芒果植株再生及其在生物技术中的应用 5页

638植物生理学通讯第40卷第5期，2004年10月芒果植株再生及其在生物技术中的应用肖洁凝’,2吴永杰’陈云凤’陈启助‘黄学林’，*，中山大学生命科学学院基因工程教育部重点实验室，广州510275,2广州大学生物与化学工程学院生物系，广州510405ThePlantRegenerationandItsApplicationinBiotechiquesofMangoXIAOJie-Ning',2,WUYong-Jie',CHENYun-Feng',CHENQi-Zhu',HUANGXue-Lin'''TheKeyLaboratoryofGeneEngineeringofMinistryofEducation,SchoolofLifeSciences,ZhongshanUniversity,Guangzhou510275;2DepartmentofBiology,SchoolofBiologyandChemistryEngineering,GuangzhouUniversity,Guangzhou510405提要介绍了近20年来芒果植株再生研究的进展及其在生物技术中的应用。芒果植株再生研究主要通过体胚发生途径进行，用已建立的芒果体胚再生体系进行芒果品种改良已有不少基拙研究，将芒果ACC氧化酶的反义基因导入“Hindi”芒果的PEMs中控制果实成熟以及用芒果胚性培养物与真菌滤出物共培养，已初步筛选出抗炭疽病菌的芒果品种。关键词芒果;体胚发生;器官发生;生物技术芒果(Mangiferaindica)是漆树科芒果属的常绿1.1芒果体细胞胚胎发生和原生质体培养大乔木，产于热带和南亚热带地区，果树速生，Litz等[[51首次报道通过芒果珠心组织进行离体适应性强，可作行道树。其果实外观美丽，果培养，并获得体细胞胚，但体胚不能成苗。肉风味可口，享有“热带水果之王”的美誉。DeWald等[6,7]采用两个多胚芒果品种(Parris和虽然芒果生产发展迅速，但问题还较多。病虫害JamesSaigon)的珠心组织，通过体胚发生途径，是芒果生产中的大敌，其中炭疽病、白粉病、蒂成功地获得再生植株。依据目前的资料，芒果的腐病是严重危害芒果生产的三大病害;而虫害约体细胞胚胎发生主要经过3个阶段:(1)胚性培养有300余种，严重影响芒果的产量以及采后贮运物的诱导;(2)体胚的诱导、分化、发育和成熟;销售，果农常常遭受巨大损失，影响芒果生产的(3)体胚的萌发和成苗。芒果的体细胞胚胎发生主经济效益[1,21。另外，人们对芒果品质的要求也越要是通过间接发生途径[[5--131，即通过愈伤组织或暂来越高，市场的供应期也不断延长。但由于芒果短的愈伤组织阶段，但也有直接发生的【14,151。芒果实不耐低温，不耐贮存，3周后即出现腐烂变果珠心组织的胚性反应能力主要取决于外植体供体软[[31，其种子是典型的顽拗性种子，不耐低温，的基因型和培养基所含的成分[[5-131，以及被珠的对脱水敏感，不耐贮存，寿命极短[41。因此，为发育状态181适应生产和市场的需要，培育品质优良、抗病性诱导胚性培养物的外植体多采用授粉后20~强、耐贮性好、矮化集于一身的芒果品种是芒果60d的幼果或长度约为1~5cm的幼果[[s-131,Patena研究中面临的重要课题。等〔13，认为较小的幼果比较大的幼果胚性反应能力植物生物技术为改良品种提供了一条新途强，DeWald等[[6,71则采用胚占据胚囊腔一半的幼径，本文介绍国内外芒果的植株再生及其在生物果。将分离的珠心组织或去除胚后的半边胚珠组技术中应用的研究进展。织(使珠心组织与培养基接触)置于固体培养基上培1芒果的离体植株再生要通过生物技术进行品种改良和实现超低温种质保存，其首要的条件是建立芒果组织培养再收稿2004-02-17修足2004-05-31生体系。经过多年的研究，己取得了较大的进展资助IPGRI基金(LOA021057)0通讯作者(E-mail:ls17@zsu.edu.cn,Tel:020-84110797).(表1)，特别是芒果体细胞胚胎发生的研究。万方数据n植物生理学通讯第40卷第5期，2004年10月639表1芒果离体培养的形态发生发生途径外植体主要研究内容及结果参考文献‘体胚发生珠心组织获得体胚但不能发育成植株;体胚发生与品种有关︶OO可获得的体胚发生，但只获得较少的萌发苗;体胚发生与品种有关，C乙，获得体胚和植株再生;增殖需要细胞分裂素;体胚发生与品种有关6固体培养基适于体胚诱导;体胚诱导依赖蔗糖，5%-6%蔗糖好;谷氨酞胺可促进体胚发生7经愈伤诱导和悬浮培养增殖，获得高频率体胚发生;试图解决体胚发生中过早萌发、下胚轴体胚二次胚发生以及体胚缺乏两极的问题l4芒果单胚品种的快速体胚发生30对高含水性体胚成熟度的调控进行研究:提高培养基中固化剂(Gel-Gro)浓度;ABA可以促进次生胚的正常发育内1，ABA、渗透压和温度对芒果体胚发生的作用傀2J乙烯促进剂以及抑制剂对体胚发生的影响，乙烯抑制体胚发生，单胚品种产生更多的乙烯9基因型、2,4-D和胚性培养物看护培养对胚性愈伤组织的诱导，2.单胚品种的高频率体胚发生，不同的品种胚性反应能力不同且1，J优化培养基，有效控制褐化，o乙未成熟子叶芒果单胚品种的快速体胚发生1l原生质体培珠心组织形通过原生质体培养进行体胚发生和再生植株养(体胚发生)成的PEMs18器官发生茎尖生长素和细胞分裂素对离体茎尖生长的作用，仅获得了有限的茎尖增殖17叶片从幼叶诱导愈伤，获得再生植株33茎尖叶和茎尖离体培养具有产生大量酚类物质、培养基褐化、植株褐化和污染、生长缓慢问题功体胚苗根体胚苗再生19茎尖、茎节生长素和细胞分裂素对离体茎尖、茎节生长的影响，仅获得了有限的茎尖增殖和腋芽20去顶幼苗获得较大量的子叶节腋芽20子叶形成不定根4成熟胚轴成熟胚轴成苗养，后者被诱导成胚性培养物的能力较前者高[[121时，褐化问题并不严重，对诱导几乎无影响，也培养基主要用MS或1/2MS培养基，也有用RO[121不需更换培养基[151。胚性培养物诱导可在光和BP培养基‘131oThomas"']发现，对于单胚品种下[5-9]或暗中培养[13-151，培养2~10周不等。"ArkaAnmol",RO培养基比MS培养基更容易诱经诱导的培养物需分别转至体胚诱导、分化导胚性培养物。培养基的附加物主要有6%蔗糖、和生长及成熟培养基上进行培养。不同研究者所20%CW,2,4-D,GA,Gln、抗坏血酸及固化用的培养基种类各不相同，有液体、固体或半固剂。值得注意的是，不同研究者在培养基中都添体培养基，培养基的基本成分有改良的B5培养加了60g-L-，蔗糖、20%CW,2,4-D和Gln，这基[6,71,MS或1/2MS[141,RO或改良的1/2B5培养些物质似乎对诱导胚性培养物较有效。Litz等[[91认基(含RO有机物)[，“]以及BP[131。在培养的前期，为2,4-D附加胚性培养物的看护培养有利于某些基培养基普遍加入2,4-D[6,7,12-141，有些还加入GA[12,14]因型体胚的诱导。由于培养过程中产生大量的酚或KT[6头培养的后期，去除培养基2,4-D(但也有例类物质会导致外植体褐化，影响愈伤组织的诱外的)后，加入BA或KT,ABA或GA。所有植导，必须在培养基中加活性碳(AC)以及通过5-7d物生长调节剂使用的浓度大多数为1-5mg-L-'，但也的继代[6,71，以除去酚类物质，但也有些品种胚性有加入更低浓度或更高浓度的[12,13]。培养基中还培养物的诱导不需更换培养基[’1410Patena等〔，，]添加4060g-L-，蔗糖、20%CW,CH,Gln,则通过使用低浓度的2,4-D(0.5mg-L-1)、高压固化剂及其它成分。灭菌的椰子水、固体培养基和BP培养基有效控制DeWald等[6,7]根据比较体胚的诱导、生长和外植体褐化。我们发现在以未成熟子叶为外植体成熟的培养基效果的结果，认为液体培养能加速万方数据n640植物生理学通讯第40卷第5期，2004年10月原胚物质(PEMs)的生长，但若要形成正常的体胚中，75r-min"，振荡培养12h，每2h更换一次新则需转到固体培养基中进行继代培养，否则液体鲜的培养液，以去除酚类物质。将处理过的外植培养基中会引发多种畸形生长;改良的B，培养基体置于加有不同浓度的生长素和细胞分裂素组合的比WPM,ms或改良的ms基本培养基好;在培培养基上培养，结果是，在含有0.24mg-L-'养基中添加50k--6%的蔗糖有利于体胚的产生;使NAA和2mg-L-'6-BA的培养基上的外植体生长用Gehite较DifcoBacto的效果好，并认为Gehite最快，培养4周便可看到芽的形成，萌动的芽经含有某些有利于体胚生长的物质，如Ca和Mg.培养3周，平均长度可达5.8cm，用叫噪丁酸外植体大多数应在暗中培养数周以上，这可防止(IBA)处理后可有20%的苗出根。体胚过早萌发，但过长的黑暗培养会影响体胚的采用茎尖或茎节培养只能得到有限的茎尖增萌发率(16]0殖和腋芽，且难以生根【1s-201。王晓峰和傅家瑞[[a)成熟的体胚被转置萌发和成苗培养基上进行用成熟芒果的离体胚轴进行培养获得了再生植株，光照培养，所采用的基本培养基有改良的B5培养他们发现0.5%AC可有效抑制胚轴的褐变。WPM基(6a],1/2改良B，培养基[10,111,1/2MS[14],1/2B5液体培养基外加0.5%AC,3%蔗糖、6mg-L-'培养基(含RO有机物)[12]或BP培养基(13]。培养基IBA,4mg-L-'KT适宜芒果离体胚轴的萌发和生中不加入植物生长调节剂或加入细胞分裂素类似长。物，如6-BA(14]或,LDZ(12]蔗糖浓度为1530g-L;',我们曾研究过十多种外植体不定芽的诱导效大多数实验体系加200/0CW，常可通过高温灭菌13,15]果，所用的外植体包括成年树的顶芽、叶柄、花或过滤灭菌“..7功口入培养基中。枝和幼果，一年生幼苗的顶芽、茎节段、叶柄虽然有较多的品种已建立的了体胚再生体和叶片，离体幼苗的茎尖、茎节段、子叶节、系，但仍有一些品种几经试验而不能成功，如根尖和叶片，成熟胚的子叶以及去顶幼苗子叶节"RedItamaraca"(16]。另外，体胚的成苗率还普等，发现只有萌发7d的去顶幼苗子叶节能诱导遍较低，一般为10%-30%，最高为63%(7];常出出3-7个腋芽，它们在含5mg-L-'IBA的生根诱现体胚苗生长缓慢和根发育不良等现象[(7.12]0导培养基上预培养5d，再在生根培养基上培养1目前，对芒果原生质体培养进行研究的只有周后能诱导出根，但炼苗移栽难以成活[2010印度的Ara等人(川。他们用珠心组织(品种为成熟的芒果子叶形成不定根较为容易，培养Amrapali)所建立的悬浮培养体系，已获得原胚物21d后，平均生根率达64%(在不含营养成分和植质，然后将其置于原生质体分离培养基(PIM，培物生长调节物质的琼脂培养基上)。芒果子叶生根养基内含B5大量元素、MS微量元素及其它附加的位点主要在近轴面切口上表皮的主维管束处。物，并含1.2%纤维素酶、1.0%半纤维素酶和2,4-D抑制子叶不定根的形成，但诱导子叶形成根0.6%果胶酶)中以去除细胞壁，经分离的原生质状物或瘤状物。5和50mg-L-，的NAA对子叶切体再次诱导形成微愈伤组织(microcalli)，在含有段生根作用不明显，当浓度达到100mg-L"，时，则植物生长调节剂的培养基上增殖，而在不含植物推迟芒果子叶不定根的形成，减少根的数目。5,生长调节剂的培养基上即形成体胚，体胚的萌发50和100mg-L，的IAA和IBA都可促进子叶生根，率约为40%-60%，成苗率约为30%.可使子叶生根百分率比对照增加35%以上，平均1.2芒果器官发生生根数增加60%以上。200mg-L-‘的三碘苯甲酸虽然人们己对芒果器官发生进行了一些研(TIBA)可完全抑制子叶不定根的形成，加入IBA究，但成功得到再生植株的例子还较少，成功的可部分逆转抑制效应。子叶不同切面不定根形成报道是Raghuvanshi和Srivastava('7]用“Amrapali"的能力差异可能与生长素的极性运输有关[201a芒果充分展开的幼叶，通过诱导愈伤组织，得到我们采用这一实验体系，通过抑制扣除杂交了再生植株。他们将消毒后的外植体接种到含方法(SSH)，获得6个可能与不定根形成相关的0.05%a聚乙烯毗咯烷酮(PVP)的MS液体培养基cDNA片段，这些片段的cDNA所推导的蛋白质分万方数据n植物生理学通讯第40卷第5期，2004年10月别与膜运载蛋白、甲酸脱氢酶(FDH),ABC转运体胚体系初步研究基因转化，将NP711基因整合蛋白、乙酞辅酶A梭化酶和转录因子同源;用到体胚中，发现不同发育时期的体胚对卡那霉素RACE法对与拟南芥生长素反应因子同源的cDNA的敏感性不同，发育前期的体胚比发育后期的体片段进行扩增，获得包含完整读码框架(ORF)的2胚更为敏感。Mathews和Litz1161将含有葡糖醛酸个基因的序列，分别命名为MiARFI芒果生长素酶和新霉素磷酸转移酶基因的pTiT37-SE::反应因子类蛋白基因1)和MiARF2(芒果生长素反pMON9749与胚性培养物(直径少于1000Jim)共培应因子类蛋白基因2)[21,221，现正对其功能作进一步养后，获得了转基因植株，但转基因植株中不含分析。目的基因。直到1997年，Cruz-Hernandez等[2512芒果离体培养在生物技术中的应用用pBIl21双元载体通过土壤农杆菌LBA4404介导人们采用己建立的芒果体胚再生体系，对芒转化，成功地将芒果ACC氧化酶的反义基因导入果进行品种改良等生物技术的研究(表2)。自1990"Hindi”芒果的PEMs中，试图获得控制果实成年开始，Litz等[231以及Mathews和Litz[241用建立的熟的转基因植株，但未见转基因植株的后续报道。表2芒果离体培养在生物技术中的应用材料来源生物技术的研究参考文献胚性培养物(珠心组织)筛选抗炭疽病菌的胚性培养物26胚性培养物(珠心组织)筛选抗炭疽病菌及毒植物素的胚性培养物，并分析其机制27体胚(珠心组织)将NPTII基因整合到体胚中:不同发育时期的体胚对卡那霉素的敏感性不同;发育前期23,24的体胚比发育后期的体胚更为敏感体胚(珠心组织)P-葡糖醛酸酶(GUS)基因和新霉素磷酸转移酶基因(NPTII基因)转化16体胚(珠心组织)ACCase反义基因的转化25胚性培养物(未成熟子叶)用PEMs成功地进行超低温保存28为T培育抗炭疽病(由真菌Colletotrichum能解决生产中的问题。因此，今后应加强研究的gloeosporioide:引起)的芒果品种，Litz等[261通过问题有:(1)国内对芒果植株再生研究的品种较芒果胚性培养物与上述真菌滤出物共培养时，初少，应扩大植株再生研究中的品种数目:(2)在现步筛选出抗炭疽病菌的体胚。Jayasankar和Litz[271有的基础上，加强离体培养调控因素的研究，特对抗菌及抗毒植物素的胚性培养物作了进一步研别是体胚成熟的同步化及成苗率，建立完善的芒究，发现抗菌及抗毒植物素的胚性培养物可抑制果植株再生体系;(3)用经超低温保存的植物，进菌丝的生长，抗菌的胚性培养物分泌的几丁质酶一步研究其抗冻的机制，克隆出与抗冻有关的基和葡聚糖酶增多，这在筛选抗炭疽病菌的芒果中因，用以进行芒果品种改良;(4)用现有的植株再迈出了可喜的一步。生体系，进一步加强芒果离体培养在生物技术中在芒果种质超低温保存方面中，我们采用玻应用的研究，利用基因工程等技术，培育抗病、璃化方法于液氮中低温保存了芒果胚性培养物，存抗虫害的新品种，改善芒果果实的品质，控制果活率90%以上，这些经过超低温保存过的胚性培实的成熟;(5)不同发育时期的芒果子叶具有不同养物可通过体细胞胚胎发生的途径再生植株。试的离体形态发生能力。以幼胚的子叶为外植体可验结果证实芒果的胚性组织培养物可作为芒果种质进行有效的体胚发生，而成熟胚的子叶却能在无长期保存的良好试材，只需用简单的玻璃化液预激素的培养基中易形成不定根，并具有很强向胚处理就可直接在液氮低温下长期保存[[28]0轴极性，因此芒果子叶不但是建立体胚再生植株3结语的有效外植体，而且对离体形态发生的调控机制虽然芒果离体培养的研究己有20多年，取得的研究来说也是一种理想的材料，可对其调控机了不少结果，但许多研究仍处于实验阶段，远未制开展研究。万方数据n642植物生理学通讯第40卷第5期，2004年10月参考文献(MangiferaindicaL),kiwi(ActnidiaargutaPlanch.ExMiq.),pomegranate(Punicagranatumvar.nana(L.)Pers)1途万兵，刘岩芒果高产栽培.北京:金盾出版社，1995.1116andpistachio(PistaciaveraL.).Berlin:Koster,1993.26--452黄国弟.我国芒果选育种研究现状及发展趋势.中国果树，19梁永恒芒果种质资源的保存及外植体植株再生1硕士学位2000,(3):4749论文].广州:中山大学，19983LakshminarayanaS.Mango.In:NagyS,ShawPE(eds).Tropi-20肖洁凝.芒果(MangiferaindicaL.)离体形态发生的调控及calandSubtropicalFruits:Composition,PropertiesandUses.不定根形成相关基因的克隆[博士学位论文].广州:中山大Westport:AVIPublishing,1980.184257学，20034王晓峰，傅家瑞芒果种子的脱水与贮藏研究植物学报，1991,21肖洁凝，黄学林，张以顺等芒果子叶切段不定根形成相关33(2):118123基因的cDNA片段的克隆.植物生理与分子生物学学报，5LitzRE,KnightRJ,GazitS.Somaticembryosfromcultured2004,30:136140ovulesofpolyembryonicMangiferaindicaL.PlantCell22肖洁凝，黄学林，黄霞等.芒果生长素反应因子类蛋白的cDNARep,1982,1:264266克隆和表达.生物工程学报，2004,20:59626DeWaldSG,LitzRE,MooreGA.Optimizingsomaticem-23LitzRE,MathewsH,BharathanNetal.Transformationofbryoproductioninmango.JAmSocHorticSci,1989,114:somaticembryosofmango.InternationalCongressonPlant712716TissueandCellCulture,1990,7:67(abstract)7DeWaldSG,LitzRE,MooreGA.Maturationandgermina-24MathewsH,LitzRE.Kanamycinsensitivityofmangoso-tionofmangosomaticembryos.JAmSocHorticSci,1989,maticembryos.HortScience,1990,25:965966114:837--84125Cruz-HernandezA,GomezLimMA,LitzRE.Transforma-8LitzRE.Invitrosomaticembryogenesisfromnucellarcallustionofmangosomaticembryos.ActaHort,1997,455:ofmonoembryonicMangiferaindicaL.HortScience,1984,29229819:71571726LitzRE,MathewsVH,HendrixRCetal.Mangosomaticcell9LitzRE,HendrixRC,MoonPAetal.Inductionofembryo-:genetics.ActaHortic,1991,291:133~140genicmangoculturesasaffectedbygenotype,explanting,2,27JayasankarS,LitzRE.Characterizationofembryogenic4-Dandembryogenicnurseculture.PlantCellTissOrgCult,mangoculturesselectedforresistancetoColletotrichum1998,53:13-18gloeosporioidesculturefiltrateandphytotoxin.TheorAppl10AraH,JaiswalU,JaiswalVS.RootingofmicroshootsofGenet,1998,96:823831Mang诉raindicaL.cv.Amrapali.CurrSci,1998,74:24024228WuY-J,HuangX-L,XiaoJ-Netal.Cryopreservationof11AraH,JaiswalU,JaiswalVS.Plantregenerationfromproto-mango(MangiferaindicaL.)embryogeniccultures.plastsofmango(MangiferaindicaL.)throughsomaticCryoletters,2003,24(5):303314embryogenesis.PlantCellRep,2000,19:622--62729DeWaldSG.Invitrosomaticembryogenesisandplantregen-12ThomasP.Somaticembryogenesisandplantletregenera-tionfromnucellartissueofmonoembryonicmango.JHorticerationfrommango(MangiferaindicaL.)nucellarcallusSciBiotech,1999,74:135139[PhDDiss].Gainesville:UniversityofFlorida,198713PatenaLF,Carlos-RefuerzoLR,BarbaRC.Somaticem-30MonsaludM-J,MathewsH,LitzREetal.Controlofbryogenesisandplantletregenerationinmango(Mangiferahyperhydricityofmangosomaticembryos.PlantCellTissindicaL.).InVitroCellDev-PI,2002,38:173177OrgCult,1995,42:19520614JanaMM,NadgaudaRS,RajmohanKetal.Rapidsomatic31Pliego-AlfaroF,LitzRE,MoonPAetal.Effectofabscisicembryogenesisfromthenucelliofmonoembryonicmangoacid,osmolarityandtemperatureoninvitrodevelopmentofvarieties.InVitroCellDev-P1,1994,30:55-57recalcitrantmango(Mang诉raindicaL.)nucellarembryos.15XiaoJ-N,HuangX-L,WuY-Jetal.Directsomaticembryo-PlantCellTissOrgCult,1996,44:5361genesisinducedfromcotyledonsofmangoimm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