高效白腐真菌的筛选及其对印染废水处理效果的研究及应用 9页

高效白腐真菌的筛选及其对印染废水处理效果的研究及应用可行性研究报告一、立项的背景和意义绍兴是纺织印染大市，印染工业已成为现代工业中环境污染最严重的产业之一。据报道，绍兴每年染料的总产量近1.0×105t，其中大约有10%～15%的染料会直接随废水排入环境当中。印染废水具有水量大、色度高、有机物浓度高、COD高及组分复杂等特点。由于染色时用的染料和助剂种类繁多，使废水中除了染料等难生物降解的物质外，还有大量无机盐、硫化物等。其中含硝基和氨基的染料化合物具有较大的生物毒性，一些染料的降解产物还为联苯胺等致癌的芳香胺化合物。因此，印染废水的脱色和回用已成为一个生态环境和水资源保护的重要课题。目前，对印染废水的处理方法主要有物理、化学法和生物处理法，虽然这些方法通过长期的应用和实验证明对印染废水处理具有一定的效果，但也明显存在一些问题。物理和化学处理技术费用太高，还经常伴随产生大量的固体废物；生物法与之相比，虽然运行费用低且无二次污染，但传统活性污泥法中的微生物对非偶氮染料基本没用脱色效果（偶氮染料可以在厌氧条件下脱色，但是几乎不能在好氧条件下脱色）；而且在厌氧条件下对活性染料进行脱色，还可生成苯胺等有毒及致癌物质。此外，由于当今印染业不断朝着染料稳定性和抗氧化性提高的方向发展，使得传统微生物在降解印染废水时日益面临困难。因此，面对染料行业的不断发展，如何筛选出新的高效微生物品种并研制最佳的操作工艺是现今印染废水处理的当务之急。自20世纪80年代《Science》首次报道了白腐真菌（Phanerochaetechrysosporium）能向胞外分泌降解木质素的酶以来，引起环境界的广泛关注。随后科研人员对白腐真菌生物学特性、降解规律、生化原理、酶学、分子生物学、工业化生产以及环境工程实际应用等方面进行了大量研究。许多研究证实了白腐真菌在废水处理中是很有发展前景的微生物，其中研究最多的是黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)。白腐真菌产生的细胞外酶(包括木质素过氧化物酶Lips和锰过氧化物酶Mnps)被认为是降解木质素和染料的特殊酶系。第9页共9页n这些酶具有非特异性、无需底物诱导的特殊性能，对许多结构不同、高度稳定、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力，它能通过白腐真菌所分泌的特殊的降解酶系及其它机制将各种人工合成染料彻底降解为CO2和H2O。白腐真菌正因为其极强的降解能力和特殊的代谢类型而成为近年来国内外研究的热点。尽管大多数研究的目标是评价白腐真菌处理废水中污染物的能力，但是目前无论国内还是国外，对白腐真菌处理染料废水研究大多还停留在实验室研究阶段。主要原因是白腐真菌属于低等真核微生物，生长速度很慢，一旦反应体系有细菌进入，细菌就会与白腐真菌争夺培养基中的营养物质，在反应体系内占优势。白腐真菌将因缺乏营养而停止生长，进而影响胞外降解酶系的分泌，致使整个处理系统失去降解染料的功能。因此，如何解决白腐真菌在非灭菌条件下有效抑制细菌生长而使白腐真菌在整个处理过程始终占优势，以及降解含染料废水过程中的工艺效率是关系到该技术能否应用到实际工程中的瓶颈。二、国内外研究现状和发展趋势白腐真菌多属担子菌纲，寄生或腐生在树木或木材上，能释放降解性酶降解木质素、纤维素，侵入木质细胞内获取营养而引起木质腐烂成为海绵状白色团块。它是整个碳素循环的中心，是已知的唯一能在纯系培养中将木质素降为CO2和H2O的一类微生物。白腐菌分布很广，在分类学上大多数属于担子菌纲，有1000多种，包括多孔菌(如Polyporusparagamenus、Polyporusancepts)、杂色云芝(Polystictusversicolor)、丛片韧革菌(Stereumfrustulosum)等。它的菌丝体为多核，少有隔膜，无锁状联合。多核的分生孢子常为异核，担孢子却是同核体，存在同宗配合和异宗配合两类交配系统。大多数白腐真菌具有脱色及降解能力是因为它们在次级代谢阶段产生木质素过氧化物酶(Lips)、漆酶(Laccase)、锰过氧化物酶(Mnps)。然而，锰过氧化物酶比木质素过氧化物酶起到更为关键的作用。其降解包括胞内和胞外2个过程：在细胞内，主要合成降解染料及有机污染物所需要的酶，首先合成的是细胞内葡萄糖酶和细胞外乙二醛氧化酶，它们在外界供给的分子氧参与下氧化染料并生成H2O2，从而激活过氧化物酶而启动酶的催化循环。同时分泌胞外酶木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶，细胞内的cAMP可能参与Lips和Mnps的表达调控；胞外降解过程主要包括3种酶系--Lips、Mnps、Laccase，催化染料的非专一性氧化反应。早期的研究多采用悬浮法培养白腐真菌来降解染料，1983年Glenn和Tien第9页共9页n首次发现过氧化物酶以来，应用白腐真菌降解难降解有机化合物的研究主要有两方面：一方面是直接将待处理有机化合物加人到白腐真菌的活性培养液中，利用白腐真菌分泌的胞外过氧化物酶对其直接氧化。Tatarko等曾采用Phanerochaetechrysosporirm对刚果红偶氮染料进行脱色研究，发现振荡液体培养和麦芽汁琼脂固体培养Phanerochaetechrysosporirm对刚果红偶氮染料都具有较好的脱色能力。另一方面是先将过氧化物酶从活性培养液中提取出来，然后把这些经过纯化的酶液加入到含有污染物的待处理液中实施对污染物的降解。2000年Schliephake等应用经纯化的漆酶对双偶氮染料进行降解，发现纯化后的漆酶在60℃能够稳定，而且其对染料的脱色率随着酶量的增加而增加。2002年Verma等用部分纯化的木质素过氧化物酶对种工业染料进行脱色，发现添加的黎芦醇、过氧化氢、酶量和染料浓度对染料脱色效率影响较大。从两者的效果来看，纯化过的酶更能发挥降解功能。总之，采用酶液对染料进行降解的方法优点是具有较高的独立性，受废水成分影响小，但它的缺点是提取和纯化这些过氧化物酶需要很高的成本。另外，直接利用酶液处理废水还存在酶的失活问题。研究发现白腐真菌固定化培养有利于染料的降解，将白腐真菌细胞固定化后，白腐真菌菌丝体的生长和产酶量增加，提高了脱色效率，从而可以解决白腐真菌在实际工程应用中的生长控制和长时间保持胞外酶浓度问题。1999年Reyes等用活性琼脂糖固定漆酶后对工业染料的脱色效果，结果发现经固定化的漆酶在系统运行10个周期后活性仍然保持在最初的85%左右，同时还发现添加羟基苯并三唑有利于提高固定化漆酶对染料的脱色率。2003年Moldes等采用在用尼龙海绵块填充的固定床管式生物反应器中Phanerochaetechrysosporirm半固态发酵获得的粗酶液对PolyR-478和结晶紫进行脱色试验，获得了较好的效果。Kapdan等用摇瓶实验研究了白腐真菌在金属网、海绵、石粒、木灰、聚亚安醋和木屑上固定时的脱色性能。结果显示，金属网载体优于其它固定化材料，其脱色率达到97%。2002年Shin等也通过摇瓶试验研究了几种天然材料（小麦杆、枫木片、大麻纤维、大麻席子和黄麻线）和人工合成材料（尼龙纤维、聚乙烯纤维和大麻一聚丙烯纤维）对白腐真菌Trametesversicolor的固定效果以及随后对觅红的脱色效果，试验结果显示黄麻作为Trametesversicolor生长所需的固定化材料最好。随后2003年Kasinaty等应用聚氨酷泡沫和松木作为载体对白腐真菌Irpeslacteus进行固定化，并考察了两种载体上生长的Irpeslacteus对Remazol亮蓝R染料的脱色情况，第9页共9页n结果显示聚氨醋泡沫载体上产生的锰过氧化物酶比松木载体产生的高。2000年Zhang等将粉末活性炭加到白腐真菌Trametesversicolor菌丝小球中，发现复合菌丝小球对偶氮染料的脱色率最高和最稳定。由此可见，可用作白腐真菌固定化的载体材料种类较多，筛选出一种高效降解、廉价的材料是非常重要。白腐真菌降解染料的生物反应器可解决白腐真菌的生长控制和长时间保持胞外酶浓度问题。白腐真菌长期培养的生物反应器的开发是使这项技术工业化的先决条件。在纯培养（无菌条件）下运行的不同类型生物反应器已有报道，1999年Zhang等设计了连续流填充床生物反应器、间歇补料流化床生物反应器和连续流流化床生物反应器三种不同结构的反应器，并对它们对偶氮染料的脱色效果进行了研究。3种白腐真菌生物反应器在长期运行中均表现出较高的和稳定的脱色效果，其中间歇补料流化床生物反应器脱色效率最高。2001年Mielgo等应用Phanerochaetechrysosporium在一个连续填充床生物反应器里进行了偶氮染料降解研究，该反应装置对偶氮染料的脱色率在95%以上。2004年Lopez等开发了一种酶--膜反应器（EMR）来对偶氮进行脱色，该反应器主要由一个搅拌罐反应器和一个超滤膜组件组成，得出连续运行方式脱色率最好。近些年来，人们对在非来菌条件下使白腐菌处理印染废水日益迫切。1999年Leidig等用聚乙烯醇包埋法保护了白腐真菌和细胞外产生的过氧化物酶免受细菌攻击，被聚乙烯醇小球包裹着的白腐真菌仍能分泌木质素过氧化物酶，并连续进行生物降解。2003年等Libra采用悬浮培养和细胞固定化两种方法进行试验，发现采用氮限制培养基和谷物均可获得较好的抑菌效果，对染料的脱色率依赖于接种白腐真菌量。综上所述，白腐真菌因其广谱的降解范围、低廉的营养要求、彻底的降解性和对固液基质的适应性等特点，使其在处理染料废水的应用中具有经济、高效、实用等多项优势。但是对非灭菌环境下有效抑制细菌的机理研究还很不深入，而我国对白腐真菌的研究本来就起步较晚，与国外相比还存在一定差距。因此，果断抓住当前国外对白腐真菌应用过程中的染菌问题仍处在起步阶段这一契机，深入研究非灭菌环境下白腐真菌降解印染废水的控制策略以及固定化技术将有助于解决目前印染废水处理的困境。第9页共9页n三、项目研究开发内容和技术关键及主要创新点主要开发内容：1.针对不同的印染废水，从本地自然生态系统筛选出对印染废水（色度、难降解有机物）具有相应高效降解功能的白腐真菌菌株。2.对筛选获得的白腐真菌进行驯化，以提高其降解印染废水的效率。3.实验室条件下对筛选白腐真菌菌株的生长条件进行优化研究，确定适宜影响因子范围（主要因子为：培养温度、pH值、营养物、分子氧含量、染料结构等）。4.因为白腐真菌在非灭菌培养条件下易受杂菌感染和攻击从而失去降解能力，为解决这一问题，运用微生物载体进行保护从而维护其持续降解能力。技术关键及主要创新点：白腐真菌的研究主要引进国外菌种，国内菌种开发较少，本研究主要对本地森林生态系统白腐真菌进行采种驯化和培养，以获得降解印染废水色度和COD效果上乘的良好菌种，其技术关键和创新点有以下几点：1.从本地森林生态系统采集降解木材的白腐真菌，获得种源进行鉴定，本土优良菌种往往具有较强的适应能力。这一研究对于开发我国本土白腐真菌，不依靠进口国外菌种具有重要意义。2.设计若干指标测定菌种的生长条件的最佳参数，特别是弄清楚pH值、培养温度、碳氮比（营养物）、产酶效率（酶活）、降解印染废水色度和COD的效果等，筛选出适应性较强的优良菌株。（本研究的前期基础已经做了如下工作：①菌种的分离与培养——菌种采自绍兴小舜江水库森林系统腐败朽木之上；②已经开发出专用培养基配方）。3.重点了解筛选菌种在降解印染废水色度和有机物的效果及筛选设计。白腐真菌对5种染料脱色初筛设计_____________________________________________________________________染料Dyes（50mg/L）已筛选3种菌株____________________________________________________________________________刚果红橙黄G结晶紫中性红亚甲基蓝____________________________________________________________________________________________1降解色度、COD数据4.利用白腐真菌构建膜生物反应器处理染料废水。这种反应器（自行设计）是利用白腐真菌对难降解有机物的高效降解能力，以及膜生物反应器的高效降解效率来完成染料废水的脱色降解。本研究第9页共9页n构建白腐真菌生物接触氧化装置，采用连续和间歇两种运行方式处理染料废水，确定当进水浓度为15mg／L，停留时间为24小时，连续式运行，混合染料废水脱色率达到的效果（刚果红、橙黄、结晶紫中性红、次甲基蓝脱色率）。5.采用固定化白腐真菌促进菌体生长和产酶，固定化白腐真菌技术在促进菌体生长和产酶方面比悬浮培养有明显优势，这主要是由于载体有利于营养物质的传递以及菌丝体能充分伸展，进而促进菌丝体的此生代谢，提高产酶量。本研究将在175rpm转速下，用聚氨酯泡沫固定白腐真菌，提高Lip产酶量。6.白腐真菌目前研究仍然停留在实验室条件下，实际工程中很难应用的主要瓶颈是反映体系的染菌问题，本研究创新性的将从载体的空间架形式上有利于抵御杂菌的进攻原理，从而使白腐真菌在降解系统中处于优势地位。在非灭菌条件下用聚乙烯醇包埋法保护白腐真菌和细胞外产生的过氧化酶免受细菌攻击，使系统长时间保持最高酶活，提高对染料的脱色率。四、项目预期目标1.筛选出具有高效脱色功能的白腐真菌菌株和固定化材料。2.绍兴每年染料的总产量近1.0×105t，其中大约有10%～15%的染料会直接随废水排入环境当中。该项目完成后可基本建立适合白腐真菌长期非灭菌培养的生物反应器及工艺，使其对主要印染废水的脱色及CODcr、TP、SS的去除率较大幅度提升。与传统的活性污泥相比，效率提高20%以上。3.至项目完成时，可实现销售收入100万元，利润10万元；建成后一年内可实现销售收入600万元，利润150万元，税金60万元。4.发表论文1篇。五、项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解项目实施方案：1.针对不同的印染废水从自然界中筛选出具有相应降解功能的白腐真菌。先从自然界中多种腐生木材中大范围选取白腐真菌，在实验室进行无菌培养、筛选、纯化、鉴定、编号。然后进行扩菌培养，摸索培养条件。最后选取几种不同印染废水与所筛得的白腐真菌进行组合处理实验，找出各自的最佳处理组合。2.对筛选获得的白腐真菌进行驯化，以提高其降解印染废水的效率。第9页共9页n通过进一步优化白腐真菌的反应条件，如温度、pH值、溶氧、营养物质、催化剂等，进筛选的白腐真菌进行驯化，研究提高其降解印染废水效率的条件。3.白腐真菌的固定化材料筛选及微生物复合。选取谷物、木质纤维素等氮限制性载体，研究其对多种已驯化的白腐真菌的固定能力，找到一种能同时复合多种白腐真菌的最佳组合。4.白腐真菌长期非灭菌培养的生物反应器及工艺开发。设计种不同结构的反应器，如连续流填充床生物反应器、间歇补料流化床生物反应器和连续流流化床生物反应器，并对它们的脱色效果和工艺进行研究，找到一种经济、简便的工艺。技术路线：从自然界大范围选取白腐真菌无菌培养、筛选、纯化、鉴定、编号白腐真菌长期非灭菌培养的生物反应器研发进行不同白腐真菌处理不同印染废水组合实验白腐真菌的固定化材料筛选及微生物复合技术筛选出各自的最佳组合规模化印染废水工艺研发对筛选获得的白腐真菌进行驯化第9页共9页n课题组采取分组实施，集中管理的方式进行，课题可分解为二大部分：1.白腐真菌筛选和驯化。（在***实验室进行）2.白腐真菌的固定化材料筛选、微生物复合和处理工艺。（在用户方示范应用）六、计划进度安排1.2011年1月至2011年6月筛选出具有相应降解功能的白腐真菌。2．2011年7月至2011年10月对筛选获得的白腐真菌进行驯化。3．2011年11月至2012年5月白腐真菌的固定化材料筛选及微生物复合。4．2012年6月至2012年10月白腐真菌长期培养的生物反应器及工艺开发；用户推广应用。5．2012年11月至2012年12月项目验收。七、现有工作基础和条件承担单位是一家专门从事节能、环保技术开发、推广的专业企业，已具备部分试验设备和相关研究人员，并聘请了国内部分大学的教授、专家作为本公司的技术力量和顾问，已在相关的技术研发投入大量的资金和研究力量，在某些方面已取得较大进展。特别是已在复合物化材料配置和相关污水污泥处理方面针对性地开展了大量前期研究，积累了大量试验经验和试验数据，已经取得了部分阶段性研究成果,本项研究是前期研究的深化和完善。合作单位具有生态环境与工程研究所等各种科研机构54所，设有相关的环境科学专业，建有省级生物学实验基地等，有利于开展环境整治、污染控制等相关的研究、教学、培训、技术开发和服务。近年来，在生态环境建设、水污染控制与处理、鉴湖湿地保护与恢复、城市固体废弃物处理、水环境污染整治、绍兴养殖水体综合控制、鉴湖水系生态修复、印染水体回用、城市固体废弃物资源化处置等方面开展了大量研究工作，取得了一批显著成果。积累了与本项目有关的大量资料和丰富的研究经验，为项目的实施奠定了良好的基础。在项目研究支撑条件方面，承担单位与合作单位已购买并计划购买相关设备仪器。如气相色谱仪、PCR仪、凝胶成像系统、超速离心机、电泳仪、分光光度计、原子吸收仪、TOC分析仪、超纯水装置、紫外分光光度仪、质谱仪、水质在线监测仪、GPS野外全球定位系统和测量设备，X射线荧光光谱仪等先进仪器设备。实验装备及实验手段均能满足项目需求为项目的实施创造了良好的设备支撑条件。第9页共9页n本项目由承担单位和合作单位联合共同承担，采用优势互补的合作方式，发挥承担单位的科研优势和合作单位的监测分析优势，整合优化高校和院所相关资源，同时共同提升科研创新能力和服务地方的实力。承担单位为本项目的主体实施单位，统筹课题研究任务的全面开展；合作单位作为本项目实施的技术协作单位，同时承担课题大量基础性工作。八、经费预算科目预算金额（万元）其中:申请专项资金（万元）1.设备费 80.0010.002.能源材料费 46.0010.00 3.试验外协费 20.00 10.004.资料印刷费 5.00 5.会议及调研费 8.00 6.租赁费 8.00 7.验收费8.人员经费 20.00 9.管理费 8.0010.其他费用5.00 合计200.0030.00第9页共9页