诊断临床病原体检查 34页

感染性疾病实验诊断程序正确、规范采集和运送标本通过直接显微镜查见病原体，或检出病原体抗原成分，或通过分子生物学方法检测到病原体核酸，结合病人病史、症状、体征，可作出初步诊断同时，进一步对病原体进行分离和鉴定，确定感染病原体的类型对细菌和真菌感染要进行抗生素敏感试验n标本的采集、运送和检查方法一．标本的采集和运送所有采集标本均置于无菌或清洁容器中，不能接触消毒剂和抗菌药物。血液：一般在发热初期和高峰期采集，如已用抗生素，则在下次用药之前采集。成人采血量为每次10-20毫升，儿童和婴儿为1.5-5毫升。专用血培养瓶。血标本采集次数根据研究，仅采血一次分离率约占80%，培养2次分离率约占90%，而培养三次的分离率约占99%。n多瓶接种①厌氧菌菌血症占菌血症5-15%,②有10%菌血症不是单一微生物引起,③长期使用抗生素患者可呈现L型菌.④免疫低下患者易发生真菌感染；根据情况做二种血培养瓶的培养,需氧和厌氧或需氧和L型培养。标本采集操作应注意严格无菌操作，避免污染杂菌。标本送检接种血液样本的培养瓶应立即送检，如因某种原因不能立即送检时，勿放冰箱存放。n尿液常用清洁中段尿。对于厌氧菌采用膀胱穿刺法收集、无菌厌氧小瓶运送。粪便取脓、血、粘液送检，排便困难及婴幼儿可用直肠拭子采集，根据检验目的选用不同的运送培养基及分离培养基提高检出率。呼吸道标本鼻咽拭子、痰、纤支镜采集物，经气管采集分泌物可避免正常菌群污染，是确定下呼吸道感染的理想标本。n脑脊液及其它体液对于脑脊液常见病原菌如脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，抵抗力弱，采集后应立即接种。对于胸、腹水和心包积液由于含菌量少宜接种量大或按血培养处理。眼、耳标本用无菌拭子采样，可用角膜刮屑。泌尿生殖道标本可用尿道口分泌物、外阴糜烂面分泌物、宫颈口分泌物和前列腺液等。创伤、组织和脓肿标本首先清创，用无菌拭子取材。n二.检查方法１.显微镜检查悬滴法用于病原体的动力观察，暗视野或相差显微镜用于病原体的生长、形态、运动方式。染色检查：革兰氏染色用于细菌和真菌的检查；抗酸染色用于结核菌及放线菌的检查；墨汁染色用于新型隐球菌的检查。n2.病原体特异性抗原检测主要用于不易培养的微生物的快速诊断，用已知抗体，利用免疫荧光、酶联免疫技术等检测标本中的抗原。3.病原体核酸的检测主要是PCR和DNA探针杂交检测标本中的病原体。4.病原体分离培养和鉴定细菌培养，将标本接种相应的培养基上，根据菌落形态、生化反应鉴定细菌；不易培养的微生物进行细胞培养。5.血清学检测检测病原体刺激机体产生的抗体，IgM型抗体检出为新近感染指标。n细菌耐药性检查抗菌药物的作用机制干扰细菌细胞壁的合成，使细菌不能生长繁殖。影响细菌细胞蛋白质的合成，使细菌丧失生长繁殖的物质基础。破坏核酸的代谢，阻碍遗传信息的复制。n抗生素的广泛使用所造成的抗生素的选择性压力使医院感染控制面临严峻挑战，因此对细菌耐药性的发生机制和耐药监测便成为临床微生物检测中的一项重要工作。n抗菌药物的选择性压力耐药菌株极少xx耐药菌株为主抗生素暴露xxxxxxxxxxn细菌的耐药性及其发生机制1.遗传学机制染色体介导的耐药　为细菌本身所固有的耐药，一般具有种属特异性,如肠球菌耐头孢菌素，一些革兰阴性杆菌耐万古霉素等。质粒介导的耐药　耐药基因易于传播,目前该类耐药在临床上占有重要地位。如由质粒介导的产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。n2.生物化学机制产生灭活酶或钝化酶这些酶可使抗生素失活。如产生β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰基转移酶等。作用靶位的改变作用靶位改变后使抗生素失去作用位点。如甲氧西林耐药的葡萄球菌可以产生一种新的青霉素结合蛋白，使细菌与β-内酰胺类抗生素的亲和力降低而导致耐药。主动外排机制如铜绿假单胞菌对多种常用的抗生素耐药,主要是由于其外膜存在着独特的药物泵出系统。n药物敏感试验1.纸片扩散法（K-B法）菌液浓度：0.5麦氏浊度（1.5×108CFU/mL）琼脂平板厚度：4mm（9cm，25ml；15cm，60ml)抗生素纸片：9cm，6-7张（4张左右）；15cm，12张培养温度、时间：35℃，18-20小时判断标准：NCCLS当年版n“敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制；“耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。“中介”者提示该细菌对常规用量体液或组织中的药物浓度的反应性低，使用高于正常给药量有疗效。n2.液体稀释法104cfu/ml4210.50.250.1250mg/mln耐药菌监测试验1.耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)检测包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRSCoN)。不能使用青霉素和头孢菌素类抗生素治疗。n2.青霉素耐药的肺炎链球菌（PRSP）青霉素是治疗肺炎链球菌的首选药物，耐药菌株对青霉素治疗无效。应用苯唑西林纸片检测。n3.超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的检测主要由革兰阴性杆菌产生，质粒介导的对青霉素和三代头孢菌素以下类抗生素广泛耐药。产酶株不能单独采用青霉素类和三代头孢治疗。n临床感染常见病原体的检查1.流行病学特点新现和再现传染病多重耐药的细菌的出现医院感染和条件致病菌的增加2.临床类型细菌感染是临床常见的感染类型病毒感染发病率最高真菌感染的发病率明显上升n细菌感染细菌培养是最重要的确诊方法病毒感染细胞培养是最常用的病毒分离方法，抗原和血清学检测临床应用最广泛真菌感染真菌培养和形态学检测最常用寄生虫感染从病人血液、体液、排泄物中检查出寄生虫的某一发育虫期，是目前最可靠的诊断方法n细菌感染免疫检测1.血清链球菌溶血素“O”试验溶血素“O”是一种A群链球菌的毒素，属于菌体蛋白，能溶解红细胞。溶血素“O”具有抗原性，可使人产生相应抗体，称抗链球菌溶血素“O”（anti-streptolysin“O”test，ASO）。A群链球菌感染2-3周后，血清中可出现抗溶血素“O”的抗体。滴度升高表明近期有A群链球菌感染，常见于活动性风湿热、风湿关节炎、急性肾小球肾炎等。n2．肥达反应（widalreactionWR）伤寒沙门菌的菌体O抗原和鞭毛H抗原均可刺激机体产生相应抗体，O抗原刺激机体产生的是IgM，出现较早，H抗原产生的是IgG，出现较晚，持续时间较长。WR利用伤寒和副伤寒沙门氏菌菌液为抗原，检测病人血清有无相应抗体的一种凝集试验。O抗体>1:80，H抗体>1:160A、B、C抗体>1:80O升高H不高可能是感染早期或其他沙门菌H升高O不高可能是既往感染或预防接种n性传播性疾病的实验室检查性传播性疾病（sexualtransmitteddiseaseSTD）是一组主要通过性行为为传播途径的侵犯皮肤、性器官和全身多脏器损害的疾病。病原学和临床类型细菌-淋病奈瑟菌，杜克雷嗜血杆菌螺旋体-梅毒螺旋体病毒-HIV、HSV、HPV支原体、衣原体真菌、原虫n1.AIDS检测分为HIV-1和HIV-2两型，主要通过检测血液中相应抗体诊断，ELISA用于筛选，WesternBlot用于确诊。HIV感染后数日或数周内常不能检出抗体，称窗口期，95%的受染者在3个月内可测出抗体。n2.梅毒的检测暗视野显微镜检查：在皮损处，用玻片刮取组织渗出液或淋巴结穿刺液，见有活动的梅毒螺旋体。主要依靠血清学试验，根据所用抗原不同，梅毒血清试验分为以下两大类：非梅毒螺旋体抗原血清试验用心磷脂作抗原，测定血清中抗心磷脂抗体，亦称反应素。本试验敏感性高而特异性较低，目前一般作为梅毒的筛选试验。n性病研究实验室试验（VenerealDiseaseResearchLaboratorytest，VDRL）用心磷脂、卵磷脂及胆固醇为抗原，需用显微镜读取结果。不加热血清反应素试验（UnheatedSerumReaginUSR）也是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似。快速血浆反应素试验（RapidPlasmareagintest，RPR）：是VDRL抗原的改良，优点是肉眼可读出结果。n梅毒螺旋体抗原血清试验用梅毒螺旋体或其成分来作抗原，测定抗梅毒螺旋体IgG抗体。梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）敏感性和特异性均高，常作为梅毒感染的确证试验。n3.淋病检测涂片检查取患者尿道分泌物或宫颈分泌物，革兰氏染色，在多形核白细胞内找到革兰氏阴性双球菌。涂片对男性急性淋病，阳性率在95%左右，可初步诊断。女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，阳性率仅为50-60%，且有假阳性，应以培养为主。n培养检查培养法对症状很轻或无症状的男性、女性患者或慢性患者都是较敏感的方法，培养后需进行菌落形态，革兰染色，氧化酶试验和糖发酵试验。淋病的确诊试验。n医院感染常见病原体检查医院感染（nosocomialinfection）是指患者在入院时既不存在，亦不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。侵入性诊疗技术的广泛应用，人口的老龄化和慢性病患者增多，细菌耐药情况的日趋严重使医院感染日益受到重视。n一.流行病学感染源病原体来源于住院病人.医务人员、探视者、医院环境及未彻底消毒的医疗器械、血液制品等。感染途径内窥镜、插管、介入疗法使感染机会增加。易感人群免疫力低下的住院患者是主要的高危人群。n二.临床类型下呼吸道感染为我国最常见的医院感染类型尿路感染主要为侵入性操作所引起手术切口感染胃肠道感染血液感染皮肤和软组织感染n病房送检—实验室检测统计--院内感染科汇总发布病原学诊断病原学检查：标本涂片或培养分离病房每月、季各菌种检出率不同标本不同菌种发生率及倾向药敏结果不同细菌对各抗生素敏感百分率n医院环境中细菌污染的监测和消毒效果的监测环境的污染是引起医院内感染的危险因素，包括病区内空气、物体表面、医务人员的手；对于手术器械、高压消毒的灭菌情况都应作监测。