alt2gto固定生物膜法焦化废水处理系统群落空间演替模式的系统轨迹分析及应 190页

优秀毕业论文PCR-DGGE图谱进行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)可以对系统的群落空间演替进行系统轨迹分析。使用基于这种系统群落空间演替的系统轨迹分析策略，我们实现了对工业装置的故障诊断和功能恢复，并且通过群落结构的分子分析对故障恢复的机制进行了探讨。具体内容包括四个部分：首先我们把出现故障的废水处理系统作为一个遭到破坏的且需要实施生态修复的生态系统(未知故障系统)，而把回流条件下(回流比3：1)的和不回流条件下的实验室装置分别作为参比系统和已知故障系统，对这三个系统的群落空间演替模式进行了系统轨迹的分析比较。通过系统轨迹的分析比较，发现参比系统有着连续、方向明确的空间群落演替模式而工业装置的空间群落演替A2池以后几乎完全停滞即好氧池的群落结构几乎与缺氧池完全一致。因为好氧池与缺氧池的最大差别在于氧气的供应，所以生物膜没有得到充分的供氧很可能是造成工业装置故障的原因。工程测定的结果进一步说明生物膜供氧不充分是由于曝气装置的安装问题引起的。当所有故障都排出以后，与参比系统相似的空间群落演替模式在工业装置中建立起来。为了找到驱动群落空间演替的重要微生物种群，．我们对参比系统A2池到04池的群落演替轨迹作了PCA载量分析并对主成分载量高的DGGE条带做了鉴定，结果表明Nitrospira属和Thauera属是群落演替中最重要的种群。实时定量PCR的结果表明Nitrospira属取代Thauera属成为群落中的优势种群是正常群落空间演替的主导过程。对废水处理系统时空群落IV精品参考文献资料n优秀毕业论文演替的系统轨迹分析不但可以用来帮助诊断系统故障出现的位置和原因，而且还能帮助我们找到促进系统生态恢复的关键启动条件。通过群落空间演替模式的比较，我们发现在不回流条件下实验室系统中A2池以后的群落空间演替发生了明显迟滞，所以可以通过比较实验室系统在回流(LR)和不回流(LNR)两种操作条件下群落结构的变化来研究回流操作对于系统群落结构的影响。16SrDNAV3PCR-DGGE指纹图谱的聚类分析表明回流会使系统内不同反应器群落之间的相互关系发生改变，其中对A2池的影响最大：回流之前，A2与A。的群落结构基本完全相似(相似性为97％)，而回流以后A2池与ol池的群落结构相似性从回流前的31．8％提高到93％，，这表明回流操作对于废水处理中系统微生物系统的影响是全局性的和整体性。进一步通过比较回流前后A：池16SrDNA克隆文库的组成差别，发现在回流的作用下A2池群落转变的过程中，与Thaueraaromatica和Thiobacillusdenitrificans等相关的反硝化菌取代了与Desulforhabdus属等相关的硫酸盐还原菌成为A2池群落中的优势种群。据文献报道，Thaueraaromatica与芳香族化合物的降解密切相关，因此与Thaueraaromatica相关的种群可能对回流后A2池COD去除能力的大幅提高起了积极的作用。因为不同操作条件下系统内不同反应器群落之间的群落存在不同的相互关系，所以群落时空演替轨迹是研究操作条件对系统群落结构影响的良好工具，对群落结构的优化有着重要的指导意义。为了进一步理解工业装置的故障原因，我们对工业装置和回流条精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文件下的实验室装置02池生物膜的16SrDNA克隆文库作了详细的比较，结果表明工业装置和实验室装置好氧池群落结构存在显著的差别。LR02文库中硝化菌的组成说明Nitrosomonaseuropaea--Ni护osoccusmobilis类群和Nitrospira属的I亚系分别是该工艺条件下重要的氨氧化菌和亚硝酸氧化菌，但是102文库中没有与硝化菌序列相近的克隆，这说!女工业装置硝化菌的种群水平很低，因此导致工业装置的NH3-N去除能力低下。另外，虽然工业装置的COD去除效率要远低于实验室装置，但是与COD降解相关的Thauera属种群在工业装置中的多度(在文库中的比例为10．1％)却要远高于实验室装置(在文库中的比例为3．2％)，这说明工业装置中虽然并不缺乏降解COD的功能种群，但是由于生物膜供氧不足使得这些微生物种群不能高效地降解COD，同时也说明用单一的功能菌群数量来监测系统的功能有可能导致错误的结论，而系统的群落空间演替模式能够更为可靠地反映系统的运行状态。最后，将基于LP-RAPD(LongPrimer-RandomlyamplifiedpolymorphicDNA)的微生物群落探针杂交技术应用于废水处理系统中微生物群落结构动态变化的监测，并据此来寻找与系统功能相关的基因组片段(指纹图谱的条带)。在回流的操作条件下，实验室装置A2池对COD去除的贡献率较不回流条件下提高了6．5倍，与此同时，A2池的LP．RAPD指纹图谱也发生了剧烈的变化。通过群落结构探针杂交找到了一条同源条带，在回流的条件下该条带出现在A2池和O池的指纹图谱中，而在不回流的条件下则仅存在于O池的指纹图谱中。从该条带中克隆到了～条占绝对优势的基因组片段(B3片段)，该基因组片段在GeneBank中没有找到任何同源的DNA序列，这表明B3很有VI精品参考文献资料n优秀毕业论文ABSTRAC可可能是宿主微生物的专一性基因组片段。使用实时定量PCR对该片段的多度进行了测定，结果表明B3片段在A2池的多度在回流条件下是不回流条件下的69倍，而A2池COD去除的贡献率也提高了6．5倍，这说明B3片段的宿主微生物与A2池的COD去除能力相关，同时B3片段在实验装置中的空间分布模式和出现故障的工业装置之间也存在明显的差异，这说明B3片段的分布模式具有对类似系统进行监测的潜力。另外，在今后尝试分离B3片段的宿主时，B3片段还可以提供序列引导的帮助。本研究通过对A1．A2．O固定生物膜法焦化废水处理工业装置和实验室装置群落空间演替轨迹的比较分析，找到了工业装置的故障位置和原因，成功地对工业装置进行了功能恢复。微生物群落时空演替模式作为工程化微生态系统的重要属性，对其进行的系统轨迹分析在废水生物处理系统的优化和控制中都有重要的指导意义。关键词：焦化废水，A1．A2．O，固定生物膜，群落空间演替，系统轨迹分析，生态恢复，功能相关种群精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文SystemTrajecotryAnalysisforSpatialCommunitySuccessionandItsApplicationinA2／OFixedBiofilmProcessforCokingWastewaterTreatmentABSTRACTWastewatertreatmentplant(WWTP)isallengineeredmicrobialecosystemoftenconsistedofseveralreactorswithcomplementaryfunctionstoeachother,suchasthewidelyusedAnaerobic-·Anoxic··Oxic(Al-A2—0)process．RelationshipsandinteractionsamongreactorsdeterTainespatialortemporalcommuni莎suocessionpatternsof彤}仃Pwhichiscloselyrelatedtotheperformanceofwholesystems．PreviousstudiesfocusonanalysisofcommunitystructureofindividualreactorsinWWTPs．butfewofthemgiveinsightstointeractionsandrelationshipsamongcommunitiesofallreactorsinonesystem．AnalysisofspatialortemporalsuccessionpatternsinsystemscanhelpUSoptimizethedesignandoperationofWWTPs．VIⅡ精品参考文献资料n优秀毕业论文ABSTR^CTOneindustrialsystemwithAl··A2·-Ofixedbiofilmprocesswasbuiltfortreatingcokingwastewaterbutwithpoorperformanceeversinceitscompletion，ofwhichtheCODandNH3一Nremovalefficiencywasonly54％and一106％duetounknownmalfunction．Todiagnosetheproblemintheindustrialsystemandidentifyconditionsforrecoveringitsnormalfunctions，alabsystembasedonthesameprocesswassetupasareferencewhoseCODandNI-13-Nremovalefficiencywere85％and95％respectively．Systemtrajectoriesforspatialcommunitysuccessionpatternscanbedisplayedintwo·dimensionspacebyPCAanalysisofthe16SrDNAV3PCR-DGGEfingerprintsofallreactorsinA1一A2·Osystems．ThisstrategybasedonsystemtrajectoriesforspatialcommunitysuccessionpaRemshasbeenusedasapowerfultoolforecologicalrestorationofthemalfunctioningindustrialsystem．Therearefourpartsinthisdissertation：Inthefrstpart，weconsideredthemalfunctioningindustrialsystemasadamagedecosystemthatcallsforecologicalrestorationinterventions．Thelabsystemoperatedwithorwithouteffluentrecirculationwasconsideredasareferencesystemorasystemwithknownsystemfault．Systemtrajectoriesofthereferencelabsystemshowedacontinuedsuccessionpatteminwhicheachreactorhasacommunitystructuredifferentfromitsadjacentneighbors．Buttheindustrialsystemrevealeddisruptedsuccession精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文pattemsinwhichthecommunitiesintheA2andOreactorssharedalmostidenticalstructures，whichWaSmostlikelyduetoinadequateaerationinOreactor．Engineersfinallyfoundthefaultindesignandinstallmentoftheaerationsystemin0reactors．Afterrenovationofallmalfunctions，theindhstriatsystemrecovereditsfullfunctionandthespatialcommunitysuccessionpattemverysimilartothatofthereferencesystemwasCOnCBITelltlyestablishedinitaswell．IdentificationofkeypopulationsbasedonPCAloadingsanalysisofsystemtrajectoryofthereferencesystemsuggestedthatThaueraandNitrospirapopulationswerethemostimportantindrivingcommunitysuccessionfromtheA2totheOreactor．Theresultsofreal—timePCRindicatedthatthegradualreplacementofheterotrophicThauerapopulationbyautotrophicNitrospirapopulationinspatialsuccessionfromtheA2tothe04reactoristhegoverningprocessforthissystem．Systemtrajectorganalysisofthespatialcommunitysuccessioni11WWTPcanbeusedtodiagnosewhereandwhymalfunctionsoccurandhelpUSidentifykeyconditionstoprompttheecologicalrestorationofmalfunctioningengineeredmicrobialsystems．Accordingtothesystemtrajectoryanalysis，thespatialsuccessionofthelabsystemwithouteffluentrecirculationwasobviouslydelayedaftertheA2reactor．Therefore，inthesecondpart，effectofeffluentrecirculationoncommunitystructuresofthelabsystemwasstudiedbycomparisonofX精品参考文献资料n优秀毕业论文ABSTRACTthemwith(LRmode)andwithouteffluentrecirculation(LNRmode)Clusteranalysisof16SrDNAV3PCR—DGGEfingerprintingprofilesindicatesthateffluentrecirculationchangestherelationshipamongcommunitiesofindividualreactorsofthesystem，especiallytheA2reactor．Tlaecommunitystructureof'theA2reactorwasshiftedfromone!iketbeAIreactorcommunitytoonelikeOreactorcommunityinresponsetqeffluentrecirculation．Further,thedifferentcompositionof16SrDNAclonelibrariesoftheA2reactorunderLRandLNRmodesrevealedthatduringtheshiftofcommunitystructureoftheA2reactor,denitrifyingpopulationsrelatedtoThaueraaromatica，Thiobacillusdenitrificansandetc．outcompetesulfatereducingbacteriamainlybelongingtoDesulforhabdusgeneraasthemostpredominantfunctionalgroup．Thaueraaromatiea-likepopulationswereuniqueintheirversatileabilitytodegradearomaticcompoundunderanoxiccondition，SOt}leywereassumedtobeactiveinthesignificantimprovementofcontributiontototalCODremovaloftheAzreactorinresponsetoeffluentrecirculation．BecausetherelationshipamongcommunitiesinvolvingWⅥH’Pchangesunderdifferentoperationalmodes，thesystemtrajectoryanalysisforspatialortemporalcommunitysuccessionisagoodtoolininvestigationofeffectsofoperationsonthesecommunitiesinaglobalmodeandthushasgreatpotentialinsludgeoptimizationofWWTP．精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文Tofurtherunderstandthereasonofthemalfunctioningoftheindustrialsystem，16SrDNAclonelibrarieswereestablishedfortheOreactorsoftheindustrialsystem(102)anditslabreference(LR02)．ThecompositionofLR02clonelibraryindicatedNitrosomonaseuropaea——N{打(uoccl昭mobilisandNitrospiragenussublineageIasdominantammoniaoxidizerandnitriteoxidizerinthisprocessrespectively，butclonesrelatedtonitrifyingpopulaionwasundetectedinI02clonelibraryindicatinglownitrifyingpopulationlevelintheindustrialsystemandthusledtolowNH3-Nremovalefficiencyofthissystem．Inaddition，althoughCODremovalefficiencyofthelabsystemwasfarmorethanthatoftheindustrialsystem，theproportionofclonesrelatedtoThaueragenuswaslowerinLR02librarythanthatin102library．TheindustrialsystemwithlowerCODremovalefficiencybuthi曲abundanceofThaueragenus(functionallyimportantpopulationsforCODremoval)wasdue'tothatlowoxygensupplytothebiofilminthe02reactorsmadethesepopulationsfailtoremoveCODin_highefficiency．Thereforeusingtheabundanceofsinglepopulation(group)asanindicatorforthefunctionalstatusofsystemmayleadtowrongconclusionandspatialcommunitysuccessionpattemofthewholesystemaremorereliabletoreflectthefunctionalstatusofWWTP．Finally,LP—RAPD(LongPrimer-RandomlyamplifiedpolymorphieDNA)fingerprinting—basedcommunityDNAhybridizationwasusedto精品参考文献资料n优秀毕业论文ABSTRACTmonitorcommunitystructuraldynamicsandidentifygenomicfragmentswhoseabundanceshiftswereconcomitanttochangesoffuncfionofWWTP．Thehostsofthesegenomicfragmentswerefunctionallyrelevantpopulationsandcabbeusedasindicatororganismsforsystemsmonitoring．ThecontributiontototalCODremovalbytheanoxicreactorincreasedfrom4％inLNRmodeto26％inLRmode．DNAhybridizationrevealedonesignaturebandof2．1kbsharedbytheA2andOreactorsinLRmodebutnotLNRmode．Clonelibraryprofilingofthisbandresultedinonepredominant2．1kbgenomicfragment(B31withnohomologoussequencesinGenBank，whichindicatesthisgenomicfragmentmaybespecificforthehostmicrobe．Real-timePCRindicatedthatcopynumbersofB3intheA2reactorunderLRmodewere69timeshigherthanthatunderLNRmode，concomitanttosignificantincreaseofCODremovalcapacityinthisreactor,whichsuggestedB3hostisafunctionallyrelevantpopulationinA2reactor．ThedifferentpatternsofdistributionofB3inthelabsystemandthecomparablemalfunctioningindustrialsystemdemonstratedthepotentialofthisgenomicfragmentasphysicalmarkersinsystemsmonitoring．Inaddition，thisgenomicfragmentmayallowsequence—guidedisolationofthehostmicrobe．Inthisstudy,themalfunctionoftheindustrialsystemWasdiagnosedanditsfunctionWasrecoveredbasedoncomparisonofspatialcommunity精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文successionpattembetweentheindustrialsystemandthereferencesystemviatrajectoryanalysis．Asanimportantattributionofengineeredecologicalsystem，systemtrajectoryanalysisforspatialortemporalcommunitysuccessionpattemhassignificantpotentialinoptimizationandcontrolofWWTP．KeyWord：cokingwastewater，AI—A2·0，fixedbiofilm，spatialcommunitysuccession，systemtrajectoryanalysis，ecologicalrestoration，functionallyrelevantpopulationsXⅣ精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述人类在几千年前就开始利用微生物来解决环境问题。有证据表明，早在公元前3000年，美索布达米娅人就开始使用废水处理系统来处理生活污水。目前，废水处理工业已经成为全球最为普及、规模最大的生物技术产业，仅就美国而言，在1996年之前，就有15000个废水处理厂；每天处理1000亿升的废水。随着工农业的发展，人口密度逐渐增加，人们对于废水处理过程的稳定性和处理效率提出了更高的要求。在废水处理的生物学本质没有被完全揭示出来以前，人们一直只能把废水的生物处理作为一个化学反应的过程来进行研究。环境化学家Arden和Locker早在1912年就已经注意到了活性污泥和曝气对于废水处理的重要性，但是直到二十世纪五十年代，RossMcKirmey和PerryMcCarty的工作才使人们认识到，深入地研究废水处理的生物学过程是发展更为高效和稳定的废水处理工艺的基础。RossMcKinney的工作加深了我们对于废水处理过程中微生物生态的了解，而PerryMcCarty则从Monod动力学方程和废水生物处理过程的稳定性假设出发，建立了一般的方程来帮助工程人员对废水处理系统进行合理的设计[6，7】。由于实验方法的限制，对于废水处理微生态学的研究在很长一段时间内只能停留在对微生物形态的观察(用显微镜观察生物相)或者对活性污泥或者生物膜中已经得到纯培养的微生物进行研究，但是这两种方法都有着相当大的局限性。首先，仅仅根据微生物的形态特征来对其进行分类是不可靠的。因为丝状菌的大量生长会降低活性污泥的沉降性能而造成污泥膨胀，所以对丝状菌的分类研究是研究污泥膨胀机制的基础。1975年，Eikelboom[8]根据丝状菌的形态对其进行了分类，他首先从1100个活性污泥样品(多数发生了污泥膨胀)中分离到26个类型(type)的丝状菌，然后根据以下特征把这些菌分为7个类群(group)，即(1)衣鞘和粘液；(2)滑行运动；(3)真或者假分支；(4)丝状菌的长短、性质和形状：(5)革兰氏染色；(6)细胞直径、长短和形状；(7)有无包含体(P船，多聚磷酸盐和硫精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文粒)。为了促进对活性污泥中丝状菌的研究，Eikelboom根据自己的研究结果编了一个简单而实用的《活性污泥中丝状微生物检索表》(Identificationkeyoffilamentousorganismsinactivatedsludge)，这样其他的学者就可以对照这张表，把对自己分离到的丝状菌进行分类。虽然Eikelboom对丝状菌的分类在废水处理的微生态研究中得到了广泛应用，但是目前这种仅仅根据形态来对丝状菌进行分类的方法已经受到了很大的质疑。例如，形态类似‘Nostocoidalimicola’的丝状菌在系统发育上至少可以划分为5个不同的fJ，活性污泥中的某些丝状菌在一定的培养条件下，还会丧失丝状的形态特征【l】，其次，目前环境中只有极少数的微生物能够被培养，所以根据培养的结果不能全面反映活性污泥或者生物膜中微生物群落的组成。学者们很早就发现使用显微镜和平扳培养对同一样品中微生物计数的结果存在一个数量级以上的差距，这种差异说明环境微生物群落中极少一部分种群能够得到纯培养【9】。据估计，从活性污泥中分离到的种群仅占群落中所有成员的1％．15％[10]。因此，用依赖培养的研究方法来研究废水处理过程中的微生物群落具有很大的局限性并很有可能得出错误的结论。I．I微生物分子生态学技术的发展微生物分子生态学是最近十几年国际上发展起来的，从基因组的水平上来解析微生物群落结构与功能的学科。因为它突破了很多微生物尚不能被分离培养的技术限制，使我们能够对环境微生物群落中微生物的种类、丰度和分布以及功能进行分析，所以极大地加深了我们对于各种不同环境中微生态学的研究和了解。I．I．1基于PCR的微生物群落分析方法PCR是最早应用于微生物群落结构研究的分子生物学技术，这种方法相对比较简单而且灵敏度极高，可以很容易地从废水处理系统、土壤、人和动物的肠道等几乎所有的环境中扩增得到所研究的微生物类群的特征序列(signaturesequence)。这些特征序列包括16SrDNA／18SrDNA或者是其它特定的功能基因的精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述片段(比如amoA等)，其中16SrDNA／18SrDNA在微生物分子生态中应用最为广泛，这是因为(1)核糖体RNA是蛋白质合成必需的，所以16SrDNA／18SrDNA广泛存在于所有的细胞中，并且结构和功能都是保守的；(2)16SrDNA／18SrDNA的序列中包括保守区和高变区，因此既可以利用保守区域来设计引物，又可以利用高变区来进行序列间的比对；(3)它们的序列变化比较缓慢，而且在原核生物中不发生水平转移，因此16SrDNA之间的序列差异可以反映不同生物之间的进化关系；(4)在GeneBank(http：／／www．ncbi．nlm．nlh．gov／)和RDPII(RibosomalDatabaseProjectII。http：／／rdp．cme．1llSu．edu／html／)数据库中已经登录了大量不同生物的16SrDNA序列，因此知道了16SrDNA的序列信息以后，就可以在上述数据库中进行序列比对，找到这些序列来源微生物的系统发育地位。I．I．I．IDNA指纹图谱变性／温度梯度凝胶电泳(denaturant／temperaturegradientgelelectrophoresisDGGE／TGGE)[1l-13]，单链构象多态性(singlestrandconformationalpolymorphism，SSCP)[14]，末端限制性片段长度多态性分析(TerminalRestrictionFragmentLengthPolymo删sm，T-RFLP)[15-17]等DNA指纹图谱可以把从环境样品中PCR扩增得到的微生物群落中所有种群的16SrDNA片段以指纹图谱的形式展现出来，理论上指纹图谱中每一条带都代表了群落中的一种微生物，而条带的亮度可以与群落中该微生物的多度(abundance)相对应。DGGE／TGGE是目前微生物分子生态学中应用最为广泛的技术之一，它的基本原理是长度相同但是序列不同的16SrDNA片段(代表着不同的微生物种类)解链时需要不同的变性剂浓度或者温度，所以在变性，温度梯度凝胶上有着不同的迁移位置，这样DGGE／TGGE就能够把PCR产物中不同的16SrDNA片段沿着变性剂或者温度梯度分离，形成能够代表微生物群落组成的指纹图谱。以DGGE／TGGE为代表的指纹图谱可以同时快速地对多个环境样品的微生物群落结构进行比较分析，因此非常适合对于环境中微生物群落的变化进行长期监测。LaPara等【18】使用DGGE对一个由七个反应器组成的医药废水处理装置的菌群结构进行了近三个月的监测，结果发现在进水成分相对稳定的条件下，七个反应器的群落结构基本维持稳定。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文同时，通过对环境中微生物群落的长期监控，可以找到与系统功能密切相关的DGGE或者TGGE条带，再通过对条带测序就可以知道该条带所代表的微生物种群。但是单链DNA污染会造成DGGE／TGGE图谱条带割胶测序成功率低的问题，针对这个问题本实验室提出了变性聚丙烯凝胶电泳纯化PCR产物来解决DGGEffGGE中单链DNA污染的方法，这一方法既显著提高了从DGGE或者TGGE中回收条带DNA进行测序的成功率，又明显改善了DGGE／TGGE(银染)图谱的质量1191。随机扩增多态性DNA(randorrdyamplifiedpolymorphieDNA，RAPD)也是一种基于PCR扩增的微生物群落分析方法，它是用基因组扩增下来的片段来作为群落中不同的微生物种群的特征序列。这些不同基因组上扩增得到的片段长短不同，通过琼脂糖或者聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离后形成的指纹图谱就可以来代表微生物群落的结构组成。Wikstroem等【20】将RAPD技术与主成分分析(principalcomponentanalysis。PCA)结合起来比较了在相同接种但是培养基成分不同的摇瓶培养条件下，微生物群落结构的差异并描述了在一个生物反应器中微生物群落随着时间的动态变化。Ouieysse等[2l】在一个批次流加硝酸和苯酚的厌氧反应器中，用RAPD和T-RFLP两种指纹图谱技术对反应器中微生物群落在被驯化的过程中演替的情况进行了分析。他们对这两种方法得出的结论作了比较后发现，这两种方法对微生物群落演替的分析总体上有着类似的结果，即每次流加硝酸和苯酚后微生物群落结构均会发生变化且向着降酚能力更强的方向演替，但是RAPD技术更为快速、简单，对群落结构的变化更为敏感，因此能更好地反映微生物群落结构的变化，而T-RFLP的优点则在于能够从系统发育的角度给出菌群变化的信息。传统的RAPD技术使用一条较短的引物(8一10个碱基1和较低的退火温度(低于40。C)，因此指纹图谱的重复性和稳定性较差。针对这一缺点，Gillings又发展出了所谓的长引物一RAPD(LongPrimerRAPD，LP—RAPD)[221。LP-RAPD使用一对较长的引物(18到24碱基)和较高的退火温度(52"C)，这种LP—RAPD技术与普通的RAPD技术相比，具有图谱稳定、重复性高以及对底物的序列差异敏感性高的优点，并且也能产生多态性丰富的指纹图来反映微生物群落的多样性。Gillings还证实虽然ERIC．PCR在引物设计上针对的是细菌基因组的重复序列，但是基因精品参考文献资料n优秀毕业论文第～章文献综述组中是否存在ERIC元件并不是PCR扩增的必要条件[231，因此ERIC—PCR实际上属于LP—RAPD。本实验室已成功地将ERIC—PCR用于人和动物的肠道[24，251、废水处理系统【26，27】、发酵食品和菌肥等多种微生态系统的群落结构研究。并在Gillings工作的基础上设计出了可用于LP．PAPD的新的长引物，在废水的微生物群落结构分析中也取得了很好的效果[271。1．1．1．2克隆文库技术通过16SrDNA克隆建库的方法可以对环境样品的微生物群落结构进行更为详尽的分析。16SrDNA克隆文库中的每一个克隆都代表了环境中的某一类微生物种群，克隆经过测序和比对，就可以知道该克隆所代表微生物的系统发育地位。文库经过测序以后，相同或相近的克隆可以划分为一个操作分类单元(operationaltaxonomicunit，OTU)，这样理论上不同OTU代表了环境中微生物群落中不同的种群并且OTU的克隆比例代表了种群在群落中的多度，所以整个文库的测序分析结果反映了群落中微生物的组成。1990年，Giovarmoni等[281首先用这一方法分析马尾藻海面浮游微生物的多样性，目前这一方法已经广泛运用于包括土壤、海洋、湖泊、肠道等在内的多种微生态系统的多样性调查，并且揭示了环境中前所未知的微生物多样性[29．311。与DGGE／TGGE为代表的指纹图谱技术相比，16SrDNA克隆建库技术比较耗时、耗力且成本高，但是能够提供环境中微生物群落构成的确切信息。1．1．I．3定量PCR虽然理论上DGGE厂rGGE指纹图谱中条带的亮度和克隆文库中OTU的比例代表了某个种群在群落中的多度，但是由于PCR和文库构建过程中存在一定的偏差，所以这些数据都只是半定量的结果【32】。通过设计专一性的引物和探针，使用定量PCR可以对群落中不同的种群的16SrDNA拷贝数进行精确定量。竞争PCR(competitivePolymeraseChainReaction，cPCR)的原理是在PCR反应体系中加入序列相近、长度不同且拷贝数已知的DNA片段作为内标，在PCR反应结束后，首先用琼脂塘凝胶电泳把目的PCR产物和内标的PCR产物分开，然精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通犬学博士学位论文后根据目的PCR产物和内标PCR产物的相对比例并参照标准曲线就可以计算出样品中目标模板的拷贝数。因为竞争PCR费时费力而且检测的线性范围只有2—3个数量级，所以已经开始被更为简单迅速以及线性范围更宽的实时荧光定量PCR技术所取代。实时荧光定量PCR技术的基本原理是PCR反应的ct值与样品中目标模板拷贝数的对数之间在很大范围内(模板拷贝数的变化范围大于6个数量级)存在简单线性关系．这样利用已知起始拷贝数的标准品作标准曲线就可以确定未知样品中模板的拷贝数。ct值是指PCR过程中的循环数域值，当循环数小于ct值时基本没有PCR产物形成而当循环数大于ct值时PCR产物形成的速度就会急剧增加。实时荧光定量PCR是通过对反应体系中荧光信号的实时监测来测定PCR反应的Q值的。实时荧光定量PCR过程中荧光信号的增量与PCR产物的增量保持同步，所以可以通过PCR过程中荧光信号的变化来实时监测PCR产物的增量，这样就可以通过对荧光信号的变化来测定PCR反应的Ct值。根据荧光信号产生的原理的不同，实时定量PCR一般常用的有3种方法，S'YBRgreenI荧光定量【33]，TaqMan荧光探针定量【4】和MolecularBeacon荧光探针定量[34，35]。SYBRgreenI荧光定量的原理利用了SYBRgreenI荧光染料优先与DNA双链结合并可以激发荧光的原理可以实现PCR过程中荧光信号增加与PCR产物增加的同步。TaqMan荧光探针定量阵了需要在PCR反应体系中加入一对定量引物外，还要额外加入一个特异性的荧光探针(TaqMan荧光探针)。如图l-1所示，TaqMan荧光探针的两端分别标记有荧光基团和一个淬灭基团。因为TaqMan荧光探针较短，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以完整的TaqMan荧光探针是监测不到荧光信号的。在PCR扩增的过程中，TaqMan荧光探针特异地结合到目，标模板与引物结合处的下游，这样在PCR的延伸过程中Taq酶的5’一3’端外切酶活性能将探针酶切降解，使探针的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光信号，并且荧光信号的增加与目标分子PCR产物的增加也是同步的。MolecularBeacon荧光探针定量除了需要在PCR反应体系中加入一对定量引物外，还要额外加入一个特异性的荧光探针(MolecularBeacon荧光探针)。如图6精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述1．1所示，MolecularBeacon荧光探针两端分别标记有一个荧光基团和一个淬灭基团。在不与目标模板结合时，MolecularBeacon能够自发形成茎环结构，使荧光基团和淬灭基团接近而淬灭荧光。当MolecularBeacon荧光探针与目标模板结合时，茎环结构会受到破坏而使得荧光基团和淬灭基团分开，所以探针能够发出荧光。在PCR的过程中，目标模板不断扩增，因而在退火时能够与目标模板结合的MolecularBeacon荧光探针也同步增加，因此荧光信号的增加与PCR削勿的增加也是同步的。SYBRgreenI荧光定量因为不能识别特异性扩增和非特异性扩增产生的荧光增量，所以在引物特异性不是很好的情况下，使用SYBRgreenI荧光定量会产生较大的实验误差。而TaqMan荧光探针定量和MolecularBeacon荧光探针定量，除了引物的结合以外，还需要TaqMan探针或MolecularBeacon探针特异性地结合在目标模板上，才会有荧光增量的产生。因此，在引物特异性不是很好的情况下，TaqMan探针定量和MolecularBeacon探针定量的准确性要高于SYBRgreenI荧光定量。1．1．1．4其它可用于群落结构分析的特征序列除了16S／18SrRNA基因以外，还有其它一些与细菌系统进化相关的基因可以做为研究群落结构的特征序列，包括RNA聚合酶p亚基(RNApolymerasebetasubuniKrpoB)【36]、DNA促旋酶B亚基(DNAgyrase'subunltB，gyrB)【37]、延伸因子G(elongationfactorG，EFG)[38]、延伸因子Tu(elongationfaetorTu，EFTu)[38】以及chaperonin一60(cpn60)『39]。除了以上所提到的与微生物进化密切相关的基因作为特征序列，还可以使用功能基因来研究具有某一类功能的微生物的多样性，比如可以使用氨单加氧酶基因(amoA)来研究氰氧化菌群的多样性[401，用反硝化代谢途径中的一系列基因(narG，nf，丘n／rS或者栅z)来研究反硝化菌群的多样性[41-93]，用苯酚羟化酶大亚基基因序列(LmPH)来研究苯酚降解菌群的多样性[441。7精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文丑出Ⅱ皿功Ⅱ皿图1-1．Taqman探针与MolecularBeacon探针嘉时荧光定量PCR原理图【4】．Fig．1-1．Theprincipleofreal-timePCRwithprobeofTaqmanorMolecularBeacon．1．1．1．5PCR可能出现的偏差以及解决方法虽然基于PCR的方法可以非常灵敏地反映各种环境中微生物群落的结构，但是PCR过程中存在的偏差会给实验室结果带来很多不利的影响。因为使用的是些模板之间序列的相似性很高的混合模板，所以基因组总DNA在16SrDNA扩增时容易出现错误，产生一些在环境扣原本并不存在的“16SrDNA”序列，这些序列统称为artifact，其中chimeria(嵌合体)和heteroduplex(异源双链)对文库的构建影响较大。Chimera是在PCR过程中不同微生物的16SrDNA片段发生共扩增所形成的杂合分子，杂合分子的5’端和3’端分别来自不同微生物的16SrDNA片段[45．47]，这种原始样品中并不存在的嵌合体分子，会使我们过高估计环境中微生物的多样性。Heteroduplex则是指在PCR反应进入平台期以后，由于引物和模板之间的比例急剧降低，造成引物与模板之间退火的几率减小，而序列相近的模板之间退火的几率增加，这些序列相近的16SrDNA分子之间退火就形成了Heteroduplex[45，47-49】。这种Heteroduplex在被克隆转化到大肠杆菌以后，如果大肠杆菌宿主具有针对缺口(nickdirected)的DNA错配修复系统(MutHLS)，就会精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述对缺口进行修复。但是由于Heteroduplex中没有甲基化修饰，所以宿主在修复时不能对Heteroduplex的两条链加以识别，因此修复的结果是在原来的不配对区随机保留Heteroduplex其中一条链的序列，这样就会产生所谓的mosaic序列【49】。以较为简单的情况进行考虑，如果一个Heteroduplex含有三个不配对的碱基，那么修复以后就有可能产生8种不同的mosaic序列，因此Heteroduplex也会使我们高估环境中微生物的多样性。另外，Mutation(突变序列)是另一种对文库的构建也有较大影响的artifact，但它是在PCR的过程中由于TaqDNA聚合酶发生了错误，在新合成的链中掺入了错误的碱基而形成的[45，47]，Mutation同样也会使我们高估环境中微生物的多样性。为了减少PCR过程产生的各种artifact，Qiu等[45】认为减少PCR的循环数和模板浓度，提高延伸时间以及选择适当的DNA聚合酶都有利于mutation、chimera和Heteroduplex比例的降低。同时，一般认为为了减少chimem，还应该在提取环境基因组总DNA时尽量保持基因组DNA的完整【47】。Thompson等[491提出用“ReconditioningPCR'’去除Heteroduplex的方法，简要地说，就是取十分之一的16SrDNAPCR扩增产物作为模板，以与第一轮PCR扩增相同的反应体系和反应条件再次进行第二轮PCR扩增，但是把循环数减少到3个循环。由于在“ReconditioningPCR'’的过程中引物和模板之间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于不同模板之间的退火，所以可以消除Heteroduplex。此外，Qiu等【45】提出聚丙烯凝胶电泳纯化和T7核酸内切酶消化两种方法也可用于去除PCR产物中的Heteroduplex。1．1．2基于杂交的方法1．1．2．1荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescem／nsituhybridization，FISH)法最初用于分子细胞遗传学的研究中，是检测基因谱和染色体畸变及分析基因表达定位的重要工具。1989年，Delong等[501首次把该技术应用于微生物生态学研究并在各种微生态系统中得到了广泛的应用【lO】。在用FISH技术进行微生物分子生态研究时，首先需要把细胞在原位固定并且通透化，然后以荧光标记的种属专～性的16SrDNA寡核苷酸为9精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文探针与靶细胞原位杂交。由于单个活细胞中除了有一个或者多个rDNA拷贝以外，还存在有成百上千的核糖体RNA，它们与荧光探针结合后能够在靶细胞内产生足够的能够在荧光显微镜下观察到的杂交信号。因为FISH避免了DNA提取及随后的PCR扩增过程中所带来的偏差，以及不同微生物基因组中rDNA拷贝数差异的影响，所以FISH是目前微生态学研究当中最为准确可靠的定量技术。FISH还可以提供微生物在环境中的形态以及空间分布的特征信息。对于具有三维结构的样品，可以使用激光共聚焦显微暑掰样品进行观察，或者对样品作切片后并进行观察。此外，FISH杂交后细胞信号的强弱还可以说明细胞内核糖体的数量，因而可以用来反映细胞的代谢是否活跃[511。虽然定量FISH的技术比其它大多数分子生态学技术更为繁琐和复杂，但是随着技术的进步比如半自动化数字系统的出现，都将使得定量FISH技术的使用在微生物分子生态学的研究当中更为普及[52】。1．1．2．2基因芯片(Microarray)基因芯片(Miemarray)技术于1991年首次在Science杂志上被提出[53】。基因芯片属于逆向杂交的方法，它是通过原位合成或直接点样的方法将探针排列在滤膜、硅片、玻璃等介质上形成微阵列，待检样品用同位素或荧光分子标记后，与微阵列杂交，通过扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息。基因芯片解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低和通量低等不足，已经成功地用于微生物纯培养物整体基因表达的研究【54】，并开始有越来越多的学者开始着手将其应用于微生物生态学研究。在研究环境微生物群落时，使用的基因芯片主要有三种：(1)系统进化寡核苷酸探针芯片(phylogenetieofigonucleotidearrays，POA或者称为Phylochip芯片)；(2)功能基因芯片(functionalgenearrays，FGAs)(3)群落基因组芯片(communitygenomearrays，CGAs)【55]。系统进化寡核苷酸探针芯片(Phylochip)中使用的探针是在系统进化框架内设计的，针对不同分类地位微生物的18．25bp的16SrRNA基因寡核苷酸探针。既可以根据16SrRNA基因的保守区设计细菌通用性的探针，也可以根据rRNA基因10精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述的高度可变区设计属或者种特异性的探针[561。但是，因为16SrRNA基因的序列比较保守，所以POAs最为关键的问题是如何保证探针的特异性，即如何区分完全匹配的杂和体和带错配碱基(特别是只有一个碱基错配)的杂和体。DavidStahl组织开展的Phylochip计划对这一问题做了一系列详细的研究[56．60]并取得了理想的效果。他们通过测定每个探针．靶序列杂和体的解链曲线来确定杂交的特异性，结果表明该方法能很好地区分完全匹配的杂和体和带错配碱基的杂和体【57】。功能基因芯片的探针可以有两种类型：50一70个寡核苷酸探针和来自于功能基因的PCR产物(200-1000bp)[55，61]。这些功能基因包括编码参与生物地化循环的功能酶基因，例如参与硝化的氨单氧化酶基因(amoA)，反硝化过程的nirS和nirK基因，氮的固定的固氮酶基因(nif霸)，它们是监测环境中微生物群落、种群功能和生理状态的重要标签。功能基因芯片主要用于环境群落中不同功能群的多样性分析【6l】。群落基因组芯片是利用已经得到纯培养的细菌的基因组作为芯片的探针。虽然我们对于大部分的细菌纯培养物的基因组信息还不完全清楚，但是可以利用这些细菌的基因组作探针做成群落基因组芯片。群落基因组芯片能够用于监测微生物群落的组成，结构和动态变化。群落基因组芯片的特异性可以达到种的水平，但是它的缺点是只能监测可培养的微生物[551。继续提高基因芯片的特异性、灵敏度和定量的能力，是将基因芯片技术应用于环境中微生物群落结构分析的关键[551。1．1．3群落功能的研究方法经过多年的研究，微生态学家已经获得了各种不同环境中大量微生物多样性的数据，目前在RDPII数据库中已经存有大约120000个16SrDNA数据，但是这些数据并不能直接告诉我们这些微生物在环境中所担负的功能(除了硝化菌等生理代谢能力比较单一的微生物种群以外)。因为微生物群落在生物地化循环和生物修复中发挥着非常重要作用，所以近年来关于微生物群落功能的研究得到了非常广泛的关注，并在群落结构和功能之间关系的研究上出现了很多新的研究方法，这些方法总的特点是需要把研究代谢的方法和研究群落结构的方法结合起来。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文1．1．3．1微放射自显影技术(Microautoradiography，MAR)1966年著名的微生态学者ThomasBrock首次把MAR技术引入微生态研究『62]。该方法的原理是让样品在放射性标记的底物中孵育，群落中能够摄入该底物的微生物细胞就会被放射性底物所标记，然后可以通过放射自显影在胶片上记录下被标j己微生物的位置。一般常使用较弱的放射性标记H3、14c和33P。放射性较低的标记物往往能够产生较高的分辨力，例如H3的分辨力可以达到O．5pm，丽“C、33p的分辨力分别为2-3“m，这，洋的分辨能力基本与微生物细胞的大小相当。最开始MAR是与其它较为简单的细胞染色技术结合起来用于微生物群落功能研究的【63—65】，1999年，Lee[66]和Ouvemeyl．67]首次将MAR技术与FISH技术结合起来，发展成MAR-FISH技术，该技术是目前唯一能够在单个细胞的水平上研究微生物种群(探针所限定的种群)在环境中功能的方法【68】，它使人们不但能够在细胞的水平上将细菌的系统发育地位与其对底物的代谢能力联系起来。而且还可以获得这些代谢活跃的微生物种群在样品表面的空间分布特征，如果进一步对样品进行切片就可以得到代谢活跃的微生物种群在整个样品中的空间分布特征【68】。微生物群落在环境中能够利用的底物往往是多种多样的，它们有可能是简单的有机物，也有可能是比较复杂的有机物。在对复杂有机物进行研究时，往往因为缺少这些有机物的同位素标记物而阻碍了MAR-FISH技术在微生态学中的应用。Hesselsoe等[69，70l针对这一问题对MAR-FISH技术作了改进，提出了HetC02．MAR的新方法。其基本原理是：绝大多数异养微生物在利用有机物进行生物合成时都需要通过不同的羧化反应来固定C02，因此通过MAR-FISH技术测定微生物种群固定CO：的情况，就可以知道该种群是否能够利用所研究的有机物作为底物进行生物台成。该方法并不直接标记所测试的有机物而是标记C02，然后让样品与所研究的有机物底物和标记C02(¨C02)共同孵育，能够利用有机物底物的种群就会因为固定14C02而被标记。该一方法另一特点是可以在一般的MAR．FISH方法研究结果的基础上，进一步研究微生物摄取底物后是否将摄入的底物用于生长，其原理是如果微生物只能摄入有机底物而不能将其用于生长，那么它们就不能通过固定¨C02而被标记。例如使用一般的MAR—FISH的方法(使用Hc标记的油酸作底物)仅能直接证明丝状菌Microthrixparvicella在厌氧的条12精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述件下摄取利用油酸[71】，但是不能直接回答这些油酸是否在菌体内被利用或是仅仅作为储能物质。Hesselsoe等【69】使用HetC02．MAR技术发现，Microthrixparvicella在厌氧的条件下不能被14C02标记，这表明虽然Microthrixparvicella在厌氧的条件下摄取了油酸，但它不能利用油酸进行生长。这一新的技术不但扩展了研究未培养的异养微生物对不同有机物代谢研究的能力，而且还使我们能够在单个细胞的水平上区分微生物对不同有机物的摄取、贮存和代谢的能力。但是该技术的缺陷在于不能用于自养菌的代谢研究，并且在研究异养菌的代谢时还需要加入自养菌的抑制剂来避免假阳性的结果。1．1．3．2稳定同位素探测技术(stableisotopeprobing，SIP)SIP是一种高通量的技术，它可以同时对微生物群落中具有特定底物代谢能力的同位群(guild)中的所有种群进行重同位素标记。该技术首先将样品在添加了稳定性同位素标记(13C或者15N)底物的培养条件下孵育一段时间，能够利用这些标记底物的微生物基因组DNA和RNA就会被重同位素所标记。被重同位素标记的基因组DNA(RNA)与未被标记的基因组DNA(RNA)的比重存在足够大的差异，可以通过密度梯度离心将它们分离开[72】。如果分离的是基因组DNA，这种技术就被称为DNA．SIP技术，该技术能够使我们获得群落中利用某一种底物的同位群中所有成员的基因组[73】。以这些被同位素标记的基因组DNA为模板进行PCR，然后再通过16SrDNA克隆文库或者DGGE技术就可以获得该同位群的多样性信息。这些被同位素标记的基因组DNA也可以直接用于元基因组分析，因为获得的基因组全部都来自于某一同位群，所以可以大幅缩小了元基因组的分析范围，有可能获得更为完整的基因组信息[721。如果分离的是RNA，这种技术就被称为RNA．SIP技术【74】。因为RNA的更新速度比DNA快，所以进行标记时所需要的孵育时间比较短，但是RNA的分离要远比DNA困难。首先RNA的分离需要产生足够高的密度梯度(>2．09／mL)，一般的CsCl密度梯度离心不能满足这样的要求，所以需要使用CsTFA密度梯度离心，但是CsTFA密度梯度离心允许的上样量很小，所以RNA．SIP对RNA抽提物的要求很高(比如完整的SSU和LSU分子)。其次，即使经过36．60小时的离心后，轻的RNA(未标记)也只能和重的RNA(标精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文记)相对分开，只有证实在重的RNA部分含量很高而在轻的RNA含量很少或者没有的RNA分子才能认为是真正被重同位素标记的分子，所以一般需要取密度梯度离心的多个连续组分作模板进行16SrDNAPCR-DGGE分析，如果随着密度梯度的增加，DGGE条带的亮度也增加，这才能说明该条带所代表的是能够利用标记底物的微生物[751。实际上MAR-FISH和DNA／RNA-SIP技术各有其优缺点，将它们合理地结合起来使用才能够对微生物群落的功能进行系统的研究。MAR—FISH技术的灵敏度虽然高于DNA／RNA-SiP，并且能够在细胞的水平上进行功能的研究，但是它是一种低通量的技术，如果在对微生物群落的组成特别是同位群的组成缺乏了解之前，就很难将MAR-FISH技术应用于群落功能的研究。而DNA／RNA．SIP虽然是一种高通量的技术，可以得到同位群组成的状况，但是因为DNA侣NA．SIP的结果容易受到cross—feeding的干扰，并且因为标记核酸会受到非标记核酸的污染而有可能产生假阳性的结果，所以使用MAR-FISH技术来对DNA／RNA．SIP得出的结论做进一步的验证也是非常必要的【70】。这种将MAR-FISH技术和DNA／RNA．SIP结合起来系统地对微生物群落的功能进行研究的方法被称为全套的同位素探测技术(full—cycleisotope-probingapproach)【76]。1．1．3．3同位素阵列技术(isotopearray)同位素阵列技术是晦同位素标记技术与microarray技术相结合的一种高通量的群落功能研究方法。该技术首先将样品在添加了放射性同位素标记(如14C)底物的培养条件下孵育一段时间，然后提取群落的rRNA，再将提取的rRNA与荧光染料共价结合，然后让rRNA与设计好的microarray杂交，最后定量读取荧光和放射性信号。这一方法实际上是将放射性示踪技术与mieroarrary技术相结合，它具有两个主要优点：(1)可以在一个芯片上得到微生物群落中能够代谢某一底物的同位群组成信息；(2)放射性信号和荧光信号的比例可以用来反映同位群中不同种群对标记底物的摄取效率f70】。Adamczyk等【77】首次将这一技术用于监控两个硝化污泥中AOB菌群的组成以及固定C02的代谢活性研究，但是同位素阵列技术在环境微生物群落功能研究上的进一步应用必须建立在microarrary技术的不断完善之14精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述_[2170]。1．1．3．4溴脱氧尿苷免疫俘获技术(Bromodeoxyuridine]mmunocapture)该技术首先是用溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine，5-bromo，2’deoxyuridine，BrdU)来标记代谢活跃的微生物种群，然后通过免疫组化的方法检测和分离被溴脱氧尿苷(5一bromo．2'-deoxyuridine，BrdU)标记的基因组DNA[78]。微生物群落中代谢活跃的种群会利用BrdU合成基因组DNA从而被标记。可以用包埋有BrdU抗体的磁珠对这些来自代谢活跃种群且被BrdU标记的基因组DNA进行物理分离，然后分析这些富含BrdU的基因组DNA就可以知道哪些微生物种群是代谢活跃的。A_rtursson等【78】用这种方法分析了内生真菌周围代谢活跃细菌的群落组成，这些与真菌密切相关的细菌能够强化内生菌根对于作物生长的促进作用，然后他们还使用选择性培养基分离到其中一株代谢活跃的细菌Bacillz盯ceFeusVAl。这些以MAR-FISH为代表的技术正在成为微生态研究中调查群落结构与功能关系时不可缺少的工具，恰当地运用这些技术能够将庞大的微生物多样性数据与生态系统的功能联系起来。这些方法的优势在于它们能够正确无误地阐明在不同环境条件下群落中不同种群对底物的摄取、储存和消耗，而这样明确的结论是不能从环境元基因组学、转录组学以及蛋自质组学中直接获得的[70】。1．2废水处理系统中微生物分子生态学研究为了提高废水处理的效率和稳定性，人们对于反应器的设计和操作的优化做了大量的研究。虽然人们很早就知道废水处理过程污染物转化和降解主要是依赖微生物群落来完成的，．但是由于技术方法的限制，在很长一段时间内，人们都只能把反应器中的微生物群落看作是一个黑箱，而把整个污水处理过程看成是一个物理和化学的过程，通过控制和监控反应器的化学参数(比如NH3．N，N03-N，P04一P和溶解氧)和物理参数(比如水力停留时间)，在最低的成本下实现对各种污染物(比如BOD，氮和磷)的达标排放。虽然这样做，在很多情况下能够实现反应器的优化，但是因为没有考虑优化措施对于微生物群落的影响而往往也同时损精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文坏了反应器中正常的微生物群落结构，因此优化的效果往往是短期的。例如，虽然通过对一组物理化学参数的调整往往不难使反应器的BOD去除率达到较高的水平，但与此同时反应器中BOD浓度的降低也增加了因丝状菌的过量生长而导致污泥膨胀发生的可能性【79】，如果不对微生物的群落结构进行优化，放任丝状菌的过量生长，污泥膨胀一旦发生，整个污水处理过程就会发生崩溃。又比如Manefield等【80J分析比较了两个焦化废才(二：业处理装置之间微生物群落的结构。虽然这两个工业装置处理相同的工业废水，反应器的结构和操作也基本相同，但是～个处理效果稳定，而另一个效果下稳定，他们通过使用RNA．SiP技术，找到了这两个反应器群落之间苯酚降解同位群的结构差别。虽然同一种未培养Acidovorax属种群在两个反应器的苯酚降解同位群中都占优势地位，但是在处理效果不稳定的一个反应器的苯酚降解同位群中还含有另外一种优势的苯酚降解种群，它与Acidovorax属亲缘关系也非常近，这种重要同位群结构上的差别很可能与处理装置的稳定性有关。最近几年，人们逐渐认识到在反应器优化的过程中必须要考虑微生物群落结构的优化问题[8l】。但是长期以来我们对于反应器中微生态学的认识都是从纯培养出发的，对于参与废水处理的微生物群落中各个种群的组成、多度、分布以及它们在环境中生理学的特点(ecophysiology,LL如生长动力学和对不同底物的利用和亲和力等)都缺乏全面而正确的认识。这些知识的缺乏，阻碍了我们从微生物的群落结构出发对反应器的设计和操作进行优化。为了实现通过微生物的群落结构的优化出发来进一步提高废水处理的效率和稳定性，以下几个基本的问题研究都是非常关键的[81】。(1)参与废水处理的微生物群落结构是怎样的?它们由哪些种群组成，各种种群在群落中多度如何，它们在环境中如何分布?(2)参与废水处理的微生物群落中各个种群的生理代谢有何特点?在废水处理中担负着怎样的作用?它们在底物利用、比生长速率、菌胶团形成能力、生物膜的附着能力以及对环境条件变化的抵抗能力上有何差别?(3)反应器的设计和操作怎样影响微生物群落的结构和生理代谢功能?(4)如何使用反应器的设计和操作对所需的微生物群落种群进行选择?解决以上问题，必须要将微生物分子生态学和废水处理工程技术结合起来。16精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述同时，解决以上问题对微生物分子生态学提出了巨大挑战，促进了微生物分子生态学技术方法的发展和技术方法之间的相互融合，使得微生态学在高通量化、定量化以及在原位获取微生物种群的表型信息方面获得了长足的进步。1．2．1废水处理系统中微生物群落结构的组成从1995年开始，学者们使用16SrDNA克隆文库的方法对多个废水处理反应器中的微生物群落进行了解析，结果发现Betaproteobacteria纲、Alphaproteobacteria纲、Gammaproteobacteria纲以及Bacteriodetes门和Actinobacteria门的微生物是参与废水处理最为常见的微生物类群(表1．1)【1】。虽然16SrDNA克隆文库能够告诉我们微生物群落是由哪些微生物组成的，但是因为受到PCR扩增偏好性的影响，克隆文库中不同01U所含有克隆的比例只能半定量[82】，而不是完全定量地反映群落中不同种群的多度以及不同种群之间的比例。因此如果要对群落中成员的多度进行精确的定量，目前最为准确的方法是根据克隆文库所提供的16SrDNA序列信息设计探针，通过FISH技术进行定量，同时还可以得到该种群在样品中空间分布情况的信息。如图1．2所示[2】，这种将16SrDNA克隆文库与定量FISH相结合的方法叫做全套的rRNA方法(full—cyclerRNAapproach)。这种全套的rRNA方法比单独使用克隆文库的方法能更加准确地测定微生物群落结构的组成，而且能够得到种群在空间中的分布特征以及细胞的的形态特征。Snaidr[83，84]和Juretschko[85]分别使用这种全套的rRNA方法对处理生活废水和工业废水的反应器中微生物的群落结构进行了较为详尽的研究。Snaidr等人[84J解析了一个处理生活废水装置中好氧池微生物群落的结构。16srDNA克隆文库中52．2％、19．4％、11．9％和6％的克隆分别属于Betaproteobacteria纲、Gammaproteobacteria纲、Epsilonproteobacteria纲和Alphaproteobacteria纲，7．5％的克隆属于低G+C含量的革兰氏阳性菌，此外还有3％的克隆分别属于衣原体门和浮霉菌门。Arcobacter属在文库中有较多的克隆，但它是一种潜在的病原菌，以前从未在废水处理的微生物群落中发现过这个属的微生物。为了进一步证实这一结论，根据其文库中Arcobacter属克隆的16SrDNA序列设计了专一性的探针，使用FISH技术进一步证实了这些菌的存在，但是目前17精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文还不清楚它们在废水处理过程中的作用。表1-1．基于16SrRNA基因对参与废水处理的主要微生物群的统计分析【l】TableI-1．Thestatisticanalysisofmainmicrobialpopulationsinvolvingw蜘atgrtreatmentbasedon16SrRNAgene一—————————生笪『土j苎曼塑坚塑兰型篓L—————————————————一蚴差洲羹薹．i-^{fi繇，口*￡§●^n∞u§i-No0TusCm"(％，n3m拍11回5佃；8-52I∞舯搠51111}Yt8棚22悯52埘4I|J”嚣仲2tHI|l’{”粪函d∞■自■*2‘≈^ad∞∞Ⅻ日5l*5∞4¨4舯日正e，2^∞∞∞m1{1I嘴mm饵擗mm埘溉詈；娜治710旧111'1f1I№Ⅷ2{11日12)*帆目m础r∞日2l''3胁C船咖口㈣1IlI％溜搿粥溜Ⅻmwamom，2f1口蓁2m16‘自，mm讲，boⅫ¨埔㈨m∞m辨僻m㈣mm珊∞西㈣洲啪m渤㈨懈田∞m辩脚∞22●，411fb∞自*Ⅻ槽，OP”111}黜勰苗窖删掰：％嬲：翟浆；毫害：黧!：：孺怒!警。l—eOY。Os’篇篇絮】：罱翟UaaftNt州3mOO潞!：端曼嚣誊黧麓：盛髫嚣驾捌；怎黧茹；鬻：嚣黑：，瀑嗣嚣黜黧怒”*16srR№辅4—矬'm啪蝴鹳crl州搿lT曲-_喇％鲥rr钟1l铀擞————．—-Ih、rln^}黜1Ph、“_≯n，●—————————————一165rDNASrquence,‘‘'‘taparall*tSmⅢ^n■h●h图1-2．全套的rRNA方法原理【2】．Fig．1-2．PrincipleoffullcyclerRNAaproach．18精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述Juretschko等人【85】用半自动(semi—automatic)定量FISH的方法研究了一个以间歇进行硝化．反硝化的操作方式处理炼油厂废水处理装置中微生物群落的结构。16SrDNA克隆文库中30．9％、25．6％，2．1％的克隆分别属于Betaproteobacteria纲，、Alphaproteobacteria纲，、Deltaproteobacteria纲，另外还有16％、11．7％的克隆分别属于绿色非硫菌门和浮霉菌门，其余的克隆分别属于Verrucomicrobia门、Acidobacteria门、Nitrospira门、Bacteroidetes门、Firmicutes门和Actinobacteria门。使用种属专一性或者OTU专一性的寡核苷酸探针，结合激光共聚焦显微镜(eonfocallaserscanningmicroscopy)和数字影像分析(digitalimageanalysis)技术，对群落中不同的微生物种群进行了定量FISH的分析。与克隆文库的结果相似，定量FISH的结果也表明Betaproteobacteria纲是微生物群落中的优势种群，它所占据的体积占了总体积的一半。在Betaproteobacteria纲中，Zoogloea和Azoarcus是最优势的属。因为定量FISH技术非常繁琐和复杂，所以这种全套的rRNA方法在具体研究中还运用得不够普遍。但是半自动化数字系统的出现极大地方便了定量FISH技术的使用，现在已经有越来越多的微生物学家将这一技术应用到废水处理微生态学的研究当中[86-88】。除了对参与废水的整个微生物群落进行分析外，微生态学者们还对参与废水处理的重要功能类群进行了详细的调查研究。氨氧化菌(ammoniaoxidizingbacterium，AOB)和亚硝酸氧化菌(nitriteoxidizingbacterium，NOB)在废水处理过程中分别负责氨的氧化和亚硝酸氧化，共同完成废水处理中的硝化反应【89】。在废水处理中，硝化反应往往是整个工艺中最难以控制的环节，所以反应器微生物群落中AOB和NOB的种群构成是微生态学家和从事废水处理的工程师所共同关心的问题。在分子方法出现以前，根据纯培养的实验结果，人们曾一度认为Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterspp．是参与废水处理硝化过程的主要氨氧化菌和亚硝酸氧化菌，但是在使用微生物分子生态学的方法对多个反应器的硝化菌组成进行研究之后，学者们发现硝化菌的组成和多样性远比人们预想的要复杂得多。研究发现Betaproteobacteria纲的氨氧化菌(9一AOB)是废水处理系统中普遍精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文存在的氨氧化菌，B．AOB又包括Nitrosomonas和Nitrosospira两个属。Wagner等『l，90]基于amoA基因的序列调查了多个废水处理装置中微生物群落中AOB菌群的多样性(表1．2)，共得到了200个amoA克隆。在对实验结果进行了统计分析后发现Nitrosospira属的氨氧化菌仅出现在两个处理市政废水的处理装置中，而Nitrosomonas属的氨氧化菌则在几乎所有的处理装置中都出现，这说明在废水处理这一工程化生态系统中，Nitrosomonas属的种群是最为普遍的氮氧化菌。而在Nitrsomonaz属的氨氧化菌中，除了Nitrosomonaseuropctea以外，还包括NitrosomonaseutmpJm，Nitrosococcusmobilis，Nitrosomonasmarina类群的一些成员以及四个还没有分离培养物的系统发育谱系(Environmentallineage14)，这说明参与废水处理过程的氨氧化菌的多样性远比人们原来认识到的要丰富。如表1-2所示，]V：itrosomonaseuropaea／eutropha类群的氨氧化菌出现次数最高，在所有类型的反应器中都出现；Niwosomonasmarina类群的氨氧化菌的出现次数位居第二，但是绝大多数分布在处理市政废水的活性污泥反应器中；而NitrosomonasNitrosa仅仅出现在处理工业废水的活性污泥系统中，这些统计分析结果说明氨氧化菌群的组成与废水的成分或者处理装置的类型有一定关系。在对NOB类群的早期研究当中，根据纯培养的研究结果，很多学者认为Ⅳj加6伽招r属是参与废水处理的主要亚硝酸氧化菌，但是使用Niwobac陀rspp．专一性的探针却在很多明确存在硝化反应的反应器里没有检测到属于Nitrobacter属的NOB种群[91，92]，因此学者们开始怀疑废水处理中NOB的优势类群很可能是并不属于Nitrobacter属。此后，通过建立16SrDNA克隆文库和FISH的方法[93—97]，学者们发现在多数的废水处理装置中，Nitrospira属才是优势的亚硝酸氧化菌。1998年，Butrell等【93】发现参与废水处理的Nitrospin7属主要可以分为两枝(clade)。2001年，Daims等[97】对数据库中所有与废水处理相关的所有属于Nitrospira属的亚硝酸氧化菌序列以及自己从生物膜中找到的Nitrospira属的序列进行了系统发育分析，结果发现Nitrospira属至少可以分为4个不同的亚系(sublineage)。在此基础上，Daims等人设计了Nitrospira属专一性的16SrRNA寡核苷酸探针，通过FISH技术和共聚焦激光扫描仪，他们发现无论在活性污泥还是生物膜中，Nitrospira属的NOB种群都集结成块(cellaggregates)。他们使用计算机辅助的三维成像系统20精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述技术，把非细胞的部分去掉并进行三维重构，结果发现在这些Nitrospira组成的小块内部由细胞形成了能让水自由通过的网状结构。表l-2．基于amoA基因对参与废水处理的氨氧化菌种群的统计分析【l】TableI-2．ThestatisticanalysisofammoniaoxidizingbacteriainvolvingWastewa：【ertreatmentbasedonamoAgeneHunbN吖am嘲aa-斟I／萌一L／“≮一“r脚¨37●∞葛a呻一25ClonesU。mn一脚2，32S。乙／。絮嚣：铡黑凳{O18—二一2H娜脚20：O一0O一。一5～一2Ⅳ鼬唧f蝌i茹，忡I"湘·3叶H∞m—I”q10；3{13Oa：0—、—一9Ⅳm∞Ima∞8{0．0—弋——。’一，￡舯蝌啪日蜊I*晶矗l～00}2—‘25一j自MⅢmⅧhne”3O{30——L——一7E肿I嘣"铆n■ke柳4OO●一'^b口‘。口∞n甜札IqmdlOOO武／‘*一～309掬er_叫—／Io～昀删神，I啪’舭O19——一2Ⅳ‘MIm”0。0Ot'}l^m口，awa堪}a'tota枷-atnl00OO广——，’五+二二二二二．二～．00OS2289421o·，州0，肾”■o％o柳麓嚣嚣黧黧嚣絮器翁慧嚣旒嚣2盟“·““叫”“486”“。—”“一除了定量FISH技术之外，实时荧光定量PCR技术也是对参与废水处理的微生物群落重要种群进行定量分析的重要技术。使用TaqMan荧光探针和MolecularBeacon荧光探针实时定量PCR技术，Harms等【4】分析了一个处理生活污水的废水处理装置中细菌域(Bacteria)、亚硝酸氧化菌(Nitrospira属)和氨氧化菌(Nitrosomonasoligotropha)的多度，在一年中采集的12个样品中，每升废水中细菌总数为4．3士2．OxlO“，Nitrospira属的总数为3．74-3．2x1010，Nitrosomonasoligotropha的总数为7．5-4-6．0x109。21精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文在不具备定量FISH的实验条件下，可以根据16SrDNA克隆文库的序列组成设计适当的引物用定量PCR对群落中重要种群的16SrDNA拷贝数进行定量，以弥补克隆文库在种群定量方面的不足。刘彬彬等[98】研究了一个处理喹啉的反硝化反应器中，从种子污泥(SS)开始到处理效率稳定后生物膜(DR)中微生物群落的结构变化，Thauera属和Azoarcus属在16SrDNA克隆文库中的比例，从ss克隆文库的4％大幅增涨到DR克隆文库的74％，这说明Thauera属和Azoarcus属可能是降解喹啉的重要种群。为了进一步验证这一结论，又使用SYBRgreen【荧光实时定量PCR舜r这两个属的16SrDNA拷贝数作丫定量测定，结果说明Thauera属和Azoarcus属的多度提高了约lO倍。因为多数原核细胞中都存在多个16SrDNA的拷贝，所以实时定量PCR对16SrDNA的拷贝定量结果不能完全等同于种群的细胞数量，这是该技术相对于定量FISH技术的缺陷。但是，实时定量PCR技术也具有其优点，首先是技术上更为简单，能够快速地对多个样品进行测定【99】，而且随着核糖体RNA操纵子拷贝数据库(TheRibosomalRNAOperonCopyNumberDambase，http：／／rmdb．eme．rosa．edu／rmdb／servlet／eontroller)的完备，还可以进一步把对16SrDNA拷贝数的定量结果换算成对细胞的定量结果。在对反应器群落结构组成有了充分了解的基础上，就可以针对群落中可能存在的所有种群设计相应的探针做成microarray芯片，对反应器中群落结构的变化进行高通量的检测，目前系统进化寡核苷酸探针芯片CPhylochip)在这方面已经有了较为成功的应用。Betaproteobacteria纲中的ghodocyclales目包括了生理功能多样性非常丰富的成员，比如Azoarcus和Thauera属的大多数成员都与反硝化条件下芳香族化合物【100，101]和卤代化合物[102]的降解有关，最近又证明这两个属与反硝化条件下杂环化合物喹啉的降解密切相关【98】。Ginige等【86】发现微生物群落中以乙酸为电子受体进行反硝化的部分重要功能菌群属于Rhodocyclaceae科。实际上，很多废水处理中主要的反硝化种群都属于Rhodocyclales刖85】。此外，Manefield[74]使用RNA—SIP技术证明Thauerasp．也是好氧池中苯酚的主要降解菌。因此监控废水处理的微生物群落结构中Rhodocyclales目的组成对于废水处理系统具有普遍意义。人们通过解析环境中复杂的微生物群落，得到了大量多样性丰富的Rhodocyclales精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述目的16SrDNA序列，这为设计Rhodocyclales目的基因芯片奠定了坚实基础。Loy等[1031根据数据库中所有属于Rhodocyclales目的16SrDNA序列设计了一个含有79个探针的针对Rhodocyclales目的Phylochip芯片(RHC-Phylochip)，并将其成功应用于一个工业废水处理装置中Rhodocyclales目微生物多样性的监测，结果发现，该工业处理装置中Rhodocyclales目的多度与几年前相比下降了很多，所以RHC．Vhylochip只能在较高的系统发育水平上才检出现杂交信号。而如果在用RHC．Phylochip进行检测之前，先针对Rhodocyclales目的进行选择性PCR扩增，芯片的灵敏度就会得到大幅提高，可以检测到多度小于1％的微生物种群。选择性PCR扩增之后芯片检测的结果表明该工业装置Rhodocyclales目的种群结构与几年前相比发生了非常大的变化，这种变化可能是由于工艺条件的变化而引起的。1．2．2废水处理系统微生物群落中不同类群的生理代谢特点使用传统的分离培养方法，必须先从环境中把微生物分离出来，才能进一步对它们的生理代谢特征进行研究。但是由于环境中绝大多数的微生物还不能分离培养，所以对这些未培养微生物生理代谢的研究只能依靠分子生物学的方法来进行。即使对于已经能够分离培养的微生物，由于实验室条件与环境条件的差异，在纯培养条件下得出的结论也可能仅仅代表了该微生物种群所具有的全部生理代谢特点的一部分，并不能肯定就是该微生物种群在环境中所具有的生理代谢特点。虽然通过严格模仿环境条件来设计培养基和培养条件可以以减少纯培养条件与实际环境条件下的差别，但是因为在纯培养条件下微生物失去了与群落中其它微生物之间相互竞争与协作的关系，所以仍然不能肯定所得到的实验结果就能代表这些微生物在环境条件下的生理代谢特点[621。随着MAR．FIsH和DNA很NA．SIP等技术的成熟和使用，最近几年来，人们对于参与废水处理的微生物群落中丝状菌，硝化菌、反硝化菌和聚磷菌等重要功能类群的生理代谢特点进行了深入研究【70】，这些技术不但可以用来阐明微生物群落中单个种群的功能，而且可以迸一步揭示群落中不同种群之间的相互作用。从长远来说，利用这些不同微生物类群的生理代谢特征，可以对反应器中的微生物群落结构进行优化，从而提高反应器的设计和操作水平【70】。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文1．2．2．1丝状菌生理代谢研究因为丝状菌的过度生长会造成污泥膨胀的产生，所以对丝状菌生理代谢的研究一直都是废水处理过程中微生态学研究的热点。Zoogloearamigera和Type021N分别是从活性污泥中分离得到的菌胶团菌和丝状菌的代表，微生物学家对这两个菌的生理代谢进行了比较研究，结果发现Type021N比Zoogloearamigera具有更高的底物亲和力，而Type021N的产率系数(yieldingcoeflieieney)及对乙酸同化速度(在乙酸浓度高的情况下)都比Zoogloearamigera低[104]，这为我们理解污泥膨胀的发生机制控制丝状菌的过度生长提供了帮助(见1．2，4)。Thiothrix是Gammaproteobacteria纲的一个属，其中很多菌株都具有氧化硫的能力并呈现出无色丝状的形态，在硫化物或者硫代硫酸盐存在的情况下，它们能够形成硫颗粒。Thiothrix属是活性污泥中常见的丝状菌，如果Thiothrix属在活性污泥里大量生长，就会降低污泥的沉降性能，引起污泥膨胀，因此，很多学者都致力于研究Thiothrix在活性污泥中的生理特点来寻找控制其过度生长的方法。经过长期的纯培养研究，人们发现有些菌株如ThwthrLxnivea、Thiothrixramosa和ThiothrixCT3采用化能自养的营养方式，而另一些菌株则采用混合营养的方式，还有一些菌株采用异养的方式，此外有些菌株因培养条件不同而采用不同的营养l方式，因此很久以来人们都不清楚发生污泥膨胀时活性污泥中占优势的是哪些Thiothrix种群，它们采用的是哪一种营养方式，所以很难把从纯培养中获取的知识应用于活性污泥中Thiothrix属种群的控制，因此必须使用不依赖培养的方法才能对Thiothrix属在活性污泥中的组成以及它们在原位的生理代谢特征进行研究。Nielsen等[105]使用MAR．FISH技术对发生污泥膨胀时，群落中过度生长的Thiothrix属种群的生理进行了深入研究。他们发现Thiothrix属表现出生理代谢上的多能性，其中绝大多数种群能够同时以异养、混合营养和化能无机自养的方式摄入放射性标记的乙酸或者二氧化碳；它们在厌氧和缺氧的条件下均能摄入硫代硫酸盐和乙酸并在胞内形成硫颗粒：在好氧情况下，硫代硫酸盐能够使得Thiothrix属对乙酸的摄取提高60％，这表明Thiothrix属采用的是混合营养的方式，同时，在硫代硫酸盐存在的情况下，乙酸又能够明显使这些种群对HC07的摄取提高精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述60．70％。活性污泥系统的迸水成分经常发生波动，各种无机物和还原性的含硫化合物以及氧和硝酸的浓度都在不断变化之中，因此Thiothrix属种群生理代谢上的多能性使它在与群落中其它种群竞争底物时占据优势。Nielsen同时还发现，采用混合营养方式能够这些种群的世代时间大幅缩短，从使它们在竞争中处于有利位。Alphaproteobacteria纲的丝状菌对于污泥膨胀的发生也有着重要影响。使用分子方法对发生污泥膨胀的工业废水处理厂进行调查后发现，污泥膨胀事故的发生35％都是由于Alphaproteobacteria纲的丝状菌过度生长造成的[106]，而Meganemaperideroedes正是Alphaproteobacteria纲中一种重要的丝状菌。Kragelund等[71】对一个污泥膨胀发生了好几年(SVI>200mlg"1)且丝状菌过度生长非常严重的废水处理厂进行了研究，FISH的结果表明Meganemaperideroedes和Thiothrix属在群落中的多度分别为60--95％和5-35％。他们进一步对Meganemaperideroedes在原位的生理代谢进行了深入研究。首先使用MAR．FISH比较了在好氧、缺氧(分别以硝酸根和亚硝酸根为电子受体)和厌氧的状态下，Meganemaperideroedes对甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙酮速、油酸、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘氨酸、亮氨酸、乙醇和重碳酸盐等12种底物的摄取情况，结果发现：在以氧为电子受体时，除了甲酸、丙酮酸、乙醇和重碳酸盐以外，Meganemaperideroedes能够摄入其它8种底物；在以硝酸根为电子受体时，Meganemaperideroedes仅能摄入乙酸、丙酸、葡萄糖，半乳糖四种底物；在以亚硝酸为电子受体时，Meganemaperideroedes仅能摄入乙酸和葡萄糖两种底物：在厌氧条件下，Meganemaperideroedes不能摄入实验中所有的12种底物。因此，在好氧条件下Meganemaperideroedes能够利用大多数有机物作底物，而在缺氧条件下，特别是在以亚硝酸为电子受体时，Meganemaperideroedes能够利用的有机物种类大幅减少，但在厌氧时，Meganemaperideroedes既不能利用有机物合成贮存物质也不能进行发酵。他们的研究还表明Meganemaperideroedes在硫代硫酸盐存在的情况下不能固定HC07，因此它可能只有异养一种营养方式，而不像Thiothrix那样还存在自养或者混和营养的营养方式。同时，Kragelund等还研究了Meganemaperideroedes在以氧、硝酸和以亚硝酸为电子受体时，平H用不同的有机物在菌体内形成储能物质PHAs(polyhydroxyalkanoates)的能力。根据实验结果，Kragelund等认为Meganemaperideroedes能够以氧和硝酸为精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文电子受体利用多种可溶性有机物，并且具有很高的底物亲和力、很强的底物摄取和PHA合成的能力。这些结论与一般的活性污泥中丝状菌的描述有一定差别，这表明在特定的废水处理厂中，特定的丝状菌有其特殊的生理特点。微生物群落中各个种群原位的动力学参数，比如生长速率、产率、对底物的亲和力等数据都是比较难获取的，很多相关知识都源于对相应纯培养物的研究。Nielsen等[107]在普通微放射自显影技术的基础上加入已知比放射性的细菌作为内标，发展出定量微放射自显影技术(quantitatixemicroaumradiography，QMAR)，并与FISH技术结合称为QMAR--FISH技术。他们用这种技术对活性污泥系统中两类不同的丝状菌Meganemaperideroedes和Thiothrix对乙酸的比底物摄取率(uptakeofspecificsubtrates)和底物亲和常数(substrateaffinityKs)作了测定，他们发现Meganemaperideroedes和Thiothrix属砷群对乙酸的平均比底物摄取率分别为4．1x1045m01．cell-1．h1和3．1x10lSt001．cell-1"h．1，对乙酸的胎分别为1．8uM和2．4pM，这些动力学参数的测定对于控制丝状菌的生长、防止污泥膨胀的发生有着重要的应用价值。此外，他们还发现不管对于Meganemaperideroedes还是对于Thiothrix来说，同一个菌丝上细胞的比底物摄取率都是很相近的，但是对于不同菌丝上的细胞测定的比底物摄取率却可以相差3倍，这说明在活性污泥这个复杂的系统中，即使在同一种群的内部，活性也存在较大的差别。1．2．2．2菌胶团菌(floe-formingbacteria)±A]成和生理代谢研究菌胶团的组成和各种环境因素一起决定了活性污泥的结构和性质。活性污泥的菌胶团由很多成份组成，其中包括细菌、胞外聚合物质(extracellularpolymericsubstances，EPS)以及有机和无机的颗粒，这些组分在反应器的物理条件(如剪切力等)和化学条件(如pH，表面活性剂和金属粒子等)的作用下，决定了菌胶团的结构和性质，而菌胶团的性质也在很大程度上决定了活性污泥在絮凝、沉淀和脱水方面的性能HOBl。活性污泥中细菌的数目在1-10x1012／gVSS之间(通过DAPI染色来计数)，而其中大约80％的细菌是活的或是有活力的(通过FISH或者MAR来计数)[109]。虽然所有这些微生物的细胞只占菌胶团所有有机物的很少一部分(大约5-20％)，精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述但是微生物群落的组成和活性以及它们与菌胶团中其它组分的相互作用对于菌胶团的性质有着很大的影响。这些细菌在菌胶团中绝大多数以大的小集落(直径大于61am)形式存在，其余则以小的小集落(直径小于6p．m)、单个细胞或者丝状菌的形态分布在以EPS为主体的三维基质中008]，这些集落的强度对于菌胶团的稳定和固液分离的效率有着很大的影响。Klausen等[110]的研究表明，活性污泥中每个菌胶团含有15个左右大的小集落。Alphaproteobacteria纲、Betaproteobacteria纲、Gammaproteobacteria纲、Deltaproteobacteria纲、Bacteridetes门、Actinobacteria门和Firmcute门的微生物都能具有形成小集落的能力，其中Betaproteobacteria纲、Alphaproteobacteria纲、Deltaproteobacteria纲形成的小集落占有最大的体积。这些不同类群微生物形成的小集落在性质上存在明显差别，在水力剪切的作用下，小集落会受到不同程度的破坏而体积变小，不同类群的小集落对于水力剪切的抵抗力反映了这些小集落强度的差别。在水力剪切的作用下，Betaproteobacteria纲、Gammaproteobacteria纲、Deltaproteobacteria纲和ActinobacterM门形成的小集落体积减少少于12％，表明这些类群形成的小集落的强度比较大；而Alphaproteobacteria纲、Fimicute门组成的小集落的体积减少了42．6l％，这表明这些微生物类群形成的小集落的强度比较小。因此微生物的群落结构也决定了菌胶团的稳定性，从而对活性污泥的沉淀性和稳定性产生影响。在厌氧的影响下，Betaproteobacteria纲(Beta-2亚群)、Deltaproteobacteria纲和Firmcute门的小集落对于水力剪切的抵抗力会明显下降，而在低温(4℃)的影响下，Betaproteobacteria门类群(Bem-1亚群)和Bacteridetes门类群的小集落对于水力剪切的抵抗力会明显下降。厌氧和低温的作用表明，微生物的代谢和活性对于小集落的强度有明显的影响，同时细胞表面之间的疏水作用力和细胞与EPS之间的相互作用力也会影响小集落的强度。在SDS(表面活性剂)、pH值、EDTA(二价金属螯合剂)和硫化物(结合铁离子)的分别影响下，不同类群的小集落对于水力剪切的抗性也会发生改变，这些变化分别说明了细胞表面疏水性(sDS)，细胞与EPS的静电作用(pH值)以及细胞在金属离子参与下与EPS的交联作用(EDl．A和硫化物)对于不同类群微生物小集落的强度贡献是不同的。因此，进一精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文步在种属的水平上去研究各种小集落形成微生物的生理代谢特点，并把这些特点与菌胶团的特定性质联系起来，能够使我们通过反应器的设计和操作来更好地调节菌胶团的特性，从而提高活性污泥在絮凝、沉淀和脱水方面的性能。Thomsen等[111]发现Betaproteobacteria门类群在一个处理生活废水的工业处理装置的群落中占有绝对优势(40．50％)，这些Betaproteobacteria纲的种群多数都形成大的小集落，其中有相当一部分小集落能与Betaprofeobacteria纲第2亚群的探针BONE23A杂交，但是却不能与复氧化菌、Azoarcus属、Zoogloea属，Thaue，a属和Accumulibacterphosphatis属这些废水处理工程中常见Betaproteobacteria纲类群探针进行杂交，这表明组成这些小集落的微生物属于Betaproteobacteria纲的第二类群，但是它们具体的系统发育地位还需要作进一步鉴定。他们使用显微操作技术从活性污泥中挑出20个小集落．其中14个都能够得到RT-PCR的产物，然后从中选取3个样品作了进一步的群落结构分析，结果发现Neisseriaceae科Aquaspirillum属的微生物在三个样品中都是优势的微生物种群，说明这种小集落主要是由Aquaspirillum属的微生物形成。接着他们又使用MAR-FISH的方法证明该种群是一种能够利用氨基酸混合物的兼性反硝化菌。他们在对九个废水处理工业装置进行调查后发现，这个种群普遍存在于所有具有脱氮功能的废水处理装置之中，特别是在处理生活废水的工业装置的群落中占有很高的比例，在某些处理装置中该比例可以到30％，这表明该种群是废水处理当中一种重要的菌胶团形成菌，同时还是一种优势的反硝化菌。仅仅研究菌胶团菌的代谢能力和对于剪切的抵抗作用还是远远不够的，微生物的其它生理特点对于小集落的性质也有着重要影响。因此，Nielson等[112，113】提出用酶联荧光底物(enzyme．1inkedfluorescentsubstrates，ELF)来进行测定细胞胞外酶活性的方法；Neu等[114]提出了用荧光凝集素(fluorescentlectins)来测定细胞表面组成的方法；Zita等[115，116]提出了用微球吸附法(microsphereadhesiontocell，MAC)来测定细胞表面的疏水性和亲水性的方法。1．2．2．3硝化菌生理代谢研究微生物的体积微小，与它们直接发生相互作用的环境也是微小的[62】。将FISH精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述技术与微电极技术(microelectrode)结合起来可以用来研究微生物群落在环境中的分布与环境中温度、pH值以及各种化学物质梯度之间的相互关系，这种相互关系可以用来反映群落中不同种群对于生态位的选择，因此也可以反映它们之间生理代谢上的差异。Schramm等[117]将原位杂交技术和微传感器相结合，分析和比较了生物膜邮--AOB茵群(Nitrosomonas属和Nitrosospira属)和NOB菌群(Nitrobacter属和Nitrospira属)中不同种群对生态位的选择以及它们在生理上的差异。他们分别从600lam厚生物膜的内外两侧通入氧气和氨水，然后使用微电极测定溶解氧、pH、氨、亚硝酸根和硝酸根在生物膜内外侧之间的梯度，同时使用FISH与激光共聚焦显微镜测定了硝化菌在生物膜内外侧之间的分布特征。在整个生物膜内，氨浓度的变化不大，而溶解氧的含量在200I_tm厚(离与氧接触一面的距离)的地方就下降为零，这说明在实验中溶解氧是整个硝化反应进行的限制性因素。在生物膜的好氧部分(<2001．tm)，氨和亚硝酸的浓度都很高，这时Nitrosomonaseuropaea类群占绝对优势且比Nitrosospira属的多度要高1-2个数量级；Nitrobacter属种群占绝对优势而Nitrospira属种群在这部分生物膜中基本不存在。在生物膜好氧和缺氧的界面上(200--300I．tm)，Nitrosomonaseuropaea类群和Nitrosospira属的多度相当，但都处在很低的水平；Nitrospira属种群占绝对优势而Nitrobacter属种群则基本测不到。在完全缺氧的生物膜部分(300-600}．tm)，所有硝化菌的多度都很低。因为Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacter属对底物和溶解氧有更高的亲和力，所以在高底物和溶解氧浓度下Nitrosomonas属和Nitrobacter属分别比Nitrosospira属和Nitrospira属种群更有竞争优势。另外，他们还认为Nitrospira属的微好氧性(microaerophilic)是其在多数废水处理反应器中占优势的重要原因。Schramm[118]等甚至还使用微电极和原位杂交的方法分别估算了生物膜中Nitrosospira属和Nitrospira属种群对氨和亚硝酸的亲和力，结果表明Nitrosospira属对氨氮的Km值要明显低于各种分离到的Nitrosomonas属的菌株，而Nitrospira属对亚硝酸的Km值也要比分离到的Ⅳf抛6叩御属的菌株低很多。Daim等【97】利用MAR-FISH技术对废水处理反应器中Nitrospira属种群在好氧、缺氧和厌氧的条件下进行混合营养生长(mixotrophy)的潜力进行了研究。他们发现在好氧的条件下，Nitrospira属的种群在所测试的有机碳源中仅能利用丙酮精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文酸作为有机碳源进行混合营养生长，但是在厌氧和缺氧的条件下，Nitrospira属的种群不能利用乙酸、丙酸、丁酸和丙酮酸中的任何一种有机物为碳源进行混合营养生长。因为一般在实际废水处理中存在丙酮酸的浓度很低，所以Nitrospira属的种群以混合营养为主进行生长的可能性不大。好氧生物膜系统已经广泛应用于脱氮工艺，在这样的生物膜系统中，硝化菌和异养菌之间相互竞争氧气和空间的竞争关系已经被人们所熟知[119，1201，在有机碳存在的情况下，硝化菌因为生长速度慢以及将底物转换为菌体的效率低，使得硝化菌在跟异养菌的竞争中处于劣势。但是人们在不存在有机碳源的条件下(以Hcoi为唯一碳源)的生物膜系统中也发现了异养菌以很高比例与硝化菌共存【93，94．121]，这说明硝化菌和异养菌之间除了相互竞争的关系以外还存在着相互依赖的夭系。硝化菌是自养菌，它们在利用无机物合成有机物满足自身生长和代谢的同时，还能产生大量的微生物产物(microbialproduct)，其中包括与底物代谢相关的产物(utilization--associatedproducts，UAP)以及与菌体相关的产物(biomass--associatedproduct，BAP)，此外硝化菌还能产生大量的胞外多聚物(extracellularpolymericsubstance。EPS)。异养菌正是利用了这些自养菌的微生物产物和胞外多聚物才能进行正常的生长和代谢，同时异养菌对自养菌代谢产物的利用，也有利于减少这些代谢产物对于自养菌生长的抑制。对于这种硝化菌和异养菌之间共生关系的研究，能使人们更完整地了解硝化菌与异养菌之间的生态关系，这对于提高硝化过程的稳定性和效率都是非常有帮助的。Kindaichi等[122]使用全套的rRNA技术与MAR-FISH技术，对一个自养硝化生物膜(以HCO了为唯一碳源)群落中主要异养菌类群对BAP和UAP的摄取能力进行了研究。首先用16SrDNA文库技术得到生物膜中异养菌和硝化菌的构成，然后根据各个不同类群的序列设计相应的FISH探针；接着使用定量FISH对生物膜中的主要类群进行定量测定，结果发现硝化菌在群落中多度为50％，其余为各种异养菌，其中Alphaproteobacteria纲、Gammaproteobacteria纲、Greennonsulfurbacteria(GNSB)f-]、Cytophaga-Flavobacterium—Bacteroides(CFB)f]和未鉴定的类群(仅能与细菌探针EUB338结合)在群落中的多度分别为23％、13％、9％、2％和3％；最后，他们又使用MAR．FISH技术对各个异养菌类群对于BAP和UAP的摄取能力进行了研究。30精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述他们共使用了三种有代表性的有机物进行了标记，其中N—aeetyl．D—glucosamine(NAG)代表细胞壁的主要成分即主要的BAP，而乙酸和混合氨基酸则都代表硝化菌的微生物产物中的UAP部分。实验结果表明AOB、NOB对这些有机物都不能利用；Alphaproteobacteria纲类群，Betaproteobacteria纲类群能够摄取乙酸和混合氨基酸，不能摄取NAG；GNSB门和CFB门类群能够摄取混合氨基酸和NAG，但不能摄取乙酸，而未鉴定的类群三种标记的有机物都可以利用。绝大多数能够摄入乙酸和混合氨基酸的微生物都属于Alphaproteobacteria纲和Betaproteobacteria纲，几乎所有CFB门噗群都能够摄入NAG，它们摄入的NAG占总量的64％，还有27％的NAG被GNSB门类群摄入。这表明硝化菌产生的UAP和BAP有可能分别被不同的异养菌类群所利用，这样就防止了硝化菌的代谢产物或者菌体自溶物质的积累。但是，这些实验中的有机物是在外部标记后加入的，并不是直接从硝化菌排出而被异养菌所摄取，因此并不能完全代表生物膜中实际的食物网。Kindaichi等[123，124]进一步改进了实验设计，重新构建了同样的自养硝化生物膜反应器。他们首先取生物膜样品在以14c标记的HCO；为唯一碳源的条件下标记6h，这时MAR-FISH的结果表明群落中几乎全部的AOB和NOB都受到很强的14C标记，而所有的异养菌都没有被标记。随后停止14C标记，使用未标记过HC07为唯一碳源，并把样品分为两份，其中一份生物膜样品在流加NH：的情况下孵育，而另一份生物膜样品在不流加NH+的情况下孵育。然后在10天的时间内跟踪硝化菌中14c标记在各个异养菌类群中的流向，这样就可以清楚地了解微生物群落中食物网的实际情况。其中流加NH：_的生物膜由于不断有能量补给，硝化菌自溶很少，所以传递给异养菌的主要是UAP和EPS，而不流加NHj的生物膜由于得不到能量补给，会发生明显的菌体自溶，所以传递给异养菌的主要是BAP和EPS。用MAR-FISH对放射性标记进行跟踪，结果清楚地表明掺入硝化菌细胞的14C可以被释放出来然后被各个不同的异养菌类群所利用。不流加NHj的情况下，50％的GNSB门类群从第三天起就开始大量地摄取Hc标记的微生物产物，并在随后lO天内保持稳定，而在流加NH：的情况下，则仅有20％左右的GNSB门类群能3l精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文够少量地摄入14c标记的微生物产物并且MAR的信号很弱。与此相反的是，CFB门类群在流加NH+的情况下，能够强烈地摄入HC标记硝化菌产物的CFB门的种群数量在十天内逐渐增加到55％，而在不流加氨的情况下，只有20％左右的CFB门类群能够少量地摄入标记的微生物产物并且MAR的信号很弱。基于这些实验结果，他们推测GNSB门种群主要是利用BAP，而CFB门类群则主要利用UAP，包括I?PS或者自溶菌体的二级代谢产物，丽A咖haproteobacteria纲和GcJnmaproteobacteria纲类群可能利用6)是硝化蔚分泌的分子量的可溶性细菌产物，(solublemicrobialproduct，SMP)比如氨基酸和短链脂肪酸。而Betaproteobacteria纲类群在群落中的多度很低，而且不能明显摄取标记的微生物产物，这表明这一异养菌类群与硝化菌的共生关系并不明显。在一个多种群组成的群落中，各个种群之间物质的交换楚研究它们之间相互关系的重要内容，这些知识是不可能通过对各个种群的纯培养研究来获得的。1．2．2．4聚磷菌生理代谢研究生物强化去磷工艺(enhancedbiologicalphosphorusremoval，EBPR)已经被广泛应用到废水处理当q6[1251，以达到减少废水排放中磷的含量，防止江河湖泊中富营养化的发生。所谓EBPR工艺，就是使活性污泥反复地经过厌氧～好氧或者厌氧一缺氧的方式来达到富集聚磷菌(polyphosphate—accumulatingorganisms，PAO)的目的。由于对PAO生理代谢知识的缺乏，目前关于PAO的生化模型是没有经过严格实验检验的经验模型。根据这个模型，PAO能够在厌氧的条件下摄取挥发性脂肪酸并合成PHA，这个过程需要利用水解聚磷来提供能量，而还原力的提供则需要依靠糖原的酵解或者让乙酸进入TCA循环获得。在随后的好氧或者缺氧阶段，P：AO能够利用厌氧阶段积累的PHA用于生长或者增加它们体内的聚磷和糖原。很多实验证据都表明Rhodocyclus属的微生物可以在具有EBPR的实验室装置中被富集，在厌氧的条件下可以摄入乙酸合成PHA，然后在好氧的条件下生长并形成聚磷，因此这些Rhodocyclus属的微生物可能代表了EBPR工艺中重要的聚磷微生物(RPAO)，但是在工业装置中，RPAO是否也是重要的聚磷菌还需要作进一步检验并且RPAO在工业装置中的生理代谢特点还需要进一步进行研究。精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述Kong等[126]使用MAR-FISH技术对三个采用EBPR工艺的工业废水处理装置中RPAO原位生理代谢进行了深入研究。Rhodocyclus属在所有三个废水处理厂微生物群落中的多度分别为5—10％、10。15％和17．22％，而能够摄入磷的聚磷菌(RPAO)在Rhodocyclus属的比例分别为27％、56％和86％，这表明RPAO确实是工业装置中重要的聚磷微生物。他们对RPAO所能利用的有机物进行了研究，结果表明在所实验的有机物中，RPAO仅能利用少部分短链的有机物，其中包括乙酸、丙酸、丙酮酸和谷氨酸，而不能利用甲酸、丁酸、油酸、乙醇、亮氨酸、甘●氨酸、天冬氨酸、胸苷酸和葡萄糖。他们又设计了实验来测定RPAO同时摄取两种底物的能力。首先将一种底物标记而另一种底物不标记，然后在随后的实验中又将前一种底物标记而后一种不标记，如果在两个实验中，RPAO都产生MAR信号，这就说明RPAO具有同时利用两种碳源的能力。通过这种方法，他们发现RPAO能够同时摄入乙酸和丙酸，虽然亮氨酸和胸苷酸都不能作为唯一碳源而被摄入，但是它们都可以与乙酸共基质而被RPAO所利用。PAO模型里假设在厌氧的条件下PAO可以利用乙酸、丙酸，和丁酸合成PHA，而实验说明RPAO不能摄取丁酸和其它一些小分子的有机物，这表明原废水中或者发酵过程中产生的小分子有机物中只有很少一部分是Ⅺ，AO摄取的底物。同时，Kong还研究了RPAO在厌氧条件下合成PHA所需还原力的来源问题。他们还发现在加入甘油醛脱氢酶的抑制剂一碘乙酸(阻断糖酵解的途径)后，RPAO不能再摄取乙酸来合成PHA，这说明RPAO摄取乙酸以及合成PHA所需要的还原力只能来源于糖酵解途径。他们还发现RPAO不能直接摄入葡萄糖，因此RPAO只能利用胞内糖原的酵解糖来获得生成PHA的还原力。根据PAO生化模型，存在两条途径来获得合成PHA的还原力，一条是糖酵解途径，而另一条是通过TCA循环，而实验证明RPAO只能利用糖酵解途径来获得还原力。Kong还研究了摄入的乙酸是用于合成储能物质还是提供菌体生长之需。结果表明，在厌氧的条件下，乙酸仅能用于合成储能物质PHA而不能用于菌体生长，且RPAO对乙酸的摄取在3小时后就达到饱和：在好氧的条件下，RPAO不但可以利用乙酸用于合成储能物质PHA，而且也可以用于菌体的生长。Kong还发现在好氧的条件下，加入乙酸后贮AO就不再摄取磷，这时RPAO转而利用水解聚磷所精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文产生的能源来摄取乙酸并合成PHA，这与PAO模型相符合。此外，Kong还发现RPAO能同时在好氧和缺氧的条件下摄入磷和其它的有机物，这对12J'AO是～类兼性的反硝化菌的观点提供了强有力支持。除了KPAO以外，他们还发现有～部分Alphaproteobacteria纲和Gammaproteobacteria纲的种群也具有聚磷的功能。对RPAO生理和代谢的研究表明PAO模型基本上是正确的，但是该研究进一步深化了我们对于RPAO生理代谢的了解，可以用于进一步改进现有模型．提高EPBR工艺的设计和操作水平，学者们从废水处理装置中也分离到了一些具有在厌氧条件下摄取有机物然后在好氧的条件下合成聚磷的微生物，这些微生物大多属于Actinobacteria门中的Microhmatus属(如Microlunatusphosphovorus)和Tetrasphaera属(如Tetrasphaeraelongata)。但是，Actinobacteria门中的聚磷菌(APAO)在工业装置中的生理和代谢行为还很少被人研究，Kong等[127]首次对工业装置中Actinobacteria门中聚磷菌的生理代谢进行了深入研究。他们首先构建了16SrDNA克隆文库，然后根据属于．4ctinobacteria门Intrasporangiaceae科的克隆序列，设计了Actino一221和Actino一658两个特异性探针，其中Actino．221与Tetrasphaera属的克隆相匹配，而Actino一658与这个科的其它克隆相匹配，并且这两个探针可以覆盖Actinobacteria门的绝大多数克隆。FISH的结果表明，能与Actino．221探针和Aetino．658探针杂交的细菌在形态分别为四联球菌和短杆菌。MAR-FISH的结果表明这两类属于Intrasporangiaceae科的微生物都能够在厌氧阶段吸收有机物，而好氧的阶段在胞内形成聚磷，因此它们都是群落中主要的聚磷菌，可以分别用球状．APAO和杆状．APAO来表示。但是APAO的生理代谢与PAO模型所描述的存在很大差异，也与RPAO的生理代谢有非常多的不同之处。首先在厌氧阶段对有机物的利用上，APAO不能摄入包括挥发性脂肪酸在内的很多有机物，如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸，油酸、乳酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸、胸苷合成储能物质(只有球状．APAO能够摄入油酸，但因此不能形成多聚物，所以在好氧阶段也不能摄入聚磷)，但APAO在能够摄入酸水解酪素(Casamioacids)或者与之类似的混合氨基酸。第二，APAO不能将摄入的有机物用来合成PHA，而是可能用来合成一种目前所未知的多聚物，为好氧阶段在胞内积累聚磷做能量贮备。第三，与RAPO不同的是，加精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述入碘乙酸并不能阻断APAO在厌氧条件下对有混合氨基酸或者酸水解酪素的摄取，这说明APAO并不是通过酵解途径来获得合成多聚物所需要的还原力的。第四，在厌氧条件下，与RPAO一样，APAO只能将它所摄取的有机物用于合成多聚物而不能用于菌体生长；而在氧和硝酸存在的情况下，APAO能够使用这些储能物质进行生长；但是在亚硝酸存在的情况下，APAO却不能代谢体内的这些储能物质，这说明APAO可能只能把硝酸还原到亚硝酸，而不能进一步还原为氮气。以上实验充分地说明APAO在生理代谢上与RPAO存在很大差别，并且与PAO模型中对PAO生理代谢的假设存在很大的出入。Kong还用定量FISH对APAO和RPAO在十个使用EBPR工艺并且进行硝化反硝化的工业废水处理装置中的多度分别进行了定量分析，结果发现APAO和RPAO广泛地存在于这些废水处理装置中。在其中一个处理装置中APAO和RPAO加起来可以占到整个群落的38％，这说明PAO在整个微生物群落中具有非常重要的作用。但是APAO和RPAO在这十个工业装置中的比例变化很大，最低为O．2，最好为9．0，一般地说在工业废水处理装置中，APAO特别是球状．APAO所占的比例较大。而在生活废水处理装置中RPAO所占比例较大。APAO可能只能利用氨基酸而RPAO则可以利用其它更多的有机物，因此工业装置中进水成分的不同对于APAO和RAPO的比例有着极大的影响。APAO广泛地存在于使用EBPR工艺中的工业装置中而目前所使用PAO模型还不能对APAO的生理代谢行为作合理的解释，这可能是目前EPBR工艺的设计和控制仍不理想的一个重要原因。进一步定量地分析这些重要功能菌的生理代谢活动，建立更加全面而完善的PAO模型是改进EPBR工艺设计和控制的关键。1．2．2．5糖原积累菌生理代谢研究糖原积累菌(glycogen．accumulatingorganism，GAO)是一类能够在胞内积累糖原的微生物，与PAO一样，它在厌氧条件下摄取有机物合成PHA作为好氧阶段的碳源和能量来源，但不同的是，它在好氧阶段胞内积累的是糖原而不是聚磷。所以在厌氧阶段GAO会与PAO相互竞争底物，OAO的过度生长会抑制PAO的生长，以致干扰甚至破坏EBPR工艺的正常进行。研究GAO的生理代谢特点，在控制其精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文生长从而保障EBPR工艺正常进行方面有着非常重要的意义。Gammaproteobacteria纲的某些微生物广泛分布在采用EBPR工艺的工业装置中，这些未培养的Gammaproteobacteria纲微生物具有相似的形态，它们都是直径在2-4urn之间的大的球杆菌(有时呈20urn长的杆状)，它们可能是一类重要的GAO菌。Kong等[128】对这些微生物进行了系统发育分析时发现，这些微生物在系统发育上比较相近，组成了Gammaprowbamr缸纲中一个新的类群，称为CandidatusCompetibacterphosphatis或者GB细菌，GB细菌又可以进一步分为7亚群(GBl，GB2，¨GB7)；Kong等[129]研究了GB细菌和PAO在12’爪使用EBPR工艺的废水处理装置中的分布和多度，并用MAR—FIsH技术深入研究了OB细菌中7个不同亚群的生理代谢特点，他们发现与PAO一样。GB细菌也广泛分布在这些使用EBPR工艺的工业装置中。在这些工业装置中，GB细菌的多度在2-6％之间，而RPAO和APAO的多度则分别平均为7％和29％。在厌氧的条件下，绝大多数GB细菌都可以摄取乙酸和丙酮酸，部分GB细菌还可以摄取丙酸，而均不能单独得摄取丁酸、乙醇、甘露醇、油酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和甘氨酸，但是GB细菌能够同时摄入乙酸和丙酸以及乙酸和亮氨酸。GB细菌中的多数亚群都具有基本相似的有机物摄取能力，但也有个别例外的情况，比如只有GB6亚群可以利用甲酸并且只有GBl亚群和GB6亚群可以利用胸苷。在厌氧的条件下，与聚磷菌一样，GB细菌也只能摄入有机物合成PHA作为储能物质而不能将其用于生长代谢，但在氧和硝酸作电子受体的情况下，摄入的有机物可以用于生长代谢。GB细菌的7个亚群中仅有GB6这个亚群能够在亚硝酸盐存在的情况下将摄入的有机物用于生长代谢，这表明GB6亚群可能具有反硝化的能力。与RPAO一样，GB细菌也只能通过胞内糖原的酵解来获得合成PHA所需要的还原力，但与PAO不同的是，在好氧的条件下，GB细菌只能在胞内积累糖原而不能形成聚磷。以上的研究表明GB细菌的生理代谢特点与现在所采用的GAO模型比较相似。GB细菌在厌氧阶段的生理代谢特点与RPAO非常相似，所以它们在微生物群落中存在很强的竞争，而且目前还很难根据两者之间生理代谢的差别抑制GB的生长同时又能促进RPAO的生长。但是GB细菌在厌氧阶段的生理代谢特点与APAO非常不一致，因此有可能通过刺激APAO的生长来抑制GB细菌和RPAO的生长精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述来达到提高EBPR工艺的效率和稳定性的目的。1．2．2．6苯酚降解菌研究酚类化合物在环境中普遍存在，大多数酚类化合物对生物体都有毒害作用。造纸厂、炼钢厂和煤矿企业每年都会产生大量的以酚类化合物为主的污染物，它们对环境造成了巨大的威胁，所以酚类化合物的排放在全世界范围内都受到严格控制，而废水的生物处理是控制酚类化合物排放的重要手段。但是，在相当长的一段时间内，人们对于在废水处理过程中微生物群落对苯酚降解的研究一直停留在分离培养的阶段，对于微生物群落中主要承担苯酚降解作用的种群一直缺乏了解。直到2002年，Manefield等【74】首次把RNA．s口技术运用于微生物分子生态学，才揭示出Thauera属的微生物在好氧池的苯酚降解中起着重要作用。因为Thauera属的微生物通常是在反硝化的条件下被分离的，所以发现这个属的微生物是好氧池中的主要降苯酚菌有些出人意外，但是这也证明了使用不依赖于培养的分子生态学技术对于阐明微生物群落结构和功能之间关系的重要价值。在这一工作的指导下，学者们已经把该微生物分离出来，并正在进行全基因组的测序工作【75】。2005年，Manefield等[80】使用RNA．SIP技术又对另一个处理含酚废水的工业装置中重要的苯酚降解菌进行了分析，结果发现Acidovorax属的某些微生物在该装置中是重要的苯酚降解菌。这些研究为我们进一步优化反应器的设计和操作提供了重要的依据[751。1．2．2．7反硝化菌生理代谢研究能够进行反硝化作用的微生物都属于反硝化菌，反硝化菌广泛分布于系统发育的众多分枝之中，甚至部分古菌和真菌也具有反硝化功能[1301。因此，在以上所研究的丝状菌、菌胶团菌、聚磷菌和糖原累积菌等功能类群的生理代谢功能时，学者们都很注意研究这些微生物是否可能具有反硝化的能力以及它们在以硝酸根和亚硝酸根为电子受体时的生理代谢特点。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文1．2．3废水处理反应器的设计和操作对微生物群落结构和功能的影响如前文所述，Manefield等【74】使用RNA．SIP技术发现在一个处理含酚废水的工业装置中，Thauera属是最重要的苯酚降解菌。而使用同样的技术，Manefield等[8015(对另一个处理含酚废水的工业装置中重要的苯酚降解菌进行了分析，却发现群落中最重要的苯酝降解菌是Acidovorax属，而不是Thauera属。这说明在处理类似的废水时，因为工艺的不同和反应器设计的差异，废水处理中重要功能菌的绷成可能泡不相同。实际上，不同的工艺和反应器的设计对于微生物的群落和结构都有着深远的影响，只有把这种影响研究清楚，才能进一步选择适当的工艺和设计合理的反应器。所以研究废水处理反应器的设计和操作对于微生物群落结构和功能的影响是进行群落结构优化的基础[81】。1．2．3．1对除磷工艺的影响EBPR工艺需要适当的工艺条件来使得活性污泥中聚磷菌得到增殖。在一般的EBPR工艺中是通过使污泥经过厌氧和好氧的交替条件来达到增殖聚磷菌的目的，而1993年以后[131，132]，人们认识到使用厌氧和缺氧交替的条件也可以实现聚磷菌的增殖，达到去磷的目的。而且使用厌氧和缺氧交替的条件具有以下优点，(1)因为不需要曝气，所以可以降低操作成本；(2)可以减少剩余污泥的产生并因此优化碳源的利用。Dabert等[141将SSCP技术用于分析序批式反应器(sequentialbatchreactor，SBR)的操作方式从厌氧．好氧交替转变为厌氧一缺氧交替时，微生物群落结构的变化情况。在厌氧一好氧交替的操作条件下，反应器具有很好的生物强化去磷(enhancedbiologicalphosphorusremoval，EBPR)效果，然后停止曝气，同时注入硝酸盐将操作条件转变为厌氧一缺氧交替。最初反应器的去磷效果和SSCP指纹图谱与厌氧．好氧交替的操作条件下非常接近，这说明在厌氧一好氧交替的操作条件下产生的微生物群落结构也能够暂时地适应厌氧一缺氧的操作条件。但是这种情况只维持了17天，此后反应器的去磷效果就急剧下降并接近于零，SSCP指纹图谱也发生了很大的改变，反映出微生物群落结构发生了剧烈变化，这说明要厌氧一缺精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述氧交替操作条件下实现长期稳定的EBPR，需要形成与厌氧一缺氧交替操作条件下完全不同的群落。这一研究再次说明，操作条件的变化对于微生物群落的影响要在更长的时间才能显现出来，所以虽然改变操作条件能够实现了对反应器的短期优化，但是如果操作条件对群落产生了不利的影响并在更长的时间后显现出来，就反而会降低甚至破坏反应器的功能。1．2．3．2对硝化工艺的影响氨氧化是硝化过程发生的第一步反应，也是整个硝化过程的限速步骤[89】。氨氧化与AOB菌群的结构和代谢活性密切相关，这是因为不同的AOB种群具有不同的底物亲和力、生长动力学和对环境因素的敏感程度。在废水处理装置中往往存在稳定的AOB菌群结构，如果AOB菌群的生理代谢特点与反应器设计和操作越适应，对于环境波动的抵抗力越强，AOB菌群的多样性越高，则理论上废水处理装置的氨氮去除效率和稳定性就越高[96，133，134]。废水装置中AOB菌群的结构与进水组成有一定的联系。在氨氮浓度低的地方，往往是Nitrosospira属的AOB种群占优势【95】，而在氨氮浓度高的地方，因为Nitrosomonas属对底物有更高的亲和力(见1．3．2．3硝化菌的生理代谢)，所以往往是Nitrosomonas属的AOB种群占优势【117】。而在处理含盐分较高的废水时，往往是比较耐盐的Nitrosococcusmobilis属的AOB种群占优势[961。虽然进水成份能够调节AOB菌群的构成，但是因为废水处理系统的迸水成份往往是很难控制和改变的，所以通过反应器的设计和操作来调节AOB菌群的构成才是可行的途径[8U。因此，不少学者对于各种反应器设计和操作对于AOB菌群的组成和代谢活性进行了广泛的研究。TURBON是一种循环床式生物膜反应器(circulating—bedbiofilmreactor)，这种反应器能够在较宽的碳氮比范围内稳定而高效地进行硝化反应。Lazarova等[91】对一个TURBON反应器在不同操作条件下硝化菌的活性和结构组成进行了研究，他们发现当COD的氧化比较强烈时，硝化作用就会受到抑制，同时AOB菌群的数量会减少且结构也会发生变化。Rowan等[134】比较了两个分别按照曝气生物滤洲／．(biologicalaeratedfilter，BAF)和滴滤池(tricklingfilter)设计，但是处理相同废水的工业装置之间AOB菌群构成精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文及多样性的差异。他们选择性地扩增AOB菌群的16SrDNA片段，然后用DGGE分析每个装置以及同～装置不同部位之间AOB菌群的构成，最后构建克隆文库对DGGE中的优势条带所代表的AOB种群进行鉴定。结果发现虽然两个处理装置之间和同一处理装置内部不同部位之间AOB菌群的构成都存在明显差异，但是两个工业装置中几乎所有的AOB种群都属于Nitrosomonas属，并且最优势的AOB种群都是Nitrosococcusmobilis。Rowan发现滴滤池的氨氮去除稳定性高于曝气生物滤池，其AOB菌群的多样性也要高于曝气生物滤池。同时他们还发现曝气生物滤，池处理中AOB菌群的组成随着高度的变化而变化，对这种变化进行统计分析后发现变化是有规律的而不是随机的，这反映出反应器设计对于AOB菌群的组成的影响。Limpiyakom等[135]对12个氨氧去除效率不同和工艺不同的废水处理工业装置在三个不同季节内的AOB菌群的组成情况进行了调查，发现细菌的总数和AOB的总数分别在1．6x10‘2．2．4x1013细胞／升和1．0×109-9．2x1010细胞／升之间变化。季节的变化主要影响AOB的总量，而不影响AOB菌群的结构。虽然有些AOB类群比如Nitrosomonasoligotropha在样品中都存在，但是他们发现反应器设计对某些AOB类群有着明显的选择性，例如Nitrosomonaseuropaea-Ni帮osococcusmobilis类群和Nitrosomonascryotolerans类群只出现在一个采用厌氧一缺氧一好氧(∥／o)7-艺的废水处理装置中，而Nitrosomonascommunis类群则几乎仅仅出现在采用A2／O工艺或者厌氧．好氧工艺的废水处理装置中。他们同时还研究了反应器的操作条件对于AOB群落结构的影响，结果发现污泥停留时间(solidsretentiontime，SRT)和溶解氧浓度对于AOB菌群的结构影响不大，而溶解氧浓度则主要是影响AOB菌的细胞比氨氮氧化速率。Hallin等[136]专门研究了SRT对于AOB菌群的影响。他们分析比较了SRT分别为lO．7天和15．6天的两个工业装置中AOB群落结构以及氨氧化活性的差异，结果发现这两个工业装置AOB菌群的氨氮氧化活性均未达到最大值，同时SRT的不同只会改变AOB菌群的氨氧化活性，而不能改变整个AOB群落的结构。改善硝化工艺条件，可以通过改变AOB菌群的数量、结构或者氨氧化活性来实现。Hallin等的实验结果表明我们有可能采用适当的操作条件，在不改变AOB菌群结精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述构的前提下，通过改变AOB群落的生理代谢活性来改善废水处理中的氨氧化过程。Coskuner等[137]改进了FISH对AOB菌群定量的方法，在这一新方法的基础上，能够对废水处理厂中AOB菌群的细胞比氨氮氧化速率(cell—specificammoniaoxidationrate)作更为准确的实验测定并与理论值达到一致。他们使用这～个新方法对多个废水处理厂中AOB菌群的细胞比氨氮氧化速率进行了测定，结果发现在这些废水处理厂之间AOB菌群的氨氮氧化速率相差100到1000倍，在氨氮去除效率最差的废水处理厂中AOB菌群的细胞比氨氮氧化速率最高，这表明AOB菌群的细胞比氨氧化速率可以作为微生物群落结构优化的一个非常重要的指标，同时也表明通过改变AOB菌群的生理代谢活性来改善废水处理中的氨氧化过程具有广阀的应用前景。Coskuner等假设存在一个AOB菌群的细胞比氨氧化速率的阂值，只要在阈值之上就会存在氨氮超标排放的危险，而低于阈值就可以达到稳定去除氨氮的目的，但是如果低于闽值过多就要多付出操作成本。因此在反应器设计固定的情况下，AOB菌群的优化可能并不需要改变AOB菌群的组成，而只需要调节它们的比活性到低于闽值的水平但同时又要把操作成本控制在最低的水平。因此，如果AOB菌的细胞比氨氮氧化速率高于阂值，也许可以通过增加污泥停留时间和曝气来降低AOB菌的细胞比活性，这样就可以达到稳定去除氮氮的目的。如果AOB菌的细胞比氨氮氧化速率高于远低于阂值，也许可以通过减少曝气来增加AOB菌的细胞比活性，这样就可以达到降低操作成本的目的。1．2．3．3对反硝化工艺的影响在碳氮比较低的废水中，需要间歇地加入甲醇、乙醇和乙酸或者原废水作为电子受体来使反硝化进行得更为完全。使用甲醇的优点是成本最低，但缺点是迟滞期较长，大约需要几天到几个星期的时间，反硝化率才开始显著提高。虽然人们很早就发现了这个问题，但是一直不知道如何通过优化反应器的设计和操作来减少迟滞期，这主要是因为还不清楚哪些种群是能够利用甲醇进行反硝化的功能菌，这些种群生理代谢的特点如何，以及如何根据这些特点来加速它们在群落中的增殖。Ginige等f87】通过将SIP技术与全套的rRNA技术相结合，寻找能够利用甲醇进行反硝化的微生物种群，随后又使用FISH．MAR技术对结果进行进一步的41精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文验证，结果发现能够使用甲醇进行反硝化的重要功能菌主要属于Methylophilales目，而这些重要功能菌在反硝化中的作用之前还没有被研究过。在此工作的基础上，人们有可能根据这些重要功能菌的生理生化特点来优化反应器的设计和操作以缩短甲醇所产生的迟滞期。此外，乙酸也是经常添加的电子供体，它的成本要高于甲醇，但是迟滞期较短。最近，Ginige等[86】又使用同样的实验方法，研究了以乙酸为电子供体进行反硝化时，微生物群落中的重要功能菌。他们发现微生物秽洛中以乙酸为电子供体进行反硝化的重萝功能菌群主要属于Comamonadaceae科和Rhodocyclaceae科，这一工作为进一步优化以无酸来强化反硝化的工艺操作提供了重要的工作基础。因为乙酸可以进入三羧酸循环而被大多数微生物所利用，所以人们普遍认为在以乙酸强化反硝化过程中，乙酸对群落结构的影响不大。但是Ginige的研究结果表明乙酸对微生物群落结构有显著影响，所以Ginige等建议在选择利用乙酸为电子供体来强化反硝化之前必须要先了解乙酸对于群落结构的影响。1．2．3．4对厌氧处理工艺的影响有机物在厌氧反应器里的降解是一个非常复杂的过程，往往需要多个微生物种群之间协同作用才能完成。在厌氧条件下，甲烷产生菌(methanogens)和硫酸氧还原菌(sulfate．reducingbacteria，SRB)往往催化有机物降解的最后阶段，它们需要依赖其它的微生物先把复杂的有机物降解为几种简单的化合物，然后再把这些简单的化合物进一步降解为甲烷、乙酸或者二氧化碳等物质。甲烷产生菌和硫酸盐还原菌所催化的反应往往是有机物降解过程的限速步骤，因此加速这些微生物的代谢活动对于提高厌氧反应器的效率非常重要。Raskin[138]等研究了流加硫酸盐对厌氧反应器群落中甲烷产生菌和硫酸氧还原菌的影响。他们让一个处理含葡萄糖废水的固定床生物膜厌氧反应器先在不流加硫酸盐的条件下运行，然后再在流加硫酸盐的条件下运行，通过FISH技术分析流加前后微生物群落的变化来反映硫酸盐对于微生物群落的影响。他们发现，即使在流加硫酸盐之前，硫酸盐还原菌也大量存在(比例约为15％)。在不流加硫酸盐的情况下，硫酸盐还原菌的作用可能是利用有机物进行发酵或者利用质子氢来42精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述合成乙酸。在加入硫酸盐以后，硫酸盐还原菌的比例迅速上升到30—40％，而甲烷产生菌的比例则由原来的25％迅速降低到约8％，与此同时硫酸盐被迅速还原而甲烷的产生速率明显下降。当反应器停止流加硫酸盐以后，甲烷的产量和产甲烷菌的比例直到50天以后才得到恢复。提高厌氧反应器处理效率的关键途径之一是提高反应器的生物量，而污泥颗粒化是有效提高反应器中微生物生物量的途径之一。污泥的颗粒化除了能够提高反应器中微生物生物量之外，还具有以下优点：(1)颗粒污泥不容易被冲出(washout)反应器，所以可以允许反应器在更高的进水流速下工作，；(2)可以在不改变水力停留时间的条件下，调整微生物的生长速率；(3)减少出水中悬浮物的数量。虽然颗粒污泥(granule)具有很多的优点，但是在处理某些污水时，颗粒污泥却难以形成。上流式厌氧污泥床(upflowanaerobicsludgebed，UASB)是目前较好的利于污泥颗粒化的反应器设计之一，但是即使使用UASB反应器，在处理高脂肪含量的工业废水(比如乳品工业废水和冰激凌废水)时，颗粒污泥也不易形成。这是因为某些微生物能够利用脂肪产生胞外多糖，而胞外多糖会阻止颗粒污泥的形成，即使这时往反应器中投加颗粒化的污泥，也会在短期内解体。Uyanik等发现[3】在处理冰激凌废水的UASB反应器中，添加多聚物KymeneSLX．2可以明显促进颗粒污泥的形成。与不添加多聚物添加剂的反应器相比，在添加了多聚物的反应器中，颗粒污泥不仅形成的时间缩短而且体积更大、密度也更大，这表明添加多聚物添加剂可以提高微生物的停留时间，提高厌氧反应器中微生物的生物量。提高厌氧反应器处理效率的另一个关键途径是给关键的厌氧种群提供优化的反应器条件。在处理冰激凌废水的过程中大量的脂肪会被产酸的微生物部分降解为长链脂肪酸，而这些长链脂肪酸会抑制产甲烷菌的生长进而影响整个反应器的处理效率，但是长链脂肪酸对产酸微生物却没有明显的抑制。所以如果能够把整个厌氧处理相对分成酸化阶段和产甲烷阶段，为敏感的甲烷产生菌提供合适的反应器条件，就可以大幅提高整个处理过程的效率。据此，Uyanik等【3】对UASB反应器的结构也作了改进，通过加入挡板，如图1．3所示，他们把一个反应器形成了四个小室(compartment)，这种新型的UASB反应器被称为厌氧挡板反应器精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文(anaerobicba用edreactor，ABR)。Uyanik等发现，虽然四室都有甲烷产生，但是从第-d,室到第四小室甲烷的产量逐渐增加，这种新型的反应器设计确实显著提高了冰激凌废水的处理效率。Uyanik等对ABR反应器的四个小室中微生物的群落结果作了比较[139]。他们发现能够自发荧光的甲烷产生菌在第一个小室中的比例只有l，5％，而在最后一个小室中这个比例达到了15％，这表明每～个小室都含有不一样的微生物群落结构。在最开始的小室中，是产酸的微生物占优势，而在后面的小室中甲烷产生菌占优势，Uy．，,aik把这种现象称为厌氧微生物的部分空呼1分离(partialspatialseparationofanaerobicbacteda)。扫描电子显微镜的结果表明，在最开始的两个小室中，最优势的是能够以H2／C02和甲酸为底物的古菌，比如Methanobrevibacter、Methanococcus，而在最后的两个小室中优势的微生物转变为能够利用乙酸的古菌，比如Methaaosaeta、Methanosarcina。Uyanik还观察到同一颗粒污泥还存在着明显的分层现象，不同层中分布着不同的微生物种群。Briones等[140]对Uyanik等在厌氧反应器的小室化设计(compartmentalized)方面取得的成功经验进行了理论分析，他们并认为小室化设计是提高厌氧反应器效率最有希望的途径。Briones把这种小室化设计的成功归结于该设计引入了系统的异质化(systemheterogeneity)，并把系统的异质化分为了两个层次：第一个层次在于小室化设计使得不同的小室按照一定空间的顺序执行不同的任务；第二个层次在于小室化设计促进了颗粒污泥的产生，在颗粒污泥内部形成物理化学梯度有利于群落中不同的种群在找到合适的生态位。Briones把系统的异质化对反应器效率的提高，在理论上归结为具有不同功能的类群在空间上或者时间上的合理衔接(functionalnichecomplementarity)。Kuscu等[141]使用ABR反应器也成功实现了厌氧条件下对难降解化合物对硝基酚的生物降解，进一步说明了ABR这种新型的厌氧反应器在设计上的合理性以及广泛的用途。44精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述$。1mm嵋Gin．Coll。atkmPort‘Samplingport冒1-3．ABR反应器示意图【3JFig．1_3．SchematicofABRreactor1．2．4应用反应器的操作和设计对微生物群落结构进行优化应用反应器的设计和操作对微生物群落进行选择，目前还处于非常初级的阶段。但是，近几年来通过微生物分子生态学的技术，人们对于参与废水处理的各个微生物类群的生理代谢有了较为深入的了解，对于反应器的设计和操作对微生物群落的影响的研究也在加深。这些知识的积累为运用反应器的设计和操作对微生物的种群进行选择，实现微生物群落的优化奠定了坚实的基础。根据微生物种群在动力学参数(比生长速率、对底物的亲和力等)、代谢途径、菌胶团形成能力、对生物膜的附着能力和对环境条件变化的抵抗能力上(robust)的差别以及微生物种群之间共生和竞争的相互关系，可以选择适当的反应器设计和操作对需要的微生物种群进行选择，并同时抑制不需要的微生物种群，以实现微生物群落结构优化，达到提高反应器的处理效率和稳定性的目的。Yuan等提出了三类不同的对微生物种群进行选择的方法，分别是代谢选择(Metabolicselection)、动力学选择(Kineticselection)和物理选择(Physicalselection)[81】。根据对可培养的菌胶团菌和丝状菌生理特点的研究(见1．3．2．1)，学者们发现菌胶团菌相对于丝状菌在高底物浓度下，对底物有更高的摄取速度。选择池利用两者之间生理上的差别，可以实现菌胶团菌和丝状菌之间的不平衡生长，达到抑制丝状菌的过度生长的目的。因为迸水首先进入选择池(图I-4)，所以选择池的底物浓度很高而曝气池的底物浓度很低，因此在选择池里菌胶团菌能够快速摄入精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文底物并在胞内合成糖原或者PHAs作为储能物质。而进入曝气池以后，丝状菌能够利用的底物已经很少，因而生长受到抑制，而菌胶团菌却能够分解利用在选择池里合成的糖原和PHAs来满足其生长和代谢的需要，这样群落经过选择池与曝气池之间的往复筛选，丝状菌的生长就能够得到有效抑制。选择池出现后很快就在废水工业处理系统中得到了广泛应用。虽然选择池是目前世界上应用最为广泛的防止污泥膨胀的装置，但是仍然有不少选择池在控制污泥膨胀方面失败的例子[142]。一般选择池对于Type021N、Thiothrixspp．和S№m凇等丝状菌的控制比较成功，但是对其占一些丝状菌的控制却不理想[79】。随着对于丝状菌生理代谢研究的深入，学者们发现有些丝状菌有着比较独特的生理代谢特征，因此对于选择器的设计和操作提出了改进的意见。比如膨perideroedes在好氧和缺氧的条件下具有与菌胶团菌相当甚至可能更高的底物摄取速率和PHA贮存能力，但以亚硝酸为电子受体或者厌氧的条件下时，膨perideroedes能够利用的有机物则大幅减少，因此如果群落中的丝状菌MPerideroedes的比例很高，就应该让选择器在厌氧的条件下操作或者在选择器中流加亚硝酸盐才能取得较好的控制效果【71】。HighCOOLowCOD$econd”ysettlingtankSludgerecyclel-4．通过选择池来控制污泥膨胀发生的废水处理装置示意图，选择池(selector)中COD受高而曝气"池(aerationtank)*COD浓度较低，污泥在这两种反应器中交替循环可以控制丝状茵的生长防止污泥膨胀的发生．Fig．1-4．Schematicofwastewatertreatmentsystemwithselectortooantrolsludgebulking．在废水的脱氮处理过程中，一般使用的是把NH：氧化成Noi(2—1)，再进一步氧化成No；(2-2)，然后再进入反硝化的途径(2—3)·但是如果能够把硝化精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述过程停留在N0i阶段，然后直接进入反硝化途径(2-4)，就可以节省25％对氧的需求，因此可以节省大量曝气所需要的能源，这种新的工艺就叫做部分硝化工艺(partialnitrification)(图1-5a)【5】。并且在处理低C／N的废水时，采用部分硝化工艺还可以使对碳源的需求减少约40％，实现部分硝化工艺的关键是对硝化菌群进行控制，尽量减少群落中亚硝酸氧化菌(NOB)的比例，提高氨氧化菌的比例(AOB)，控制方法之一是利用AOB·和NOB在生长速度上的差别。NOB的生长速度对于温度变化更为敏感，在较高的温度下(高于2632)，NOB的生长速度要低于AOB，因此在高温的条件下，只要能合理地控制污泥停留时间，就能够使得NOB在反应器中被稀释掉(washout)，而同时AOB的群落能够在反应器中得以保留。这一控制方法目前已经在SHARON(SinglereactorHi曲activityAmmoniaRemovalOverNitrite)-1-艺[14316a得到了应用(图1-5b)，在该工艺中需要把一半的NH：氧化成N07，然后可以利用ANAMMOX工艺进行脱氮(2．5)。另一个对硝化菌群进行控制的方法是，在序批式反应器中对硝化过程中的pH和DO进行在线控制。在氨氧化过程接近完成时反应器的pH会出现从下降到上升之间的转折点，而DO上升的速度会突然加快，这时如果及时停止曝气使反应器进入缺氧阶段，NOB就会因为无法获得足够的氧气而使生长和代谢受到抑制，从而使亚硝酸的氧化不能进行或者很少发生[144]。NH4++1．502J曼墨些堕一N02’+214++H20(AG。’=-27510too|1)(2—1)NO，’+O．50，—塑墼墼堡bNO|‘(AG“=-74kJmoFl)(2．2)NO，一+H++5(H)—塑塑L÷O．5N，+3H，O(2．3)N02-+H++3(H)—匡堕些堕寸O．5N2+2H20(2-4)NH4++NOi—』坠塑塑生堕—}N2+H20(AG们=-357kJmol。‘)(2·5)精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文i．PartialnitrmcalionNz“00)NIl,*／NO：———————1。Anammox《爿"50J图1-5．部分硝化工艺流程图，(a)一般的部分硝化工艺；(b)SHARON工艺，括号内的数字表示各种舍氮化舍之间的比例．Fig．1—5．Fluxdiagramsofthepartalnitrification,(a)partialnitrification；(”SHARON[51．1．3本章总结深入开展废水处理过程中微生态学的研究是发展更为高效而稳定的废水处理工艺的基础。微生物分子生态学的发展，突破了传统分离培养的限制，能够对废水处理中微生物群落的结构和功能进行深入的分析。为了实现微生物群落结构的优化，学者们对废水处理系统中微生物群落的种群组成、多度和分布进行了广泛的研究，并对其中一些重要的功能类群包括菌胶团菌、硝化菌、反硝化、聚磷菌、糖原积累菌和一些重要污染物的降解菌在原位的生理和代谢行为进行了深入的研究，获得了大量关于这些重要类群在动力学参数(比生长速率，对底物的亲和力等)、底物利用、代谢途径和菌胶团形成能力等方面的知识和数据。同时，学者们还广泛地研究了不同的反应器设计和操作对除磷、硝化、反硝化和厌氧处理过程中微生物群落的影响。利用不同功能类群在生理代谢上的差别，使用不同的反应器设计和操作策略可以实现对这些关键种群的调控和优化。目前在丝状菌的控制，糖原积累菌的控制和硝化菌的选择等方面已经取得了一些成功的经验，进一步应用微生态学在废水处理研究中所获得的新的精品参考文献资料n优秀毕业论文第一章文献综述知识、数据和方法对微生物群落的结构进行调整和优化仍然具有巨大潜力。目前对于废水处理系统的微生态研究往往是针对系统中一个或者几个反应器单独进行，但是废水处理的过程往往是由多个反应器来协同完成的，所以对废水处理系统中微生物群落进行系统分析非常重要。这样的研究会促进我们对于同一个处理系统中不周反应器群落之间的相互关系和作用的了解，而这些相互关系和作用对于实现处理系统在生态上更为合理的控制是必不可缺少的D40]。本文以采用Al—A2一O固定生物膜法工艺处理焦化废水的一套工业系统和土套实验室系统为对象，从群落空间演替的角度来研究系统中不同反应器群落之间的相互关系，并在此基础上对工业装置的故障进行了诊断并实现了工业处理装置的功能恢复，通过对关键反应器的群落结构的进一步对比分析，阐明了功能恢复的微生物生态学机理，进一步说明微生物群落结构在整个处理系统中的空间演替模式可以作为系统优化调控的重要依据。1．4参考文献1．Wagner,M．andA．Loy,Bacterialcx)mmunitycompositionandfunctioninsewagetreatmentsystems．CurtOpinBiotechnol，2002．13(3)：P．218-27．2．Schleifer,K．H．，Microbialdiversity：Facts，problemsandprospects．SystematicandAppliedMicrobiology,2004．27(1)：P．3-9．3．Uyanik,S．，P．J．Sallis，andGK．Anderson，Theeffectofpolymeradditionongranulationinananaerobicbaffledreactor(ABR)．PartI：processperformance．WaterResearch,2002．36(4)：P．933．943．4．Harms，G，etal．，Real-timePCRquantificationofnitrifyingbacteriainnmunicipalwastewatertreatmentplant．EnvironmentalScience&Technology,2003．3“2)：P．343-351．5．Schmidt,I．，eta1．，Newconceptsofmicrobialtreatmentprocessesforthenitrogenremovalinwastewater．FernsMicrobiologyReviews，2003．27(4)：p．481-492．6．Graham,D．WandV．H．Smith．Designedecosystemservices：applicationofecologicalprin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以用来帮助诊断系统故障出现的位置和原因，而且还能帮助我们找到促进系统生态恢复的关键启动条件进而实现系统功能的修复。关键词：系统轨迹分析，主成分分析，变性梯度凝胶电泳，群落空间演替，实时定量PCR精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空间演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用ABSTRACTAmalfunctioningwastewatertreatmentplantcanbeconsideredasadegraded,damagedordestroyedecosystem,whichcallsforrestorationintervention．Theoryandmethodofecologicalrestorationcouldbeusedtodiagnoseandrecoverthemalfunctioningsystem．Inthischapter,systemtrajectoryanalysisforspatialcommunitysuccessionwasusedfortherecoveryofamalfunctioningindustrialsystemtreatingcokingwastewater．Alab—scaleAl—A2·Ofixed—biofilmsystemwassetup蠲referencesystemwithhi。ghtreatmentefficiency．Thelabsystem谢tll(recylingratio：3：1)andwithouteffluentrecirculation，andtheindustrialsystemWereconsideredaSareferencesystem．asystemwithknownmalfunctionandasystem、Ⅳithunknownmalfunctionrespectively,whosespatialcommunitysuccessionpattenswerecomparedbysystemtrajectoriesanalysis．SystemtrajectoriesforspatialcommunitysuccessionpatternsweredisplayedintwodimensionsspacebyPCAanalysisofthel6SrDNAV3PCR-DGGEfingerprintsofallreactorsinthesystems，SystemtrajectoriesofthereferencesystemandtheindustrialsystemrevealeddisruptedsuccessionfromtheA2tothe04reactorintheindustrialsystemwasmostlikelyduetoinadequateaeration．EngineersfinallyfoundthefaultindesignandinstallmentoftheaerationsystemintheOreactors．Twoweeksafterrenovationoftheaerationsystem,spatialcommunitysuccessionappearedintheindustrialsystemandfunctionsoftheindustrialsystemalsobegantoberecovered．Howeverpumpforrecyclingeffluentdidnotworkproperlyafterrenovationoftheaerationsystem．Lowrecylingratio(I：1)decreasedthenitrogenremovalefficiencyoftheindustrialsystemandledunnormalspatialcommunitysuccessionpattemoftheindustrialsystem：theA2reactorneartheAtreactorbutfarawaryformthe0rcactorinthesystemtrajectoryofspatialcommunitysucessionoftheindustrialsystemwhichWaSmoresimilartothatofthesystemwimknownmalfunction．Afterthepumpwasrepaired，theA2reactornearthe0reactorbutfarawaryformAlreactorinthesystemtrajectoryoftheindustrialsystemindicatedthespatialcommunitysuccession精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文paRemverysimilartothatofthereferencesystemwasestablishedintheindustrialsystem．IdentificationofkeypopulationsbasedonPCAloadingsanalysisofsystemtrajectoryofreferencesystemsuggestedthatThaueraandNitrospirawerethemostimportantpopulationsindrivingcommunitysuccessionfromtheA2tothe04reactor．Theresultsofreal-timePCRindicatedduringspatialsuccessionfromtheA2tothe04reactor,theabundanceofNitrospirapopulationgraduallyincreasedfrom4．0X10jI他DNAto6．04X107／IxgDNAandtheabmldanceofThauerapopulationgraduallydecreasedfrom1．1XIoS／I_tgDNAto8．6Xi06／p,gDNA，thereforeautotrophicNitrospiragraduallyreplacesofhetemtrophicThaueraasdominantpopulationincommunityisthegoverningprocessduringthiseommtmitysuccession．ThemechanismofthiscommunitysuccessionisthatCODconcentrationisdecreasedbymetabolismofThauerapopulationwhichleadstohabtatsfromtheA2tothe04reactorgraduallynotsuittothegrowthofThauerapopulationbutgraduallyfavorthegrowthofNitrospirapopulation．Therefore．systemtrajectoryanalysisforthespatialcommunitysuccessioncanthusbeusedtodiagnosewhereandwhymalfunctionsoccurredandhelpustoidentifykeyconditionstopromptecologicalrestorationofmalfunctioningsystem-KeyWords：systemtrajectoryanalysis，principalcomponentanalysis，denaturinggradientgelelectrophoresis，spatialcommunitysuccession,real—timePCR精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空间演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用引言：废水处理过程中各种污染物的转化必须依靠多个微生物群落来协同完成，因此废水处理系统无疑是一种工程化生态系统【2，3]。很自然，一个出现故障的废水处理系统可以看作是一个退化的、损坏的或者破坏的生态系统，如果这个生态系统能够恢复到正常状态，那么废水处理的功能也能够得到恢复，所以对系统故障的诊断和排除过程实际上也是一个生态修复过程。因此生态恢复的理论和方法对于废水处理系统的修复具有重要的指导作用[4，5】。只有把不同设计、不同操作条件和不同功能的多个反应器在时间或者空间上合理地整合在系统中，让它们的功能之间相互补充、相互促进，系统才能够高效率地完成废水处理设定的目标。同一系统的反应器群落之间存在着密切的联系和相互作用，前一个反应器群落的代谢活动，往往会改变废水中污染物的组成和物理化学性质而影响下一个反应器中群落的结构组成，并且这些反应器群落之间还存在着微生物的交流。群落之间的相互关系和作用形成了系统特有的时间或者空间群落演替模式。一旦系统的时间或者空间群落演替模式发生了变化，往往就意味着系统中反应器群落之间功能上相互补充、相互促进的关系受到了破坏，此时系统就会出现故障。所以，时间或者空间的群落演替模式作为系统的重要属性可以用于指导故障系统的生态修复过程。将PCR-DGGE和实时定量PCR等分子生态学技术与主成分分析(princip·alcomponentanalysis，PCA)相结合可以对系统中群落的时间或者空间演替进行系统轨迹分析【6．9】。PCR-DGGE能够同时测定空间上或者时间上多个微生物群落的结构。PCR-DGGE指纹图谱中每一条带迁移位置和亮度的数字化可以将指纹图谱与高维空间中的一个点相对应，将这些点沿着时间或者空间方向连接起来就可以得到系统的群落时空演替轨迹。这些高维空间的系统轨迹非常复杂，为了便于分析比较，还必须借助PCA分析对系统轨迹的主要特征进行提取，然后在一个二维或者三维空间里把系统轨迹直观地展现出来[5，6，8】。在PCA分析的基础上，再对那些主成分载量较高的DGGE条带进行鉴定，就可以知道哪些种群是推动群落演替进行的重要种群。进一步可以用实时定量PcR对这些重要种群在演替过程中的动态变化进行定量测定，以消除PCR的偏好性以及DGGE的分辨能力等方法偏差对精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文于实验结果的影响[101。焦化废水是煤化工过程中产生的，其中含有高浓度的氨氮和致癌致畸的有机物物质比如酚类物质、多环芳烃和杂化化合，这些污染物都会对环境造成严重的破坏。厌氧．缺氧一好氧(anaerobic．anoxic．oxic，A1一A2-O)固定生物膜工艺是处理焦化废水的常用工艺『11-13]。上海某焦化厂采用该工艺建立了一套工业装置来处理焦化废水，但是该工业装置的处理能力低下。该厂工程人员一直找不到故障出现的部位、原因以及解决问题的方法。为了获得理想装置下或者是正常工艺条件厂的时间或者空间群落演替模式，我们建立一套实验室装置作为参比系统。本章的研究目的就是在生态恢复的原理和方法的指导之下，7通过比较分析工业装置和参比系统群落空间演替的系统轨迹来寻找工业装置故障部位、原因以及启动工业装置生态恢复的关键条件进而实现工业装置功能的修复。另外我们还让实验室装置在不回流的条件下运行，并作为一个带有已知故障的系统。因为在这个已知故障系统中A2池与O池之间功能上相互促进作用的关系受到了破坏，所以系统的空间群落演替模式也应该会随之改变。我们用这个已知故障系统来检验我们所使用的方法是否能够找出该系统正确的故障部位。2．1材料与方法2．1．!工业装置和实验室装置的运行：上海某焦化厂为了处理其日渐增多的焦化废水按照AI-A2．O固定生物膜工艺设计并建造了一套焦化废水处理装置(以下称其“工业装置”)。工业装置的O池是一个圆环形的推流式反应器，整个0池沿着其内周可以平均分为4个部分，即01、02、03和04。Al、A2和。反应器的水力停留时间分别为6h、10h和23h。回流比保持在10：l。所有反应器都填充着半柔性填料，这些半柔性填料是由塑料环和合成纤维组成的【l】，生物膜就生长在这些填料上。该工业装置在我们对其进行研究之前已经运行了三年，但是其出水的氨氮和COD浓度都无法达到规定的排放标准。实验室装置的流程如图2．1所示。Al、A2和0池的体积分别为12L、20L和精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空间演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用46L。好氧池被三个挡板分为四个小室(Ol、02，、03和04)，这样的设计类似工业装置中O池推流式的反应器设计。实验室装置的进水取自与工业装置相同的焦化废水，在整个实验过程中进水COD浓度介于940．1496mg／L之间,NI-13-N浓度介于21．160mg／L之间。实验室装置中每个反应器的接种污泥均取自工业装置中相应的反应器，并且反应器采用的填料也与工业装置完全相同。实验室装置AI、A2和O池的水力停留时问也与工业装置保持一致。所有反应器的温度都通过电加热器控制在27℃到3l℃之间；pH值通过流加Na2C03控制在7．0—8．0之间；溶解氧浓度通过调整曝气量控制在3-6mg／L之间。图2一LAl．A2-O固定生物膜法处理焦化废水试验工艺流程示意图[1】Fi92·1SchematicofArA2一OfixedbiofimprocesstOtreatcokingwastewatef1．A1reactor2．A2reactor3．0Ireactor4．02reactor5．03reactor6．04reactor7．Pumpforinlet8．Pumpforeffluentrecirculation9．Aerator10．Baffle实验室装置在驯化完成后，先在没有回流的操作条件下稳定运行43天，然后再逐渐将回流比提高到3：1，最后系统在3：1的回流条件下稳定运行44天。实验室装置在驯化结束后取得了良好的处理效果，出水的COD和NH3-N浓度均可以达到国家排放标准。COD的测定采用重铬酸钾法。pH和DO分别用pH计(pHS·3C，雷磁，中国)和溶71精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文解氧电极(oxi330i，wTw，德国)测定。“LNR'’代表在不回流的操作条件下运行的实验室装置，即已知故障的实验室装置；“LW’代表在回流条件下操作的实验室装置，即参比系统；‘‘I，’代表出现未知故障的工业装置，“IRe'’代表修复后的工业装置。"LNR'’、“LR'，、·‘I”和“IRe”在反应器名称的前面，分别代表这些反应器分别是LNR、LR、I和IRe装置中的一部分。2．1．2生物膜采样、样品预处理和总DNA提取在实验室装置功能稳定时采集生物膜，采样方法与zhang等[13】的方法类似值有所改动，具体如下：分别从反应器的底部，中部和顶部采集4克生物膜样品(连同填料)，然后放入三角烧瓶里，加入10ml无菌的PBS缓冲液(每升中含有89NaCI，0．29KCI，1．449Na2HP04，0．249KH2P04,pH7．4)，然后剧烈地震荡将生物膜从填料上洗脱，这一步骤重复数次，直到生物膜被完全洗脱。工业装置生物膜样品的采集，需要预先在工业装置的固定的生物膜旁边加挂一串可以拔出的生物膜，取样的时候将生物膜从反应器中拉出取样。其他的取样步骤同实验室装置。按以下方法进行样品预处理：样品中加5倍体积的TENP缓冲液(50mMTris，20mMEDTA，100raMNaCl，0．019／mlPVP，pill0)和3粒玻璃珠，充分旋涡清洗样品。4"C，100009离心5min，收集沉淀，该步骤反复数次直到上清较为清亮。然后再用5倍体积的PBS缓冲液(Sg／LNaCl，0．29／LKCl，1A49／LNa2HP04，O．249／LKH2P04，pH7．4)旋涡清洗样品，收集沉淀，该步骤重复二次。然后再加PBS缓冲液悬浮样品沉淀，分装到10ml的离心管中，每管加4ml悬浮液和lml甘油，混匀后在．70℃保存。DNA提取采用本实验室建立的方法，将经过预处理的样品于4"C，80009离心lO分钟，收集沉淀(约500mg)。加2mlExtraction缓冲液(100mMTris，100mMEDTA，200ramNaCI，I％PVP，2％CTAB，pH8．O)和2粒玻璃珠，漩涡5min使样品充分悬浮。加入2mlSDS缓冲液(209／LSDS)，放置冰上5min并不时颠倒。样品于4"C，130009离心lOmin，将上清液转移到一个新的离心管中。加入4ml平衡酚，颠倒离心管使样品与有机相充分接触。然后4"C，130009离心15min，小心将上清精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空间演营的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用液转移到一个新的离心管中。同样的方法分别用2ml平衡酚加2ml氯仿，4ml氯仿各抽提一次。加入0．6倍体积异丙醇，上下颠倒混匀。样品于．20℃沉淀过夜，140009离心样品20min，倒掉上清液。用70％乙醇洗涤～次，然后冷冻干燥30分钟。用lOOplddH20溶解样品。加入1,5pIRnaseA(20mg／m1)，37’C消化20rain。用DyNAquant200荧光仪测DNA浓度，再用0．7％(wt／v01)t构琼脂糖凝胶(含有O．5mg／mL的溴化乙锭EB)d邑泳检测抽提DNA的完整情况，最后用UVI凝胶成像系统(UVItec公司)记录结果。提取的DNA样品在．20℃保存。2．1．316SrDNAV3区PCR-DGGE及主成分分析2．1．3．116SrDNAV3区PCIODGGE16SrDNAV3区PCR扩增所用的引物为P2(5’-ATTACCgCggCTgCTgg-3’)，P3(5’·cgecegccgcgegcggcgggcggggcgggggcacggggggCCTACgggAggCAgCAg-3’)(3I。PCR扩增采用Promega公司的TaqDNA聚合酶扩增体系。PCR扩增体系及程序采用Muyzer等人的方法【6l】。PCR扩增体系：dNTP(2．5mmol／L)4p110XBuffer5plMgCl2(250mmol／L)4“lP2(12．5pmol／R1)1斗LP3(12．5pmol／m)lm模板DNA20ngTaq酶(5u／斗1)0．4¨l加水至50“lPCR扩增采用“TouchDown”程序：预变性94℃4min变性94℃lmin、返火TalminL25个循环延伸72℃lminJ延伸72℃lmin退火温度Ta在前20个循环内，每两个循环降低一度，从65℃逐渐降低到56℃，然后剩下的5个循环中保持55℃。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文“Recondi“0ningPCIt"：第一轮PCR产物稀释十倍后作为新的模板再进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR反应体系和第一轮一样，但只扩增3．5个循环，这叫做“ReconditioningPCR'’[161。由于第二轮PCR过程始终存在大量的引物，所以“ReconditioningPCR”可以有效去除第一轮PCR产物中的单链DNA，减少DGGE中单链DNA污染对于图谱的观察和分析【14】。使用1．2％[wt／v01]的琼脂糖凝胶(含有0．5mg／mL的溴化乙啶)电泳检测扩增结果，用uVI凝胶成像系统记录实验结果。16SrDNAV3区PCR扩增产物可以通过bGGE进行分离。使用Bio—Rad公司的DCode系统进行DGGE分析，变性剂梯度为37。58％(100％变性剂的浓度为7M尿素和40％去离子甲酰胺)。实验采用8％聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为lxTris．Acetate．EDTA(TAE，pHS．4)。在电压200V，温度60"(2的条件下电泳200min，电泳结束后用IxSYBRGreenI(AMRESCO公司)染色，然后用UVI凝胶成像系统保存实验结果。2．1．3．2DGGE指纹图谱的主成分分析DGGE图谱条带的亮度和迁移位置都用ImageJ软件(http：／／rsb．info．nih．gov／ij0进行数字化。条带的亮度按照以下方法标准化：条带亮度=(直接从胶上读取的条带亮度×100／每个泳道内所有条带亮度之和)根据标准化后条带的亮度数据，在variance．eovariance矩阵的基础上进行PCA分析(principalcomponentanalysis)。PCA分析使用PAST软件(PalaeontologicalStatistics，version1．35b，http：／／folk．uio．no／ohammcr／past0完成，并在此基础上进行PCA载量分析，找到DGGE图谱中对主成分载量较高的电泳条带。2．1．4DGGE条带的鉴定为了对DGGE图谱中主成分载量较高的条带进行鉴定，还构建了LR03生物膜的16SrDNA克隆文库(方法同3．I．4)。先用已经构建好的LRA2(见第三章)和LR0316SrDNA隆文库(见第四章)对DGGE图谱中主成分载量较高的条带进行鉴定。仍未能得到鉴定的条带则按照本实验室优化的方法【14】，先割胶回收条精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空间演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用带中的DNA，然后再克隆测序进行分子鉴定。2．1．5实时定量PCR2．1．5．1Nitrospira属种群的定量在正常工艺条件下中与亚硝酸氧化菌相关的种群属于Nitrospira属的I亚区【15】，其序列与Dionisi等【16】提出Taqman荧光探针实时定量PCR方法的探针和引物完全匹配(见第四章相关内容)，因此可以用该方法对样品中Nitrospira属16SrDNA拷贝数进行定量测定。使用OPTICALII实时荧光定量PCR仪及配套软件(MJResearch公司)进行实时定量PCR实验。定量PCR反应体系中使用Takara公司的rTaqDNA聚合酶及缓冲液，并以3-10rig的样品基因组DNA或者lxl02到lxl07个拷贝的标准样品作模板DNA，每个样品测定四次。PCR扩增体系：dNTP(2．5mm01／L)2¨l10xBUtier2．5ulMgCl2(250mmol／L)2LLlNSRl113f(15pmol／pJ)1．2ulNSRl264r(15pmol／I．t1)1．2ulTaqMan探针NSRl1431恤l样品模板DNA3-10ngTaq酶(5u／I_t1)0．351al加水至25#lPCR扩增程序：预变性95℃3min变性95℃0．5minq卜55个循环退火延伸63℃lminj读取荧光值2．1．5．2Thauera属种群的定量引物THAU832F(5’。GTTCGGAGCAGCAATGCA-3’)是根据探针THAU832[17】精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文设计的，它不但与已经测序的16SrDNA全长文库(ULAl和LRA2文库)中Thauera属的克隆序列完全匹配(见第三和第四章相关内容)，而且也能与RDP数据库中Thauera属的大多数成员完全匹配【17】。引物ATDl420R是Azoarcus属、Tha“era属和Denitromonas属专一性的引物[17】，因此可以在SYBRGreenI实时荧光定量PCR中加入这对引物对样品中Thauera属的16SrDNA拷贝数进行定量测定。使用OPTICALⅡ实时荧光定量PCR仪及配套软件(MJResearch公司)进行实时定量PCR实验。定量PCR反应体系中使用Takara公司的rTaqDNA聚合酶及缓冲液，并以3-10ng的样品基因组DNA或者l×102到lxl07个拷贝的标准样品作模板Dp蛤，每个样品测定四次。经过实验测定，PCR中产生引物二聚体的解链温度低于82℃，而PCR产物的解链温度高于82℃l所以选择在82℃读取荧光值。PCR扩增体系：dNTP(2．5mmoI／L)2“l10xBUffer2．5ulMgCl2陀50retool／L)2ulTHAU832F(12．5pmol／91)0．5UlATDl420R(12．5pmol／“1)0．5“110XSYBRGreenI0．3“l样品模板DNA3-lOngTaq酶(5u／p1)O．351al加水至25p．1PCR扩增程序：预变性94℃3min变性94℃45s退火60℃45s延伸72℃lmin读取荧光值82℃恒温2．2结果与分析2．2．1LR、LNR和I系统功能的比较LR、LNR和I系统对COD和氮的去除效率如表2-l所示。参比系统对COD和NH3-N的平均去除率分别为85％和95％，参比系统出水的COD和NH3-N浓度都精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空间演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用低于国家标准，这说明使用A。A2．O固定生物膜法来处理该厂的焦化废水是合理的。而LNR系统，因为关闭了回流装置而导致其总体的脱氮效率大幅下降，由于这一故障的存在使其对总氮(totalnitrogen,TN)的平均去除率只有45％，明显低于参比系统的63％。而工业装置的COD和氨氮去除效率分别只达到54％和．106％，均远远低于参比系统，这表明工业装置出现了故障。表2．1．实验室装置(回流与不回流)和工业装置(修复前和修复后)的处理效率，(a)实验室装置(回流与不回流)；(b)工业装置(修复前和修复后)TABLE2．1．Theefficiencyoftreatmentofthelab-sealesystem(LNRandLRmodelandtheindustrialsystem(beforeandafterrestoration)．(数据由华东理工大学环境学院冯晓西，刘勇第研究小组提供)(a)实验室装置(回流与不回流)LabsystemwithoutefflHelitrecirculationLabsystemwithe铘uentrecirculationlnfluetitE用uerttRemovallnfluentEftluentRemoval唑型12【巴型121堑!!!!!Zl塑f巴型12血型121里!堕!!zf堑2COD966178811158169．285NH3一N45．70．79595．65．495TKN106．415．086175．5．35．780N02-N06．8，00．6／NO，-N1．437．9，3．230．8，TN107．859．745178．767．163(b)工业装置(修复前和修复后)2．2．2LR、LNR和I系统空间群落演替模式的轨迹分析和比较每个系统都取了相应的六个部位进行空间群落演替模式分析，其中AI、A2池分别为其中一个部位，而0池总体上是推流式反应器，所以被等距得分为四个部位(从01到04)。使用16SrDNAV3PCR—DGGE对每个系统六个部分的群落结构进行了分析，结果如图2．2所示。在这三个系统18个样品的DGGE胶上，一共有精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交遥大学博士学位论文402条条带分布在62个不同的迁移位置上，因此在一个62维空间可以分别用三条系统轨迹来描述这三个系统群落结构的空间演替模式。这些复杂的系统轨迹可以用PCA的方法进行简化。如图2．3a所示，经过PCA分析以后，LR、LNR和I系统的空间群落演替轨迹可以在一个二维平面上展现出来，并且近70％的数据差异能够由前两个主成分解释(第一和第二主成分分别可以解释36％和31．6％的数据差异)。参比系统的轨迹先沿着右上方从Al延伸到A2，然后再沿着右下方从A2延伸到04，A2池在系统轨迹中的位置远离Al池而紧挨着Ol池，这清楚地显示出Al-A2．O固定生物膜法工艺所应该具有的正常空间群落演替模式。而在出现故障的实验室和工业系统中，这种空间群落演替模式发生了迟滞或者停止。LNR系统的群落演替在总体上沿着与参比系统相似的轨迹，但是与参比系统不同的是在LNR系统中A2池远离O池而紧挨着AI池。这表明在LNR系统中，从Al到A2的空间群落演替发生了明显迟滞。而与参比系统相比，I系统从A2到04的轨迹封闭在一个很小的区域内，这表明在出现故障的工业装置中，从A2到04的空间群落演替的模式发生了停滞。2．2．3工业装置故障的诊断及修复LNR系统的故障是由于没有出水回流到A2池引起的，而其空间演替最明显的迟滞发生在A2池，正好反映出LNR系统故障出现的位置，这说明通过对空间群落演替的系统轨迹分析来诊断系统的故障位置是可行的。而对于工业装置来说，A2池到04池的空间群落演替发生了停滞，从PCR-DGGE指纹图谱上看A2池到04池几乎有着完全一致的群落结构(图2．2)，这说明故障发生的部位应该是A2池到04池。在正常的工艺条件下，A2池与O池的最大差别在于氧的供应，O池应该充分曝气而A2池则仅仅因为回流而带来极少量的溶解氧。好氧池生物膜供氧不足是造成A2到04群落结构几乎完全相同的最有可能原因。溶氧电极对溶解氧的测定结果表明虽然好氧池废水中溶解氧的浓度非常高，但生物膜中间却不能检测到任何的溶解氧，这说明好氧池生物膜供氧不足。工厂的工程师最终确信是因为好氧池中曝气装置的设计和安装问题导致了供氧的短路。当把曝气装置修好两个星期以后，系统轨迹分析表明A2池到04池的群落空间演替在工业装置中被建立精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空间演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用起来(图2-4a,b)。同时，工业装置的处理能力都得到了初步的恢复，其COD和NH3-N的去除能力分别达到了80％和94％(表2．1)。图2-2．LNR，LR和I系统所有反应器的16SrDlNAV3PCR-DGGE指纹图谱。“LNR，’和“LR，’分别代表回流和不回流条件下的实验室装置，‘1”代表工业装置．标有数字的条带都进行了鉴定，见表2—2．Fig．2．2．16SrDNAV3PCR-DGGEfingerprintingprofilesofthelab-scaleandtheindustrialsystem．“LNR，’and“LR'’representedthelab-scalesystemoperatedwithoutandwithe用uenIrecirculationrespectirely,“I”representedtheindustrialsyrstem．LaNeswerelabeledwithnamesofreactors．BandswithnumberlabelwereidentifiedanddescribedinTaIble2—2．精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文》，．／㈣?纽‘套＼。“m苏、≥夕＼．i．R02一电、／／¨R府／、U17、～童m一·／：’弋萝／；、弋2：芷乏|、霪竺三三三i赫’．／0，Pcl(90，’∞图2．3．对图2．2．PCR-DGGE指纹图谱所fb、A分析，(a)时LNR’uL和LR三个系统所有反应器指纹图谱的PCA分析；(b洌+LR系统中A2和0l—04池指纹图谱的PCA分析．“LNR-”和“LR-”分别代表回流和不回流操作条件下实验室装置的反应器，I-'代表工业装置的反应器．箭有代表空间的方向．Fig．2-3．PlotofPCAOilIX；GEfmgerpdntingprofilesofsystems(Fig．2-2)，(a)PCAonfingerprintingprofilesofLNR，LRandIsystem；(b)PCAonfingerprintingprofilesofA2toOtreactorofLRsystem．“LNR-”and“LR-'’representedreactorsofthelab-scalesystemoperatedwithoutandwitheffluentrecirculationrespectively,“I，’representedreactorsoftheindustrialsystem．Thea／rowsindicatethespatialaspect．但是，因为工业装置的曝气装置修复后回流泵又出现了故障(回流tE只能维持在1：1)，所以此时虽然工业装置出现了空间群落演替，但其模式仍然是不正常的：A2池在IRe系统演替轨迹中的位置仍然离A1池比较近(图2-4b)而离O池比较远，这种空间群落演替模式与LNR系统(已知故障系统)非常相似。在回流go精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空问演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用泵修好后，我们于2006年3月9日和18日又两次对工业装置中的群落演替进行了系统轨迹分析，结果表明A2池在演替轨迹中的位置更靠近0池而远离Al池(图2-4c，d)，这说明与参比系统类似的群落空间演替模式在工业装置中建立起来，标志着对工业装置生态修复的完成。●¨Ⅺ／、／，．．7＼．R／{㈠7一j{∥—＼Y"U(抛)no麓yi一1。％‘101=∥，：■t甜二一P(a)(b)02广＼pO2●-～＼A1＼￥∞E＼—、＼A1＼＼■!睨|＼＼、。—，b，^21(c)(d)8I精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文图2．4．工业装置所有反应器的16SrDNAV3PCR-DGGE指纹图谱及PcA分析，(a)修复前和修复后(2005．9．9)工业装置的指纹图谱；(b)对(a)的PCA分析；(c)修复后的工业系统(2006．3．s和2006．3．16两次取样)的指纹图谱分析：(d)对(c)的PcA分析．星号代表2006．3．8日的样品，三角代表2006．3．16目的样品．“I-竹和“IRej’分别代表修复前和修复后的工业装置，箭头代表空间的方向．(数据由本实验室毛跃健同学提供)Fig．2-4．DGGEfingerprintingprofilesofallresctorsinsystemsandtheirPCAanalysis，(a)fingerprintingprofilesoftheLRsystemandIResystem(2005．9．9)；(b)PlotofPCAoll(a)；(c)fingerprintingprofilesoftheIResystemat2005．9．9and2006．3．16；td)PlotofPCAon(c)．2．2．4群落空问演替中的重要微生物种裤找到驱动空间群落演替进行的重要微生物种群，不但可以帮组我们找到群落演替的主导过程而且还可以对群落空间演替的生态学机制作更深入的探讨。为了找到找到驱动空间群落演替进行的重要种群，我们对参比系统从A2池到04池空间群落演替的系统轨迹进行了PCA分析(如图2．3b所示)，PCI和PC2分别能够解释80．3％和14．2％的数据差异。然后通过PCA载量分析一共找到了7条具有较高PCI载量的条带以及1条具有最高PC2载量的条带，这些条带都代表了推动A2池到04池群落演替的重要种群，接着对这8条条带分别进行了鉴定(表2·2)。条带53具有最大的PCI负载量，它与Nitrospirasp．cloneb30(AJ224041)的相似性为97％，属于Nitrospira属的I亚区(sublineage)[15]。而条带34和35具有第一个和第二高的PCI正载量，它们都属于Thauera属。从DGGE图谱中可以看到条带53的亮度是逐渐增加的，而条带34和35的亮度是逐渐降低的，这说明Nitrospira属的种群水平数量逐渐增加，而同时Thauera属的种群水平逐渐下降。为了消除PCR的偏好性以及DGGE的分辨能力等方法偏差对于实验结果的影响，还需要用定量PCR对群落演替过程中Nitrospira属和Thauera属种群的动态变化进行定量测定。2．2．5群落演替过程中Nitrospira属和Thauera属种群的动态变化进一步使用定量PCR对LR、LNR、I和IRe系统中从A2池到04池Nitrospira属和Thauera属16SrDNA拷贝数的动态变化作了定量测定。Nitrospira属和Thduera属的定量标准曲线R2值分别为O．994和O．997，这表明循环阈值(Ct值)精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空同演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用与标准拷贝数的对数之间存在显著的线性关系(图2．5)。根据该标准曲线进行计算，在参比系统中，从A2池到04池，Nitrospira属的16SrDNA拷贝数从4．0X10s／pgDNA升高到6．04X107／i．tgDNA，升高了120倍(表2．3a)，而Thauera属的16SrDNA拷贝数则从1．1X10S／pgDNA降低到8．6X106似gDNA，降低约10倍(表2—3b)a这说明Thauera属的优势地位逐渐被Nitrospira属的种群所取代是A2池到04池正常群空间演替的主导过程(图2-6)。表2-2．对D(ⅪE胶(Fig．2．3)上的部分条带进行鉴定的结果TABLE2-2．SequencesimilaritiestoclosestrelativesandphylogenetieaffiliationsofDGGEbands4BandClosetrelativePCAIoadin矿竺鲨：鲨塾!!；鳖塾翌i蔓鲨竺：===!竺铲。∞，m，钾嚣：要P“a—一2黜：。0署，占南Rcaoxndegrading-0j1．016矿DQ98825999m训”：≯嘶”跏n枷4(AY661418、’—’taephthala=Uncultured11。DQ997048l∞doltaprotcobacteriurri．03，．。0913"DQ98829597proteob。ctermmcloneRhadoc”lacea"譬测IRB2(DQ069i9蚋Unculturedbeta026_006(015)(062)ecs265(AYl33064)Toluene-degrading20“DQ98827499sulfate-reducmg肿撕一。F出uel盏裟∥．051．o力60ckn“m(u49*29]Nitro$omonmeuropaea24"DQ98829799肺avsomonaJ016-0．06(BX321$56JOegradationofThaueraphenylaceaca‰lleYa0110．2331‘DQ$3743999(T)．B4P(AJ315678)compoun出HyabgenophdaccaeAChvatedsludge．002OO】33。DQ98529497bocknum．ID33t／catmgcokmg∞16)07)(-o(AY5781701mileraaromatieaDQ98528599strainLG356力Ⅵ㈣De口ad砒IofIof005240IW'OlllaglCcompounds34c(AJ315680)(．028)(-o50)Un∞l札∞dsludgeRhodobacter辛N嘛母m鲥％确研DQ99928399b“：c盯lum(AF234740)mLetlvatedsludge3，DQ997049100％日b㈣OilreservokThauemspA170．05029(-o241(-006)(AY570693)UnculmredbacteriumReactortreating025_o2238。DQ98828690％ActdobacteriumSHArl8(AJ249099)dichloropropane‘019)(0脚)SJA-36(AJ009461)trichloro咖(-016}(-ots)UricultaredbacteriumTeactorta'eahng52"DQgIm29lI98％Bacteriaclonebed044．044拶IX]9970J097NJtroJptraspNilrodpiraNi扛I如msb30(AJ224041【)(oso)(-o30UnCulturedbetaLTUforD0口口ln啦5fDQ53744198proteobactcnurnAllcaligewaceoehydrocarbons．0．01033(AY|44222)eontammaxedsite酽D1筇37447't00Sulfilrredueens．oDt0_2，PCA(AE017lso)Orcam“ofLRsystemfF㈣2JIb)fillcdm5ldcbracket‰∞ofPCA∞血wholeDGGEpatem(F192da)atefilledottuidebntekct血dthose伽血^2删．B柚出baycmarkedmFi￡20‘8扣deldenafiedflora16SrDNAclonelI蛔“recoverm$DNA‰han“”q“旭№sndscqn口emS．．Bmtdeaofie．dby精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文籁g枯掣运V-．q竽循环数阈值(Q)(a)Nitrospira属的定量标准曲线籁叵(数掣蛞V2普循环数阑值(Ct)(b)Thauera属的定量标准曲线图2．5．Nitrospira属和Thauera属的定量标准曲线表明循环数的阁值(Ct)值与标准质粒拷贝数的对数之间存在明显的缌陛关系(一·0．997)，(a)Nhrospira属的定量标准曲线；(b)l'hauera属的定量标准曲线Fig．2-5StandardcurveofNitrospiraand孤口啪showedlinearrelationshipbelweenthethresholdcycles(CtlandlogarithmofcopyllHmbetofstandardplasmidfrom(群=0．997)，(a)StandardCHIVeofNitrospira；(b)StandardcurveofTham口．精品参考文献资料n优秀毕业论文第二章群落空问演替的系统轨迹分析在修复工业废水处理系统中的应用在LNR系统中从A2池到04池，Nitrospira属的16SrDNA拷贝数也趋于不断升高，从1．4X104／p．gDNA增加到1．5X106／HgDNA，升高了约100倍(表2-3a)。从A2池到Ol池，Thauera属的16SrDNA拷贝数提高了2倍，但从Ol池到04池的过程中，Thauera属的16SrDNA拷贝数则从1．1X10s／lugDNA降低到1．3X107／IxgDNA，也降低了约lO倍(表2-3b)。但是与参比系统相比，在相应的反应器中，LNR系统Nitrospira属的拷贝数要比参比系统低10到40倍，这说明Nitrospira属逐渐取代Thauera属成为群落优势种群的演替过程在LNR系统中发生了明显的迟滞(图2-6a)。而从A2池到Ol池的过程中，参比系统中Thauera属的16SrDNA拷贝数降低了～倍，而在LNR系统中却升高了一倍，这也反映出了LNR系统的故障部位存在于A2池中(图2．6b)。在修复前的工业装置即l系统中，Nitrospira属的16SrDNA只能在A2池和Ol池检测到且拷贝数远远低于参考系统中相应的反应器(分别只有6．2X103拷贝／烬DNA和7．5x104拷贝／rtgDNA，见表2-3a)。而从02池到04池，Nitrospira属的16SrDNA拷贝数则低于线性检钡4限度，按照标准曲线的结果，本方法的灵敏度为模板中含有100个Nitrospira属16SrDNA拷贝，所以这些样品中Nitrospira属的多度应该少于1．0×104个拷贝mgDNA(均使用10ngDNA作为定量的模板)。而Thauera属的16SrDNA拷贝数从A2池到04池都维持在10s拷贝／岭DNA的高水平上(表2-3b)。这说明Nitrospira属逐渐被Thauera属种群取代的演替过程在I系统中发生了停滞(图2-6)。但在修复后的工业装置即IRe系统中，从A2到04池Nitrospira属的16SrDNA拷贝数从4．6X106／p．gDNA上升到1．2X107／p．gDNA，升高了3倍，达到了与参比系统相同的数量级(表2-3a)。而Thauera属的16SrDNA拷贝数，从1．7X108／i．tgDNA下降到了8．7X106／pgDNA，降低了约20倍，降低到与参比系统几乎完全一样的数量(表2-3b)。这表明群落演替中Nitrospira属逐渐取代Thauera属成为优势种群的过程在IRe系统被建立起来(图2．6)。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交远大学博士学位论文表2，3实验室装置(回流和不回流条件下)以及工业装置(修复前后)Nitrospira和Thauera属的16SrDNA拷贝敷的实时定量PCR测定结果。(a)Nitrospira属．(b)Thauera属．“II娘”和"LR”分别代表回流和不回流条件下的实验室装置，“I”和IRe分别代表修复前和修复以后的工业装置．TABLE．2-3．Quantificationofl6SrDNAcopynumberofNitrospiraandThaueragenerabyreal-timePCRinthelab-scalesystem(LNRandLRmode)andtheindustrialsystem．(a)Nitrospira，(”Thauera．“LNR"and‘‘LR，’representedthelab-scalesystemoperatedwithoutandwitheffluentrecirculationrespectively,“I”and“IRe”representedtheindustrialsystembeforeandafterecologicalrestorationrespe℃tively．(a)Nitrospira垒!旦191Q!堕LRsystem(4㈣6)E+54(3．4±1)E+5(3．4士0．7)E+6(4．蛀1．0)E+7(6o±1．0)E+7LNRsystem(1．4i-0．4)E+4(32-+-4．3)E+J(1．2士0．6)E+5(4．5-20．2)E+6(1．5士o．2)E+6’Isystem‘6．2-+-4．7)E+3‘7．5：t=lA)E+4对(a)的聚类分析．Fig3-3．ThemicrobialcommunitiesofallreactorsoflabsystemwithandwithouteffluentrecirculationwerecomparedbyDGGEfingerprimingprofiles．(a)16SrDNAV3regionPCR·DGGEfingerprinting；(b)clusteringanalysisof(a)．3．2．3回流前后A2池群落的16SrDNA克隆文库分析3．2．3．1克隆文库的库容分析通过DGGE指纹图谱的聚类分析，可以看到A2池的群落结构发生了重大变化，同时A2池的功能变化也最大(图3．2)，所以我们使用16SrDNA克隆文库技术对A2池群落结构的变化作了更为细致的分析。不回流的A2池文库(LNRA2)和回104精品参考文献资料n优秀毕业论文第三章刷流操作对AI．A2-O固定生物膜法焦化废水处理系统中微生物群落结构的影响流的A2池文库(LRA2)都含有90个克隆，按照97％序列相似性的标准，分别含有28和45个OTU(operationaltaxonomicunit)。在用文库的组成来比较样品群落结构组成差异之前，必须先要验证文库的库容是否能够代表样品中微生物群落的多样性，因为群落中所有种群往往很难在采样过程中都被采集到，所以在充分取样的条件下，生态学研究中经常使用多样性估算指数(richnessestimators)来推算环境中物种的种类数目。如果随着取样的增加，用多样性估算指数计算得到的样品物种种类趋于平稳，也可以反过来说明取样已经充分。据此，Kemp[15，161等发展出通过渐进取样来评价文库的库容是否已经足够的方法。这种方法的原理是，如果随着文库库容的增加，多样性估算指数趋于平稳，则说明文库的库容已经足够用来代表微生物的多样性。为了确保结果的可靠性，这种方法同时使用两对多样性估算指数Sch。l和S^CE来预测样品中微生物的种类。我们用这种方法对LNRA2和LRA2文库的库容分析结果表明，两个多样性估算指数对微生物种类数目的预测都已经趋于平稳，说明这两个文库的库容都已经足够用来代表各自样品中微生物群落的多样性了(图3．4)。Bq宣毒i§口p￡∞∞∞钟∞如撕伸o∞∞∞砷u口宣言口931罾∞∞00204060∞100LihalySb精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士：学位论文图3-4．使用渐进采样的方法来检验LRA2和LNRA2文库的库客是否足够代表样品中微生物群落的多样性Fig．3-4．PredictednumbersofphyIotypesbasedOnvaluesofSACE(．)andSchaoI(o)VS．1ibrarysize．(a)LRA2clonelibrary,(b)LNRA2clonelibrary．3．2．3．2克隆文库的系统发育分析与比较对两个克隆文库的系统发育分析表明，一共有73个OTU分别分布在不同的门或者纲中(图3．5)。其中，Betaproteobacteria纲分别是LRA2文库中的第一大微生物类群(占克隆总数的3l％)和LNRA2文库中的第二大微生物类群(占克隆总数的19．9％)。对Betaproteobacteria纲的系统发育分析表明(图3-6a)，LRA2和LNRA2文库中属于Betaproteobacteria纲的OTU主要分属于四个不同的类群，它们是Rhodocyclacea科，Comamonadaceae科，Alcaligenaceae科和Nitrosomonas属。其中Rhodocyclaceae科和Comamonadaceae科在LRA2和LNRA2文库中都是优势类群。LRA2．4与ThaueraaromaticaLG356的序列相似性为99％，ThaueraaromaticaLG356能够在反硝化的条件下利用苯甲酸和甲苯[281。另外，LRA2．9，13都属于Thiobacillus属，这个属在LRA2文库中的比例为5．5％。LRA2．9，13都与Thiobacillusdenitrificans(T)NCIMB9548非常接近(相似性分别为97％和98％)，Thiobacillusdenitrificans(DNCIMB9548具有利用无机硫元素进行反硝化的能力『29]。LRA2．6则与Diaphorobacternitroreducensstrain：KSP3非常接近，这是一种在活性污泥中分离的能够在反硝化条件下降解PHBV(polyhydroxybutyrate-valerate，聚羟基丁酸戊酸共聚酯)的微生物，它属于Comamonadaceae科【30】。LRA2—11与Alicycliphilusdenitrifieans(a3；K601的序列相似性为99％，它是一种在活性污泥中发现的能够在反硝化条件下利用环己醇的微生物，它也属于Comamonadaceae科【31】。在LNRA2文库属于Betaproteobacteria纲的OTU中，LNRA2，5，9，23分别与LRA2文库中的OTU：LRA2．6，14，4，13序列相近(相似性大于98．9％)，且都属于Rhodocyclaceae科或者Comamonadaceae科。LNRA2文库中Rhodocyclaceae科和Comamonadaceae科半数以上的克隆都能在LRA2文库中找到序列相似性大于97％的克隆，这说明精品参考文献资料n优秀毕业论文第三章回流操作对AI-A2-O固定生物膜法焦化废水处理系统中微生物群落结构的影响Rhodocyclaceae科和Comamonadaceae科的种群结构受回流操作的影响可能比较小。与此相反的是，属于Nitrosomonas属的OTU只存在于LRA2文库中，而属于Alcaligenaceae科的OTU则只存在于LNRA2文库中，所以这些类群是受回流操作影响比较大的类群。属于Nitrosomonas属的OTU只存在于LRA2文库中，可能是因为回流把好氧池中的溶解氧带到了A2池，使得A2池中能够保持较低的溶氧水平(O．5mg／m1)【l】，因此能够满足Nitrosomonas属种群生长对于氧的需求[32，331。曰丽习巴!纠f1盥曰一．盥一／／／／／／7／图3-5．LNRA2和LRA216SrDNA克隆文库中克隆在不同门(纲)的分布。Fig3-5．PhyIogeneticdistributionofclonesin16SrDNAclonelibrariesofLNRA2andLRA2．拟杆菌是LRA2文库中的第二大类群(占克隆总数的25．4％)，但在LNRA2文库只有四个克隆属于拟杆菌。对拟杆菌的系统发育分析表明(图3—6b)，LRA2文库中的拟杆菌主要属于Chitinophaga属和Flavobacteriaceae科。LRA2一l和LNRA2．11都属于Chin'nophaga属，它们与unculturedbacteriumHPIA28(AF502209)的序列相似性都为95％。LRA2．1是LRA2文库中最为优势的OTU(占克隆总数13．3％)，而LRA2．11只占LNRA2文库克隆数的2．2％，这表明在回流的作用下Chitinophaga属从A2池群落中的少数种群变成了优势种群。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博}学位论文，∞，^cdo啪，6_od_Ⅲ珊c椭C1(AJ4S7’91)≈，塑嚣口pfot。Ⅲ。OS川^B删!瞰oA|哪c|l碑I№撕啦mc∞snK601(AJ418044。L—UnculturldbectlIriumRE-01fAB087519)喇唿徽留掰搿溢潞∞“鳓rLRA2-8o’LLNRA2-2———广LRA2-12一唧m删"sp100LUric“tured讪础en洲81f似12e柏)妒地岫神。砷e笋^4归c·脚p．stfwfl：85841．S碑J5859啦)TRT-01fABl668鲫o‘～LRA2-44—LRA2-45’商rHyarogenoahagait々temTediamsl(AF019037)～LNRA2·137卜UnculturedbelcteriumTSAE01(ABJ8682Sl一LRA2·32JncⅢmredbactedumTrA懈(AY∞14C5●LRA2-33UricdturedbactmdonePL-33BS洲570sat)UqRA2．14厂LNRA2·“鬻描镪嚣猕鼢S戡蛳5’埘’Il舳姆鲫孔柳k岛麓I§麓乳mmd¨vv6(^y7709卿J厂LNRA2-23jqRA2·13}Ur．：uftured唧dq■n雌f幽鹭·HIMctedum=033(AY皇78170)一舟J曲{cfmB瑚触舯smi．--LRA2-9NCMB9朝8(AJ243144)一mooacdtu=aquaesu☆={LJ58019’uncuRurec／betaprolsobactenumCcs2衢(Ayl331撼,4)讶然‰Ⅲ，№(Ay235,∞8)LNRA2{呻一风援釜渊≤渊镶秽矸0|习飞础勰品№p|ot．女目．mSBRl001泔“252)．]1『L耐二撕LRA‰2：20mw¨03ATCC19544mix749，3)ll仁：；嚣并”。“”1{”8n●菩u■_『"lu壹奄l’鼍忡摅嬲一m．LGⅢ帅，∞卿lV7m"ha。u—era舅隳根躲姜嚣：”㈨””8’Il拙蕊黜筹船蕊勰碍；j滋I。列：“)J广LRA2-T6，—-————嘲船器溺蒜”错矗嬲∞”蛳’{Ni嘶osonlonaseuropaea6，舶的∞mon私()IM明珊)Tl‘●珥(a)、“，图3-6．对LNRA2和LRA216SrDNA克隆文库中所有OTU代表克隆及其参比序列构建的系统进化树．这里展示的是其中的(a)Betaproteobacteria纲，(b)Bacteriodetes纲，(cMlphaproteobacteria纲，(d)Deltaproteobacteria纲和(e)Epsilonproteobacteria纲的部分。Fig．3-6．PhyIogenetictreewasderivedfrom16SrDNAanalysisofLNRA2andLRA2clonelibraries，showingthepositionoftheclonessequences．Foursubgroupswe∞shownhere,(a)Betaproteobacteria,(b)Bacteriodetes，(cMlphaproteobacteria,(d)Deltaproteobacteria和(e)Epsilonproteobacteria．ThetreeWasconstructedwithMEGAsoftwareusingtheNeighbor-Joiningmethodwithbootstrapsupport(100replicates)basedOnadistancematrix．108精品参考文献资料n优秀毕业论文第三章田J流操作对AI-A2-O固定生物膜法焦化废水处理系统中微生物群落结构的影响{训’P———————————_“(b)图3-6(继续)(b)拟杆菌门Fig．3·6(continued)(”Bacteriodete$●嚣臼嚣冬薹。窖，￡q卉a消图3-6(继续)(c)Alphaproteobacteria纲Fig．3-6(eontinued)(c)Alphaproteobacteria109精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文Alphaproteobacteria纲在LRA2文库中是第三大微生物类群(占23．3％的克隆)而在LNRA2文库中仅有一个克隆属于Alphaproteobacteria纲(图3—6c)。对Alphaproteobacteria纲的系统发育分析表明，LRA2文库中的OTU主要属于Rhodobac耙raceae科和Sphingomonadaceae科。其中LRA2-2与一个在硝化．反硝化活性污泥中找到的未培养微生物(AF234740)[341的相似性为99％。而LRA2．17与已知反硝化菌Paracoccussolventivorans(Y13826)[35]的序列相似性为99％。而LRA2．3在Alphaproteobacteria纲中单独形成了一个新的分支，与它序列最为接近且分类地位明确的是Magnetospirillumsp．MSM-4(Y17390)[36]，但是它们之间的序列相似性只有85％，这说明这个序列可能代表了Alphaproteobacteria纲中一个新的区系【37】。从一个纸厂的废水处理系统中也曾经克隆了一种未培养微生物(AYl57133)『381的部分16SrDNA序列，这段序列与LRA2．3相应位置的序列完全相同。LRA2．3所代表的新区系目前还没有在废水处理之外的生态系统中被发现。Deltaproteobacteria纲是LNRA2文库中最大的微生物类群(占有48．8％的克隆)，但在LRA2文库中仅有四个克隆属于这个门。对这个门的系统发育分析表明(图3-6d)，LNRA2文库中几乎所有的克隆部属于Syntrophobacteracea科，这个科中的多数种群都是严格厌氧的【39】。LNRA2．I在LNRA2文库占有绝对的优势(占克隆总数的42．2％)，它与Desulforhabdus属的一种能降解甲苯的硫酸盐还原菌(U49429)的序列相似性为99％[40]。LNRA2．6与一个未培养微生物(AY661418)的序列相似性为99％，这种微生物来自于能够在跃氧条件下高温降解对苯二甲酸的产甲烷群落【4l】。而在LRA2文库中，多数OTU都属于Bacteriovorax祸。Gamaproteobacteria纲足LNRA2文库中第三大的微生物类群(占克隆总数的13-3％)。LNRA2文库的克隆主要属于Acinetobacter属和Pseudomonas属，但在LRA2文库中仅有一个克隆耩于Gamaproteobacteria纲(表3．1)。Gamaproteobacteria纲是废水处理中常见的微生物类群，它们在LRA2文库中极低的比例说明Gamaproteobacteria纲在处理焦化废水的反硝化反应器群落中的多度可能比较低。类似的现象也曾经在处理垃圾渗滤液的反硝化反应N[42]和一个采用问歇曝气的处理炼油厂废水的硝化．反硝化反应器[341群落中发现过，因为焦化废110精品参考文献资料n优秀毕业论文第三章酬流操作对AI-A2-O固定生物膜法焦化废水处理系统中微生物群落结构的影响水、垃圾渗滤液和炼油厂废水都含有高浓度的氨氮和COD，并且这些反应器都执行反硝化的功能，所以群落中Gamaproteobacteria纲多度低的现象很可能是与进水的性质或者是反硝化条件有关。对Epsilonproteobacteria纲的系统发育分析表明(图3-6e)，LNRA2文库与LRA2文库的组成也存在很大差异。在LRA2文库中，只有一个克隆属于Epsilonproteobacteria纲，并且其系统发育地位目前还不能确定。而在LNRA2文库中，有三个OTU属于Epsilonproteobacteria纲，其中两个OTU(LNRA2．7．8)属于Arcobacter属，另外一个OTU则属于Woinella属。Arcobacter属被认为是一种重要的人和动物相关的细菌[391，但是这个属在其他环境中也广泛存在，如河水【43】、地下水【44】、活性污泥【45】和海岸【46】。Snaidr等【45】首先在活性污泥中观察到有相当数量种群属于Arcobacter属，它们与Arcobactercryaerophilus的序列相似性为98．3％到99．5％。很有意思的是，在LNRA2文库中两个属于Arcobacter属的OTU中，其中一个OTU(LNRA2-7)也与Arcobactercryaerophilus有着很高的序列相似性(99％)，而另外一个OTU(LNRA2．7)贝iJ与一种未培养的微生物(AY692045、更为相近，它来自于一个UASB反应器的群落。LRA2文库中还含有1个OTU属于Thermomicrobiaf](占有1．1％的克隆)，3个OTU属于Acidobacteria(](占9．9％的克隆，见图3．5和表3．1)。在．-Acidobacteriaf]中，LRA2．7与一种末培养的微生物(AJ009461)的序列非常相似，这种微生物存在于一个能够在厌氧条件下转化三氯苯甲酸的微生物群落中[471。而在LNRA2文库中，还含有四个OTU属于Firmicutesl7(占4．4％的克隆，图3．5，表3．1)，其中LNRA2．20的序列与一株能够在厌氧条件下转化苯甲醛的微生物(AY353956)非常接近【48]。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文晡(d)}-—-----—·-—---—叫啪(e)图3-6(继续)(d)Deltaproteobacteria纲，(e)Epsilonproteobacteria纲Fig．3-6(cominued)(d)Deltaproteobacteria，(e)Epsilonproteobacteria表3-1．LNRA2和LRA2克隆文库中各OTU的系统发育地位Table3-1．Clonesaffiliationaccordingtotheirl6SrDNAsequencesofOTUsinLNRA2andLRA2libraries．(a．'Alphaproteobacteria，fl：BetaproteobacteHa，『),：Gammaproteobacteria,d：DeltaProteobacteria,sjEpsilonproteobacteria．)112精品参考文献资料n优秀毕业论文第二哥fIÞJ流操作对AJ-A2心固定生物膜法焦化废水处理系统中微生物群落结构的影响精品参考文献资料优秀毕业论文Nameo(OTU(percentage)LRA2-2(6.7%)LRA2-17(2.2%).LRA2-30(I.lo/.)，LRA2-3S(I.I%)LRA2-3(S.6%)LRA2-18(2.2%)LRA2-29(1.1%)LRA2-23(1.I%)LRA2-24(1.1%)，LRA2-25(1.I%)LRA2-22(1.I%)LRA2-4(5.S%)，LRA2-31(1.I%).LRA2-20(1.1010)LRA2-34(1.I%)LRA2.9(3，3%)，LRA2-13(2.2%)，LRA2-14(2.2%)，LRA2-6(4.4%)LRA2-11(2.2%)LRA2-44(I.l%)，LRA2-45(1.I%)LRA2.I2(2.2%)，LRA2-16(2.2%)LRA2-32(1.1%)，LRA2-33(1.l%)LRA2-I9(I.I%)LRA2-26(1.l%)，LRA2-27(1.I%)L.RA2-28(1.1%)LRA2-36(t.l%)A2-15(2.2%)Put.tlvephylumaaaaaaaaFβFFFPFβFβyssseClosestrelatedsequence业出出且且i99·AMF"饵"仰"MWMmM啊nMhyny97-9997-989999989899。96-999588-9"98。osettrelatedbaderiaRhndohacteraceaesp.RhodobacterlParac何ωsp.Environmentalclone.Rhodospirillaceaesp.Environmentalclone.·协'hingobωmsp.Sphingomonassp.Met炒，'Iobacteriaceal!sp.Thauerasp.Zoogloeasp.Dechlorosomasp.Rhodocyclaceaesp.Diaphorobacter吨Alicycliphilussp.Hydrogenophaga51申Burkholderialessp.Nitrosomonassp.Environmentalc10neLegiω回lIaceal!sp.Bdellovlbriosp.Bacteriovoraxsp.Environmentalc10ne精品参考文献资料优秀毕业论文LRLRA2-37(1.I%)LRA2-1(13.3%I，LRA2-38(1.I%)LRA2-8(3.3%)，LRA2-1创2.2%)LRA2-39(1.1%)，LRA2-4O(I.l%)lRA2-41(1.1%)LRA2-42(1.1%)LRA2-43(1.1%)LRA2-S(4.4%)，LRA2-21(1.I%)LRA2-7(3.30/0)LNRA2-28(1.1%)LNRA2-Z(5.6划，LNRA2-13(1.1%)LNRA2战2.2%)LNRA2-10(2.2%)，LNRA2-5(4.4%)，LNRA2-23(1.1%)LNRA2-14(1.1%)LNRA2-17(1.1%)，A2-24(t.l%)l'hermomicroh;aBacteroidetesBacteroi郎的'esBacteroidetesBacferoidetesBacteroidetesBacteroidetesAcidobacteriaAcidohacleriaaFββFFβββ958795-9698-9993-94969497锁)-9398929992999797-99"9898EnvironmentaJcloneThermomicrobiumsp.Chitinnphagα.sp.Chryseobacteriumsp.Flavobacteriumsp.EnvironmentaJcJoneCylophaga毡ip...BacterOl仇i臼sp.Acidobacteriumsp.。、EnvironmentalcloneSphtngomlJnadace咽吨·iaphoro/)ucterip.Comamonaduceaesp.Thullerasp.Sterol‘bacterillmsp.Rhod，队二')'cltJceaesp.EnvironmentalcloneAlcalígellessp.AlcaliRe阳'ceaesp.精品参考文献资料优秀毕业论文LNRLNRA2-3(7.80/0)7LNRA2-4(4.4%)，LNRA2-27(1.1%)7A2-1(42.2%)8LNRA2-6(3.3%)8"97"AcinelObactersp.Pseudomollossp.Desu({orha杭阳部精品参考文献资料优秀毕业论文LNRLNRA2-IS(I.I%)8"93Syntrophl崎sp.Synlrnphobacteraceaesp.精品参考文献资料优秀毕业论文LNRA2-12(1.l%)LNRA2-26(I.l%)LNRA2-7(3.3%)，LNRA2-8(3.3%)LNRA2-19(1.1%)LNRA2-11(2.2%)lNRA2-22(I.l)LNRA2-16(I.l)LNRA2-20(1.1%)，LNRA2-21(1.I%)LNRA2-18司1.1%)LNRA2-2雪(1.1%)精品参考文献资料n优秀毕业论文892895899E99Bacteroitktes968acteroidetes98Bacteroidete$99Firmicutes98Firmicule:l99Firmicules97Firmicutes87Desu(fovibriosp.E沁sulfuromonassp.A陀抽血.tersp.Wo/inella部.Chitinophagasp.岛咆onomo脯sp.Bacteroidale:ssp.Tíssierellasp.C{ostridiaceaesp.Environmentalclone.En叽ronmentalcJone.精品参考文献资料优秀毕业论文113精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博t学位论文3．2．4克隆文库与PCR-DGGE指纹图谱分析结果之间的比较虽然克隆文库和PCR-DCrGE都是以PCR为基础的方法，但是因为本研究中两种方法所使用的引物不一样并且PCR扩增过程中产生的偏差对于两种方法的影响也可能不相同，所以有必要对两种方法得出的结果进行比较，这有助于评估方法的偏差对于结果的影响。首先PCR扩增文库中主要OTU(含两个克隆以上)代表克隆16SrDNA插入片段的V3区，然后通过DGGE寻找群落指纹图谱中位置与之相同的条带，这样就可以将克隆文库与PCR．DGGE指纹图谱的分析结果进行比较[49】。如图3—7所示，几乎所有的DGGE的主带都能匹配一个以上的主要OTU，而所有的主要OTU几乎也都能够与DGGE上的一条条带对应上。比如说LNRA2．1是LNRA2文库中最为优势的克隆，它就对应了DGGE指纹图谱中最亮的一条条带。但是也有例外，比如LNRA2文库中的LNRA2．10和LRA2文库中的LRA2．11，12，都无法在相应的DGGE指纹图谱中找到位置相同的条带。所以，虽然用克隆文库和PCR-DGGE指纹图谱对群落进行分析的结果存在一定的差别，但是从总体上来说是比较接近的。竺!：：竺：!竺竺12竺!!竺==A2-2^dd_，。，缸●n3DHBl(m：45eo∞)A2-4P¨删嘶’o憎■龆lq_'一‘舳LBl9{hF390747)A2．-11日a■目ad日她b-目_’哪cloneVC5(AY211071)A2-7^，∞如咖凹目邯印r_岫isolawCCUel7802{AY314756),#．2-3^cmm¨c¨"PDl2岬39¨)A2-OUnoJureabad_咖d甘_rrAmm{AY661418'A2-5BH叩m∞oh■目¨ndom∞●蛳1AVl330斟，A2-20$dehnoenfa¨∞№rol，№(^K目栅A2-enⅢMatona№loamLG3560K131SSaO)A2-1Un日帅咖““n}r●^咖h时帅帅(U,19429)(a)114精品参考文献资料n优秀毕业论文第三章斟流操作对AI．A2-O同定生物膜法焦化废水处理系统中微生物群落结构的影响0TUNurelltspeeiuSimilarityRJchness％％厂_LR^2-8如啪，晒船h蛐Bk．38fAJ318191I∞a3，二一一LR#．2-16舸啪蜊删europa衄ATCC～utA2-10胁哪柏栅雄Ⅲ519∞∞1971斟8X3口1856)褥22∞22≮：、、一LRA2-6凸叩帅∞蛔瑚r州岫Hh，--曲tIrr·荡P4(船07eam)994L4＼＼一LRA2,ol自m日Mh‰cloneVC5(AY211071}∞'3＼LLRA2-15E删b咿∞自曲删‘柙done铀舡HD5l^F446743)9422L＼一LItA2-3舢咖w咖曲蜥f帅P∞9c^Y157竹却神5m＼一LRA2-44竹mpqm№EISB418(AJss．m)∞''L～mA2-24鼬^mMⅢ"Y2(^B064247)∞11h～LR越{1m埘m舯哪岫LG356‘A3315680)∞，'除～LR#．2-13蜥咖扣唧M删随ctemum．1033(AYb"78170)ge22i＼＼＼一LRA2-2Rhodoeact_删LICOncum；(AB077966I∞6．7、＼一限A24m啪aexnatC^嘲{AJ315氆0)∞t4＼、一LRA2-14a嗡舶咖叫喇翱啪ccs∞5／AYl33∞4)9722＼＼一氓A2-9Hydrogernphdaceaob棚、巾．1033(AY57"8170)97a3＼一LRA2-5UnculturoO岫曲帅SHA-18彻490唧∞^4～LRA2{L—LRA2-18^岫№pdwo誉*m_n：KCM粤-15p,JS81585)∞22Uocultumdbact8rltJlllSJ／曲6川∞9481J∞a3(b)图3-7．用16SrDNA克隆文库来鉴定A2池DGGE图谱中的条带．(a)不回流务件下；(b)回流条件下。Fig．3-7．Identificationofthebandsobserved011DGGEpattemofA2reactorbyrepresentativecloneofOTUsinclonelibrary．(a)withouteffluentroeirculation；(b)witheffluentrecirculation．3．3讨论研究反应器操作对于微生物群落结构的影响是进行群落结构优化的基本问题。日自口认为，反应器的操作可以通过代谢选择、动力学选择和物理选择来满足所需要种群的生长而压制其它不需要种群的生长，从而达到种群优化的目的【2】。回流作为AI．A2．0工艺的重要操作，对A2池微生物群落结构有深刻的影响。在不回流的操作条件下，LNRA2文库中42．2％的克隆都属于Desulforhabdus属，它是一种硫酸盐还原菌[40，501。而在回流的操作条件下，微生物群落发生了明显的变化，LRA2文库中没有一个与已知硫酸盐还原菌相近的克隆，与此同时，A2池的反硝化作用明显增强[11，LRA2文库与硝化菌媚近的克隆也明显增加：共有7个OTU(19个克隆)分别与已知的反硝化菌Thaueraaromatica，Thiobacillusdenitrificans，Diaphorobacternitroreducens，Alicycliphilusdenitrificans和Paracoccussolventivoram有较近的亲缘关系。这种优势功能类群的转变是由于缺氧的条件下精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博t学位论文硫酸赫还原菌利用底物产生能量的效率要远低于反硝化菌造成的，因此在回流的作用下群落中反硝化菌受到选择而硫酸盐还原菌则受到抑制。LRA2文库中与反硝化相关的克隆大多都属于Betaproteobacteria纲，这表明Betaproteobacteria纲在反硝化作用中具有重要的作用，这一结论也与前人的研究结果相吻合[42，51，5e]。在与LRA2文库克隆亲缘关系较近的反硝化菌中，只有Thaueraaromatica被报道具有反硝化条件下降解芳香族化合物的能力[28，51，53-55]，因此与Thaueraaromatica亲缘关系较近的种群极有可能是回流条件下A2池群落中COD的主要降解菌，在对其COD去除能力的大幅提高上起重要作用。但是由于克隆文库和DGGE的实验方法部无法将种群的系统发育地位和其功能直接联系起来，所以我们不能完全确定所有文库中OTU在群落中具体功能，利用其他更先进的分子生态学技术，比如本文第一章所介绍的RNA／DNA．SIP[56．571和MAR．FISH技术[58，59]，能够对这些微生物在环境中的功能作进一步研究。在本研究中，我们发现同一系统中的不同反应器群落之间存在密切联系，特别表现在：在不回流的条件下，Al池和pb池的群落结构几乎完全相同；在回流的条件下，A2池与0-池的群落结构几乎完全一致，这些群落之间高度的相似性反映了同一系统中不同反应器群落之间的密切联系。这种结构高度相似的微生物群落在独立的反应器之间是很难建立起来，例如Kaewpipat等【60】对同样接种的两个相同反应器中的微生物群落进行了比较，这两个反应器的PCR．DGGE指纹图潜表明它们的群落结构存在明显的差别；Fernandez等【6l】也发现厌氧反应器中的细菌群落是高度不稳定的，因此系统内不同反应器群落之间高度的相似性反映了系统内群落之间的相互影响和相互作用。这种相互影响和相互作用的关系可能与废水的串行处理方式有关，即第一个反应器群落的代谢产物(出水)是下一个反应器群落的底物(进水)，也可能是通过系统内不同反应器群落之间微生物的相互交流来实现的(反应器中除了被固定的生物以外，还存在一定量的悬浮污泥，它们可以在系统内不同反应器之间进行循环交流[41)。不同的操作条件下系统内不同反应器群落之间的相互关系也不相同，这晚明不同操作条件下系统有着不州的群落空间演臂模式(见第一章)，因此反应器的操作条件对系统群落的影响并不局限于系统的某个反应器，而是系统性的和全局性116精品参考文献资料n优秀毕业论文第三章回流操作对AI-A2-O固定生物膜法焦化废水处理系统中微生物群落结构的影响的。所以系统的群落空间演替模式比系统内单个反应器的群落结构变化能更完整得把操作条件对于系统内群落的影响体现出来，因此群落时空演替模式系统轨迹分析是研究反应器的操作对于群落结构影响的良好工具，它在系统群落结构优化上有着重要的指导意思。3．4本章小结研究反应器的操作对废水处理中微生物群落的影响，是进行群落结构优化的前提条件。我们通过比较A1．A2．o固定生物膜法焦化废水处理系统在回流和不回流两种操作条件下微生物群落结构的变化，来研究回流操作对于系统内群落结构的影响。16SrDNAV3PCR-DGGE指纹图谱的聚类分析结果表明在回流的作用下A2池的群落结构从与Al池相似转变成与O池相近，这表明回流操作对于系统内微生物群落的影响是全局性的和整体性。使用16SrDNA克隆文库的方法对回流前后A2池群落的结构变化作了进一步分析，结果表明在回流的作用下反硝化菌取代硫酸盐还原菌成为A2池群落中的优势功能类群，其中与Thaueraaromatica亲缘关系较近的种群可能对于回流后A2池群落COD去除能力的大幅提高起到重要的作用。因为回流操作对于系统内微生物群落的影响是全局性的和整体性的，所以群落时空演替的系统轨迹分析足研究操作条件对系统群落结构影响的良好工具，对群落结构的优化有着重要的指导意义。3．5参考文献I．徐正茂，焦化废水生物脱氮除碳优化技术研究(硕士论文)．2004．2．Yuan，Z．GandL．L．Blackall，Sludgepopulationoptimisation：anewdimensionforthecontrolofbiologicalwastewatertreatmentsystems．WaterResearch，2002．36(2)：P．482—490．3．Amann，R．I．，砒Ludwig,andK．H．Schleifer,Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation．MicrobiolRev,1995．59(n：P．143—69。4．Zhang,M．，eta1．，CokeplantwastewatertreatmentbyfixedbiofilmsystemforCODand117精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通丈学博士学位论文NH3-Nremoval．WaterRe∞arcII，1998．32(2)：P．519-527．5．Li，Y．M．，cta1．，Treatmentofcoke—plantwastewaterbybiofilmsystemsforremovaloforganiccompoundsandnitrogen．Chemosphere，2003．52(6)：P．997-1005．6．Zhang,M．，eta1．，Comparisonbctxveenanaerobic-anoxic-oxicandanoxic-oxicsystemsforcokeplantwastewatertreatment．JournalofEnvironmentalEngineedng-Asce,1997．123(9)：P．876．883．7．Dice，Measuresoftheamountofecologicalassociationbetweenspecies．J．Ec01．，1945．26：P．297—302．8．GrifoniAeta1．，IdentificationofAzospirillumstrainsbyrestrictionfragmentlengthpolymorphismofthe16SrDNAandofthehistidineoperon．FEMSMicrobiologyLetters，1995．12“I·2)：P．85-91．9．DiCello，E，eta1．，BiodiversityofaBurkholderiacepaciapopulationisolatedfromthemaizerhizosphereatdifferentplantgrowthstages．ApplEnvironMicrobiol，1997．63(11)：P．4485—93．10．Qiu，X．，eta1．，EvaluationofPCR-generatedchimeras，mutations，andheteroduplexeswith16SrRNAgene—basedcloning．ApplEnvironMicrobiol，2001．67(2)：P．880-7．11．Thompson，J．RLA．Marcelino,andM．EPolz,Heteroduplexesinmixed-templateamplifications：formation，consequenceandeliminationby’reconditioningPCW．NucleicAcidsRes,2002．30(9)：P．2083-8．12．Acinas，S．G，eta1．，PCR-inducedsequenceartifactsandbias：Insightsfromcomparisonoftwo16SrRNAclonelibrariesconstructedfromthef*lnlesample．AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2005．71(12)：P．8966-8969．13．Liu，W．T．，etal．，Denmudnggradientgelelectrophoresispolymorphismforrapid16SrDNAclonescreen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closerelationship．CommunitysnⅥcnIreof02reactorofanindustrialsystem(poorperformance)andalab-scalesystemfgoodperformance)witllsimilarprocesswascomparedby16SrDNAclonelibraries．Bacteroidetes，BetaproteobacteriaandAlphaproteobacteriacouldbedetectedinbothlibrariesoftheindustrialsystem(LR02)andthelab-scalesystem(102)，butActinobacteria·Nitrospira，Spirochaetes，Deinococcus—ThermusandAcidobacteriaonlybedetectedinLR02clonelibraryandEpsilonproteobacteria，CyanobacteriaandGeneraincertaesedisTM7onlybedetectediIl102clonelibrary，whichindicatethereissignificantdifferencebetweencommunitiesoftheindustrialandthelabsystem．nlecompositionofLR02clonelibraryindicatedNitrosomonaseuropaea--NitrosoccusmobilisandNitrospiragenussublineage1weredominantammoniaoxidizerandnitriteoxidizerinthisprocessrespectively，butclonesrelatedtoNitrosomonasandNitrospiragenerawasnotdetectediII102clonelibrary,whichindicatedthelowpopulationlevelofnitrilyingbacteriaintheindustrialsystemandthusledtolowNH3一Nremovalefficiencyofthissystem．Inaddition,althou曲CODremovaleffiicienyofthelabsystemwasfarmorethanthatoftheindustrialsystem，theproportionofclonesrelatedtoThaueragenuswaslowerinLR02librarythanthatin102library,whichsuggestedthefunctionallyimportantpopulationsaboutCODremovalwasnotabsentintheindustrialsystem．TheindustrialsystemwithlowerCODremovalefficiencybuthighabundanceof刀搬ueragenus(functionallyimportantpopulationsforCODremoval)wasduetothatlowoxygensupplytothebiofilminthe02reactorsmadethesepopulationsfailtoremoveCODinhighefficiency．Thereforeusingtheabundanceofsinglepopulation(group)asanindicatorforthefunctionalstatusofsystemmayleadtowrongconclusionandspatialcommunitysuccessionpattemofthewholesystemaremorereliabletoreflectthefunctionalstatusofWWTPKeyWords：Cokingwastewater,nitrilyingbacteria,16SrDNA，clonelibrary，Real·timequantitativePCR精品参考文献资料n优秀毕业论文第四章实验室装置和工业装置好氧池生物膜之间微生物群落结构的比较引言：废水生物处理是由微生物群落中的所有种群协同作用完成的，因此微生物群落的结构与其功能有着密切的关系。一个高效且稳定运行的废水处理系统和一个低效且不稳定运行废水处理系统的微生物群落结构之间肯定存在着极大的差异。即使在反应器设计和操作非常相似的条件下。不同的微生物群落结构也会造成处理效果上的很大差别【l，2】。但是从事废水生物处理设计和操作的工程师往往习惯于把整个污水处理过程看作是一个物理和化学的过程，而把参与废水处理的微生物群落看作是一个“黑箱”【3】。这样做固然简化了废水生物处理工艺的设计和优化过程，但是也使得工艺的设计和优化过于依赖工程师的直觉和经验，而不是完全建立在生态科学的基础之上【4】。现代的微生物分子生态学技术，包括DGGE、克隆文库以及FISH等[5】为解开参与废水处理的微生物群落这个“黑箱”提供了强有力的工具。我们已经有可能把微生物的群落结构与反应器的运行效率和稳定性联系起来，通过优化反应器中微生物群落结构的组成来提高反应器的运行效率和稳定性，这就是所谓的“sludgeoptimization'’【3】。焦化废水是煤化工生产过程中产生的主要污染物，它的主要成分是酚类化合物，含氮杂环类化合物、氨氮和氰化物，是一种典型的难于生物降解的工业废水【6】。Al-A2．O固定生物膜法是目前处理焦化废水的常用工艺，该工艺微生物的停留时闻长，废水在Al，A2和O池分别经过了厌氧酸化、缺氧反硝化以及好氧氧化，无论是COD还是氨氮和硝态氮都能达到较好的去除效果[6，7】。但是该工艺在实际运行过程中也会遇到出水长期不达标的问题，而且单独使用常规的理化检查方法难以找出系统的故障所在。本文所研究的上海某焦化厂就是这样一个典型的例子，该厂按照A1．A2．o固定生物膜法工艺构建了一套焦化废水工业装置，但是该装置运行效果一直不理想，cOD和氨氮的排放仅能达到国家三级排放标准(GB8979．1996)。为了找到工业装置出现问题的原因，我们模拟该套工业装置，构建了一套实验室装置，该实验室装置处理效果稳定良好。工业装置和实验室装蜀是两个工艺类似、但处理效果不同的两套废水处理系统。我们在第二章里，以实验室装置做为参比系统，通过对实验室装置和工业装置空间群落演替的系统轨迹分析，发现工业装置的故障在于精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通丈学博士学位论文好氧池生物膜供氧不足。本章的研究目的通过比较工业装置和实验室好氧池群落结构的差异，更为详细得分析在供氧不足情况下群落结构的异常，为今后类似故障的诊断提供新的依据；再次，这两个克隆文库可以用来鉴定系统群落空间演替轨迹分析中找到的重要种群(DGGE条带)并且这两个文库提供的序列信息是我们对这些重要种群进行实时定量PCR测定的基础(见2．2．4和2．2．5)。4．1材料与方法4．1．1工业装置和实验室装置的运行工业装置和实验室装置(回流操作条件下)的运行见2．1．1。4．1．2生物膜采样、样品预处理和总DNA提取去好氧池中前段即02池的生物膜样品进行分析，实验室装置和实验室装置生物膜样品的采集方法同2．1．2。样品预处理和总基因组DNA的提取方法同2．1．2。4．1,316SrDNAV3区PCR扩增16SrDNAV3区PCR扩增方法同2．1．3．1。4．1．416SrDNAV3区克隆文库的构建PCR产物的纯化、连接和转化同3．1．4．2。实验室装置02池样品构建的16SrDNAV3区克隆文库，以下称为LR02克隆文库；1-业装置02池样品构建的文库，以下称为102克隆文库。4．1．5克隆文库的测序对文库中所有克隆用T7通用引物测序，测序由上海英俊生物技术公司完成。所得的序列先在RDP数据库中进行嵌合体(chimera)检测(versioll2．7；RibosomalDatabaseProject,www．rdp．cme．msu．edu／cgis／chimera．cgi)[8l，将文库中的嵌合体序列精品参考文献资料n优秀毕业论文第四章实验室装置和工业装置好氧池生物膜之间微生物群落结构的比较排除后，再按照97％的相似性将文库中所有的克隆划分为不同的操作分类单元(OTU，provisionaloperationaltaxonomicunits)。4．1．6克隆文库库容的分析方法同3．1．5．2。4．1。7克隆文库的序列分析克隆文库的系统发育分析方法同3．1．5．3。根据克隆文库中OTU的数量和每个OTu的克隆数目，计算Shannon-Wiener多样性指数。计算公式为；H．qp。h妒i(朋=抑／Ⅳ)，其中刀，为每个OTU的克隆数目∥为克隆文库的总克隆数目。本研究中所得16SrDNA序列在GenBank数据库中的登录号分别为：DQ537386-DQ537436(LR02文库)，DQ537437·DQ537478(LNR02文库)。4．2结果4．2．1工业装置和实验室装置的功能比较我们对工业装置取样月份(2003年6月份)的出水数据进行了统计分析(图4-1)，结果表明COD的进水浓度平均为1387mg／L，出水浓度平均为618mg／L，平均去除率只有54％，同时NH3-N的进水浓度平均为49．3mg／L，出水浓度平均为90．1mg／L，平均去除率仅为．106％，这表明工业装置出水的COD和氨氮都未达到国家排放要求。我们也对实验室装置在稳定运行期间的出水数据进行了统计分析(图4—1)，结果表明COD的进水浓度平均为1158mg／L，出水浓度平均为169．2mg／L，平均去除率为85％，同时NH3．N的进水浓度平均为95．6mg／L，出水浓度平均为5．4mg／L，平均去除率为95％。实验室装置出水的COD和NH3-N浓度已经分别达到国家二级和一级排放标准(GB8979．1996)，符合排放要求。129精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博}学位论文√＼、广u广弋^／^、八．．＼．，／／＼善ielo口u0，IOt5202，30354045Tin．day}一LRI【一1f可口}p暑军口皇Th％脚(b)图4一1．实验室装置和工业装置处理效率的比较．(a)COD去除率；(b)NH3-N去除率．Fig．4一I．Comparsionofremovalefficiencybetweenthelab-scaleandtheindustrialsystem．(a)CODremovalefficiency(b)NH3-Nremovalefficiency．(实验室装置数据由华东理t走学环境学院冯晓西，刘勇弟研究小组提供)实验室装置和工业装置之间功能上的差异与它们之间好氧池的群落结构差异有关。所以，我们通过构建165rDNA克隆文库的方法，对它们之间群落的结构组成进行了比较。4．2．2克隆文库中16SrDNA序列分析本实验中LR02文库共得到了94个克隆，可分为51个OTU，而102文库共130精品参考文献资料n优秀毕业论文第四章实验室装置和工业装置好氧池生物膜之间微生物群落结构的比较得到了87个克隆，可分为42个OTU(表4．1)，它们分别分布在不通的门或者纲中(图4．2)。为了检验克隆文库的库容是否足够代表样品中微生物的多样性，我们采用了渐进采样的方法来进行检验。如图3．3所示，在LR02和102两个文库的库容大小范围内，用ScIIaol和SACE分别预测的样品群落的phylotypcsrichness都已经趋于平稳，这说明LR02和102文库都能很好地代表样品中微生物的多样性。所以，我们可以对两个文库的组成进行比较来分析工业装置和实验室装置。池微生物群落的差异。表4-1．LR02和102文库多样性指数的比较TABLE4-1．ComparisonofthediverisityindicesofLR02and102clonelibrary4Shannon．Wienerindcx,Hisdcnncd醛—∑nIf鼽，wherenisthedecimalfractionofindividuals(clones)ofthe／thOTU．#．§l￡山口～L～!．。7，，≯7，／夕／／∥图舢2．LR02和10216SrDNA克隆丈库中克隆在不同门(纲)的分布．Fig．4-2．Phylogeneticdistributionofclonesin16SrDNAclonelibrariesofLR02and102．首先利用两个文库的组成来计算样品群落的Shannon．Wiener多样性指数，实验室装置和工业装置的Shannon-Wiener多样性指数分别为3．64和3．46(表4一1)，这说明实验室装置0池的微生物群落多样性略高于工业装置。然后，通过文库的序列分析来进一步分析样品中微生物群落结构的差异。精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博上学位论文汹LR02do∞城x何圆*莹0l奢△雹3}≈童∞∞∞柏∞∞∞钟嚣。O2040∞801∞U∞哆Sm102cIm#埘嗍》∥圈徊∞∞∞柏娶害一害々l葛芏∞oO∞4060∞100L岫S∞图4．3使用渐进采样的方法采检验克隆文库的库容是否足够代表样品中微生物群落的多样性．(a)LR02丈库，(b)102文库．Fig．4·3Predictednumbersofphylotypesbased011valuesofSAcE(·)andSchaoI(o)VS．1ibrarysize．(a)LR02clonelibrary,(b)102clonelibrary．将LR02和102克隆文库中所有0Tu的代表序列，在RDP．u数据库(RibosomalDabbleProject．IIRelease9)中寻找最相近的序列(表3-2，3．3)作为参比序列，并将两个文库OTU的代表序列与参比序列一起构建系统发育树，结果如图4．4所示。Bacteroidetes门分别是LR02和102文库的第一和第二大微生物类群，其比例分别为37．2％，27．6％(图4．2)。两个文库中Bacteroidetes门的OTU多数属于Flavobacteriaceae科和Chitinophaga属且一半以上的克隆都集中于2个OTU(图4-4a)。在LR02文库中，LR02．1和LR02．2的克隆数最多，它们在文库中的比例分别为12．8％和8．5％，而在102文库中，102．1和102．2的克隆数最多，它们精品参考文献资料n优秀毕业论文第四章实验室装置和工业装置好氧池生物膜之问微生物群落结构的比较在文库中的比例分别为9．2％和8．05％(表4．2，表4．3)。这说明虽然在实验室装置和工业装置0池微生物群落中Bacteroidetes门都分别由两个优势种群组成，但是这两个样品的两个优势种群并不完全相同。LR02．1和102．2序列的相似性为99．9％，它们都属于Chitinophaga属(图3-4a)：而LR02—2和I02-2的序列差异很大，前者属于Flavobacteriaceae科，而后者目前只能分到门的水平。这说明在实验室装置和工业装置02池的群落结构之间，在Bacteroidetes门有一个优势的种群存在明显的差异。Betaproteobacteria纲分别是LR02和102文库中的第二和第一大微生物类群，其比例分别为28．7％和36．8％(图4．2)。两个文库中Betaproteobacteria纲的OTU多数属于Rhodocyclaceae科和Burkholderiales目(图4-4b)。LR02-5和102—3与Thaueraphenylacetica(AJ315678)的序列相似性都为99，5％，Thaueraphenylacetica在有氧的条件能够以苯酚等多种芳香族化合物为底物生长[9】。而LR02-42与Thauerasp．A17(AY570693)的序列相似性为99．5％，Thauerasp．A17是从油藏中分离到的能利用甲苯为碳源生长的细菌[10】。102—16与Thaueraaminoaromatica(DS2(AJ315677)ff'J序列相似性为96％[91。I02文库中Thauera属的克隆比例(10．4％)是LR02文库(3．2％)的3倍。Nitrosomonas属的OTU仅在LR02文库中检测到(图4-4b)，LR02-35(DQ537420)属于Nitrosomonaseuropaea--Nitrosoccusmobilis类群，它与生物膜中分离的氨氧化菌Nitrosomonassp．Koll．21(AJ224941)序列相似性达到99．5％。Alphaproteobacteria纲在LR02和102文库中分别占20．2％和17．2％(图4．2)。两个文库中Alphaproteobacteria纲的OTU多数属于Sphingomonadaceae科，Rhodobacteraceae科和Rhodospirillales目。但是Mesorhizobium属仅在LR02文库中检测到，而Rickettsia属和Asticcacaulis属则仅在102文库中检测到(图4—4b)。Gamaproteobacteria纲在LR02和102文库中的比例分别为6．38％和8．05％(图4．2)，而Deltaproteobacteria纲在LR02和102文库中的比例分别为2．3％和4．6％(图4．2)。133精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通大学博士学位论文图44LR02和102克隆文库所有OTU及其相近序列构建的系统进化树。这里展示的是其中的(a)Bacteriodetes门，(b)Betaproteobacteria纲，(c)Alphaproteobacteria纲的的系统进化树．Fig．4-4．Phylogenetictreewasdedvedfrom16SrDNAanalysisofLR02andI02clonelibrariesandthekrelativesequences．Threesubgroupswereshownhere，(a)Bacteriodetes，(b)Betaproteobacteria．(c)Alphaproteobacteria．The16SrDNAsequenceofAquifexpyrophilus(M83548)Wasselectedastheout-group．Onlybootstrapvaluesgreaterthan50％ofthereplicatesageshown．Thescalebarrepresents2nucleotidesubstitutionsper100nucleotides．精品参考文献资料n优秀毕业论文第四章实验室装置和T业装置好氧池生物膜之间微生物群落结构的比较图4-4(继续)(b)Betaproteobacteria纲．Fig．4-4(continued)(b)Betaproteobacteria．135精品参考文献资料n优秀毕业论文上海交通丈学博t学位论文(C)匿02-9。。一锪搿棚”黝㈣M∞撕|％¨l=’lI§l一ls脚I脚m(^Y619渤}l薷{L1蚓蒜‰。单一(^v姗奶JlI。J茜捌却M唧m㈣{mY2(AB084247》lSuncultured日phaproteobactenucnse瑚a砷a4‘“2548鸵)|嘉一LR02-51jr--102-22————-1钆Unculturedbacte“umRCP2．17lAF523878)IPJcketblll埘——_LRL—U眦哦ur蝴糠p№鲫舶曲刚鲥咐1NOS702*3681(AY043趟JOILROZ34Llncult城edI啕ctermmM仃【^Y444979)——丽L—UnculⅫed脚|ld一102．∞r栅eobaclenumEb刚1VW255640)rq缆袅搿印“渺勰嬲’IMeBorhtzoblum-I————————————眦UrCullwedr_LR02-19boctenum摧m(ABll7709'“r—Uncultufl目蜘p『oI。曲∞m㈣JG30-KFa(AJ538857)I1IL只02-,50l眦印枷睡船o—Ⅷ102-4ltLR02-49————_T碱／‰dObOctero№o，Mm’|AB077986)ll崎坤∞计掰卿帅嗍mDSM2665(T)‘AJ227813)L—Uncultumclsl埘口obaetenumAl5b(AF234740)I尺抽痂6副珈啊Io●■●OutgroupI鬣‰删m’ooLR02-33W0233(AJ2925∞)|^舳曲ou11cmⅢ蛐“m()l图4-4(继续)(c)Alphaproteobacteria纲．Fig．4-4(continued)(c)Alphaproteobacteria．除此之外，Actinobacteria门．Nitrospira门，Spirochaetes门，Deinococcus．Thermus门和Acidobacteria门仅在LR02文库中检测到，而Epsilonproteobacteria纲、Cyanobacteria门和GeneraincertaesedisTM7门仅在102文库中检测到(图4-2)。这些单独存在于LR02文库或102文库中的门(纲)，进一步说明了实验室装置和工业装置中微生物群落结构之间的差别。LR02文库中，仅有LR02-18与亚硝酸氧化菌相关，序列分析表明它属于Nitrospira属的I亚系(sublineage)【ll】，它与亚硝酸氧化菌Nitrospirasp．cloneb30(AJ224041)的相似性为97％。亚硝酸氧化菌在废水的微生物处理当中起到把亚硝酸转化成硝酸的重要作用。很多的研究都认为Nitrospira属而不是Nitrobactor属是废水处理当中最重要的亚硝酸氧化菌种群【12-xs]，但是我们在I02文库中既没有找到与Nitrospira属相近的克隆也没有找到与Nitrobactor属相近的克隆。精品参考文献资料n优秀毕业论文第四章实验室装置和T业装置好氧池生物膜之间微生物群落结构的比较表4．2LR0216SDNA克隆文库的OTU分析TABLE4-2AnalysisofOTUsinLR0216SrDNAClonelibraryGeneBank0TUo喇”佃elwntt即l“哦PAccessionLR(砼．1『128％l130537386UnculturedBactermdetes$5223PGlAF43I5761RhtzospheresoilLR02·2(85t％1DQ537387UIlc廿taredBacteroldewsBlui38f^J3181911BiofiRerUncⅢtmedHydrogenophdaceoehlc忙n啪【D33ActivatedsludgeLR02·3(3t9％kDQ537358(AY578170)LR02-4(426％)DQ537359Mesorhtzobium印N3I(AF2829231LR02-51213％’DQ537390砌咖难A17(AY570693)0iIreserv04rUncultmedbetawoteobacteriumSBR20∞EBPRsludgeLR02-6(213％'DQ537391(AF20425”LR02-7(213％’DQ537392U眦ulturedbacteti吼TrAH5