高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用 84页

论文分类号：２学校代码：１０７０８学号：１５０１０３３ＳＨＡＡＮＸＩＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＣＩＥＭＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ硕士学位论文’ＴｈｅｓｉｓｆｏｒＭａｓｔｅｒｓＤｅｇｒｅｅ高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用魏：廣ｉＩ晔．ｉ王指导教师姓名：张安龙教授王雪青副教授学科名称：环境工程论文提交日期：２０１８Ｗｉｆｌｌｌ年３月论文答辩日期１８年５月：２０学位授予单位：陕西科技大学——■■■ｍｍｍｍ—ｍ＾ｍn申请工学硕士学位论文论文题目：高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用学科门类：工学一级学科：环境科学与工程培养单位：环境科学与工程学院硕士生：王晔导师：张安龙教授，王雪青副教授2018年5月nIsolationandIdentificationofaHighlyEfficientPhenol-degradingFungusanditsApplicationasBioaugmentationInoculuminWastewaterAThesisSubmittedtoShaanxiUniversityofScienceandTechnologyinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofEngineeringScienceByYeWangSupervisor:Prof.AnlongZhangA/Prof.XueqingWangMay2018nn高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用摘要苯酚是制药、焦化、造纸、塑料等行业废水中普遍存在的有毒难降解有机污染物之一。随着经济社会的不断发展，含酚废水的污染问题愈发严重，对生态环境造成了严重威胁。生物法处理含酚废水因成本低，无二次污染而具有广阔的应用前景。本文以陕西某造纸厂好氧处理段的活性污泥为样品，遴选出一株对苯酚耐受性高，降解效果好的菌株并将其命名为QWD1。通过形态观察、ITSrDNA基因测序进行种属鉴定并构建系统发育树后表明，QWD1为丝状真菌，属于Magnusiomycescapitatus。同时，对菌株苯酚降解机制进行了初步探究，通过测试QWD1菌株的苯酚关键降解酶邻苯二酚1，2双加氧酶和邻苯二酚2，3双加氧酶的活性，推测得到QWD1降解苯酚路径为邻位开环。对影响生物修复的实验因素包括氮源种类、接种量、pH、温度、氮源浓度等参数进行优化后，在一定程度上提高了菌株QWD1的苯酚降解效率，其在液体培养基中对苯酚的耐受阈可以达到1600mg/L；优化结果显示QWD1菌株最适降解条件为：(NH4)2SO4为氮源，接种量15%，pH7，温度35℃，氮源浓度14mmol/L。在此条件下，28小时内对1600mg/L苯酚去除率可以达到97.15%。通过对比无机载体（蛭石、硅藻土）和有机载体（麦麸、谷糠）对菌液的吸附效果以及制备菌剂后的保存效果，对QWD1降酚菌剂的载体选择和适宜保存温度进行了初步研究。结果表明谷糠不仅吸水率高，对QWD1菌株有较好的吸附效果，且制备的菌剂在长期保存的过程中pH变化较小，保存时间较长。同时，在对比4℃和常温条件下不同菌剂的保存效果后，发现4℃的保存效果均优于常温保存，其中以谷糠为载体制备的菌剂4℃条件下保存时间可以达到90d甚至更长，活菌数高达2.5×108cfu/g左右，对含酚废水的处理效果也优于其他菌剂，24h对苯酚的去除率均可以达到100%左右。最后考察了投加生物强化菌剂对活性污泥处理模拟含酚废水效果及其微生物群落结构的影响。发现投加降酚菌剂可以明显提高活In性污泥对含酚废水的处理效果，缩短完全降解苯酚所需时间，提高COD去除效率和总去除率；优化得到的最适菌剂添加量为4g/L，24h时可将浓度为1600mg/L的苯酚完全降解，60h时COD去除率可达到94.7%。利用高通量测序技术分析经生物强化和非强化的活性污泥中的微生物群落结构后发现，降酚菌剂的添加可以提高反应器处理废水过程中细菌和真菌的丰度及多样性，投加的QWD1（Magnusiomycessp.）菌株可在菌剂强化处理系统中成为优势菌种；降酚菌剂的投加不仅可以使参与酚类代谢的微生物种群规模扩大，并能有效地提高处理系统后期的微生物多样性，有利于进一步形成稳定的微生物生态系统。关键词：降解苯酚，真菌，强化菌剂，活性污泥IInIsolationandIdentificationofaHighlyEfficientPhenol-degradingFungusanditsApplicationasBioaugmentationInoculuminWastewaterABSTRACTPhenolisoneofthetoxicandrefractoryorganicpollutantsinthewastewaterofpharmaceutical,coking,papermaking,plasticandotherindustries.Withthecontinuousdevelopmentoftheeconomyandsociety,thepollutionofphenolicwastewaterisbecomingmoreandmoreserious,whichposesaseriousthreattotheecologicalenvironment.Biologicaltreatmentofphenolcontainingwastewaterhasabroadapplicationprospectowingitslowcostandnosecondarypollution.Inthispaper,activatedsludgefromaerobictreatmentsectionofapapermillinShaanxiProvincewasselectedastheresearchspecimen,andthedominantmicrobialcommunitywithhighphenoltolerancethresholdwasobtainedthroughstepwisedomesticationandisolation.Thephenoldegradingabilityof8strainswerefurtherinvestigated,andastrainwithhighphenoltoleranceandhighdegradationefficiencywasselectedandnamedQWD1.Themorphologicalfeature,ITSrDNAgenesequenceandphylogenetictreeindicatedthatQWD1wasafilamentousfungusbelongingtotheMagnusiomycescapitatus.Then,themechanismofphenoldegradationwaspreliminarilyexplored.ItwasspeculatedthatthepathwayofQWD1degradationphenolwasbelongedtotheortho-openloopedmodebytestingtheactivityofphenol-degradingenzymescatechol1,2-dioxygenaseandcatechol2,3-dioxygenaseofQWD1.Thedegradationpotentialofmicrobestothetoxicandrefractorycompoundsisstronglyinfluencedbydifferentfactorssuchasnutrients,pollutionloadsandphysicochemicalcultivationconditions.Therefore,theinfluencingfactorsforbioremediationneedtobeoptimizedtoobtainthebestremovaleffect.Optimizationofparametersincludingnitrogensources,inoculumconcentrations,pH,temperatures,andIIInnitrogensourceconcentrationshadimprovedthephenoldegradationefficiencyofstrainQWD1tosomeextent,thethresholdofphenoltoleranceinliquidculturemediumcouldreach1600mg/L.TheoptimizationresultsshowedthattheoptimaldegradationconditionsforstrainQWD1were(NH4)2SO4asnitrogensource,inoculumconcentration15%,pH7,temperature35°Candnitrogensourceconcentration14mmol/L.Undertheseconditions,theremovalrateofphenolwasupto97.15%in28hours.Then,theselectionofthecarrierandthesuitablepreservationtemperatureoftheQWD1bioaugmentationinoculumwerepreliminarilystudied.Bycomparingtheadsorptioneffectoftheinorganiccarriers(vermiculite,kieselguhr)withtheorganiccarriers(wheatbran,cavings)onthefungalliquidandthepreservationeffectafterpreparationofthebioaugmentationinoculum,itwasfoundthatthecavingshadahighwaterabsorptionandabetteradsorptioneffectofQWD1,andthepHrangeofthebioaugmentationinoculumduringthelong-termstorageprocesswassmall,andthepreservationtimewaslonger.Atthesametime,aftercomparingthepreservationeffectofdifferentbioaugmentationinoculumat4°Candnormaltemperature,itwasfoundthatthepreservationeffectat4°Cwasbetterthanatnormaltemperature,andthepreservationtimeofthebioaugmentationinoculumpreparedwithcavingsascarrierat4°Ccouldreach90daysorevenlonger,thenumberofviablefungiwasabout2.5×108cfu/g.Thetreatmenteffectofphenol-containingwastewaterwasalsobetterthanotherbioaugmentationinoculum,andtheremovalrateofphenolcouldreach100%at24hours,whichpresentedagoodapplicationpotential.Finally,theeffectsofaddingbioaugmentationinoculumonsimulatedsludge-containingwastewatertreatmentbyactivatedsludgeandtheeffectonmicrobialcommunitystructurewereinvestigated.Itwasfoundthattheadditionofphenol-reducingbioaugmentationinoculumcouldsignificantlyimprovethetreatmenteffectofactivatedsludgeonphenol-containingwastewater,shortenthetimerequiredforcompletedegradationofphenol,andincreasetheCODremovalIVnefficiencyandtotalremovalrate.Theoptimumdosageoftheobtainedmicrobialagentwas4g/L,thephenolwithaconcentrationof1600mg/Lcouldbecompletelydegradedat24hours,andtheremovalrateofCODcouldreach94.7%in60hours.Thehigh-throughputsequencingtechnologywasusedtoanalyzethemicrobialcommunitystructureinbio-enhancedandnon-enhancedactivatedsludge.Itwasfoundthattheadditionofphenol-reducingbioaugmentationinoculumcouldincreasetheabundanceanddiversityofbacteriaandfungiinthewastewatertreatmentprocessofreactors.TheaddedQWD1belongingtoMagnusiomycescouldbethedominantstrainintheintensificationtreatmentsystem.Theadditionofbioaugmentationinoculumnotonlyenlargesthepopulationsizeofmicroorganismsinvolvedinphenolmetabolism,butalsoeffectivelyimprovesthemicrobialdiversityinthelaterstageofthetreatmentsystem,andwasconducivetothefurtherformationofastablemicrobialecosystem.KEYWORDS:degradationofphenol,fungi,bioaugmentationinoculum,activatedsludgeVn目录摘要...........................................................................................................................................IABSTRACT............................................................................................................................III1绪论........................................................................................................................................11.1课题研究背景及意义.............................................................................................11.2含酚废水的处理方法.............................................................................................11.2.1物理法............................................................................................................11.2.2化学法............................................................................................................21.2.3生物法............................................................................................................31.2.4苯酚的好氧微生物降解途径....................................................................51.3生物强化技术..........................................................................................................61.3.1生物强化的作用机制.................................................................................71.3.2生物强化技术的优势.................................................................................71.3.3微生物菌剂...................................................................................................81.4环境微生物群落分析.............................................................................................91.5课题研究的目的、技术路线及内容................................................................101.5.1课题研究的目的及技术路线..................................................................101.5.2课题研究的内容........................................................................................112高效降解苯酚真菌的分离筛选....................................................................................132.1实验材料及方法....................................................................................................132.1.1样品来源......................................................................................................132.1.2培养基..........................................................................................................142.1.3实验主要仪器.............................................................................................142.1.4实验试剂......................................................................................................152.1.5分析方法......................................................................................................162.2实验方法.................................................................................................................172.2.1好氧苯酚降解菌的驯化...........................................................................172.2.2好氧苯酚降解菌的分离筛选..................................................................182.2.3菌株的形态特征观察...............................................................................182.2.4分离株的分子生物学鉴定......................................................................182.2.5菌株降解苯酚路径分析...........................................................................192.3结果与讨论.............................................................................................................202.3.1菌株的分离和纯化....................................................................................20In2.3.2QWD1菌株的形态特征...........................................................................202.3.3分子生物学鉴定........................................................................................212.3.4QWD1降解苯酚的路径分析..................................................................222.4本章小结.................................................................................................................233QWD1菌株降解苯酚性能的优化................................................................................243.1实验材料及方法....................................................................................................243.1.1菌株来源......................................................................................................243.1.2培养基..........................................................................................................243.1.3实验主要仪器.............................................................................................243.1.4实验试剂......................................................................................................253.1.5苯酚浓度的测定........................................................................................263.1.6实验设计......................................................................................................273.2结果与分析.............................................................................................................283.2.1苯酚浓度对菌株降解苯酚能力的影响................................................283.2.2最佳氮源的确定........................................................................................293.2.3最佳接种量的确定....................................................................................303.2.4最佳温度的确定........................................................................................313.2.5最佳pH的确定..........................................................................................323.2.6最佳氮源浓度的确定...............................................................................323.3本章小结.................................................................................................................334降酚菌剂的制备...............................................................................................................344.1实验材料及方法....................................................................................................344.1.1实验原料......................................................................................................344.1.2模拟废水的配置........................................................................................344.1.3实验主要仪器.............................................................................................344.1.4实验试剂......................................................................................................354.1.5分析方法......................................................................................................364.2实验方法.................................................................................................................364.2.1不同载体吸水率的测定...........................................................................364.2.2菌剂的制备.................................................................................................364.2.3不同菌剂有效活菌数的测定..................................................................374.2.4不同菌剂降解苯酚效果的测定.............................................................374.3结果与分析.............................................................................................................37IIn4.3.1不同载体的吸水率....................................................................................374.3.2不同保存温度下菌剂的活菌数.............................................................374.3.3不同保存温度下菌剂对苯酚的降解效果...........................................384.4本章小结.................................................................................................................405降酚菌剂对活性污泥处理含酚废水效果及其微生物群落结构的影响............415.1实验材料及方法....................................................................................................415.1.1实验原料......................................................................................................415.1.2模拟废水的配置........................................................................................415.1.3实验主要仪器.............................................................................................415.1.4实验试剂......................................................................................................425.1.5分析方法......................................................................................................435.2实验方法.................................................................................................................435.2.1活性污泥投加生物强化菌剂的效果研究...........................................435.2.2菌剂添加量对活性污泥降酚效果的影响...........................................435.2.3活性污泥微生物群落结构的研究.........................................................435.3结果与讨论.............................................................................................................445.3.1降酚菌剂对活性污泥处理含酚废水效果的影响..............................445.3.2菌剂投加量的优化研究...........................................................................465.3.3活性污泥中微生物群落结构的分析....................................................475.4本章小结.................................................................................................................576结论与展望........................................................................................................................596.1结论..........................................................................................................................596.2创新点......................................................................................................................606.3展望..........................................................................................................................60致谢..........................................................................................................................................61参考文献.................................................................................................................................62攻读学位期间发表的学术论文目录................................................................................71原创性声明及关于学位论文使用授权的声明..............................................................72IIIn高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用1绪论1.1课题研究背景及意义随着经济的快速发展，地表水体的污染尤其是各类有机化工废水的污染日益严重，大量有机污染物进入环境，从而造成一系列环境问题，严重影响了人民的生活质量和我国的经济发展。这些污染物毒性强，难降解，容易在环境中累积，甚至可能产生三致（致癌、致畸、致突变）效应，对人类健康以及自然生态系统的构成了严重威胁。因此，开发经济、有效的污染控制与治理技术以减少环境中有毒有害难降解污染物的危害，已成为环境工程领域的紧迫课题。苯酚，作为一种苯的单羟基衍生物，是许多工业废水中最常见的污染物之一，如树脂生产、炼油、炼钢、有机染料、爆炸物生产、造纸、化学工业、制药、天然气和焦炉等行业[1,2]。苯酚被列入美国环境保护署（EPA）公布的水环境中129种优先控制污染物之一，具有长效性和生物积累性，即使在低浓度下也是有毒的，不仅会对水生生物造成很大伤害，而且会通过皮肤粘膜的接触、吸收和口服而侵入到人体内部，对人类造成几种全身性疾病[3,4]。如今，随着工业规模的扩大，含酚废水的排放量越来越大，在某些工业废水中苯酚浓度相当高，且因其难降解特性极易在水中和土壤中积聚[5]。因此，许多国家严格限定了苯酚及其衍生物在饮用水和环境中的允许浓度[6]。在我国，挥发酚的日均最高允许排放浓度标准为0.5mg/L（GB18918-2002）。1.2含酚废水的处理方法随着污水处理技术的不断发展，目前已经形成和改进出多种多样的含酚废水处理方法，总体来说主要分为物理法、化学法和生物法。针对不同的污水水质和处理要求，可以采用其中一种方法或将它们有效的结合在一起，以使处理效果更佳。1.2.1物理法常见的处理含苯酚废水的物理方法主要有吸附法、萃取法、乳状液膜法等。（1）吸附法吸附法是一种简单易行的含酚废水处理方法，脱酚率一般在80%左右，能耗低、设备简单但操作繁琐，成本高。该方法主要利用活性炭、大孔树脂、沸石等多孔性物质来吸附除去酚类化合物，当吸附饱和后再利用碱液、蒸汽或有机溶剂解吸[7]。活性炭微孔结构丰富、比表面积较大，所以吸附容量大且对高、低浓度含酚废水都有很好的处理效果，但存在再生困难、选择性较大等弊1n陕西科技大学硕士学位论文端。与活性炭相比，大孔树脂更具有明显的优势，它吸附量大，机械强度高，且可再生，但树脂的价格比较昂贵，交换柱的操作条件和要求较高，所以经济效益有限。（2）萃取法对于高浓度的含酚废水常采用溶剂萃取法，即利用苯酚在萃取溶剂和水中溶解度不同的原理，实现酚类物质的相转移。如江燕斌等[8]选用磷酸三丁酯（TBP）煤油溶液经三级萃取后废水酚含量由10767mg/L降至50mg/L以下，脱酚率高于99.5%。络合萃取法则是通过将含络合剂的溶剂与酚类物质接触后反应形成络合物，并使其转移至萃取相内，然后通过逆向反应回收使酚类物质并实现萃取溶剂的循环使用。对于络合萃取法，络合剂和稀释剂的选择是最为关键的。杨得龄等[9]以伯胺N1923与石油醚、磺化煤油、甲苯为稀释剂组成络合萃取剂，发现40%（φ）N1923的甲苯溶液萃取苯酚效果最好，挥发酚的一级萃取率超过99.0%。萃取法处理范围广泛，设备投资少，能耗低，但仍存在采用的萃取剂多、价格昂贵，且操作复杂，处理后的酚含量很难达标，溶剂损失会给环境带来新的污染等问题。（3）乳状液膜法乳状液膜法除酚采用水包油包水（W/O/W）体系，原理是苯酚与内水相中的试剂生成不溶于油相的产物而使外水相中苯酚不断通过液膜进入油相，液膜通常由煤油等溶剂和表面活性剂构成。乳状液膜法具有选择性高、分离速率高、投资与作业成本低，乳液经破乳后可重复使用等优点。汪从等[11]通过优化以磷酸三丁酯为载体的Span-80/甲苯/NaOH乳状液膜体系的乳状液膜法处理兰炭含酚废水的各种条件，使除酚率达到96%以上。1.2.2化学法化学法处理含酚废水主要包括化学氧化法、化学沉淀法和光催化氧化法、湿式氧化法、超声氧化法等。（1）化学氧化法化学氧化法是利用空气、臭氧、过氧化氢、次氯酸钠、高锰酸钾等氧化剂自身的强氧化性将水中的酚类物质氧化去除，其中以臭氧作为氧化剂最为普遍[12]。化学氧化法发展较早，工艺较成熟，但由于氧化剂资源少，价格昂贵且不能重复利用，使其处理成本很高[13]。化学氧化法与其他方法的结合使用也成为了一项研究热点，如荆肇乾等[14]采用臭氧氧化与SBR活性污泥法联用法处理苯酚及苯胺废水，对苯酚和苯胺的去除率可达95%以上。（2）化学沉淀法2n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用化学沉淀法是通过在废水中添加化学物质，使酚类物质与之产生碳酸酯或磷酸酯沉淀而除去。其中最常见的是酚醛缩聚法，其原理是在一定的条件下，使苯酚与甲醛反应生成酚醛树脂经固液分离后除去，具有流程简单、处理效果稳定等特点。化学沉淀法虽然工艺简单，应用范围广泛，但处理后废水中酚浓度仍较高，常需与其它的方法联合起来应用[15]。（3）光催化氧化法光催化氧化法是在通过含酚废水中加入光催化剂，利用紫外光照射条件下产生氧化能力强的羟基自由基有效地将含酚废水中的酚类化合物降解低分子中间产物并最终生成为二氧化碳和水[16]。光化学氧化反应条件温和，无二次污染，可处理较高浓度的含酚废水，催化剂价廉易得，氧化能力强、适用范围广[17]。（4）离子交换法离子交换法是利用苯酚呈弱酸性这一性质通过离子交换技术将其从废水中除去，不仅可以达到净化水质的目的还可用阴离子交换树脂进行回收。如庞洁等[10]优化异相离子交换膜电渗析法去除含酚废水的处理工艺后，对于浓度为1000mg/L的含苯酚废水中苯酚的去除率达到了98.2%。（5）湿式氧化法湿式氧化法是在高温（125-320℃）、高压（0.5-20MPa）条件下，利用外加氧化剂将酚类有机物氧化降解从而去除，该法的突出优点是酚类物质的氧化效果好，缺点是高温、高压的要求会大大增加投资运行成本。孟志国等[18]采用湿式过氧化物氧化法并投加活性炭加强催化效果来处理苯酚丙酮生产装置排放的高浓度有机废水，COD去除率可以达到95%左右。（6）超声氧化法超声氧化法的原理是利用超声波（>20kHz）辐照溶液产生高温（>5000K）和高压（>100MPa）的空化气泡及强氧化性物质，从而氧化降解难降解有机物，具有操作简单、投资成本低，无二次污染的优点[19]。孙秀君[20]优化超声波预处理含酚废水的条件如超声功率、震荡时间、pH后，COD去除率可达48.53%。1.2.3生物法微生物对有毒有害化合物的降解有着重要的作用，特别是微生物生态降解系统具有温和、高效和不产生二次污染等特性。研究和开发降解酚类等有机有毒污染物的微生物资源，对保护生态环境和人类健康具有重要的现实意义。近几十年来，不同类型的微生物对苯酚的生物降解引起了许多研究者的关注，已分离鉴定的可降解苯酚的微生物包括根瘤菌、藻类、酵母菌、醋酸钙不3n陕西科技大学硕士学位论文动杆菌、假单胞菌、真氧产碱菌、反硝化菌等，说明苯酚能够被许多原核和真核微生物利用。目前，常见的处理含酚废水的生物方法主要有活性污泥法、生物膜法等。表1-1部分降解苯酚的微生物资源Table1-1Particalmicroorganismscapableofdegradingphenol菌株参考文献热带假丝酵母（Candidatropicalis）[21]根瘤菌（Rhizobia）[22]红球菌（Rhodococcus）[23]醋酸钙不动杆菌（Acietobactercalcoaceticus）[24]真养产碱菌（Alicaligenesrutrophus）[25]假单胞菌（Pseudomonas）[26,27]白腐真菌（Phanerochaete）[28,29]藻类（AlgaOchemaonas）[30]（1）活性污泥法活性污泥由微生物群体及它们所依附的有机物质和无机颗粒等组成的复杂非均质体[31]。活性污泥法则是利用生物絮凝、吸附和氧化作用等方式除去污水中可生物降解的有机污染物，从而使污水得到净化。活性污泥法具有设备简单、经济安全、操作运行费用低、处理效率高、工艺较成熟等优点，在生活污水、工业废水等处理中被广泛应用。但同时也存在着一些问题，如曝气池容积负荷低、污泥易膨胀且产生量大、对高浓度含酚废水处理效果不佳等。因此，改进反应器和工艺、提高活性污泥中高降解性能微生物量以提高活性污泥法处理酚类废水的效率是重要的研究方向之一。例如，Ucun等[32]研究了使用活性污泥的间歇喷射回路生物反应器（JLB）中的苯酚生物降解后得出结论，JLB的生物降解能力高于搅拌釜反应器。Zhang等[33]将苯酚用作生物强化剂投加到好氧颗粒污泥中，并在6周的时间内交替投加苯酚和三氯乙烯，实现了苯酚和三氯乙烯的共同除去，并发现三氯乙烯共代谢改善了好氧颗粒污泥的结构完整性，显示出长期稳定性。（2）生物膜法生物膜法是利用附着生长在惰性物质表面的微生物的代谢活动来去除废水中溶解性和胶体状污染物，其主要的处理技术有生物滤池、生物转盘、生物接触氧化法和生物流化床等。其中在实际应用过程中，生物膜法也显示出很多4n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用优势，如供氧充分，传质条件好，设备处理能力大且效率高，无污泥膨胀、运行方便等。但同时，由于该方法需要使用大量的载体材料，也会导致运行成本的增加，因此，选择高性能和经济性的载体材料是非常重要的。1.2.4苯酚的好氧微生物降解途径许多专家学者已经对苯酚的微生物降解途径进行了深入研究并形成了较为成熟的理论。苯酚的好氧微生物代谢过程，需要多种酶和氧的参与下协同完成。如图1-1所示，苯酚羟化酶（phenol2-monooxygenase）是苯酚降解过程中的第一个关键酶，负责将苯酚转化为邻苯二酚（catechol）[34]。邻苯二酚的进一步降解有两种不同的途径和酶系统：邻苯二酚1，2-双加氧酶（C12O，邻位裂解）或邻苯二酚2，3-双加氧酶（C23O，间位裂解），邻位酶或间位酶可以将邻苯二酚开环裂解为三羧酸（TCA）产物。在邻位途径中，邻苯二酚开环裂解产生中间产物粘糠酸，而在间位途径中，邻苯二酚开环裂解后产生中间产物2-羟基粘糠酸半醛。经两个独立的代谢系统形成的琥珀酸、乙酰辅酶A、丙酮酸等物质可以通过三羧酸循环继续被微生物利用，一部分用于微生物自身的生长繁殖，另一部分则被氧化分解为二氧化碳和水，为微生物新陈代谢提供所需能量[35]。5n陕西科技大学硕士学位论文说明：HO：苯酚羟化酶；C12O：邻苯二酚1,2-双加氧酶；C23O：邻苯二酚2,3-双加氧酶；TE：顺粘糠酸内脂酶；HMSD：2-羟基粘糠酸羧化酶；4OD：4-氧化丁烯脱羧酶；4-OT：4-氧化丁烯变位酶图1-1好氧菌降解苯酚的途径Fig.1-1Thedegradationpathwayofphenolbyaerobe1.3生物强化技术随着工业技术的不断更新和发展，其产生的废水量不断增大且成分也愈发复杂，有毒难降解的有机污染物含量大大增多，当传统的处理技术已经很难满足处理要求时，上世纪70年代，生物强化技术被提出并逐渐得到广泛应用[36]。生物强化技术（Bioaugmentation）是指通过向原有处理系统中投加对某种或某些特定有机污染物具有高效降解能力的微生物、共代谢基质物或营养物来改善原有生态系统中土著微生物处理废水能力差的问题，可有效地提高生物反应器6n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用对含难降解有机物废水的处理效果[37]。生物强化的主要方法有三种：（1）加入从环境系统中分离纯化出的单菌株或混合菌群；（2）加入经基因工程改造过的菌株；（3）加入与特定污染物降解相关的共代谢基质或生物酶[38]。1.3.1生物强化的作用机制生物强化技术主要是通过高效降解菌的直接作用和微生物的共代谢作用两种模式实现对各类目标污染物的去除[39]。高效降解菌的直接作用是目前生物强化技术最普遍的作用机制，具有处理效率高、抗冲击负荷能力强的特点。即通过在特定的环境系统中通过筛选、驯化、培养、富集等方法，筛选出可以以目标污染物为碳源和能源生长的菌株，并将其投加至反应体系中直接用于降解污染物。如Donghui等[40]人在处理制药废水的的膜生物反应器中添加降解吡啶的细菌进行生物强化，提高了吡啶降解率和处理效果；Xu等人[41]从煤气化废水厂的驯化活性污泥中分离出高效萘降解菌株，该菌株对萘的毒性耐受浓度高达200mg/L。将菌株加入到膜生物反应器（MBR）中以增强真煤气化废水的处理，结果表明在生物强化反应器中萘得到了显着的去除。微生物共代谢作用机制是指当有些有毒有害污染物不能被微生物直接作用降解时，通过添加某些底物，这些有毒有害物质的结构就可以被微生物改变并代谢去除。宋为峰等[42]在研究浮选废水中苯胺黑药与外加基质的共代谢特性中发现，不同的共代谢基质及不同的基质和污染物的比例影响了系统对污染物的去除效果；Adriaens等[43]发现不动杆菌属（Acinetobactersp.）菌株4-CB1在4-氯苯甲酸酯存在的条件下，可以将自身不能利用的3，4-二氯苯甲酸酯代谢为3-氯-4-羟基苯甲酸酯。1.3.2生物强化技术的优势生物强化技术的优势主要表现在以下几个方面。（1）应用范围广生物强化技术可以应用于各种含有毒有害难降解物质的工业废水处理系统中，并且效果良好。如制药废水[44]、石化废水[45,46]、造纸废水[47]、印染废水[48]、焦化废水[49]、混合化工废水[50]等。此外，还有研究报道了生物强化技术应用于处理地下水[51]，废水的脱氮除磷深度处理[52]，降解其他有毒有害的无机物如含汞废水[53]、含氰废水[54]等方面，也有良好的应用前景。（2）减少化学试剂的使用，环境相容性好利用生物强化技术处理废水，可以节省化学药品试剂的使用，减少对环境造成的二次污染。同时，从废水中筛选出目标菌种并应用到环境系统中，具有7n陕西科技大学硕士学位论文良好的环境相容性。（3）提高系统的耐冲击负荷和稳定性Hailei等[55]比较了在类似条件下处理造纸废水过程中，接种优级混合菌群的强化序批式反应器与常规序批式反应器的差异后表明，添加优良混合菌群不仅可以缩短污泥驯化时间，而且可以使反应器具有更高的承受高容量负荷的能力，提高反应器的处理效率；ChengZ等[56]将蜡状芽孢杆菌和睾丸酮丛毛单胞菌投入到处理DNB合成废水的实验室规模序批式生物膜反应器（SBBR）中，不仅改善了污染物的去除，而且对DNB的冲击负荷也表现出明显的抗性。（4）缩短处理系统启动时间Yu等[57]在使用恶臭假单胞菌ONBA-17处理邻硝基苯甲醛（ONBA）合成废水的序批式反应器（SBR）的可行性的实验中证明了生物强化不仅增强了目标化合物的去除能力，而且缩短了系统的启动时间。（5）提高系统在恶劣条件下的适应能力生物处理系统运行过程中，需要面对各种恶劣条件的情况，如低温、高盐度、营养物质缺失等问题会影响生物体的活性，从而降低了生物系统的处理效果。面对此类情况，通过生物强化投加对恶劣环境适应性好的菌株或添加营养物质提高微生物活性，使系统在恶劣条件下仍拥有良好处理效果成为了可能。张敏等[58]从洗涤剂生产车间曝气池活性污泥中分离出的高效嗜冷菌株在5℃的低温条件下48h内对20mg/L的表面活性剂C12E7的降解率可达70%以上；赵立军等[59]在气温低于10℃、水温低于14℃的条件下采取活化菌液、生物污泥和生物菌剂共同投加的生物强化方式，成功完成系统的快速启动，有效克服低温、低负荷、贫营养、水量波动等不利因素的影响。1.3.3微生物菌剂从环境中筛选到具有特殊降解功能且活性强的菌株制作成液体或固态的生物强化菌剂作为生物强化技术的一种方式，现今已经广泛应用到饲料添加、土壤改良和生物修复等领域。在实际的工程应用过程中，微生物菌剂的投加需要满足四个基本条件[47]：（1）对目标污染物有很好的降解效果且效率高，甚至在复杂环境下或其它抑制物存在时仍能降解；（2）与系统中的土著微生物兼容；（3）在进入生态系统后保有竞争力，维持相当数量；（4）添加的微生物不能和人类病原体密切相关。微生物对有毒化合物的降解性能受环境因素影响显著，相较于液态菌液，固体菌剂能有效提高菌体对有害有毒物质的处理效果，且有利于菌体活性的保持、菌剂的保存和运输，提高生物处理系统的运行性能，适合在工程化应用中8n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用推广[60,61]。固定化细胞处理各类污水方面，中外学者已经进行了很多研究，固定化的方法具有对有毒难降解有机物耐受浓度高、降解速率高、处理能力强等特点。目前固定化细胞使用的方法主要为包埋法、交联法和吸附法。其中，包埋法是通过物理或化学手段将游离的微生物或酶固定在一个特定的空间区域内。包埋法制备菌剂的材料主要有两种类型：一是天然高分子凝胶载体，如琼脂、海藻酸钙等；二是人工合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰胺（PAM）和聚乙烯醇（PVA）等[62]。包埋法制备的菌剂有明显的优势，如细胞密度高，可长期保存在反应器中，易固液分离，可重复使用等。且对高浓度的有毒物质有较高的耐受性，投加含有难降解污染物废水的效果明显[63]。Santos等[64]发现用海藻酸钠固定的丝状酵母降酚性能优于游离细胞，能够在120h完全降解30mmol的苯酚；LenzM等[65]将固定了S.barnesii菌株的凝胶块加入升流式厌氧污泥床（UASB）反应器中来处理含硒酸盐的模拟废水，证明微生物强化菌可以在处理系统中存活，且对硒酸盐去除效率较无生物强化的反应器高。然而包埋法也存在一些明显的弊病，如方法复杂，对微生物生理、生态性能会产生影响，菌体活性保持性难以维持，成本较高等问题，同时，包埋固定化材料的传质阻力较大，对培养基中的营养物质和氧气向细胞内的传递以及胞内代谢废物向胞外的传递也会有不利影响。吸附法制备菌剂是一种更为简单、经济且对菌株活性影响小的固定方法，主要是通过吸附性能好的物质吸附菌体制成活菌制剂，使其高度密集并保持生物活性。其主要优点有：（1）能快速提升处理系统中菌群浓度，缩短菌群驯化时间，进而大幅度提高系统的处理效能；（2）安全经济，操作便捷，实时处理。刘亚君等[66]将菌株球盖菇、芽孢杆菌利用硅藻土吸附制成的固体菌剂具有高效、低毒及无残留的优点，对番茄根结线虫病温室防效达到90%以上。目前，一些微生物强化菌剂产品已成功商业化生产，并取得了一定的成效[67]。利用吸附法构建菌剂，最主要的问题是选择出适宜菌株生长的载体，良好的载体可以提高对菌体的吸附量，有利于菌体的存活。刘方春等[68]研究了发酵鸡粪、蚯蚓粪和菇渣作为假单胞菌（Pseudomonas）YT3吸附载体的可行性后表明，鸡粪是适宜的PseudomonasYT3吸附载体，有效菌体释放效率可达到93.08%。吴金男等[69]采用三种材料作为载体对液体发酵培养的微生物进行吸附实验，结果表明，稻草粉为吸附载体的菌剂活性较好。1.4环境微生物群落分析基于454FLXpyrosequencingplatform、RochGSFLXsequencer、Genome9n陕西科技大学硕士学位论文Analyzerplatform等测序平台发展起来的高通量测序技术（“第二代”测序技术）可以对环境中的微生物群落多样性进行分析，近年来取得了较快的发展。该技术主要是通过对16S/18S/ITS等核糖体RNA高变区域的基因进行测序，分析出各类环境样品中不同微生物的组成、丰度、多样性进而分析其进化关系。高通量测序技术具有高准确性、高通量、高灵敏度、和低运行成本等突出优势，不仅通量高，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，而且能够同时分析上百个不同的样品，是分析和反映复杂环境中微生物群落结构和相对丰度的重要工具[70]。高通量测序的实验流程一般分为六步，即基因组DNA的提取；设计并合成引物接头；PCR扩增和产物纯化；PCR产物定量及均一化；文库制备；高通量测序。基因组设计并合成PCR扩增PCR产物定文库高通量DNA提取引物接头和产物纯量与均一化制备测序化图1-2高通量测序实验流程Fig.1-2Theexperimentalprocessofhigh-throughputsequencing目前，高通量测序技术已经被人们所熟知并成功应用于土壤、污泥、食品、水体等样本的微生物菌群分析。如夏围围等[71]比较了变性梯度凝胶电泳和高通量测序两种方法在分析土壤微生物群落研究中的适用性，发现高通量测序更能较为全面和准确的反映土壤微生物群落结构；Del等[72]利用高通量测序技术分析了沿海水域鞭毛生物的多样性及分布的研究强调了高通量测序方法的重要性。张静娜等[73]将高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查后发现Hiseq测序技术可以在准种水平上有效地用于HCV感染溯源调查，具有高通量、操作较简便、成本相对低、实用价值较高的特点；李慧星等[74]利用Miseq高通量测序平台研究了厌氧活性污泥的微生物菌群，不仅在在属（genus）水平上分析了污泥中细菌和古菌的种类和相对丰度，还为阐释酒精废水治理中厌氧消化技术的生物机制及其技术改良提供参考。宋云龙等[75]利用高通量测序技术对微生物强化原位污泥减量工艺中微生物群落进行解析，发现高通量测序对活性污泥微生物群落在门、纲、目、科水平鉴定结果良好，属水平上也有一定鉴定效率。1.5课题研究的目的、技术路线及内容1.5.1课题研究的目的及技术路线10n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用含酚废水是普遍存在的有毒难降解的有机污染物之一，寻找经济可行的含酚废水处理技术对环境的可持续发展具有重要意义。生物法处理含酚废水因成本低，无二次污染而具有广阔的应用前景。可降解苯酚的微生物中，真菌比细菌对恶劣环境的适应性更好。针对液态菌液保存时间较短、运输困难的瓶颈，制备固体菌剂，可以提高菌体存活率和储藏稳定性。本实验的目的是筛选一株能够高效降解苯酚的真菌，优化其降酚性能并选择合适的载体制备菌剂。图1-3展示了本文的技术路线，通过逐级驯化和纯化分离降酚菌，筛选得到降酚性能较强的真菌并通过ITSrDNA基因测序进行种属鉴定，通过参数优化进一步提高菌株降解苯酚的性能并考察菌株降解苯酚的途径；同时制备基于吸附法的固定化菌剂，在提高菌剂保存时间、保证菌株活性的基础上降低菌剂制备的成本；最后，将菌剂投加到活性污泥中考察其对活性污泥处理含酚废水效果和微生物群落结构的影响。本实验基于活性污泥处理含酚废水技术的高效性、经济性和可行性，利用生物强化技术提高其处理性能，为将微生物强化菌剂应用于低成本高效处理含酚废水工业化处理提供一定理论依据。图1-3本研究的技术路线Fig.1-3Thetechnicallineofthesis1.5.2课题研究的内容本课题的主要研究内容分为以下四个方面：11n陕西科技大学硕士学位论文（1）对造纸厂好氧处理段活性污泥环境中微生物进行驯化培养，并分离筛选出可耐受或降解苯酚的菌株；对分离出的菌株进行苯酚耐受性和降解能力的对比，遴选出耐受性高和降解能力好的菌株作为后续研究对象并通过形态观察和分子生物学鉴定确定其种属。（2）对影响菌株降酚效率的环境因素如苯酚浓度、氮源、接种量、温度、pH、氮源浓度等进行研究，以便在实际应用过程中可以通过控制外界因素来强化菌株的降酚效果。（3）选择吸附法开展降酚微生物的固定化研究，以不同材料为载体制备菌剂，通过稀释平板计数法和苯酚降解实验探究菌剂在不同温度下的保存效果，确定最佳载体材料和适宜菌剂保存的温度。（4）研究降酚菌剂作为生物强化菌剂投加到活性污泥中来处理模拟含酚废水的可行性，对比其与原始活性污泥对含酚废水的苯酚降解效率和COD去除效率并对菌剂的最优添加量进行确定。最后，通过高通量测序技术对不同活性污泥样品中的微生物群落结构进行分析，以期从更为深入的角度去解析降酚菌剂添加对活性污泥中相关微生物的群落变化的影响。12n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用2高效降解苯酚真菌的分离筛选从被污染环境中筛选出对酚类物质具有高降解能力的微生物，研究其降解特性后，应用到含酚废水处理系统中，是处理含酚废水较为经济有效的途径之一。近年来，国内外在苯酚生物降解方面展开了广泛的研究，已分离和鉴定出如醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)[76]、红球菌(Rhodococcussp.)[77]、假单胞菌(Pseudmonassp.)[78]、根瘤菌(Rhizobia)[79]等多种具有苯酚降解能力的细菌。但是这些菌株普遍都存在环境适应能力弱，对苯酚能够耐受浓度低、降解效率低等问题。因此，在利用微生物处理含酚废水的过程中，分离筛选出对苯酚耐受能力高且降解效率高的微生物仍是亟待解决的问题。而根据微生物对有机污染物和重金属的抗性特征，在大多数情况下，当环境大幅度变化时，真菌比细菌更难受到影响和限制[80]。在一些不适于细菌生长的极端情况下，有些真菌依然保有较高的生物活性且能成为降解有机污染物的主要种群。例如，青霉菌Penicilliumchrysogenum能在5.8%的盐度下以苯酚为唯一碳源和能源生长[81]；在低温条件下，真菌Mortierellasarnyensis可以成为降解高浓度苯酚和甲酚的生物膜反应器的主要微生物[82]。因而，对真菌进行详细的研究十分必要。国内外已经报导了一些真菌降解废水中芳香族化合物的应用，如董婧等[83]从生物流化床中分离出一株具有苯酚降解能力的丝状真菌PHE-1，但在苯酚浓度为400mg/L时，苯酚对菌株生长表现出较明显的抑制作用。YuJiang等[84]从制药厂分离出的嗜盐真菌JS4在最佳条件下32h可完全降解500mg/L的苯酚。目前对苯酚降解真菌分离筛选的报道还不多，因此分离高耐受性的高效苯酚降解真菌种群对于含酚工业废水处理技术的开发具有重要意义。本章通过生物强化途径，以苯酚为降解底物，从处理造纸废水的活性污泥中富集可耐受并降解苯酚的真菌，利用合适的菌株驯化和筛选方法，分离得到对苯酚耐受性高、降解能力好的菌株并通过ITSrDNA序列分析和相近物种的系统发育分析对筛选得到的菌株的种属进行鉴定。最后通过测定苯酚降解相关酶的活性来推测菌株降解苯酚的路径。2.1实验材料及方法2.1.1样品来源用于分离菌株的活性污泥取自陕西某造纸厂好氧生化池，污泥呈黑色，絮状，有臭味。将采集的泥样放置于事先准备好的广口瓶中，置于4℃的冰箱内保存备用，且应尽快使用。13n陕西科技大学硕士学位论文2.1.2培养基（1）富集培养液：蛋白胨3g/L，酵母粉3g/L，MgCl2•7H2O0.15g/L，CaCl20.1g/L。（2）选择培养液（试剂均为分析纯）：(NH4)2SO40.396g/L，10%NaCl10mL，营养液（次氮基三乙酸10.0g，MgSO4•7H2O29.5g，CaCl2•2H2O3.335g，FeSO4•7H2O0.099g，(NH4)6Mo7O24•4H2O0.0093g，微量元素液50mL，蒸馏水950mL）20mL/L，灭菌后加入磷酸盐缓冲溶液（KH2PO468.05g，K2HPO487.09g，蒸馏水1000mL）20mL/L，维生素溶液（烟酸0.1mg/mL，烟酸硫胺0.05mg/mL，生物素1μg/mL）10mL/L，苯酚含量按需加入，通过1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节pH。（3）固体培养基：在液体培养基中加入2%的琼脂粉，经121℃、30min高压灭菌倒入直径为9cm的无菌培养皿，冷却后得到固体分离培养基平板。（4）冻存液：30%甘油+70%液体培养基。2.1.3实验主要仪器实验主要用具：锥形瓶、涂布器、离心管、酒精灯、烧杯、量筒、容量瓶、比色管、培养皿等。实验使用的主要仪器如表2-1所示。表2-1实验主要仪器Table2-1Themaininstrumentsoftheexperiment实验仪器型号生产厂家生物安全柜AC2-4S1新加坡ESCO科技有限公司pH计FE28梅特勒-托利多仪器有限公司磁力搅拌器IKAC-MAGMS10艾卡仪器设备有限公司台式高速离心机TD4N长沙英泰仪器有限公司紫外-可见分光光度计UV759上海佑科仪器仪表有限公司双层恒温摇床QYC-2102C江苏盛蓝仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌锅SN510C重庆雅玛拓科技有限公司固定式漩涡混匀仪MX-G美国赛洛捷克100-1000μL、移液枪德国艾本德股份有限公司0.5-5mL电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A上海一恒科学仪器有限公司分析天平JT2003B余姚市金诺天平仪器有限公司14n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用低温冰箱DW-FL450中科美菱低温科技股份有限公司电热恒温水浴锅HH-S4河南金博仪器制造有限公司环境扫描电镜Q45美国FEI公司2.1.4实验试剂实验所使用的主要试剂如表2-2所示。表2-2实验主要试剂Table2-2Themainreagentoftheexperiment序号名称型号生产厂家1蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司2酵母粉生化试剂生工生物工程（上海）股份有限公司3苯酚分析纯天津市大茂化学试剂厂4(NH4)2SO4分析纯天津市凯通化学试剂有限公司5琼脂粉生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司6NaOH分析纯天津市天力化学试剂有限公司7MgCl2•7H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司8CaCl2分析纯天津市致远化学试剂有限公司9次氮基三乙酸分析纯阿拉丁试剂有限公司10MgSO4•7H2O分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司11K2HPO4分析纯天津市大茂化学试剂厂12KH2PO4分析纯天津市大茂化学试剂厂13烟酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司14盐酸硫胺生化试剂上海蓝季生物科技有限公司15FeSO4•7H2O分析纯天津市大茂化学试剂厂16KOH分析纯天津基准化学试剂有限公司17氨水分析纯天津市富宇精细化工有限公司18NH4Cl分析纯天津市大茂化学试剂厂194-氨基安替比林分析纯上海科丰实业有限公司20铁氰化钾分析纯天津市天力化学试剂有限公司21NaCl分析纯天津市大茂化学试剂厂22丙三醇分析纯天津市致远化学试剂有限公司15n陕西科技大学硕士学位论文23(NH4)6Mo7O24•4H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司24L-天冬氨酸生化试剂天津市大茂化学试剂厂25葡萄糖分析纯天津市大茂化学试剂厂2.1.5分析方法（1）微生物生物量的测定1）分光光度法：采用比浊法对培养液中的微生物的生物量进行测定。即用空白培养基作参比，用紫外可见分光光度计在波长为600nm下测定菌液的OD值（用光程为20mm的比色皿），记作OD600。OD600值过大时经适当稀释再测定，使其处于0.8以下。此方法主要用于间接反映液体培养基中的微生物生长状况。2）稀释平板计数法：取样品经分散和适当稀释后取一定量的稀释液涂布到平板上，经过培养待平板上生长出肉眼可见的菌落，选择菌落数在30-300的平板进行统计。此方法主要用于测定菌液中的有效活菌数量。（2）苯酚浓度的测定采用4-氨基安替比林分光光度法测定培养液中的苯酚含量。其原理是：苯酚在碱性介质中（pH值为10±0.2）中，在氧化剂铁氰化钾的存在下，会与4-氨基安替比林生成橙红色的安替比林燃料，并在510nm处有最大吸收峰。1）苯酚标准贮备液的配制用天平称取1g苯酚于烧杯中，加蒸馏水溶解后移入1000mL的容量瓶中，稀释至标线，则此苯酚标准贮备液的浓度为1g/L。将配制的的苯酚贮备液装入细口棕色试剂瓶中，置4℃冰箱内保存。使用时取100mL的苯酚贮备液稀释至10mg/L。2）试剂的配制2%4-氨基安替比林缓冲溶液：称取2g4-氨基安替比林溶于水，并定容至100mL，放置4℃冰箱中保存备用，保质期一周。8%铁氰化钾溶液：称取8g铁氰化钾溶于水，并定容至100mL，放置4℃冰箱中保存备用，保质期一周。氯化铵缓冲溶液（pH值为10±0.2）：称取20g氯化铵溶于100mL氨水中，放置4℃冰箱中保存备用，注意取用后加盖塞严以避免氨挥发引起的pH值的变化。3）标准曲线的绘制取10支50mL的比色管，编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，向其中分别移取0mL、5mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、16n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用45mL、50mL的10mg/L的苯酚原溶液，并用蒸馏水定容至50mL标线。在10支比色管中分别加入0.5mL缓冲溶液，加盖摇匀，此时pH为10±0.2；然后加入1.0mL4-氨基安替比林溶液，加盖摇匀；再加1.0mL铁氰化钾溶液，加盖充分混匀，放置10min后立即于510nm波长处，以水为参比，测定其吸光度，绘制吸光度对苯酚浓度的标准曲线。本实验得到的标准曲线如图2-1所示，标准曲线方程为y=0.1143x+0.037，R2=0.999。图2-1苯酚浓度标准曲线Fig.2-1Thestandardcurveofconcentrationofphenol4）样品中苯酚浓度的测定将待测样品在8000r/min条件下离心5min后取上清液采用分光光度法测定苯酚含量，苯酚浓度较大时应进行适当的稀释后测定，使读数在1.0以下。（3）苯酚降解率的测定苯酚降解率=（反应前苯酚浓度－反应后苯酚浓度）/反应前苯酚浓度×100%2.2实验方法2.2.1好氧苯酚降解菌的驯化为了使好氧型苯酚降解菌成为活性污泥中的优势菌群，本实验利用苯酚为唯一碳源的选择培养基对其进行逐级驯化培养。取10g的活性污泥置于装有100mL苯酚浓度为200mg/L选择培养基的锥形瓶中，用棉花封口后，放入恒温摇床中在温度为30℃、转速为200r/min的条件下振荡培养，每隔12h测定培养液中的苯酚含量。当培养基中的苯酚完全降解时，取20mL的菌悬液接17n陕西科技大学硕士学位论文入含有400mg/L苯酚的选择培养基中。按相同的方法逐级提高苯酚的浓度，对其进行驯化培养，得到可以降解2000mg/L苯酚的降酚菌菌群。2.2.2好氧苯酚降解菌的分离筛选经驯化培养后的培养液中存在大量的耐酚型和降酚型的菌株，此时需要对这些菌株进行进一步的分离纯化。本实验选择采用平板涂布法和平板划线法对培养液中的菌株的分离和纯化。将富集、驯化后得菌体培养液用无菌水按10-1~10-10梯度稀释，选择最后四个稀释度的稀释液分别取20μL稀释液在固体选择培养基上进行涂布分离操作（每个稀释度三个平行样），将涂布后的培养皿倒置于恒温培养箱中，30℃条件下进行好氧培养。随时观察，当平板上长出小型菌落，通过菌落形态观察和显微镜观察区别不同特征的单个菌落，挑取不同菌落用纯木质接种棒进行平板划线，长出单菌落后重复划线5次，直至获得纯菌。挑取分离得到的各单菌落接种到20mL的富集培养液中进行扩大培养，当菌株生长至对数期时，将其分别接种到含有不同浓度苯酚的培养液中，在30℃、200r/min条件下进行苯酚降解实验，每隔6h测定培养液中的苯酚含量，计算苯酚降解率。选择对苯酚耐受性高、降解率高的菌株作为后续研究对象并对其进行冷冻保存。2.2.3菌株的形态特征观察对筛选出的菌株进行形态特征观察和环境扫描电镜观察。（1）菌落形态观察：肉眼对分离所得菌株的菌落形态和菌液进行观察。（2）环境扫描电镜观察。2.2.4分离株的分子生物学鉴定将纯化的菌株接种于固体培养基中，于35℃条件下培养，当菌落布满2/3平板时，挑取菌体于50uLTaKaRaLysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR(CodeNo.9164)中，80℃反应15min，变性后离心取上清作为模板。分离株的分子生物学鉴定采用ITSrDNA测序分析。（1）用于ITSrDNA扩增的PCR反应引物：ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。（2）PCR反应体系（50μL）：模板DNA液1uL，两种引物各0.5μL，PCRPremix25μL，ddH2O23μL。（3）PCR扩增反应条件：94℃预变性（5min）；94℃变性（1min），55℃退火（1min），72℃延伸（1min），重复以上3个步骤，进行30个循环；72℃延伸（5min）；4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。PCR扩增产物委托上海生工生18n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用物工程有限公司进行测序，测序结果通过BLAST与NCBI数据库序列进行比对。2.2.5菌株降解苯酚路径分析（1）菌株的培养在保存的QWD1菌株平板上挑取单菌落分别接种至以500mg/L苯酚和500mg/L葡萄糖为唯一碳源的选择培养基中，在35℃，200r/min的条件下培养至对数生长末期（OD600=1.0左右）。分别取10mL菌液10000r/min的条件下高速离心2min，上清液即为胞外粗酶液，收集菌体并称量菌体的湿重。（2）胞内粗酶液的提取使用在生工生物工程股份有限公司购买的酵母蛋白提取试剂盒来获得粗酶液，具体步骤如下：1）分别称取湿重为50mg的菌体加入500μL等渗液，5μL蜗牛酶和1μL疏基乙醇于10mL离心管中后利用漩涡混匀仪将菌体悬浮起来。2）将离心管放入水浴锅中设置温度为30℃水浴60min后在10000r/min的条件下高速离心1min，去掉上清液，收集菌体后重复洗涤一次。3）在离心管中加入500μL低渗液（使用前，在500μL低渗液中加入5μLPMSF）将菌体重悬，放入-20℃冰箱中冷冻30min，室温溶解。重复冷冻30min后室温溶解。4）将裂解后的溶液在12000r/min的条件下离心5min，上清液则为获得的粗酶液，-20℃保存备用。（3）邻苯二酚1,2-双加氧酶活性的测定反应体系为4mL，其中含有0.26mL的粗酶液，pH=7的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液0.16mL，3.58mL浓度为50mg/L的邻苯二酚溶液，反应以加入邻苯二酚溶液开始，混合均匀后迅速放入紫外分光光度计中，以缓冲溶液为参比，30℃反应2min，测定260nm处吸光值的变化。（4）邻苯二酚2,3-双加氧酶活性的测定反应体系为4mL，其中含有0.26mL的粗酶液，pH=7的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液0.16mL，3.58mL浓度为50mg/L的邻苯二酚溶液，反应以加入邻苯二酚溶液开始，混合均匀后迅速放入紫外分光光度计中，以缓冲溶液为参比，30℃反应2min，测定375nm处吸光值的变化。（5）酶活力的测定酶活力单位（U）定义为该反应条件下每分钟催化生成1umoL产物所需的酶量。邻苯二酚1，2-双加氧酶的活力以单位时间内反应生成的粘康酸在26019n陕西科技大学硕士学位论文－1－1nm（ε260=16000mol·L·cm）处吸光度的变化表示。邻苯二酚2，3-双加氧酶的活力以单位时间反应生成的2-羟基粘康酸半醛在375nm（ε375=12000mol·L－1·cm－1）处吸光度的变化测定。酶比活力的计算公式如下：6AV10U（2-1）M式中：U——酶比活力（u/mg）ΔA——每分钟波长下光密度的变化值V——酶活测定体系的体积（mL）ε——邻苯二酚在260nm或375nm处的摩尔消光系数M——测定体系中提取粗酶液菌体的湿重（mg）2.3结果与讨论2.3.1菌株的分离和纯化按逐级驯化的方式不断提高苯酚在培养液中的浓度，获得对苯酚降解性能好的优势菌群。观察到苯酚浓度为2200mg/L时培养液不能变浑浊，所以将苯酚浓度为2000mg/L的培养液在平板上进行涂布，待培养基长出菌落后，挑取单菌落划线分离三次后获得8株纯菌。将筛选得到的菌株接种到含不同苯酚浓度的培养液中，在初始pH为7，温度为30℃、摇床转速200r/min的条件下进行苯酚降解实验并测定苯酚降解率。通过对比不同菌株对苯酚的耐受性和降解效率，选择出了一株对苯酚降解性能最好、耐受性最高的菌株，命名为QWD1。此菌株在液体培养基中对苯酚的耐受阈可以达到1600mg/L，且在48h内基本可将苯酚完全降解，苯酚浓度越低，完全降解所需时间也越短，当苯酚浓度超过菌株的耐受范围时，菌体出现死亡。2.3.2QWD1菌株的形态特征（1）菌落形态特征如图2-2和2-3所示，菌株QWD1的菌落呈圆形，白色，不透明，无水溶性色素产生，表面粗糙，有放射状菌丝，与培养基连接紧密；菌液呈白色，浑浊态。20n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用图2-2QWD1菌落形态图2-3QWD1菌液形态Fig.2-2ColonymorphologyofQWD1Fig.2-3FungalfluidmorphologyofQWD1（2）环境扫描电镜观察通过环境扫描电镜观察QWD1（图2-4），可以看出，菌株为丝状菌，菌丝直径约为2-4μm。图2-4QWD1环境扫描电镜图像Fig.2-4PictureofE-SEMforQWD12.3.3分子生物学鉴定对菌株QWD1进行基于ITSrDNA基因的分子生物学鉴定，将所得序列通过NCBI基因库中的序列进行同源性分析并通过软件MEGA6.0使用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建系统发育树[85]，结果如图2-5所示，表明菌株QWD1属于Magnusiomycescapitatus属，而目前尚未有此种属菌株在含酚废水21n陕西科技大学硕士学位论文处理中应用的报道。同时，将QWD1的ITSrDNA基因序列上传至GenBank，接受编码为MF716448。说明：括号中的序号代表序列GenBank登录号，分支处标注有自展值。图2-5菌株QWD1的系统进化树Fig.2-5ThephylogenetictreeofQWD12.3.4QWD1降解苯酚的路径分析通过测定菌株QWD1粗酶液中邻苯二酚1,2双加氧酶和邻苯二酚2,3双加氧酶的活性，可以判断该菌株降解苯酚的代谢途径。如表2-3可知，两种培养基的胞外粗酶液中均未检测到酶活，而在以苯酚为底物的培养基获得的胞内粗酶液中检测到了邻苯二酚1,2双加氧酶酶活，可以说明苯酚降解相关酶为胞内酶，菌株降解苯酚的路径为苯酚首先在羟化酶的催化作用下生成邻苯二酚，再由邻苯二酚1,2双加氧酶作用，经邻位途径开环裂解，最后形成三梭酸循环中间物。22n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用表2-3不同培养基菌株粗酶液中苯酚相关降解酶比活力Table2-3Specificenzymaticactivitiesofdifferentsubstratesforphenol-degradingenzymes邻苯二酚1,2双加氧酶邻苯二酚2,3双加氧酶培养基质粗酶液比活力(U/mg)比活力(U/mg)苯酚为唯胞外粗酶液00一碳源胞内粗酶液0.910葡萄糖为胞外粗酶液00唯一碳源胞内粗酶液002.4本章小结本实验以苯酚为唯一碳源对处理造纸废水的活性污泥进行驯化，筛选分离出了8株对苯酚有降解能力的菌株，通过对比其对苯酚的降解效果，选择出一株对苯酚耐受性高，降解效果最好的菌株QWD1，通过形态观察、ITSrDNA基因测序进行种属鉴定并构建系统发育树后表明，QWD1为丝状真菌，属于Magnusiomycescapitatus属。通过获取菌株粗酶液并测定邻苯二酚1，2双加氧酶和邻苯二酚2，3双加氧酶的活性，推测得到QWD1降解苯酚的路径为邻位开环降解途径。23n陕西科技大学硕士学位论文3QWD1菌株降解苯酚性能的优化生物法处理废水的过程中，微生物对有机物的降解效果容易受到外界环境的影响。为了提高苯酚降解菌对苯酚的降解效果，一种方法是通过基因工程的手段，除此之外，也可以通过优化培养条件提高苯酚降解菌对苯酚的降解效果。因此，测定环境因素对微生物降解苯酚影响的程度，可以为实际工程中含酚废水的处理提供技术指导。结合实际情况，本实验选择了以下几个因素进行研究，首先考察了不同浓度苯酚对菌株QWD1降酚效果的影响，并通过单因素实验对菌株的降酚性能进行优化，包括不同氮源、接种量、pH、温度以及不同氮源浓度，得到菌株QWD1降解苯酚的最佳条件。3.1实验材料及方法3.1.1菌株来源本实验研究的菌株来自从活性污泥中分离出的QWD1菌株。3.1.2培养基（1）富集培养液：蛋白胨3g/L，酵母粉3g/L，MgCl2•7H2O0.15g/L，CaCl20.1g/L。（2）选择培养液（试剂均为分析纯）：(NH4)2SO40.396g/L，10%NaCl10mL，营养液（次氮基三乙酸10.0g，MgSO4•7H2O29.5g，CaCl2•2H2O3.335g，FeSO4•7H2O0.099g，(NH4)6Mo7O24•4H2O0.0093g，微量元素液50mL，蒸馏水950mL）20mL/L，灭菌后加入磷酸盐缓冲溶液（KH2PO468.05g，K2HPO487.09g，蒸馏水1000mL）20mL/L，维生素溶液（烟酸0.1mg/mL，烟酸硫胺0.05mg/mL，生物素1μg/mL）10mL/L，苯酚含量按需加入，通过1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节pH。3.1.3实验主要仪器实验主要用具：锥形瓶、离心管、烧杯、量筒、容量瓶、比色管、培养皿、等。实验使用的主要仪器如表3-1所示。24n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用表3-1实验主要仪器Table3-1Themaininstrumentsoftheexperiment实验仪器型号生产厂家生物安全柜AC2-4S1新加坡ESCO科技有限公司pH计FE28梅特勒-托利多仪器有限公司磁力搅拌器IKAC-MAGMS10艾卡仪器设备有限公司紫外-可见分光光度计UV759上海佑科仪器仪表有限公司台式高速离心机TD4N长沙英泰仪器有限公司双层恒温摇床QYC-2102C江苏盛蓝仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌锅SN510C重庆雅玛拓科技有限公司100-1000μL、移液枪德国艾本德股份有限公司0.5-5mL电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A上海一恒科学仪器有限公司分析天平JT2003B余姚市金诺天平仪器有限公司高效液相色谱仪600E美国Waters公司3.1.4实验试剂实验所使用的主要试剂如表3-2所示。表3-2实验主要试剂Table3-2Themainreagentoftheexperiment序号名称型号生产厂家1蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司2酵母粉生化试剂生工生物工程（上海）股份有限公司3苯酚分析纯天津市大茂化学试剂厂4(NH4)2SO4分析纯天津市凯通化学试剂有限公司5琼脂粉生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司6NaOH分析纯天津市天力化学试剂有限公司7MgCl2•7H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司8CaCl2分析纯天津市致远化学试剂有限公司9次氮基三乙酸分析纯阿拉丁试剂有限公司10MgSO4•7H2O分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司25n陕西科技大学硕士学位论文11K2HPO4分析纯天津市大茂化学试剂厂12KH2PO4分析纯天津市大茂化学试剂厂13烟酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司14盐酸硫胺生化试剂上海蓝季生物科技有限公司15FeSO4•7H2O分析纯天津市大茂化学试剂厂16KOH分析纯天津基准化学试剂有限公司17氨水分析纯天津市富宇精细化工有限公司18NH4Cl分析纯天津市大茂化学试剂厂194-氨基安替比林分析纯上海科丰实业有限公司20铁氰化钾分析纯天津市天力化学试剂有限公司21NaCl分析纯天津市大茂化学试剂厂22丙三醇分析纯天津市致远化学试剂有限公司23(NH4)6Mo7O24•4H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司24L-天冬氨酸生化试剂天津市大茂化学试剂厂25葡萄糖分析纯天津市大茂化学试剂厂26甲醇色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司3.1.5苯酚浓度的测定采用高效液相色谱法测定培养液中的苯酚浓度。（1）色谱条件固定相：ODS-C18反向色谱柱（250mm×4.6mm）；流动相：甲醇和纯水（v/v=60/40）；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：270nm；柱温：室温30℃；进样体积：20μL。（2）标准曲线的绘制用电子天平准确称取苯酚2g于烧杯中，加超纯水溶解后转移到1000mL的容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，则此苯酚标准贮备液的浓度为2g/L，4℃保存备用。使用时分别准确吸取5，10，15，20，25，30，35，40，45，50mL的苯酚标准贮备液置于50mL比色管中，用超纯水稀释至刻度，配制成浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2g/L的苯酚标准溶液。加盖摇匀后用注射器分别取上述各溶液2mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后注入高效液26n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用相色谱仪（HPLC）中进行测定，记录其在270nm波长处色谱峰的面积，每个浓度进行三次平行实验。绘制峰面积对苯酚标准浓度的标准曲线。本实验得到的标准曲线如图3-1所示，标准曲线方程为y=(19.286x+0.2928)×106，其相关系数为R2=0.9999。图3-1苯酚浓度对峰面积的标准曲线Fig.3-1Thestandardcurveofthephenolconcentrationwithpeakarea（3）菌液中苯酚含量的测定采用高速离心机将培养液于8000r/min离心5min，取上清液1mL经0.22μm针头式微孔滤膜过滤后采用高效液相色谱仪测定其在270nm波长处的峰面积。3.1.6实验设计（1）苯酚挥发性实验在锥形瓶中添加苯酚为1200mg/L的培养液，将接种量为10%的处于指数生长期的QWD1种子液接种到每个锥形瓶中，同时设置灭活细菌作为空白对照实验。调节初始pH=7，并放置于30℃的恒温摇床中进行培养，摇床转速为200r/min。每隔8小时测量苯酚残留浓度，分析的挥发作用对降解效果的影响。（2）QWD1对苯酚的生物降解实验实验在含有100mL选择培养基的五个250mL锥形瓶中进行，所述选择培养基添加0、400、800、1200、1600及1800mg/L的不同浓度的苯酚。灭菌后将接种量为10%的处于指数生长期的QWD1种子液接种到每个锥形瓶中，调节初始pH=7，并放置于30℃的恒温摇床中进行培养，摇床转速为200r/min。每隔8小时测量苯酚残留浓度，了解菌株对不同浓度苯酚的降解情况及耐受性。27n陕西科技大学硕士学位论文所有的测试都重复三次，注意避免苯酚的光破坏。（3）环境因素对菌株QWD1降解苯酚效果的影响将分离筛选得到的QWD1菌株的菌落接种到含富集培养液的锥形瓶中进行扩大培养，定时测定OD600，当其生长至对数期时，将菌液接种到含苯酚的选择培养液中进行苯酚降解实验。通过单因素实验考察不同氮源、不同氮源浓度、pH、温度和接种量等参数对菌株降解苯酚能力的的影响，优化降酚菌的降解性能。3.2结果与分析3.2.1苯酚的挥发性实验由图3-2可知，培养40h时，添加菌株组培养液中的苯酚已经完全降解，而灭活菌株空白组中苯酚的损失约为3.2%，说明降解过程中间苯酚浓度的减少并不完全由苯酚的挥发作用引起。由于空白对照中苯酚的损失量相对较少，因此在后续的实验中忽略这部分的损耗。图3-2苯酚挥发性实验Fig.3-2Thevolatileexperimentofphenol3.2.2苯酚浓度对菌株降解苯酚能力的影响探究不同苯酚浓度对菌株降解能力的影响，可以观察到，在苯酚浓度为低于1600mg/L时，将菌液刚接入培养基时，培养基为含有少量悬浊物的透明液体，可以闻到刺鼻的苯酚气味。随着培养时间的延长，培养基颜色由澄清变浑浊再变为含有大量悬浊物的乳白色，苯酚的刺鼻味道也不断减轻。而当培养基中不含苯酚或当苯酚浓度超过1600mg/L时，则不能观察到培养液颜色明显的28n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用变化。测定不同培养基中剩余苯酚浓度计算出不同时间菌株对苯酚的降解率如图3-3所示，可以看出，此菌株在液体培养基中对苯酚的耐受彧可以达到1600mg/L，且在48h内基本可将苯酚完全降解，苯酚浓度越低，完全降解所需时间也越短。随苯酚浓度的不断增加，相同时间内菌株对苯酚的去除率也随之下降。但是当培养基中苯酚的浓度高于1600mg/L时，菌株在一段时间后不再降解苯酚，对苯酚的去除率只有10%左右。出现这种情况的原因可能是在苯酚浓度超过菌株的耐受彧之后，会使细胞中的酶发生变性，从而使菌株对苯酚的去除率明显下降。此外，还可以看出，菌株对苯酚的降解没有明显的滞后期，尽管开始8h的降解速率要慢得多，但接种完成后苯酚降解就开始了，这可能是由于种子培养液在接种前就保持活性，使菌株可以对环境快速的适应。图3-3苯酚浓度对菌株QWD1降解能力的影响Fig.3-3EffectofphenolconcentrationondegradationabilityofQWD13.2.3最佳氮源的确定微生物的生长繁殖不仅需要足够的有机基质，而且需要多种比例恰当的营养成分，其中包括碳、氮、磷、硫及微量元素等。氮源对耐酚菌株降酚能力影响的对象氮源是提供微生物生长繁殖所必须氮元素的营养源，微生物吸收氮素后用于构成蛋白质、核酸等细胞成分。城市生活污水一般含有上述的全部养料且比例基本恰当，但工业废水则可能缺乏氮或某些微量元素，因而需要及时加以补充，此时合适的氮源选择显得尤为重要。本试验选择了作为研究本实验选择了L-谷氨酸、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、KNO3作为研究对象，在pH为7、温度为30℃、接种量为10%的情况下，添加6mmol/L不同氮源[86]进行苯酚降解实验以选择出合适的氮源，提高菌株对苯酚的降解效果。结果如图3-4所示，29n陕西科技大学硕士学位论文菌株QWD1对无机氮源的利用效果比有机氮源好，其中氮源为(NH4)2SO4时苯酚降解效果最好，32h降解率可达到78.3%。图3-4不同氮源苯酚降解曲线图Fig.3-4Degradationcurveofphenolwithdifferentnitrogensources3.2.4最佳接种量的确定菌液生物量可以直接影响苯酚的降解效果。接种量过小时，菌株适应环境的时间变长，且苯酚对微生物的毒害作用也变大；而接种量过大时，一方面增加预配养成本，另一方面微生物之间会竞争营养物质，代谢产物也会增多，影响菌种的扩大培养，从而影响降酚效果。研究最适添加量，对其今后在实际应用过程中投加量的控制具有很大的指导作用。设置接种量梯度为5%，10%，15%，20%，25%，在苯酚浓度1600mg/L、pH为7、温度为30℃、(NH4)2SO4浓度6mmol/L的条件下培养，每隔4h测定苯酚浓度，苯酚降解率如图3-5所示。可以看出，当接种量过小时，菌株降解苯酚的迟滞期很长，对苯酚的降解效果也不理想；随着接种量的增加，菌株降解苯酚的适应期越来越短，苯酚去除率不断提高。而接种量分别为5%、10%、15%时，32h后，培养液中的苯酚均基本降解完全，说明适当提高接种量可以有效提高菌株对苯酚的降解效果，但继续增加接种量对苯酚降解效果提高不明显，而且会增加处理成本。经综合考虑，选择15%为最佳接种量。30n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用图3-5不同接种量苯酚降解曲线图Fig.3-5Degradationcurveofphenolwithdifferentinoculationamount3.2.5最佳温度的确定温度对微生物酶活性的影响直接影响其生长代谢速率以及降酚活性，选择合适的温度有助于提高酶促反应，加快微生物的细胞新陈代谢速率。设置温度梯度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，在苯酚浓度1600mg/L、pH为7、(NH4)2SO4浓度6mmol/L、接种量15%的条件下培养28h时，苯酚降解率和微生物量如图3-6所示。可以看出，温度对菌株降解苯酚的能力影响较为明显，菌株最佳生长和降酚温度为35℃，28h时苯酚降解率可以达到91.46%。温度过高时会使参与降解酚类的酶蛋白变性失活；而温度过低时酶活性降低，微生物生长代谢变慢，表现为细菌量增长缓慢和降酚能力变差。图3-6温度对菌株降酚性能和生长的影响Fig.3-6Effectoftemperatureonphenoldegradationandgrowthofstrain31n陕西科技大学硕士学位论文3.2.6最佳pH的确定来自工业过程的废水的pH值由于其成分的复杂性而经常波动，这是生物法处理废水的常见问题[87]。pH对微生物的生命活动和代谢活力具有很重要的影响。pH的改变不仅会影响微生物胞外聚合酶的活性[88,89]，改变有害物质对微生物的毒性，还会引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对环境中营养物质的吸收以及对污染物的降解能力[90,91]。不同的微生物所适宜的pH环境也不同，探究其对pH的适应范围和最佳pH，对调节酸碱性来提高微生物的降解效果是非常必要的。设置pH梯度分别为4、5、6、7、8、9，在苯酚浓度1600mg/L、(NH4)2SO4浓度6mmol/L、接种量15%、温度为35℃的条件下条件下培养28h，苯酚降解率和微生物量如图3-7所示。菌株QWD1能够生长的培养基pH范围从4~10，并且不同pH值下生长速率和苯酚降解率有明显区别，其中pH在6~8范围内苯酚去除率和生物量相对较高，在该范围内28h时苯酚去除率达到70%以上，pH为7是其最佳条件，28h时降解率可以达到92%左右。当pH为3和11时，细菌量并无明显增长，这与之前的研究结果一致，即当pH与中性显著不同时，大多数微生物的代谢过程被抑制[92,93]。此外，通过测定反应后的培养液终pH，发现pH都有所降低，是因为苯酚降解过程中会生成一些有机酸的中间产物，主要是己二酸、羟基粘酸、丙酮酸、琥珀酸等羧基酸，这与苯酚降解的机理相符合[94]。图3-7pH对菌株降酚性能和生长的影响Fig.3-7EffectofpHonphenoldegradationandgrowthofstrain3.2.7最佳氮源浓度的确定氮源是影响微生物固碳效果的重要因素，合适的氮源浓度会提高微生物的32n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用固氮效率[95]。设置氮源浓度梯度为2、6、10、14、18mmol/L，在在苯酚浓度1600mg/L、接种量15%、温度35℃、pH为7的条件下培养28h时，苯酚降解率和微生物量如图3-8所示。可以看出氮源浓度对菌株生长和降酚能力的影响并不如温度和pH显著，菌株在不同的氮源浓度下对苯酚的降解率均可以达到90%左右，其中当氮源浓度为14mmol/L时，28h菌株的生物量最大，苯酚降解率也最高，可以达到97.15%。图3-8氮源浓度对菌株降酚性能和生长的影响Fig.3-8Effectofnitrogensourceconcentrationonphenoldegradationandgrowthofstrain3.3本章小结本章通过单因素实验考察了苯酚浓度、不同氮源、接种量、pH、温度及不同氮源浓度对菌株QWD1降解苯酚效果的影响，得到了菌株生长、降酚的最佳条件，得出结论如下：（1）QWD1菌株在液体培养基中对苯酚的耐受彧可以达到1600mg/L，随苯酚浓度的不断增加，相同时间内菌株对苯酚的去除率也随之下降。（2）QWD1菌株降解苯酚的最佳环境条件为：(NH4)2SO4为氮源，接种量为15%，pH为7，温度为35℃，氮源浓度14mmol/L。在此条件下，28小时内对1600mg/L苯酚去除率可以达到97.15%。相比于当前筛选出的一些菌株，如YuJiang等[84]从制药厂分离出的嗜盐真菌JS4降解500mg/L的苯酚需要32h；薛智权等[96]从污水处理厂曝气池中分离得到的热带假丝酵母GY8降解1.0g/L的苯酚需要48h，QWD1显示出较高的苯酚耐受性和良好的苯酚降解效率。33n陕西科技大学硕士学位论文4降酚菌剂的制备固定化微生物处理各类污水方面，中外学者已经进行了很多研究，固定化微生物具有耐受浓度高、降解速率高、处理能力强等特点。然而固定化也存在方法复杂，菌体活性保持性难以维持，成本较高等问题。目前对降酚菌剂制备的研究多采用包埋固定法，而对于利用载体直接吸附法的研究还较少，如葛启隆等[97]以海藻酸钙为材料，对降酚菌株进行包埋固定化；ElnaasMH等[98]将恶臭假单胞菌利用包埋法固定在聚乙烯凝胶上。包埋固定法操作复杂、成本高，且包埋固定化材料的传质阻力较大，对培养基中的氧气和向细胞内的传递以及胞内代谢废物向胞外的传递也会有不利影响，限制了其在实际应用中的推广。基于此，本研究选择了原料丰富易得，操作简单的吸附法构建降酚菌剂的方法，对降酚菌剂载体吸附法的可行性和性能进行研究。4.1实验材料及方法4.1.1实验原料（1）制备菌剂的菌源为本实验分离的QWD1菌株。（2）制备菌剂的载体材料有蛭石、麦麸、硅藻土、谷糠。4.1.2模拟废水的配置用于本章实验配置的模拟废水的配方为：苯酚500mg/L，C6H12O6•H20400mg/L，CaCl21665mg/L，CO(NH2)2600mg/L，MgSO4•7H2O1540mg/L，NaHCO3378mg/L，KH2PO466mg/L，FeCl2•4H2O19mg/L，CoCl2•6H2O0.40mg/L，ZnCl20.23mg/L，NaMoO4•2H2O0.21mg/L，CuSO4•5H2O0.12mg/L，MnSO4•H2O0.12mg/L（实际均为分析纯）。4.1.3实验主要仪器实验主要用具：锥形瓶、离心管、烧杯、量筒、容量瓶、比色管、培养皿等。实验使用的主要仪器如表4-1所示。34n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用表4-1实验主要仪器Table4-1Themaininstrumentsoftheexperiment实验仪器型号生产厂家生物安全柜AC2-4S1新加坡ESCO科技有限公司pH计FE28梅特勒-托利多仪器有限公司磁力搅拌器IKAC-MAGMS10艾卡仪器设备有限公司台式高速离心机TD4N长沙英泰仪器有限公司紫外-可见分光光度计UV759上海佑科仪器仪表有限公司双层恒温摇床QYC-2102C江苏盛蓝仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌锅SN510C重庆雅玛拓科技有限公司固定式漩涡混匀仪MX-G美国赛洛捷克100-1000μL、移液枪德国艾本德股份有限公司0.5-5mL电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A上海一恒科学仪器有限公司分析天平JT2003B余姚市金诺天平仪器有限公司低温冰箱DW-FL450中科美菱低温科技股份有限公司电热恒温水浴锅HH-S4河南金博仪器制造有限公司4.1.4实验试剂实验所使用的主要试剂如表4-2所示。表4-2实验主要试剂Table4-2Themainreagentoftheexperiment序号名称型号生产厂家1蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司2酵母粉生化试剂生工生物工程（上海）股份有限公司3苯酚分析纯天津市大茂化学试剂厂4(NH4)2SO4分析纯天津市凯通化学试剂有限公司5琼脂粉生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司6NaOH分析纯天津市天力化学试剂有限公司7MgCl2•7H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司8CaCl2分析纯天津市致远化学试剂有限公司35n陕西科技大学硕士学位论文9次氮基三乙酸分析纯阿拉丁试剂有限公司10MgSO4•7H2O分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司11K2HPO4分析纯天津市大茂化学试剂厂12KH2PO4分析纯天津市大茂化学试剂厂13烟酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司14盐酸硫胺生化试剂上海蓝季生物科技有限公司15FeSO4•7H2O分析纯天津基准化学试剂有限公司16KOH分析纯天津市大茂化学试剂厂17氨水分析纯天津市富宇精细化工有限公司18NH4Cl分析纯天津市大茂化学试剂厂194-氨基安替比林分析纯上海科丰实业有限公司20铁氰化钾分析纯天津市天力化学试剂有限公司21NaCl分析纯天津市大茂化学试剂厂22丙三醇分析纯天津市致远化学试剂有限公司23(NH4)6Mo7O24•4H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司24L-天冬氨酸生化试剂天津市大茂化学试剂厂25葡萄糖分析纯天津市大茂化学试剂厂4.1.5分析方法（1）COD的测定方法采用重铬酸钾法（GB/T1914-89）。（2）苯酚浓度的测定：与第三章3.1.5相同。4.2实验方法4.2.1不同载体吸水率的测定选用蛭石、麦麸、硅藻土、谷糠四种材料作为载体，为了保证菌液能够被载体材料全部吸附且不含多余的水分，需要测定不同载体材料的吸水率。称取不同载体材料各100g于烧杯中，按一定梯度加入菌液并使菌液和载体充分混匀，直到载体材料湿润、疏松且不沾壁、不结块时为止。定义100g载体材料所含的菌液量为载体吸水率，测定三次取平均值。以吸水率反映载体的吸附能力及确定菌剂中载体材料和菌液的配合比。4.2.2菌剂的制备按合适的配合比分别称取定量的不同载体材料于烧杯中，锡箔纸封口后置36n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用于高压灭菌锅中在121℃条件下灭菌30min。在无菌条件下将20mL培养至对数生长期的菌液加入载体材料中并混合均匀匀后装入无菌容器，放入35℃恒温干燥箱低温烘干，每种菌剂分为两份后分别放置于4℃和常温（25±5℃）条件下保存。4.2.3不同菌剂有效活菌数的测定不同菌剂中有效活菌数的测定采用稀释平板计数法。将以不同载体制备的四种菌剂分别保存于4℃和常温（25±5℃）条件下，在2d、10d、20d、35d、60d、90d时分别取1g菌剂到装有100mL无菌水的锥形瓶中，置于恒温摇床中35℃震荡2h后，取样品经分散和适当稀释后取一定量的稀释液涂布到平板上，经过培养待平板上生长出肉眼可见的菌落，选择菌落数在30-300的平板进行统计。设置三组平行实验并计算平均值。4.2.4不同菌剂降解苯酚效果的测定将保存于4℃和常温（25±5℃）两种温度条件下以不同载体制备的菌剂，在2d、10d、20d、35d、60d、90d时分别取0.1g菌剂加入到50mL苯酚浓度为500mg/L的模拟废水中，测定24h时的苯酚降解率，以此表征菌剂中的菌株活性和降酚能力。4.3结果与分析4.3.1不同载体的吸水率称取不同载体材料各50g于烧杯中，在120℃的条件下灭菌30min，在无菌条件下按梯度加入菌液并使菌液和载体充分混匀，直到载体材料湿润、疏松且不结块、不沾壁时为止。实验得出蛭石、麦麸、硅藻土、谷糠四种载体的吸水率分别为：25%、45%、25%、40%。4.3.2不同保存温度下菌剂的活菌数菌剂的保存稳定性直接影响菌剂的使用效果，为评价不同载体制备菌剂的稳定性，需要测定不同菌剂中微生物的存活情况。测定在不同保存温度下不同时间的四种菌剂中有效活菌数的结果如表4-3和表4-4所示，可以看出，采用不同载体材料制备的菌剂活化后微生物生长量差异很大。由于每种载体吸水率的差别，所能定植的菌量也有差别（0天时不同菌剂的活菌数通过测定接种到载体中的菌液的活菌数计算得到）。谷糠和麦麸由于其吸水性较强，比表面积较大而更有利于菌株的吸附和固定，因而初始有效活菌数多。同时，在菌剂制备完成后常温烘干时间内，由于麦麸和谷糠含有丰富的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维等有机质和氮、磷、钾等元素，可以供菌体37n陕西科技大学硕士学位论文利用维持生命活动并进行增殖，出现了活菌数的一个明显增长。此外，可以看出，在不同的保存温度下，载体中的活菌数随时间会发生一定的变化。以蛭石和硅藻土为载体的菌剂在不同温度下90d的保存效果并没有明显变化，90d时的有效活菌数分别为1.12×106cfu/g和1.2×105cfu/g。以麦麸为载体的菌剂虽然在10d前的活菌数最多，达到2.3×108cfu/g，但随后快速下降，4℃保存效果较常温保存效果稍好。通过测定发现以麦麸为载体的菌剂pH随着保存时间的延长不断增大，超过菌体的耐受范围后引起了菌体的大量死亡，推测是因为菌体利用麦麸含有的某些有机物代谢生长时会产生碱性物质而引起pH变化，常温较低温新陈代谢更快因而pH变化更为明显。而以谷糠为载体的菌剂，在4℃保存时，90d内的有效活菌数一直保持较高水平，高达2.5×108cfu/g左右，25℃保存时，在35d时的活菌数开始下降。测定发现以谷糠为载体的菌剂pH始终稳定在6~7左右，适于作为长期保存的菌剂载体。综上所述，利用谷糠作为载体制备的菌剂具有较好的储藏稳定性，4℃保存效果优于常温保存，菌剂可保存90d甚至更长时间。表4-34℃保存下不同菌剂的有效活菌数Table4-3Thenumberofeffectiveviablefungiofdifferentmicrobialinoculumunder4℃有效活菌数（×105cfu/g）载体材料0d2d10d20d35d60d90d蛭石36.512.214.213.611.812.111.2麦麸66.4214032806071050.00093/硅藻土41.71.451.74.32.231.41.2谷糠58.4240023602410247025002480表4-4常温保存下不同菌剂的有效活菌数Table4-4Thenumberofeffectiveviablefungiofdifferentmicrobialinoculumundernormaltemperature有效活菌数（×105cfu/g）载体材料0d2d10d20d35d60d90d蛭石36.515.614.51410.61.270.89麦麸66.4272023100.0008///硅藻土41.75.35.073.63.032.671.61谷糠58.43140320027808906254204.3.3不同保存温度下菌剂对苯酚的降解效果38n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用有效活菌数并不能完全体现菌剂处理含酚废水的效果，所以需要考察菌剂活性和降酚性能随时间的变化。测定不同菌剂对模拟废水中苯酚的降解效果，结果如图4-1和图4-2所示，可以看出，两种温度保存过程中，菌剂对苯酚的去除效果均有波动，其中以麦麸为载体的菌剂分别在35d和10d前具有良好的降酚效果，24h内基本可以将苯酚降解完全，但随保存时间的延长，降酚效果快速下降。以蛭石和硅藻土为载体的菌剂在两种保存温度下24h对苯酚的去除效果普遍不高。而以谷糠为载体的菌剂，无论是4℃还是常温下，保存90d内24h对苯酚的去除率均可以达到100%左右。综上所述，以谷糠为载体的菌剂对苯酚的去除效果最好，90d内4℃和常温保存均对苯酚有较高的去除率，这证明了合适的载体不仅会提供给微生物一定的碳源以满足它们的生命活动，更能帮助微生物保持活性，如范伟平等[99]用稻草末固定白腐菌用于处理染料废水，认为稻草末可以提供给菌体生长所需的营养；谢冬瑾等[100]用丝瓜囊吸附固定白腐真菌对含酚模拟废水进行处理，15h的苯酚去除率可以达到100%，COD去除率可以达到96%。图4-14℃保存下不同菌剂的降酚效果Fig.4-1Thephenol-degradingresultsofdifferentmicrobialinoculumunder4℃39n陕西科技大学硕士学位论文图4-2常温保存下不同菌剂的降酚效果Fig.4-2Thephenol-degradingresultsofdifferentmicrobialinoculumundernormaltemperature4.4本章小结吸附法制备菌剂操作简单，生产加工过程中可以缩短用时，提高效率。本章通过对比无机载体和有机载体对菌液的吸附效果以及制备菌剂后的保存效果，发现麦麸和谷糠吸水率高，对QWD1菌株有较好的吸附效果，它们均属于农业废弃物，资源丰富，成本低廉。但在长期保存的过程中以麦麸制备的菌剂pH变化较大，保存时间较短。同时，在对比在4℃和常温条件下不同菌剂的保存效果后，发现4℃的保存效果均优于常温保存，其中以谷糠为载体制备的菌剂4℃条件下保存时间可以达到90d甚至更长，对含酚废水的处理效果也优于其他菌剂，有良好的应用潜力。40n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用5降酚菌剂对活性污泥处理含酚废水效果及其微生物群落结构的影响5.1实验材料及方法5.1.1实验原料（1）降酚菌剂：参考第四章用QWD1菌株制备的菌剂。（2）种子污泥：用于实验的活性污泥取自陕西省某造纸厂废水处理段好氧池，4℃保存备用。5.1.2模拟废水的配置用于本章实验配置的模拟废水的配方为：C6H12O6•H20400mg/L，CaCl21665mg/L，CO(NH2)2600mg/L，MgSO4•7H2O1540mg/L，NaHCO3378mg/L，KH2PO466mg/L，FeCl2•4H2O19mg/L，CoCl2•6H2O0.40mg/L，ZnCl20.23mg/L，NaMoO4•2H2O0.21mg/L，CuSO4•5H2O0.12mg/L，MnSO4•H2O0.12mg/L，苯酚按需添加（实际均为分析纯）。5.1.3实验主要仪器实验主要用具：锥形瓶、离心管、烧杯、量筒、容量瓶、比色管、培养皿、曝气头等。实验使用的主要仪器如表5-1所示。表5-1实验主要仪器Table5-1Themaininstrumentsoftheexperiment实验仪器型号生产厂家生物安全柜AC2-4S1新加坡ESCO科技有限公司pH计FE28梅特勒-托利多仪器有限公司磁力搅拌器IKAC-MAGMS10艾卡仪器设备有限公司台式高速离心机TD4N长沙英泰仪器有限公司紫外-可见分光光度计UV759上海佑科仪器仪表有限公司双层恒温摇床QYC-2102C江苏盛蓝仪器制造有限公司分析天平JT2003B余姚市金诺天平仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅SN510C重庆雅玛拓科技有限公司固定式漩涡混匀仪MX-G美国赛洛捷克41n陕西科技大学硕士学位论文100-1000μL、移液枪德国艾本德股份有限公司0.5-5mL电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A上海一恒科学仪器有限公司低温冰箱DW-FL450中科美菱低温科技股份有限公司电热恒温水浴锅HH-S4河南金博仪器制造有限公司充氧泵AC0-003森森集团股份有限公司三参数水质检测仪5B-6C北京连华科技有限公司5.1.4实验试剂实验所使用的主要试剂如表5-2所示。表5-2实验主要试剂Table5-2Themainreagentoftheexperiment序号名称型号生产厂家1蛋白胨生化试剂国药集团化学试剂有限公司2酵母粉生化试剂生工生物工程（上海）股份有限公司3苯酚分析纯天津市大茂化学试剂厂4(NH4)2SO4分析纯天津市凯通化学试剂有限公司5琼脂粉生化试剂北京奥博星生物技术有限责任公司6NaOH分析纯天津市天力化学试剂有限公司7MgCl2•7H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司8CaCl2分析纯天津市致远化学试剂有限公司9次氮基三乙酸分析纯阿拉丁试剂有限公司10MgSO4•7H2O分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司11K2HPO4分析纯天津市大茂化学试剂厂12KH2PO4分析纯天津市大茂化学试剂厂13烟酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司14盐酸硫胺生化试剂上海蓝季生物科技有限公司15FeSO4•7H2O分析纯天津市大茂化学试剂厂16KOH分析纯天津基准化学试剂有限公司17氨水分析纯天津市富宇精细化工有限公司18NH4Cl分析纯天津市大茂化学试剂厂42n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用194-氨基安替比林分析纯上海科丰实业有限公司20铁氰化钾分析纯天津市天力化学试剂有限公司21NaCl分析纯天津市大茂化学试剂厂22丙三醇分析纯天津市致远化学试剂有限公司23(NH4)6Mo7O24•4H2O分析纯天津市天力化学试剂有限公司24L-天冬氨酸生化试剂天津市大茂化学试剂厂25葡萄糖分析纯天津市大茂化学试剂厂5.1.5分析方法（1）COD的测定方法采用重铬酸钾法（GB/T1914-89）。（2）苯酚浓度的测定：与第三章3.1.5相同。5.2实验方法5.2.1活性污泥投加生物强化菌剂的效果研究将保存备用的活性污泥取出摇匀后倒入烧杯，静置沉淀30min后倒去上清液。取100mL活性污泥，400mL苯酚浓度为1600mg/L的模拟废水倒入500mL量筒中，控制温度在30℃左右，溶解氧在2-3mg/L之间，曝气84h。设置三组平行实验，每隔12h测定COD去除率，并每隔4h测定苯酚去除率。在相同条件下，将1gQWD1降酚菌剂投加至活性污泥中进行实验，研究降酚菌剂对活性污泥处理含酚废水效果的影响。5.2.2菌剂添加量对活性污泥降酚效果的影响分别取5组500mL的量筒（每组3个），标记为S1、S2、S3、S4、S5组，分别加入100mL静置沉淀30min的活性污泥和400mL苯酚浓度为1600mg/L的模拟废水。其中S1为对照组，不添加降酚菌剂，S2、S3、S4、S5分别加入2、4、6、8g/L的QWD1降酚菌剂，控制温度在30℃左右，溶解氧在2-3mg/L之间，曝气72h。每隔12h测定COD去除率，并每隔4h测定苯酚去除率。探究不同菌剂添加量对活性污泥处理含酚废水效果的影响，以得到最佳菌剂添加量。5.2.3活性污泥微生物群落结构的研究（1）样本总DNA抽提：分别对原始活性污泥，S1、S2、S3反应器中反应24h和72h时的活性污泥进行取样并标记为S0、S1D1、S2D1、S3D1、S1D3、S2D3、S3D3，置于高速离心机中8000r/min离心5min后弃去上清液，样品保存于-80℃条件下。DNA的提取步骤参照试剂盒（Tiangen-genomicDNAKit）43n陕西科技大学硕士学位论文的使用说明书。完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。（2）设计并合成引物接头：用于细菌16SrDNA扩增的引物为V3-V4区通用引物338F（5’-CTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3’）；用于真菌ITSrDNA扩增的引物为ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。（3）PCR扩增PCR反应体系（20μL）：5ng/μLDNA模板2μL，5×Buffer5μL，5×GCBuffer5μL，5U/μLDNA酶0.25μL，5μM引物各0.5μL，2.5mMdNTP2μL，补充ddH2O到20μL。PCR反应参数：a.98℃初始变性2min；b.98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s（35个循环）；c.72℃终循环5min。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒对目标片段进行切胶回收。（4）参照凝胶电泳的初步定量结果，对PCR扩增回收产物进行荧光定量。（5）高通量测序采用Illumina公司的Miseq测序平台。5.3结果与讨论5.3.1降酚菌剂对活性污泥处理含酚废水效果的影响本实验探讨了投加QWD1降酚菌剂对活性污泥处理模拟含酚废水效果的影响。图5-1对比了投加降酚菌剂组与不投加菌剂组的活性污泥在不同时间对苯酚浓度为1600mg/L模拟废水的COD去除效果，可以看出，两组实验均存在COD去除效率的平稳阶段，达到平稳阶段后继续增加处理时间，COD的去除率不再上升。添加菌剂组的活性污泥在60h后出现了COD去除效率的平稳阶段，最佳去除率为93.2%，而未添加菌剂组的活性污泥在72h才出现COD去除率的最佳值，最佳去除率为87.9%。实验结果表明，在相同的处理条件和时间下，投加降酚菌剂可以明显提高活性污泥对含酚废水的处理效果，加快COD去除效率，提高最终COD去除率。44n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用图5-1添加降酚菌剂对模拟含酚废水中COD去除的影响Fig.5-1Effectofaddingthephenol-degradingmicrobialinoculumonCODremovalfromsimulatedphenol-containingwastewater图5-2添加降酚菌剂对模拟含酚废水中苯酚去除率的影响Fig.5-2Effectofaddingthephenol-degradingmicrobialinoculumonthephenoldegradationrateinsimulatedphenol-containingwastewater图5-2对比了投加降酚菌剂组和不投加菌剂组活性污泥在不同时间对含酚废水中苯酚的去除效果，可以看出，降酚菌剂的投加对活性污泥降解苯酚效能起到了很大的促进作用，32h时废水中苯酚得降解率就可以达到100%，而此时，未添加菌剂组的活性污泥对苯酚的去除率仅为72.3%。同时，添加降酚菌剂的活性污泥降解苯酚的迟滞期较短，12h后已经开始进入快速降酚阶段，而45n陕西科技大学硕士学位论文未添加菌剂的活性污泥在16h后才开始快速降解苯酚。实验结果表明，生物强化菌剂的投加提高了活性污泥对含酚废水的处理效果，可以缩短完全降解苯酚所需时间。5.3.2菌剂投加量的优化研究分别取100mL的活性污泥及400mL苯酚浓度为1600mg/L的模拟含酚废水，加入不同量的降酚菌剂后进行曝气处理，菌剂添加量分别为2、4、6、8g/L，室温下反应72h。通过对COD去除率和苯酚降解率的比较确定降酚菌剂的最佳添加量。由图5-3可以看出，COD去除率随降酚菌剂添加量的增加呈现出先增高后降低的趋势，当降酚菌剂的添加量为4g/L时，COD去除率最高，60h后COD去除率到达平稳阶段，最佳去除率为94.7%。此后随着菌剂添加量的增大，COD的去除率反而降低，一方面可能是由于添加过多的外来微生物会与土著微生物竞争营养物质，导致大量微生物缺乏营养物质后活性降低，另一方面可能是由于降酚菌剂本身由麦麸制备，麦麸分解的有机物没有被微生物分解利用，也成为COD数值的贡献者。因此，就COD的去除率而言，降酚菌剂的最佳添加量为4g/L，最佳处理时间为60h。图5-3不同菌剂添加量对模拟含酚废水中COD去除的影响Fig.5-3Effectofdifferentphenol-degradingmicrobialinoculumadditivesonCODremovalfromsimulatedphenol-containingwastewater对比不同菌剂添加量对活性污泥处理模拟含酚废水的降酚效果如图5-4所示，可以看出，苯酚降解率的趋势与COD去除率相同，当降酚菌剂的添加量为4g/L时，苯酚降解率最高，24h时就可以将苯酚完全降解，菌剂添加量为2g/L或8g/L时28h的苯酚降解率仅为88.5%和83.5%，说明过多或过少的菌46n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用剂添加量都会影响活性污泥的降酚效果。综合以上实验结果，可以看出针对高浓度的含酚废水，降酚菌剂的最佳添加量为4g/L。图5-4不同菌剂添加量对模拟含酚废水中苯酚去除率的影响Fig.5-4Effectofdifferentphenol-degradingmicrobialinoculumadditivesonthephenoldegradationrateinsimulatedphenol-containingwastewater5.3.3活性污泥中微生物群落结构的分析（1）菌群基因组DNA鉴定使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测提取出的基因组DNA，样品上样量为5μL，电泳时间20min，电泳图如图5-5所示，可以看出，样品条带明亮清晰，符合建库测序要求。图5-5琼脂糖凝胶电泳图Fig.5-5TheelectrophoresisofDNAproducts（2）测序数据质量评价与统计分析47n陕西科技大学硕士学位论文1）有效序列数据统计对7个活性污泥样品的原始测序数据（RawData）进行统计，共得到细菌的有效序列327159条，真菌的有效序列437823条。细菌和真菌的有效序列长度分布如表5-3、5-4所示。表5-3细菌的有效序列长度分布Table5-3LengthdistributionofbacterialvalidsequencesLength（bp）SequencesPercent1-220780.02%221-2601930.06%261-30032637099.76%301-340310.01%341-38020.00%381-42090.00%421-4602930.09%461-5001830.06%表5-4真菌的有效序列长度分布Table5-4LengthdistributionoffungalvalidsequencesLength（bp）SequencesPercent1-100830.22%101-150278577.24%151-200238006.18%201-25032742385.08%251-30050121.30%301-3505640.15%351-400590.02%401-500650.02%2）优化序列数据统计原始数据中可能存在模糊碱基、单碱基高重复区及长度过短的序列等低质量数据，所以需要对得到的有效序列进行质控和过滤，得到更利于精准分析的优化序列用于后续的生物信息学分析。对有效序列过滤处理后，7个样品共得到细菌优化序列282834条，真菌有效序列366569条。其长度分布分别如表5-5、48n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用5-6所示，可以看出，优化后的序列的长度分布更加集中，为后续的生物信息学分析提供了更为精准的序列。表5-5细菌的优化序列长度分布Table5-5LengthdistributionofbacterialtrimedsequencesLength（bp）SequencesPercent100-200110.00%221-240430.02%241-26030.00%261-28028275699.97%281-300130.00%301-40080.00%表5-6真菌的优化序列长度分布Table5-6LengthdistributionoffungaltrimedsequencesLength（bp）SequencesPercent100-1503360.09%151-20028719278.35%201-2507748621.14%251-30013330.36%301-3501700.05%351-450520.01%（3）稀释性曲线稀释性曲线（Rarefactioncurve）是以随机抽取的测序数据量为横坐标，以观测到的OTU数为纵坐标构建的曲线[101]。它可以用来评判每个样本的当前测序深度是否足以反映该群落样本所包含的微生物多样性，也可以用来反映在相同的测序深度下不同样品中OTU数量的多少，比较不同样本中OTU数的多少，从而在一定程度上衡量每个样本的多样性高低。本实验在97%相似度的OTU下制作的稀释性曲线如图所示，可以看出，稀释性曲线在小于5000条序列时，OTU数量增加迅速，而随着测序深度的不断增加，几组样品细菌和真菌的稀释性曲线均逐渐趋于平缓，说明测序深度可以覆盖样本中所有潜在的微生物种群，满足实验要求。49n陕西科技大学硕士学位论文图5-6细菌群落的稀释性曲线Fig.5-6Rarefactioncurveofthebacterialcommunities图5-7真菌群落的稀释性曲线Fig.5-7Rarefactioncurveofthefungalcommunities（4）微生物群落结构分析OTU（OperationalTaxonomicUnits）是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（种、属等）设置的同一标志[102]。通过将序列按照彼此间的相似性进行划分和归类操作，就可以得到一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息。可根据不同的相似度水平对所有序列进行OTU划分，OTU的相似度一般有90%、95%、97%三个水平，本实验选择在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。1）细菌多样性分析各个样品的细菌的多样性指数如表5-7所示。S0的Chao1指数为1862，50n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用S1、S2、S3在24h时的Chao1指数分别为1965、2037、2277，76h时的Chao1指数分别为1320、1391、1561。可以看出活性污泥用于处理含酚废水后细菌丰度会有所提高，大量细菌开始利用有机物进行增殖。相比同时期S1、S2、S3的Chao1指数，可以看出降酚菌剂的添加可以提高反应器处理废水过程中细菌的丰度。而1d到3d，三组反应器中细菌的Chao1指数都有所减少，这是由于反应后期有机物的减少导致营养物质的缺失而降低了的细菌的丰度。S0的Shannon指数为9.37，S1、S2、S3在24h时的Shannon指数分别为7.53、7.64、8.39，76h时的Shannon指数分别为6.62、6.73、7.17。可以看出，由于原始活性污泥中某些细菌不能适应高浓度苯酚环境，三组反应器中的细菌多样性都较原始污泥减小。而对比同时期的S1、S2、S3的Shannon指数可以看出，降酚菌剂的添加会提高活性污泥中的细菌多样性，可能是由于降酚菌剂的投加会使苯酚降解相关的细菌菌群富集而造成多样性增加，另一方面苯酚的降解在一定程度上解除了其对部分细菌的毒性抑制。随着反应时间的增加，由于有机物被大量消耗，三组反应器的Shannon指数都出现了下降。表5-7各个样品中细菌多样性指数统计Table5-7StatisticsofbacterialAlpha-diversityindexineachsampleSampleIDSimpsonChao1ACEShannonS00.9954551862.001862.009.37S1D10.9913041965.672133.247.53S2D10.9760402037.832185.827.64S3D10.9759122277.942344.238.39S1D30.9583701320.521423.696.62S2D30.9685821391.801489.436.73S3D30.9781741561.051662.247.17说明：Simpson/Shannon[103,104]：多样性指数，用来评价样品中群落的多样性。Simpson或Shannon指数值越高，表明样品中微生物群落多样性越高。Chao1/ACE[105,106]：丰富度估计指数，用来估计样品中实际存在的物种数。Chao1或ACE指数值越大，代表样品中所含物种总数越丰富。几组样品中细菌门水平微生物群落结构如图5-8所示，可以看出，在原始污泥样品S0中，优势菌菌群为Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Planctomycetes（浮霉菌门）和Firmicutes51n陕西科技大学硕士学位论文（厚壁菌门），其所占比例分别为46.1%、18.3%、9.6%、7.0%和3.7%。这与相关活性污泥微生物群落结构研究所得到的结论相同。如金浩等[107]研究污水处理活性污泥微生物多样性后发现Proteobacteria、Firmicures、Bacteroidetes、Chloroflexi、Nitrospirae为优势菌群。随着环境中有毒有害物质的增加，活性污泥中的细菌群落会发生改变，不能适应环境生存的细菌被淘汰。在处理高浓含酚废水的活性污泥样品中，虽然这五类细菌仍为优势菌，但在整个样品中所占比例却发生明显变化。如Firmicutes，在S1、S2、S3样品中所占比例均明显提高，是因为其对苯酚有较高的耐受性和适应能力。而Proteobacteria、Bacteroidetes在S1、S2、S3中1d的比例均较原始污泥有所减小，可能是因为其不能耐受高浓度的苯酚而大量死亡，而在3d时，Bacteroidetes、Proteobacteria的比例有所提高，也是因为苯酚被降解为各类中间产物，酚对环境中微生物的毒性胁迫基本消失，对照中的土著优势种群开始恢复。FirmicutesProteobacteriaBacteroidetesChloroflexiPlanctomyceyessAcidobacteriaVerrucomicrobiaActinobacteriaNitrospiraeArmatimonadetesCyanobacteriaSaccharibacteriaChlorobiGemmatimonadeteChlamydiaeIgnavibacteriaeParcubacteriaGracilibacteria图5-8细菌门水平群落结构组分图Fig.5-8Microbialcommunityhistogramofbacteriaatthephylumlevel图5-9为几组样品中细菌属水平群落结构图，可以看出S0中的微生物多样性较高，而处理含酚废水的几组活性污泥样品中微生物群落多样性都有所减少，一些不能耐受高浓度苯酚的菌株被环境所淘汰，而一些可以直接利用苯酚作为基质生长或在其他共代谢基质下可以降解苯酚的菌株则大量增殖。S1、S2、S3中的优势菌为Bacillussp.（芽孢杆菌属）、Domibacillussp.（房间芽孢杆菌属）、Lysinibacillussp.（赖氨酸芽孢杆菌属）。在系统处理前期（1d），对比S1D1，S2D1，S3D1可以看出，QWD1菌剂的加入使能够参与酚类代谢的原核52n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用生物如Bacillussp.（芽孢杆菌属）、Domibacillussp.（房间芽孢杆菌属）等种群规模扩大，可能是由于加入的QWD1强化菌剂可以先代谢完成苯酚降解过程中耗能较大的开环环节，而代谢过程中产生的中间产物如丙酮酸、乙酸、琥珀酸等则更容易被芽孢杆菌属细菌利用，刺激了芽孢杆菌属等种群规模的快速增加。而在系统处理后期（3d），对比几组样品的物种多样性，可以看出，S3D3的多样性高于S2D3和S1D3，且有恢复到原始生态系统的趋势。这说明菌剂的加入可以有效地提高降解后期的微生物多样性，有利于进一步形成稳定的微生物生态系统。BacillusDomibacillusLysinbacillusLysobacterRhodopseudomonasThaueraStenotrophomonasChryseobacteriumunculturedunidentifiedMacellibacteroidesOrnatilineaunculturedHerbaspirillumLuteimonasDechloromonasUnculturedAilcycliphilusunidentifieduncultured图5-9细菌属水平群落多样性结构图Fig.5-9Microbialcommunityhistogramofbacteriaatthegenuslevel2）真菌多样性分析各个样品的真菌的多样性指数如表5-8所示。S0的Chao1指数为401，S1、S2、S3在24h时的Chao1指数分别为293、324、390，76h时的Chao1指数分别为226、280、336。可以看出活性污泥用于处理含酚废水后真菌丰度会有所下降。相比同时期的S1、S2、S3的Chao1指数，可以看出降酚菌剂的添加可以提高反应器处理废水过程中真菌的丰度，这可能是由于QWD1真菌投加到活性污泥中用于处理含酚废水后可以很快适应环境并利用苯酚作为生长基质来进行增殖，而导致添加菌剂的反应器中真菌丰度提高，且添加量越大，提高越明显。S0的Shannon指数为4.45，S1、S2、S3在24h时的Shannon指数分别为53n陕西科技大学硕士学位论文3.60、3.62、3.91，76h时的Shannon指数分别为3.85、4.43、4.60。可以看出，由于原始活性污泥中某些真菌因不能适应高浓度苯酚环境被淘汰，三组反应器中的真菌多样性都较原始污泥减小。而对比同时期的S1、S2、S3的Shannon指数可以看出，降酚菌剂的添加会提高活性污泥中的真菌多样性，可能是由于降酚菌剂的投加加快了苯酚的去除效率，相应的减少了苯酚对一些耐受度较低菌株的毒害作用，使其尽快恢复活性。表5-8各个样品中真菌多样性指数统计Table5-8StatisticsoffungalAlpha-diversityindexineachsampleSampleIDSimpsonChao1ACEShannonS00.877342401.08399.834.45S1D10.833217293.27296.513.60S2D10.837848324.17325.153.62S3D10.840542390.92386.803.91S1D30.829047226.53221.273.85S2D30.899698280.00280.004.43S3D30.932599336.23340.514.60说明：Simpson/Shannon[103,104]：多样性指数，用来评价样品中群落的多样性。Simpson或Shannon指数值越高，表明样品中微生物群落多样性越高。Chao1/ACE[105,106]：丰富度估计指数，用来估计样品中实际存在的物种数。Chao1或ACE指数值越大，代表样品中所含物种总数越丰富。几组样品中真菌门水平微生物群落结构如图5-10所示。可以看出，在原始污泥样品S0中，优势菌菌群为Rozellomycota、Zyqomycota、Basidiomycota（担子菌门）、Ascomycota（子囊菌门）和unclassified（未分类），其所占比例分别为46.1%、18.3%、9.6%、7.0%和3.7%。当利用活性污泥处理含酚废水后，随着高浓度苯酚的出现，活性污泥中的真菌群落会发生改变，不能适应环境生存的真菌如unclassified被大量淘汰。而一些对苯酚有较高的耐受性和适应能力的真菌则开始利用苯酚最为碳源能源进行增殖，如Zyqomycota。同时，我们可以观察到，Ascomycota在S1、S2、S3中的比例较S0有明显增多，且随着降酚菌剂的添加而增多，添加量越大，增多越明显，这是因为菌剂中的QWD1菌株属于Ascomycota（子囊菌门），随着菌剂添加量的提高，活性污泥中Ascomycota的比例不断增多，可能是因为QWD1菌株在活性污泥中可以很快54n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用的适应环境并且成为优势种，从而提高了Ascomycota的丰度。随着反应时间的延长，由于代谢基质苯酚的大量消耗，Ascomycota在72h的丰度会有所下降。ZyqomycotaRozellomycotaunclassifiedAscomycotaBasidiomycotaCiliophoraUnidentifidGlomeromycotaChytridiomycotaNeocallimastigomycotaCercozoa图5-10真菌门水平群落结构组分图Fig.5-10Microbialcommunityhistogramoffungusatthephylumlevel图5-11为几组样品中真菌属水平群落结构图，可以看出原始活性污泥中的微生物种类和处理含酚废水的几组活性污泥样品中微生物种类有较为明显的变化，一些不能耐受高浓度苯酚的菌株被环境所淘汰，而一些可以直接利用苯酚作为基质生长或在其他共代谢基质下可以降解苯酚的菌株则大量增殖。S1、S2、S3中的优势菌为Basidiobolussp.、Magnusiomycessp.、Bullerasp.及undientified。其中，在反应器处理前期（1d），投加的QWD1菌株所属的Magnusiomycessp.在经强化的处理器中含量明显较未经强化的处理器中含量高，且菌剂添加量越多，含量提高越明显，说明QWD1可以在微生物系统中存活并成为优势菌种。而Basidiobolussp.、Bullerasp.及undientified在S1、S2、S3中的含量也较原始活性污泥中有明显增多，说明这些种群对苯酚有良好的耐受性或可能通过与添加的QWD1菌株形成共代谢互生关系稳定种群规模。对比反应器处理后期（3d）几组反应器的真菌多样性，可以看出经生物强化的反应体系真菌多样性明显高于未强化的反应体系。可见，生物强化可以促进真菌群落的演替，增加其适应外部环境变化的能力。55n陕西科技大学硕士学位论文BasidiobolusundientifiedunclassifiedMagnusiomycesBulleraSchizangiellaTrichosporonThanatephorusunidentifiedunidentifiedCandidaCryptococcusLecteraEntolomaunidentifiedAspergillusunidentifiedAmbisporaHyphopichia图5-11真菌属水平群落结构组分图Fig.5-11Microbialcommunityhistogramoffungusatthegenuslevel（5）样品群落差异性分析采用非度量多维尺度分析法（NMDS）对7个样品的微生物群落组成进行排序，其结果如图5-12和5-13所示，可以看出，不管是细菌群落还是真菌群落，7个样品的样点均被分为三组且分组情况相同，各分组相距较远说明其微生物群落结构存在明显差异。其中S1D1、S2D1、S3D1三组活性污泥的样点聚在一起（分组B），表明群落结果相近，这是由于苯酚降解初期大量酚降解相关的微生物聚集；S1D3、S2D3、S3D3的样点为组C，但其样点分布较为分散，说明其组间群落结构差异较大，说明菌剂的添加对系统处理后期的微生物群落组成影响较大，其中S3D3距原始污泥样品S0的样点较近，这进一步说明了菌剂的添加有利于微生物种群向原始生态系统恢复。56n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用图5-12基于NMDS分析的各样品细菌群落组成差异Fig.5-12DifferencesofbacterialcommunitiesineachsamplesbasedonNMDSanalysis图5-13基于NMDS分析的各样品真菌群落组成差异Fig.5-13DifferencesoffungalcommunitiesineachsamplesbasedonNMDSanalysis5.4本章小结本章通过对比投加生物强化菌剂和非强化的活性污泥对模拟含酚废水COD和苯酚的处理效果，发现在相同反应条件下，投加降酚菌剂可以明显提高活性污泥对含酚废水的处理效果，缩短苯酚完全降解所需时间，加快COD去57n陕西科技大学硕士学位论文除效率并提高COD总去除率。单因素实验考察不同菌剂添加量对活性污泥处理模拟含酚废水效果的影响，得到最适的菌剂添加量为4g/L，在此条件下24h就可以将浓度为1600mg/L的苯酚完全降解，60h时的COD去除率可以达到94.7%，而过多和过少的菌剂添加量都会影响活性污泥的降酚效果。利用高通量测序技术分析了经生物强化和非强化的活性污泥中的微生物群落结构，得出以下几点结论：（1）对几组样品的细菌微生物群落进行分析，发现降酚菌剂的添加可以提高反应器处理废水过程中细菌的丰度和多样性。几组样品中细菌优势菌菌群均为Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Planctomycetes（浮霉菌门）和Firmicutes（厚壁菌门），但在经强化和非强化的活性污泥样品中中所占比例却发生明显变化。QWD1菌剂的投加使能够参与酚类代谢的原核生物如Bacillussp（.芽孢杆菌属）、Domibacillussp.（房间芽孢杆菌属）等种群规模扩大，并且可以有效地提高降解后期的微生物多样性，有利于进一步形成稳定的微生物生态系统。（2）对几组样品的真菌微生物群落进行分析，发现降酚菌剂的添加可以提高反应体系处理废水过程中真菌的丰度和多样性。投加的QWD1菌株所属的Magnusiomycessp.在经强化的处理器中含量明显较未经强化的处理器中含量高，且菌剂添加量越多，含量提高越明显，说明QWD1可以在微生物系统中存活并成为优势菌种。（3）采用非度量多维尺度分析法（NMDS）对样品的微生物群落组成进行排序，群落结构差异较大，菌剂的添加对系统的微生物群落组成影响较大，其中S3D3距原始污泥样品S0的样点最近，进一步说明了菌剂的添加有利于微生物种群向原始生态系统恢复。58n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用6结论与展望6.1结论苯酚是许多工业废水最常见的污染物之一，其环境暴露后的生态危害极大，基于微生物降解的含苯酚污水处理技术集反应条件温和、成本低和无二次污染等优点，极具开发潜力。本文通过分离筛选高效降酚菌株，优化其对苯酚的最适降解条件，并通过吸附法构建菌剂以选择出合适的载体材料，最终将制备的菌剂投加到活性污泥，考察投加降酚菌剂对活性污泥处理含酚废水效果和其微生物群落结构的影响。实验得出以下结论：（1）对处理造纸厂废水的活性污泥进行以苯酚为唯一碳源的驯化，遴选出了一株对苯酚耐受性高，降解效果好的菌株QWD1。通过形态观察、ITSrDNA基因测序进行种属鉴定并构建系统发育树后表明，QWD1属于Magnusiomycescapitatus属。同时，获取QWD1菌株粗酶液并测定邻苯二酚1，2双加氧酶和邻苯二酚2，3双加氧酶的活性，推测得到QWD1降解苯酚的路径为邻位开环降解途径。（2）通过单因素实验考察了苯酚浓度、氮源种类、接种量、pH、温度及不同氮源浓度对菌株QWD1降解苯酚效果的影响，发现QWD1菌株在液体培养基中对苯酚的耐受阈可以达到1600mg/L。QWD1菌株生长、降解苯酚的最佳环境条件为：(NH4)2SO4为氮源，接种量为15%，pH为7，温度为35℃，氮源浓度14mmol/L。在此条件下，28小时内对1600mg/L苯酚去除率可以达到97.15%。（3）以蛭石、麦麸、硅藻土、谷糠为载体利用吸附法构建菌剂，通过对比不同菌剂在不同保存温度和保存时间的有效活菌数和苯酚降解效果，证明了有机载体由于其营养物质丰富更有利于菌株的保存，其中以谷糠为载体制备的菌剂在保存过程中pH稳定，单位有效活菌数高且投加后降解苯酚效果好，保存时间可达到90d甚至更长，有效活菌数高达2.5×108cfu/g左右。（4）通过对比投加生物强化菌剂和非强化的活性污泥对模拟含酚废水的处理效果，发现在相同反应条件下，投加降酚菌剂可以明显提高活性污泥对含酚废水的处理效果，缩短苯酚完全降解所需时间，加快COD去除效率并提高COD总去除率。最适的菌剂添加量为4g/L，在此条件下24h就可以将浓度为1600mg/L的苯酚完全降解，60h时的COD去除率可以达到94.7%。在利用高通量测序技术分析经生物强化和非强化的活性污泥中的微生物群落结构后，发现QWD1菌剂的投加可以提高反应体系处理废水过程中微生物的丰度和多样59n陕西科技大学硕士学位论文性，QWD1（Magnusiomycessp.）菌株可以在微生物系统中存活并成为优势菌种。同时，QWD1菌剂投加到活性污泥中使能够参与酚类代谢的微生物种群规模扩大，并有效地提高降解后期的微生物多样性，有利于进一步形成稳定的微生物生态系统。采用非度量多维尺度分析法（NMDS）对样品的微生物群落组成进行排序，进一步说明了菌剂的添加有利于细菌种群向原始生态系统恢复。综上所述，本研究分离得到一株高浓度苯酚耐受性和高降解效率的真菌菌株QWD1并制备了稳定性高、活性高、应用环境广泛的固定化降酚菌剂，在含酚废水生物强化处理方面极具应用潜力。6.2创新点（1）本研究从处理造纸厂废水活性污泥中分离筛选出的真菌QWD1（Magnusiomycessp.）目前尚未有对其在含酚废水处理中应用的报道，且相较于现在报道的一些降酚菌株，QWD1更能承受较高的有机负荷且降解效率高。（2）本研究以谷糠为载体制备的降酚强化菌剂在保存过程中pH稳定，单位有效活菌数高且投加后降解苯酚效果好，保存时间可达到90d甚至更长。将制备的菌剂投加到活性污泥中，发现其对活性污泥处理高浓度含酚废水的效果有明显的作用。6.3展望由于受到研究时间的限制，某些研究还不够广泛和深入，因此在今后还可以对其进行以下方面的探讨：（1）本实验仅利用单一菌株制备菌剂，在以后的研究中可以将混合菌剂以及复合菌剂的制备和应用作为一个研究方向，对比其与单一菌剂的投加效果。（3）本实验对QWD1降酚菌剂载体的选择和适宜保存温度进行了初步研究，证明了利用载体吸附法制备降酚菌剂的可行性，但关于添加保护剂以延长保存时间、优化菌剂配方以及菌剂在实际废水中的投加方式和时间等还有待进一步研究。（4）利用高通量测序技术可以分析得出活性污泥中的微生物群落，而关于其中微生物之间的相互关系仍是一个值得研究的课题。60n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用致谢时光荏苒，三年的研究生学习生涯即将结束，我感慨良多。在这里，我想要感谢在我生活和学习中给予我悉心指导以及无私帮助的人，正是有了他们我才能完成科研任务。在论文完成之际，我想向他们表达诚挚的谢意！首先，我要感谢我的导师张安龙教授，他是一位有着丰富实践能力的教授，在他的指导下，我的视野变得更加开阔，科研能力也有了很大提高。在科研过程中，他总是想尽各种办法为我们创造好的条件和设施，为我们的科研学习任务顺利完成打下基础。还要感谢我的二导，王雪青老师，她是一个非常亲切和蔼的老师，我的论文和实验很多部分都是在王老师的悉心指导下完成的，无论是论文的选题、实验的规划、论文的修改定稿，她都倾注了大量的心血。同时，她还组织负责我们课题组的各类事务，让我们凝聚成一个更紧密的大家庭。感谢我们课题组的罗清、王森、张波、侯银萍、王先宝、高俊玲老师，在每次开组会时给我的实验和研究工作提出各种具有建设性的意见，在我询问问题时给我耐心的指导，正是有了这个大家庭，才让我更快的成长和进步。感谢周丹妮师姐，她积极乐观的心态和努力生活的态度总是影响着我，在我学习遇到瓶颈的时候，是她在身边安慰我，鼓励我，让我更快的调整好心态。同时，她是一个管理和学习能力很强的人，带领我们在研究生期间参加各种比赛，统筹规划。在她身上，我学到了很多东西。感谢在实验过程中给我最多指导的董婷婷师姐，感谢她总是在我遇到问题的第一时间为我答疑解惑并出谋划策，也正是跟随着她一路学习，我才更快的掌握了很多知识和技能。感谢在生活学习中给我提供很多帮助的谢飞师弟和赵呈馨师弟，在我觉得学习生活枯燥无味的时候，给我的带来欢笑，在我的科研探索之路上，给与我很多灵感和帮助。感谢我的爸爸妈妈，他们在我的生活中给了我无尽的鼓励和关怀，他们是我求学路上的后备军，是我低谷时期的指路灯，她们不仅为给了我无微不至的关心和照顾，更给了我信心和勇气去面对各种困难，一路勇往直前。感谢我的母校，给了我良好的生活和学习环境，总是尽力给我们提供更优越舒适的环境，看着学校一天天变得更美更好，我也发自内心的觉得自豪。最后感谢各位审稿和评审老师，能在百忙之中抽出时间评阅我的论文以及参与我的答辩!61n陕西科技大学硕士学位论文参考文献[1]AgarrySE，SolomonBO．KineticsofbatchmicrobialdegradationofphenolsbyindigenousPseudomonasfluorescence[J]．InternationalJournalofEnvironmentalScience&Technology，2008，5（2）：223-232．[2]KavithaV，PalaniveluK．TheroleofferrousioninFentonandphoto-Fentonprocessesforthedegradationofphenol[J]．Chemosphere，2004，55（9）：1235-1243．[3]PaisioCE，AgostiniE，GonzálezPS，etal．LethalandteratogeniceffectsofphenolonBufoarenarumembryos[J]．JournalofHazardousMaterials，2009，167（1-3）：64-68．[4]PaisioCE，TalanoMA，GonzÃlezPS，etal．Characterizationofaphenol-degradingbacteriumisolatedfromanindustrialeffluentanditspotentialapplicationforbioremediation[J]．EnvironmentalTechnology，2013，34（1-4）：485-493．[5]TomeiMC，AnnesiniMC，DaugulisAJ．2，4-Dichlorophenolremovalinasolid–liquidtwophasepartitioningbioreactor（TPPB）：kineticsofabsorption，desorptionandbiodegradation[J]．NewBiotechnology，2012，30（1）：44-50．[6]KrastanovA，AlexievaZ，YemendzhievH．Microbialdegradationofphenolandphenolicderivatives[J]．EngineeringinLifeSciences，2013，13（1）：76–87．[7]高超，王启山．吸附法处理含酚废水的研究进展[J]．水处理技术，2011，37（1）：1-4．[8]江燕斌，钱宇．炼油碱渣废水处理——萃取脱酚实验研究[J]．化学工程，2000，28（5）：39-41．[9]杨得岭，宁朋歌，曹宏斌，等．伯胺N_（1923）络合萃取苯酚[J]．过程工程学报，2012，12（4）：569-575．[10]庞洁，孟洪，陆颖舟，等．异相膜电渗析法处理苯酚废水[J]．北京化工大学学报（自然科学版），2010，37（5）：15-20．[11]汪丛，李林波，毕强，等．乳液液膜法处理高浓度兰炭含酚废水[J]．环境化学，2014，33（3）：494-499．[12]白雪．含酚废水工业处理方法[J]．山东化工，2017，46（10）：179-181．[13]ChristoskovaS，StoyanovaM．Degradationofphenolicwastewatersover62n高效苯酚降解真菌的分离筛选及其作为强化菌剂在废水处理中的应用Ni-oxide[J]．WaterResearch，2001，35（8）：2073-2077．[14]荆肇乾，胡静，虞婷．臭氧氧化与生物法联合处理苯酚和苯胺废水研究[J]．工业水处理．2015，35（12）：61-63．[15]李红梅．苯酚厌氧降解菌的选育及其降酚特性[D]．天津：天津大学，2006．[16]徐建华，杨海锋．高级氧化技术降解含酚废水反应条件优化[J]．安徽农业科学，2016，44（36）：110-111．[17]王红娟，奚红霞．含酚废水处理技术的现状与开发前景[J]．工业水处理，2002，22（6）：6-9．[18]孟志国，王金生，付磊，等．湿式过氧化物氧化法处理苯酚丙酮废水研究[J]．西安建筑科技大学学报（自然科学版），2009，41（4）：571-574．[19]贾太轩，冯世宏，杜慧玲．含酚废水的氧化法处理[J]．天津化工，2005，19（2）：12-14．[20]孙秀君．超声波预处理含酚废水技术研究[J]．应用化工，2016，45（1）：190-191．[21]BasakB，BhuniaB，DuttaS，etal．Enhancedbiodegradationof4-chlorophenolbyCandidatropicalisPHB5viaoptimizationofphysicochemicalparametersusingTaguchiorthogonalarrayapproach[J]．InternationalBiodeterioration&Biodegradation，2013，78（3）：17-23．[22]ParkeD，RynneF，GlennA．RegulationofphenoliccatabolisminRhizobiumleguminosarumbiovartrifolii[J]．JournalofBacteriology，1991，173（17）：5546-5550．[23]DabrockB，KesselerM，AverhoffB，GottschalkG．IdentificationandcharacterizationofatransmissiblelinearplasmidfromRhodococcuserythropolisBD2thatencodesisopropylbenzeneandtrichloroethenecatabolism[J]．Applied&EnvironmentalMicrobiology，1994，60（3）：85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