高效苯酚降解菌剂复配及其对含酚废水处理系统的强化 195页

中国图书分类号：X172学校代码：10213 国际图书分类号：606密级：公开理学硕士学位论文高效苯酚降解菌剂复配及其对含酚废水处理系统的强化硕士研究生：聂玉冰导师：杨基先教授副导师：马放教授申请学位：理学硕士学科、专业：微生物学所在单位：市政环境工程学院答辩日期：2010年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学nClassifiedIndex：X172U.D.C.:606DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringCONSTRUCTIONOFEFFICIENT PHENOLDEGRADATIONMICROBIAL AGENTANDITSBIOAUGMENTATION OFPHENOLICWASTEWATERTREATMENTSYSYTEMCandidate：NieYubingSupervisor：Prof.YangJixianAssociatesupervisor：Prof.MaFangAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpecialty：MicrobiologyAffiliation：SchoolofMunici.&Envir.Eng.DateofDefence：June,2010Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnologyn哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要含酚废水的来源广泛、成分复杂，如医药废水、焦化废水、化工及印染废水等，废水中含有的高浓度酚类化合物会对微生物的生长产生抑制作用，从而增加生物处理的难度，成为现阶段国内外含酚废水处理技术领域亟待解决的一个难题。为解决苯酚对传统生物处理系统的抑制，本研究以模拟含酚废水为基质，在获得高效苯酚降解菌的基础上，人工构建了高效苯酚降解菌剂，并在不同条件下对其降解特性进行详细的分析，同时采用PCR-DGGE技术对经苯酚降解菌剂强化后的生物处理体系群落结构进行解析，阐明宏观功能变化与微观结构之间的内在联系，从而为含酚废水的生物强化处理提供一定的理论依据和技术支持。对脱酚菌TF1和TF2进行多相分类结果表明，菌株TF1为Alcaligenessp.，菌株TF2为Acinetobactersp.。两株菌的生理生化特性研究结果表明两株菌对苯酚都有较强的降解能力，且在生长条件发生变化的情况下，TF2对苯酚的降解能力始终高于TF1。通过正交试验确定TF1的最佳生长条件为：温度为25℃，pH为7，初始苯酚浓度100mg/L，摇床转速为140rpm，初始接菌量为10%；TF2的最佳生长条件为：温度25℃，pH为9，初始苯酚浓度为100mg/L，摇床转速为140rpm，起始菌量为2%。采用单菌株生态组合，复合构建的方式进行高效苯酚降解菌剂的构建，确定脱酚菌TF1和TF2最佳的复配比例为2.33:1。对强化菌剂的应用效果进行分析，结果表明无论温度及苯酚浓度是否发生变化，强化菌剂对苯酚及COD的处理效果都达到了最高水平。出水中有机物的种类已由未进行生物强化的68种减少到经过强化处理后的32种。经过生物强化处理后水样中长链烷烃的含量大幅度下降，同时苯系类、酯类和醛酮类物质几乎全部被去除，有机物的数量也减少了约50%左右。应用PCR-DGGE技术对生物处理体系的群落结构进行解析，在苯酚高效降解菌剂强化的体系中，当系统温度及污染物强度发生变化时，强化菌剂处理系统的微生物丰度都达到了最高水平。且与未经过生物菌剂处理系统相比，其微生物种类构成也发生了较大变化。结合生物强化菌剂对苯酚及COD降解效果和出水中有机物的种类变化综合分析，表明生物强化作用对含酚废水处理效果十分显著。关键词：生物强化；苯酚降解；菌剂构建；群落结构；-I-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractThesourceofphenolicwastewaterisextensiveandthecompositionsarecomplicated,suchaspharmaceutical,coking,chemicalanddyingwastewatwer.Theexistenceofhighconcentrationofphenolicswillinhibitthegrowthofthemicroorganismandbringsmoredifficultyinbiologicaltreatment,whichhasbecomeadifficultproblemindomesticandinternationalwastewatertreatmentfieldandisurgenttobesolvedcurrently.Tosolvetheproblemofinhibitoryeffectofhighconcentrationofphenolicsontraditionalbiologicaltreatmentsystem,theobjectivesofthispaperaretoexploreofbioaugmentationtreatmentsystems,whicharecapableofdegradingphenolics,studyonthecharacteristicsoftreatmentsystemsunderdifferentconditionsandanalyzethecommunitystructureduringtreatmentprocessbymolecularbiologytechnology,suchasPCR-DGGE.Theexperimentalresultswillclarifytherelationshipbetweenthemicrostructureandmacrofunctionoftreatmentsystemandprovideatheoreticalandtechnicalsupportsforthebiologicaltreatmentofphenolichyper-salinewastewater.Alcaligenessp.TF1,Acinetobactersp.TF2couldutilizephenolassolecarbonsource,whichwasidentifiedonthebasisofphysiologicalandbiochemicaltestsandpolyphasic-taxonomytechnique.Studingonphysiological-biochemicalcharacteristicofTF1andTF2,bothofthemhavestrongabilityofphenoldegradation,TheabilityofphenoldegradationofTF2isalwayshigherthantheTF1’s,whateverChangesingrowthconditionsandcircumstances.TheoptimumculturalconditionsofTF1obtainedaccordingtothesinglefactorexperimentandtheorthogonalexperimentwas：25℃,pH7,Initialphenolconcentration100mg/L,rpm140,Initialinoculationwas10%;TheoptimumculturalconditionsofTF2was:25℃,pH9,Initialphenolconcentration100mg/L,rpm100,Initialinoculationwas2%.ThebestmixtureratioStrainsofTF1andTF2is2.33:1.Analyzeingtheeffectofbioaugmentationmicrobialinoculums,thedatashowthatregardlessofwhetherthetemperatureandphenolconcentrationchanges,bioaugmentationmicrobialinoculumsOnthetreatmenteffectofphenolandCODhaveachievedthehighestlevel.Thetypesoforganiccompoundsindrainingwaterhasbeenreducedto32speciesfrom68species.Longchainalkanesinthewatertreatingbythebioaugmentationmicrobialinoculumswassignificantdecline,benzene,esters,aldehydesandketoneswereremovedalmost,thenumberoforganiccompoundsalsoreducedbyabout50%.Analyzingthecommunitystructureduringtreatmentprocessbymolecularbiologytechnology,suchasPCR-DGGE,showsthatregardlessofwhethertemperatureand-II-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文phenolconcentrationchanges,bioaugmentationmicrobialinoculumssystemhasreachedthehighestabundanceleves.Comparedwiththosesystems,whichdid’ttreatbybioaugmentationmicrobialinoculums,themicrobialspeciescompositionhaschangedsignificantly.Comprehensiveanalysiswiththedegradationofphenol,CODandthetypesoforganicmatterindrainingwater,showtheeffectbybioaugmentationissignificant.Keywords:bioaugmentation;phenoldegradation;microbialinoculumsbuilding;communitystructure；-III-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文目录摘要........................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................II第1章绪论............................................................................................................................11.1课题背景........................................................................................................................11.2含酚废水处理研究进展...............................................................................................21.2.1含酚废水的污染现状及危害...............................................................................21.2.2含酚废水处理方法................................................................................................21.2.3含酚废水生物处理研究........................................................................................51.3生物强化技术研究现状.............................................................................................101.3.1生物强化机理研究现状......................................................................................111.4课题研究目的及主要内容.........................................................................................151.4.1课题来源...............................................................................................................151.4.2课题研究的目的及意义......................................................................................151.4.3研究的主要内容..................................................................................................16第2章试验材料与方法.....................................................................................................172.1试验材料及仪器..........................................................................................................172.1.1试验仪器...............................................................................................................172.1.2试验试剂...............................................................................................................182.1.3试验用培养基......................................................................................................182.1.4菌种来源...............................................................................................................192.2试验方法......................................................................................................................192.2.1微生物多项分类法..............................................................................................192.2.2微生物量测定方法..............................................................................................202.2.3水质分析方法......................................................................................................202.2.4GC-MS分析方法................................................................................................212.2.5灭菌方法...............................................................................................................212.2.6菌体驯化方法......................................................................................................212.2.7微生物群落解析方法..........................................................................................22第3章苯酚降解菌纯培养特性.........................................................................................25-IV-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1苯酚降解菌的多相分类研究.....................................................................................251.2.1菌体的形态学观察..............................................................................................251.2高效苯酚降解菌的降解特性研究............................................................................291.3.1高效苯酚降解菌苯酚降解能力的测定.............................................................291.3.2温度对高效苯酚降解菌苯酚降解性能的影响................................................301.3.3外加碳源对高效苯酚降解菌苯酚降解性能的影响........................................311.3.4苯酚降解过程中COD值的变化规律..............................................................321.3利用正交试验优化苯酚降解菌生长条件................................................................351.4.1正交试验优化苯酚降解菌生长条件.................................................................361.4.2TF1与TF2生长条件比较.................................................................................40本章小结........................................................................................................................40第4章含酚废水生物增强菌剂的构建途径及应用效果...............................................422.1高效苯酚降解菌剂的构建.........................................................................................432.1.1苯酚降解菌剂构建的方法.................................................................................432.2生物强化作用在含酚废水中的效能分析................................................................452.2.1相同温度及苯酚浓度下生物强化作用解析.........................................................452.2.2相同温度不同苯酚浓度下生物强化作用解析....................................................472.2.3不同温度下相同苯酚浓度生物强化作用解析....................................................492.2.4石化废水生物强化处理前后的有机物成分分析................................................51本章小结........................................................................................................................52第5章生物强化作用下微生物群落结构解析................................................................535.1功能微生物总DNA的提取......................................................................................535.1.1微生物的DNA提取...........................................................................................535.2微生物16SrDNA（V3区）的扩增.........................................................................555.3变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析........................................................................555.3.1DGGE图谱的细菌多样性统计分析..................................................................56本章小结........................................................................................................................59结论.....................................................................................................................................61参考文献................................................................................................................................63附录1......................................................................................................................................69附录2......................................................................................................................................70附录3......................................................................................................................................71附录4......................................................................................................................................73-V-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文攻读学位期间发表的学术论文及其他成果......................................................................75哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明......................................................................76哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书......................................................................76致谢.....................................................................................................................................77-VI-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第1章绪论1.1课题背景随着经济发展和人口增长，全球环境正急剧恶化，水环境恶化、温室效应、臭氧层破坏、热带雨林消失、和酸雨等全球环境问题以严重威胁人类自身的生存和发展，并已成为制约经济和社会发展的一大障碍。近年来，我国高速发展的经济形式令世界震撼。但是，生态环境也因此付出了巨大代价。我国约1/3的土地上都遭遇过酸雨的袭击，7大河中一半的水资源是完全不能应用的，而另有1/4的人口没有纯净的饮用水。1/3的城市人口生活在被污染的空气之中。城市中只有不到20%的垃圾是按照环保的方式处理。我国环境污染和生态恶化已到了岌岌可危的地步，并呈积重难返之势，而高速增长的经济、急剧增加的人口，都在为严峻的环境状况增加巨大的压力。中国的环境保护正处在一个重要的转折点和历史性关头。随着我国经济的高速增长，城市化水平的不断提高，水污染问题日趋严重。据统计[1]，2004年的废水排放总量为482.4亿m3，其中工业废水排放量占221.1亿m3，生活污水排放量为约261.3亿m3。化学需氧量总排放量为1339.2万m3，其中工业排放量占509.7万m3，生活排放量为829.5万m3；氨氮排放量为133.0万m3，其中工业排放量为42.2万m3，生活排放量为90.8万m3。据2002年我国行业废水排放情况统计，石油化工、黑色金属冶炼、造纸等三个行业的废水排放量为91.1亿m3，占全国工业废水排放总量的48％，其中，石化废水排放总量达33.7亿m3，占总废水排放量的17.8％。因此，水环境中污染物排放数量及处理难度在逐步加大，石化废水以其污染程度和污染物排放数量成为水环境污染治理中的一大公害。在废水处理中，生物技术以其成本低、效果好、无二次污染，成为污染治理的主要手段，但对于工业合成的一些异生化合物（Xenbiotics），在传统的生物处理系统中缺乏有效降解它们的微生物。因此，通过向生物处理系统中投加高效菌种的生物强化技术作为污染治理的一种有效手段，已成为近年来研究的热点[2][3]。在这样的大背景下，本文提出了应用生物强化技术构建苯酚高效降解菌剂对含酚石化废水的降解效能，及生物强化过程中废水系统微生物群落变化规律进行研究。-1-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1含酚废水处理研究进展1.2.1含酚废水的污染现状及危害含酚废水主要来源于煤气、炼油、焦化和以苯酚或酚醛为原料的制药、化工等生产过程，其来源广、数量多、危害大，是各我国水污染控制中列为重点解决的有毒有害废水之一。酚类化合物在工业生产中应用广泛，并随工业生产废水的排放进入水体，对水体造成严重污染。我国污水综合排放标准（GB8978-1996）规定的挥发酚的一级标准、二级标准和三级标准分别为0.5mg/L、2.0mg/L和5.0mg/L。含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。对含酚废水的排放有严格的规定:饮用水的最高挥发性酚的浓度为0.001mg/L，水源水体中含酚最高容许浓度为0.002mg/L。表1.3列出了各类废水中的酚含量[4]。表1-1工业废水中的含酚量工业污染源酚浓度(mg/L)工业污染源酚浓度(mg/L)苯酚生产12000-15000采矿4000-12000树脂生产10-35200炼焦脱酚前1500-5000塑料600-2000炼焦脱酚后10-100木材干馏560-5500焦和煤气30000-150000炼焦化工400-6700油漆和涂料200-400气化泥煤1200-10800玻璃纤维生产40-400含酚废水中所说的酚是一些有毒酚类化合物的总称。酚类化合物是一系列芳香族碳氢化合物的含氧衍生物，其芳烃中苯环上的氢原子被羟基取代，按苯环上的羟基数目可分为一元酚、二元酚、三元酚等，沸点在230℃以下的一元酚具有挥发性并能与水蒸共沸而挥发，也叫挥发酚，其余为不挥发酚。通常含酚废水中以苯酚和甲酚的含量最高。目前环境检测通常以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。酚类化合物是一种原型质毒物对一切生物个体都有毒害作用。它们可通过多种途径进入环境，造成对水体、大气和土壤的严重污染，可对人体造成严重的损害，产生三至（癌变、突变和畸变）效应。由此可见，含酚废水的治理是一个十分值得重视的问题。尽管近年来人们已经认识到了问题的严重性，但这一问题仍呈上升的趋势。1.2.2含酚废水处理方法含酚废水的处理方法是随着对含酚废水危害性的认识和水处理技术的不断发展-2-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文而逐渐发展起来的，目前己有很多关于含酚废水的处理方法，而且随着技术的不断发展，各种处理方法之间还进行着相互的渗透组合，以达到更好的治理目的。含酚废水的处理方法综合起来主要分为三大类:物理法、化学法、生物法。1.1物理法[5]萃取法溶剂萃取法是利用难溶于水的萃取剂与废水接触，使废水中的酚类物质与萃取剂进行物理或化学的结合，实现酚类物质的相转移。吸附法吸附法主要是利用一些多孔吸附剂的较高的比表面积表现出的较强的吸附性能将废水中的酚类物质吸附，吸附剂吸附饱和后可再利用碱液、蒸汽或有机溶剂进行解吸脱附，酚类物质也可以回收利用。气提及蒸馏气提法是根据挥发性酚类化合物与水蒸气形成共沸化合物，利用酚在两相中的浓度差将酚水分离，从而使水得以净化。离子交换法由于苯酚是酸性化合物，因此可以用离子交换技术将其从废水中除去，一般含量为100-600mg/L的含酚废水均可经济地用阴离子交换树脂进行回收，并同时达到净化水质的目的。盐析法含酚废水可用硫酸钠以盐析作用将酚析出,对于含有2%-3%酚的废水，可用氯化钠以盐析的形式将酚析出。通过酚的析出，降低了水中的酚类物质含量，从而降低了含酚废水的危害。1.2化学法化学法处理含酚废水主要有化学氧化法和化学沉淀法[6][7]。化学氧化法该法主要是利用一些氧化剂的强氧化性将水中的酚类物质氧化去除。常用的氧化法有臭氧氧化法、氯系氧化法、空气氧化法、光催化氧化法、电解法等。此种方法工艺简单，不会产生二次污染，但不能回收酚，氧化剂不能重复利用。化学沉淀法该法主要是将酚类物质形成溶解度更小的磺酸酯、碳酸酯或磷酸酯等除去。此法中也包括酚醛缩合法，即在适当的酸碱性条件下，调整酚醛摩尔比，将废水中的酚缩聚成低分子热塑性或热固性树脂。此法一般适合于处理高浓度的含酚废水。1.3生物法酚类化合物虽然是一种生物毒性物质，但是很多微生物（包括好氧的和厌氧的）可以利用酚类作为生长碳源，因此为含酚废水的生物处理法提供了理论依据。生物法主要是利用微生物的新陈代谢作用，降解水中的酚类化合物，将其转化为无机物以实现无害化的目的。生物法具有应用范围广、处理能力大、设备简-3-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文单和比较经济等特点，是目前应用最广的废水处理技术，也是我国含酚废水无害化处理的主要方法。但是，生物处理法受废水PH值及酚含量等因素影响很大，操作条件要求较严格，且酚类物质不能回收。活性污泥法作为传统的废水生物处理技术，活性污泥法在水污染治理中发挥了极其重要的作用，目前已成为炼钢、焦化、煤气等诸多行业工业废水的主要治理方法。活性污泥法虽然具有运行维护简单、处理量大等优点，但其占地面积大，对一些小型的企业不太适用。特别是在焦化废水的处理中，由于焦化废水水质成分复杂，含有许多有毒物质，对微生物的生长具有抑制作用，易使活性污泥中的某些微生物丧失活性。目前，传统活性污泥法处理焦化废水普遍存在的问题是毒物承受能力低、曝气池溶剂负荷低、污泥产生量大、对高浓度的含酚废水处理效果不理想等问题。为提高活性污泥法的处理效率，改良工艺是近年来活性污泥技术发展的重要方向之一[8]。生物膜法该法利用生物滤池中附着在过滤介质表面上的微生物粘膜来处理废水[9]。当废水流过生物滤池时，吸附在过滤介质上的生物膜吸附废水中的酚类物质，在有氧条件下使酚类物质分解，使废水得到净化。它比活性污泥法具有生物密度大、耐污力强、动力消耗低、运转管理容易等优点,在石油化工、印染、医药废水等处理中有广泛的应用。生物接触氧化法该法采用人工曝气、填料完全浸没在废水中的生物处理手段，使微生物以固定生物膜的形式吸附于填料表面，与废水相接触对酚类物质进行降解和转化，兼有活性污泥法和生物膜法的优点。自20世纪80年代以来,在我国得到广泛的应用。此工艺的改良以及与其他工艺相结合是近年来的发展方向之一。酶制剂处理法酶是具有催化活性高、专一性强等特性的生物催化剂，自20世纪80年代开始将酶制剂技术应用于废水处理中。据报道用于处理含酚废水的酶有酪氨酸酶[10]、辣根过氧化物酶[11]等。由于水溶性酶易失活、稳定性较差，并且只能使用一次，处理成本高。为了提高酶活性、稳定性以及降低成本，发展酶的固定化技术是该领域的主要研究方向。固定化细胞技术由于传统方法存在着微生物易流失、细胞对毒物的耐受能力低等问题，近十几年来，国内外开展了将固定化细胞技术用于废水处理的探索研究。固定化细胞就是将细胞自然固定或定位于一个有限空间，保持其固有的催 化活性，并可以重复使用[12]，与传统废水处理方法相比，单位体积内的微生物浓度能大大提高，具有处理效率高、适应能力强、剩余污泥量少、固液分离效果好 等优点。目前常用的固定方法有：吸附法、包埋法、交联法、无载体固定化法。-4-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文生物强化技术生物强化技术产生于20世纪70年代中期，就是为了提高废水处理系统的处理能力，而向该系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因工程技术产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质的方法[13]。投入的菌种与底物之间的作用主要包括直接作用和共代谢作用。由于它能在不增加现有的水处理设备的前提下，提高其水处理的范围和能力，因此近年来在现代废水治理中的应用日益受到重视。1.1含酚废水生物处理研究（1）苯酚降解的微生物资源及其研究现状早在1908年，Stormer等人就从土壤中分离到能够降解苯酚、对甲酚等化合物的菌株。1911年，Fowler等人从污水中分离到能够降解苯酚的菌株，该菌株能在无机盐培养基中以苯酚（100mg/L）为碳源进行生长。1928年，Gray等人从土壤中分离到多株能够降解苯酚、甲基酚、萘酚等化合物的微生物，并用于土壤的生物修复[14]。此后的几十年，研究者们一直致力于分离筛选大量的高效降解酚类化合物的微生物资源，深入研究其降解特性，为进一步开展深入的研究奠定基础。（2）含酚废水生物处理研究历程20世纪60年代以前，研究者们主要进行降解酚类化合物微生物资源的筛选以及降解特性的研究。1934年，Henry和Smyth发现S.aureus在培养过程中培养条件的任何微小的变化，培养时间相差2-4h或者培养温度相差1℃都能影响其降解活性[15]。因此，应该准确的掌握微生物的培养条件以获得最佳的降解效果。1947年，Evans从土壤中发现了能够降解苯酚和苯甲酸类化合物的微生物。1953年，Berger和Wyss通过在培养基中逐渐增加苯酚浓度的方法驯化培养出一株能够降解0.3%的苯酚的菌株，鉴定为Micrococcuspyogeiesvar.aureus。发现该菌株在含苯酚的培养基中降解苯酚的效果明显好于自然界存在未经驯化野生菌株，但是在混合基质条件下的野生菌的竞争能力更强[16]。1955年，Hamdy等人分离到一株能够降解苯酚的菌株，发现温度在22-54℃、pH5.5-8.0的条件下均能生长。通过形态观察和生理生化特性分析确定该菌株属于假单胞菌（Pseudomonas），命名为PseudomonasX54。在降解苯酚过程中发现有黄色中间产物生成，并且很快消失，但是对该中间产物没有进一步的分析[17]。1964年，Henry等人[18]从土壤、河水和底泥中分离到多株能够在无机盐培养基中以特定酚类化合物为唯一碳源进行生长的菌株。其中假单胞菌（Pseudomonas）的降解能力最强。利用以苯酚为唯一碳源培养的菌株对104种酚类化合物进行降解-5-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文试验，发现对65种酚类物质具有明显的氧化活性。说明酚类物质的结构与可降解性之间存在明显的相互作用关系。一般二元酚能够被氧化而三元酚不能被氧化；甲基酚和二甲基酚能够被氧化；间甲基苯甲酸能够被利用而邻（对）位甲基苯甲酸不能被利用；硝基和氯取代基的酚类化合物以及苯系物不易被降解。1967年，Neujahr等人筛选出两株能够利用酚、甲酚、甲氧基衍生物作为生长基质的菌体，并经过鉴定为Trichosporoncutaneum及Candidatropicalis。20世纪70年代，研究者开始了酚类化合物的生物降解机理和代谢途径的研究，对降解过程中关键酶的酶学性质进行了深入的探讨。1969年，Feist等人[19]发现邻苯二酚或甲基邻苯二酚是Pseudomonasputida降解苯酚、苯甲酸和甲酚的中间产物。菌株降解苯甲酸过程中，邻苯二酚是邻位开环降解；菌株降解苯酚和甲酚过程中，邻苯二酚是间位开环降解。1970年，Neujahr等人对从土壤中分离的酚类降解菌Trichosporoncutaneum和Candidatropicalis[20][21]的降解途径进行分析，检测到催化苯酚降解过程第一步和第二步反应的两个关键酶，苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性。1971年，Sala-Trepat等人通过研究TOL质粒pWW0上的xyl基因，揭示了间位裂解途径[22]。间位裂解途径由邻苯二酚2,3-双加氧酶起始反应，加氧催化开环生成2-羟基粘糠酸半醛，再经2-羟基粘糠酸脱氢酶等酶的作用产生三羧酸循环的中间代谢物丙酮酸和乙醛，进入TCA。假单胞菌主要通过这个途径降解。1973年，邻位裂解途径得到了报道[23]，邻位裂解途径由邻苯二酚1,2-双加氧酶起始反应，加氧催化开环生成cis-粘糠酸，再经多步反应生成琥珀酸和乙酰CoA，最后形成TCA循环的中间物进入TCA循环。醋酸不动杆菌等主要通过这个途径降解。1973年，Neujahr等人又从高效降酚菌Trichosporoncutaneum中分离并纯化了苯酚羟化酶，并对其特性进行了研究。发现该酶是单链黄素蛋白-苯酚单加氧酶，主要负责将苯酚转化为邻苯二酚。以后从假单胞菌PKO1(Pseudomdnaspickettii)[24]、BacillusstearmophilusBR219[25]等菌中也分离到此类黄素-单加氧酶。-6-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文说明：1.苯酚；2.邻苯二酚；3.2-羟基粘康酸半醛；4.2-羟基粘酸；5.4-氧代二乙酸（α-酮基二乙酸）；6.2-氧代戊乙酸；7.乙二酸；8.内酯；9.β-酮基乙二酸；HO：苯酚羟化酶；C23O;邻苯二酚2，3加氧酶；C12O：邻苯二酚1，2加氧酶；HMSD：2－羟基粘康酸羟化酶；4-OT：4氧化丁烯酸变位酶；TE：顺粘康酸内酯酶图1-1微生物降解苯酚的代谢途径1976年，Munnecke在研究4-硝基酚降解过程时检测到有对苯二酚的生成，所以推断4-硝基酚经由对苯二酚途径代谢[26]，此后，该途径又在多种细菌中被发现，包括研究最为深入的Moraxella[27]、ArthrobacteraurescensTW[28]等。1976年，Patel等人从AcinetobactercalcoacticusADP-96中提取并纯化了邻苯二酚1,2-双加氧酶。该酶能够催化邻苯二酚、4-甲基邻苯二酚、3-甲基邻苯二酚和异丙基邻苯二酚等。发现重金属、巯基抑制剂和底物的类似物等会影响酶活性。通过Bio-Gel琼脂糖过滤和和沉降平衡分析该酶分子量分别为85000和81000[29]。1979年，Gaal和Heujahr发现Trichosporoncutaneum降解苯酚和间苯二酚时都是邻位开环降解的。在此过程中检测到了苯酚羟化酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶和粘糠酸内酯酶的活性。对3个酶进行了纯化后发现，粘糠酸内酯酶的活性增加了50倍[30]。80年代，随着分子生物学的发展，酶的研究进入了分子阶段，揭示了微生物降解酚类化合物的代谢途径中编码各类酶所需要的基因及其表达系统，如苯酚羟化酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶等。1981年，Franklin[31]等将TOL质粒上的xylE基因克隆到pKT230载体,该载体带有Sm和Km抗性基因的两个强启动子，比较了分别插入这两个启动子区域的-7-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文xylE的表达情况。结果发现，TOL质粒表面的酶活为90u/g,而把其中的xylE基因克隆至pKT230载体，发现在Sm抗性基因启动子控制下，酶活约为900u/g,在Km抗性基因启动子控制下约为7000u/g,说明了虽然两个都是强启动子,但Km抗性基因启动子比Sm抗性基因活力约强8倍。1985年，Pillis和Davis分离了一株假单胞菌psychrotrophicPseudomonasputida，该菌株能在好氧、pH7.0、温度1-35℃范围内降解多种酚类化合物[32]。1986年，Ellen[33]等人从Acinetobactercalcoaceticus中克隆了编码邻苯二酚1,2-双加氧酶（catA）的6.7kb的基因片段，将该基因在大肠杆菌中表达，并且表达产物的酶学性质。检测大肠杆菌中酶活性比野生菌株增加了2倍。该邻苯二酚1,2-双加氧基因是首次被克隆的由染色体编码的结构基因。1985年，Ghosal等人克隆了由质粒编码的4.2kb邻苯二酚1,2-双加氧酶基因[34]。比较两段基因发现它们有共同的祖先，表明了基因进化的多样性。1989年，Harayama等人发现Pseudomonasputidamt-2中的邻苯二酚2,3-双加氧酶位于TOL质粒上，由xylE基因编码。xylE基因有921个碱基对，基因中G+C%较高，编码邻苯二酚2,3-双加氧酶由4个相同亚基构成，每个亚基的相对分子量为35KDa，同时酶蛋白中还有亚铁成分[35]。1989年，Shingler等人从Pseudomonassp.CF600中克隆了多组分苯酚羟化酶基因，与以往报道的苯酚羟化酶多是单一组分的黄素蛋白有所不同。该酶基因是一个大质粒编码的6个多肽组成的寡聚蛋白，通过缺失定位、核酸序列分析和多肽分析发现，假单胞菌CF600中15个基因以dmpKLMNOPQBCDEFGF顺序位于同一个操纵元上，DmpKLMNOP是编码假单胞菌CF600多组分的苯酚羟化酶[36]。1990年,Jerome等人从PseudomonaspickettiiPKO1中克隆了大小为26kb的苯酚水解酶基因片段，并通过质粒载体pRO1727成功把该基因在Pseudomonasaeruginosa中表达，该酶分子量约为80KDa，能降解苯酚、甲酚和甲基儿茶酚等多种芳香化合物[37]。到了90年代，随着工业的飞速发展，使得进入到环境中的废水的组成成分日益复杂，高温、低温、偏酸、偏碱、高盐等环境条件对生物处理系统提出了挑战。研究者们针对复杂条件下含酚废水的生物降解进行了大量的研究。1994年，Quentmeier等人[38]将编码苯酚降解的质粒成功转移到嗜酸的细菌Acidophiliumcryptum中，通常该菌属的菌株能在pH2-3条件下生长，对新构建的菌株进行分析发现，发现其能够高效降解2.5M的苯酚。1996年，Mutzel等人[39]发现嗜热芽胞杆菌Bacillussp.能在55-75℃范围内完全降解5mM的苯酚，但是浓度大于10mM就会受到抑制。该菌株还能在高温条件下-8-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文降解1mM的甲酚(3种同分异构体)，但是不能以甲苯等为唯一碳源、氮源进行生长。1997年，Hinteregger等人[40]在鼓泡塔反应器中用盐单胞菌Halomonassp.处理高盐含酚废水，该菌株在1-14%NaCl条件下13h即可完全降解0.1g/L苯酚。1999年，Kanekar等人[41]在湖底泥中筛选了14株菌，它们能在pH10.0的条件下降解500mg/L苯酚。其中四株菌（Arthrobactersp.,Bacilluscereus,CitrobacterfreundiiandMicrococcusagilis）用于处理实际含酚废水时（废水pH10.0、苯酚浓度370-660mg/L），48h即可完全降解苯酚，COD去除率为11-56%。2000年，Onysko等人[42]研究了温度对psychrotrophicPseudomonasputida生长和降解苯酚的影响，在最佳温度条件下，建立了菌株生长及苯酚降解动力学模型。根据模型确定了菌株最大比生长速率（µmax）和底物饱和常数（Ks）均随温度增加而增加，而在低温条件下底物抑制常数（Ki）明显增加。2000年以后，主要对高浓度苯酚或混合酚废水的生物降解开展了研究，同时利用分子生物学手段对生物处理系统微观结构变化进行了大量的研究。2000年，Andrew等人[43]研究了生物系统处理工业含酚废水的过程，基本确定了系统内微生物群落的组成以及动态变化。DGGE分析表明，不同处理系统微生物群落组成发生了明显变化，而且废水中污染物的种类对群落的组成影响较大。FISH分析发现在大部分处理系统中都有Cytophaga-Flavobacteriu菌株的存在，同时在平板涂布分离过程中也分离到了Cytophaga-Flavobacterium菌属菌株，因此，推断Cytophaga-Flavobacterium在整个生物处理过程中起到重要的作用。2004年，Héctor等人[44]研究了好氧SBR对不同组成成分废水的处理效果以及群落动态变化。结果表明，系统启动后，在加入苯酚的1号反应器中初始降解效率较高但不能长期稳定，平均速率为0.093Lmg-1day-1；而加入苯酚和三氯乙烯的2号反应器中初始降解速率有所降低，但是整个过程运行效果比较稳定，降解速率保持在0.044Lmg-1day-1。T-RFLP分析表明，2号反应器中初始100天内群落发生明显变化，此后群落组成保持稳定；而1号反应器中群落发生周期性变化。系统内微生物群落的变化很好的解释了系统宏观运行效果的变化。2005年，Stephen等人[45]分别在两个反应器中接种活性污泥（R1）和好氧颗粒污泥（R2）处理苯酚废水。R1系统4天后不能完全去除苯酚，而R2系统初始去除苯酚较慢，但是从第3天开始能稳定去除苯酚。16SrRNA指纹分析表明，R1系统从第0天至第3天群落多样性减少导致去除效果下降；而R2系统群落结构有所变化但是多样性没有减少，所以系统去除效果稳定。因此，推断在污水处理过程中好氧颗粒污泥比活性污泥更有应用价值。-9-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文2005年，Arutchelvan等人[46]从含酚工业废水中分离到两株高效降解苯酚的菌株，分别为Pseudomonascepacia和Bacillusbrevis，它们能够在144h小时内降解2000mg/L和1750mg/L苯酚。并且两株菌能够处理高浓度的含有硫化物和氰化物的含酚废水。Bacillusbrevis比Pseudomonascepacia的处理效率更高，因此在高浓度含酚废水的处理中有很大的应用潜力。2006年，Tsai和Juang分别研究了菌株PseudomonasputidaCCRC14365对苯酚、水杨酸、苯酚和水杨酸混合液的降解情况。研究结果表明，单一底物条件下，菌株对苯酚的最大比降解速率（µmax=0.245h-1）大于水杨酸（0.137h-1）。菌株降解水杨酸时，少量苯酚的存在能够促进水杨酸的降解，相反，少量水杨酸的存在即可明显延迟苯酚的降解[47]。2007年，Bai等人[48]研究了菌株Alcaligenesfaecalis处理苯酚和间甲酚的混合废水时底物之间的相互作用。结果表明，该菌株能够以苯酚或间甲酚为唯一碳源生长，但是混合存在时存在明显的底物抑制现象。文中分别建立了在单一底物和混合底物条件下菌株Alcaligenesfaecalis的生长和降解动力学模型。模型的各项参数分析表明模型能很好的描述该菌株在单一或混合底物情况下苯酚和间甲酚的降解过程。2007年，Salmerόn-Alcocer等人[49]研究了混合菌群对含酚废水的降解效果以及此过程中优势菌的变化情况。结果表明，处理单一苯酚或氯酚化合物时混合菌的降解效果与各单菌差别不大，但是以苯酚为基础碳源和能源培养，加入单氯酚、二氯酚和三氯酚等化合物后，混合菌苯酚去除率为95-99.8%，COD去除率为85-1.1%，明显优于各单菌降解效果。ARDRA指纹分析显示系统内加入不同的氯酚类化合物后菌群的组成发生变化，但是优势菌Microbacterium.phyllosphaerae在各试验条件下均稳定存在。1.2.1生物强化技术研究现状生物强化技术即生物增强技术(Bioaugmentation)，是为了提高生物系统的处理能力，而向该系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因工程产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质的方法[50]。该项技术产生于本世纪70年代中期[51]，80年代以来在污染土壤[52][53]、海洋[54][55]和地下水[56][57]的修复，城市污水和工业废水的处理中[58][59]得到了广泛的研究和应用。一般的生物治理技术对于浓度较高、易于生物降解的废水去除效率高，但是，当废水中含有有毒物质时会对系统中的微生物产生毒害作用。用一般生物方法治理，降解速率较慢，而微生物需要一段较长的时间来适应，同时在外界环境-10-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文条件较苛刻，如温度较低时，微生物的代谢活性将显著降低，而生物强化技术恰好弥补了这些不足，投加优势菌种可迅速有效降解目标污染物[60]。近年来，国内外研究人员展开了大量研究，把这项技术用于工业废水、地表水、地下水中难降解的有毒有害物质的治理，且用于提高现有的污水处理系统中。目前实施生物强化技术有如下三条途径：（1）投加有效降解污染物的微生物[61]；（2）优化现有处理系统的营养供给、添加基质(底物)类似物来刺激微生物生长或提高其活力[62]；(3)投加遗传工程菌(GEM)[63]。生物强化技术应用最为普遍的方式是直接投加对目标污染物具有特效降解能力的微生物，这种特效微生物经过筛选、培养、驯化之后，投入到该废水中以目标污染物为唯一碳源和能源。废水中的微生物可以附着在载体上，形成高效生物膜，也可以以游离的状态存在。现就国内外生物强化技术在石化工业废水处理中的研究进展作进一步综述。1.1生物强化机理研究现状生物强化所投加的微生物可以来源于原系统，经过筛选、驯化、富集、培育之后投加，也可以是系统之外的外源微生物，比如从自然界富含微生物的土壤中筛选的优势菌种或通过基因工程产生的高效菌种[64][65]。通常认为，微生物降解污染物的途径有两种[66]：一是矿化作用，即有机污染物在一种或多种微生物作用下彻底分解为CO2、H2O、简单的无机化合物的过程。矿化作用是彻底的生物降解过程，可以从根本上清除有毒物质的环境污染。自然界中原本就存在的物质大多都能找到其相应的降解菌。微生物在降解污染物的同时可以获取生长所需的能源、碳源、氮源、磷源、硫源等。矿化作用过程包括氧化、还原、脱水、水解、脱氨基、脱羧基、脱卤、裂解等等生化反应过程，其实质就是酶促反应过程。二是共代谢作用，即一些难降解污染物不能直接作为碳源或能源被微生物利用，但是，当有其他可利用的碳源或能源物质（称为第一基质）存在时，难降解污染物（称为第二基质或共代谢基质）才能被利用，这种代谢过程称为共代谢作用。在共代谢过程中，第二基质的降解不能为微生物生长提供能量和碳源，它的降解只是一种附带的作用，而且这种降解往往不彻底，生成的中间产物需要依赖其他微生物进一步代谢。由于近些年来工农业的发展，许多新的物质被制造出来，如DDT等杀虫剂、甲基磷等农药，以及许多用于生产生活方面的石油化工产品，这些环境异生物质被排放到环境中后，自然界还没有来得及进化出降解它们-11-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文的专门的微生物，因此这些污染物在环境中代谢极为缓慢，被称为持久性有机污染物(POPs)，而且，它们的代谢通常是通过共代谢实现的，共代谢作用主要是使难降解有机物得到修饰或转化，而非彻底分解，须借助其他微生物的协同作用来使其进一步分解矿化。共代谢是一种重要的污染物降解方式，据报道，环境中多达90%的微生物是通过共代谢作用来降解污染物的。从污染物的生物降解途径来看，生物强化作用的机理可从以下两方面进行阐述：（1）高效菌株直接降解目标污染物；（2）共代谢作用。1.1高效降解菌直接作用高效菌直接作用是指通过驯化、筛选、诱变、基因重组等技术得到1株以目标降解物质为主要碳源和能源的微生物，向处理系统中投入一定量的该菌种，就能增强对目标污染物的去除效果[67]。由于微生物形体微小、结构简单、进化地位低，在自然界中微生物几乎无处不在，它们是整个生态系统的分解者。微生物具有比表面积大、繁殖速率快、易变异等特点，因此从理论上讲，给予足够长的时间，适宜的生存环境，任何一种污染物都可以进化出其相应的降解菌。然而由于污染物的种类和数量激增，相比之下，自然界的进化速度显得很慢，因此，环境微生物工作者为了清除污染，便用各种方法来加快微生物的进化过程。微生物自身的特点和功能是生物强化技术的理论根基。高效降解菌投加到生物处理系统之后，需满足以下条件方能产生较好的生物强化效果：1、投加后菌体具有较高活性；2、菌体可快速降解目标污染物；3、在系统中能够竞争生存，并维持一定的数量。因此，在这项技术具体实施过程中需要考虑如下问题：首先，目标污染物的浓度往往比实际处理构筑物中的浓度高许多。实际污染环境中，许多污染物的浓度对于降解菌来说是贫营养环境，因此，需要考虑微生物投加之后是否能够快速适应并降解低浓度的底物。其次，投加后的微生物面临的是一个复杂的生态环境，既有微生物种群之间的竞争，也有被原生动物捕食的可能。因此，若想达到良好的生物强化效果，投加的微生物必须在处理构筑物中保持一定的代谢活力，维持一定的数量。另外，废水处理构筑物中往往同时含有多种化合物，有的可能对投加的微生物有毒害作用，有的可能会被投加的微生物优先利用而影响目标化合物的降解。因此，需要对废水水质做深入细致地分析，其中各种主要成分的可生化性、代谢途径等要考查清楚。高效降解菌直接生物强化技术的研究和应用主要包括以下几个方面：高效降解菌的分离、筛选、驯化技术；诱变育种技术；生物固定化技术；工程菌的构建与应用；投菌方式及生物强化工艺条件的研究。-12-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1共代谢作用投加共代谢基质或辅助营养物质是实现生物强化技术的途径之一，这种方法的理论基础就是共代谢作用。对于一些有毒有害物质，微生物不能将其作为碳源和能源生长，但在其他基质存在下能够改变这种有害物的化学结构并使其得到降解。如20世纪60年代即发现一株假单胞菌不能单独利用三氯乙酸生长，但在一氯乙酸存在时可以使三氯乙酸脱氯。在甲烷、芳香烃、氨、异戊二烯和丙烯为主要基质生长的一些菌可以产生一种氧化酶，这种酶可以共代谢三氯乙烯(TCE)[68]。共代谢作用可以提高微生物对难降解物质的降解效率。共代谢作用主要有3种类型：(1)靠降解其他有机物提供能源，即当一级基质存在时，一级基质的代谢能够提供足够的碳源和能源供微生物生长，且能诱导产生相应的降解酶来降解二级基质。例如直肠梭菌（Clostridiumrectum）需有蛋白胨类物质存在时才降解丙体666。这也是添加能源类营养物质能促进生物强化作用的原因。Gregory等人[69]用Fe(0)去处理高度氯化的脂肪族碳氢化合物，在Fe(0)和浓缩的甲烷菌以及甲烷菌的纯培养基中联合培养时，四氯化碳(CT)和氯仿(CF)的降解速度得到提高。焦化废水是典型的难降解废水，其成分复杂，含大量多环芳烃和杂环类化合物等难降解有机物，采用常规活性污泥法处理，出水效果不好，COD值较高。Grave等[70]发现，漂白厂的废水对产甲烷菌有抑制作用，但是，当用甲醇或乙醇作一级基质时可以提高对废水中难生化有机卤化物的去除率。(2)靠其他微生物协同作用，如农药二嗪农的嘧啶基环，需要链霉菌和节杆菌共同作用才能降解，两菌各自单独存在时则不起作用。有些污染物的降解并不导致微生物的生长和能量的产生。有研究证明，在用苯甲酸单独培养普通的脱硫弧菌属和铜绿假单胞菌属时，二者均不能利用苯甲酸，但是，在含有苯甲酸和SO2的基质中共同培养时，苯甲酸即可被生物彻底降解，同时SO2被还原为H2S；生物膜或颗粒污泥的形成能有效地发挥微生物间的协同作用，提高生物降解率[71]。帖靖玺[72]从焦化废水中筛选、分离出3株高效降解且具有生长优势的菌株：CN1,CN2,DB3，将它们以不同方式组合投加高效混合菌株，或投加单菌株，研究COD去除率以及共代谢基质对提高COD去除率的作用。结果表明：共代谢基质能提高焦化废水COD去除率，且共代谢基质营养越丰富，提高作用越明显；单菌株最佳投加量为10%；菌株之间的协同作用能有效提高COD去除率，三种菌联用效果最佳，最终确定共代谢基质与优势菌联用为最佳生物强化技术。(3)通过其他物质诱导，产生降解目标底物的酶。如一种铜绿假单胞菌要经正庚烷诱导才产生羟化酶系，使链烷羟基化为相应的醇。投加基质类似物是针对代-13-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文谢酶的可诱导性而提出的，利用目标污染物的降解产物、前体作为酶的诱导物，提高酶活性。作为诱导物(基质类似物)应考虑：毒性相对较低、价格低廉且有多种用途，并在无富集基质(目标污染物)时，诱导物可维持富集培养物的生长。雷萍等[73]通过微生物呼吸耗氧量的测定和摇床模拟降解，试验了葡萄糖、尿素、葡萄糖复合物等营养物质、无机盐作为营养强化基质和不同废水浓度对焦化废水降解的影响。试验结果表明：葡萄糖、牛肉膏、Fe3+、Mg2+等能提高活性污泥对焦化废水降解的能力；葡萄糖和Fe3+配合，可使焦化废水降解率提高10%。通常情况下，共代谢只能使难降解有机物得到修饰和转化，而不能使其彻底降解，但共代谢产物并不会在自然界中长期积累，因为他们常为其他微生物种群所利用，并最终得到矿化。因此，深入研究污染物的生物代谢过程、自然界微生物种群在降解污染物过程中的协同作用和生态关系等，才能更好的利用共代谢机理提高生物强化作用。生物强化作用，顾名思义，强化了原来的生物处理系统中微生物的作用，这种强化的实现过程是在深入认识微生物降解污染物的途径和机理的基础上建立的。总的说来，生物强化技术的机理可以分为两方面：高效降解菌直接作用；共代谢作用。其所涵盖的内涵和相应的应用研究如表1-2所示：表1-2生物强化的机理与相应的应用机理研究应用研究原来的降解菌含有降解酶，但须诱导生成或高效降解菌的筛选分离技术，包括解除反馈抑制；而且降解菌与其他非功能菌杂培养基设计，选择性繁殖，诱变育种处，不利于其降解作用的发挥技术降解性质粒的兼容性，可平行传递等特点；降解酶都有其对应的遗传基因，但含此基因的降解菌在活性和适应性等方面不一定强于其他菌，可利用基因工程将降解基因导入优势生长[74]菌基因工程菌；原生质体融合；质粒育种[75]；基因重组等技术降解菌在群落中不占生长优势，须通过一定生物固定化技术，包括固定化细胞方法使其高浓度化和固定化酶技术在实际水处理过程中，菌剂会受到各种物投菌方式、投菌量、投菌点的研理、化学、生物等环境因素的影响究，结合水处理工艺参数的研究-14-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文续表1-2生物强化的机理与相应的应用机理研究应用研究以第一基质为碳源或能源时可同时降解第二基质；基质类似物可诱导降解酶的生成投加基质类似物或辅助营养物质研究各种污染物之间代谢过程的干扰或促进一种污染物的降解可能促进另一种污染物的作用降解，也可能抑制其降解，即二次生长现象污染物的代谢途径，酶学研究[76]通过某种代谢途径的切断或加强来改造降解过程微生物生态学研究，考察微生物之间的协同作用及抑制作用等多种菌生态复配技术，混合菌生物强化技术1.1课题研究目的及主要内容1.2.1课题来源本课题得到了黑龙江省科技计划项目（项目编号：CC05S301）“生物增强技术多尺度研究与应用”和黑龙江省重大攻关项目（项目编号：GB05C202-05）“寒冷地区污水处理回用技术与示范工程”的共同资助。1.2.2课题研究的目的及意义基于含酚废水较大的危害性及难降解性，生物强化技术在含酚废水治理中的应用日益引起人们的关注。大量的研究证明该方法可有效提高有毒有害物的去除效果，改善污泥性能，加快系统启动，强化系统稳定性、耐负荷冲击能力等。生物强化技术在不扩充现有的水处理设施的前提下，能有效地提高系统处理的范围和能力，为人们开拓了一条新思路。向废水处理系统中投加功能菌群的生物强化技术，通过提高系统中功能微生物的含量和活性，从而达到理想的酚类物质去除效果，是处理工业含酚废水的有效手段。生物强化技术关键在于生物处理，而生物处理的核心是能发挥降解作用的微生物，而在自然环境下，单纯依靠土著微生物对酚类物质的降解，很难达到理想的去处效果，且降解速度缓慢。通过向生物处理系统中投加高效菌种的生物强化技术已成为解决该问题的一种有效手段，也是近年来研究的热点。但是，到目前为止，由于缺乏对现有污水厂生化系统的生态学研究，生物强化技术的机理研究尚浅，限制了其应用和推广。-15-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文因此，本研究将对两株脱酚菌TF1、TF2的理化特性、苯酚降解机理及降解能力，菌剂的构建策略进行探讨。从微生物生理生态学的角度对其降解效能进行分析，并提出相应的生物学改进措施，从而为生物强化技术的应用提供理论指导和技术支持。构建能高效降解酚类污染物的功能菌群，并依靠分子生物学手段研究系统中优势种群演替规律及群落的动态变化规律，以求通过从多角度、多方位确定相应指标指导苯酚降解菌的投加方式和污水厂的调控。1.1研究的主要内容本研究将从降解有毒化合物、治理环境、保护生态系统、减少苯酚类物质对动植物和人类危害的角度出发，研究高效苯酚降解菌的降解特性，并在此基础上，构建高效苯酚降解菌剂，并对某石化废水厂的活性污泥系统进行生物强化，将强化前后的系统中污染物去除效果和运行稳定性进行解析，且对强化后的活性污泥进行PCR-DGGE分析，确定优势种群演替规律及群落的动态变化规律，从而为高效菌的实际工程应用提供理论基础和技术支撑，主要内容包括以下几个方面：(1)分别对两株脱酚菌TF1、TF2进行纯培养理化特性研究，主要包括①两株苯酚降解的菌种多项分类鉴定采用传统微生物学与分子生物学检测方法相结合的分类学手段，对脱酚菌TF1和TF2进行分类学特征研究②苯酚降解菌纯培养特性研究主要对脱酚菌TF1和TF2苯酚降解能力及COD降解能力进行测定；考察不同温度及在有其他外加碳源情况下，脱酚菌TF1和TF2苯酚降解性能及COD降解能力的变化；③通过正交试验确定苯酚降解菌的最佳生长条件。(2)含酚废水生物增强菌剂的构建途径及应用效果研究对脱酚菌TF1和TF2复配构建生物强化菌剂的策略及生物强化菌剂处理实际含酚废水的效能进行研究和分析。(3)生物强化作用后的微生物群落演替规律解析考察不同温度及苯酚初始含量条件下，微生物群落的演替规律。-16-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第2章试验材料与方法1.1试验材料及仪器1.2.1试验仪器试验所需仪器名称见表2-1和表2-2：表2-1微生物学、化学及环境工程试验仪器与设备仪器名称型号生产厂家全温振荡器HZQ—QX哈尔滨东联电子技术有限公司空气浴振荡器HZQ—C哈尔滨市东明医疗仪器厂双层全温度恒温振荡器ZHWY-2112B上海智城分析仪器制造有限公司生化培养箱（30℃）HPS—250哈尔滨市东明医疗仪器厂超净工作台SW-CJ标准型苏净集团苏州安泰空气技术公司垂直流超净工作台ZHJH-1109上海智诚分析仪器制造有限公司鼓风干燥箱DH-9053A型上海益恒试验仪器有限公司真空干燥箱DZF-6030B型上海-恒科学仪器有限公司电热恒温水浴锅DK-98-I型天津市泰斯特仪器有限公司分光光度计PC22上海棱光技术有限公司紫外分光光度计52上海棱光技术有限公司显微镜CX31奥林巴斯光学工业株式会社显微数码成像系统—奥林巴斯全自动压力蒸汽灭菌器8037-SGS超型长春百奥pH计DELTA320A梅特勒—托利多仪器有限公司底速大容量离心机DL—5型上海安亭科学仪器厂COD速测仪TL-1A承德市华通环保仪器厂冷藏柜MPR-311D（H）SANYO旋片式真空泵2XZ型浙江黄岩求精真空泵厂电子天平ALC-210。4北京赛多利斯天平有限公司涡旋振荡器HMS-350北京华尔博科技磁力加热搅拌器78-1江苏金坛新一桂仪器GC/MS色谱-质谱仪MP5890美国惠普公司生产固相萃取小柱—SupelcleanENVI-CarbSPE-17-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文表2-2分子生物学试验所涉及的试验仪器与设备仪器名称型号生产厂家高速台式离心机TGL—16G上海安亭科学仪器厂底速大容量离心机DL—5型上海安亭科学仪器厂立式透明门冷藏箱—青岛澳柯玛股份有限公司西门子智能冰箱KK25E西门子家用电器凝胶成像分析系统UVP美国BIO-RAD公司透射扫描仪ImageScannerⅢ欧洲GE超纯水系统USFPURELABGelmanDGGE电泳仪170-9106美国BIO-RAD电泳槽JY-SPAT北京君意东方电泳设备有限公司电泳仪ZY200北京君意东方电泳设备有限公司Eppendorf离心管1mL离心管北京鼎国生物技术有限公司Dragon移液器1mL，200μL，50μL北京鼎国生物技术有限公司PCR仪9700美国ABI公司1.1试验试剂常规理化试验试剂：氯化钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸铵，牛肉膏，蛋白胨，琼脂，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯化铵，氨水，溴化钾，硫代硫酸钠，溴酸钾，碘单质，淀粉，微量元素液，氢氧化钠溶液，盐酸，纳氏试剂，酒石酸钾钠试剂。PCR-DGGE及测序试剂：华舜细菌DNA小量抽提试剂盒（华舜）、华舜PCR产物纯化试剂盒、TagDNA聚合酶（大连宝生物）、dNTPs、BSA（小牛血清蛋白）。电泳试剂：琼脂糖（西班牙）、丙烯酰胺、尿素，无水碳酸钠，甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、Tris，硝酸银，TEMED购自于AmershamPHarmaciaBiotech公司；甲醛，醋酸，硫代硫酸钠均为国产分析纯引物：534GC和341f由TAKARA公司合成。1.2试验用培养基1、苯酚-无机盐培养基（g/L）：苯酚：0.2，(NH4)2SO4：3.0，KH2PO4：0.5，Na2HPO4：0.5，MgSO4·7H2O：0.3，微量元素溶液：1mL/L，pH7.2-7.4。2、微量元素溶液（g/L）：FeSO4：0.3，CuSO4·5H2O：0.038，ZnSO4·7H2O：0.115，MnSO4：0.169，H3BO3：0.116，CoCl·6H2O：0.024，Na2Mo·2H2O：0.017。3、苯酚-营养肉汤培养基：苯酚：0.2，NaCl：5.0，蛋白胨：10.0，牛肉膏：-18-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1，pH7.2-7.4。4、苯酚-营养琼脂固体培养基：苯酚：0.2，NaCl：5.0，蛋白胨：10.0，牛肉膏：3.0，琼脂粉：15.0，pH7.2-7.4。1.2.1菌种来源菌种为黑龙江省环境生物技术重点试验室保存的脱酚菌TF1及TF2，该菌筛自于某石化污水厂曝气池活性污泥。1.3.1试验方法1.4.1微生物多项分类法2.1涂布平板法将菌液均匀涂布在普通培养基平板上，肉眼直接观测微生物菌落形态。2.2光学显微镜观察法光学显微镜观察法将需观察的菌株的菌液涂布在载玻片上，然后用结晶紫染色1min，水洗、干燥。在光学显微镜下观察到生长完整的菌体，同时选择视野进行拍摄。2.3原子力显微镜观察法将样品均匀固定在载玻片上，放置在AFM载物台上，其工作原理是：将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，具有微小针尖的另一端与样品表面接触，由于针尖原子与样品表面原子间存在微弱的排斥力，在扫描时恒定这种力，微悬臂将对应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面在垂直方向做起伏运动。由此测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化，获得样品形貌信息。工作模式为轻敲模式，原子力显微镜为DIBioScope(美国Veeco公司)。2.4透射电镜观察法将固定、染色处理后的样品粘在金属载网上，进行透射电镜观察，其工作原理是：由电子枪发射出来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上；透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多；经过物镜的会聚调焦和初级放大后，电子束进入下级的中间透镜和第1、第2投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板上；荧光屏将电子影像转化为可见光影像以观察。2.5脂肪酸鉴定法脂肪酸是构成生物膜的重要物质，细菌的细胞的结构中普遍含有脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，各种细菌具有其特征的细胞脂肪酸指纹图谱。脂肪酸鉴定法不仅可以对大量的菌株进行比较和分群,而且也可-19-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文以提供菌株的有关描述特征。脂肪酸鉴定菌种的步骤：（1）获菌：用提取脂肪酸指定的培养基培养待鉴定菌株，四区划线。取第三区菌40-60mg，菌量不够的可从第四区取菌。取出的菌放在干燥干净的13mm*100mm有螺旋盖的培养试管中底部。（2）皂化：注入1mL试剂1，盖紧旋盖，震荡试管5-10s,放入沸水浴95-100摄氏度中加热5min后，从沸水浴中拿出试管并轻微冷却（用冷水冲凉），再震荡5-10s后放回水浴。（此步骤目的是确认试管是否漏损，若漏损则有气泡产生，要重新旋紧盖子，否则要换新的培养试管）继续加热25min,冷却。（3）甲基化：目的是转化脂肪酸成甲基脂肪酸，增加脂肪酸挥发性以供GC分析。加入2mL试剂2，震荡5-10s，80摄氏度水浴加热10min,快速冷却。（4）萃取：加入1.25mL试剂3，温和旋转10min,分层后移去下层的水相。（5）基本洗涤：加入3mL试剂4，温和旋转5min,吸取上层相（约5mL）置于GC检体小瓶。（若此次分层后上清液不澄清，似乳化状浑浊，则滴加少数滴NaCl溶液，握着试管置垂直状并震荡。）（6）气象色谱检测1.116SrDNA鉴定由于16SrDNA在进化过程中十分保守,具有相对一定的进化速率,因此常用于进化分析。不同细菌16SrDNA序列同源性小于93%则认为是不同属的菌株；不同细菌16SrDNA序列同源性在93-97%，则认为是同属但不同种内的菌株；不同细菌16SrDNA序列同源性大于97%，则认为是同种内的菌株。PCR法快速扩增细菌16SrDNA序列方法，快速、灵敏、重复性好，成为试验室进行细菌16SrDNA鉴定的主要方法。1.2.1微生物量测定方法(1)分光光度法，用于细菌生长曲线测定试验。(2)血球计数法[77]，用于菌体计数试验。(3)稀释平板法[77]，用于菌体计数试验。(4)菌体干重法[77]，用于菌体干重试验1.2.2水质分析方法主要参考国家环保局废水检测分析方法，具体的分析项目与方法见表2-3。-20-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文表2-3水质分析项目与方法编号项目分析方法1CODCL-12型化学需氧量速测仪2苯酚残余含量[78]4-氨基安替比林分光光度法3氨氮含量纳氏试剂光度法3MLSS[77]重量法4MLVSS[77]重量法[77]目测法5SV301.1GC-MS分析方法（1）固相微萃取法将经0.45μm滤膜过滤后的二沉池出水1L以3mL/min的流速通过经甲醇和蒸馏水活化过的SuplecleanENVI-18小柱（500mg，3mL）进行固相萃取，再先后用乙醚和二氯甲烷洗脱富集在柱上的有机物。洗脱完毕后，用烘干的无水硫酸钠粉末对洗脱液进行脱水，将脱水后的洗脱液转入K-D浓缩器，用高纯氮气吹脱浓缩至样品体积接近1mL。（2）进样条件仪器：美国惠普公司生产的MP5890GC/MS色谱—质谱联用仪色谱条件：SE-54型石英毛细管柱（25m×0.32mm）柱温：柱温：初始柱温为40℃保持2min，升温速度为3-5℃/min，至温度达到250℃终温保持30min；质谱条件：离子源温为250℃，倍增器电压2400V，电子轰击能量为70eV；进样量：0.2uL.1.2灭菌方法试验的部分工作要求在无菌条件下进行，故试验室用的材料、器皿、培养基、移液管、Effendorf离心管、无菌水等都要经灭菌后方能使用.本试验中主要采用高压蒸汽灭菌法，121℃，灭菌20~30min。1.3菌体驯化方法本试验所选取的为-80℃保存下的脱酚菌TF1、TF2，在试验开始前需对其进行驯化：首先配制一系列液体培养基（编号1，2，3，…）：按编号由小到大的顺序，培养基中筛选时用的营养比例逐渐减小，目标生境的物质比例在逐渐增大，-21-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文将这些培养基高温灭菌，待用。然后，将-80保藏的TF1、TF2分别接种到1号培养基中，在摇床中进行培养，待培养基变浑浊（此时菌量较大）时，吸取一定量的1号培养基中的菌液至2号培养基中，再进行培养，当培养基变浑浊时，认为菌体已经度过适应期，进入对数生长期及稳定期。按照此法，将2号培养基中的菌液接种至3号培养基中，直至将菌液接种至完全为目标物质的培养基中进行培养，以此实现从富营养到贫营养的驯化。接下来再配制一系列液体培养基（编号1，2，3，…）：按照编号由大到小的顺序，培养基中筛选时用的营养比例在逐渐增小，目标生境的物质比例在逐渐减小，将这些培养基高温灭菌，待用。然后，从完全为目标物质的培养基中吸取一定量菌液至1号培养基中，操作同上，实现从贫营养到富营养的驯化。反复几次富营养到贫营养，贫营养到富营养的驯化，最后的菌液也用于实际工程中，并要将驯化后的工程菌保存。1.1微生物群落解析方法1.2.1细菌基因组总DNA的提取细菌基因组（DNA）的提取根据破壁方法的不同可分为物理、化学和生物等多种破壁方法，而不同的破壁方法裂解细胞，释放DNA的效率是不相同的。由于活性污泥中除了具有带有代谢活性的微生物群体外，还具有内源代谢、自身氧化的残留物；石化废水带入的难降解的石油烃类、芳香烃类、酚类等物质有机物和无机物等物质，参照苏俊峰等人的提取方法[79]，采取试剂盒法提取样品DNA：(1)样品的预处理：用PBS溶液将样品离心（转速为12000）洗脱3次，每次5分钟，每个样品再超声破碎2分钟。（2）细菌的消化：将预处理后的1ml样品离心30秒，弃上清。在细菌沉淀中加入40ulDB液，200ul的Lysozyme和8ulRNaseA，彻底震荡悬浮，37℃温浴2小时，期间每10分钟来回颠倒离心管1次。（3）加入200ulDLT液和25ulproteinaseK，迅速且温和来回颠倒离心管彻底混匀。置65℃温浴90min，期间每10分钟来回颠倒离心管1次。以>12000xg离心5分钟后，将上清全部移入一个干净离心管中。（4）加入200ul无水乙醇，混匀后全部移入吸附柱中。9000xg离心30秒。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中。（5）将500ulWGP液，静止1分钟后，离心30秒。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中。（6）加入500ulWGP液，离心30秒。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集-22-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文管中。（7）离心1分钟。（8）将吸附柱移入一个1.5ml离心管中。在吸附膜中央加入60ulT1液，65℃静置5分钟，离心2分钟，将DNA轻微混匀，-20℃保存。1.1基因组总DNA的PCR扩增（1）为减少PCR扩增过程中非特异性条带的产生，采用对大多数细菌和古细菌的16SrDNA基因V3区扩增的通用引物对：534RGC:(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，341f:(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)。（2）PCR反应体系（25μl）：针对污水处理系统中污染物的复杂性、多样性.按照优化后的体系进行扩增，此反应体系可加入0.1μl的BSA（小牛血清蛋白），用以去除少量的腐殖酸，去除对PCR扩增产物不显现的影响。（3）PCR反应条件：采用PCR扩增策略为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s,72℃延伸30s，30个循环，72℃最终延伸20min。4℃保存，PCR反应的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离。使用梯度混合装置，制备6~12%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从30%到60%和40%到60%（100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物）。上样量为纯化后的PCR样品6μl和上样缓冲液6μl混合后加入上样孔。仪器温度设定为60℃，534GC/341f引物的选择110V的电压下，电泳时间9h。电泳结束后，将凝胶进行银染，最后将染色后的凝胶用ImageScannerⅢ透射扫描仪扫描后保存。试剂的配制和操作过程参见《分子克隆》一书。具体的操作程序如下：（1）变性梯度胶的制备：使用梯度混合装置，制备6%和8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从40%到60%（100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），其中变性剂和丙烯酰胺的浓度从胶的上方向下方依次递增。（2）PCR样品的加样：待变性梯度胶完全聚合后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品6μl和6μl10×加样缓冲液混合后加入上样孔。（3）电泳及染色：110V的电压下，60℃电泳9h。电泳结束后，将凝胶进行银染。（4）胶图扫描：将染色后的凝胶用ImageScannerⅢ透射扫描仪扫描后获取胶图。-23-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文（5）DGGE的指纹图谱分析用quantityone软件进行处理。有关泳道和条带的技术处理都用该软件进行。使用相似性系数（similaritycoefficient）描述图谱中条带间的相似性。-24-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第3章苯酚降解菌纯培养特性本研究中的脱酚菌TF1及TF2来自于黑龙江省环境生物技术重点试验室。该菌与其他脱酚菌相比具有良好的苯酚降解效能和较强的环境适应能力。本章对脱酚菌TF1及TF2进行纯培养特性研究，通过多相分类技术确定其分类学特征，并考察其生长特性与苯酚降解效能，及不同温度和碳源下对COD和苯酚去除率的影响，并对其生长条件进行优化。1.1苯酚降解菌的多相分类研究微生物分类是在对大量微生物进行观察、分析和描述的基础上，以它们的形态、结构、生理生化反应和遗传性等特征的异同为依据，并根据生物进化的规律和应用的方便，将微生物分门别类地排列成一个系统。“多相分类”一词是由Colwell(1970)首先提出的[80],它主要是对微生物的表型、遗传型以及系统发育关系等各个方面可用于鉴别的特征进行研究并加以综合分析。遗传学的信息主要来自于细菌中的核酸(DNA和RNA);表型特征来自于蛋白质及其功能、各种不同的化学分类指标以及大量其它的表达特征。1.2.1菌体的形态学观察1.3.1平板划线法观察菌落形态将处于对数生长期的脱酚菌TF1、TF2均匀涂布在苯酚-普通培养基平板上，生化培养箱30℃恒温培养36小时后，观察菌落形态。如图3-1、3-2所示：图3-1TF1菌落形态图3-2TF2菌落形态-25-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1光镜下的菌株形态在载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少量单菌落菌体于蒸馏水充分混匀，过火固定，结晶紫染色30秒后用水冲洗，再次过火至水分完全蒸发，于40倍下光镜观察。如图3-4、3-5所示：图3-3TF1光镜下形态图3-4TF2光镜下形态1.2原子力显微镜下菌株形态原子力显微镜（AFM）可直接对DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的结构进行研究。同时，样品制备上避免了电镜成像过程中所需要的喷镀、染色和标记等用来增加图形反差的复杂处理步骤。其分辨率能达到纳米级，能够实现生物大分子单分子成像。图3-5和3-6分别是菌株TF1和TF2在接触模式下的AFM三维图像，图中两菌的形状、大小和表面形态清晰可见。图3-5TF1原子力显微镜图像图3-6TF2原子力显微镜图像-26-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1透射电子显微镜下菌株形态将处于对数生长期的TF1和TF2菌液做10倍稀释，在蜡板上滴一滴菌液，用铜网吸附样品3min，滤纸吸去多余菌液后，用1%的磷钨酸染色2分钟，吸去多余染料后，待样品自然风干，透射电镜观察。图3-7TF1透射电镜下形态图3-8TF2透射电镜下形态表3-1脱酚菌生理生化特征菌株TF1TF2形状圆形圆形大小1.0~2.0(mm)1.0~1.5(mm)表面低凸低凸颜色淡黄色淡黄色色素不产不产荧光无无透明度半透明不透明粘滞性易挑起易挑起光滑光滑光滑边缘波状，有辐射整齐，无辐射质地较软较软菌体形态短杆状杆状菌体大小0.8~1.2(um)1.0~1.8(um)革兰氏染色阴性阳性NH3++石蕊牛奶++淀粉+--27-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文续表3-1脱酚菌生理生化特征吲哚-+乙酰甲基醇+-明胶-+H2S+-NO3+-甲基红--油脂-+接触酶++柠檬酸++糖发酵+-1.1苯酚降解菌的16SrDNA序列分析目前16SrDNA序列分析已发展成为细菌系统发育分类学中最重要的遗传鉴定方法，已逐渐取代传统的生理生化细菌分类鉴定方法。最新版的细菌分类学的经典著作《伯杰系统细菌学手册》已主要采用16SrDNA序列分析为其进行细菌分类的主要依据，而经典的生理生化分析成为细菌分类的辅助判断依据。一般认为，不同细菌16SrDNA序列同源性小于93%则认为是不同属的菌株；不同细菌16SrDNA序列同源性在93-97%，则认为是同属但不同种内的菌株；不同细菌16SrDNA序列同源性大于97%，则认为是同种内的菌株。PCR法快速扩增细菌16SrDNA序列方法，快速、灵敏、重复性好，成为试验室进行细菌16SrDNA鉴定的主要方法。以菌株TF1、TF2的总DNA为模板，利用细菌的16SrDNA的通用引物，PCR扩增菌株的16SrDNA，将PCR产物进行测序，在GenBank中登陆的序列号分别为AY346138(附录1)和EF030545(附录2)。结果表明，TF1菌株与菌株Alcaligenessp.（AY346138）相似性99%，具有较高的同源性。TF2菌株与菌株与Acinetobacterxiamenensis（EF030545）的相似性97%，具有较高的同源性。综合上述两株菌的形态观察、生理生化分析和16SrDNA分析，将TF1菌株归结为Alcaligenessp.，TF2菌株归结为Acinetobactersp.。1.2苯酚降解菌的脂肪酸分析脂肪酸分析所采用的气相色谱系统为美国Agilent6890N型，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；分析软件应用美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌软件SherlockMIS4.5和LGS4.5。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升温至310℃，维持-28-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文90s；汽化室温度250℃、检测器温度300℃；载气为（2ml/min）、尾吹气为氮气（30ml/min）；柱前压l0.00psi（1psi=6.895kPa）；进样量lμl，进样分流比100:l。系统根据各组分保留时间计算等链长(ECL)值确定目标组分，采用峰面积归一化法计算各组分相对含量，再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度(similarityindex，SI)，从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高SI的菌种作为鉴定结果，但当报告的几个菌种SI比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。脱酚菌TF1和TF2的脂肪酸气相色谱检测与MIDI数据库比对的结果表明TF1为Alcaligenes-faecalis，TF2为Acinetobacter-calcoaceticus。具体数据详见附表3和附表4。1.1高效苯酚降解菌的降解特性研究苯酚是一种重要的化工原料，制酚醛树脂、医药、染料等，稀溶液用做防腐剂和消毒剂。含酚废水主要来自焦化厂、煤气厂、石油化工厂、绝缘材料厂等工业部门以及石油裂解制乙烯、合成苯酚、聚酰胺纤维、合成染料、有机农药和酚醛树脂的生产过程。含酚废水中主要含有酚基化合物，如苯酚、甲酚、二甲酚和硝基甲酚等。酚基化合物是一种原生质毒物，可使蛋白质凝固。饮用水中含酚能影响人体健康，即使水中含酚质量浓度只有0.002mg/L，用氯消毒也会产生氯酚恶臭。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。误服引起消化道灼伤，出现烧灼痛，呼出气带酚味，呕吐物或大便可带血液，有胃肠穿孔的可能，可出现休克、肺水肿、肝或肾损害，出现急性肾功能衰竭，可死于呼吸衰竭。因此，研究苯酚降解菌的降解特性，对去除水体中酚类物质，保障水质安全及至关重要。1.2.1高效苯酚降解菌苯酚降解能力的测定将高效苯酚降解菌TF1及TF2分别接种到苯酚起始浓度为110mg/L的苯酚无机盐培养基中，菌体接种量为培养基的10%，培养条件为：温度25℃，rpm130，测定20h内苯酚降解情况，即在某一时间内废水中苯酚的含量变化（mg/L）情况。结果见图3-9。-29-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文120100TF1TF28060402008h10h12h14h16h20h时间（h）图3-9TF1及TF2苯酚降解情况从图中可以看出，当苯酚初始含量为110mg/L时，TF1及TF2在20h内对苯酚的降解均有明显效果，但是TF1在24h内的降解呈线性关系，而TF2在0-11h的时间范围内苯酚含量显著下降，这说明TF2的活性及苯酚降解能力明显高于TF1，其对苯酚的降解能力在接入后的短时间内迅速发挥作用。1.1温度对高效苯酚降解菌苯酚降解性能的影响不同的微生物在相同的温度条件下对废水中目的污染物的降解效能不同，而同一微生物在不同温度条件下对目的污染物的降解效能也不同。本试验主要研究高效苯酚降解菌TF1及TF2在不同的温度条件下，随着时间的推移对苯酚处理效能，也就是在某一时间内苯酚的浓度变化情况。本试验共设5个温度梯度，分为TF1和TF2两组分别进行，起始苯酚浓度为150mg/L，在10%接菌量，rpm130条件下测定36小时内对苯酚的降解效果。结果见图3-10，图3-11。1801601401201008060402015℃20℃25℃30℃35℃00h12h24h36h时间（h）图3-10TF1在不同温度条件下苯酚含量变化-30-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1601401201008060402015℃20℃25℃30℃35℃00h12h24h36h时间(h)图3-11TF2在不同温度条件下苯酚含量变化由上图可以看出，当苯酚初始含量为150mg/L时，TF1在25℃-35℃的降解效果很好，其苯酚降解率分别为97.97%，98.04%，95.31%，但是在15℃的时苯酚含量几乎没有变化，说明TF1不适合低温的条件。而TF2在20℃-30℃的范围内降解效果都很好，其苯酚降解率分别为98.01%，98.04%，97.84%，同时在15℃时TF2对苯酚也具有一定的降解效果，降解率为46.82%。究其原因在于，低温条件下与苯酚降解有关的酶活性受到了抑制导致了苯酚降解率的下降，但相比之下TF1更易受到低温的影响。后期试验可考虑对TF1和TF2进行低温驯化，以适应北方寒冷地区冬季含酚废水处理需要。1.1外加碳源对高效苯酚降解菌苯酚降解性能的影响微生物能够利用的碳源物质很多，但是，当几种碳源物质同时存在时就可能抑制或者促进某一碳源的利用。本试验设计分别向苯酚-无机盐培养基中分别加入1.2.1g普通培养基、乙酸钠、丁二酸钠及葡萄糖，在25℃，rpm130，10%接菌量的情况下考察36小时内苯酚的降解情况。旨在研究除苯酚之外还存在其它碳源物质时，高效苯酚降解菌TF1及TF2的苯酚降解性能。-31-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文普通培养基乙酸钠丁二酸钠葡萄糖无任何外加物180 160 140 120 100 8060402000h12h24h36h时间(h)图3-12TF1在不同碳源存在时的苯酚降解情况普通培养基乙酸钠丁二酸钠葡萄糖无任何外加物160 140 120 100 8060402000h12h24h36h时间(h)图3-13TF2在不同碳源存在时的苯酚降解情况从图3-12和图3-13中可知，当培养基中存在其它的碳源物质时，TF1对苯酚的降解情况有很大的差异，而TF2则几乎没有受到其它物质的干扰，并且苯酚降解率均达到了94%左右。原因可能在于，当环境中存在其他碳源时TF1具有大量的理想底物，其先降解简单底物为自身生长提供物质及能量，苯酚不再被TF1优先光顾，使其适应性减弱。只有当环境中其他底物量不足时，TF1才以苯酚作为物质及能量来源；TF2在其他底物存在的情况下，依旧对苯酚具有良好的降解效能，说明其对环境具有较强的适应能力，具有广泛的底物来源，且苯酚是其优先级底物。1.1苯酚降解过程中COD值的变化规律化学需氧量（ChemicalOxygenDemand，简称COD），是在一定的条件下，采-32- nn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nn哈尔滨工业大学理学硕士学位论文用一定的强氧化剂处理水样时，所消耗的氧化剂量。它是表示水中还原性物质多少的一个指标。水中的还原性物质有各种有机物、亚硝酸盐、硫化物、亚铁盐等。但主要的是有机物。因此，COD又往往作为衡量水中有机物质含量多少的指标。化学需氧量越大，说明水体受有机物的污染越严重。1.1相同温度下COD变化规律本试验主要考察在普通无机盐培养基中，25℃下，10%接菌，rpm130，高效苯酚降解菌TF1及TF2在36h内的SOD（溶解性COD）和TCOD（总COD）的变化情况，结果图3-14和图3-15所示。50045040035030025020015010050SODTCOD00h8h10h12h14h16h20h时间（h）图3-14TF1的SOD和TCOD的变化情况50045040035030025020015010050SODTCOD00h8h10h12h14h16h20h时间（h）图3-15TF2的SOD和TCOD的变化情况由图中可以看出，TF1及TF2在20h内对SOD和TCOD都有明显去除效果，但TF2相对于TF1而言，其在11h内即可将系统中的COD降至52mg/L，基本达到了国家对出水COD要求的一级A标准，具有较强的SOD和TCOD去除率，且TF2测得的SOD小于TF1。可见，TF2无论在苯酚降解能力上还是COD去除方面-33-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文都优于TF1。结合系统中苯酚含量变化情况分析，说明TF1和TF2具有较强的去除苯酚及COD的能力，脱酚菌能够充分将苯酚降解为CO2和H2O，而不是简单的将苯酚进行转化。1.1不同温度条件下COD的变化规律为考察不同温度下，苯酚降解菌对COD的去除情况，设定了15℃-35℃五个温度梯度，在10%接菌量，25℃，rpm130条件下对菌体在苯酚-无机盐培养基中进行培养，测定36小时内COD变化情况。图3-16和3-17显示了不同温度条件下，TF1及TF2在降解苯酚时其COD值的变化规律。70060050040030020010015℃20℃25℃30℃35℃00h12h24h36h时间（h）图3-16TF1在不同温度条件下的COD变化规律70060050040030015℃20℃25℃30℃20035℃10000h12h24h36h时间（h）图3-17TF2在不同温度条件下的COD变化规律图中所示的COD变化情况与测得的苯酚含量呈现对应关系，即TF1在25℃-35℃的降解效果很好，TF2在20℃-30℃的范围内降解效果很好，综合苯酚含量及COD的结果可以看出这两株菌都有一个较宽的温度适应范围。TF1尤其适应较高的温度，且在高温下对苯酚及COD也具有良好的降解能力。-34-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1外加碳源存在时COD的变化规律300250普通培养基200乙酸钠150丁二酸钠100葡萄糖无任何外加物5000h12h24h36h时间（h）图3-18TF1在不同碳源存在时COD变化规律300250普通培养基200乙酸钠150丁二酸钠葡萄糖100无任何外加物5000h12h24h36h时间（h）图3-19TF2在不同碳源存在时COD变化规律由图3-18和图3-19可以看出，随着时间的推移，TF1和TF2系统中COD都呈现减小的趋势，而且在36h时的最终COD均是没有任何外加物的无机盐培养基最小；但是TF1对含有丁二酸钠的苯酚降解效果比较好，而TF2对含有乙酸钠的降解效果好。1.2.1利用正交试验优化苯酚降解菌生长条件苯酚降解菌在生长过程中，除必需的营养元素外，还需要适合的环境因子如温度、pH、溶解氧等。当这些环境因子发生改变时，就会影响到苯酚降解菌的生长繁殖，影响其代谢功能和对目标污染物的去除效果。温度是影响苯酚降解菌生长的重要环境因子。温度的改变会直接影响到苯酚n-35- nn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nn哈尔滨工业大学理学硕士学位论文降解菌的生长，微生物生长最旺盛的温度为其最适温度，在这一温度下微生物的代谢水平最高，生长状态最好且繁殖能力最强，同时对底物的降解能力也达到最高水平。pH对苯酚降解菌的生命活动影响很大，其主要作用于细胞膜的电荷变化，从而影响苯酚降解菌对营养物质的吸收；影响代谢过程中与苯酚降解有关酶的活性；及改变生长环境中营养物质的可给性。苯酚降解菌作为好氧微生物，氧气为其有氧呼吸提供最终受体，溶解氧的含量直接影响到其有氧代谢水平。1.1正交试验优化苯酚降解菌生长条件为确定苯酚降解菌最佳的生长条件，本试验以温度，pH，摇床速度（溶解氧含量）作为主要环境因子，同时将苯酚浓度及初始接菌量作为参考指标，通过正交设计助手Ⅱv3.1对两株菌共进行正交试验设计，试验选用L16（45）正交表，将所选温度、苯酚浓度、摇床转速、pH、初始接菌量分别代表A、B、C、D、E为5因素，每个因素选择4个水平，分别代表不同的投加量（见表3-2）。在不考虑5个因素交互作用的情况下分别列出TF1和TF2L16（45）正交试验结果。对表进行直观分析，将表中因素A处在第一水平时的苯酚降解率相加，得到K1。依次算出每种因素每个水平的K，并计算出极差。K值越大代表该水平苯酚降解能力越高，而极差却大，说明该因素变化对苯酚降解的影响越大。TF1、TF2共进行32组试验，分析两株菌对各种环境条件变化的响应，优化苯酚降解菌的生长及降解条件，从而为后期的菌剂构建提供基础。试验设计如表3-3所示表3-2正交试验脱酚菌生长条件及其水平表水因素pH初始接种菌量温度苯酚浓度摇床转速平（℃）（mg/L）（rpm）（mL）151008052215200100753254001209104356001401015根据上述试验设计，8小时后测得TF1苯酚降解率及各因素分析见表3-3。-36-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文表3-3TF1生长条件正交试验结果所在列12345因素温度（℃）苯酚浓度（mg/L）摇床转速（rpm）pH初始接菌量（ml）试验结果试验11111118.14试验2122225.33试验3133330.73试验4144440.7试验5213347.9试验6224434.59试验7231121.2试验8242216.11试验931442100试验103233178.36试验11332241.58试验12341132.33试验1341223100试验14421140.208试验15434410.286试验16443320.043均值16.22556.5106.0885.47025.724均值24.95022.1223.96228.25526.643均值345.5680.94926.76221.75826.913均值425.1342.29645.06526.3942.597极差40.61855.56141.10322.78524.316由极差可以看出，5个因素对脱酚菌TF1苯酚降解效果的影响大小依次为：苯酚浓度>温度>摇床转速>初始接种量>pH。苯酚的初始浓度在100mg/L时苯酚降解率最高，含量过多或过少，苯酚降解率都降低，其原因可能在于：当苯酚浓度过低时脱酚菌TF1的碳源不足，个体为了获取更多的碳源从而发生种内竞争，导致一部分TF1菌体得不到充足的碳源而被淘汰，使得苯酚降解率下降；由于苯酚本身是一种毒性较大物质，具有杀菌作用，当其含量过高时，会对脱酚菌产生毒害，从而减少脱酚菌数量，并降低其代谢水平，使得苯酚降解率下降。当温度为25℃时苯酚的降解率最高，高于或低于此温度都会使苯酚降解率有所下降，究其原因在于25℃为TF1生长的最适温度，在此温度下TF1的代谢能力-37-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文最强，与苯酚降解有关的酶活性也最高，低于或高于这个温度都会使酶活性降低，从而降低苯酚的降解能力。摇床转速rpm140时，TF1降解苯酚的能力最强，因为苯酚降解过程是有氧呼吸过程，充足的氧气为有氧呼吸提供了足够的电子最终受体，溶解氧含量过低时，有氧呼吸作用不能充分进行，导致菌体活性下降，生长缓慢，对目标底物-苯酚的降解能力下降。TF1起始接菌量为10ml即培养体系10%时，苯酚去除率最高，接种量过大或过小都会对苯酚降解造成影响，分析原因为当接种量过小时，培养体系中菌体数量过少，苯酚作为底物含量相对较大，使得苯酚降解率下降；当接种量过大时，由于培养体系中菌体总量过多，使得底物含量相对减少，TF1发生种内斗争现象，从而使得一部分降解能力较差的菌体得不到充分的底物而被淘汰，使得苯酚降解率下降。pH为7是苯酚的降解率最高，过酸或过碱情况下都会使得苯酚降解率下降，原因在于pH7为TF1最佳pH值，在此条件下，其酶活性最高，代谢能力最强，但环境中pH变化时，使得细胞膜的电荷变化，从而影响其对营养物质的吸收及影响代谢过程中与苯酚降解有关酶的活性，同时也可能改变了生长环境中营养物质的可给性。综上所述，TF1在苯酚的初始浓度在100mg/L，温度为25℃，rpm140时，起始接菌量为10ml，pH为7时对苯酚的降解效果最佳。同样的试验设计，8小时后测得TF2苯酚降解率及各因素分析见表3-4表3-4TF2生长条件正交试验结果所在列12345因素温度（℃）苯酚浓度（mg/L）摇床转速（rpm）pH初始接菌量（ml）试验结果试验1111111.44试验2122221.56试验3133334.14试验4144441.66试验521234100试验62214356.51试验7234123.18试验8243215.79试验931342100试验1032431100-38-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文续表3-4TF2生长条件正交试验结果所在列12345因素温度（℃）苯酚浓度（mg/L）摇床转速（rpm）pH初始接菌量（ml）试验结果试验113312450.32试验123421320.654142380试验13试验144231417.83试验154324178试验164413258.64均值12.20070.36041.72710.77546.308均值241.37043.97550.05334.41840.845均值367.74233.91031.94065.69540.325均值458.61721.68546.21059.04242.453极差65.54248.67518.11354.9205.983由极差可以看出，5个因素对脱酚菌TF2苯酚降解效果的影响大小依次为温度>pH>苯酚浓度>转速>初始接种量。温度作为影响TF2最重要的影响因子，当温度为25℃时苯酚的降解率最高，低于此温度会影响苯酚降解能力，但TF2在35℃下对苯酚的降解能力依然良好，说明TF2对高温条件适应性更强，其与苯酚降解有关的酶活性受高温影响较小，所以对苯酚的降解能力影响不大。pH为9是苯酚的降解率最高，pH9应为TF1最佳pH值，在此条件下，其酶活性最高，代谢能力最强，且当pH值继续升高时，TF2对苯酚依旧具有较高的降解能力，说明TF2对碱性环境的具适应能力要优于酸性环境。苯酚的初始浓度在100mg/L时苯酚降解率最高，含量过多或过少，苯酚降解率都降低，其原因可能在于：当苯酚浓度过低时脱酚菌TF2的碳源不足，个体为了获取更多的碳源从而发生种内斗争，导致一部分TF2菌体得不到充足的碳源而被淘汰，使得苯酚降解率下降；由于苯酚本身是一种毒性较大物质，具有杀菌作用，当其含量过高时，会对脱酚菌产生毒害，从而减少脱酚菌数量，并降低其代谢水平，使得苯酚降解率下降。摇床转速rpm100时，TF2降解苯酚的能力最强，说明TF2在消耗少量氧气的情况下即可对苯酚进行降解，存在TF2是兼性好氧菌的可能。TF2起始接菌量为2ml即占培养体系2%时苯酚去除率最高，其接种比例偏小，说明TF2个体对苯酚的降解能力较强。接种量过大或过小都会对苯酚降解造-39-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文成影响，分析原因为当接种量过大时，由于培养体系中菌体总量过多，使得底物含量相对减少，TF2发生种内斗争现象，从而使得一部分能力较差的菌体得不到充分的底物而被淘汰，使得苯酚降解率下降。综上所述，TF2在25℃下，pH为9，苯酚初始浓度为100mg/L，rpm100，起始菌量为2ml时，对苯酚的降解能力最强。1.1TF1与TF2生长条件比较TF1与TF2同作为苯酚降解菌，都能够降解苯酚为自身生长提供所需要的能量及物质来源，但二者在分类学上的分类地位不同，TF1为产碱假单胞菌属，TF2为不动杆菌属，在对环境的要求及对苯酚的降解能力上有所不同，现将二者最优生活环境对比如下：表3-5TF1与TF2生长条件比较TF1TF2温度（℃）2525pH79摇床转速140100苯酚浓度（mg/L）100100初始菌量（ml）102由上表可知，两株苯酚降解菌对温度及系统中初始苯酚浓度要求相同，这为二者混合培养去除苯酚提供了可能，但在其他三个水平上有所差异。降解相同含量的苯酚，TF1的接种量为TF2的5倍，且对溶解氧（摇床转速）的要求也高于TF2，表明TF2个体降解苯酚的能力要优于TF1,其可在消耗较少能量的前提下降解更多的苯酚。本章小结1、对脱酚菌TF1和TF2进行了多相分类分析，结果表明，菌株TF1与菌株Alcaligenessp.（AY346138）相似性99%，TF2菌株与菌株与Acinetobacterxiamenensis（EF030545）的相似性97%，综合上述两株菌的形态观察、生理生化分析和脂肪酸分析，将TF1菌株归结为Alcaligenessp.，TF2菌株归结为Acinetobactersp.。2、对脱酚菌TF1和TF2进行生理生化特性研究，表明两株菌对苯酚都有较强的降解能力，其中TF2对苯酚的降解能力高于TF1。不同温度下，TF1随着温度-40-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文改变苯酚降解率受到的影响较大。在系统中存在外加碳源的时，TF1对苯酚的降解情况有很大的差异，而TF2则几乎没有受到其它物质的干扰。在对系统中COD去除方面，TF1在25℃-35℃的降解效果很好，TF2在20℃-30℃的范围内降解效果很好。存在外加碳源时，系统中COD都呈现减小的趋势，而且在36h时最终的COD均是没有任何外加物的无机盐培养基最小。3、通过正交试验确定TF1的最佳生长条件为：初始苯酚浓度100mg/L，温度为25℃，rpm140，起始接菌量为10%，PH为7；TF2的最佳生长条件为：温度25℃，PH为9，苯酚初始浓度为100mg/L，rpm100，起始菌量为2%。-41-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第4章含酚废水生物增强菌剂的构建途径及应用效果在实际含酚水的处理中，对于高浓度的含酚废水，首先应考虑将苯酚加以回收利用；对于苯酚含量较低，无回收价值的废水或经回收处理后仍留有残余酚的废水，则必须进行无害化处理，做到达标排放，实现经济利益和环境利益统一。根据原理的不同，含酚废水的处理主要分为吸附法、氧化分解法和生物处理法三类。相比较于传统的物理化学方法，生物法具有经济、高效、无二次污染等优点[81]，其中生物强化技术是在生物处理体系中投加高效菌种来增加和改善原有系统的处理能力,以达到对某类污染物的高效去除[82]。组建高效菌剂就是结合微生物法和微生物生态法的特点，通过一系列工作得到适应目标生境的工程菌，同时为其创造最适生存条件，使其最终达到高效且稳定去除难降解物质的目的。菌剂生态构建的一般方法，见图4-1。从特殊微生物的生存环境中筛选出高效微生物对筛选出的微生物进行菌种鉴定对筛选出的微生物进行驯化对微生物进行生态组合将高效工程菌系统进行实际工程应用对高效工程菌系统进行效能研究对高效工程菌系统进行工艺、设备开发图4-1工程菌生态构建的一般方法本章在充分掌握脱酚菌TF1及TF2纯培养理化特性的基础上，着重研究含酚废水生物强化菌剂的构建途径，具体包括TF1与TF2复配比例，反应条件，及对含酚废水中苯酚、氨氮、COD的去除情况，并进一步对强化菌剂在实际废水中的应用效果进行研究。-42-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1高效苯酚降解菌剂的构建本研究采用单菌株生态组合，复合构建的方式进行高效苯酚降解菌剂的构建，构建复合菌剂的菌源取自黑龙江省环境生物技术重点试验室保存的脱酚菌TF1及TF2。1.2.1苯酚降解菌剂构建的方法本试验在研究TF1和TF2苯酚降解规律及菌株生长规律的基础上，以不同配比将两株菌混合，确定最佳配比。在无菌条件下，将0.35g苯酚加入到1.5L苯酚无机盐培养液中，充分溶解后准确量取100mL至250mL空三角瓶，按不同比例加入两种菌液，做好标注；并测定初始时刻各样品中TF1与TF2的菌数（见图4-1）。本试验分两组同时进行，第二组为平行试验。分别测1#-11#样品中苯酚的初始浓度、初始TOC值、及TF1与TF2的菌数。培养条件为：25℃，摇床转速130rpm，24h后20mm比色皿，波长510nm下测定离心后样品上清液中苯酚残余浓度及TOC值。表4-2接种液中TF1与TF2的比例关系编号1234567891011TF1:TF210:09:18:27:36:45:54:63:72:81:90:10图4-1初始时刻细菌菌数-43-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1不同配比浓度下苯酚含量变化样品1-11在相同条件下培养24小时后，测定苯酚含量变化如图4-2所示：图4-2不同配比浓度下苯酚含量(mg/L)变化情况苯酚在经TF1和TF2联合作用下，含量都有所减少，其中7号样品的苯酚含量在24小时后降到最低，降解率高达99.8%，基本上将苯酚完全降解。1.2不同配比浓度下TOC含量变化TF1和TF2以不同比例配比，经24小时后处理TOC情况，见图4-3图4-3不同配比浓度下TOC变化情况试验数据表明，7号样品经24小时后，体系中TOC的含量最低，去除率达1.2.1%。结合24小时内苯酚含量与TOC的变化情况分析，样品7的处理能力最强，即TF1与TF2的复配体积在4:6时其对苯酚和COD具有良好的处理效果，处理率分别高达99.8%和97.8%。根据0时刻样品7中TF1与TF2的数量关系，最后确定二者菌数比例关系为TF1/TF2=2.33：1时，对苯酚和TOC的处理效果最佳，分-44-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文析原因在于，虽然两株菌都能够以苯酚作为底物，但在该比例下，二者菌数适中，苯酚含量相对丰富，使得两种菌之间没有发生种间竞争或竞争不激烈，能够共存，使得苯酚及TOC降解率高。1.1生物强化作用在含酚废水中的效能分析酚类化合物在工业生产中广泛应用，并随着工业生产废水的排放进入水体，对水体造成严重污染，通过生物强化手段处理含酚废水，可在不增加现有的水处理设备的前提下，提高其水处理的范围和能力。在充分研究苯酚降解菌TF1及TF2生理生化特性及最佳配比关系的基础上，将二者以最佳比例复配的苯酚降解菌剂投加到含酚废水中，通过对苯酚、COD、NH4+-N等指标的检测，对生物强化作用与普通处理方法间的效能差异进行分析。取某石化污水处理厂，进水水样及氧化段活性污泥。试验设计如表4-3所示：表4-3生物强化试验设计表编号12345成分水样+污泥+苯酚水样+TF1+污泥+苯酚水样+TF2+污泥+苯酚水样+强化菌剂+污泥+苯酚水样+强化菌剂+苯酚试验取某石化污水厂进水作为处理对象，其好养段污泥SS为1.0512g/L，MISS为10.512g/L。设定每组样品中石化废水体积为150mL，投加的污泥量为75mL，按照表4-3所示，将TF1、TF2及二者复配菌剂（复配比例为TF1:TF2=2.33：1，（详见4.1）分别投加到每组样品中，同时向每个体系中加入一定含量的苯酚原液（50g/L）以调节苯酚浓度。为减少试验误差，本试验所加入的活性污泥及强化菌剂、单菌，均离心后再加入处理体系中。每组试验为2组，另一组为对照试验。1.2.1相同温度及苯酚浓度下生物强化作用解析将1#-5#样品，在25℃，苯酚含量200mg/L，摇床转速130rpm的条件下培养，测初始时刻及8小时后的苯酚、COD、NH4+-N含量。-45-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文图4-4苯酚含量变化图4-5COD含量变化+-N含量变化 图4-6NH4图4-4与4-5分别显示了样品在8小时内对苯酚和COD的去除效果，其中1#处理体系，在没有经生物强化作用的情况下，其苯酚降解率为28%，表明土著微生物中也具有能够对苯酚进行降解的微生物种类。1#处理体系中COD去除率为1.1%，去除率偏低，说明苯酚对土著微生物的生长造成了一定影响，原因在于，苯酚自身的毒性对微生物产生了危害，使其代谢能力下降，酶活水平降低，进而影响到微生物的生长、发育及繁殖。2#体系的苯酚和COD去除率分别为72.5%和40%；3#体系的苯酚和COD去除率分别为86.5%和76.5%。都高于未经生物强化作用的1#体系的去除率，表明通过生物强化作用，TF1、TF2各自很好的融入到原生态系统之中，在有效去除苯酚含量的同时，解除了苯酚对原系统中土著微生物的一部分抑制作用，从而提高了苯酚及COD的去除率。相比之下，3#体系的处理效果优于2#体系，表明，在对实际含酚废水进行处理时，TF2比TF1适应能力更强，其苯酚降解能力得到了充分的发挥。数据表明TF1与TF2以2.33:1比例复配的菌剂，投加到废水处理系统后的降-46-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文解效果最佳，其苯酚降解率及COD去除率达95%和82.2%，高于其他体系处理水平，对含酚废水处理效果良好。表明经复配后的强化菌剂，在投加到处理体系中后，与土著微生物构成了新的生态系统结构，使各自都能够适应含酚废水环境，又能在该环境下对苯酚进行高效的降解。此外，高苯酚降解率说明，TF1与TF2在进入土著微生物原生态系统中时，与土著微生物及彼此之间的竞争较小，说明它们生态位重叠的部分较小，同时也存在生态位发生分离的可能，从而减少竞争压力。复配菌剂对处理系统的强化作用，在很大程度上解除了苯酚对土著微生物的抑制，使得体系中原有的微生物，代谢增强，酶活性变大，达到苯酚和COD的高效去除效果。5#系统的苯酚和COD去除率最低，仅为11.4%和12.5%，说明向含酚废水中单纯加入强化菌剂，在没有土著微生物的配合下，不能达到理想的处理效果，原因在于含酚废水中污染物种类较多，含量较大，TF1和TF2作为外来物种，代谢能力和生长水平受其影响较大，只有当土著微生物对废水中的污染物进行有效降解，才能使TF1和TF2适应废水环境，同时，也只有强化菌剂对苯酚进行高效去除，才能解除苯酚对土著微生物的限制作用，说明TF1、TF2与其他微生物在系统中是互利共生的关系，即只有在强化菌剂和土著微生物的共同作用下才能对含酚废水进行高效处理。图4-6表明，通过生物强化作用对废水体系中的NH4+-N处理效果的影响并不明显，分析可能是，土著微生物中的反硝化细菌在苯酚冲击下对其NH4+-N的降解能力影响较小，此外，也说明TF1和TF2基本上不具有处理NH4+-N的能力。1.1相同温度不同苯酚浓度下生物强化作用解析苯酚含量在200mg/L的情况下，生物强化作用显著，本试验考虑在温度不变的情况下（25℃）进一步加大苯酚浓度，使含酚废水中苯酚浓度分别达到400mg/L及600mg/L，并采取连续流测样方式，检测10小时内苯酚、COD及NH4+-N的变化情况，进而对高苯酚浓度下生物强化功能进行解析。试验设计见表4-4。-47-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文表4-425℃不同苯酚浓度下生物强化试验设计表编号样品1水样+污泥+400mg/L苯酚2水样+TF1+污泥+400mg/L苯酚3水样+TF2+污泥+400mg/L苯酚4水样+污泥+强化菌剂+400mg/L苯酚5水样+污泥+600mg/L苯酚6水样+TF1+污泥+600mg/L苯酚7水样+TF2+污泥+600mg/L苯酚8水样+污泥+强化菌剂+600mg/L苯酚考虑到在200mg/L的苯酚浓度下单纯加入复配菌剂，经多次驯化下，处理效果依旧很低，所以后续试验中不再对其进行研究。将1#至8#样品在25℃，rpm130下培养，检测10小时内苯酚含量、COD、NH4+-N变化情况，见图4-7至4-9。图4-7不同样品10小时内苯酚降解情况+-N降解情况图4-8不同样品COD降解情况图4-9不同样品NH4在相同的温度下，提高含酚废水中苯酚的浓度，试验结果表明，4#体系和8#-48-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文体系的8小时内苯酚降解率分别为93.8%、88.2%，明显高于其他体系的苯酚降解水平，说明高苯酚浓度没有影响到强化菌剂对废水的处理效果，表明TF1和TF2具有较强的抗苯酚冲击负荷能力。经TF1和TF2单独强化的2#、3#、6#、及7#体系的苯酚降解程度也相对较大，说明TF1和TF2可以适应高浓度苯酚的环境，但其处理效果较复配菌剂处理体系为低，说明TF1和TF2在含酚废水体系中所共同构建的生态体系更加稳定，更利于其对苯酚的降解。未经任何生物强化作用处理的1#体系和5#体系的苯酚含量亦有所下降，表明土著微生物中，一部分苯酚降解菌也具有适应高苯酚浓度的能力，但其对苯酚降解的能力较低，可考虑从体系筛选、分离出这些细菌，加以驯化，并对其生理生化特性加以研究，以备日后研究使用。未经任何生物强化作用处理的1#体系和5#体系8小时内的COD降解率分别为45.6%、18.1%，说明高苯酚浓度环境对土著微生物产生了严重的抑制作用。4#体系和8#体系的8小时内COD去除率分别为95.6%、87.4%。一方面说明复配的强化菌剂对COD的去除具有一定的贡献，同时也说明了，其高效的苯酚降解能力降低了环境中苯酚对土著微生物的抑制作用，从而大大提高了COD的去除率。经TF1和TF2单独强化的2#、3#、6#、及7#体系中的COD也有不同程度上升高，说明也解除了苯酚对一部分土著微生物的抑制作用。所有体系对NH4+-N处理效果的差别并不明显，说明生物强化菌剂对NH4+-N的去除贡献不大，这可能与进水NH4+-N浓度偏低有关。1.1不同温度下相同苯酚浓度生物强化作用解析本试验设定在苯酚浓度不变的情况下，考察温度对生物强化作用处理含酚废水的影响，检测处理8小时后体系中内苯酚、COD及NH4+-N的变化情况，进而对不同温度下下生物强化功能进行解析。体系中污泥及强化菌及菌剂的投加方式同试验4.2.1。试验设计见表4-5：表4-5不同温度下生物强化试验设计表编号样品115℃水样+污泥+200mg/l苯酚215℃水样+TF1+污泥+200mg/l苯酚315℃水样+TF2+污泥+200mg/l苯酚415℃水样+污泥+强化菌剂+200mg/l苯酚525℃水样+污泥+200mg/l苯酚-49-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文续表4-5不同温度下生物强化试验设计表编号样品625℃水样+TF1+污泥+200mg/l苯酚725℃水样+TF2+污泥+200mg/l苯酚825℃水样+污泥+强化菌剂+200mg/l苯酚8小时后测得苯酚、COD、NH4+-N的变化情况如图4-10至4-11所示：图4-10不同温度下苯酚降解情况+-N变化情况图4-11不同温度下COD变化情况图4-12不同温度下NH4根据试验数据显示，相同的苯酚浓度条件下，4#和8#处理体系的苯酚降解率分别为95%和95.4%，COD的去除率为88.4%和82.2%，差别都不是很大，表明低温对生物强化菌剂的影响并不十分显著，对土著微生物的影响也十分有限，分析原因可能与北方的气候特征有关。-50-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1石化废水生物强化处理前后的有机物成分分析对25℃下苯酚含量200mg/L的1#和4#处理体系做出水有机物成分分析。未经生物强化及经过生物强化的含酚石化废水处理体系的出水GC-MS总离子流色谱图分别如图4-13和图4-14所示。8000006000004000002000000000008000006000004000002000005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00时间/min图4-13未经生物强化含酚废水处理系统出水组分分析9000008000007000006000005000004000003000002000001000005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00时间/min图4-14生物强化后含酚废水处理系统出水组分分析从图4-13可以看出，未经生物强化的含酚废水处理系统出水中共检出有机污染物68种，按化合物类型可以分为8大类。在这些有机污染物中，危害最严重的是多环芳烃、卤代烃和苯类，浓度高、毒性大，部分具有致癌性；其次是烷烃和环烷烃类有机污染物；最后是醇醛酮类有机物，其所占比例不大，但却是可疑致癌物，其危害性不容忽视。从图4-14可以看出，出水中有机物的种类已由未进行生物强化的68种减少到-51-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文经过强化处理后的32种。经对GC-MS的结果进行分析后发现：水样在未处理前含有较多的长链烷烃、卤代烃、苯系类、酯类、醛酮类，其中以长链烷烃的含量最多。经过生物强化处理后水样中长链烷烃的含量大幅度下降，同时苯系类、酯类和醛酮类物质几乎全部被去除，有机物的数量也减少了约50%左右。因此，投加了高效苯酚降解菌的生物强化技术不仅对目标污染物苯酚有很好的降解效果，该工艺对石化废水中其他的难降解有机污染物有很好的去除效果。由以上试验可以看出，强化系统对含酚废水的处理能力明显优于未强化系统，且强化系统的稳定性和抗负荷冲击能力更好，且经过生物强化以后的废水中其它有机污染物的浓度也明显下降。本章小结1、采用单菌株生态组合，复合构建的方式进行高效苯酚降解菌剂的构建，确定脱酚菌TF1和TF2最佳的复配比例为2.33:1。2、对强化菌剂的应用效果进行分析，数据表明无论温度及苯酚浓度是否发生变化，强化菌剂对苯酚及COD的处理效果都达到了最高水平。出水中有机物的种类已由未进行生物强化的68种减少到经过强化处理后的32种。经过生物强化处理后，水样中长链烷烃的含量大幅度下降，同时苯系类、酯类和醛酮类物质几乎全部被去除，有机物的数量也减少了约50%左右。-52-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第5章生物强化作用下微生物群落结构解析微生物种群多样性一直是环境学科和微生物生态学研究的重点。近年来，微生物群落结构的变化成为研究热点，逐渐被应用到了废水生物处理过程中对总细菌或功能细菌的微生态结构进行解析。传统的培养分离技术和显微观察可分离取得单菌株鉴定分析，但受到可分离培养技术的限制性，加之污水处理系统中的微生物种群结构复杂多样性，致使实际分离出的菌株往往只占一小部分。采用变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）对含酚废水中微生物群落进行表征，可以鉴定出生态体系中的非培养细菌。由于自然界生态系统中只有0.1%-1%的微生物通过常规方法能被培养[83]·，所以与传统方法相比DGGE技术能够快速、准确地鉴定在自然生境或人工环境中的微生物种群，并进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物基因定位、种群动态、表达调控的评价分析。为了避免分离培养和鉴定工作周期长，工作量大等问题，应用PCR-DGGE技术对不同苯酚浓度及不同温度作用下的含酚废水微生物提取总DNA，再将编码有16SrDNA（V3区）的基因组扩增，可直接获得污水处理系统中微生物群落的生态分布。1.1功能微生物总DNA的提取1.2.1微生物的DNA提取分别取表5-1所示的1-14#在-80℃下保存的各样品，污泥菌群的充分裂解是DNA提取的一个重要前提，本试验采取了超声裂解法破碎菌体，时间为2min。另外，由于样品中含有大量的腐殖质和复杂的化学成分，如苯酚，4-硝基苯邻二甲苯等，这些化学物质在危害生态环境时，也干扰了生化处理系统中微生物的正常生长代谢。在石化废水活性污泥样品的总DNA提取及其扩增过程，这些有毒物质会不同程度地影响DNA的纯度，同时会抑制后继链式聚合酶反应产生。因此，本试验在提取DNA的过程中，经过PBS的洗脱，降低背景值，并用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），氯仿：异戊醇（24：1），乙酸钠（3mol/L）分三步对初步提取的DNA反复提纯。DNA提取过程参考第2章试验方法。不同温度及苯酚浓度活性污泥共14个样品。提取方法详见2.2.4.1细菌基因组总DNA的提取。提取后的DNA经琼脂糖电泳检测后，条带亮度较高，获得了较高的DNA量（见图5-1），可以直接用于PCR扩增。-53-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文图5-1提取样品DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱表5-1DNA琼脂糖凝胶电泳图谱各泳道样品次序（与PCR及DGGE次序相同）条带样品0Marker125℃水样+TF1+TF2+污泥+400mg/l苯酚225℃水样+TF2+污泥+400mg/l苯酚325℃水样TF1+污泥+400mg/l苯酚425℃水样+污泥+400mg/l苯酚525℃水样+TF1+TF2+污泥+200mg/l苯酚625℃水样+TF2+污泥+200mg/l苯酚725℃水样+TF1+污泥+200mg/l苯酚825℃水样+污泥+200mg/l苯酚915℃水样+TF1+TF2+污泥+200mg/l苯酚1015℃水样+TF2+污泥+200mg/l苯酚1115℃水样+TF1+污泥+200mg/l苯酚1215℃水样+污泥+200mg/l苯酚13TF114TF2-54-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1微生物16SrDNA（V3区）的扩增对提取出的DNA做PCR扩增，为减少PCR扩增过程中非特异性条带的产生，采用对大多数细菌和古细菌的16SrDNA基因V3区扩增的通用引物对534RGC:(5′CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，341f:(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)。25μl的PCR反应体系组成如下：2.5u的10×PCRbuffer（withMgCl2）；0.2μl的Tap；dNTP2u；样品DNA1u；引物534RGC1u、341f1u；BSA0.2；ddH2O1.2.1uPCR反应条件及扩增策略为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；72℃最终延伸20min。4℃保存，PCR反应的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图5-2所示，表明PCR扩增获得了高质量、特异性强产物，扩增产物可直接作为DGGE分析的样品。图5-2PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱Marker为DL2000，样品PCR产物上样量各5ul1.2变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）作为一种指纹分析技术，具有可重复性，快速和操作简单等特点，其通过对核酸片段的分析进行微生物群落研究，可以实时动态监测非培养细菌及功能基因，近年来再分子微生态方面得到了广泛的应用。DGGE可很好地鉴别复杂的16SrDNA样品，条带的多寡可以反映出系统中群落的多样性，条带信号的强弱，可反映相对的数量。因此可以根据条带信息确定不同活性污泥中所含微生物OTU和数量之间的关系。得出微生物多样性的信息。通过从不同温度及苯酚浓度的样品中提取总DNA，对细菌群落进行DGGE指纹分-55-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文析，以获得不同样品中细菌构成和结构功能及动态变化规律，从而确定对含酚废水进行生物强化后微生物群落变动规律。PCR扩增产物用1%琼脂糖进行凝胶电泳，取15ul纯化后的PCR产物在DGGE电泳仪上进行电泳，变性梯度为30%-60%，电压为110V，电泳时间为9h，温度恒定为60摄氏度。电泳结束后，对凝胶进行银染，待凝胶显色后去离子水洗涤数次后于ImageScannerⅢ透射扫描仪下成像检测。1.1DGGE图谱的细菌多样性统计分析在ScannerⅢ凝胶成像系统下，使用quantityoneV4.52（Bio-rad，USA）软件对银染的DGGE凝胶进行成像，在12条泳道上共观察到25条不同的条带，见图5-3；图5-4是根据凝胶成像系统的成像照片，经过软件和人工分析后绘制的DGGE图谱示意图，简洁的描述了各条带的相对强度和分布。图5-3PCR产物的DGGE凝胶图5-4PCR-DGGE图谱条带分布相对强度示意为了解微生物种群在反应系统中的动态变化，对DGGE条带图谱进行了统计分析，着重讨论各种环境下细菌种群的丰度和相关性[84]，其中，丰度分析以图谱中所有条带为1，不同环境下细菌种群丰富度值为改条件下样品条带数除以DGGE图谱中的条带总数（统一位置的条带只算一条）。RSi=Li/LY式中，RSi为第i泳道细菌种群丰富度值；Li第i泳道条带的数目；LY为DGGE图谱中条带总数。相关性分析主要分析不同条件下细菌种群的相似性，2条带之间的相似性系数可用公式计算为：CSAB=2LAB/(LA+LB)*100式中，CSAB为泳道A和泳道B之间的相似系-56-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文数；LAB为泳道A和泳道B上相同的条带数；LA为泳道A上的条带数；LB为泳道B上的条带数，见表5-2。表5-2不同条件下细菌种群相似系数Lane1234567891011121100.027.949.230.744.128.869.749.261.528.316.517.0227.9100.041.758.742.316.828.513.920.016.117.332.7349.241.7100.038.364.112.645.335.220.015.520.54.8430.758.738.3100.039.517.843.637.219.219.422.040.3544.142.364.139.5100.034.745.333.830.521.613.212.1628.816.812.617.834.7100.022.721.534.915.929.518.2769.728.545.343.645.322.7100.051.731.533.117.623.3849.213.935.237.233.821.551.7100.027.315.88.325.5961.520.020.019.230.534.931.527.3100.021.213.917.31028.316.115.519.421.615.933.115.821.2100.015.128.91116.517.320.522.013.229.517.68.313.915.1100.06.51217.032.74.840.312.118.223.325.517.328.96.5100.01.1相同温度及苯酚浓度下微生物群落结构分析选取25℃，苯酚浓度200mg/L反应系统中的活性污泥，进行DGGE分析。条带5到8的丰富度值见表5-3：表5-325℃苯酚含量200mg/L条件下细菌群落丰度值指标5678条带数11875RS0.440.320.280.20根据表5-2及表5-3，发现第8泳道的条带数目最少，RS值小于同等条件下其他泳道，且CS85、CS86、CS87值也不高，说明在没有进行生物强化的反应体系中微生物的种群相对较少，这是因为石化废水中含有苯酚，其具有毒性和腐蚀性，对土著微生物具有毒害作用，所以使得体系中土著微生物种类减少，代谢活动减弱。研究发现未经生物强化的含酚废水处理体系的出水苯酚含量有所下降，表明土著微生物中具有一定的能够降解苯酚的微生物种类，但其苯酚降解能力较低，当体系中存在其他底物时，优先利用其他底物，只有当其他营养成分不足时，经诱导作用，可以激活苯酚降解酶，分解苯酚供自身生长。由于向含酚废水处理系统中投加了苯酚降解菌TF1、TF2，对废水进行生物强化作用，DGGE指纹图谱表明经生物强化作用处理的废水体系中，微生物种群数量都有所增加，其种群丰度值同时加大，且CS68为21.5、CS78为51.7，数值偏-57-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文低，说明微生物种类也发生了较大变化。其中投加TF1与TF2复配菌剂的处理系统种群丰度增长尤其明显，达到了0.44，大于经TF2处理系统的0.32及TF1处理系统的0.28；其CS58值为33.8，介于CS78与CS68之间。原因在于，经TF1和TF2共同处理的废水，苯酚降解率提高（详见第四章），解除了苯酚对一部分土著微生物的毒害作用，指纹谱带增多；且当这两株苯酚降解菌投加到废水处理系统中，较好的融入到原有的微生物生态结构中，由于其优先降解苯酚的特性，使得其与土著微生物很少甚至不发生竞争关系，同时存在土著微生物利用其次级代谢产物的可能，使得生态系统区域稳定，微生物种群数量增加。经TF1与TF2各自生物强化的处理系统的微生物种群数量和丰度亦有所增加，介于复配菌剂强化和原始反应系统之间，可能因为TF1和TF2对苯酚都具有降解作用，但单独投加的菌种生存、降解能力受到环境影响较大，水平较低，使得系统中苯酚含量偏高，所以只解除了苯酚对小部分土著微生物的限制作用，使得微生物群落数量增加有限。根据表5-2可知，TF2强化系统中的细菌种群数量及丰度多于TF1，说明TF2更适应于自然条件下对苯酚的去除。且CS78高于CS58和CS68，说明经TF1强化后的系统中微生物种类与原始系统最为相似。1.1相同温度不同苯酚浓度下微生物群落结构分析选取25℃，苯酚浓度分别为200mg/L和400mg/L反应系统中的活性污泥，进行DGGE分析。条带1到8的丰富度值见表5-4：表5-425℃下苯酚含量200mg/L和400mg/L条件下细菌群落丰度值指标12345678条带数956510875RS0.360.200.240.200.440.320.280.208泳道与4泳道的R值相同，但CS48值为37.2，说明在提高苯酚浓度的前提下，二者的微生物群落丰度虽然相同，群落构成却有较大差别。原因可能在于，高苯酚浓度对系统中土著微生物中的优势种群影响较大，使得种群发生演替现象，原有的具有苯酚降解能力的非优势种群趋于主导地位，而不具备苯酚降解能力的细菌由于不适应新的环境而被淘汰。泳道5在相同温度、不同苯酚浓度的条件下群落丰度最大，略高于泳道1，说明提高苯酚浓度，对经复配菌剂强化的含酚废水处理系统中微生物群落丰度影响不大，其原因可能在于，所提高的苯酚浓度（400mg/L）仍在复配菌剂的处理能力之内，所以能够有效地对苯酚进行降解，使微生物群落丰度维持在一个相对稳定的水平。但CS51值较低，仅为44.1，说明较高的苯酚含量对系统中微生物的群落-58-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文构成产生了一定的影响，一方面，高苯酚浓度进一步降低了土著微生物中非苯酚降解菌的生态地位，抑制了其生物活性；另一方面，使得体系中具有苯酚降解能力的细菌得到了驯化，从而适应了高苯酚浓度的环境，生态位发生迁移，取代了体系中原有微生物的主导地位，成为体系中的优势微生物。经TF1、TF2分别强化的废水处理系统，微生物群落丰度介于复配菌剂强化系统和非生物强化体系之间，表明TF1、TF2单独作用下虽然可以对苯酚产生降解效果，但降解能力不高，使得原土著微生物受苯酚抑制水平较高，从而种群相似度和微生物群落丰度偏低。1.1不同温度、相同苯酚浓度下微生物群落结构解析选取15℃和25℃下，苯酚浓度分别为200mg/L反应系统中的活性污泥，进行DGGE分析。条带5到12的丰富度值见表5-3：表5-5不同温度下苯酚含量200mg/L细菌群落丰度值指标56789101112条带数108758865RS0.440.320.280.200.320.320.240.20泳道8与泳道12的群落丰度相同，但CS812为25.5，表明二者群落构成差异较大，主要是由于温度的不同，使得微生物的分布及群落构成，代谢活性均受到不同程度的影响，在15℃下，苯酚处理系统中，土著微生物中低温菌处于生态位的主导地位，而功能菌受到低温限制，生长活动、代谢能力下降，从而在系统中处于次级地位；此外，由于系统内存在一定浓度的苯酚，也会对微生物的群落构成造成一定影响。所以，分析系统中占主导地位的微生物应为低温苯酚降解菌。泳道9的微生物群落丰度远低于同是强化菌剂处理的泳道5，分析原因在于，低温限制了TF1和TF2的生物活性，降低了其苯酚降解能力，泳道9所代表的生态系统中苯酚得不到高效降解，导致系统中苯酚含量偏高，从而对土著微生物造成影响，进一步作用于系统中微生物群落，使之发生改变。此外泳道6、10，泳道7、11在微生物群落丰度上变化不大，但CS610为1.2.1、CS711为17.6也表明温度对系统中微生物群落构成影响很大。本章小结对强化菌剂处理系统的微生物群落结构进行PCR-DGGE分析，数据表明无论温度及苯酚浓度是否发生变化，强化菌剂处理系统的微生物丰度都达到了最高水平。且与未经过生物菌剂处理系统相比，其微生物种类构成也发生了较大变化，-59-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文结合其对苯酚及COD降解效果和出水中有机物的种类变化综合分析，表明生物强化作用对含酚废水处理效果十分显著。-60-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文结论针对含难降解有机污染物的工业含酚废水构建了高效的苯酚降解菌剂，并采用其对复杂含酚石化废水处理的可行性和稳定性。本研究系统地考察了不同条件下生物强化体系对含酚废水生物降解性能的变化，同时利用现代分子生物学手段对生物强化废水处理体系的微观结构进行解析，阐明了生物处理体系宏观功能与微观结构之间的内在联系，为生物强化体系工程实际应用提供科学依据和理论支持。本文主要结论如下：1、对脱酚菌TF1和TF2进行了多相分类分析，结果表明，菌株TF1与菌株Alcaligenessp.（AY346138）相似性99%，TF2菌株与菌株与Acinetobacterxiamenensis（EF030545）的相似性97%，综合上述两株菌的形态观察、生理生化分析和脂肪酸分析，将TF1菌株归结为Alcaligenessp.，TF2菌株归结为Acinetobactersp.。2、对脱酚菌TF1和TF2进行生理生化特性研究，表明两株菌对苯酚都有较强的降解能力，二者均能在20h内将110mg/L苯酚完全降解，其中TF2在11h内的对苯酚的降解能力明显高于TF1。温度发生变化时，TF1的苯酚降解率比TF2受到的影响较大。在系统中存在外加碳源的时，TF1对苯酚的降解情况有很大的差异，而TF2则几乎没有受到其它物质的干扰。在对系统中COD去除方面，TF1在25℃-35℃的降解效果很好，TF2在20℃-30℃的范围内降解效果很好。存在外加碳源时，系统中COD都呈现减小的趋势，而且在36h时最终的COD均是没有任何外加物的无机盐培养基最小。3、通过正交试验确定TF1的最佳生长条件为：温度为25℃，PH为7，初始苯酚浓度100mg/L，rpm140，起始接菌量为10%，；TF2的最佳生长条件为：温度25℃，PH为9，苯酚初始浓度为100mg/L，rpm100，起始菌量为2%。4、采用单菌株生态组合，复合构建的方式进行高效苯酚降解菌剂的构建，根据苯酚及TOC的去除情况，确定脱酚菌TF1和TF2最佳的复配比例为2.33:1，以该比例复配下的强化菌剂在8h内可将120mg/L的苯酚基本去除。5、对强化菌剂的应用效果进行分析，数据表明无论温度及苯酚浓度是否发生变化，强化菌剂对苯酚及COD的处理效果都达到了最高水平。出水中有机物的种类已由未进行生物强化的68种减少到经过强化处理后的32种。经过生物强化处理后水样中长链烷烃的含量大幅度下降，同时苯系类、酯类和醛酮类物质几乎全部被去除，有机物的数量也减少了约50%左右。6、对强化菌剂处理系统的微生物群落结构进行PCR-DGGE分析，数据表明-61-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文无论温度及苯酚浓度是否发生变化，强化菌剂处理系统的微生物丰度都达到了最高水平。且与未经过生物菌剂处理系统相比，其微生物种类构成也发生了较大变化，结合其对苯酚及COD降解效果和出水中有机物的种类变化综合分析，表明生物强化作用对含酚废水处理效果十分显著。建议:1、对微生物群落变化采用定量的方法进行研究，采用生物强化技术和载体固定化技术扩大利用优势功能菌群，为生物强化技术的推广应用奠定坚实的理论基础；2、从蛋白质组学、酶学角度研究功能微生物高效降解污染物的的代谢机制，及改变环境条件对酶活和蛋白表达的影响，为维持微生物生长，维持正常代谢活性提供必要条件，为处理系统的稳定运行提供一种工艺参数。-62-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文参考文献1.1国家环境保护总局.2004年中国环境状况公报.环境保护.2005,6:11~271.2中国工程院“东北水资源”项目组.东北地区有关水土资源配置生态与环境保护和可持续发展的若干战略问题研究.中国工程科学.2006,8(5):1~241.3M.Wiyada,D.Saovanee.BiodegradationofLipid-RichWastewaterbyaMixedBacterialConsortium.InternationalBiodeteriorationandBiodegradation.2002,50(2):101~1051.4张芳西.含酚废水的处理与利用[M].北京：化学工业出版社,1983,1-10.1.5刘琼玉,李太友.含酚废水的无害化处理技术进展[J].环境污染治理技术与设备.2002,3(2):62-661.6贾太轩,冯世宏,杜惠玲.含酚废水的氧化法处理[J].天津化工,2005,19(2):12-141.7蒋展鹏.环境工程学[M].北京:高等教育出版社,19921.8夏北成.环境污染物生物降解[M].北京:化学工业出版社,2002.1.9尹军,韩相奎,周春生等.流化式生物膜法处理含酚废水的效能[J].环境科学,1996,17(1):60-62.1.10安林坤,马林,全军民等.固定化酪氨酸酶去除水中酚及胺类物质的研究[J].中山大学学报(自然科学版),2000,39(5):63-67.1.11叶鹏,张剑波,陈嵩等.固定化辣根过氧化物酶催化去除五氯酚[J].中山大学学报(自然科学版),2005,41(6):918-925.1.12魏远隆,安春江,席淑琪等.固定化微生物法处理含酚废水的研究[J].南京理工大学学报,2005,29(3):326-329.1.13WatanabeK,HinoS,TakahashiN,etal.Effectsofexogenousphenol-degradingbacteriaonperformanceandecosystemofactivated-sludge[J].JournalofFermentationandBioengineering,1996,82:291-297.1.14EvansWC.Oxidationofphenolandbenzoicacidbysomesoilbacteria[J].BiochemicalJournal,1947,41(3):373-382.1.15HenryF,SmythJR.Evaluationofsomefactorsinfluencingthephenolresistanceofstaphylococcusaureus[J].JournalofBacteriology,1934,27:333-3411.16BergerH,WyssO.Studiesonbacterialresistancetoinhibitionandkillingbyphenol [J].JournalofBacteriology,1952,65:103-109.1.17HamdyMK，SherrerEL，RandlesCIetal.Somecharacteristicsofaphenol-oxidizingPseudomonas[J].JournalofBacteriology,1955,4:71-75.1.18HenryHT,CecllWC,PaulWK.Microbialmetabolismofaromaticcompounds.Decompositionofphenoliccompoundsandaromatichydrocarbonsbyphenol--63-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文adaptedbacteria[J].JournalofBacteriology,1964,87:910-919.1.1FeistGF,HegemanGD.PhenolandbenzoatemetabolismbyPseudomonasputida:regulationoftangentialpathway[J].JournalofBacteriology,1969,100(2):869-877.1.2NeujahrHY,LindsjoS,VargaJ.Oxidationofphenolsbycellsandcell-freeenzymesfromCandidatropicalis[J].AntonievanLeeuwenhoek;JournalofMicrobiology,1974,40:209-216.1.3NeujahrHY,andVargaJM.Degradationofphenolsbyintactcellsandcell-freepreparationsofTrichosporoncutaneum[J].EuropeanJournalofBiochemistry,1970,13:37-44.1.4Sala-TrepatJM,EvansWC.ThemetacleavageofcatecholbyAzotobacterspecies.4-Oxalocrotonatepathway[J].EuropeanJournalofBiochemistry,1971,20(3):400-413.1.5StanierRY,OmstonLN.Thebeta-ketoadipatepathway[J].AdvanceinMicrobialPhysiology,1973,20(3):400-413.1.6KkorJ,OlsenRH.CompletenucleotidesequenceoftbuD,thegeneencodingphenol/cresolhydroxylasefromPseudomonaspickettiiPKO1,andfunctionalanalysisoftheencodedenzyme[J].Journalofbacteriology,1992,174:6518-6526.1.7KimIC,OrielPJ.CharacterizationoftheBacillusstearmophilusBR219phenolhydroxylasegene[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1995,61(4):1252-1.2.11.3.1MunneckeDM,HsichDP.Pathwayofmicrobialmetabolismofparathion[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1976,31:63-69.1.3.2SpainJC,WyssO,GibsonDT.Enzymaticoxidationofp-nitrophenol[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication,1979,88:634-641.1.3.3HammeLF,KirkLL,AppseSMetal.Degradationandinductionspecificityinactinomycetesthatdegradep-nitrophenol[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1993,59:3505-3508.1.3.4PatelRN,HouCT,FelixAetal.Catechol1,2-dioxygenasefromAcinetobactercalcoacticus:purificationandproperties[J].JournalofBacteriology,1976,127(1):536-544.1.3.5GaalA,NeujahrHY.MetabolismofphenolandresoricinolinTrichosporon cutaneum[J].JournalofBacteriology,1979,137(1):13-21.1.3.6BagdasarianM,TimmisKN.Hostvectorsystemsforgenecloningin Pseudomonas[J].CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,1982,96:47-671.3.7BagdasarianM,TimmisKN.Hostvectorsystemsforgenecloningin Pseudomonas[J].CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,1982,96:47-671.3.8EllenLN,OrnstonNL.CloningandexpressionofAcinetobactercalcoaceticus-64-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文catechol1,2-dioxygenasestructuralgenecatAinEscherichiacoli[J].JournalofBacteriology,1986,168(2):815-820.1.1GhosalD,YouIS,ChatterjeeDKetal.Genesspecifyingdegradationof3-chlorobenzoicacidinplasmidspAC27andPjp4[J].TheProceedingoftheNationalAcademyofScience,1985,82:1638-1642.1.2HarayamaS,RekikMW,RoseKetal.Characterizationoffivegenesintheupper-pathwayoperonofTOLplasmidpWW0fromPseudomonasputidaandidentificationofthegeneproducts[J].JournalofBacteriology,1989,171(9):5048-1.2.11.3.1MullerC.CarboncatabolicrepressionofphenoldegradationinP.Putidaismediatedbytheinhibitionoftheactivatorproteinph1R[J].JournalofBacteriology,1996,178(7):2030-2036.1.3.2JeromeJK,RonaldHO.Molecularcloning,characterization,andregulationofaPseudomonaspickettiiPKO1geneencodingphenolhydroxylaseandexpressionofthegeneinPseudomonasaeruginosaPAO1c[J].JournalofBacteriology,1990,172(8):4624-4630.1.3.3QuentmeierA,FriedrichCG.Transferandexpressionofdegradativeandantibioticresistanceplasmidsinacidophilicbacteria[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1994,60:973-978.1.3.4MutzelA,ReinscheidUM,AntranikianGetal.IsolationandcharacterizationofathermophilicBacillusstrain,thatdegradesphenolandcresolsassolecarbonsourceat70℃[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1996,46:593-596.1.3.5HintereggerC,StreichsbierF.Halomonassp.,amoderatelyhalophilicstrain,forbiotreatmentofsalinephenolicwastewater[J].BiotechnologyLetter,1997,19:1099-1102.1.3.6KanekarPP,SarnaikSS,KelkarAS.BioremediationofphenolbyalkaliphilicbacteriaisolatedfromalkalinelakeofLonar,India[J].JournalofAppliedMicrobiology,1999,85:128-133.1.3.7OnyskoKA,BudmanHM,RobinsonCW.EffectoftemperatureontheinhibitionkineticsofphenolbiodegradationbyPseudomonasputidaQ5[J].BiotechnologyandBioengineering,2000,70:291-299.1.3.8AndrewSW,MarkJB.Bacterialcommunitystructureandphysiologicalstatewithinanindustrialphenolbioremediationsystem[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2000,66(6):2400-2407.1.3.9HéctorL,Ayala-del-Río,StephenJetal.Correspondencebetweencommunitystructureandfunctionduringsuccessioninphenolandphenol-plus-Trichloroethene-fedsequencingbatchreactors[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2004,-65-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文70(8):4950-4960.1.1StephenTLT,BenjaminYPM,AbdulMMetal.Comparingactivatedsludgeandaerobicgranulesasmicrobialinoculaforphenolbiodegradation[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2005,67:708-713.1.2ArutchelvanV,KanakasabaiV,NagarajanSetal.Isolationandidentificationofnovelhighstrengthphenoldegradingbacterialstrainsfromphenol-formaldehyderesinmanufacturingindustrialwastewater[J].JournalofHazardousMaterials,2005,B127:238-243.1.3TsaiSY,JuangRS.BiodegradationofphenolandsodiumsalicylatemixturesbysuspendedPseudomonasputidaCCRC14365[J].JournalofHazardousMaterials,2006,B38:125-132.1.4BaiJ,WenJP,LiHMetal.Kineticmodelingofgrowthandbiodegradationofphenolandm-cresolusingAlcaligenesfaecalis[J].ProcessBiochemistry,2007,42:510-517.1.5Salmerόn-AlcocerA,Ruiz-OrdazN,Juárez-RamírezJetal.ContinuousbiodegradationofsingleandmixedchlorophenolsbyamixedmicrobialcultureconstitutedbyBurkholderiasp.,Microbacteriumphyllosphaerae,andCandidatropicalis[J].BiochemicalEngineeringJournal,2007,37:201-211.1.6S.E.Fantroussi,SpirosN.Agathos.IsBioaugmentationaFeasibleStrategyforPollutantRemovalandSiteRemediation?CurrentOpinioninMicrobiology.2005,(8):268~2751.7C.Y.Young.TheUseofEnzymesandBiocatalyticAdditivesforWastewater TreatmentProcess.WaterPollutControlFedHighLights.1976,(13):51.8H.Dave,C.Ramakrishna,B.D.Bhatt,etal.BiodegradationofSlopOilfroma PetrochemicalIndustryandBioreclamationofSlopOilContaminatedSoil.WorldJ MicrobiolBiotechnol.1995,(10):653~6561.9R.T.Lamar,M.W.Davis,D.M.Dietrich,etal.TreatmentofaPentachloroPhenol andCreosote-ContaminatedSoilUsingtheLignin-DegradingFungusPhanerochaete Sordida:AFieldDemonstration.SoilBiolBiochem.1994,(26):1603~16111.10SalvadorAldrett,S.James,Bonner,etal.MicrobialDegradationofCrudeOilin MarineEnvironmentsTestedinaFlaskExperiment.Wat.Res.1997, 31(11):2840~28481.11MauroFabiano,DanielaMarrale,CristinaMisic.BacteriaandOrganicMatter DynamicsDuringABioremediationTreatmentofOrganic-RichHarbourSediments. MarinePollutionBulletin.2003,(46):1164~11731.12Z.Babu,Fathepure,K.Vijai,etal.BioaugmentationPotentialofAVinylChloride-AssimilatingMycobacteriumsp.,IsolatedFromAChloroethene-Contaminated-66-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文Aquifer.2005,248(2):227~2341.1FedericoAulenta,AnnalisaBianchi,MauroMajone,etal.AssessmentofNaturalorEnhancedinSituBioremediationataChlorinatedSolvent-ContaminatedAquiferinItaly:AMicrocosmStudy.EnvironmentInternational.2005,(31):185~1901.2K.Watanabe,M.Teramoto,S.Harayama.StableBioaugmentationofActivatedSludgewithForeignCatabolicGenesHarbouredbyanIndigenousDominantBacterium.EnvironMicrobiol.2002,(4):577~5831.3N.Boon,E.M.Top,W.Verstraete,etal.BioaugmentationasaTooltoProtecttheStructureandFunctionofanActivatedSludgeMicrobialCommunityAgainsta3-ChloroanilineShockLoad.ApplEnvironMicrobiol.2003,6(9):1511~15201.4S.R.Guiot,B.Tartakovsky,M.Lanthier,etal.StrategiesforAugmentingthePentachlorophenolDegradationPotentialofUASBAnaerobicGranules.WaterSciTechnol.2002,(45):35~411.5C.J.VanderGast,A.S.Whiteley,I.P.Thompson.TemporalDynamicsandDegradationActivityofanBacterialInoculumforTreatingWasteMetal-WorkingFluid.EnvironMicrobiol.2004,(6):254~2631.6E.Silva,A.M.Fialho,I.Sa-Correia,etal.CombinedBioaugmentationandBiostimulationtoCleanUpSoilContaminatedwithHighConcentrationsofAtrazine.EnvironSciTechnol.2004,(38):632~6371.7M.EvaTop,DirkSpringael,NicoBoon.CatabolicMobileGeneticElementsandTheirPotentialUseinBioaugmentationofPollutedSoilsandWaters.FEMSMicrobiologyEcology.2002,(42):199~2081.8金玉洁.基因工程菌对偶氮染料脱色研究.大连理工大学硕士论文.2005,6:56~611.9李环.组合式工艺处理煤气废水的小试研究.哈尔滨工业大学硕士学位论文.2003,3:26~421.10王家玲.环境微生物学.第二版.北京,高等教育出版社.2004:1761.11全向春.生物强化技术及其在废水治理中的应用.环境科学研究.1999,12（3）:22~271.12J.G.Steirt,R.L.Grauford.CatabolismofPentachlorphenolbyaFla2Cobacteriumsp.BiochembiophysBiochembiologyRes.Commun.1986,141:8251.13Gregory,B.Kelvin.BioaugmentationofFe(0)forTheRemediationofChlorinatedAliphaticHydrocarbons.Environ.Eng.Sci.2000,17(3):169~1811.14J.W.Grave,T.W.Joyce.ACriticalReviewofTheAbilityofBiologicalTreatmentSystemstoRemoveChlorinatedOrganicsDischargedbyThePaperIndustry.WaterS.A.1994,20:155~1601.15R.E.Speece.AnaerobicBiotechnologyforIndustrialWastewater.Tennessee:ArchePressPub.1996:123~134-67-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文1.1帖靖玺.生物强化技术处理焦化废水中难降解有机物及其相关性分析.西安建筑科技大学硕士毕业论文.2003,4:32~431.2雷萍,郭爱莲.焦化废水降解的生物强化条件研究.西北大学学报.2000,30(6):511~5131.3E.M.Top,D.Springael,N.Boon.CatabolicMobileGeneticElementsandTheirPotentialUseinBioaugmentationofPollutedSoilsandWaters.FEMSMicrobiologyEcology.2002,(42):199~2081.4T.V.Bathe,M.S.Wuertz,M.Hausner.BioaugmentationofaSequencingBatchBiofilmReactorbyHorizontalGeneTransfer.WaterScienceandTechnology.2004,49(11/12):337~3441.5K.Wantanabe,M.Teramoto,S.Harayama.StableAugmentationofActivatedSludgewithForeignCatabolicgenesHarbouredbyanIndigenousDominantBacterium.EnvironmentalMicrobiology.2002,4(10):577~5831.6马放,任南琪,杨基先.污染控制微生物学试验.哈尔滨.哈尔滨工业大学出版社.2002:53~57,67~84,1051.7《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法[M].北京:中国环境科学出版社,1997,408-410.1.8苏俊峰,马放,侯宁等.活性污泥总DNA不同提取方法的比较.生态环境.2007,16(1):47~491.9ColwellRR.PolyphsictaxonomyofthegenusVibrio:numericaltaxonomyofVibriocholera,Vibrioparahaemolyticus,andrelatedVibriospecies.JBacteriol,1970,104:410-4331.10王显军,肖利萍,姚传忠.从煤气废水污泥中分离的酚降解菌及其特性[J].工业用水与废水,2005,36(2):66268.1.11全向春,施汉昌,王建龙,等.苯酚存在对生物强化系统降解2,42二氯酚的影响[J].环境科学,2003,24(1):75279.1.12WardDM,BatesonMM,WellerR,etal.RibosomalRNAanalysisofmicroorganismsastheyoccurinnature.AdvMicrobEcol,1992,12:219-2861.13PCR-DGGE研究处理垃圾渗滤液序批式生物膜反应器(SBBR)中的细菌多样性.肖勇,杨朝晖,曾光明等,环境科学第28卷,第五期2007年5月-68-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文附录1TF116SrDNA测序结果：GGCTCGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGGATGCTTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCTCTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATCGCAAGACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGCATCCCCTAATACGGGATGCTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGGTGGATTAATTTC-69-n哈尔滨工业大学理学硕士学位论文附录2TF216SrDNA测序结果：GAGGCTCGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGGGAAAGGTAGCTTGCTACTGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACGTTCCGAAAGGAGCGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGA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