缺陷的体细胞中，是有可能从根本上治疔由于遗传物质缺陷导致的疾病的。目前己有几种基因治疔方法。其中最常用的基因转移方法是利用减毒的病毒DNA(retrovirusDNA)作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组减毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。   例如，用莫洛尼氏鼠白血病病毒(m卜n吖e血a讨m，mloMyMW)改造而成的retrovirus载体，己用于治疗严重综合免疫缺陷(wmd胡c;en吖，虬m)。SCID是由于腺苷脱氨酶(扔en面ned,ADA)基因突变引起的，患者无任何免疫功能，只能在严格控制的无菌条件下才能生存。将人类正常的ADA基因插入到mloneyMLVretrovirus载体上，取代该病毒中的3个结构基因(鹤、pl和env)，保留病毒的ψ序列(编码包装所必须的蛋白质)及两端的长末端序列LTR序列参与控制转录及整合到染色体上(图9-23)。将构建的重组病毒DNA分子包装后，从患者体内抽取白细胞(T细胞)，用包装的病毒感染T细胞，将正常的ADA基因整合到T细胞染色体上，再将培养的T细胞返回到患者体内。利用这种方法治疗后，有的患者的正常T细胞可达到50%，但有的仅0.1%。2000年法国的费雪尔(Fischer)等人利用类似方法，成功地治疗两个患有SCID的幼儿(8个月和11个月)，他们将患者的骨髓干细胞抽取后，在人工培养条件下，用带有正常基因的重组减毒病毒反复愍染3次，再将干细胞返回到患者。两周之内，就可以从患者体内检测到新细胞及正常基因，完全恢复了患者的正常免疫系统和功能。这两个小孩己能同其他同龄人一样，在正常环境下生活。这一工作被认为是20世纪人类基因治疔上的重大突破。     在未来的基因治疔中，寻找新的克隆载体将是研究的热点之一。减毒病毒载体接受外源DNA的片段较小，载体只能在宿主细胞DNA复制时才能整合到染色体中，有些病毒载体诱导宿主细胞的免疫反应，或插入到染色体后引起插入位点基因失活。另外，减毒病毒载体也可能同己存在于细胞内的野生型病毒发生重组，形成新的病毒分子。目前已发展的载体还有腺病毒(adenovirus)及与腺病毒有关的病毒载体等。毫无疑问，随着人类基因组草图的绘制成功，以及后基因组学的兴起，基因治疔必将得到更快的发展与广泛应用，使许多现在束手无策的疾病能有治疔的良方。(六)DNA芯片DNA芯片(DNAchip)是将核酸分子杂交的原理和方法，与半导体技术结合而发展形成的一门新技术。这一技术可便许多分子杂交反应同时进行。DNA芯片技术是在面积不大(如2cm2)的基片表面分成不同小格，有序地点阵排列一系列固定于一定位置的、可寻址的核苷酸分子，再将待分析的核苷酸分子标记(如用荧光)，变性成单链后与芯片进行分子杂交，与芯片上序列相同的核苷酸将与其杂交，与芯片上序列不同的序列就会被洗掉，然后用高精度的激光扫描仪记录分子杂交的荧光信号，通过计算机软件分析、综合成可读的信息(图9-24)。因此，DNA芯片分析同核酸分子杂交一样，得到的信息是核苷酸水平的遗传变异资料。DNA芯片的基片有用玻璃、硅片或尼龙制备的。早期推出的DNA芯片，每块芯片含有几千个微点。现已发展出每片1的万点阵的芯片。这一技术已用于单核苷酸多型性(s吨卜mclmMe刨p圯pMm，S押)遗传筛选、不同细胞和组织的RNA群体的比较。在医学中可利用DNA芯片技术检泌遗传疾病，如扫描P53基因突变;因为60%的癌细胞具有P53基因突变。随着基因芯片制作工艺和检测手段以及基因组研究的飞跃发展，基因芯片技术必将得到更加广泛的应用。第二节基因组学    基因组学（genomics）是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，只要研究生物体全基因组（genome）的分子特征。一个物种的单倍体的染色体数目称为该物种的基因组或染色体组，它包含了该物种自身的所有基因。不同物种的基因组大小差异极大，表9-2列举了几种生物的基因组大小。基因组学强调的是以基因组为单位，而不是以单个基因为单位作为研究对象，因此，基因组学的研究目标是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的遗传物质的全部信息及相互关系，为最终充分合理地利用各种有效资源，为预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。\n基因组学的重要组成部分是基因组计划（genomeproject），大体上可以分为：①构建基因组的遗传图谱（geneticmap）；②构建基因组的物理图谱（physicalmap）；③测定基因组DNA的全部序列；④构建基因组的转录本图谱；⑤分析基因组的功能。基因组计划研究开始于1990年，美国国立卫生研究院（NationalInstitutesofHealth,NIH）和能源部(DepartmentofEnergy,DOE)联合启动了被誉为“人体阿波罗计划”的“人类基因组计划”（humangenomeproject,HGP），预计投资30亿美元，历时15年，将测定构成人类基因组的30亿个核苷酸对的排列次序，构建高分辨率的人类基因组遗传图谱、人类基因组物理图谱，发展新实验技术、研究系统和仪器设备，发展生物信息学。1996年，构建了每个标记的密度为0.6Mb(1Mb=1×106bp)的人类基因组遗传图谱，0.1Mb的物理图谱。2000年完成了人类基因组草图的构建，并已测定基因组的大量核苷酸序列，这些研究成果使人们深信，人类将在不远的将来会彻底揭示人类自身的全部遗传信息。在美国提出人类基因组计划后，英、法、日、俄罗斯和一些发展中国家不甘落后，也相继启动了类似的研究项目。如日本于1991年4月提出了与HGP同等重要的“水稻基因组计划”（ricegenomeproject,RGP），1991年10月正式实施。通过该计划，将绘制出水稻所有12条染色体的遗传图谱，并对全部cDNA进行序列分析、组织特异性表达和基因功能研究。该计划正开展着广泛的国内国际合作研究，已构建成较为饱和的遗传图谱，构建了YAC和cosmid克隆的染色体物理图谱，完成了数组不同组织器官的cDNA文库。又如1992年8月，中国根据国情正式宣布实施自己的“水稻基因组研究计划”，并于2001年完成了水稻基因组物理图谱的构建。由于以人类为对象的研究实际上受到诸多限制，也受伦理学的约束，所以人类基因组计划还将对有关的模式生物如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥等进行相应的研究，为研究人类基因组的战略提供了重要的依据。目前已有多种模式生物的基因组序列已全部测定。在真核生物中，有酵母、线虫、果蝇、拟南芥。还有水稻基因组全序列已接近完成。在原核生物中，有大肠杆菌等10多种生物的基因组序列也已经测定。人们预计，随着新技术和系统的不断发展，人类将测定更多基因组的全部序列。一、基因组图谱的构建人类基因组计划中，最终要测定人的基因组中核苷酸的全部排列顺序。而利用现有的DNA测序方法，每个测序反应通常只能得到800个核苷酸的序列，这就意味着要用很多DNA小片段的序列，才能装配、连接构成完整的连续DNA分子。鸟枪射击法（shotgun）是许多小基因组序列测定中通常采用的途径（图9-25），利用构建的基因库直接测序，根据片段之间的重复序列，就可以连接成完整的基因组DNA。但是随着DNA片段数的增加，最后对各片段序列的分析连接会变得越来越复杂。例如当DNA片段数为n时，各片段之间可能的重复数将达到2n2-2n。。另外，若基因组中含有相同或相似的重复序列，在构建、装配连续DNA分子时就容易出现错误，会将来源不同区段的DNA片段连接在一起。因此，仅用鸟枪射击法不适用于大基因组序列测定。在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定但是基因组全部核苷酸序列的重要一环。基因组图谱可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便先重后轻地分析基因，锚定测知的核酸序列在染色体上的位置。因此，在人类基因组计划实施过程中，首先用了6年时间构建高密度的基因组图谱，然后才进入测序工作。有了基因组图谱之后，基因组序列测定可用下列两种方法结合进行：A:克隆连续序列法（clonecontig）：将基因组DNA切割长度为0.1Mb~1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上，分别测定单个克隆的序列，再装配、连接成连续的DNA分子。B:定向鸟枪射击法（directedshotgun）:以基因组图谱中的标记为依据，测序、装配和构建不同DNA片段的序列。根据基因组图谱构建的途径，可分为基因组遗传图谱构建和物理图谱构建两种。遗传图谱的构建是根据任一遗传性状（如已知的多型性基因位点、功能未知的DNA标记、可鉴别的表现性状）的分离比例，将其定位在基因组中。因此，遗传图谱是据等位基因在减数分裂中的重组频率，来确定其在基因组中的顺序和相对距离的。物理图谱的构建不需要检测等位基因的差异，它既可以利用具有多型性的标记，也可利用没有多型性的标记进行图谱构建，它将标记直接定位在基因组中某一位点。实际上这两种途径都需要利用分子遗传学的技术和方法。尽管两种图谱是分别构建的，但它们可以相互借鉴，互为补充，作为基因组图谱利用。（一）图谱的构建1.图谱标记图谱构建中需要可以鉴别的标记（marker），在构建遗传图谱中，可用基因和DNA作为标记。（1）基因标记。基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记，这与前述的连锁交换中介绍的方法一样。遗传学中最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的一些基因作为标记，分析各基因间的连锁关系及遗传距离，绘制出连锁遗传图谱。这些基本原理和方法，仍在现在的基因组遗传图谱构建中广泛应用。\n（2）DNA标记。基因是非常有用的标记，但并不十分理想。在高等真核生物中，根据基因绘制的遗传图谱都不太详细，每个标记之间相距很远。例如，经过半个多世纪的研究，到1985年，水稻基因组的遗传图谱也仅具有119个基因。另外对于一些复等位基因位点，也很难全部鉴定标记出来。因此遗传图谱构建中还需要其他标记。DNA可作为构建遗传图谱的标记，可有以下3种类型。①限制性内切酶多型性：若在“基因工程”一节所述，限制性内切酶能识别饿切割特异核苷酸序列，DNA序列能或不能被某一酶酶切，实际上相当于一对等位基因的差异。如有两个DNA分子，一个具有某一酶的酶切位点，而一个没有这个位点，酶切后形成的DNA片段长度就有差异，即多型性（RFLP）(图9-20)。根据这一等位基因的遗传，可将RFLP作为标记，定位在基因组中某一位置上。这同用基因标记的方法一样。据分析，人类基因组中有105RFLP位点，每一位点只有两个等位基因。但是，用限制性酶酶切基因组DNA后，会产生很多DNA片段。例如，用识别6个核苷酸的EcoRI（表9-1）酶切的DNA，理论上它可以在每隔4096bp(46)切割DNA分子，这样，人类基因组就会有75万个DNA片段，所以内切酶酶切要结合Southern杂交分析，用特异的杂交探针来检测差异，或用PCR方法，扩增包括RFLP的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳中检测等位基因的差异。②简单序列长度多型性：简单序列长度多型性（simplesequencelengthpolymorphism,SSLP）是一些长度不等的重复序列。与RFLP不同的是，SSLP可有多个等位基因位点，SSLP又可分为两种(a)多次重复序列(variablenumberoftandemrepeat,VNTP),也称为微随体（minisatellite）。这种重复序列长度为几十个核苷酸。(b)简单重复序列（simpletandemrepeat,STP）又称为小随体（microsatellite）。这种重复序列短，常只有2个、3个或4个核苷酸重复单位（如一个基因具有TCTGAGAGACGC,另一个等位基因具有TCTGAGAGAGAGACGC）。利用STR作为标记比用VNTR的更多，这是因为VNTR主要集中在染色体末端，而STR分布在整个基因组中。利用PCR检测小于300bp的DNA片段的速度快，准确度也高。VNTR的长度通常灾00bp以上。将PCR产物电泳，可直接观察等位基因之间的差异。③单核苷酸多型性：单核苷酸多型性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）是基因中的点突变，存在的数量多，其中有些可产生RFLP，但多数突变不是发生在酶切位点。据估计，人类基因组的编码基因只能感有20万个SNPs，在非编码区的数目可能还要多10倍以上。这种标记也只有两种等位基因。由于SNPs数目大，可用寡聚核苷酸分子杂交法直接检测，例如，利用DNA芯片技术将不同寡聚核苷酸固定在芯片上，标记待测DNA，一次就可测得很多SNPs标记。也可用特异等位基因动力学杂交方法（dynamicallele-specifichybridization,DASH）检测。这种方法是利用液体杂交法检测，即在酶标偶联反应（ELISA）板的96个孔中进行杂交，再用一种只与双链DNA结合的荧光染料检测。只有当两条DNA分子完全互补配对，形成双链DNA时才有信号。这种方法还可通过控制不同复性温度，来鉴别不同等位基因。2．遗传图谱的构建（1）人类基因组遗传图谱的构建。人类的遗传图谱是利用家系分析法，在对8个家系的134个成员的分析中（186个减数分裂），主要根据5264个STR标记绘制而成的。因为STR在每一百万个碱基中总有几个位点，而且每一个STR具有多个等位基因位点。利用这些家系的资料绘制第1至22号染色体与扑。对于X染色体图谱，还利用了来自另外12个家系，170个成员（105个减数分裂）的资料绘制而成。最后，将5264个标记定位在2335个位点，因为其中有些标记相距很近而作为一个位点，所以位点数小于标记数目。据此构建的人类基因组遗传图谱的密度为每个标记599kb。这个图谱密度比预期的每个标记1000kb要好得多。（2）植物基因组遗传图谱的构建。在利用前述图谱标记的原理和方法构建植物遗传图谱时，根据植物材料及其遗传特点，在具体的实验中又结合了植物遗传分析和植物育种的一些方法和材料，所以植物遗传图谱的构建常可按以下步骤进行。①选择亲本：选择亲本理论上要求亲缘关系远，遗传差异性大的品种或材料做亲本，但又不能相差太大以致引起子代不育。利用形态、同工酶、DNA标记对备选材料进行多态性（差异性）检测，综合测定结果，选择出有一定量多态性的一对或几对材料作为构图亲本。②产生构图群体：用选好的亲本材料配制杂交组合，建立分离群体，如单交组合产生的F2代或由其衍生的F3、F4家系，或者由连续多代自交或姊妹交产生的重组近交系（recombinantinbredline,RIL）,也可以利用回交或三交（复交）产生的后代群体，如图9-26所示。③遗传标记的染色体定位：常用的染色体定位方法有单体分析、三体分析、代换系与附加系分析等方法，依据染色体剂量的差异，将遗传标记定位在特定的染色体上，即当供体材料总DNA等量时，DNA杂交带的信号强弱与该标记位于的染色体剂量成正比。如水稻的初级三体是2n=24+1,12个初级三体系分别代表着12条不同的染色体，当一个标记与DNA含量相等的12个三体系总DNA杂交时，其中有一个三体系的DNA杂交带强度高于其他三体系，因此，该标记就位于高强度杂交带三体系所代表的染色体上。④标记间的连锁分析：通过分析分离群里内双亲间有多态性的遗传标记间的连锁交换情况和趋于协同分离的程度，即可确定标记间的连锁关系和遗传距离。\n（二）物理图谱的构建1.物理图谱的构建原因前面介绍了遗传图谱的构建，为什么还要构建物理图谱呢？主要有以下两个原因。（1）遗传图谱的分辨率有限。对于低等生物来说，因可重复进行多次杂交、测交，在短期内可产生大量群体，可以得到大量重组交换的子代群体用于分析，因而可以构建高密度的遗传图谱，每个标记之间相距不远。例如，1990年在大肠杆菌基因组计划启动时，其基因图谱上已有1400个标记，每个标记平均只有3.3kb，所以可直接据遗传图谱开始测序工作，不必再进行物理图谱的构建。同样，酵母菌基因组计划也是在一个精细遗传图谱基础上开始的（1150个标记，每个标记10kb）。而对于像人类及其他高等真核生物来说，不可能得到大量子代群体，而只能分析一定数量的来自减数分裂的群体，使连锁分析受到限制。尽管人类基因组遗传图谱的密度达到每个标记599kb，但这离计划的每个标记100kb的目标仍有较大的差距，因此有必要采用非遗传学途径，绘制基因组图谱。（2）遗传图谱的精确性不高。现在已经知道，在减数分裂同源染色体之间发生的交换重组，并不是在真个染色体上随机发生的，在染色体上有一些重组热点（recombinanthotspot）,其发生重组的频率高于其他位点，从而影响到重组热点邻近区段遗传图谱的准确性。这在1992年酵母菌第Ⅲ染色体的核苷酸序列全部测序后，就得到了证实。比较酵母菌第Ⅲ染色体的遗传图谱和物理图谱，即可发现经遗传分析绘制的图谱，同染色体上实际DNA序列的位置有较大差异，有的甚至还有基因顺序的误差。在真核生物中，酵母菌和果蝇的基因组曾被广泛用于遗传图谱的构建，如果这种遗传图谱都具有准确性问题，而那些未经广泛分析验证的生物遗传图谱的准确性就可想而知了。2.物理图谱的构建途径基因组物理图谱的构建不需要经过减数分裂的世代群体，可以直接利用DNA分子分析，只要有以下3种不同途径。（1）限制性酶图谱。利用限制性内切酶绘制图谱对于DNA分子长度在50kb以下的片段，一般没有什么困难。而对于大于50kb的DNA分子，可选用稀有切点的内切酶酶切DNA。①用识别较多核苷酸的内切酶，如NotⅠ。理论上，8个核苷酸的酶切位点出现的频率是48=65536bp，大大低于6个核苷酸的酶切位点（46=4094）出现的频率。②选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶。如在人类基因组中，有一种5'-CG-3'的序列，其出现的频率极低，因为人类基因组中的甲基化酶常使胞嘧啶甲基化，形成的C5'-甲基化不稳定，很容易脱氨而变成胸腺嘧啶，结果在人类进化中，5'-CG-3'转变成5'-TG-3'，使人类基因组中很少出现5'-CG-3'序列。如果用SmaⅠ(5'-CCCGGG-3')酶切DNA，每78kb才有一个切点；如果用BssHⅡ(5'-GCGCGC-3')酶切，每390kb有一个切点；用NotⅠ(5'-GCGCGCGC-3')时，每10Mb有一个切点。利用这类酶切的特点，可以提高限制性酶的应用范围。（2）荧光原位杂交。荧光原位杂交技术（fluorescentinsituhybridization,FISH）是另一种物理图谱构建方法。它通过荧光标记探针与DNA分子杂交，使染色体上的杂交信号在显微镜下可直接观察。原位杂交中的探针可用荧光或同位素标记。染色体上出现杂交信号的位置，就是探针DNA在染色体上图谱位点。方法是取处于有丝分裂中期的细胞制片，将染色体变性成单链，再将标记的DNA探针变性后加到染色体上，保温及处理后记录结果。在FISH中，一个克隆的DNA片段就可作为杂交的探针。（3）序列标签位点。利用某一已知序列为标签的位点(sequencetaggedsite,STS)作探针，与基因组DNA杂交，绘制物理图谱。作为STS，需要具备两个条件，一是其序列是已知的，以便用PCR检测；二是在基因组中仅一个位点，没有重复。目前广泛使用的STS有以下两大类型，每一类型中又有几种。①特异DNA序列;A.表达的序列标签(expressedsequencetag,EST),表达的序列来自cDNA,一些cDNA的短片段测序后可作为EST。B.SSLP也可用于物理图谱的构建。可据遗传图谱中的SSLP标记，再用于物理图谱构建，进而比较和相互验证。C.DNA随机片段，可随机选择DNA片段，测序后经分析比较，如果不是重复序列，也可作为STS。②DNA片段：利用DNA片段作为图谱标记的又可分为两种不同类型；辐射杂交系及克隆连续序列。A.辐射杂交系：辐射杂交系（radiationhybrid）是指啮齿动物细胞含有另一个生物的染色体片段的细胞株，这类似植物中的异附加系。细胞遗传学研究表明，用3000~8000rdX射线处理后，人类染色体会出现随机断裂，再将处理的细胞与正常的仓鼠或其他啮齿动物细胞相融合，断裂的人工染色体可与仓鼠染色体融合，并随其复制。有一种仓鼠缺失突变细胞，不能合成胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（thymidinekinase,TK）或次黄嘌呤转磷酸核糖激酶（hypoxanthinephosphoribosyl\ntransferase,HPRT）,这两种酶缺失的细胞株不能在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine,T）（三者通称为HAT）的培养基上生长。将融合后的仓鼠细胞在HAT培养基上选择，能生长的就是含有外源人类染色体片段的细胞。利用这种方式，产生了一系列带有不同人类染色体的辐射杂交系。这种杂交系可携带人类染色体片段，长度在5~10Mb，以这种方式构成的一套杂交系称为辐射杂交系库（radiationhybridpanel）。利用100个人类基因组辐射后与仓鼠细胞融合形成的辐射杂交系，就可进行人类基因组物理图谱的构建。现在已有标准化的人类基因组辐射杂交系，供世界各国科学家使用，从而不同实验室的图谱结果，可以直接比较，这种辐射杂交系也用在其他动物（如鸡）的物理图谱构建中。B.克隆的DNA片段序列：利用YAC或BAC克隆的DNA，测序后也可作为分子标记。不同克隆的序列测定后，可分析他们之间的重叠序列，使各克隆的序列连接起来，这样装配起来的序列作为STS标记应用，直接定位在染色体上。其中也可能包括SSLP标记。3.人类基因组物理图谱在人类基因组计划开始序列测定时，已有45万个EST，其中一些重复序列，经计算机分析筛选后，得到49625个，每一个代表一个基因。然后再从中选出3万个EST，两个辐射杂交系库（分别有83个和93个细胞株），一个具有32000个克隆的YAC库（平均长度1Mb），用于分析构建图谱。结果表明，共有20104个EST可定位在基因组中，其中19000个的图谱位置可用一个辐射杂交系库或两个库分析所证实，其余EST用YAC库确定图谱位置。最后将20104个EST定位在人类基因组的16354个不同能够位点（有些EST来自同一基因而使位点数降低），所构建的物理图谱分子标记的密度是每个标记183kb，这与最初计划的目标100kb的密度十分接近。EST是表达的基因序列，由此构建的物理图谱还可以表明在染色体不同位置的基因密度。从构建的物理图谱可见，基因在染色体上不是均匀分布的，每一条染色体都有一段基因密集区和非密集区，而且有些染色体上基因密度相对较低。将上述遗传图谱及其物理图谱整合后，构成更加完整的人类基因组图谱，作为基因组序列测定的框架和分析的依据。二、基因图谱的应用    一张基因组图在很多方面十分类似于我们熟知的交通地图。如果将特定的染色体比作是编了号的告诉公路的话，位于特定染色体上的基因则有如城市和城市里的街区。要有效快捷地到达目的地，最好办法是有一张好的交通地图。因此，高密度的基因组图谱在基础研究和应用研究方面都具有广泛的应用价值。基因组图谱中除了如前所述按构建方法分为遗传图谱和物理图谱外，还刊物依其所用的标记类型不同分为不同的称谓。如RFLP连锁图，即利用RFLP标记构建的图谱。此外还有RAPD图谱、AFLP0图谱等。迄今为止，已构建了基因组图谱的植物达30多种，其中农作物有：莴苣、马铃薯、胡椒、水稻、玉米、番茄、小扁豆、油菜、大麦、棉花、大豆等。正在构建基因组图谱的植物也有30多种，有些植物的基因组图谱已趋于饱和。基因组图谱除了用于基因组序列测定外，还主要用于以下几个方面。（一）基因定位借助基因组图谱，可使基因定位在精度、速度、广度等方面有极大的提高，已陆续在各种农作物上定位了许多重要农艺性状和经济性状的基因，如抗病基因、抗虫基因、耐逆性基因、高含油量基因、早熟基因、光周期敏感基因、雄性不育恢复基因、矮杠基因等。在复杂的数量性状基因位点（quantitativetraitloci,QTL）定位分析方面，也取得了很大进展。（二）基因组比较分析已经在禾本科的玉米、水稻、高粱、大麦小麦和黑麦，茄科的番茄、胡椒、马铃薯，十字花科的拟南芥、甘蓝、花椰菜、油菜等做了遗传图谱比较分析，从分子水平了解物种间的同源性，研究基因组的进化和染色体的演变。（三）标记辅助选择（marker-assistedselection,MAS）饱和的基因组图谱至少可以用来确定与任何一个目的基因紧密连锁的分子标记，从而根据图谱间接选择目的基因，可以降低连锁累赘，大大加速目的基因的转移与利用，提高回交育种的效率。此外，标记辅助选择有助于克服轮回选择过程中早期选择的盲目性。（四）基因的克隆和分离根据饱和的基因组图谱，可以找到一个与目的基因紧密连锁的分子标记，作为染色体步行（chromosomewalking）的起始点，进行基因的克隆和分离，此法又称图位克隆法（map-basedcloning）,为基因产物未知的基因克隆提供了捷径。三、后基因组学    后基因组学（post-genomics）是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上，进一步研究全基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机制为主要内容的学科。    目前人类基因组计划已测定了人类基因组序列中85%以上的核苷酸序列，将计划完成全序列测定的时间从2005年提前到2003年。但是，要分析构成基因组中的各个基因的功能，弄清楚共有多少基因表达、何时表达、受什么因子控制等，将比序列测定本身要复杂得多，需要的时间也长的多。有人估计还得花几十年甚至上百年时间才能完成这一工作。\n从1996年酵母菌基因组全序列测定以后的4年多时间里，全世界已有1000多个实验室，5000多名科学家从事酵母菌后基因组学的研究，共发表论文7000多篇，鉴定1060个新基因的功能，但仍然还有约1600个阅读框架的功能不清楚。这些结果充分说明后基因组学研究的复杂性。后基因组学主要利用DNA微列阵技术、蛋白质组学、酵母菌双杂交系统以及生物信息学等技术相结合，对已知的基因组序列进行研究。（一）DNA微列阵DNA微列阵（DNAmicroarray）就是利用DNA芯片技术，同时进行大量分子杂交，以分析比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从核酸水平分析基因表达模式。这是后基因组学研究中的重要方法之一。（二）蛋白质组学蛋白质组学（proteomics）是从蛋白质水平来研究基因组的基因表达，分析基因组的蛋白质类型、数量、空间结构变异以及相互作用的机制。蛋白质组学的英文全称是由蛋白质英文的前一部分（prote）与基因组英文名的后一部分（omics）组合而成，蛋白质组学也是以基因组为单位进行研究的。如在“基因调控”一节所述，有些基因不表达形成蛋白质，或表达成蛋白质后要经过修饰加工才有活性。DNA的一段线状结构与二级结构的功能通常差异不大，而线状多肽链必须折叠成一定的三维空间构型才能成为有功能的蛋白质。同一种蛋白质可能因经历不同的加工修饰而具有不同的功能。因此生物的蛋白质多样性要大大高于基因数目。例如，据估计人类基因组共有约3.5万个基因，而可能高达2000万种不同的蛋白质。因此，蛋白质组学比基因组学更为复杂。在蛋白质分析中，目前主要利用奥佛诺（O'Farrel,1975）发明的据蛋白质的等电点和分子量分析蛋白质的双向电泳技术，来分析蛋白质组（proteome），这也是迄今为止分辨率最高的蛋白质分析技术。这一技术现已发展为将pH梯度整合到丙烯酰胺基质中，成为固定pH梯度，这一改进比过去用安福林作为等电聚焦的pH梯度要好，使实验重复性大大提高。随着方法的不断发展，尤其是将双向电泳与计算机技术、以及扫描成乡技术结合，使其检测灵敏度不断提高，用途更加广泛。（三）酵母菌双杂交系统酵母菌双杂交系统（twohybridsystem）是利用在酵母菌的同一细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间相互作用的一种分析方法。这是目前用于鉴定真核生物蛋白质互作（除膜蛋白以外）的最好体系。如前所述，真核生物的基因表达受到转录因子控制，转录因子必须与启动子区域的DNA结合，并激活RNA聚合酶转录。转录因子的这种与DNA结合及激活转录这两个功能，分别是由两个不同区域（domain）完成的，而且将有些转录因子的这两部分分割成两个片段后，它们仍可以互作，并装配成一个完整有功能的转录因子。正是基于这一特点，设计出酵母菌杂交系统。    在双杂交系统中，当报告基因（作为检测信号的基因，如β-半乳糖苷酶基因）缺少转录因子的一部分时，它总是处于关闭状态。将酵母菌因子的DNA结合区域以及RNA聚合酶激活区域分开，分别克隆。再将DNA结合区域与待分析的目的基因序列（即分析其蛋白质是否与其他蛋白质互作的基因，其蛋白质用A表示）构建成融合蛋白。同时将RNA聚合酶激活区域也与另一组DNA序列的混合体连接，构建成许多不同融合蛋白分子（用蛋白质X表示，假设蛋白质X和A均是人类蛋白质）。再将构建的这两种类型的融合蛋白质分子混合后共转化酵母菌细胞，，有些共转化的酵母菌会含有两个融合蛋白质分子，一个带有DNA结合区域及待测的目的基因序列，另一个具有RNA聚合酶激活区域及其他未知的DNA序列。如果这两个基因的产物能够互作，DNA结合区域——蛋白质A融合蛋白与报告基因启动子结合后，另一个能与蛋白质A互作的融合分子就会与蛋白质A靠近，从而将RNA聚合酶激活区域带到DNA结合区域一起，形成一个完整有功能的转录因子，起始转录报告基因，使报告基因表达，形成的菌落具有可鉴别的表型。这样，与RNA聚合酶激活区域融合在一起的蛋白质，就是与蛋白质A互作的蛋白质。如果细胞中没有与蛋白质A结合的蛋白质，RNA聚合酶激活区域就不会被带到报告基因的启动子区域与DNA结合区域结合，报告基因就不能转录，而不能表达。通过这种方式，就可鉴别出与人类蛋白质A互作的蛋白质。（四）生物信息学生物信息学（bioinformatics）是利用计算机贮存原始资料，分析生物信息，将DNA芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学信息的学科。生物信息学是将现代生物技术与计算机科学结合，收集、加工和处理生物资料。具体来说，它是将数学、统计学、计算机方法结合起来，用于综合、分类、分析和阐述生物信息的科学。    生物信息学被认为是在为了生命科学中起关键作用的学科之一。以生物信息学为工具，人类可以将不同基因组的理论及应用研究结果综合并标准化，生物信息研究人员可以利用大量电子信息资料，来了解生物遗传网络系统、信号传递及相互关系，可以利用计算机模拟蛋白质分子的三维结构，人工合成新的蛋白质以及创建新的生命形态。从微生物、植物、以及人类基因组的序列测定产生的大量资料需要分析，生物信息学的利用，对于这些研究结果的分析及弄清它们的遗传信息具有极其关键的作用。因此，在21世纪，以生物基因组为对象的研究必将得到更快的发展，而生物信息学对于利用和阐述生物信息将具有不可替代的作用。第十章基因突变     以上各章所论述可遗传的变异都是基因重组的结果。基因重组只是原有基因之间关系的变动，不是基因本身发生质的变化。而基因突变是指染色体上某一基因位点内部发生了化学性质的变化，与原来基因形成对性关系。突变一词是荷兰DeVris\n首先提出来的，他根据对月见草的研究，在月见草中发现的变异，于是他把基因型的大而明显的改变现象称为突变，并于1901~1903年发表了“突变学说”。1910年摩尔根（Morgan)首先肯定了基因突变，例如果蝇由红眼到白眼的突变。因此，基因突变也称点突变，是生物进化原材料的主要源泉。自然突变：自然突变指在没有特殊的诱导条件下，由外界环境条件的自然作用或者由生物体内的生理和生化变化而发生的突变。诱发突变：在专门的诱变素影响下发生的突变。但这两类突变的表现形式是没有严格区别的。突变引起的表现改变从明显的表现特性分析时，可以分为以下几点：1、形态突变型：泛指造成外型改变的突变型。2、致死突变型：能造成个体死亡或生活力明显下降的突变型。3、条件致死突变型：在一定条件下致死。4、生化突变型：没有形态效应但导致某种特定生化功骅改变的突变型。根据突变对于身体所发生的影响，有显著的，也有微弱的，发生突变的遗传物质或突变的部位也有所不同，通常以显微水平为标准分为两大类：染色体畸变和基因突变。第一节基因突变率和时期1、基因突变率    基因突变在自然界广泛地存在。从病毒、细菌到人类都有自然突变的发生，而且同一突变可以重复发生。如水稻的矮生型、棉花的短果枝等。因此，基因有突变频率，而且各种生物的突变频率地一定条件下是相当稳定的。在遗传学上把表现突变性状的个体或细胞称为突变体，而突变体占观察总个体数的比例叫突变频率。    据×估计，在高等类型的生物里，基因的突变频率是1×10-4到1×10-8，即大约在10万到一亿个配子里，有一个基因发生突变。细菌的突变频率是1×10-4到1×10-10，即一万到一万亿个细菌之间，可以看到一个突变型。在人类中，在十万个带有X染色体的配子中，大约有2--3个含有新发生的血友病突变基因、色肓、白化病。突变的研究指出，不同的基因，突变频率是不一样的。    在有性生殖的生物中，突变率通常是用每一配子发生突变的概率占观察的总配子数的比例表示。例如，在玉米中，影响颜色的R基因在每百万个配子中平均突变率为492；而使种子凹陷的sh基因仅为1.2两者相差高达500倍。在无性繁殖的细菌中，突变率是用每一细胞世代中每一细菌发生突变的概率占观察的总细菌数来表示。2、基因突变的时期    一般说来，任何组织都能够发生突变。而体细胞所发生的基因或染色体的变化叫体细胞突变。在性原始细胞或成熟性细胞内发生的突变叫性细胞突变。性细胞突变的频率比体细胞的高，这是因为性细胞在减数分裂的未期对外界环境条件具有较大的敏感性。    在传递上，性细胞发生的突变可以通过受精过程直接传递给后代。而体细胞突变一般不能传给后代，除非那突变部分可以由无性生殖传留后代，或者那部分以后能够产生生殖细胞。    在只有通过有性途径进行繁殖，而且性原始细胞早期已经分化的生物中，一般体细胞突变在进化上没有作用，对于选种也没有价值。但是对于能够进行无性繁殖的生物来说，体细胞突变是有重要的意义。因为这些类型能由体细胞组织发育成完整的新个体。例如，果树的芽变等。    基因突变通常是独立发生的，即某一基因位点的这一等位基因发生突变时，不影响其它等位基因。例如AA—Aa、aa—Aa，某些动植物的体细胞发生突变，由于体细胞是二倍体，所以只有显性突变或者是处于纯合状态的隐性突变才能表现出来。这种表现往往使该个体产生镶嵌现象。即一部分组织表现原来的性状；而另一部分组织表现改变了的性状，镶嵌程度，根据突变发生时有机体的发育时期而不同，突变发生愈早，则变异愈大，突变愈晚，则变异部分愈小。例如有一种猫，叫金银眼猫，猫的一只眼睛的虹彩是黄褐色，另一只眼睛的虹彩是兰色。这大概是在个体一发育较后阶段发生突变的结果。第二节基因突变的一般特征1、突变的重演性和可逆性\n     同一突变可以在同种生物的不同个体间多次发生叫重演性。通常表现为显性。而突变后的基因则称突变基因，表现为隐性。当A→a时称为正突变，反之a→A为反突变或叫回复突变。因此，突变过程正象有机体内进行的许多生物化学过程一样是可逆的。例如，红色面包霉本平不需要从外界吸收肌醇来制造自身所需的营养，但其中一个突变使它要求肌醇才能生长，即I→i，但在以后的诱变试验中，又发现这个突变不再需要肌醇，即i→I，这表明它发生了反突变。    正突变和反突变的频率一般是不一样的。用U代表正突变的频率，V代表反突变的频率，突变频率可以这样写：A＝a。一般说来，正突变的频率高于反突变，因此在自然界中所出现的突变多数为隐性突变。突变可逆性的事实表明，基因突变一般不是由于基因物质的丧失，而主要是组成基因的物质发生了化学变化。基因突变的可逆性也是区别于其它变民，如基因重组和染色体畸变的特点之一。如缺失的突变就无法发生回复突变。2、突变的多方向性和复等位基因   基因突变的方向是不定的，可以多方向发生。例如，基因A可以突变为a，也可以突变为a,a1,a2,a3......对于A来说都有是隐性基因，同时a1,a2,a3......等之间的生理功能与性状表现又各不相同，这就是突变的多方向性。遗传试验表明，这些隐性突变基因彼此之间，以及它们与A基因之间都有存在对性关系。用其中表现型不同的两个纯合体杂交，F2都有呈现等位基因的分离比例3:1或1：2：1。具有对性关系的基因是位于同一个基因位点上的，位于同一位点上的各个等位基因，称复等位基因。AaAaAa复等位基因存在同一生物类型的不同个体中，复等位基因广泛地存在于生物界。栽培的普通烟草为自花授粉植物，但在烟草属中有两个野生种表现为自交不亲和性。在这些烟草中发现15个自交不亲和的复等位基因S1、S2、S3、S4、------等，控制自花授粉的不结实性。这里所指的自交不亲和性是指自花授粉不结实，而株间授粉都能结实的现象。试验表明，具有某一基因的花粉不能在具有同一基因的柱头上萌发，好象同一基因之间存在一种拮抗作用。♀S1S2X♂S1S2→不育♀S1S2X♂S1S2→S1S3，S2S3♀S1S2X♂S3S4→S1S3，S1S4，S2S3，S2S4A、B、O血型的遗传；从19世纪初期限为了救活某些病人，医学上应开始采用了输血的办法，即把一个人的血液输入另一个人的血管里。可是这种治疗方法不时发生致命的事故。同一家族的不同成员的输血例如儿子给父亲输血，也可发生致命的事件。1900年，奥国的医生Landsteiner对血液进行了研究，他反不同个体的血液相互混合，发现有些不同的血液彼此混合的很好，有些不同的血液发生凝集的现象，于是他发现了人类的血液不是只有一个类型，而是有几个类型，这叫做血型（是指红细胞膜上的蛋白质的特异性，在作用上这类蛋白质都是抗原）。当时他发现了3种血型，1902年他的一个学生发现了第4种血型。即A、B、O和AB。于是人们知道，过去输血发生事故的原因就是由于某些不同血型的血液混合在一起，引起红血球的凝集，堵塞了血管的缘故。遗传学的研究也已经确定了，这性状的遗传也是复等位基因的一个典型例子。研究指出，A血型对O血型是显性，B血型对O血型是显性，A和B则无所谓显性，两者在一起都能表现它们的作用。如果彩复等位基因的一般命名法，用I代表显性基因，i代表隐性等位基因，那么表现型和基因型的关系可以组成6种基因型和4种表现型。AIAIA、IAiABIAIBBIBIB、IBiOii按照孟德尔的遗传规律可以知道，父母双方都是O型，那么他们儿女的血型只能是O型。父母双方的血型如果一个是AB，一个是O型，那么他们儿女的血型只能是A或B。这样的遗传学知识有实用意义。例如地浙江省遂昌县人民医院造成两个刚出生的男婴4年前在医院里错换（天津日报1987年11月25日）1983年9月29日下午，产妇季国花生一男婴，取名程文剑，第二天凌晨，罗素慧也生下一男婴，取名李辉。护士有章不循，致使婴儿发生了阴差阳错的互换事件。1987年初，程文剑和李辉同在遂县妙高镇幼儿园入托。4月季国花的妹妹调到幼儿园里当阿姨，发现李辉的相貌酷似自已的哥哥，就将此事告诉了家人。程成飞和其妻季国花由此怀疑自已的亲生儿子是否在4年前已被错换，就作血型鉴定，发现夫妻双方血型为A，而儿子血型为B，无任何血缘关系。3、突变的有害性和有利性\n大量的观察表明，绝大多数的基因突变都会给生物带来不利的影响，如生活力的降低，孕性的降低等。可以说，突变的有害性，是生物界较普遍的现象。这种现象以自然选择的观点是容易理解的。因为任何一种生物的基因型都是历史上长期自然选择的结果。因此它的基因型，无论从内部结构，生理生化状态以及外部形态上说，对外界环境条件都具有较适应的意义，达到了一定的平衡状态。而基因突变破坏了这种内部的协调性，打破了它旧有的平衡状态，因而给生物带来不利的影响。极端的有害突变可导致有机体的死亡，例如人类中的血友病，植物的白化苗等。先讨论致死突变和致死基因：小家鼠中有一种突变，使体毛呈黄色，研究查明，这黄色基因Y对黑色基因y是显性，奇怪的是：黄色小家鼠从来不能真实地遗传。它们近亲交配所产生的后代是：2黄色：1黑色。这表明它们是杂型合子，以下的结果也支持了这一点：黄色X黑色F1：黄色：黑色1：1  黄色小家鼠近亲交配所产生的后代比它们跟黑色小家鼠交配所产生的后代平均少了1/4，而且前一种交配中有一部分胚胎在母体内就已死亡了。以上材料表明黄色和黑色的遗传达室主要仅仅牵涉到一对基因的遗传。怎样说明呢？假定黄色基因Y在纯型合子中引起死亡，说明Y具有隐性的致死效应。就可以解释上面的遗传达室结果。黄色AyaX黄色Aya→1AyAy::2Aya:1aa像Y这样的基因，就叫做致死基因，因为它表现一定程度的显性，所以是显性致死基因。隐性的致死基因是更加普遍的现象，如玉米品种植株自交的后代有时会出现一定比例的白苗，这类白苗不能制造叶绿素在4~5片真叶时就要死亡。它的遗传达室行为如下：绿株WW→Ww→自交产生1WW：2Ww:1ww(白苗）死亡大多数的致死突变，均如上述为隐性致死，但也有少数为显性致死。显性致死突变在杂合状态下即可死亡。例如人的神经胶正基因，可以引起皮肤畸形生长，严重智力缺陷，多发性肿瘤，具有这个杂合基因的人，于年轻时即死亡。致死突变可以发生在常染色体上，也可发生在性染色体上形成为伴性致死。基因致死突变对于致死的个体总是不利的，但是某些致死突变品系对于个体发育的研究和育种实践具有一定利用价值。为了检测基因突变和控制♀♂个体平衡致死品系就是一个有用的材料。果蝇里有一个突变型，翅发育不好，边缘呈念珠状，叫做珠状翅缘。这是显性遗传，但在纯合子时引起死亡，所以这是致死突变。情形是这样的，让这种突变型近亲交配，所产生的后代有2/3突变型，1/3常态型。这暗示这种突变型是由于一种显性的致殆基因，情形跟小说家鼠中的黄色致死基因相似。经过选择，研究者偶然从上述的突变型中培育出一个这样的品系，一个几乎能够真实遗传达室的珠状翅缘的品系。这就是说，这种突变型近亲交配，不再产生出2/3突变型和1/3常态型的后代，而产生的后代出乎意外几乎全是突变型，只是偶然出现了一些常态型。奇怪的是：这个新品系的突变型如果跟常态型交配，它们的后代是：1/2突变型和1/2常态型，这表示那突变型还是杂型合子。经过仔细的分析，知道珠状翅缘基因（Bd）是发生在第三染色体上的显性致死突变，纯型合子Bd/Bd时，引起死亡。但是在新的品系里，增加了一个突变，这是隐性的致死突变（i），它也在第三染色体上。如果用符号代表上述的基因，并采用+符号代表野生型的基因，那么原来突变型的基因型是：Bd/+，新培育出来的突变型的基因型是：Bd+/+i,在这里，Bd跟I的等位基因（+）相连锁，成为Bd+,隐性致死基因i跟Bd的等位基因（+）相连锁，成为+i。这种连锁几乎是完全的。因此，新品系的突变型Bd+/+i一般只产生两种配子；Bd+和+i。它们近亲交配可能产生的合子有4种类型。Bd++iBd+X+iX在这4种合子中，两种纯型合子都死亡。一个死亡的原因是Bd/Bd，另一个死亡的原因是i/i。活下来的都有是杂型合子。在这里，虽然有两个致死基因，但由于它们都不是纯型合子，所以能够生存。又由于纯型合子都有死亡，所以表现突变型真实遗传的现象。“平衡致死”讲的就是具有上述特点的遗传现象。但是，上面讲过，在后代中也偶然出现了常态型的果蝇，这是由于连锁在这里并不是完全的。偶然发生的少数交换，可以产生Bdi和++的配子，由++和++的配子相结合，就可以形成常态的合子，发育成常态型果蝇了。平衡致死品系：同源染色体上分别带有两个非等位的致死基因品系，品系内个体相互交配时出现纯一后代，因为子代中有半数个体对于这个或那个致死基因来讲是纯合状态的，因而在检出以前死亡。存活的子代则象亲代一样，对于致死基因来讲呈杂合状态。有些基因仅仅控制一些次要性状，它们即使发生突变，也不会影响生物的正常生理活力，因而仍能保持正常的生活力和繁殖力，为自然选择保留下来，这类突变称为中性突变。4、突变的平行性\n亲缘相近的物种经常发生相似的基因突变，这种突变称为突变的平行性。例如，禾本科植物中水稻、小麦、玉米和高梁等都有具有相似的变异性状，如子粒颜色都有长形的突变，子粒颜色上都有白粒，红粒和紫粒等突变。这说明近缘物种的许多性状在基因突变上具有平行性。因此，当了解一个物种的一系列类型时，常可预见到其近缘种和属也会存在着相似的类型。突变的平行现象对于研究物种间的亲缘关系，物种进化和人工的定向诱变都有具有一定的意义。第三节基因突变与性状表现1、显性突变和隐性突变的表现    任何基因发生突变，不管是自然的或是诱发的，不一定立刻就表现出来。不同的突变，表现的规律就可能不一样。我们知道基因有显性的，有隐性的，突变也这样，先讲显性的突变。例如，家鸡里的卷羽基因（F）的家鸡，其表现型就是卷羽。如果公母鸡的生殖细胞里一定基因（f）发生突变，变成它的等位基因（F），f→F,那么卷羽基因来自精子也好，来自卵子也好，那受精卵发育起来一定是卷羽的鸡。现在，这卷羽的鸡是突然出现的，它的亲代都是常态鸡，没有一只是卷羽的。但是以后各代的家鸡，总大约有一半是卷羽的，并且可以代代出现。              显性突变的特点在于可以在直接的子代中出现。但显性突变纯合相对的慢。隐性突变的出现与此相反，表现的晚而纯合的快。养狗的人曾偶然发现红毛的狗。研究者指出，红毛狗是由突变而来的，红毛是一种隐性的性状，由于一个孟德尔基因（r）。            我们知道隐性基因是不容易表现的，只有在纯型合子（rr）的情况下才能表现，如果它在X染色体上，那么它在雄性中也可以在单独存在的条件下表现，例如色肓基因就是这样的。但是狗的红色并不是性连锁。因此，一只狗不管是♂的或者♀的，它的生殖细胞时如果发生了突变，产生了红色基因，由于一只♂狗和一只♀狗同时发生同样的突变的机会极少，所以那个突变基因一般只能存在于杂型合子中，不能表现。这样经过若干世代，这红毛基因在狗家族中逐渐扩散，即愈来有愈多的狗带有红毛基因，于是通过两只杂型合子的♀♂狗的交配，在后代中就可能出现个别的红毛狗，数目约占有1/4。从以上的材料可以知道，显性突变和隐性突变地表现上，具有不同的规律。这主要因为隐性基因在杂型合子中不能表现。除非是性连锁，不会在下一代表现出来，它要表现，需要时间，需要若干世代的时间，使用权隐藏性突变在后代中逐渐扩散，让较多的个体带有这种基因。由于带有这种稀有的突变基因的个体往往有血统关系，所以同一家系和交配会使隐性突变表现的机会大大地增强。这就说明了在人类中的近亲结婚，例如姑表结婚，容易使某些隐性性状表现出来的原因了。例如，人类中的低智能儿大约2千万人，先天愚型160万人，克汀病200万人，这些大半是近亲结婚的。突变性状的表现在作物因繁殖方式和授粉方式而有别。自花授粉植物只要通过自交繁殖，突变性状就会分离出来。异花授粉植物则与动物相似。二、大突变和微突变的表现     基因突变引起性状变异的程度是不相同的。有些突变效应表现明显，容易识别，这叫大突变。控制质量性状的基因突变大都属于大突变。有些突变效应表现微小，较难察觉，这叫微突变。控制数量性状的基因突变大都属于微突变。第四节基因突变的鉴定经诱发而产生的变异是否属于真实的基因突变，是显性突变还是隐性突变，突变发生频率的高低等，都应进行鉴定。    在处理材料的后代中，一量发现与原始亲本不同的变异体，就要鉴定它是否真实遗传。变异有可遗传的变异与不遗传的变异。由基因本身发生某些化学变化而引起的变异是可遗传的。而由一般环境条件导致的变异是不遗传的。如边行优势、营养条件等，高杆植物经理化因素处理，在其后代中发现个别矮化植株。这变异体究竞是基因突变的结果，还是别的原因，为了探明这个问题，把它与原亲本比较种植来进行鉴定。如后代还表现变异体的性状那就是发生了突变。否则后代与原亲本一样。        突变体究竞是显性突变还是隐性突变，这可利用杂交试验来加以鉴定。如F1F2测定突变率的方法很多，其中最简单的是利用花粉直感现象，以估算配子的突变率。例如，为了测定玉米子粒由非甜粒变为甜粒（Su→su）的突变率，用甜粒玉米纯种作母本，由诱发处理非甜粒玉米纯种（susu）的花粉作父本进行杂交。已知非甜粒（Su）对甜粒(su）为显性，按理说授粉后的果穗应该完全结成非甜粒子粒，但在实际并不是这样。假定在2万个子粒中出现了2粒甜粒玉米，就是说在父本的2万粒花粉中有2粒花粉的基因已由Su突变为su,这样就测知Su的突变率为万分之一。     一般测定突变率的方法是根据M2出现的突变体占观察总个体数的比例来估算的。\n第五节生化突变     1941年Beadle等人开始以红色面包霉为材料，阐明基因是通过酢作用来控制性状的，提出“一个基因一个酶”的假说。这样就把基因与性状两者联系了起来。由于诱变因素的影响导致生物代谢功能的变异一般称为生化突变。例如，用X射线诱发引起的红色面包霉的营养缺陷型。它与正常的野生型，即原养型的区别在于丧失了合成某种生活物质的能力。当一旦提供这种生活物质，这同野生形型一样又能正常生长。因此，进行生化突变试验，能揭示代谢合成的步骤及其遗传基础。1、红色面包霉的生化突变型    从培养的实验知道，红色面包霉所要求的外界条件比较简单。它从周围环境里所要求的物质是：水、一些无机盐例如硫酸盐和硝酸盐、一些糖类、微量的生物素。上述的这些物质构成了红色面包霉最低限度的营养需要。用它们制成的培养基叫基本培养基。    在基本培养基里，红色面包霉能够正常地生长和发育，能够自已合成它们生活物质所有的其它组成部分，包括多种氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶等。生物化学的研究指出，生物体内复杂有机物的合成是通过一步一步的生化过程来完成的。Beadle根据许多生化突变的研究指出，一步一步的生化过程是受一个一个的基因控制的。基因D→物质丁C→丙B→乙A→甲这个论点现在有许多事实支持着。     用X射线照射红色面包霉的分生孢子，使分生孢子发生突变。把突变型分离出来培养，可以形成许多品系。    红色面包霉有若干跟精氨酸的合成有关的突变品系，它们都有不能合成精氨酸，需要在基本培养基上加入精氨酸，需要在基本培养基上加入精氨酸，它们才能生活。分析这些品系，它们各自的特点如下：   （1）有一个品系非提供精氨酸就不能生活。这表明这个品系的一个有关基因发生了突变，因此不能全盛精氨酸。A→精……蛋白质    （2）另一个品系在有精氨酸的条件下能够正常生活，但不给精氨酸只给瓜氨酸也能正常生活。这表明这个突变型能够利用瓜氨酸合成精氨酸，但不能合能瓜氨酸。这表明一个有关的基因发生了突变。C→瓜→精→蛋白质    （3）另一个品系在有精氨酸或瓜氨酸的条件下能够正常生活，但仅仅给它鸟氨酸，它也能够正常生活。这表明它能够利用鸟氨酸合成精氨酸，但由于一个基因发生了突变，不能合成鸟氨酸。O→鸟氨酸→瓜→精→蛋白质根据上述几个突变型的测定，可以推论精氨酸的合成步骤与基因的关系大致为：O→C→A→蛋白质经过详细的分析，已经知道鸟氨酸在红色面包霉体内形成一个循环。情形是这样的：精氨酸在精氨酸酶的作用下分解成鸟氨酸和尿素。2、红色面包霉生化突变的鉴定方法     首先引起突变，检出突变，用X射线或紫外线照射纯型的分生孢子，可以诱发突变。再让这些处理过的分生孢子分别跟相反交配型的野生型红色面包霉交配，由此产生出子囊孢子。仔细地从子囊壳里检出一粒一粒细小的子囊孢子，让它们分别生活在完全的培养基里。红色面包霉的各种突变型一般都能在完全培养基里生长和发育。产生出许多菌丝和分生孢子。    然后从在完全培养基里生长起来的各组红色面包霉所产生的分生孢子取出一部分分别培养在基本培养基里，观察它们的生长，如果不能生长，那就表明突变发生了。接着分析所发生的是什么突变，把确定为突变的一组跟其它组分开，把这些突变型的分生孢子从完全培养基里取出来，分别培养在以下若干不同的培养基上：（1）完全培养基、（2）基本培养基、（3）基本培养基加氨基酸、（4）基本培养基加多种维生素。如果发现突变型不能在第三种培养基里生活而能在第四种培养基里生活。那表明突变型属于维生素缺陷型，即控制某种维生素合成的基因发生了突变，使它不能合成某种维生素，所以只有在含有这种维生素的培养基里才能生活。\n    如已确定是维生素的突变型，那就进一步确定究竟是什么维也纳生素。把这种突变型的分生孢子分别培养在许多含有不同维生素的基本培养基里，如（1）加上硫胺素B1，（2）吡醇素B6，（3）加遍多酸，（4）加肌醇。如果发现它只能在含有硫胺素的基本培养基里生活，而不能在其他培养基里生活，那就表明这种营养突变型是控制硫胺素合成的基因发生了突变，即基因B1+→B1-。    现已充分知道，红色面包霉有许多不同的基因分别控制各种不同的维生素，各种氨基酸、嘌呤和嘧啶等的合成。这些生化突变的研究阐明了基因和新陈代谢的关系，阐明了基因的原始作用。第六节基因突变的诱发   诱发突变是1927年Muller用X射线开始研究的。引起突变的外界条件和物质叫做诱变因素，可分为两大类：（1）物理的：各种放射线、超生波、温度等。（2）化学的：如秋水仙素、芥子气、烷化剂、碱基类似物等。1、物理因素诱变    物理因素只限于各种电离辐射和非电离辐射。基因突变需要相当大的能量，因此细胞必须在得到大量的能量以后，基因才可能突变。能量低的辐射如可见光只产生热量：能量较高的辐射如紫外线除产生热能外，还能使原子“激发”，能量很高的辐射如X射线，r射线，β射线，中子等除产生热能和使原子激发外，还能使原子“电离”。1、1、电离辐射诱变    电离辐射包括α、β和中子等粒子辐射击。还包括γ射线和Χ射线等电离辐射。最早用于诱发变异的是Χ射线，随后主要是γ射线、钴60和铯137是γ射线的主要辐射源。    在这里中子是不带电的粒子，中子的诱变效果最好，经中子照射的物体带有放射性，人体不能直接接触。    Χ和γ射线及中子都适应于外照射即辐射源与接受照射的物体之间要保持一定的距离，让射线从物体之外透入物体之内，在体内诱发突变。α（氢核）和β（阴电子）穿透力很弱，只能用于“内照射”，α在空气中的射程只有几厘米，而在植物组织中只有十分之几毫米，β比α穿透力大，在植物组织中可达几毫米。现大部分用β射线，它常用的辐射源是P32和S35，尤以P32使用较多，可以用浸泡和注射的方法，使其渗入生物体内，在体内放出β射线进行诱变。辐射剂量是指单位质量被照射的物质所吸收的能量数值。    Χ射线和γ射线的剂量单位是伦琴γ，即在1克空气中吸收83尔格辐射击的能量。中子的剂量单位是“积分流量”即每平方厘米的截面上通过的中子数。    β射线的剂量单位是指用每克物质吸收多少“微居里”的放射击性同位数表示。微居里是放射强度单位，表示每秒钟3.7X104个原子核发生蜕变。    剂量率：应用X射线或γ射线照射击时必须考虑到单位时间内的射线能量的大小，这就是剂量率，通常用伦/秒、伦/分、伦/时等表示。    1、2、非电离辐射诱变主要紫外线，紫外线的波长（3800~150Α）只此可见光略短，所以它的能量不足以使原子电离，只能产生激发作用。由于紫外线的波长较长，限制它往组织内部穿透的能力。所以紫外线一般只能用于微生物或以高等生物配子为材料的诱变工作。研究表明，紫外线诱变的最有效的波长为2600Α左右，而这个波长正是DNA所吸收的紫外线波长。所以紫外线的诱变作用在于被DNA吸收之后，促使分子结构发生离析，这是紫外线的直接诱变作用。紫外线还有间接诱变作用，比如用紫外线照射过的培养培养基去培养微生物。结果使微生物的突变率增加了。这是因为紫外线照射过的培养基内产生了H2O2。氨基酸经H2O2处理高有使用微生物突变的作用，这一事实说明辐射诱变的作用并不单靠它城乡差别直接影响基因本身，改变基因的环境也能间接地起作用。     （三）电离辐射可诱发基因突变和染色体断裂，它们的频率和辐射剂量成正比。从实验得知，应用中等剂量的X射线，致死突变的发生频率大抵跟X射线的剂量成正比。比方说，在果蝇里，性连锁致死突变的自然频率大约是0.2％提高到３％，使用2000γ单位会提高到大约6%，使用3000γ单位会提高到大约9%。这种使用量和效果的简单关系甚至对于最低的使用量也是存在的。    第二，辐射效应是累积的，Muller的研究指出，对于果蝇，在8分钟内给以2000γ单位和在30天以上给以同样剂量的放射线，所引起的突变频率是大抵相等的，都是6%。这表明γ单位的作用取决于所引起离子化的数目，而不取决于时间的长短。X射线和其它同类性质的放射线，由于穿过组织的能力极强，对一切生物，包括人类在内，都极能引起突变。\n    X射线和其它放射线对于生物体的影响是多方向的，受伤害的情况跟照射的量相联系的。对小家鼠的实验表明，如果剂量较大，它们就死亡。同样剂量小家鼠要比果蝇死的快。因为小家鼠的身体比果蝇含有更大量的生活细胞和分裂中的细胞。在人类1000γ以上会引起死亡，全身照射50~1000γ会引起放射线病。如果剂量稍为低一些，小家鼠可以生活下去，但表现不同种类的伤害。它可以失掉了毛，或者象受了火伤一样。X射线所引起的火伤可以发展成癌。这样，它就间接地死于X射线的照射。    如果照射的量更少一些，小家鼠可能不表现任何受伤害的样子，但不育。如果比上面再减少一些，那么小家鼠是完全健康的，并且可以生育后代。看来X射线好像丝毫不发生作用，但遗传实验分析指出，这小家鼠的遗传基础发生了诱发突变了，如果是显性突变，那么子1代就可能表现出来，如果是隐性突变的，那儿要经过好几代那有害的影响才能表现出来。前苏联切尔诺贝利核电站。2、化学因素诱变    化学药物的诱变作用是有特异性的。就是说一定性质的药物能够诱发一定类型的变异。这就使遗传学和育种学领域中出现利用化学药物定向诱变的希望。    2、1、烷化剂：烷化剂有一个或多个不稳定的烷基（C2H5），这些烷基能够移到电子密度较高的其它分子中去，这种通过烷基置换其它分子的氢原子的作用，叫烷化作用，目前常用的有：甲基磺酸乙酯（EMS）硫酸二乙酯（DES）等。烷化剂的诱变作用主要是通过烷化作用改变基因的分子结构，从而造成基因突变。      2、2、碱基类似物：它的分子结构与基因分子的碱基相似，它们在不妨碍基因复制的情况下作为组成基因的成分参入到分子中去。但由于碱基类似物在某些取代基上与正常碱基不同，所以它在参入基因分子时或以后，会使基因复制时发生偶然配对上的差错，从而导致基因突变，常用的有5—溴尿嘧啶、5—溴脱氧尿核苷等。    3、诱变在育种上的应用    在基因突变的性质上，诱变和自然突变是没有区别的。但是，在突变率上，前者可超过后者几百倍。甚至千倍，为人工创造变异开辟了广阔的途径。诱变育种能提高突变率，扩大变异幅度。改良现有品种的单一性状常有显著的效果，而且处理方法简便。因此，在作物育种上，特别是在微生物育种上，广泛采用这一技术，并在生产上已取得显著成果。诱变育种工作必须注意以下几个技术问题。    首先，是选用合适的处理材料。实验表明，诱变育种的成果常因作物凡殖方式和染色体倍数而不同。水稻、大麦等二倍体作物的成果较显著；小麦等多倍体作物因有重复基因的存在，成果常较差。    其次，是确定适当的诱变剂量。根据辐射诱变的资料，辐射剂量与基因突变率成正比。因此，适当的诱变剂量应该是既能引起较多的有利突变，又能保存相当多的成活植株，以供选择。为此，最常用的剂量是半致死剂量（DL50%）即指被处理的材料能有50%成活的剂量。由于处理时的不同条件（如氧气、温度、湿度），诱变剂量常表现不同的诱变效应。不同的作物，不同的品种和不同的组织、器官对诱变剂量的敏感性也表现不同。在辐射处理中，一般以豆科植物最敏感，大约7000~2万伦琴；禾本科2~3万伦琴，十字花科6~8万伦琴。湿润或萌发的种子，幼龄植物和分生组织，尤其是性细胞表现较为敏感。    第三、要善于选择诱变后代，诱变处理的种子胚或其化组织大都为多细胞所组成。因此发生的突变体必须是嵌合体。例如，稻麦等谷类作物的种子有3~4个胚芽，诱变种子当代长成的第一代植株，一般称M1，其中可能有少数植株中有一个穗中部分的籽粒发生突变，且多数是隐性突变。故M1一般不进行选择。诱变后代也与杂交后代一样，在M2代将分离大量突变性状，故应扩大群体。现以大麦主茎发生隐性突变（A→a），成熟时要按单穗分别收获，以便穗行播种。从中选择符合需要的有利突变体，M3代进一步鉴定当选株系的综合性状及其基因型的纯合性。一般在M4已经纯合稳定，即可测产比较，育成优良品种。    以上育种程度是对一般质量性状的突变而言，实际上，有些质量性状的突变往往表现一因多效，或与其它性状连锁现象，这种突变不利于选择。因而对于这种突变体常需要进一步与杂交育种相结合，促使基因发生交换和重组，然后再进行选择。第十一章细胞质遗传第一节细胞质遗传的概念和特点内容：一、细胞质遗传的概念二、细胞质遗传的特点一、细胞质遗传的概念\n1.核遗传：染色体基因组所控制的遗传现象和遗传规律。2.细胞质遗传：由细胞质基因所决定的遗传现象和遗传规律，也称为非孟德尔遗传，核外遗传。二、细胞质遗传的特点如果精子不提供细胞质，即没有细胞质参与受精，那么细胞质就表现以下遗传特点：1.正交和反交的遗传表现不同。由细胞质基因控制的性状，只能由母本传递给子代。AXB正交BXA反交2.通过连续的回交能把母本的核基因全部置换掉，但母本的细胞质基因及其控制的性状仍不消失。3.由附加体或共生体决定性状，其表现往往类似病毒的转导或感染。第二节叶绿体遗传内容：一、叶绿体遗传的花斑现象二、叶绿体遗传的分子基础一、叶绿体遗传的花斑现象1.发现Correns在花斑的紫茉莉中发现三种枝条：绿色、白色和花斑分别进行以下杂交表12-1紫茉莉花斑性状的遗传接受花粉的枝条提供花粉的枝条杂种表现白色白色绿色白色花斑白色绿色绿色绿色花斑白色花斑绿色白、绿、花斑花斑结果：白→白绿→绿花斑→白、绿、花斑枝条和叶色的遗传物质是通过母本传递的。细胞学证据：白色——白色质体绿色——叶结体花斑——白色质体和叶绿体\n精卵受精时，由于精子的细胞质不参与受精，所以枝条的颜色完全由卵细胞（母本）的细胞质决定。2、叶绿体遗传的规律i自主性。i相对自主性。某些情况下，质体的变异是由核基因所造成的。二、叶绿体遗传的分子基础●双链环状DNA●12～160kb大小，多数为150kb●基因组结构目前已经测定了烟草（shinozaki，1986）、水稻（Hiratsuka，1989）等叶绿体DNA的全序列。举例：烟草叶绿体基因组结构大小：156kb，环状分区(4个区):86.5kb的大单拷贝区(LSC)18.5kb的小单拷贝区(SSC)两个等同的25kb第三节线粒体遗传内容：一、线粒体遗传的表现二、线粒体遗传的分子基础一、线粒体遗传的表现举例：红色面霉缓慢生长突变型的细胞质遗传生化分析：突变型不含细胞色素氧化酶，这种酶是由线粒体控制合成的。二、线粒体遗传的分子基础●大小：差别很大表12-1线粒体基因组的大小物种类型物种数目基因组大小（kb）昆虫4214.5~17.9真菌2718.9~95高等植物20120~2700●形状:构型复杂、有开环、共价闭环、超螺旋、直线型等形式。●基因组结构表现出极复杂的变化主要原因是重组使线粒体基因组的组织结构变得非常复杂第四节植物雄性不育性遗传内容：一、植物雄性不育性的概念二、植物雄性不育性类型三、植物雄性不育性的遗传\n一、植物雄性不育性概念不育(sterility)：一个个体不能产生有功能的配子（gamete）或不能产生在一定条件下能够存活的合子（zygote）的现象。雄性不育性（malesterility）：当不育性是由于植株不能产生正常的花药、花粉或雄配子时，就称之。l43科、162属、320个种二、植物雄性不育的分类1、细胞核雄性不育（genicmalesterility）（1）不受光温影响的核雄性不育（2）光温敏核雄性不育2、核质互作型雄性不育（gene-cytoplasmicmalesterility，也叫质核互作雄性不育）△孢子体不育：花粉的育性受孢子体（植株）基因型控制，而与花粉本身所含基因无关。孢子体RR，Rr→花粉全部可育（R或r）→F1可育孢子体rr→花粉全部不育（r）→F1不育△配子体不育：花粉育性直接由配子体（花粉）本身的基因所决定。孢子体Rr→R花粉可育，r花粉不育。三、植物雄性不育性的遗传1.质核互作型不育（1）一般遗传模式图12-10三系：不育系、保持系和恢复系●S（rr）×N（rr）→S（rr）F1不育S（rr）→不育系N（rr）→保持系●S（rr）×N（RR）→S（Rr）F1可育N（RR）→恢复系（2）雄性不育性的分子机制——核质互作类型线粒体基因Levings和Pring（1976）：多种限制性核酸内切酶切MTDNA（玉米N和T）→差异的限制性核酸内切酶片段线粒体蛋白质–玉米T型：13KD特异蛋白，受Rf基因的抑制–C型：17.5KD不受Rf基因–S型：58-84KD（8条）影响?玉米：CMS-T的分子机制Rf1Rf2抑制–不育系：13KD多肽←T-urf13×13KD–保持系：不能合成13KD，21KD–与T小种感染密切相关––T-urf13连结在Mt启动序列上–导入\n–烟草––部分或完全不育2.光温敏核雄性不育的遗传（简单遗传）高温或长日不育适温短日可育倒位重复区(IRA、IRB)第十二章数量性状遗传第一节数量性状及其特征    前几章所讲的相对性状间的差异，大多数是明显的不连续。例如，水稻的糯与非糯，豌豆的红花与白花，相对性状之间都显示出质的差异，所以称为质量性状（qualitativecharacter）。质量性状在杂种后代的分离群体中，具有相对性状的个体可以明确分组，求出不同组之间的比例，比较容易地用分离规律、独立分配规律或连锁遗传规律来分析其遗传动态。除了质量性状外，生物界还存在着另一类性状，这些性状的变异呈连续性，个体之间的界限不明显，很难明确分组，更不能求出不同组之间的比例，因而不能用分析质量性状的方法来分析。这类性状叫做数量性状（quantitativecharacter）.动植物的许多经济性状往往都是数量性状，如农作物的产量、成熟期、奶牛的产奶量、棉花的纤维长度等。与质量性状相比，数量性状有两个最显著的特征：    1.表现为连续变异，具有相对性状的两个亲本杂交后的分离世代不能明确分组。例如，水稻种子的千粒重，不能简单地划分为“重”和“轻”两组统计每组的植株数目。若千粒重在25g到35g之间，可以有26.0、27.6、28.3……等一系列变化，很难分类。只能用特定的仪器度量，借用统计学方法加以分析。    2.数量性状一般比质量性状更容易受环境条件的影响而发生变异。这种变异是不遗传的，它往往和那些能够遗传的变异混淆在一起，使问题复杂化。例如，纯系品种的株高，并不是完全一致的，株间也有差异，这种差异就是环境条件的影响所至，因为株间的遗传基础是完全一样的。同一株树上的苹果大小，也是环境条件影响的结果。假使两株果树的遗传基础不一样，果实大小应该有差异，但同一株树上也有差异，如何区分这两种差异呢？这就比质量性状复杂得多了。举一个实际例子。有两个玉米品系，一个是短果穗，长5-8cm，另一个是长果穗，长13-21cm，二者杂交，F1的穗长介于双亲之间。F2各植株的穗长呈连续分布，不能分组。同时，由于环境条件的影响，基因型纯合的亲本（P1、P2）和基因型杂合一致的F1，各个个体的穗长也呈现连续的分布，而不是只有一个长度。F2群体中既有由于基因分离造成的基因型之间的差异，又有由于环境的影响而造成的相同基因型的表型差异，所以F2的连续分布范围比亲本和F1都更广泛。玉米穗长的遗传穗长（cm）56789101112131415161718192021P1（短穗）42124857P2（长穗）311121526151072101F111212141794\n69F211019264773686839251591401    质量性状和数量性状的划分也不是绝对的。因为区分性状的方法不同，或者由于观察层次的不同，质量性状与数量性状也是可能相互转化的。例如，植株高度是一个数量性状，但在有些杂交组合中，高和矮却表现为简单的质量性状遗传。小麦子粒的红色与白色，在一些杂交组合中表现为一对基因的分离，而在有些组合中表现为连续变异，即具有数量性状的特征。第二节研究数量性状的基本统计方法    对数量性状的研究，一般是采用一定的度量单位进行测量，然后进行统计学的分析。最常用的统计参数是：平均数（mean），方差（variance），标准差(standarddeviation)。先介绍这几个统计参数的计算方法。    一.平均数　表示一组资料的集中性，是某一性状全部观察值的平均值。通常应用的平均数是算术平均数.x=(x1+x2+x3+……+xn)/n=∑x/nx：平均数。X表示每个实际观察值。∑表示累加。N表示观察的总个体数。例如上例中对短穗亲本共测量了57个果穗，就得到57个观察值。其中5cm的4个，6cm的21个，7cm的24个，8cm的8个。X=(5×4+6×21+7×21+8×8)/57=6.632(cm)    二.方差和标准差方差又称变量，表示一组资料的分散程度或离中性。方差的平方根值就是标准差。方差和标准差是全部观察值偏离平均数的重要度量参数。方差愈大，也说明平均数的代表性愈小。    计算方差的方法是先求出全部资料中每一个观察值与平均数的离差的平方的总和，再除以观察值个数。V=∑(x-x)2/norv=∑(x-x)2/(n-1)观察值个数又称为样本容量。当样本容量n＞30时，称为大样本，当n＜30时，称为小样本。小样本时，用n-1代替n.这种计算方法比较烦琐，尤其不利于使用计算器或计算机。用下列公式可以简便一些：v=(∑x2-1/n(∑x)2)/nor(n-1)标准差s=V1/2第三节遗传率的估算及其应用    一、遗传率的概念    具有相对性状的两个亲本杂交，后代的性状分离取决于两方面的因素，一是基因的分离，一是环境条件的影响。所以，表现型是基因型和环境条件共同作用的结果。某性状的表现型数值，称为表现型值，以P表示。其中有基因型所决定的部分，称为基因型值，以G表示。表现型值与基因型值之差就是环境条件引起的变异，以E表示。P=G+E现以P﹑G﹑E表示三者的平均数，则各项的方差可以推算如下.\n∑(P-P)2=∑〔(G＋E)－(G＋E)〕2=Σ(G－G)2＋Σ(E－E)2＋2Σ(G－G)(E－E)∑(P-P)2是表现型的离均差平方和，∑(G-G)2是基因型造成的离均差方和，是环境影响产生的离均差平方和，Σ(G－G)(E－E)表示基因型与环境条件的互作效应。若基因型与环境之间没有互作，即∑(G-G)(E-E)=0则∑(P-P)2=∑(G-G)2+∑(E-E)2各项都除以n，得∑(P-P)2/n=∑(G-G)2/n+∑(E-E)2/n也就是VP=VG+VEVP﹑VG﹑VE分别表示表现型方差（总方差），基因型方差（遗传方差）和环境方差。上式表明，表现型方差包括由遗传作用引起的方差和由环境影响引起的方差。其中遗传方差占总方差的比值，定义为广义遗传率。Hb2=遗传方差/总方差×100%=VG/(VG+VE)×100%遗传力是衡量遗传因素和环境条件对所研究的性状的表型总变异所起作用的相对重要性的数值。所以，遗传力又称为遗传决定度（degreeofgeneticdetermination）。    假如某性状的遗传率为70%，表示在后代的总变异（总方差）中，70%是由基因型的差异造成的，另外30%是由环境条件的影响所造成的。若Hb2=20%，则说明，环境条件对该性状的影响占80%，而遗传因素所起的作用很小。假如在这样的群体中选择，效果一定很差，这是可以想见的。所以，遗传率大的性状，选择效果就好，反之，遗传力小的性状，选择效果就小。从基因作用来分析，基因型方差（即遗传方差）又可分解为三个部分：加性方差（VA）,显性方差（VD）和上位性方差（VI）    基因加性方差是指同一座位上等位基因间和不同座位上的非等位基因间的累加作用引起的变异量，如前例中，含3个R的个体比含2个R的个体的子粒颜色深。显性方差是指同一座位上等位基因间相互作用引起的变异量，上位性方差是指非等位基因间的相互作用引起的变异量。显性方差和上位方差又统称为非加性的遗传方差。因此：VG=VA+VD+VIVP=VA+VD+VI+VE加性方差只和基因有关，而和基因型无关，比如，R1r1R2r2、R1R1r2r2、r1r1R2R2三种基因型是等效的。而显性方差、上位性方差直接与基因型有关，R1R1r2r2、r1r1R2R2和R1r1R2r2的效应是不同的。我们又知道，亲代传递给子代的是基因，而不是基因型，基因在上下代之间是连续的不变的，而基因型在上下代之间是不连续的。因此，由基因的加性效应所引起的遗传变异量是可以通过选择在后代中被固定下来的，而显性效应、上位性效应引起的变异将会在下一代因基因的重新组合而消失，一是不能被固定的。我们定义基因加性方差占总方差的比值为狭义遗传力Hn2.Hn2=基因加性方差/总方差×100%=VA/VP×100%=VA/(VA+VD+VI+VE)×100%理论上，在同一个试验中Hn2一定小于Hb2。\n狭义遗传力才真正表示以表现型值作为选择指标的可靠性程度。依次，狭义遗传力又称为育种值方差。二．广义遗传力的估算方法Hb2=VG/(VG+VE)×100%=VG/VP×100%=(VP-VE)/VP×100%VP是可以从表现型值P计算获得的，而VG是不能直接测得的，但知道了VP，若能得到VE，则也就有了VG。因此，估计环境方差就成了估算广义遗传力的关键了。对于任何一个性状，在基因型一致的群体中，个体间的差异，都是由环境条件的影响所造成的。    两个纯合亲本所得到F1群体，各个体的遗传组成（基因型）在理论上是一致的，基因型方差等于0，其表型方差完全是环境条件的影响所致。即VF1=VE假如F1和F2生长在相同的环境条件下，且对环境条件有相似的反应，也就是说基因型与环境没有互作，可以认为二者的环境方差是相同的。F2的表现型方差是基因型方差和环境方差之和，从VF1（VP）中减去F1的方差VF1就可以得到F2的基因型方差（VG）。Hb2=VG/VP×100%=（VF2–VF1）/VF2×100%前例玉米穗长试验的结果中，VF1=2.307，VF2=5.072，那么，在该组合中，穗长的广义遗传率为：Hb2=（5.072-2.307）/5.072×100%=54%表明，在该杂交组合中，F2穗长的变异大约有54%是由于遗传差异造成的，46%是环境影响造成的。    在理论上，自花授粉作物亲本品种的基因型都是纯合一致的，不应该有基因型方差，个体间的表现型差异也是完全因环境条件的影响造成的，因此，也可以用生长在同一条件下的亲本品种的表现型方差来估计分离世代的环境方差。VE=1/2(VP1+VP2)or1/3(VP1+VP2+VF1)三．狭义遗传力的估算方法    狭义遗传力的估算要从基因效应的分析着手。设一对基因（A、a）构成三种基因型AA、Aa、aa，其相应的理论表型值为a、d及-a图中的0点为两亲本的中间值，即中亲值（mid-parentvalue）,〔a＋(-a)〕/2=0a：相对于中亲值而言的基因加性效应值（理论值），增效为正，减效为负；d:表示由显性效应所引起的与中亲值的偏差，即显性偏差。当d=0时，不存在显性偏差，说明A-a这对基因为加性效应；当d＜a时，即偏向与AA或aa一方，表示A-a为部分现象；当d=a时，A-a为完全显性；当d＞a时，A-a为超显性。基因A-a在F2的分离比例1/4AA：1/2Aa:1/4aa，平均理论值x=1/4(a)+1/2(d)+1/4(-a)=1/2dF2的遗传方差可计算如下：F2的基因型理论值及遗传方差的估算FxfxFx2AA1/4a1//4a1/4a2Aa1/2d1/2d1/2d2aa1/4-a-1/4a1/4a2合计n=1∑fx=1/2d∑fx2=1/2a2+1/2d2f为各基因型的频率，总和n=1，x为理论值，实际计算中用试验观察值替代。VF2=∑fx2－(∑fx)2/n\n=1/2a2＋1/2d2－(1/2d)2=1/2a2＋1/4d2如果这一性状受R对基因控制，并假定作用相等，且效应累加，又假定他们相互之间没有连锁，也不存在相互作用，那么F2的遗传方差为VgF2=1/2(a12＋a22＋……＋ak2)＋1/4(d12＋d22＋……＋dk2)=1/2∑a2＋1/4∑d2∑a2为基因的加性效应，即前述的VA，∑d2为基因的显性效应，即前述的VD，则VgF2=1/2VA+1/4VDF2的总方差内还应包括环境条件影响的方差（VE），若基因效应和环境影响相互独立，没有互作，则F2群体的总方差应该是：VF2=1/2VA+1/4VD+VE在杂交组合AA×aa中，令AA为P1，aa为P2，F1(Aa)与AA回交的子代为B1，Aa与aa回交的子代为B2Aa×AAAa×aa↓↓B11/2Aa:1/2AAB21/2Aa:1/2aaB1群体的遗传组成是1/2Aa+1/2AA;B2群体的遗传组成是1/2Aa+1/2aa,B1的平均基因型理论值及遗传方差的估算fxfxfx2AA1/2a1/2a1/2a2Aa1/2d1/2d1/2d2∑n=11/2(a+d)1/2(a2+d2)B1的平均基因型理论值x=1/2(a+d)B1的遗传方差Vgb1=1/2(a2+d2)－1/4(a+d)2=1/2(a2+d2)－1/4(a2+2ad+d2)=1/4(a2-2ad+d2)=1/4a2-1/2ad+1/4d2B2的平均基因型理论值及遗传方差的估算fxfxfx2Aa1/2d1/2d1/2d2aa1/2-a-1/2a1/2a2∑n=11/2(d-a)1/2(a2+d2)B2的平均基因型理论值x=1/2(d-a)B2的遗传方差Fx2-(fx)2=1/2(a2+d2)-〔1/2(d-a)〕2=1/2(a2+d2)-1/4(a2-2ad+d2)=1/4a2+1/2ad+1/4d2B1和B2的方差中，都有1/2ad这一项，这一项中a和d不能分开，但B1和B2中的ad项的符号相反，若将B1和B2的遗传方差合并，则ad不能分割的问题就解决了。Vgb1+Vgb2=1/4a2-1/2ad+1/4d2+1/4a2+1/2ad+1/4d2=1/2a2+1/2d2\n=1/2(a2+d2)若控制某一性状的基因有许多对，且不连锁，无互作，则∑a2=VA,∑d2=VD则VB1+VB2=1/2VA+1/2VD+2VE2VF2-(VB1+VB2)=2(1/2VA+1/4VD+VE)－(1/2VA+1/2VD+2VE)=1/2VA1/2VA正好是F2群体中加性方差的理论值。根据狭义遗传力的定义，有hn2=加性方差/总方差×100%=1/2VA/（1/2VA+1/4VD+VE）×100%=〔2VF2-(VB1+VB2)〕/VF2×100%用这种方法估计hn2有以下几个优点：    1、方法简便。只要根据F2及两个回交子代的表现型方差，就可以估计出群体的狭义遗传力，不需要用不分离的群体估计环境方差。    2、特别适用于异花授粉作物。缺点：    1．回交要增加工作量。    2．当控制性状的基因之间存在连锁和有互作时，可能使狭义遗传力估计值偏大，甚至大于广义遗传力。    3．仍不能分拆上位性方差。    遗传率是一个统计学概念，是针对群体的而不适用用于个体。例如人类身高的遗传率是0.5（50%），并不是说某一个人的身高一半是由遗传控制的，另一半是由环境决定的，而只是说，在人群中，身高的总变异中，1/2与遗传差异有关，1/2与环境的差异有关，或者说，群体中各个人身高的变异，50%是由其个体间的遗传差异造成的。遗传力是对特定群体特定性状而言的，是某一群体的遗传变异和环境变异在表现变异中所占的相对比例，所以，若遗传基础改变了，或环境条件改变了，遗传力自然也随之改变。估算同一群体在两个不同环境中的遗传力或者测定两个群体在同一环境中的遗传力，或者同一群体的两个不同的性状的遗传力，其结果都是不同的。计算实例见教材P98四、遗传力在育种上的应用    某一性状的表现（表现型）是基因型和环境共同作用的结果，但对某一具体性状而言，了解它的遗传作用和环境影响在其表现中各占多大的比重，对于育种家关系极大。    一般地说，遗传率高的性状，容易选择，遗传率低的性状，选择的效果较小。遗传率在育种上的应用，有以下几条规律：遗传率高的性状，在杂种的早期世代选择，收效较好。而遗传率较低的性状，则应在杂种后期世代选择才能收到较好的效果。     相关选择。有些性状，尤其是产量等经济性状都是典型的数量性状，且遗传率很低，但是若这些性状与某些遗传率高的简单性状密切相关，可以用这些简单性状作为指标进行间接选择，以提高选择的效果。如大豆产量的遗率很低，而子粒重，开花期的遗传率较高，且与产量之间的有很高的相关系数，因此可以通过选择子粒重、开花期而达到对产量的选择目的。 \ncopyright©2005-2006天津农学院农学系遗传教研室版权所有e农网站设计制作地址：天津农学院农学系email:zl1952@yahoo.com.cnTel:022-23789376第十三章遗传与进化   遗传学所研究的是生物遗传和变异的规律和机理，进化论所研究的是生物物种的起源和演变过程。                   第一节进化理论    生物进化的理论，细分起很多，但归结为三个，一个是拉马克的获得性状遗传学说，另一个是达尔文的自然选择学说，再有1968年日本木村资提出的中性学说。1、拉马克的获得性遗传学说    拉马克认为生物的种不是恒定的类群，而是由以前存在的种衍生而来的。他看到，在生物的个体发育中，因为环境不同，生物个体有相应的变异而跟环境相适应。例如年幼的树木在密密的森林里，为了争取阳光，就长得高高的。鸟类善于飞翔，胸肌就发达了，他在1802年提出用进废退学说或获得性状遗传学说。这个学说的主要论点：①生物生长的环境，使它产生某些要求。②生物改变旧的器官，或产生新的痕迹器官，以适应这此致要求。③继续使用这此些器官，使这些器官的体积增大，功能增进，但不用时可以退化或消失。④环境引起的性状改变是会遗传的，从而把这些改变了的性状传递给下一代。2、达尔文的自然选择学说主要论点是：①生物个体是有变异的，就是每个个体都不同。如人的面貌。野生动植物的个体差异。②生物个体一的变异，至少有一部分是由于遗传上的差异。个体差异=基因型\n+环境③生物体的繁育潜力一般总是大大地超过它们的繁育率。例如，一条鲱鱼产卵30万粒，一株烟草约结种子36万粒，而实际能发育的是很小的一部分，许多都有不能发育，如受不利条件，天敌等，达尔文称之为生存斗争。④个体一的性状不同，个体对环境的适应能力和程度有差别，这些不同和差别至少有一部分是由于遗传性差异造成的，因此遗传性不同的个体，它们本身的生存机会不同，留下后代的数目有多有少，这个事实叫“繁殖差别”⑤适合度（一个生物能生存并把它的基因传给下代的相对能力）高的个体留下较多的后代，适合度代的个体留下较少的后代，而适合试的差异至少一部分是由遗传差异决定，这样一代一代下去，群体的遗传组成自然而然地趋向更高的适合度。这个过程叫做自然选择。但环境条件不能永久保持不变，因此生物的适就生总是相对的。生物体不断地遇到新的环境条件，自然选择不断地使群体的遗传组成作相应的变化，建立新的适应关系，这就是生物进化中最基本的过程。⑥地球表面上生物居住的环境是多种多样的，生物适应环境的方式也是多种多样的，所以通过多种多样的自然选择过程，就形成了生物界的众多种类。⑦生物界通过自然选择而得到多种新的性状，其中有些性状或性状组合特别有发展前途，是生物适应方式的基本革新。如种子生殖，体温调节机制等。3、中性学说   中性学说又叫中性突变随机漂变学说。1968年日本木村资生发表一篇“分子水平的进化速率”的论文，提出了中性学说。翌年，美国科学家J.King和T.Jukes发表了“非达尔文主义进化”一文，他们支持木村的中性学说。这个学说是根据核酸、蛋白质中的核苷酸、氨基酸的置换速率，以及这样的置换造成核酸、蛋白质改变并不能影响生物大分子功能的事实，提出“中性突变”的概念。他们认为进化是“中性突变”在自然群体中进行随机的遗传漂变的结果，这个学说对以自然选择为基础的达尔文主义进化论提出了新的挑战。这个学说的要点如下：①突变大半是“中性”的，这种突变不影响核酸，蛋白质的功能，对个体生存既没有什么害处也没有什么好处，选择对它们没有作用。中性突变如同同义突变，同功能突变（蛋白质存在多种类型，如同功酶），非功能性突变（没有功能的DNA顺序发生突变，如高度重复序列中的核苷酸置换和基因间的DNA序列的置换）。这些中性突变由于没有选择的压力，它们在基因库里漂动，通过随机遗传漂移在群体中固定下来。②分子进化的主角是中性突变而不是有利突变，中性突变率，也就是核苷酸和氨基酸的代换率是恒定的。细胞色素C中氨基酸的代换率在各种生物中也差不多是相同的，所以蛋白质的进化表现与时间呈直线关系。可根据不同物种同一蛋白质分子的差别，估计物种进化的历史，推测生物的系统发育。这和化石以及其它来源推导出的进化关系是相符的。还可根据恒定的蛋白质中氨基酸的化换速率，对不同系统发育事件的实际年代作出大致的估计，即所谓进化的分子钟。③中性突变的进化是通过遗传漂移来进行的，遗传漂移使中性突变在群体中依靠机会自由组合，并在群体中传播，从而推动物种进化，所以生物进化是偶然的，随机的。④中性突变分子进化是由分子本身的突变率来决定的，不是由选择压力造成的，所以分子进化与环境无关。中性学说是在研究分子进化的基础上提出来的，用随机出现的中性突变，能很好地说明核酸蛋白质等大分子的非适应性的多态性，认为根据核酸，蛋白质分子一级结构上的变化就可说明生物性状的所有变异，进而说明进化原因，它否定了自然选择在进化过程中的作用。4、突变为进化提供原材料    遗伟的变异主要有两个来源：一个是突变，包括基因的突变和染色体的畸变；二是不同基因的重新组合。但突变是更加基本的，因为如果没有突变而成为不同的等位基因，那就谈不到任何重组合，所以突变是最初始的原材料。有极少数的突变是有利的，可以作为进化的原材料。突变的有利与否，随所处环境而异。    基因频率是指某群体中，某一等位基因在该位点上可能出现的基因总数中所占的比率。任何一个位点上的全部等位基因频率之和必定等于1或100%。假定设有红轴玉米品种和白轴玉米品种。前者是显性基因P，后者是隐性基因p控制的，两者的比例是1：1，则各自的频率是50%或0.5。一个群体中，不同基因型所占的比率就是基因型频率。例如，上述玉米的基因型可能有三种：PP：Pp:pp，某一基因型频率就是它在全部个体中的比率或百分率。如果我们发现一个群体中有1/4属于PP，有1/4属于pp，有2/4Pp，则可以说PP和pp基因型频率各为25%，而Pp为50%，全部基因型的总合为1或100%。根据上述定义，如果知道了基因型频繁率，可计算某一特定位点的基因频率用符号表示：基因基因型频率AaAAAaaapqDHR由此p+q=1D+H+R=1    今设一对同源染色体某一位点上有一对基因A及a，则接上式由这三种基因型构成的群体共有总个体数N，则：D`+H`+R`=N`N个体共有2N个基因，其中A有2D`+H，a有H`+2R`，因此，基因A及a的频率分别为：P=1/2（2P+H）∴P=P+1/2Hq=1/2(2q+H)∴q=q+1/2H如果用基因型频率来计算时，即：\nD=D`/N，H=H`/N，R=R`/N。则基因频率P和Q可改写为：P=D+1/2H，q=1/2H+R例如：设由一对基因A、a构成的群体，它们的三种基因型可从表现型区别出来，它们的个体数是：AA（D`）2Aa(H`)12aa(R`)26总数40按（1）式可以求出：基因A的频率P=0.20,Q=0.80同理，按（2）式可以求出结果相同。2、孟德尔氏种群    所谓孟德尔式种群是指一群相互杂交的个体所组成的群体。种群或群体一词在遗传上通常多应用于有性繁殖，并经常异交的那些生物群体。这里所说的异交就是群体内不同基因之间的杂交。在这样的群体里虽然是研究许多基因在群体中的遗传，但它仍以孟德尔氏遗传定律为基础，是孟德尔氏遗传学的发展，因此称为孟德尔氏种群。在种群内，诸个体间的交配是随机的。也就是说，群体中的每一个体都有有同等的交配机会。    完全无性繁殖的生物体不发生孟德尔氏的分离现象，结果形成无性繁殖系或无性繁殖系群。其基因的分配规律就不能用孟德尔氏方法进行研究和鉴别。自交的植物和动物通常驻不发生基因交换，这些纯系也不能称作孟德尔种群。3、哈德—魏伯格定律    Hardy(英国数学家）—Weinbeg（德国医生）定律即遗传平衡或基因平衡定律。它是指在一个大的随机交配的群体里，基因频率和基因型频率在没有迁移、突变和选择的条件下，世代相传不发生变化。并且基因型频率是由基因频率决定的，该定律是在1908年分别由Hardy和Weinberg首先提出来的。所以称为Hardy—Weinberg定律。Hardy—Weinberg定律的主要含义是在一个随机交配的种群中，基因频率和基因型频率代代相传保持恒定。它的推导包括三个步骤：①从亲本到它们所产生的配子；②从配子的结合到产生合子的基因型；③从合子的基因型到子代的基因型；3、1、基因频率的恒定    假设在亲本产生的精子与卵子中，基因A与a的频率各为P和q，它们结合产生的合子其基因型将如下：♂♀PAqaPAAAAaqaAaaa再由合子的基因型到子代中的基因频率将是：P2AA：2pqAa:q2aa亦即：P2AA+2PqAa+q2aa=1此即Hardy-Weinberg公式，这一代的配子将是：A=P2+1/2（2pq)=p2+pq∵p+q=1∴P2+pq=p(p+q)=p同理：a=q2+1/2(2pq)=q2+pq=q由此可见，这一代基因A的频率仍然是P，基因a的频率仍然是q，而且将以这种频率在所有世代传递下去，这就是遗传平衡。    例如，已知兔子的脂肪有白色和淡黄色两种，这是一对相对性状，有显隐性关系。在一个群体中，如有60%兔子有白色脂肪，基因型是AA，另有40%兔子有黄色脂肪，基因型是Aa，则p+q=100%,在这个随机交配的群体中，精卵结合其合子基因型如下：♂♀P(A)=0.8q(a)=0.2P(A)=0.8AA0.64Aa0.16q(a)=0.2Aa0.16A0.04\n在随机交配的下一代群体中，（ＡＡ）个体的频率是P2（Aa）个体的频率是2pq，(aa)个体的频率是q2。要证明下一代P2（AA）+2pq(Aa)+q2(aa)中的p和q的比值仍是0.8和0.2保持世代稳定不变，从这一代群体中基因频率的变化即可看出。在这一代A配子的比例应为：P2+1/2(2pq)=P2+pq=0.64+0.16=0.8同理，a配子的比例应为：q2+1/2(2pq)=q2+pq=0.04+0.16=0.2可见A与a的频率仍与亲本相同，并未产生变化。依此类推，以后各代仍然保持恒定。因此，一对等位基因代代相传的遗传平衡公式可概括为：P2+2pq+q2=1这个公式的含义是：在一个大的自由交配的群体里，一对等位基因所决定的单位性状，在没有迁移、突变和选择的条件下，基因频率p和q以及基因型频率D、H、R在世代相传时不产生变代。整个群体的基因和基因型频率的总和等于1。3、2基因型频率的恒定由于基因频率代代相传保持恒定，而基因型频率又由基因频率决定，所以基因型频率同样保持代代恒定。归纳后代基因型频率得：(D+1/2H)2+2(D+1/2H)(R+1/2H)+(R+1/2H)2仍和上代相同保持平衡不变。4、复等位基因的遗传平衡    遗传平衡的公式同样可用于复等位基因的遗传，只是各种基因频率的计算要比一对等位基因稍微复杂些，下面以人的ABC血型为例说明之。设：p=基因A的频率q=基因B的频率r=基因O的频率则p+q+r=1在自由婚配的情况下，后代的基因型频率应为：♂♀P(A)q(a)r(O)P(A)P2PqPrq(a)Pqq2qrr(O)Prqrr2其平衡公式是：p2+q2+r2+2pq+2pr+2qr=1又设A、B、AB、O为各血型的表现型频率，则有A=p2+2pr.B=q2+2qrAB=2pqO=r2很明显，基因O的频率等于O血型频率的平方根。即：r=√OA血型频率与O血型频率之和等于基因A频率与基因O频率之和的平方。即：A+O=p2+2pr+r2=(p+r)2√A+O=p+r∴p+q+r=1又p+r=1－q∴1－q=√A+O∵q=1－√A+O同理p=1－√B+O5、基因频率的分析     根据遗传平衡公式对群体进行基因频率的分析。在人类的群体遗传研究中是非常有用的。如果知道群体中隐性纯合体的比率。则基它基因和基因型频率即可推算出来，从而预测在群体事某基因存在的频率和有关特性的表现。例如，在小孩中有一种幼年失明痴呆病患者，它是由一对隐性基因纯合而致病的。假定它的频率为0.000038，根据这个数值可以计算群体中正常基因纯合体和杂合体在群体事所占的比例。∵q=20.000038∴q2=√0.000038=0.0062则：p=1－q=1－0.0062=0.9938基因型频率可计算为：p2=(0.9938)2=0.98762pq=2×0.9938×0.0062=0.0123(致病杂合体）0.0123÷0.000038=323.68由计算可知携带致病基因的杂合体比患者多三百多倍。\n根据基因频率的分析，还可以检验某性状是否处于遗传平衡。例如，M—N血型是由两个等位基因M和N控制的。现从人群中抽样420人进行M—N血型分析；发现137人是M血型；196人是MN血型；87人是N血型。设M基因频率=p、N基因频率=q则p=2D`+H`/2N`=2×137+196/2×420=0.56q=H`+2R`/2N`=2×87+196/2×420=0.44由此，可计算基因型频率：MM=p2=(0.56)2=0.314;MN=2pq=2×0.56×0.44=0.493;NN=q2=(0.44)2=0.194把计算得到的基因型频率乘以总人数，即得到预期数。然后与实测数进行比较，进行X2检验。MMMNNN实得人数13719687预期人数13220781差数5-116d2/e0.190.580.44计算结果，得X2=1.21，p=20%—30%。表明三个基因型频率符合遗传平衡。（这里X2的自由度是1，因为在计算预期值时要应用一个基因频率p和q，这是从实际数估算出来的，因此自由度应为3—2=1）1954年Race和Sanger曾作过一组ABO血型复等位基因的基因频率分析。在190177人所组成的一个血型频率样品中，O血型88783人，A血型79334人，根据基因平衡公式可知：O=88783÷190177=0.4668A=79334÷190177=0.4172已知O基因频率r=√O=√0.4668=0.6932又p+r=√A+O∴p=√A+O－r=√0.4172+0.4668－0.6832=0.2570(A的基因频率)。p+q+r=1,∴q=1－(p+r);q=1－(0.6832+0.2570)=0.0598(B的基因频率）求表型频率，因为B=q2+2qr∴B=(0.0598)2+2×0.0598×0.6832=.08532又AB=2pq∴AB=2×0.2570×0.0598=0.0307由计算得出血型的基因频率和表现型频率为：P=0.2570q=0.0598r=0.6832表型：A=0.4172B=0.0853O=0.4668AB=0.0307而基因型频率为：AA=P2=(0.2570)2=0.06605BB=q2=(0.0598)2=0.0036OO=r2=(0.6832)2=0.4668AO=2Pr=2×0.2570×0.6832=0.3511BO=2qr=2×0.0598×0.6832=0.0817AB=2pq=2×0.2570×0.0598=0.0307则相加≈1以上根据基因平衡公式推导的理论预期数，经X2验与实际数值相符合。根据上述，归纳遗传平衡的要点如下：⑴在随机交配的大群体中，如果没有突变，自然选择、迁移、遗传漂移等因素的干扰，则各代基因频率保持平衡不变。⑵在任何一个大群体内，不认其基因频率和基因型频率如何，只要一代的随机交配，这个群体就可达到平衡。\n⑶一个群体在平衡状态时，基因频率和基因型频率的关系是：D=p2、H=2pq、R=q2。    实际上，自然界许多群体都有是很大的，个体间的交配一般也是接近于随机的，所以哈德—魏伯格定律基本上普遍适用。它已成为分析自然群体的基础，对人类群体也是适用的。    遗传平衡定律在群体遗传学中是很重要的，它揭示基困频率和基因型频率的规律。由于这一规律，一个群体的遗传特性才能保持相对的稳定。生物遗传特性的变异是由基因和基因型的差异引起的，这样就影响到基因频率和基因型频率的差异。但是在群体内各个个体间如果进行随机交配，那么将保持平衡，而不发生改变。即使由于突变、选择和迁移及杂交等因素改变了群体的基因频率和基因型频率，只要这些因素不继续产生作用，而进行随仙交配，则这个群体仍将保持平衡。但是，群体平衡是有条件的，尤其在人工控制下通过选择，杂交或人工引变等途径，就可以打破这种平衡，促使生物个体发生变异因而群体的遗传特性也会随之改变。动植物育种的目的就是在于打破群体中的固有基因频率和基因型频率，使之建立新的遗传平衡            第三节影响群体平衡的因素    群体的遗传平衡是相对的、有条件的。前面关于哈迪－温伯格定律的讨论，是假定影响基因频率的因素不存在的情况下进行的。实际上，自然界的条件千变万化，任何一个群体都在不同程度上受到各种影响群体平衡因素的干扰，而使群体遗传结构不断变化。研究这些因素对群体遗传组成的作用，具有十分重要的理论与实践意义，这不仅在于解释生物进化的原因，而且还因为在育种过程中，实际上是通过运用这些因素来改变群体遗传组成，而育出符合人类需要的新品种群体。所以从这个角度看，可以认为，所谓育种无非是人为地运用各种影响群体平衡的因素，以控制群体遗传组成的发展方向，从而获得优良品种的过程。影响群体平衡的主要因素包括：突变、选择、迁移、遗传漂移和交配系统。一、突变    基因突变(mutation)对于群体遗传组成的改变具有两个重要的作用：首先，基因突变本身就改变了基因频率，是改变群体遗传结构的力量。例如，当基因A突变为a时，群体中A基因的频率就减少，而a基因的频率就增加；其次，基因突变是新等位基因的直接来源，从而导致群体内遗传变异的增加，并为自然选择和物种进化提供物质基础。没有突变，选择即无从发生作用。当突变和选择的方向一致时，基因频率改变的速度就变得更快。虽然大多数突变是有害的，但也有一些突变对育种是有利的，如控制矮秆和某些抗病基因。突变可分为如下三种情形：（一）非频发突变    非频发突变指的是仅偶尔发生一次而不能以一定频率反复发生的独一无二的突变。这种突变在大群体内长期保留的机会很微小，因而，不大可能对群体的基因频率有什么影响。假定在AA纯合群体内发生一次A→a的突变，则群体内只有一个Aa个体。该杂合子Aa只能与其他AA个体交配。如果该个体不能产生后代，则新基因a丢失的机会是1；如果杂合子Aa只能产生一个后代，则该后代基因型是AA或Aa的可能性各占0.5，亦即a基因丢失的概率为0.5。如果该杂合子Aa产生两个后代，则a基因丢失的机率是0.25。依此类推，若Aa个体能产生k个后代，则a基因丢失的概率是：。a基因丢失的概率取决于Aa×AA所产生的个体数。后代数越多，a基因保存的机会越多。然而每传递一代突变的a基因都有丢失的可能，传递代数越多，丢失的总概率越大。所以，除非突变基因有特殊的生存价值(突变体生活率、对环境的适应性和繁殖力等)，或育种者在它出现后能及时正确地识别并选择它，否则很难在群体内长期保留。如果实际的生物群体并不大，独一无二的突变基因在这种群体内可能长期保存，再加上随机漂移的作用，最终可能导致群体基因频率的变化。（二）频发突变    以一定的频率反复发生的突变叫频发突变。由于这种突变能够反复发生，突变基因得以在群体内维持一定的基因频率，从而成为引起群体基因频率改变的重要因素之一。\n    假定A基因以固定的频率u突变为a基因。则每经一代之后，a基因的频率就会增加u×p(其中p为上代A基因的频率)，因此a基因的频率越来越大，而A基因频率越来越小，也就是说a基因的数目逐渐增加，而A基因的数目逐渐减少。突变使群体的遗传结构逐代发生变化，这种作用称为突变压(mutationpressure)。如果没有其它因素的阻碍，最后a基因将可能完全取代A基因，则这个群体最后将达到纯合性(homozygosis)的a。设基因A在某一世代的频率为p0，则在经过n代之后，它的频率pn将是：pn=p0(1-u)n   因为大多数基因的突变率是很小的(～)，因此只靠突变压而使基因频率发生显著改变，就需要经过很多很多世代；不过有些生物的世代是很短的，因而突变压就可能成为改变群体遗传结构的重要因素。（三）回复突变   一个等位基因可以突变为其相对的另一个等位基因，反之另一个等位基因也可以突变为原来的基因，这种突变叫回复突变。由A变为a叫正向突变，其突变率为u，反之由a变为A称为反突变，其频率为v。当然，这两个方向的突变率不一定相等。对这种回复突变可用下图表示：puＡａqv如果起始群体中A基因频率为p0，a基因为q0，则由A突变为a的基因比率为p0u，反突变由a变成A的基因比率为q0v。当p0u＞q0v时，a频率增加；当p0u＜q0v时，a频率减少。如果正、反突变的频率不变，则基因突变的结果又反过来影响基因突变的比率p0u和q0v的值，到某一世代，当u=v时，两基因频率不再变化，即达到平衡，因这时u=v(1-)u=v于是有qn=同理可得＝可见在平衡状态下，基因频率与原基因频率无关，仅取决于正反突变频率u和v的大小。如果一对等位基因的正反突变频率相等(u=v)，则达到平衡时的基因频率和的值都是0.5。二、选择    选择(selection)有自然选择和人工选择，两个都是改变基因频率的重要因素。个体间遗传基础的差异是选择的基础。达尔文指出，自然界中生物的适者生存，不适者淘汰的过程就是自然选择的过程。由于不同基因型很可能在育性、生活率或其他方面不同，也即是在某些内在条件或外界因素的作用下，使不同的基因型产生的后代数目不同，从而导致一些基因型频率逐代增高，另一些逐代降低，这就是自然选择作用的实质。人工选择是在人为的干预下，按人类的要求对生物加以选择的过程，也即把某些合乎人类要求的性状保留下来，使其基因频率逐代增大，从而使群体遗传结构朝着一定方向改变。    生物体育性和生活率的差异可以用适应度(W)表示。特定基因型的适应度可用具有该基因型的个体所产生的平均后代个体数目表示。适应度的概念包含生活率和育性两个方面。生活率用达到繁育年龄的个体数占个体总数的比例表示；育性则用每个繁育个体的平均后代表示。一对亲本的后代数应该一半属于父本，另一半属于母本。例如，4个AA基因型的个体中有3个存活到繁育年龄，因此其生活率是；属于这3个繁育个体的后代共有6个个体，因而每个繁育个体的平均后代是；所以AA的适应度W1=×＝1.5。同理可算出其他基因型的适应度，比如Aa基因型的为W2=1.5，Aa基因型的为W3=0.5。以这种方式算得的适应度叫做绝对适应度。遗传学中习惯于应用两种基因型绝对适应度的比值，叫做相对适应度。如果上述基因型都以AA为标准，那么AA的相对适应度是1.5/1.5=1.0，Aa的是1.5/1.5=1.0，而aa的为\n0.5/1.5＝0.33。由于相对适应度应用范围很广，为方便起见，往往直接把它称为适应度。另外，为使选择的理论模型简单化，有时把适应度的含义等同于生活率的含义，而略去育性的作用。     选择系数是表示选择强度的参数，用s表示，并且s=1-W。它表示在选择的作用下降低的适应值，用以测量某一个基因型在群体中不利于生存的程度，0≤s≤。当s＝0，W=1，表示选择不改变适应值。当s=1时W＝0，表示选择使适应值完全消失，使该基因型100%不能繁育后代，例如对致死或不育基因纯合体的选择。现以一个位点上的两个等位基因的情况说明选择的作用。（一）选择使显性基因淘汰    隐性基因有利，在作物中也不少见。有些抗病性有利基因是隐性基因。例如玉米抗小斑病O小种的rhm基因。一些控制特殊品质性状的基因也为隐性，例如某些禾谷类作物的糯性(wxwx)，玉米的甜粒(susu)等等。此外某些控制雄性不育、矮秆等的基因也往往是隐性基因。因此在育种中为获得这些特性而进行选择时，显性基因是淘汰的对象。人工选择(或显性致死时的自然选择)下淘汰显性基因，只要一代就能把显性基因型的个体从群体中消灭，从而把显性基因的频率降低到0。    在自然选择状态下，如果不是显性致死而只是生活率和繁殖力有所降低，即纯合子aa的适应度最高，而AA和Aa都受到选择系数为s的选择压力，这样显性基因频率将会是逐代降低，在若干代后变为0。其作用情况如表14-10。当选择系数s〈1时，则是对于显性基因的不完全选择。选择一代后的基因频率可表示为：表14-10不利于显性个体的部分选择基因型AAAaaa总和初始频率2p0q01选择系数ss0适应度1-s1-s1选择后比率(1-s)2p0q0(1-s)1-s(1-)一代选择所引起的基因频率变化量是：△q=q1-q0=△这时△q是正值，说明选择结果是a基因频率逐渐增高。在s＝1.0时有：=1△q＝=p0即显性基因被淘汰掉了，只剩下隐性基因。（二）选择使隐性基因淘汰    大多数隐性基因都是有害的，因此无论是人工选择还是自然选择的作用，都趋于使这些不利的基因淘汰。在育种中如果希望通过选择来淘汰隐性不利基因，育种者需要了解选择对淘汰这些基因的效果如何，并以此作为制定选择计划的参考。人工选择淘汰隐性基因的速度比淘汰显性基因慢很多。设未进行选择时群体中隐性基因的频率为q0，三种基因型AA、Aa和aa的频率分别为D0、H0和R0，则q0=H0+R0；由于选择作用(s=1)使aa淘汰了，隐性基因只存在于杂合体中，并且只占杂合体基因数目的一半，故下一代隐性基因的频率为：同理可得，经过两个世代的选择淘汰后，隐性基因的频率为：在经过n个世代的选择淘汰后，隐性基因的频率将变为：\n    两个世代间隐性基因的频率改变量为：△q＝qn+1-qn=这时△q值随qn值的增大而增大。说明隐性基因频率改变的速度与其频率qn值有关，qn值越大，改变越快，qn值越小改变越慢，表明在完全淘汰隐性基因的选择时，隐性基因的频率越高，选择淘汰的效果就越好，但这种效果会随选择所进行的世代数目的增多而快速减慢。如果起始群体隐性基因频率q0=0.40，由于的选择作用淘汰隐性纯合体而使各世代隐性基因频率降低的结果如下：世代012345678910频率0.400.2860.2220.1820.1540.1330.1180.1050.0950.090.08由此可见，淘汰隐性基因的速度是比较缓慢的。由14-10式可得出需要隐性基因频率降低到某个值所需的世代数：n=如果起始群体隐性基因频率q0=0.40，如果要使隐性基因频率降低到0.01，则所需世代数为：n===97.5    即经过将近100代的选择，隐性基因的频率才能降低到0.01左右，这时R=0.0001，即在1万个个体中还有可能出现一个隐性性状个体。这也是群体中出现“返祖现象”的原因之一(另外也有可能是基因发生突变所致)。又例如欧洲人白化率为0.00005，假如通过完全选择措施要将其发生率减少一半，即为白化率为0.000025，需要多少世代？这时，0.00707，0.005n==59(代)    在自然选择状态下，如果不是隐性纯合致死而只是生活率和繁殖力有所降低，即纯合子aa受到的选择压力小于1，这样隐性基因频率逐代降低的速度更慢。若对aa基因型的选择系数为s，则aa基因型的适应值就不再是1，而是1-s，其选择作用如表表：针对隐性基因的选择作用基因型AAAaaa总和初始频率2p0q01选择系数00s适应度111-s选择后比率2p0q0(1-s)1-s经一代选择后，基因频率发生了变化：推广到任何连续两代之间的关系则有：并且pn+qn=1，pn+1+qn+1=1。由于1-s≤1，所以pn+1≥pn，说明选择作用的结果，增加了显性基因的频率，降低了隐性基因的频率。△q＝qn+1-qn=-qn=说明基因频率改变的速度取决于q和s值的大小。当s=0时，△q=0，基因频率不发生变化，群体处于平衡状态；当0＜s＜1时，△q＜0，表明选择的结果减少了隐性基因的频率。由(14-14)式可以证明，只有当q＝p＝0.5时，△q有最大值，表明这时选择淘汰基因最有为效。当s＝1时，aa全部淘汰，但基因依然保存于杂体Aa中。    从选择作用影响基因频率的效果来看，一般地可以得出两点结论：⑴基因频率接近0.5时，选择的效果最好；当频率大于或小于0.5时，选择效果降低很快；⑵隐性基因很少时，对一个隐性基因的选择或淘汰的有效度就非常低，因为此时隐性基因几乎完全存在于杂合体中而得到保护。当由于隐性基因频率较低而限制选择效果时，不应盲目地靠增加代数来达到选择目的，否则会造成人力物力的浪费。\n（三）选择淘汰纯合体   基因型是杂合的个体Aa，常常优于其纯合体AA和aa，这在自然界及育种中是常见的，而且有时很重要。当纯合个体的生存和繁殖能力都不如杂合个体时，杂合个体的适应值为1，两种纯合个体的适应值分别为1-s1和1-s2，纯合体AA和aa的选择系数s1和s2可以相等，也可以不相等。经过一代的选择作用后基因型频率的变化如表表14-12有利于杂合体的选择基因型AAAaaa总和起始群体2p0q01适应值1-s111-s2选择后(1-s1)2p0q0(1-s2)1-s1-s2由表可算得选择一代后频率的变化为：△q＝q1-q0=－q0＝由此可知，到某一世代，当s1-s2＝0或者说s1＝s2时，△q＝0，基因频率不再变化，处于平衡状态。由s1-s2＝0，s1-s2(1-)＝0得到：＝，＝说明在平衡状态下，基因频率完全由s1和s2决定，与原有基因频率无关。在纯合体不能生存的极端情况下，群体的基因型是单一的杂合体Aa，显性基因和隐性基因的频率相等，各为0.5。从以上三种情况讨论了选择对于改变群体基因频率的效应。在不同情况下选择效果不一样，选择效果与基因频率有关，应该注意所选择或淘汰的性状的频率。三、遗传漂移    群体达到和保持遗传平衡状态的重要条件之一是群体必须足够大，理论上说应该是无限大，以保证个体间进行随机交配和基因能够自由交流。但实际上任何一个具体的生物群体都不可能无限大，人工群体尤其如此。虽然有些植物群体可以很大，但因受地域隔离和花粉传播距离的限制，也很难实现真正意义的随机交配。因此，实际中的群体只能看成是来自某随机交配群体的一个随机样本，每世代从基因库中抽样以形成下一代个体的配子时就会产生较大的误差，这种由于抽样误差而引起的群体基因频率的偶然变化叫做遗传漂移(randomgeneticdrift)，也称为遗传漂变。    遗传漂移一般发生在小群体中。因为在一个大的群体里，个体间可进行随机交配，如果没有其它因素的干扰，群体能够保持哈迪-温伯格平衡。而在一个小群体里，即使无适应性变异等的发生，群体的基因频率也会发生改变，这是因为在一个小群体里，由于与其它群体相隔，个体不能进行真正意义上的随机交配，也即群体内基因不能达到完全自由分离和组合，基因频率就会容易发生偏差。一般地说，群体越小，遗传漂移的作用越大。    为方便起见，举一个最简单的例子。假定有一自花授粉的杂合基因型植株(Aa)，每代只成活、繁殖一株植株(即群体大小N＝1)。由于：Aa→AA+Aa+aa所以在自交一代是杂合型基因型(象亲本Aa)的概率是50％；是纯合基因型(AA或aa)的概率也是50％。在后一种情况下，A基因频率从亲代的0.5已改变到1(自交一代是AA时)或0(自交一代是aa时)；即由于随机抽样误差，A基因频率在群体中或者被固定达最大值或者被消除。如果群体足够大，其遵从哈迪－温伯格定律，是不会导致基因频率的变化的。    现讨论由于抽样误差引起基因频率变化的一般情况。基因频率变化的大小可用成数的标准差σ＝来计算。这里p是A基因的频率，q是a基因的频率，    2N是群体中基因总数。对二倍体来说，由于每个亲本携带两个等位基因，所以这里的N就是实际的亲代个体数。例如，原始群体中基因频率p=q=0.5，如果以后每个世代只保持5000个个体的群体，即有σ===0.005。\n    所以该群体的基因频率值大约有68％的可能在0.5±0.005即在0.495～0.505间变动。但若每代只保持5个个体，即σ＝=0.16。所以，该群体的基因频率约有68％的可能在0.5±0.16即在0.34～0.66间波动，有99％的可能在0.5±2.58×0.16即在0.09～0.90间波动。遗传漂移对基因频率的影响可能有三方面：    ⒈减少遗传变异。这是因为遗传漂移的结果，在小群体内打破原有的遗传平衡，即改变原有各种基因型频率，使纯合个体增加，杂合体数目减少，因而各小群体内个体间的相似程度增加，而遗传变异程度减少，甚至最终产生遗传固定，即群体是单一的纯合基因型，等位基因之一的频率为1，另一等位基因的频率为0。    ⒉由于纯合个体增加，杂合个体减少，群体繁殖逐代近交化，其结果是降低了杂种优势，降低了群体的适应性，群体逐代退化，对于异花授粉作物来说，降低了其在生产上的使用价值。    ⒊遗传漂移使大群体分成许多小群体（世系），各个小群体之间的差异逐渐变大，但在每一小群体内，个体间差异变小。    ⒋在生物进化过程中，遗传漂移的作用可能会将一些中性或不利的性状保留下来，而不会象大群体那样被自然选择所淘汰。    在作物的引种，选留种，分群建立品系或近交等，都可以引起遗传漂移，这是造成群体基因频率变化很重要的人为因素。在作物群体改良中，为了防止遗传漂移而引起的部分优良基因的丢失以及因遗传固定、纯合个体的增加而使群体杂种优势的降低，不能片面地只顾增大选择强度，同时还应保证足够大的有效群体含量。在种质保存中，同样也存在遗传漂移的影响。为保存一个综合品种或异花授粉作物的天然授粉品种，必需种植足够大的群体，否则经多年种植保存之后，因遗传漂移的影响，所保存的种质已不能代表原有的群体。四、迁移    群体间的个体移动或基因流动叫做迁移(migration)，是影响群体基因频率的一个因素。迁移实质上就是两个群体的混杂。这种个体或基因流动既可能是单向的，也可能是双向的，如是后者，又可叫做个体交流或基因交流。由于群体间个体或基因流动，必然会引起群体基因频率的改变。设在一个大的群体内，每代都有一部分个体新迁入，且迁入个体的比率为m，那么群体内原有个体比率则为1-m，总频率仍为1。设原来群体a基因频率为q0，迁入个体a基因频率为qm，那么迁入后第一代a基因频率为：q1＝mqm+(1－m)q0＝m(qm-q0)+q0当qm=q0时，q1＝q0，表明基因频率不变，当qm≠q0时，q1≠q0，前后两代频率的差异为：△q=q1-q0=m(qm－q0)可见迁移对群体基因频率的影响大小由迁入个体的比率m以及频率差(qm－q0)所决定。   了解迁移对改变群体基因频率的效应，在育种中也有一定的指导意义。在群体改良中，为了增大改良群体的遗传方差，或者向群体引入优良基因，通常采用与外来种质杂交的办法，在这种情况下就会发生因迁移而改变原有群体某些基因频率的效应。引种是单独引进一个群体，经试种后，直接用于生产或用作育种原始材料，就这地区而言，新种质引入的结果，必然改变了该地区群体的遗传组成。还有一种情况，是属于个别基因而不是整个个体迁入群体后，对群体遗传组成的影响，这是指一物种的基因引进到另一物种的基因库中的现象，称为种质渐渗。如玉米的起源就可能包括了大刍草的种质渐渗，即大刍草的某些基因引进到了玉米中，这增加了玉米的遗传变异水平和杂种优势。第四节物种的概念与形成方式一、物种的概念\n    物种(species)是自然界中实际存在的生物群体单位。但生物界中物种的划分不是通过条件（特征）集来进行逻辑分类所能完成，而是必须进行综合的分析。实际上给物种下一个在理论上合乎逻辑性、在实际应用上又方便有效的定义是极其困难的。对物种概念的定义有一个历史发展过程。早在17世纪，JohnRay(1868)就认为物种是一个繁殖单元。林奈(Linne,C.von，1750)进一步提出，物种是由形态相似的个体组成，同种个体间可自由交配，并能产生可育后代；而异种个体间则杂交不育。达尔文提出，种是显著的变种，是性状差异明显的个体类群。杜布赞斯基（Dobzhansky,Th.）认为，物种是享有一个共同基因库、能进行杂交的个体的最大的生殖群落。迈尔(Mayr,E.，1982)给物种下了一个定义：物种是由种群所组成的生殖单元（和其它单元在生殖上隔离着），它在自然界中占有一定的生境地位。陈世骧（1987）对此定义作了补充：物种在宗谱上代表一定的分支。尽管很多学者对物种的概念提出了各种各样的观点，但都忽视了营无性生殖的低等生物，这有待进一步研究和探讨。综合各学派的观点，物种的划分应综合考虑如下一个方面的内容：    (一)形态学标准主要根据生物体的形态特征方面的差异进行物种的划分。在分类学上这仍然是常用的标准。这种分类方法方便易行，但标准难以统一，因而会出现划分结果不一致现象。     (二)遗传学标准理论上是指以群体间的遗传组成方面的差异、染色体数目和结构方面的差异以及由遗传原因导致的生理生化方面的差异等作为标准，实际操作上是以能否进行杂交以及杂种后代有否繁殖能力作为标准，也即生殖隔离标准，这是区分不同物种的重要标准。这方面的标准已经发展到分子水平。凡能够进行杂交而且产生能生育的后代的个体或类群，就属于同一个物种；凡不能进行杂交，或者能够进行杂交但不能产生有生育能力的后代的个体或类群，则属于不同的物种。例如，水稻和玉米间不能进行杂交，所以它们分属于两个不同的物种。又如马和驴能够相互杂交而产生马骡和驴骡，但所得杂种均不能生育，所以马和驴也属于不同的物种。    (三)生态学标准物种是生态系统中的功能单位，不同物种占有不同的生态位，不同的物种有不同的生态习性。    (四)生物地理学标准不同物种的地理分布范围不同，有的分布区域很广阔，有的分布区域很狭窄；有的过去分布广，后来变狭窄了；有的则相反，过去分布很狭窄，后来变得宽阔了。    (五)宗谱分支和时间概念宗谱分支概念是从指分支系统学的角度来考察物种的分化形成和物种间的区分。从生物进化的宗谱来看，每一次分支产生若干新物种。新物种间以及新物种与原物种间，既有明显的区别，又有具有历史的关联，并且在形态学、遗传学等方面也有一定的关联。时间概念是要从生物进化时间这个向量来考虑物种的形成与区分，认为某些物种之间的差别可能是在漫长的进化过程中，表型的改变量不同所致，这些在时间上存在关联的不同物种代表生物在时间向量上的连续性改变和进化。    物种的结构：由个体构成群落，由群落组合为亚种，再由亚种组合为种。群落(localpopulation)是指生活在特定生态和地理环境中的一群同一物种的个体。群落是物种存在的基本结构单元。需要注意的是，农业生产上使用的品种(cultivarorvariety)并不是一个分类学上的单位，而是一个生产应用中的名词。品种是人类在一定的生态和经济条件下，根据自己的需要而创造出来的某种作物的一种群体，它能满足人类进行生产的各种需要。二、物种形成的方式    物种形成(speciation)也叫物种起源，是指物种的分化产生，它是生物进化的主要标志。物种的形成是一种由量变到质变的过程。根据生物发展史的大量事实，物种的形成可以概括为两种不同的方式：一种是渐变式，即在一个相当长的时间内旧的物种逐渐演变成为新的物种，这是物种形成的主要方式。另一种是爆发式，即在短时期内以飞跃形式从一个物种变成另一物种，它在高等植物，特别是种子植物的形成过程中，是一种比较普遍的形式。    (一)、渐变式物种形成(gradualspeciation)\n渐变式物种形成方式是通过突变、选择和隔离等过程，首先形成若干亚种，然后进一步逐渐累积变异造成生殖隔离而成为新种。渐变式又可分为两种方式：即继承式和分化式。    ⒈继承式物种形成(successionalspeciation)这是指一个物种可以通过逐渐积累变异的方式，经历悠久的地质年代，由一系列的中间类型，过渡到新的种。例如纵观马的进化历史，就可以看到这种进化方式。    ⒉分化式物种形成(differentiatedspeciation)这是指一个物种的两个或两个以上的群体，由于地理隔离或生态隔离，而逐渐分化成两个或两个以上的新种。它的特点是种的数目越变越多，而且需要经过亚种的阶段，如地理亚种或生态亚种，然后才变成不同的新种。例如，棉属(Gossypium)中一些种的变化，以及前面提到的加拉帕戈斯群岛上鸣禽的分化，都属于这种形式。    分化式物种形成又可分为异域式物种形成(allopatricspeciation)和同域式物种形成(sympatricspeciation)两种形式。前者又称为地理隔离式物种形成(geographicspeciation)，是指一个物种被分成两个或两个以上的地理分隔群体时，会产生随机漂移，再加上由于地理条件和生态条件不相同，适应性也不相同，所累积的遗传变异也就不一样，最终导致生殖隔离而形成不同的物种。后者是指分布在同一地区的物种的不同群体之间，由于生态的分异等原因，它们之间没有机会进行杂交和基因交流，从而分化形成新的物种；这主要是受精前的隔离因素如寄主以及交配季节和时间等的不同，使群体间个体不易进行杂交而造成的。(二)、爆发式物种形成(suddenspeciation)    爆发式物种形成方式，是指不需要悠久的演变历史，在较短时间内形成新物种的方式。这种形式一般不经过亚种阶段，而是通过染色体数目或结构的变异、远缘杂交、大的基因突变等，在自然选择的作用下逐渐形成新物种。    远缘杂交结合多倍化，这种物种形成形式主要见于显花植物。在栽培植物中多倍体的比例比野生植物多，所以这种物种形成方式与人类有密切关系。根据小麦种、属间大量的远缘杂交试验分析，证明普通小麦起源于两个不同的亲缘属，逐步地通过属间杂交和染色体加倍，形成了异源六倍体普通小麦。科学上已经用人工的方法合成了与普通小麦相似的新种，其形成过程如右图    这种人工合成的斯卑尔脱小麦与现有的斯卑尔脱小麦很相似，它们彼此间可以相互杂交产生可育的后代。已知普通小麦是由斯卑尔脱小麦通过一系列基因突变而衍生的，因此这一事实有力地证明现在栽培小麦的形成过程。    这种物种形成过程在棉属、烟草属、芸薹属等属内也的类似的例子，详见教科书第287～288页。第十三章遗传与进化   遗传学所研究的是生物遗传和变异的规律和机理，进化论所研究的是生物物种的起源和演变过程。                   第一节进化理论    生物进化的理论，细分起很多，但归结为三个，一个是拉马克的获得性状遗传学说，另一个是达尔文的自然选择学说，再有1968年日本木村资提出的中性学说。1、拉马克的获得性遗传学说\n    拉马克认为生物的种不是恒定的类群，而是由以前存在的种衍生而来的。他看到，在生物的个体发育中，因为环境不同，生物个体有相应的变异而跟环境相适应。例如年幼的树木在密密的森林里，为了争取阳光，就长得高高的。鸟类善于飞翔，胸肌就发达了，他在1802年提出用进废退学说或获得性状遗传学说。这个学说的主要论点：①生物生长的环境，使它产生某些要求。②生物改变旧的器官，或产生新的痕迹器官，以适应这此致要求。③继续使用这此些器官，使这些器官的体积增大，功能增进，但不用时可以退化或消失。④环境引起的性状改变是会遗传的，从而把这些改变了的性状传递给下一代。2、达尔文的自然选择学说主要论点是：①生物个体是有变异的，就是每个个体都不同。如人的面貌。野生动植物的个体差异。②生物个体一的变异，至少有一部分是由于遗传上的差异。个体差异=基因型+环境③生物体的繁育潜力一般总是大大地超过它们的繁育率。例如，一条鲱鱼产卵30万粒，一株烟草约结种子36万粒，而实际能发育的是很小的一部分，许多都有不能发育，如受不利条件，天敌等，达尔文称之为生存斗争。④个体一的性状不同，个体对环境的适应能力和程度有差别，这些不同和差别至少有一部分是由于遗传性差异造成的，因此遗传性不同的个体，它们本身的生存机会不同，留下后代的数目有多有少，这个事实叫“繁殖差别”⑤适合度（一个生物能生存并把它的基因传给下代的相对能力）高的个体留下较多的后代，适合度代的个体留下较少的后代，而适合试的差异至少一部分是由遗传差异决定，这样一代一代下去，群体的遗传组成自然而然地趋向更高的适合度。这个过程叫做自然选择。但环境条件不能永久保持不变，因此生物的适就生总是相对的。生物体不断地遇到新的环境条件，自然选择不断地使群体的遗传组成作相应的变化，建立新的适应关系，这就是生物进化中最基本的过程。⑥地球表面上生物居住的环境是多种多样的，生物适应环境的方式也是多种多样的，所以通过多种多样的自然选择过程，就形成了生物界的众多种类。⑦生物界通过自然选择而得到多种新的性状，其中有些性状或性状组合特别有发展前途，是生物适应方式的基本革新。如种子生殖，体温调节机制等。3、中性学说   中性学说又叫中性突变随机漂变学说。1968年日本木村资生发表一篇“分子水平的进化速率”的论文，提出了中性学说。翌年，美国科学家J.King和T.Jukes发表了“非达尔文主义进化”一文，他们支持木村的中性学说。这个学说是根据核酸、蛋白质中的核苷酸、氨基酸的置换速率，以及这样的置换造成核酸、蛋白质改变并不能影响生物大分子功能的事实，提出“中性突变”的概念。他们认为进化是“中性突变”在自然群体中进行随机的遗传漂变的结果，这个学说对以自然选择为基础的达尔文主义进化论提出了新的挑战。这个学说的要点如下：①突变大半是“中性”的，这种突变不影响核酸，蛋白质的功能，对个体生存既没有什么害处也没有什么好处，选择对它们没有作用。中性突变如同同义突变，同功能突变（蛋白质存在多种类型，如同功酶），非功能性突变（没有功能的DNA顺序发生突变，如高度重复序列中的核苷酸置换和基因间的DNA序列的置换）。这些中性突变由于没有选择的压力，它们在基因库里漂动，通过随机遗传漂移在群体中固定下来。②分子进化的主角是中性突变而不是有利突变，中性突变率，也就是核苷酸和氨基酸的代换率是恒定的。细胞色素C中氨基酸的代换率在各种生物中也差不多是相同的，所以蛋白质的进化表现与时间呈直线关系。可根据不同物种同一蛋白质分子的差别，估计物种进化的历史，推测生物的系统发育。这和化石以及其它来源推导出的进化关系是相符的。还可根据恒定的蛋白质中氨基酸的化换速率，对不同系统发育事件的实际年代作出大致的估计，即所谓进化的分子钟。③中性突变的进化是通过遗传漂移来进行的，遗传漂移使中性突变在群体中依靠机会自由组合，并在群体中传播，从而推动物种进化，所以生物进化是偶然的，随机的。④中性突变分子进化是由分子本身的突变率来决定的，不是由选择压力造成的，所以分子\n进化与环境无关。中性学说是在研究分子进化的基础上提出来的，用随机出现的中性突变，能很好地说明核酸蛋白质等大分子的非适应性的多态性，认为根据核酸，蛋白质分子一级结构上的变化就可说明生物性状的所有变异，进而说明进化原因，它否定了自然选择在进化过程中的作用。4、突变为进化提供原材料    遗伟的变异主要有两个来源：一个是突变，包括基因的突变和染色体的畸变；二是不同基因的重新组合。但突变是更加基本的，因为如果没有突变而成为不同的等位基因，那就谈不到任何重组合，所以突变是最初始的原材料。有极少数的突变是有利的，可以作为进化的原材料。突变的有利与否，随所处环境而异。    基因频率是指某群体中，某一等位基因在该位点上可能出现的基因总数中所占的比率。任何一个位点上的全部等位基因频率之和必定等于1或100%。假定设有红轴玉米品种和白轴玉米品种。前者是显性基因P，后者是隐性基因p控制的，两者的比例是1：1，则各自的频率是50%或0.5。一个群体中，不同基因型所占的比率就是基因型频率。例如，上述玉米的基因型可能有三种：PP：Pp:pp，某一基因型频率就是它在全部个体中的比率或百分率。如果我们发现一个群体中有1/4属于PP，有1/4属于pp，有2/4Pp，则可以说PP和pp基因型频率各为25%，而Pp为50%，全部基因型的总合为1或100%。根据上述定义，如果知道了基因型频繁率，可计算某一特定位点的基因频率用符号表示：基因基因型频率AaAAAaaapqDHR由此p+q=1D+H+R=1    今设一对同源染色体某一位点上有一对基因A及a，则接上式由这三种基因型构成的群体共有总个体数N，则：D`+H`+R`=N`N个体共有2N个基因，其中A有2D`+H，a有H`+2R`，因此，基因A及a的频率分别为：P=1/2（2P+H）∴P=P+1/2Hq=1/2(2q+H)∴q=q+1/2H如果用基因型频率来计算时，即：D=D`/N，H=H`/N，R=R`/N。则基因频率P和Q可改写为：P=D+1/2H，q=1/2H+R例如：设由一对基因A、a构成的群体，它们的三种基因型可从表现型区别出来，它们的个体数是：AA（D`）2Aa(H`)12aa(R`)26总数40按（1）式可以求出：基因A的频率P=0.20,Q=0.80同理，按（2）式可以求出结果相同。2、孟德尔氏种群    所谓孟德尔式种群是指一群相互杂交的个体所组成的群体。种群或群体一词在遗传上通常多应用于有性繁殖，并经常异交的那些生物群体。这里所说的异交就是群体内不同基因之间的杂交。在这样的群体里虽然是研究许多基因在群体中的遗传，但它仍以孟德尔氏遗传定律为基础，是孟德尔氏遗传学的发展，因此称为孟德尔氏种群。在种群内，诸个体间的交配是随机的。也就是说，群体中的每一个体都有有同等的交配机会。    完全无性繁殖的生物体不发生孟德尔氏的分离现象，结果形成无性繁殖系或无性繁殖系群。其基因的分配规律就不能用孟德尔氏方法进行研究和鉴别。自交的植物和动物通常驻不发生基因交换，这些纯系也不能称作孟德尔种群。\n3、哈德—魏伯格定律    Hardy(英国数学家）—Weinbeg（德国医生）定律即遗传平衡或基因平衡定律。它是指在一个大的随机交配的群体里，基因频率和基因型频率在没有迁移、突变和选择的条件下，世代相传不发生变化。并且基因型频率是由基因频率决定的，该定律是在1908年分别由Hardy和Weinberg首先提出来的。所以称为Hardy—Weinberg定律。Hardy—Weinberg定律的主要含义是在一个随机交配的种群中，基因频率和基因型频率代代相传保持恒定。它的推导包括三个步骤：①从亲本到它们所产生的配子；②从配子的结合到产生合子的基因型；③从合子的基因型到子代的基因型；3、1、基因频率的恒定    假设在亲本产生的精子与卵子中，基因A与a的频率各为P和q，它们结合产生的合子其基因型将如下：♂♀PAqaPAAAAaqaAaaa再由合子的基因型到子代中的基因频率将是：P2AA：2pqAa:q2aa亦即：P2AA+2PqAa+q2aa=1此即Hardy-Weinberg公式，这一代的配子将是：A=P2+1/2（2pq)=p2+pq∵p+q=1∴P2+pq=p(p+q)=p同理：a=q2+1/2(2pq)=q2+pq=q由此可见，这一代基因A的频率仍然是P，基因a的频率仍然是q，而且将以这种频率在所有世代传递下去，这就是遗传平衡。    例如，已知兔子的脂肪有白色和淡黄色两种，这是一对相对性状，有显隐性关系。在一个群体中，如有60%兔子有白色脂肪，基因型是AA，另有40%兔子有黄色脂肪，基因型是Aa，则p+q=100%,在这个随机交配的群体中，精卵结合其合子基因型如下：♂♀P(A)=0.8q(a)=0.2P(A)=0.8AA0.64Aa0.16q(a)=0.2Aa0.16A0.04在随机交配的下一代群体中，（ＡＡ）个体的频率是P2（Aa）个体的频率是2pq，(aa)个体的频率是q2。要证明下一代P2（AA）+2pq(Aa)+q2(aa)中的p和q的比值仍是0.8和0.2保持世代稳定不变，从这一代群体中基因频率的变化即可看出。在这一代A配子的比例应为：P2+1/2(2pq)=P2+pq=0.64+0.16=0.8同理，a配子的比例应为：q2+1/2(2pq)=q2+pq=0.04+0.16=0.2可见A与a的频率仍与亲本相同，并未产生变化。依此类推，以后各代仍然保持恒定。因此，一对等位基因代代相传的遗传平衡公式可概括为：P2+2pq+q2=1这个公式的含义是：在一个大的自由交配的群体里，一对等位基因所决定的单位性状，在没有迁移、突变和选择的条件下，基因频率p和q以及基因型频率D、H、R在世代相传时不产生变代。整个群体的基因和基因型频率的总和等于1。3、2基因型频率的恒定由于基因频率代代相传保持恒定，而基因型频率又由基因频率决定，所以基因型频率同样保持代代恒定。归纳后代基因型频率得：(D+1/2H)2+2(D+1/2H)(R+1/2H)+(R+1/2H)2仍和上代相同保持平衡不变。4、复等位基因的遗传平衡\n    遗传平衡的公式同样可用于复等位基因的遗传，只是各种基因频率的计算要比一对等位基因稍微复杂些，下面以人的ABC血型为例说明之。设：p=基因A的频率q=基因B的频率r=基因O的频率则p+q+r=1在自由婚配的情况下，后代的基因型频率应为：♂♀P(A)q(a)r(O)P(A)P2PqPrq(a)Pqq2qrr(O)Prqrr2其平衡公式是：p2+q2+r2+2pq+2pr+2qr=1又设A、B、AB、O为各血型的表现型频率，则有A=p2+2pr.B=q2+2qrAB=2pqO=r2很明显，基因O的频率等于O血型频率的平方根。即：r=√OA血型频率与O血型频率之和等于基因A频率与基因O频率之和的平方。即：A+O=p2+2pr+r2=(p+r)2√A+O=p+r∴p+q+r=1又p+r=1－q∴1－q=√A+O∵q=1－√A+O同理p=1－√B+O5、基因频率的分析     根据遗传平衡公式对群体进行基因频率的分析。在人类的群体遗传研究中是非常有用的。如果知道群体中隐性纯合体的比率。则基它基因和基因型频率即可推算出来，从而预测在群体事某基因存在的频率和有关特性的表现。例如，在小孩中有一种幼年失明痴呆病患者，它是由一对隐性基因纯合而致病的。假定它的频率为0.000038，根据这个数值可以计算群体中正常基因纯合体和杂合体在群体事所占的比例。∵q=20.000038∴q2=√0.000038=0.0062则：p=1－q=1－0.0062=0.9938基因型频率可计算为：p2=(0.9938)2=0.98762pq=2×0.9938×0.0062=0.0123(致病杂合体）0.0123÷0.000038=323.68由计算可知携带致病基因的杂合体比患者多三百多倍。根据基因频率的分析，还可以检验某性状是否处于遗传平衡。例如，M—N血型是由两个等位基因M和N控制的。现从人群中抽样420人进行M—N血型分析；发现137人是M血型；196人是MN血型；87人是N血型。设M基因频率=p、N基因频率=q则p=2D`+H`/2N`=2×137+196/2×420=0.56q=H`+2R`/2N`=2×87+196/2×420=0.44由此，可计算基因型频率：MM=p2=(0.56)2=0.314;MN=2pq=2×0.56×0.44=0.493;NN=q2=(0.44)2=0.194把计算得到的基因型频率乘以总人数，即得到预期数。然后与实测数进行比较，进行X2检验。MMMNNN实得人数13719687预期人数13220781差数5-116d2/e0.190.580.44计算结果，得X2=1.21，p=20%—30%。表明三个基因型频率符合遗传平衡。（这里X2的自由度是1，因为在计算预期值时要应用一个基因频率p和q，这是从实际数估算出来的，因此自由度应为3—2=1）\n1954年Race和Sanger曾作过一组ABO血型复等位基因的基因频率分析。在190177人所组成的一个血型频率样品中，O血型88783人，A血型79334人，根据基因平衡公式可知：O=88783÷190177=0.4668A=79334÷190177=0.4172已知O基因频率r=√O=√0.4668=0.6932又p+r=√A+O∴p=√A+O－r=√0.4172+0.4668－0.6832=0.2570(A的基因频率)。p+q+r=1,∴q=1－(p+r);q=1－(0.6832+0.2570)=0.0598(B的基因频率）求表型频率，因为B=q2+2qr∴B=(0.0598)2+2×0.0598×0.6832=.08532又AB=2pq∴AB=2×0.2570×0.0598=0.0307由计算得出血型的基因频率和表现型频率为：P=0.2570q=0.0598r=0.6832表型：A=0.4172B=0.0853O=0.4668AB=0.0307而基因型频率为：AA=P2=(0.2570)2=0.06605BB=q2=(0.0598)2=0.0036OO=r2=(0.6832)2=0.4668AO=2Pr=2×0.2570×0.6832=0.3511BO=2qr=2×0.0598×0.6832=0.0817AB=2pq=2×0.2570×0.0598=0.0307则相加≈1以上根据基因平衡公式推导的理论预期数，经X2验与实际数值相符合。根据上述，归纳遗传平衡的要点如下：⑴在随机交配的大群体中，如果没有突变，自然选择、迁移、遗传漂移等因素的干扰，则各代基因频率保持平衡不变。⑵在任何一个大群体内，不认其基因频率和基因型频率如何，只要一代的随机交配，这个群体就可达到平衡。⑶一个群体在平衡状态时，基因频率和基因型频率的关系是：D=p2、H=2pq、R=q2。    实际上，自然界许多群体都有是很大的，个体间的交配一般也是接近于随机的，所以哈德—魏伯格定律基本上普遍适用。它已成为分析自然群体的基础，对人类群体也是适用的。    遗传平衡定律在群体遗传学中是很重要的，它揭示基困频率和基因型频率的规律。由于这一规律，一个群体的遗传特性才能保持相对的稳定。生物遗传特性的变异是由基因和基因型的差异引起的，这样就影响到基因频率和基因型频率的差异。但是在群体内各个个体间如果进行随机交配，那么将保持平衡，而不发生改变。即使由于突变、选择和迁移及杂交等因素改变了群体的基因频率和基因型频率，只要这些因素不继续产生作用，而进行随仙交配，则这个群体仍将保持平衡。但是，群体平衡是有条件的，尤其在人工控制下通过选择，杂交或人工引变等途径，就可以打破这种平衡，促使生物个体发生变异因而群体的遗传特性也会随之改变。动植物育种的目的就是在于打破群体中的固有基因频率和基因型频率，使之建立新的遗传平衡            第三节影响群体平衡的因素\n    群体的遗传平衡是相对的、有条件的。前面关于哈迪－温伯格定律的讨论，是假定影响基因频率的因素不存在的情况下进行的。实际上，自然界的条件千变万化，任何一个群体都在不同程度上受到各种影响群体平衡因素的干扰，而使群体遗传结构不断变化。研究这些因素对群体遗传组成的作用，具有十分重要的理论与实践意义，这不仅在于解释生物进化的原因，而且还因为在育种过程中，实际上是通过运用这些因素来改变群体遗传组成，而育出符合人类需要的新品种群体。所以从这个角度看，可以认为，所谓育种无非是人为地运用各种影响群体平衡的因素，以控制群体遗传组成的发展方向，从而获得优良品种的过程。影响群体平衡的主要因素包括：突变、选择、迁移、遗传漂移和交配系统。一、突变    基因突变(mutation)对于群体遗传组成的改变具有两个重要的作用：首先，基因突变本身就改变了基因频率，是改变群体遗传结构的力量。例如，当基因A突变为a时，群体中A基因的频率就减少，而a基因的频率就增加；其次，基因突变是新等位基因的直接来源，从而导致群体内遗传变异的增加，并为自然选择和物种进化提供物质基础。没有突变，选择即无从发生作用。当突变和选择的方向一致时，基因频率改变的速度就变得更快。虽然大多数突变是有害的，但也有一些突变对育种是有利的，如控制矮秆和某些抗病基因。突变可分为如下三种情形：（一）非频发突变    非频发突变指的是仅偶尔发生一次而不能以一定频率反复发生的独一无二的突变。这种突变在大群体内长期保留的机会很微小，因而，不大可能对群体的基因频率有什么影响。假定在AA纯合群体内发生一次A→a的突变，则群体内只有一个Aa个体。该杂合子Aa只能与其他AA个体交配。如果该个体不能产生后代，则新基因a丢失的机会是1；如果杂合子Aa只能产生一个后代，则该后代基因型是AA或Aa的可能性各占0.5，亦即a基因丢失的概率为0.5。如果该杂合子Aa产生两个后代，则a基因丢失的机率是0.25。依此类推，若Aa个体能产生k个后代，则a基因丢失的概率是：。a基因丢失的概率取决于Aa×AA所产生的个体数。后代数越多，a基因保存的机会越多。然而每传递一代突变的a基因都有丢失的可能，传递代数越多，丢失的总概率越大。所以，除非突变基因有特殊的生存价值(突变体生活率、对环境的适应性和繁殖力等)，或育种者在它出现后能及时正确地识别并选择它，否则很难在群体内长期保留。如果实际的生物群体并不大，独一无二的突变基因在这种群体内可能长期保存，再加上随机漂移的作用，最终可能导致群体基因频率的变化。（二）频发突变    以一定的频率反复发生的突变叫频发突变。由于这种突变能够反复发生，突变基因得以在群体内维持一定的基因频率，从而成为引起群体基因频率改变的重要因素之一。    假定A基因以固定的频率u突变为a基因。则每经一代之后，a基因的频率就会增加u×p(其中p为上代A基因的频率)，因此a基因的频率越来越大，而A基因频率越来越小，也就是说a基因的数目逐渐增加，而A基因的数目逐渐减少。突变使群体的遗传结构逐代发生变化，这种作用称为突变压(mutationpressure)。如果没有其它因素的阻碍，最后a基因将可能完全取代A基因，则这个群体最后将达到纯合性(homozygosis)的a。设基因A在某一世代的频率为p0，则在经过n代之后，它的频率pn将是：pn=p0(1-u)n   因为大多数基因的突变率是很小的(～)，因此只靠突变压而使基因频率发生显著改变，就需要经过很多很多世代；不过有些生物的世代是很短的，因而突变压就可能成为改变群体遗传结构的重要因素。（三）回复突变   一个等位基因可以突变为其相对的另一个等位基因，反之另一个等位基因也可以突变为原来的基因，这种突变叫回复突变。由A变为a叫正向突变，其突变率为u，反之由a变为A称为反突变，其频率为v。当然，这两个方向的突变率不一定相等。对这种回复突变可用下图表示：puＡａqv\n如果起始群体中A基因频率为p0，a基因为q0，则由A突变为a的基因比率为p0u，反突变由a变成A的基因比率为q0v。当p0u＞q0v时，a频率增加；当p0u＜q0v时，a频率减少。如果正、反突变的频率不变，则基因突变的结果又反过来影响基因突变的比率p0u和q0v的值，到某一世代，当u=v时，两基因频率不再变化，即达到平衡，因这时u=v(1-)u=v于是有qn=同理可得＝可见在平衡状态下，基因频率与原基因频率无关，仅取决于正反突变频率u和v的大小。如果一对等位基因的正反突变频率相等(u=v)，则达到平衡时的基因频率和的值都是0.5。二、选择    选择(selection)有自然选择和人工选择，两个都是改变基因频率的重要因素。个体间遗传基础的差异是选择的基础。达尔文指出，自然界中生物的适者生存，不适者淘汰的过程就是自然选择的过程。由于不同基因型很可能在育性、生活率或其他方面不同，也即是在某些内在条件或外界因素的作用下，使不同的基因型产生的后代数目不同，从而导致一些基因型频率逐代增高，另一些逐代降低，这就是自然选择作用的实质。人工选择是在人为的干预下，按人类的要求对生物加以选择的过程，也即把某些合乎人类要求的性状保留下来，使其基因频率逐代增大，从而使群体遗传结构朝着一定方向改变。    生物体育性和生活率的差异可以用适应度(W)表示。特定基因型的适应度可用具有该基因型的个体所产生的平均后代个体数目表示。适应度的概念包含生活率和育性两个方面。生活率用达到繁育年龄的个体数占个体总数的比例表示；育性则用每个繁育个体的平均后代表示。一对亲本的后代数应该一半属于父本，另一半属于母本。例如，4个AA基因型的个体中有3个存活到繁育年龄，因此其生活率是；属于这3个繁育个体的后代共有6个个体，因而每个繁育个体的平均后代是；所以AA的适应度W1=×＝1.5。同理可算出其他基因型的适应度，比如Aa基因型的为W2=1.5，Aa基因型的为W3=0.5。以这种方式算得的适应度叫做绝对适应度。遗传学中习惯于应用两种基因型绝对适应度的比值，叫做相对适应度。如果上述基因型都以AA为标准，那么AA的相对适应度是1.5/1.5=1.0，Aa的是1.5/1.5=1.0，而aa的为0.5/1.5＝0.33。由于相对适应度应用范围很广，为方便起见，往往直接把它称为适应度。另外，为使选择的理论模型简单化，有时把适应度的含义等同于生活率的含义，而略去育性的作用。     选择系数是表示选择强度的参数，用s表示，并且s=1-W。它表示在选择的作用下降低的适应值，用以测量某一个基因型在群体中不利于生存的程度，0≤s≤。当s＝0，W=1，表示选择不改变适应值。当s=1时W＝0，表示选择使适应值完全消失，使该基因型100%不能繁育后代，例如对致死或不育基因纯合体的选择。现以一个位点上的两个等位基因的情况说明选择的作用。（一）选择使显性基因淘汰    隐性基因有利，在作物中也不少见。有些抗病性有利基因是隐性基因。例如玉米抗小斑病O小种的rhm基因。一些控制特殊品质性状的基因也为隐性，例如某些禾谷类作物的糯性(wxwx)，玉米的甜粒(susu)等等。此外某些控制雄性不育、矮秆等的基因也往往是隐性基因。因此在育种中为获得这些特性而进行选择时，显性基因是淘汰的对象。人工选择(或显性致死时的自然选择)下淘汰显性基因，只要一代就能把显性基因型的个体从群体中消灭，从而把显性基因的频率降低到0。    在自然选择状态下，如果不是显性致死而只是生活率和繁殖力有所降低，即纯合子aa的适应度最高，而AA和Aa都受到选择系数为s的选择压力，这样显性基因频率将会是逐代降低，在若干代后变为0。其作用情况如表14-10。\n当选择系数s〈1时，则是对于显性基因的不完全选择。选择一代后的基因频率可表示为：表14-10不利于显性个体的部分选择基因型AAAaaa总和初始频率2p0q01选择系数ss0适应度1-s1-s1选择后比率(1-s)2p0q0(1-s)1-s(1-)一代选择所引起的基因频率变化量是：△q=q1-q0=△这时△q是正值，说明选择结果是a基因频率逐渐增高。在s＝1.0时有：=1△q＝=p0即显性基因被淘汰掉了，只剩下隐性基因。（二）选择使隐性基因淘汰    大多数隐性基因都是有害的，因此无论是人工选择还是自然选择的作用，都趋于使这些不利的基因淘汰。在育种中如果希望通过选择来淘汰隐性不利基因，育种者需要了解选择对淘汰这些基因的效果如何，并以此作为制定选择计划的参考。人工选择淘汰隐性基因的速度比淘汰显性基因慢很多。设未进行选择时群体中隐性基因的频率为q0，三种基因型AA、Aa和aa的频率分别为D0、H0和R0，则q0=H0+R0；由于选择作用(s=1)使aa淘汰了，隐性基因只存在于杂合体中，并且只占杂合体基因数目的一半，故下一代隐性基因的频率为：同理可得，经过两个世代的选择淘汰后，隐性基因的频率为：在经过n个世代的选择淘汰后，隐性基因的频率将变为：    两个世代间隐性基因的频率改变量为：△q＝qn+1-qn=这时△q值随qn值的增大而增大。说明隐性基因频率改变的速度与其频率qn值有关，qn值越大，改变越快，qn值越小改变越慢，表明在完全淘汰隐性基因的选择时，隐性基因的频率越高，选择淘汰的效果就越好，但这种效果会随选择所进行的世代数目的增多而快速减慢。如果起始群体隐性基因频率q0=0.40，由于的选择作用淘汰隐性纯合体而使各世代隐性基因频率降低的结果如下：世代012345678910频率0.400.2860.2220.1820.1540.1330.1180.1050.0950.090.08由此可见，淘汰隐性基因的速度是比较缓慢的。由14-10式可得出需要隐性基因频率降低到某个值所需的世代数：n=如果起始群体隐性基因频率q0=0.40，如果要使隐性基因频率降低到0.01，则所需世代数为：n===97.5    即经过将近100代的选择，隐性基因的频率才能降低到0.01左右，这时R=0.0001，即在1万个个体中还有可能出现一个隐性性状个体。这也是群体中出现“返祖现象”的原因之一(另外也有可能是基因发生突变所致)。又例如欧洲人白化率为0.00005，假如通过完全选择措施要将其发生率减少一半，即为白化率为0.000025，需要多少世代？这时，\n0.00707，0.005n==59(代)    在自然选择状态下，如果不是隐性纯合致死而只是生活率和繁殖力有所降低，即纯合子aa受到的选择压力小于1，这样隐性基因频率逐代降低的速度更慢。若对aa基因型的选择系数为s，则aa基因型的适应值就不再是1，而是1-s，其选择作用如表表：针对隐性基因的选择作用基因型AAAaaa总和初始频率2p0q01选择系数00s适应度111-s选择后比率2p0q0(1-s)1-s经一代选择后，基因频率发生了变化：推广到任何连续两代之间的关系则有：并且pn+qn=1，pn+1+qn+1=1。由于1-s≤1，所以pn+1≥pn，说明选择作用的结果，增加了显性基因的频率，降低了隐性基因的频率。△q＝qn+1-qn=-qn=说明基因频率改变的速度取决于q和s值的大小。当s=0时，△q=0，基因频率不发生变化，群体处于平衡状态；当0＜s＜1时，△q＜0，表明选择的结果减少了隐性基因的频率。由(14-14)式可以证明，只有当q＝p＝0.5时，△q有最大值，表明这时选择淘汰基因最有为效。当s＝1时，aa全部淘汰，但基因依然保存于杂体Aa中。    从选择作用影响基因频率的效果来看，一般地可以得出两点结论：⑴基因频率接近0.5时，选择的效果最好；当频率大于或小于0.5时，选择效果降低很快；⑵隐性基因很少时，对一个隐性基因的选择或淘汰的有效度就非常低，因为此时隐性基因几乎完全存在于杂合体中而得到保护。当由于隐性基因频率较低而限制选择效果时，不应盲目地靠增加代数来达到选择目的，否则会造成人力物力的浪费。（三）选择淘汰纯合体   基因型是杂合的个体Aa，常常优于其纯合体AA和aa，这在自然界及育种中是常见的，而且有时很重要。当纯合个体的生存和繁殖能力都不如杂合个体时，杂合个体的适应值为1，两种纯合个体的适应值分别为1-s1和1-s2，纯合体AA和aa的选择系数s1和s2可以相等，也可以不相等。经过一代的选择作用后基因型频率的变化如表表14-12有利于杂合体的选择基因型AAAaaa总和起始群体2p0q01适应值1-s111-s2选择后(1-s1)2p0q0(1-s2)1-s1-s2由表可算得选择一代后频率的变化为：△q＝q1-q0=－q0＝由此可知，到某一世代，当s1-s2＝0或者说s1＝s2时，△q＝0，基因频率不再变化，处于平衡状态。由s1-s2＝0，s1-s2(1-)＝0得到：＝，＝说明在平衡状态下，基因频率完全由s1和s2决定，与原有基因频率无关。在纯合体不能生存的极端情况下，群体的基因型是单一的杂合体Aa，显性基因和隐性基因的频率相等，各为0.5。\n从以上三种情况讨论了选择对于改变群体基因频率的效应。在不同情况下选择效果不一样，选择效果与基因频率有关，应该注意所选择或淘汰的性状的频率。三、遗传漂移    群体达到和保持遗传平衡状态的重要条件之一是群体必须足够大，理论上说应该是无限大，以保证个体间进行随机交配和基因能够自由交流。但实际上任何一个具体的生物群体都不可能无限大，人工群体尤其如此。虽然有些植物群体可以很大，但因受地域隔离和花粉传播距离的限制，也很难实现真正意义的随机交配。因此，实际中的群体只能看成是来自某随机交配群体的一个随机样本，每世代从基因库中抽样以形成下一代个体的配子时就会产生较大的误差，这种由于抽样误差而引起的群体基因频率的偶然变化叫做遗传漂移(randomgeneticdrift)，也称为遗传漂变。    遗传漂移一般发生在小群体中。因为在一个大的群体里，个体间可进行随机交配，如果没有其它因素的干扰，群体能够保持哈迪-温伯格平衡。而在一个小群体里，即使无适应性变异等的发生，群体的基因频率也会发生改变，这是因为在一个小群体里，由于与其它群体相隔，个体不能进行真正意义上的随机交配，也即群体内基因不能达到完全自由分离和组合，基因频率就会容易发生偏差。一般地说，群体越小，遗传漂移的作用越大。    为方便起见，举一个最简单的例子。假定有一自花授粉的杂合基因型植株(Aa)，每代只成活、繁殖一株植株(即群体大小N＝1)。由于：Aa→AA+Aa+aa所以在自交一代是杂合型基因型(象亲本Aa)的概率是50％；是纯合基因型(AA或aa)的概率也是50％。在后一种情况下，A基因频率从亲代的0.5已改变到1(自交一代是AA时)或0(自交一代是aa时)；即由于随机抽样误差，A基因频率在群体中或者被固定达最大值或者被消除。如果群体足够大，其遵从哈迪－温伯格定律，是不会导致基因频率的变化的。    现讨论由于抽样误差引起基因频率变化的一般情况。基因频率变化的大小可用成数的标准差σ＝来计算。这里p是A基因的频率，q是a基因的频率，    2N是群体中基因总数。对二倍体来说，由于每个亲本携带两个等位基因，所以这里的N就是实际的亲代个体数。例如，原始群体中基因频率p=q=0.5，如果以后每个世代只保持5000个个体的群体，即有σ===0.005。    所以该群体的基因频率值大约有68％的可能在0.5±0.005即在0.495～0.505间变动。但若每代只保持5个个体，即σ＝=0.16。所以，该群体的基因频率约有68％的可能在0.5±0.16即在0.34～0.66间波动，有99％的可能在0.5±2.58×0.16即在0.09～0.90间波动。遗传漂移对基因频率的影响可能有三方面：    ⒈减少遗传变异。这是因为遗传漂移的结果，在小群体内打破原有的遗传平衡，即改变原有各种基因型频率，使纯合个体增加，杂合体数目减少，因而各小群体内个体间的相似程度增加，而遗传变异程度减少，甚至最终产生遗传固定，即群体是单一的纯合基因型，等位基因之一的频率为1，另一等位基因的频率为0。    ⒉由于纯合个体增加，杂合个体减少，群体繁殖逐代近交化，其结果是降低了杂种优势，降低了群体的适应性，群体逐代退化，对于异花授粉作物来说，降低了其在生产上的使用价值。    ⒊遗传漂移使大群体分成许多小群体（世系），各个小群体之间的差异逐渐变大，但在每一小群体内，个体间差异变小。    ⒋在生物进化过程中，遗传漂移的作用可能会将一些中性或不利的性状保留下来，而不会象大群体那样被自然选择所淘汰。\n    在作物的引种，选留种，分群建立品系或近交等，都可以引起遗传漂移，这是造成群体基因频率变化很重要的人为因素。在作物群体改良中，为了防止遗传漂移而引起的部分优良基因的丢失以及因遗传固定、纯合个体的增加而使群体杂种优势的降低，不能片面地只顾增大选择强度，同时还应保证足够大的有效群体含量。在种质保存中，同样也存在遗传漂移的影响。为保存一个综合品种或异花授粉作物的天然授粉品种，必需种植足够大的群体，否则经多年种植保存之后，因遗传漂移的影响，所保存的种质已不能代表原有的群体。四、迁移    群体间的个体移动或基因流动叫做迁移(migration)，是影响群体基因频率的一个因素。迁移实质上就是两个群体的混杂。这种个体或基因流动既可能是单向的，也可能是双向的，如是后者，又可叫做个体交流或基因交流。由于群体间个体或基因流动，必然会引起群体基因频率的改变。设在一个大的群体内，每代都有一部分个体新迁入，且迁入个体的比率为m，那么群体内原有个体比率则为1-m，总频率仍为1。设原来群体a基因频率为q0，迁入个体a基因频率为qm，那么迁入后第一代a基因频率为：q1＝mqm+(1－m)q0＝m(qm-q0)+q0当qm=q0时，q1＝q0，表明基因频率不变，当qm≠q0时，q1≠q0，前后两代频率的差异为：△q=q1-q0=m(qm－q0)可见迁移对群体基因频率的影响大小由迁入个体的比率m以及频率差(qm－q0)所决定。   了解迁移对改变群体基因频率的效应，在育种中也有一定的指导意义。在群体改良中，为了增大改良群体的遗传方差，或者向群体引入优良基因，通常采用与外来种质杂交的办法，在这种情况下就会发生因迁移而改变原有群体某些基因频率的效应。引种是单独引进一个群体，经试种后，直接用于生产或用作育种原始材料，就这地区而言，新种质引入的结果，必然改变了该地区群体的遗传组成。还有一种情况，是属于个别基因而不是整个个体迁入群体后，对群体遗传组成的影响，这是指一物种的基因引进到另一物种的基因库中的现象，称为种质渐渗。如玉米的起源就可能包括了大刍草的种质渐渗，即大刍草的某些基因引进到了玉米中，这增加了玉米的遗传变异水平和杂种优势。第四节物种的概念与形成方式一、物种的概念    物种(species)是自然界中实际存在的生物群体单位。但生物界中物种的划分不是通过条件（特征）集来进行逻辑分类所能完成，而是必须进行综合的分析。实际上给物种下一个在理论上合乎逻辑性、在实际应用上又方便有效的定义是极其困难的。对物种概念的定义有一个历史发展过程。早在17世纪，JohnRay(1868)就认为物种是一个繁殖单元。林奈(Linne,C.von，1750)进一步提出，物种是由形态相似的个体组成，同种个体间可自由交配，并能产生可育后代；而异种个体间则杂交不育。达尔文提出，种是显著的变种，是性状差异明显的个体类群。杜布赞斯基（Dobzhansky,Th.）认为，物种是享有一个共同基因库、能进行杂交的个体的最大的生殖群落。迈尔(Mayr,E.，1982)给物种下了一个定义：物种是由种群所组成的生殖单元（和其它单元在生殖上隔离着），它在自然界中占有一定的生境地位。陈世骧（1987）对此定义作了补充：物种在宗谱上代表一定的分支。尽管很多学者对物种的概念提出了各种各样的观点，但都忽视了营无性生殖的低等生物，这有待进一步研究和探讨。综合各学派的观点，物种的划分应综合考虑如下一个方面的内容：    (一)形态学标准主要根据生物体的形态特征方面的差异进行物种的划分。在分类学上这仍然是常用的标准。这种分类方法方便易行，但标准难以统一，因而会出现划分结果不一致现象。     (二)遗传学标准\n理论上是指以群体间的遗传组成方面的差异、染色体数目和结构方面的差异以及由遗传原因导致的生理生化方面的差异等作为标准，实际操作上是以能否进行杂交以及杂种后代有否繁殖能力作为标准，也即生殖隔离标准，这是区分不同物种的重要标准。这方面的标准已经发展到分子水平。凡能够进行杂交而且产生能生育的后代的个体或类群，就属于同一个物种；凡不能进行杂交，或者能够进行杂交但不能产生有生育能力的后代的个体或类群，则属于不同的物种。例如，水稻和玉米间不能进行杂交，所以它们分属于两个不同的物种。又如马和驴能够相互杂交而产生马骡和驴骡，但所得杂种均不能生育，所以马和驴也属于不同的物种。    (三)生态学标准物种是生态系统中的功能单位，不同物种占有不同的生态位，不同的物种有不同的生态习性。    (四)生物地理学标准不同物种的地理分布范围不同，有的分布区域很广阔，有的分布区域很狭窄；有的过去分布广，后来变狭窄了；有的则相反，过去分布很狭窄，后来变得宽阔了。    (五)宗谱分支和时间概念宗谱分支概念是从指分支系统学的角度来考察物种的分化形成和物种间的区分。从生物进化的宗谱来看，每一次分支产生若干新物种。新物种间以及新物种与原物种间，既有明显的区别，又有具有历史的关联，并且在形态学、遗传学等方面也有一定的关联。时间概念是要从生物进化时间这个向量来考虑物种的形成与区分，认为某些物种之间的差别可能是在漫长的进化过程中，表型的改变量不同所致，这些在时间上存在关联的不同物种代表生物在时间向量上的连续性改变和进化。    物种的结构：由个体构成群落，由群落组合为亚种，再由亚种组合为种。群落(localpopulation)是指生活在特定生态和地理环境中的一群同一物种的个体。群落是物种存在的基本结构单元。需要注意的是，农业生产上使用的品种(cultivarorvariety)并不是一个分类学上的单位，而是一个生产应用中的名词。品种是人类在一定的生态和经济条件下，根据自己的需要而创造出来的某种作物的一种群体，它能满足人类进行生产的各种需要。二、物种形成的方式    物种形成(speciation)也叫物种起源，是指物种的分化产生，它是生物进化的主要标志。物种的形成是一种由量变到质变的过程。根据生物发展史的大量事实，物种的形成可以概括为两种不同的方式：一种是渐变式，即在一个相当长的时间内旧的物种逐渐演变成为新的物种，这是物种形成的主要方式。另一种是爆发式，即在短时期内以飞跃形式从一个物种变成另一物种，它在高等植物，特别是种子植物的形成过程中，是一种比较普遍的形式。    (一)、渐变式物种形成(gradualspeciation)渐变式物种形成方式是通过突变、选择和隔离等过程，首先形成若干亚种，然后进一步逐渐累积变异造成生殖隔离而成为新种。渐变式又可分为两种方式：即继承式和分化式。    ⒈继承式物种形成(successionalspeciation)这是指一个物种可以通过逐渐积累变异的方式，经历悠久的地质年代，由一系列的中间类型，过渡到新的种。例如纵观马的进化历史，就可以看到这种进化方式。    ⒉分化式物种形成(differentiatedspeciation)这是指一个物种的两个或两个以上的群体，由于地理隔离或生态隔离，而逐渐分化成两个或两个以上的新种。它的特点是种的数目越变越多，而且需要经过亚种的阶段，如地理亚种或生态亚种，然后才变成不同的新种。例如，棉属(Gossypium)中一些种的变化，以及前面提到的加拉帕戈斯群岛上鸣禽的分化，都属于这种形式。    分化式物种形成又可分为异域式物种形成(allopatricspeciation)和同域式物种形成(sympatricspeciation)两种形式。前者又称为地理隔离式物种形成(geographicspeciation)，是指一个物种被分成两个或两个以上的地理分隔群体时，会产生随机漂移，再加上由于地理条件和生态条件不相同，适应性也不相同，所累积的遗传变异也就不一样，最终导致生殖隔离而形成不同的物种。后者是指分布在同一地区的物种的不同群体之间，由于生态的分异等原因，它们之间没有机会进行杂交和基因交流，从而分化形成新的物种；这主要是受精前的隔离因素如寄主以及交配季节和时间等的不同，使群体间个体不易进行杂交而造成的。(二)、爆发式物种形成(suddenspeciation)\n    爆发式物种形成方式，是指不需要悠久的演变历史，在较短时间内形成新物种的方式。这种形式一般不经过亚种阶段，而是通过染色体数目或结构的变异、远缘杂交、大的基因突变等，在自然选择的作用下逐渐形成新物种。    远缘杂交结合多倍化，这种物种形成形式主要见于显花植物。在栽培植物中多倍体的比例比野生植物多，所以这种物种形成方式与人类有密切关系。根据小麦种、属间大量的远缘杂交试验分析，证明普通小麦起源于两个不同的亲缘属，逐步地通过属间杂交和染色体加倍，形成了异源六倍体普通小麦。科学上已经用人工的方法合成了与普通小麦相似的新种，其形成过程如右图    这种人工合成的斯卑尔脱小麦与现有的斯卑尔脱小麦很相似，它们彼此间可以相互杂交产生可育的后代。已知普通小麦是由斯卑尔脱小麦通过一系列基因突变而衍生的，因此这一事实有力地证明现在栽培小麦的形成过程。    这种物种形成过程在棉属、烟草属、芸薹属等属内也的类似的例子，详见教科书第287～288页。