一株栅藻的分离培养及其应用于养猪废水处理的潜力研究 162页

分类号：XZ!：Q墨窆密级：丞中文题目：≥：j、单位代码：学号：博士学位论文⑧1033510914024申请人姓名猩瀣翅指导教师里当魉塾拯专业名称丕蕴王蕉研究方向叠蕴廛左堑登菱焦所在学院叠擅盏盗菱堂暄n⑧论文作者签名：论文评阅人1：(姓名3亟整3望焦，至回)评阅人2：(隐名迁闺堂焦i企塞盆喳)评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：盆自圈3数援3浙江太堂委员1：塑绍建3塾援3逝选太堂委员2：选丕盘3数授3浙江三齑太堂委员3：塑壬3熬援3浙江太堂委员4：里龙迓3熬援3逝江太堂委员5：nAuthor’Ssignature：Supervisor'ssignature：堡．丝盈!竺Thesisreviewer1：Thesisreviewer2：Thesisreviewer3：Thesisreviewer4．Thesisreviewer5：Chair：X旦Xi垒塾gYi堕g业煦￡∑垡自i垦坠g型坠iY曼!墨i!Y(Committeeoforaldefence)Committeeman1：兰h曼ngS塾垒Qji垒堕里煦￡鲨h自i垒旦g堕niY：Committeeman2．一ShenDongshenghPl'of3ZhejiangGongshangUniv．Committeeman3：圣鱼曼旦g里i旦g里!Q￡鲨h自i垦塾g堕卫i∑丛鱼!YCommitteeman4：卫垫鱼!垫g堕也g里盟￡鲨鱼自i堑g堕塾垃笪墨i鲤Committeeman5·Dateoforaldefe：nce：2013-5．26：蓥I删藿l兰一兰～迎韭血业盟薹|n独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：抄／)年y月歹彦日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝婆盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权监’江盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：佑嘲I签字日期：友户J71焊厂月)∥日学位论文作者毕业后去向：导师签名：＼习P—]签字日期．纱’多年，月叫日工作单位：衢州学院通讯地址：浙江省衢州市柯城区九华北大道78号电话：0570．8015117邮编：324000n浙江大学博士学位论文致谢几度寒暑易节，一段重要人生经历即将落下帷幕。再回首，一次次的夜半灯火，披星戴月历历在目，三年半的博士生涯忙碌、紧张而充实。在此论文即将付梓之际，心中感慨万千，我知道自己一路走来的顺利和收获来之不易，但我更不能忘记，这一切的得来主要是因为我不是一个人在奋斗。谨在此感谢在我三年半博士生涯中给予我无私帮助的老师、同学、朋友及家人。首先，我要感谢我的指导老师田光明教授。本研究及学位论文是在老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。从课题的选择到最终完成，老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。他严谨的治学态度，求真务实的研究作风，为人师表的工作风范不断激励和鞭策着我的学习。三年多来，老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想和生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。其次，我要感谢我的父母、姐姐和默默支持我的女友，感谢他们对我无微不至的关怀，他们是我坚强的后盾，时刻让我感受到家的温暖和幸福。我还要感谢同我一起愉快地度过研究生生活的实验室同窗们，他们是赵国智博士、彭桂群博士、刘俊稚博士、葛亚明博士、潘丹丹博士、保琦蓓博士、臧玲博士、张建华博士、褚淑棉、李霞、李灵香玉、杨治中、徐强、周慧、吴婧嘉、朱于红，感谢他们对我学习和生活的关心和帮助，在我遇到困难的时候给我鼓励和支持，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。感谢张辉、季军远等博士班同学一起渡过这三年半的博士生涯，它将成为我人生中的美好回忆。感谢我的好友鲍钱江、边菊芳、吴振兴博士、李晓燕博士、丁锐博士、曾章慧、李立强等，有了你们，让我觉得生活是如此的美好。感谢多年求学生涯中所有关心、帮助和指导过我的老师、同学好友甚至匿名友人，限于篇幅，不一一列举，但对你们的关爱我将永远铭记。程海翔2013年5月于浙大紫金港n浙江大学博士学位论文摘要养猪业的快速发展导致养猪废水的大量产生，给地区生态环境和居民健康带来了严重危害，实现养猪废水的无害化、资源化和减量化处理是保证产业可持续发展的基础，而现有的常规污水处理技术仅仅作为一种处理工艺实现废水的无害化处理，忽略了废水的资源化利用；另一方面，为缓解当前资源匮乏、能源紧缺的形势，微藻生物能源成为生物质能研究领域的热点之一，但如何降低微藻培养成本是实现微藻燃料商业化发展的关键。基于微藻培养的污水处理技术的出现，为同时实现养猪废水的无害化处理、资源化利用和降低微藻培养成本提供了可能，它将水质净化与高价值生物质生产相耦合，实现污水处理由处理工艺向生产工艺转变，所获得的微藻生物质可以用作生产生物柴油的原料，给养猪场创造经济效益，保障养猪场的可持续发展。但藻种的筛选和培养体系的构建是成功实现此处理技术的关键。本实验室从养猪场废水处理池内分离纯化了一株微藻，因此，课题主要围绕此微藻的分离培养及其在养猪废水处理中应用的基础条件进行了探讨，为构建基于微藻培养的养猪废水处理技术体系提供基础依据，论文通过对微藻的分离鉴定及其理化性质测定、微藻培养条件的优化、微藻处理养猪废水的可行性及强化微藻处理养猪废水条件的研究，获得了以下主要结果：(1)借助形态学和分子生物学手段，鉴定此微藻为栅藻，命名为Desmodesmussp．CHXl，相关纯化藻株和序列基因已提交至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏受理号：CGMCCNo．6649)和Genebank(登录号：JX255841)；栅藻(Desmodesmussp．CHXl)最佳光密度值为OD690，但OD690测定值不易超过O．7，在此测定范围内，光密度值与藻体干重间呈线性正相关关系(尺2=O．9942)；正常培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在BG．11培养液中生长45天后达到生长稳定期，最高浓度达4．54g／l；培养4周后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内C、N、H和zn含量分别为45．7％、7．13％、7．90％和79．7mg／kg，Cu含量低于最低检测浓度；藻体总叶绿素含量为4．92mg／1，其中叶绿素a占总叶绿素含量的78．5％，类胡萝卜素含量为1．67mg／1；藻细胞总脂含量为12．1％．14．6％，脂肪酸成分中以C16．C18含量为主，占总脂肪酸含量的70．7％，适合作为生物柴油生产原料。此外，藻体粗蛋白含量为49．3％，在所测n浙江大学博士学位论文摘要定的16种氨基酸成分中含有人体所必需的7种氨基酸，其中天冬氨酸含量最高，达27．2mg／g，总氨基酸含量为198．4mg／g，其中总必需氨基酸含量为59．31mg／g，占总氨基酸含量的29．9％，也可作为养猪场部分蛋白饲料的替代品。(2)混养培养方式最利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长，而葡萄糖和N03_N分别作为碳源和氮源时，最适宜于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物产量和Chl(a+b)的积累；正交优化试验结果表明，在所测定的四个因素中，葡萄糖添加浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂产率的影响最大，其次为藻细胞初始接种浓度，结合正交试验和单因子试验结果，筛选出最利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂生产的培养条件组合为：葡萄糖浓度3g／l、培养液初始pH=10、细胞接种浓度5％(初始OD690=0．08)、硝酸盐浓度2酊；在此培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)从适应期结束到稳定期只需5天左右，大大缩短了藻细胞培养时间；此外，曝气能显著增加栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的生物产量、Chl(a+b)含量和油脂产量，且在所研究的曝气量范围内(16．1601／h)，随曝气量的增加，上述指标均显著增加，培养7天后，在曝气量为1601／h时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的生物量浓度、Chl(a+b)含量和油脂产率分别达到7．26酊、60．5m酊和128．7mg,Vd，这说明在栅藻(Desmodesmussp．CHXl)培养过程中，适当的曝气利于微藻生长和油脂的生产。(3)栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能在适度稀释的灭菌后养猪废水中存活并生长，培养12天后，最大生物量产率和比生长率分别达到196．7m鲋／d和0．279／d，对NH4+-N、TP和COD的最大去除率分别为98．2％、80．4％和37．1％。因此，该栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备应用于养猪废水处理的潜力，但在处理前，对养猪废水进行适当的稀释是保证栅藻(Desmodesmussp．CHXl)快速生长和有效去除营养物质的前提，而在现今的商业运作模式中，稀释是商业化应用过程中的一大限制，因此，降低养猪废水对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的抑制效应，寻找其他低成本的预处理方式以强化其商业化应用的可行性成为必要。(4)直接空气吹脱可以作为一种简单有效的预处理方法应用于基于微藻培养的养猪废水处理技术体系中，以降低养猪废水中过高氨氮对微藻的生长抑制作用；而向不灭菌养猪废水中泵入含5％C02的空气(即混养培养)时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长、油脂积累和废水中NH4+-N、TN、TP和COD、n浙江大学博士学位论文摘要Cu、zn等去除均得到显著加强。培养8天后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生物量浓度、生物量产率和油脂产率分别高达7．91g／1、869．0mg／1／d和132．1mg／l／d(总脂含量15．2％)，而废水中NH4+-N、TN、TP、COD、Cu和zn等去除率分别为97．3％、87．9％、93．2％、41．8％、50．1％和30．1％。元素流分析结果表明，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的直接吸收利用是废水中N、P和cu、zn去除的主要原因。混养培养后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内N、P含量、C16．C18脂肪酸含量、粗蛋白含量和氨基酸含量均得到显著提高，其中N、P含量分别为9．55％和O．79mg／kg，粗蛋白和总氨基酸含量分别为59．7％和315．9rtg／g(EAA／TAA为30．5％)，C16．C18脂肪酸占总脂肪酸成分的83．11％。关键词：栅藻(Desmodesmussp．CHXl)，分离鉴定，培养优化，油脂产率，废水处理，养猪废水，基础研究n浙江大学博士学位论文摘要n浙江大学博士学位论文AbstractOwningtotherapiddevelopmentofpighusbandry,thereisadramaticincreaseintheswinewastewater,whichbringsaseveredamagetothelocalecologicalenvironmentandhealthoftheresidents．ItiSafoundationforthesustainabledevelopmentofthepighusbandrytorealizetheinnocent，resourcefulandreductiontreatmentoftheswinewastewater．However,thecurrentregularwastewatertreatmenttechnologiesonlyfocusontheinnocenttreatmentofthewastewater,butneglecttheresourcefulutilizationofthewastewater．Ontheotherhand，inordertoalleviatethesituationinwhichthereisashortageofresourceandenergy,themicroalgalbio·energyRimstobeoneofthehotspotsintheresearchfieldofbiomassenergy,andhowtolowerthecostformicroalgalcultivationisakeytorealizethecommercialdevelopmentofthemicroalgalbiofuel．Theoccurrenceofwastewatertreatmenttechnologybasedonthemicroalgalcultivationmakesitpossibletorealizetheinnocenttreatmentandresourcefulutilizationofswinewastewaterandto10Werthecostformieroalgalcultivation．Itcouplesthewaterpurificationwiththeproductionofvaluablebiomass，whichrealizesthetransformationofwastewatertreatmentfromtreatmentprocesstoproductiontechnology,andthemicroalgalbiomassobtainedCanactastherawmaterialsforproducingthebiodiesel，whichCancreateeconomicbenefitandguaranteethesustainabledevelopmentofthepigfarm．However,theselectionofalgaeandconstructionofcultivationsystemarethekeystorealizethetreatmenttechnologysuccessfully．Inthisexperiment，amicroalgalinthewastewatertreatmenttankofthepigfarmwasseparatedandpurified．Therefore，theprojectfocusedonthediscussionabouttheisolatedcultivationofmicroalgalandthebasicconditionsforitsapplicationintheswinewastewatertreatment，whichprovidedtheinformationbasisfortheswinewastewatertreatmenttechnologybasedonthemicroalgalcultivation．Theresearchcontentsmainlyincludedtheisolationandidentificationofthemicroalgalanddeterminationofitsphysicochemicaln浙江大学博士学位论文characteristics，theoptimizationofthemicroalgalcultivationconditions，feasibilityofswinewastewatertreatmentbasedonmicroalgaeaswellasthestrengtheningintheconditionofthemicroalgalswinewastewatertreatment，etc．Thefollowingresultshavebeenobtainedthroughexperimentalresearch：(1)Withthehelpofmorphologyandmolecularbiologyapproaches，thismicroalgalWasidentifiedastheScenedesmusandnamedasDesmodesmussp．CHXl．TherelatedpurifiedstrainandgenesequencehasalreadybeensubmittedtotheChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter(AcceptedNo．ofthepreservation：CGMCCNo．6649)andGenebank(accessionnumber：JX255841)．ThebestopticaldensityoftheDesmodesmussp．CHXlWasOD690，butthemeasuredvalueofOD690couldnotexceed0．7easily．Wiminthismeasuringrange，thereWasalinearpositivecorrelationbetweentheopticaldensityandthedryweightofthecells俾?=O．9942)．Undernormalcultivation，theDesmodesmussp．CHX1reachedstablegrowthphaseaftergrowingintheBG-11culturesolutionfor45days，withthemaximumdensity4．54g／1．Afterfourweeks，thecontentsoftheC，N，HandZninthecellofDesmodesmussp．CHXlwere45．7％，7．13％，7．90％and79．7mg／kg，respectively,andthecontentofCuwaslowerthantheminimumdetectableconcentration．ThetotalChlorophyllWas4．92mgn，inwhichtheChlorophyllaaccountedfor78．5％ofthetotalchlorophyll，whilethecontentofcarotenoidWas1．67mg／1．111etotallipidoftheisolatedalgaWastherangeof12．1％·14．6％．andthecontentofC16-C18dominatedinthefattyacid，accountingfor70．7％ofthefattyacidcontent，whichcouldbeusedastherawmaterialsforthebiodiesel．Inaddition，thecrudeproteincontentWas49．3％，andtherewere7kindsofaminoacidwhichwereessentialforthehumanbodyamongthe16kindsofaminoacid，inwhichthecontentofasparticacidWasthehigllest，about27．2mg／g；thecontentoftotalaminoacidwas198．4mg／g，inwhichthecontentofessentialaminoacidswere59．31mg／g，accountingfor29．9％ofthetotalaminoacid．Alsoitcouldbetakenasthesubstitutesofsomeproteinfeedinthepigfarm．(2)ThemixotrophiccultivationWasfavorableforthegrowthofDesmodesmussp．CHXlmost．WhentheglucoseandN03一NweretakenasthecarbonandnitrogenTln浙江大学博士学位论文source，respectively,itWaSfavorableforthebiologicalyieldoftheDesmodesmussp．CHXlandtheaccumulationofChl(a+b)．TheorthogonaloptimizationtesthadshownthatwithinthefourfactorsmeaSured，theadditiveconcentrationofglucosehadthebiggestinfluenceonthegrowthandoilproductionrateoftheDesmodesmussp．CHXlandtheinitialinoculationconcentrationrankedthesecond．Accordingtotheresultsoforthogonaltestandsinglefactorexperiment，thecombinationofculturesthatWaSmostfavorableforthegrowthandoilproductionrateoftheDesmodesmussp．CHXlhadbeenselected，namely,theconcentrationofglucoseWaS3g／l，theinitialpHofthemediumWaS10，thecellinoculationconcentrationWaS5％(initially,OD690=0．08)andtheconcentrationofthenitratewas2g／1．Insuchaculture，itonlytook5daysfortheDesmodesmussp．CHXltoreachthestablephasefromtheendofadaptivephase，whichshortenedthecultivationperiodgreatly．Asaresult，thecultureofDesmodesmussp．CHXlseedcouldbepreparedintheoptimizedcultivationcondition．Inaddition，theaerationccouldincreasethebiologicalyieldoftheDesmodesmussp．CHXl，thecontentofChl(a+b)andoilproductiondramatically．Withintheresearchscope(16-160l／h)，theabovementionedindexincreasedwitlltheaerationquantity．After7daysofcultivation，thebiomassconcentrationoftheDesmodesmussp．CHXlcell，theChl(a+b)contentandoilproductionreached7．26g／1，60．5m酣and128．7mg／1／d，respectively,whentheaerationwas160l／h，suggestingthatduringthecultivationofDesmodesmussp．CHXl，properaerationisfavorableforthegrowthofmicroalgaeandtheaccumulationofvaluableadditionalmaterials．(3)Desmodesmussp．CHXlcouldsurviveandgrowintheproperly-dilutedswinewastewateraftersterilization．After12daysofcultivation，themaximumbiomassyieldandgrowthratereached196．7mg／Vdand0．279／d，respectively,whilethemaximumremovalrateofNH4+-N，TPandCODreached98．2％，80．4％and37．1％，respectively．Therefore，Desmodesmussp．CHXlhasthepotentialofbeingappliedintotheswinewastewater．Butbeforetreatment，properdilutionofswinewastewaterisapremiseofguaranteeingthefastgrowthofDesmodesmussp．CHXlandeffectiveremovalofnutritionalingredients．However,inthecurrentcommercial111n浙江大学博士学位论文operationmodel，dilutionislimitedinthecommercialapplication．Therefore，todeCreasetheinhibitingeffectofswinewastewateronDesmodesmussp．CHXl，otherlow·-costpre--treatmentmethodscanbesoughttostrengthenthefeasibilityofitscommercialapplication．(4)Directairstrippingcouldbetakenasasimpleandeffectivepre-treatmentappliedintheswinewastewatertreatmenttechnologysystembasedonthemicroalgMcultivationtode．easetheinhibitionofhighammoniaandnitrogenintheswinewastewateronthemicroalgal．Besides．topumptheairwith5％C02(namelyasthemixotrophiccultivation)intotheunsterilizedswinewastewater,thegrowthofDesmodesmussp．CHXl，theaccumulationofoilandtheremovalrateofNH4十-N，TN，TP,COD，CuandZninthewastewaterwerestrengthenedremarkably．After8daysofcultivation，thebiomassconcentration，biomassyieldandoilproductionrateofDesmodesmussp．CHXlwereashighas7．91egl，869．0m鲥／dand132．1mg／1／d(thecontentofthetotaloilis15。2％)，whiletheremovalrateofNH4+-N，TN，TP,COD，CuandZninthewastewaterWas97．3％，87．9％，93．2％，41．8％，50．1％and30．1％respectively．Theelementarystreamanalysisresultshadshownthat，directabsorptionandutilizationofDesmodesmussp．CHX1werethemaincausesoftheremovalofNandP，aswellasCuandZninthewastewater．Afterthemixotrophiccultivation，thecontentofN，P，fattyacidcontentofC16一C18，crudeproteincontentandaminoacidcontentinthecellofDesmodesmussp．CHXlwereimprovedgreatly,inwhichthecontentofNandPWas9．55％andO．79megkgrespectively,whilethecrudeproteincontentandtotalaminoacidcontentare59．7％and315．9pg／g，respectively(EAA／TAAis30．5％)，andthefattyacidcontentofCl6一C18accountedfor83．11％ofthetotalfattyacid．Keywords：Desmodesmussp．CHXl，Isolationandidentification，Optimization，Lipidproductivity,Wastewatertreatment，Piggerywastewater,BasicresearchIVn浙江大学博士学位论文目录第1章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1课题背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．2养猪废水的产生、危害及处理方法分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··21．2．1我国养猪业发展现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2．2猪场废水的产生和水质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．3猪场废水的危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．4养猪废水处理方法及分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．3微藻处理污水⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··81．3．1微藻去除氮磷的原理和优势⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．3．2去除氮磷的常见藻种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．3．3微藻去除氮磷的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4微藻生物能源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．4．1微藻生产生物能源的原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·141．4．2微藻生产生物能源的优势⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·151．4．3微藻培养的影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·161．5基于微藻培养的养猪废水处理技术及存在的问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．6论文构思⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2．1微藻的分离、纯化及扩繁⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·282．2．2微藻种类鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·302．2．3微藻理化性质测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·322．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯352．3．1藻种的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·352．3．2藻密度表征方法确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·37n浙江大学博士学位论文目录2．3．3藻体无机元素含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·412．3．4藻体色素含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·412．3．5藻体总脂含量和脂肪酸组成测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·422．3．6藻体粗蛋白含量和氨基酸组成测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·442．4本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45第3章栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．2．1微藻及预培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·483．2．2培养方式优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·493．2．3碳源优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·493．2．4氮源优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·503．2．5正交组合优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·513．2．6单因子优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·523．2．7测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·523．2．8数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·53313结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯533．3．1培养方式优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·533．3．2碳源优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·553．3．3氮源优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·583．3．4正交试验优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·603．3．5单因子试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·633．3．6栅藻CHXl在优化组合条件下的生长曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯683．4本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69第4章栅藻CHXl应用于养猪废水处理的初试研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯714．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7l4．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯714．2．1微藻及预培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·714．2．2养猪废水的收集及理化性质测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·71n浙江大学博士学位论文目录4．2．3试验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·724．2．4测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·734．2．5数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·734．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯734．3．1栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·734．3．2养猪废水水质变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·754．4本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯79第5章曝气对栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．815．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯815．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯825．2．1微藻及预培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·825．2．2试验装置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·825．2．3试验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·835．2．4取样与测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·835．2．5数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·845．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯845．3．1栅藻CHXl生长情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯845．3．2藻细胞Chl(a+b)含量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘865．3．3藻细胞油脂含量和产率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·895．4本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯90第6章混养培养强化栅藻CHXl生长及净化养猪废水性能的研究⋯⋯⋯⋯⋯916．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯916．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯926．2．1微藻及预培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·926．2．2养猪废水的收集和预处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·926．2．3试验装置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·936．2．4试验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·936．2．5测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·946．2．6数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·95IIln浙江大学博士学位论文目录6．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯956．3．1预处理对养猪废水理化性质的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·956．3．2栅藻CHXl的生长情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯966．3．3栅藻CHXl细胞理化性质变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯986．3．4废水水质变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1036．4本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一111第7章主要结论和研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1137．1主要结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1137．1．1一株微藻的分离鉴定及其理化性质测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1137．1．2栅藻细胞生长和油脂积累培养条件优化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1137．1．3栅藻应用于养猪废水中的初试研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1147．1．4曝气对栅藻生长和油脂积累影响的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1147．1．5混养培养强化栅藻生长和养猪废水净化性能的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1157．2主要创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1157．3研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··116参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·119攻读博士学位期间主要的研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·141lVn浙江大学博士学位论文图目录图1．1利用微藻获取生物能源示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15图2-1分离藻在显微镜下的形态特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36图2．2分离藻的18SrDNAPCR扩增产物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37图2．3基于18SrDNA部分序列构建的系统发育树⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37图2．4不同稀释倍数栅藻(Desmodesmussp．CHXl)最佳光密度值⋯⋯⋯⋯⋯39图2．5Desmodesmussp．CHXl藻液OD690和藻体干重的关系曲线图⋯⋯⋯⋯⋯40图2-6栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在500ml培养瓶中的生长曲线⋯⋯⋯⋯41图3．1不同培养方式下培养前后栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量浓度⋯55图3．2不同碳源条件下培养前后栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量浓度⋯56图3．3培养3d后不同碳源条件下栅藻CHXl细胞内叶绿素a和叶绿素b含量58图3．4不同氮源条件下培养前后栅藻CHXl细胞生物量浓度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··59图3．5培养7d后不同氮源条件下栅藻CHXl细胞内叶绿素(a+b)含量⋯⋯··60图3-6葡萄糖浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量的影响⋯⋯⋯⋯⋯65图3．7葡萄糖浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)比生长率的影响⋯⋯⋯⋯65图3．8葡萄糖浓度对栅藻CHXl油脂含量和油脂产率的影⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··66图3-9接种浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯67图3．10接种浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)比生长率的影响⋯⋯⋯⋯··67图3．11接种浓度对栅藻CHXl油脂含量和油脂产率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·68图3．12栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在优化组合条件下的生长曲线⋯⋯⋯··69图4．1栅藻CHXl在不同倍数稀释后养猪废水中的生长情⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··75图4-2T-20％和T-50％处理下废水中NH4+-N浓度变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·76图4．3T-20％和T-50％处理下废水中pH变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··77图4．4T-20％和T-50％处理下废水中TP浓度变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··78图4-5T-20％和T-50％处理下废水中COD的变化情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··79图5-1栅藻(Desmodesmussp．CHXl)培养结构示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯83图5-2不同曝气量处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长情况⋯⋯⋯⋯85图5．3不同曝气量处理下培养液中DO浓度变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯86Vn浙江大学博士学位论文图目录图5．4不同曝气量处理下栅藻CHXl细胞培养液内叶绿素(a+b)含量⋯⋯⋯88图5．5不同曝气量处理下培养液pH变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯88图5-6不同曝气量处理下栅藻CHXl细胞的油脂含量和产率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··90图6．1混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)结构示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93图6．2不同处理下栅藻(Desmodesmussp。CHXl)的生长情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯97图6．3栅藻CHXl在养猪废水中混养培养前后藻细胞体内C、N、H含量⋯⋯98图6．4不同处理下栅藻CHXl体内油脂含量及油脂产率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·102图6-5不同处理下栅藻CHXl对废水中NH4+-N(a)和TN(b)的去除情况·105图6-6不同处理下废水pH的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯105图6．7不同处理下栅藻CHXl对废水中TP的去除情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··107图6．8不同处理下栅藻CHXl对废水中COD的去除情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··108图6-9培养8d后不同处理下养猪废水中Cu2+和zn2+浓度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··1lO图6．10不同处理下培养前和培养后栅藻CHXl体内中Cu和Zn含量⋯⋯⋯··111VIn浙江大学博士学位论文表目录表1．1猪场废水的一般理化性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4表1．2不同植物生物柴油产率及用地面积比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16表2．1BG．11培养基成分表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29表2．2栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内无机元素和色素含量⋯⋯⋯⋯⋯⋯41表2．3栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内脂肪酸组成成分及相对含量⋯⋯⋯⋯··43表2．4栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内氨基酸组成成分及含量⋯⋯⋯⋯⋯45表3．1L9(3)4正交试验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51表3．2正交试验优化结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62表3．3正交试验优化结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62表3．4一些微藻种生物量产率和油脂产率的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63表4-1试验用养猪废水的主要理化性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72表6-1养猪废水在曝气预处理前后理化性质测定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一96表6．2栅藻CHXl在养猪废水中混养培养前后藻细胞内粗蛋白和氨基酸含量·100表6．3栅藻CHXl在养猪废水中混养培养前后藻细胞内粗蛋白和氨基酸含量·103表6．4不同处理下栅藻CHXl对养猪废水中Cu2+和Zn2+的去除效率⋯⋯⋯⋯111VIIn浙江大学博士学位论文表目录VIlln浙江大学博士学位论文第1章绪论1．1课题背景随着畜禽养殖业的发展和“菜篮子工程”的实施，我国生猪生产快速、稳步发展。据统计，2002．2009年生猪存栏量由41776．2万头增至48204．8万头，增长了15．39％，出栏量由56684．0万头增至64538．6万头，增长了13．86％，2010年猪肉产量达到5070万吨，占到我国肉类产量的63．97％(闫振宇等，2012)。生猪养殖规模的扩大化在解决人类肉产品供给问题的同时，也给生态环境带来了极大压力。根据2010年2月发布的《第一次全国污染源普查公报》，畜禽养殖业主要水污染物COD排放量高达1268万吨，占全国水污染COD排放量的41．8％；畜禽粪便废水中主要污染物COD、BOD5、NI-14+-N、TP、TN的流失量分别为797．3万吨、580．87万吨、155．88万吨、46．7万吨和407．14万吨，其中氮、磷的流失量己超过化肥的流失量，约为化肥流失量的122％和132％，养猪废水带来的污染已经或正在成为许多地区水体水质恶化的主要污染源，成为人们普遍关注的社会问题，养猪废水的治理迫在眉睫(黄利伟，2011)。实现废水的无害化、减量化和资源化是养猪废水处理的目标，而现有的常规污水生物处理工艺虽然能够去除污水中大部分有机和无机污染物，但仅仅作为一种处理工艺而实施，实现了废水的无害化处理，忽略了废水的资源化利用；此外，现有工艺对废水中氮磷等营养物质的去除效果较差；而化学法的除磷效果良好，但化学药剂成本高，产生的污泥量大且难以处理(Rawat等，2011)。可以说，现有常规污水处理工艺不仅造成N、P资源的浪费而且对于微利行业的养猪业来说，存在严重的成本压力问题。因此，寻找一种体系简单、成本低且能同时实现养猪废水无害化、资源化利用目的的污水处理工艺，实现污水处理由处理工艺向生产工艺转变，给养猪场创造经济效益，是实现养猪场可持续发展的重要保障(ChesapeakeBayFoundation，2006)。另一方面，随着人口增长与经济的快速发展，带来了资源和能源过度消耗、面临枯竭的困境，能源危机给人类的可持续发展带来了前所未有的威胁。2010年全球的能源缺口为403EJ／a，据估计，到2020年这个缺口将达到488EJ／a(Mark等，2007)，而我国到2020年石油资源将趋于枯竭(闵恩泽，2006)，全n浙江大学博士学位论文第1章绪论球现有原油储量和天然气储量也将分别在40年和64年后用尽(Vasudevan等，2008)。可以说，中国未来发展面临的能源约束是刚性的，能源短缺已经成为中国国民经济增长最主要的制约瓶颈。出于战略安全方面考虑，2010年1月27日，中国政府宣布成立国家能源委员会，发展可再生生物质能源，改变以煤为主、石油和天然气短缺的能源结构作为其核心任务之一。传统生物质能源是以大豆等粮食作物为原料，发展过程中存在生产周期长、光合效率低、原料不足、加重温室效应、可能引发粮食危机等一系列问题，因此，寻找可持续再生、环境友好的新型生物质能源势在必行(Searching等，2008；葛亚明，2012)。近年来，微藻在污水脱氮除磷处理(Gonzalez等，2008；Park等，2010；Lim等，2010；Li等，2010；Li等，2011；Su等，2011)和制备生物柴油(Peer等，2008；Liang等，2009；Cheng等，2009；李鑫等，2010；Zhou等，2011；Li等，2011)方面均得到了越来越多的重视，并开展了大量相关研究。参考国内外研究资料与文献，本文就养猪废水产生、危害及处理方法、微藻处理污水和微藻生产生物柴油等三面进行了综述。1．2养猪废水的产生、危害及处理方法分析1．2．1我国养猪业发展现状我国是世界上公认的养猪大国，2010年生猪存栏量4．70亿头，出栏量6．67亿头，居世界第一，约占全球的一半(李俊柱，2011)，猪肉产量5070万吨，约占全国肉类总产量的64％，养猪业产值约1万亿元，占全国畜牧业总产值的35％(黄微和徐顺来，2011；闫振宇等，2012)。这一比例在浙江省内更高，2010年，浙江省生猪存栏1248万头，出栏1922万头，产值约295亿元，占畜牧业总产值的66％(戴旭明，2011)。目前我国养猪业的发展也呈现出一定特点，首先，养殖模式由传统的农户散养逐渐向企业规模化养殖转变。截止到2009年底，全国生猪规模化养殖比例超过60％，其中万头猪场由2006年的1300家和2007年的1800家，上升到2008年的2500家，2009年突破3000家，预计到2020年这一比例将超过70％(黄微和徐顺来，2011)，而浙江省2010年全省生猪规模化比率高达82％，以中等规模为主(出栏500头以上的规模)(戴旭明，2011)。生猪规模化养殖不仅向城市提供了丰富的肉产品，保障了市场肉产品的需求，满足了广大人民的生活需要。同时又拉动了农业产值的增加，带动了农民致富，成n浙江大学博士学位论文第1章绪论为我国广大农村居民收入的主要来源之一。可以说，养猪业已成为中国农村经济中最活跃的增长点和主要的支柱产业。1．2．2猪场废水的产生和水质现代化封闭型的规模化养猪技术促进了我国城市养猪业向优质高效发展，提高了饲养技术、防疫能力和管理水平，降低了生产成本，增加了经济效益。但另一方面，规模化的养猪场也造成猪场废水的大量增加，据计算，一个年出栏量为10000头的规模养猪场年排40x104t粪尿，对应年排冲栏废水55x104t，这相当于每年排放COD4x104t、N2400t、P240t(曹榕等，2012)，如此大的废水排放量，给生态环境带来了极大压力。猪场废水主要是由猪尿、猪粪和猪舍冲洗废水组成，据估计到2020年，畜禽养猪废水年产生量将高达17．18亿m3(杨朝晖，2002)。规模化养殖场废水具有排放量大、冲击负荷大、固液混杂、有机质浓度高、处理难度大、含氮量高、碳氮比失调等特点，其水质因猪粪尿清洗工艺不同而异。目前，我国规模化养猪场主要的粪尿冲洗工艺有三种(黄若涵，2012)：水冲式、水泡粪(自流式)和干清粪工艺。水冲式清粪工艺具有劳动效率高，劳动强度小的优点，但耗水量很大，我国南方地区目前大多采用这种工艺；水泡粪清粪工艺是在水冲式工艺的基础上改造而来的，是在猪舍内的排粪沟注入一定量的水，猪粪尿落入沟中储存，待排粪沟装满后，排出沟中粪尿污水。这一工艺较水冲式工艺节省水、节省人工，但是因粪便长时间在猪舍中停留，形成厌氧发酵，会产生大量的有害气体如H2S、CH4等，恶化猪舍内空气，危害动物和饲养人员的健康，我国北方地区多采用该工艺。采用上述两种工艺排出的猪场废水是猪尿、猪粪和猪舍冲洗废水三者的完全混合，废水中有机物浓度含量高，处理难度大。干清粪工艺，是粪便一经产生便分流，干粪由机械或人工收集，走清粪道清出，尿水及污水从下水道流出。该工艺可保持猪舍内清洁，无臭味，产生的污水量少，且浓度低，易于净化清理；干粪直接分离，养分损失小，肥料价值高，是目前比较理想的清粪工艺。采用此种工艺排出的猪场废水是猪尿、部分猪粪和猪舍冲洗废水三者的混合物，废水中有机物浓度含量相对较低。表1．1汇总了水冲式猪粪废水的各项常规水质指标(杨朝晖，2002)。由表1可以发现，猪粪废水pH呈中性，在6．2．7．7范围，含有一定的碱度，Ts质量n浙江大学博士学位论文第1章绪论浓度和COD含量较高，分别高达10．20∥1和11．26g／1。另外，猪粪废水中含氮物质含量较高，TKN的质量浓度达到0．68．1．1酊，碳氮比比例失衡。此外，除上述一般的水质特征外，猪粪废水中还含有一些特殊组分，如硫化物、重金属离子、抗生素等。如此大量有机物含量高且成分复杂的猪场废水，若得不到适当处理而直接排入自然水体中，会消耗水中溶解氧，氮磷等营养元素促进低等水生植物大量繁殖，引起水体富营养化，危害水生生物，恶化水质，对我国水环境形成潜在污染威胁。表1-1猪场废水一般理化性质(除pH外，单位mg,a)Table1．1Generalcharacteristicsofswinemallurewastewater1．2．3猪场废水的危害猪场废水本是一种极好的天然肥料，但是如果不处理或处理不当就排入环境或作为回灌用水时不能被土地消纳，就会对地表水、地下水、土壤和空气造成严重污染，也会危及猪群和居民的健康(王建彬等，2007)。生猪养殖废弃物所造成的环境恶化问题已引起了世界畜牧界和环保组织的极大关注，也引起了各国畜牧业生产部门和广大群众的高度重视。国外对养猪业污染的危害性和严重性认识较早，如日本于20世纪60年代就提出了“畜产公害”问题(张彩英，1992)，纷纷通过法律及环境管理措施加强对畜禽养殖场粪尿及废水的处理、处置与综合利用。而我国对养猪业污染的防治和管理要大大落后于产业的发展，行业污染形势十分严峻，处理效率很低。据我国农业部统计，至2005年底，处理规模化畜禽养殖场粪便污水的沼气工程累计仅达到2493处；而当年，规模化养殖场(猪存栏>500头，鸡存栏>10000只，牛存栏>100头)则共约5万个，采取沼气工程等手段处理畜禽养殖废水的畜禽场仅占总量的4．9％左右。尽管最近几年加快了畜禽粪便污水的处理步伐，但我国大约仍有90％以上的养猪场没有4n浙江大学博士学位论文第1章绪论配套的粪尿废水综合处理设施，如官雪芳(2009)在福建省养猪业沼气工程建设情况的调研中发现全省未治理生猪废弃物的常年存栏量200头以上的养猪场共有5496个，且90％1)／(上的养猪场没有废弃物综合利用和污水处理设施；张乃弟等(2011)对武汉市规模化养殖企业污染治理情况调查中发现，全市277家规模化养殖企业，进行了建设项目环境影响评价的企业有60家，环评比例为21．7％；具备污水处理设施的企业38家，完成率为13．7％；通过环保验收的企业22家，完成率仅为7．9％，未经处理的废弃物污水任意排放现象极为普遍，导致大量的氮、磷进入环境，形成水体污染，迅速发展的养猪业已经或正在成为当地主要污染源。归纳起来养猪废水对环境产生的危害主要表现在以下几个方面：(一)对水环境的污染猪场废水已经成为地表水、地下水及农田污染的主要污染源之一。没有经过处理的猪场废水富含氮、磷及有机污染物，直接排放到自然水体，大量有机物在微生物的分解过程中，会消耗水中的溶解氧，使水体发黑发臭，同时氮磷等营养元素又会促进藻类的大量繁殖，导致水体水华和赤潮等富营养化生态后果的发生(张春娣，2010)，如太湖水华导致无锡等城市供水短缺的严重饮用水安全问题。此外，由于防渗措施不佳，猪场废水在存放过程中会渗透到地下水层中，使地下水体水质中氮、磷、有机污染物等的含量增加和细菌总数超标，严重影响饮用水水质安全和人类健康(赵君怡等，2010；万风等，2012)，如Krapac等(2002)调查发现从畜禽粪便水粪贮存池周边水井中取出的饮用水中硝酸盐和大肠杆菌含量大大超出饮用水标准；Dougherty等(2009)连续两年对新西兰某养殖废水污灌区周边的地下水进行观测，发现第·年检测大肠杆菌浓度为3558．4040efu／100ml，第二年就已经增JJ口至IJ34025．28401efu／100ml。(二)对大气环境的影响刚排出的猪粪中含有NH。、H2S和胺等有害气体，在与猪尿水或冲洗废水混合后，未能及时清除或清除后不能及时处理时，臭味将成倍增加，产生甲基硫醇、甲硫醚及低级脂肪酸等恶臭气体，恶化养殖场内外环境的空气质量，长时间存在会使人精神不振，记忆力下降，对养殖场工作人员和周边居民产生危害，还会影响畜禽的生产性能、降低其生产力水平。据调查，我国规模化养殖场多建设在近郊和城乡结合部，距离居民点较近，甚至就在村落中进行养殖，而且n浙江大学博士学位论文第1章绪论我国90％以上的养猪场没有配套的粪尿水综合处理设施，每天产生的粪尿废水露天存放，蚊蝇孳生，给农村生态环境带来了严重危害(张乃弟等，2011)。此外，传统养猪废弃物多数采取存放池堆放，池中的厌氧发酵除了产生H2S、NH3等恶臭气体外，还会产生大量的ci-14，养猪业对大气中CH4含量增加的贡献亦很大。众所周知，CH4是产生温室效应的重要作用气体之一，目前，气温上升已成为国际社会十分关注的一个全球性环境问题，可以说，畜禽业的快速发展，也是加速全球变暖的重要驱动因素之一(WorldBank，2005)。(三)对土壤环境的影响由于我国农业灌溉用水的短缺，养殖废水和经过简单处理后的养殖废水已经作为非常规水源补充进行农田灌溉(齐学斌等，2006)。虽然养殖废水回灌可以增加土壤中氮磷等营养元素的含量，从而减少化肥的使用同时又能弥补农用水资源的短缺，但废水回灌也同时增加了土壤中污染物浓度，这与养殖废水中含有大量污染物有关。随着饲料工业的发展，养猪过程中大量使用钙、磷等矿物质元素以及铜、铁、锌等微量元素和抗生素，而这些元素在生猪体内的消化吸收利用率极低，只有5％．15％被吸收，其余全部碎粪尿排泄出体外(陶秀萍和董红敏，2009)。还田处理使用会显著增加土壤中重金属总量及生物有效态含量(Qian等，2003；姚丽贤等，2007)和抗生素残留量(王瑾等，2008)。此外，大量废水回灌也会引起营养物质在土壤中累积，导致土层结构破坏，地表植被消失，树木枯死，使土壤丧失还原能力，并为有害微生物及致病菌、寄生虫卵提供了繁衍潜伏的环境而导致人畜发病率的升高(杨朝晖，2002)。养猪废水回灌在影响土壤环境质量的同时，还会通过淋溶、下渗等途径影响附近地表水和地下水环境质量，特别是粪尿中的含氮化合物在土壤微生物的作用下，通过氨化、硝化、反硝化等生物化学反应过程形成亚硝酸盐、硝酸盐渗入到地下水，使地下水中亚硝酸盐和硝酸盐含量增加，水质破坏，如赵君怡等(2011)研究指出随着养猪废水农田灌溉量的增大，土壤孔隙部分被水填充，造成局部的嫌气环境，促进反硝化作用的进行，而土壤中反硝化反应增加，淋溶进入地下水中的N02也相应有所增加。(四)病原菌及寄生虫病的蔓延据世界卫生组织和联合国粮农组织有关资料，目前有200种“人畜共患传染n浙江大学博士学位论文第1章绪论病”，其中由猪传染的约25种，这些人畜共患传染病的主要传播载体是畜禽粪尿排泄物。据估计，19猪场的粪水中，大约含有83万个大肠杆菌和69万个肠球菌，还有寄生虫卵、活性较强的沙门氏菌等。实践表明，随意排放的猪场废水会导致病原菌和寄生虫病的传播和蔓延，如1998年7月末至9月初，江苏省部分地区发生的由猪链球菌血清II型及粪肠球菌引起的成批生猪发病，爆死数以千计。同期，与病猪密切接触者也多人发病死亡的事件报道。这些经血液传播的人猪共患病的爆发与流行不仅影响对外贸易，也会给养殖造成巨大的经济损失，同时对公共卫生尤其是相关从业人员的健康造成更严重的威胁，对人类生命安全、养猪业以及公共卫生安全造成了极大的负面影响(王华等，2012)。鉴于养猪废水可能产生的以上危害，在发展养猪业的同时，必须解决好养猪废水的处理，采取适当的方法，大力控制畜禽养殖业生产中的环境污染，对于增强环境保护和保障人类健康都具有十分重要的现实意义。1．2．4养猪废水处理方法及分析养猪废水属于畜禽养殖废水的处理范畴，国内外对畜禽养殖废水的处理方法主要有综合利用和处理达标排放两大类(万风等，2012)，其中综合利用是生物质实现多层次利用、建设生态农业和保证农业可持续发展的较好途径。但由于我国畜禽养殖业饲养管理方式落后，加上综合利用前处理效果的不稳定，常使畜禽废水在综合利用的过程中产生许多问题，如废水产生量大、成分复杂、处理后污染物浓度仍然很高和受季节灌溉影响等；而对于处理达标排放来讲，从采用工艺技术来看，有厌氧处理(Ndegwa等，2008；Wang-等，2009；Song等，2010；曹榕等，2012)、好氧处理(Obaja等，2005；梁美东等，2009)、厌氧好氧组合处理(wal【i等，2007；Hwang等，2007；胡晓莲等，2010；易剑锋，2011)以及氧化塘(叶美锋等，2006)、人工湿地(林东教等，2004)等处理方法。尽管有这些处理方法，养殖场废水处理率仍然很低。据调查，武汉市规模化猪场废水和粪尿处理设施的普及率也仅为7．9％(张乃弟等，2011)。养猪废水处理率普遍偏低的主要原因包括：一是我国畜禽养殖行业处于微利行业，受到自然和市场的双重风险，企业经济效益差，没有资金去建设相应的污水处理设施或运营已建成的污水处理设施；二是相关人员的环保意识差，相关的法律法规不健全，执法过程中存在重罚款、轻治理的行为，尤其在一些地方n浙江大学博士学位论文第1章绪论县市，经济发展、税收贡献往往高于环境质量的危害。此外，还有一个重要原因就是对畜禽养殖废水处理认知的模糊，处理模式往往较为单一。目前国内外所用的工艺流程大致相同，即固液分离．厌氧消化．好氧处理，许多人始终存在一个思维上的定式，即环保的“达标排放”思路，一些粪污研究和设计人员不切实际地追求处理设施的机械化和现代化，错误地认为粪污处理必须要建造复杂的构筑物和现代的机械设备，致使处理工程投资大、运行费用高，致使微利运营的养殖企业难以承受，即使建有处理设施，也可能只是作摆设。实际上，各地的自然、经济条件千差万别，养殖场的规模大小不一，环境容量有大有小，废水排放要求也不尽相同，粪污处理模式也应该多种多样。因此，有必要对各地畜禽养殖废弃物的不同处理方法进行调查研究和技术经济评价，探寻设施投资少、运行费用低和处理高效稳定的养殖业污水处理方法，进行污染物的减量化、无害化、资源化处理与合理利用，才是治理养殖业污染的最佳途径。1．3微藻处理污水1．3．1微藻去除氮磷的原理和优势微藻在污水处理中去除氮磷的机理包括直接吸收转化作用和间接作用(胡洪营等，2009)。微藻细胞能利用水体中多种无机氮和有机氮化合物作为氮源，利用二氧化碳和碳酸盐作为碳源，进行光能自养生长。被藻细胞吸收的硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐可以用于氨基酸和蛋白质等物质的合成；水中的磷可直接被藻细胞吸收，并通过多种磷酸化途径转化成ATP、磷脂等有机物。同时，微藻的光合作用造成水体pH升高，导致正磷酸盐和NH3分别通过形成沉淀和挥发的形式去除，从而间接去除氮磷。作为一种新型的“绿色”技术，利用微藻细胞去除氮磷主要有以下优势(胡洪营等，2009)：(1)能源(太阳光)充足；(2)去除氮磷的同时可固定C02；(3)去除氮磷无需投加外部碳源；(4)处理出水中含有丰富的溶解氧；(5)无污泥处置问题，无二次污染；(6)获得的藻细胞利用途径多(如动物饲料、生物沼气、生物柴油等)；(7)微藻光合作用形成的高pH值，也可起到一定的消毒作用。由于微藻处理污水的上述优势，加之其生长速度快，代谢迅速，对污水的净化效率高，因此利用微藻净化污水已经成为污水处理中的重要研究方向(Rawat等，2011)。n浙江大学博士学位论文第l章绪论1．3．2去除氮磷的常见藻种目前国内外用于废水处理的微藻种类主要有绿藻门的小球藻(ChlorellaXXu等，2006；陈春云等，2009；Min等，2011)、栅藻(Scenedesmus)(Li等，2010；Park等，2010；马红芳等，2012)、盐藻(Dunaliellu)(张扬等，2011)、葡萄藻(Botryococcus)(An等，2003；葛亚明，2012)、衣藻(Chlamydomonas)(Kong等，2010；Faraloni等，2011；邓旭等，2010)、根枝藻(Rhizoclonium)(Mulbry等，2008)和蓝藻门的螺旋藻(Spirulina)(Kulandaivel等，2007；杨敏等，2012；Chang等，2012；Markou等，2012)、颤藻(Oscillatoria)(Mostafa等，2012)等，其中又以小球藻(Chlorella)和栅藻(Scenedesmus)被认为是对N、P元素去除率最高，相对开展的研究最多(胡洪营等，2009)。同时有些抗逆性较强的藻还可以高效富集和降解多种重金属和有机化合物，如苯、有机氯化合物、有机氮化合物(Aravindhan等，2007；Rathinam等，2009；Markou等，2012；Ji等，2012)。1．3．3微藻去除氮磷的应用污水处理的主要目的是从其中去除高含量的营养物质，如N、P等营养元素。如果将未处理的污水直接排入水体，会引发水体富营养化，给环境和水资源带来严重危害(Flotats等，2009)。污水中P是特别难被去除的元素，传统处理中常采用化学法除磷，过程是向污水中加入一定量的化学药剂与磷酸盐形成难溶性沉淀，沉积在污泥中，最后随污泥一起被填埋或制成污泥堆肥。这种方法不仅成本昂贵，而且极易造成二次污染，对磷也未做到物尽其用。微藻能有效去除污水中N、P已是不争的事实，更有报道称微藻对N、P的去除效率还优于化学方法(Pittman等，2011)。目前，微藻在废水处理中去除氮磷的研究较多，涉及的废水类型主要包括农业养殖废水、工业废水和城市生活污水，在这些研究中，研究人员不仅仅考察了微藻对氮磷的去除效果，同时还评估了微藻的生长、油脂含量及油脂产率等指标。下面就近几年微藻在几种污水处理中的应用做一简单概括。(一)城市生活污水传统的城市生活污水处理一般由三级处理单元组成，其中一、二级处理单元主要用于去除悬浮物和溶解性有机物，而三级处理单元常作为深度处理以去除N、P等营养元素(Pittman等，2011)。城市生活污水中富含N、P等营养元素，n浙江大学博士学位论文第1章绪论有毒有害物质含量低，可用作微藻培养基，很多研究也亦证明微藻不仅可在生活污水中生长良好，而且在培养过程中能有效地去除污水中N、P。刘玉环等(2008)用高含油量栅藻(Scenedesmusdimorphus)处理模拟生活污水，结果表明S．dimorphus能利用污水中的养分从而移出其中的N、P，培养6d后，污水中的N03’浓度从8．3mga下降到3．6mgn以下，P04孓浓度从0．24mgn下降到0．03m酊以下；Li等(2011)用小球藻(Chlorellasp．)处理生活污水，培养14d后，污水中NH4+-N、TN、TP和COD的去除率分别达到93．9％、89．1％、80．9％和90．8％，而微藻体内油脂含量为11．04％，生物柴油产量可达O．12g／1。利用微藻处理生活污水过程中，为了充分发挥微藻的性能，很多研究者对培养条件、藻种筛选等也进行了深入研究，如李超等(2012)研究了不同水力停留时间对小球藻(Chlorellavutgam)处理市政生活污水的影响，结果表明水力停留时间对C．vu／gar／s去除污水中营养物的影响较小，不同水力停留时间(24，48，96h)内，COD和TP的去除率分别在66．1％．71．1％和37．6％．51．1％，进一步碳素流分析表明，污水中71．1％的有机碳被微藻利用，其中94．6％被转化为微藻生物质，其余被代谢为C02释放，废水中有机碳(COD)转化为微藻油脂的转化率为11．6mg／mg／1；Cho等(2011)研究了污水处理厂二级出水进行不同除菌预处理后(紫外灯照射、过0．459m滤膜、过0．21am滤膜)，Chlorellasp．227对污水中N、P的去除情况，结果表明，在所有预处理方式中，Chlorellasp．227在过0．2“m滤膜处理污水中生长最好且对N、P的去除率最高，分别为92％和86％，但研究者同时指出处理后污水中TOC含量却被显著增加，推测可能与藻细胞产生次级代谢产物有关。“等(2010)从城市生活污水处理厂二级污水处理池内分离出一株高含油栅藻Scenedesmussp．LXl，为验证该栅藻在污水中生长、油脂积累和对污水的处理效果，研究者进一步开展了Scenedesmussp．LXl处理二级出水的实验，结果表明，Scenedesmussp．LXl能耐受二级出水并且生长良好，最大生物量达到O．11g／1，脂质含量为31．33％。培养10d后，废水中无机营养盐的去除率均在98％以上；Su等(2011)从市政污水二级出水池内培育出一株藻菌共生体，研究了此藻菌共生体对二级出水处理效果，结果表明，此藻菌共生体具有很好的沉降性能，对污染物具有较好的去除效果，培养8d后，污水中COD、TKN、TP的去除率分别达到98．2％、88．3％和64．8％，藻菌共生体的生物量产率达到10．9g／m2／d。并且深n浙江大学博士学位论文第l章绪论入探讨了N、P的去除机理，指出微藻直接吸收利用是污水中N、P去除的主要原因，被利用的N、P占总去除N、P量的44．9％和61．6％。微藻对生活污水的处理不仅仅局限于二级出水，它还能适应更高浓度的初级出水或污泥离心后的浓缩水。Pittraan等(2011)研究表明小球藻C．w／gar／s能生长在生活污水初级出水池出水中，培养一定时间后，N、P的去除率分别达到90％和80％；Zhou等(2011)从明尼苏达州5种类型水体内筛选出60株微藻，进一步筛选出17株对生活污水污泥离心后的浓缩污水有较好耐性的高含油微藻，培养3d后，污水中TOC含量显著降低，而微藻的油脂产率高达74．5．77．8ms／l／d／；Wang等(2010)研究了小球藻(Chlorellasp．)在不同的市政生活污水(初级池进水(1存)和出水(2撑)、活性污泥处理后出水(3捍)及污泥离心后产生的浓缩水(4撑))中的生长和营养物去除情况，结果显示，Chlorellasp．在1群、2群、3捍和矿四类污水中均能生长良好，特定生长率分别达到0．412／d、0．429／d、O．343／d、0．948／d，并且1撑、2#、3拌、4撑污水经处理后污水中营养物质和金属离子(ca、Fe、Mn、A1等)含量子均显著降低，其中NI-14+．N的去除率分别为82．4％、74．7％和78．3％，COD去除率分别为50．9％、56．5％和83．O％，TP去除率分别为83．2％、90．6％和85．6％。而在3井污水中氮的主要存在形态主是N03--N，培养结束时N03--N去除率达62．5％，但3撑污水中COD未降反升。(二)养殖废水与城市生活污水相比，养殖废水中N、P含量更高(Wilkie和Mulbry，2002)。尽管污水中N、P含量更高，微藻仍可以在养殖废水中生长，并且有效去除污水中N、P等元素。如葡萄球藻(Botryococcusbraunii)能在N03’盐含量达788mg／1的养猪废水中生长良好，并且能将80％初始N03"盐去除(An等，2003)。但很多类型养殖废水的氮主要以氨氮为主，过高的氨氮浓度会抑制微藻的生长，所以一般会对养殖废水进行适当稀释或脱氨等预处理后再进行微藻净化处理。如Chang等(2006)利用雨生血球藻(Haematococcuspluvialis)净化经过预处理的生活污水和养猪场废水，并考察了所得藻体中虾青素的含量。结果表明，在仅提供二氧化碳混合气体和光照的情况下，Haematococcuspluvialis在4倍稀释后的废水中生长量和在普通培养基中相当，虾青素含量分别达到5．1％和5．9％(占细胞干重)，废水中的氮磷也得到了很好的去除；Gonzalez等(2008)用微藻．菌n浙江大学博士学位论文第1章绪论系统降解养猪废水，结果表明，2倍稀释或不稀释废水会抑制微藻(Chlorellasorokiniana)生长，推测可能是因为高pH和氨氮浓度抑制了微藻的光合氧化过程，而在4倍稀释后和8倍稀释后废水中，微藻生长良好且TOC和NH4+-N被有效去除，其中TOC去除率为86％和75％，NI-I,,+．N浓度分别从373m酊降至46m酊(4倍稀释后污水中)和从186m酣降至70mg／l(8倍稀释后污水中)。调整废水pH至7后，2倍稀释后废水不在抑制微藻生长，培养后废水中可溶性有机碳和NH4+-N含量也大大降低，并指出NH4+-N去除主要是由于微藻的直接吸收利用和硝化反应转变为N02--N；陈春云等(2009)利用小球藻(Chlorellasp．)对工厂化对虾养殖废水中N、P的去除开展了研究。结果表明，小球藻能很好地去除水体中的N、P，培养4d后，．水体中的NH4+-N去除率达到80％以上，P043-．p的去除率达到85％以上；马红芳等(2012)利用栅藻(Scenedesmussp．LXl)处理养鱼废水，培养至稳定期后，栅藻LXl获得藻细胞干重为o．38∥l，藻细胞油脂含量达31．6％，对废水中的NH4+．N、N02’．N、N03--N和P的去除率分别为95．0％、96．3％、85。8％和98．8％；张强等(2011)研究指出小球藻(Chlorellasp．)能够有效地去除模拟养殖废水中的TN、TP，最终去除率可分别达88％和73．2％。并且他还探讨了不同培养条件下小球藻处理废水的能力，结果表明小球藻在光照条件下对TN、TP的去除效果优于黑暗条件下，但对有机污染物的降解能力下降；黑暗条件下，摇床振荡较之静置，更有利于TN、TP去除，但光照条件下的TN、TP去除则以静置优于摇床振荡。并且菌藻协同处理废水可以获得比单纯藻或活性污泥更好的处理效果。此外，很多研究者还就养殖场粪便厌氧消化液作为微藻培养基替代的可行性进行了研究，如Wang等(2010)用不同稀释倍数(10、15、20、25x)的牛粪厌氧消化液培养富油微藻Chlorellasp．，结果表明，培养初始7d内，微藻的生长与培养液的浊度成显著负相关(R2=o．982)，牛粪消化液稀释倍数越小，越不利于小球藻生长。但微藻仍能有效去除消化液内NH4+-N、TN、TP和COD浓度，培养7d后，去除率分别为100％、75．7％．82．5％、62．5％-74．7％和27．4％．38．4％。富油微藻体内油脂含量从9．0％．13．7％，脂肪酸成分分析表明，藻体内脂肪酸含量以C18：2和C16：0为主，适用于微藻生物柴油生产；Park等(2010)借用栅藻(Scenedesmussp．)去除家畜粪尿厌氧消化液，结果显示，Scenedesmussp．对氨氮有一定的耐受能力，但过高浓度(200-500ppm)就会抑制n浙江大学博士学位论文第1章绪论Scenedesmussp．的生长，微藻对氨氮有很好的去除效果，在氨氮浓度为100ppm时，培养后氨氮去除率可达70％。(三)工业废水用微藻处理工业废水算是一种新的尝试，这是因为较之城市生活污水和养殖废水，工业废水中N、P含量相对较低，营养物质含量很不均衡，但有毒有害物质含量却很高，如化肥厂出水中N含量高，但碳含量较低，所以微藻在工业废水中的生长速率受到一定限制，因此，大规模地应用微藻处理工业废水的研究较少，在实验室研究条件下，为满足微藻生长有时需要向废水中外源添加一定量营养物质(de．Bashan和Bashan，2010)，如贾璇等(2010)用异养原核小球藻USTB．01去除化肥厂废水中总氮。结果表明，添加一定量的磷酸盐和葡萄糖分别作为磷和有机碳源，不仅可以明显促进原核小球藻USTB．01的生长，而且可以大幅度提高废水中总氮去除效率，培养4d后，原核小球藻USTB．01的生长提高了7倍，而废水中总氮的浓度也从125m酊下降到10．3mg,a，去除率达到93．1％，处理后的废水可以达标排放；Lim等(2010)利用高效藻类氧化塘处理印染废水，结果显示小球藻(ChlorellavutgamUMACC001)在印染废水内生长良好，生物量从初始的0．17增至2．26mgChla／l，废水中色度、NH4+-N、a04．P、COD的去除率分别为41．8％．50％、44．4％．45．1％、33．1％．33．3％和38．3％．62．3％。而向印染废水中补加Bold基础培养基可显著增加微藻生物量，但并未提高对色度和污染物的去除率；郑子英等(2011)用普通小球藻(Chlorellavutgaris)处理不同浓度的氨厂废水(浓度分别为25％、50％、75％和100％)，结果表明，各浓度污水都会抑制微藻生长，但随污水浓度升高抑制作用强度降低。25％、50％、75％、100％浓度污水对藻细胞光合作用停止时间分幂点分别为144、144、144和72h，光合作用停止后，藻细胞主要通过异养生长降解污染物。培养192h后，25％、50％、75％、100％浓度下COD去除率分别为84％、96．4％、97％和95．6％，NH3．N去除率分别为22．7％、4．9％、10．6％和0％；Su等(2011)在光膜生物反应器内利用栅藻(Scenedesmussp．LXl)处理电镀厂污水处理厂出水，在进水量为60l／ll时，微藻的特定生长率仅为O．02／d，但对正磷酸盐去除率为100％，硝态氮去除率为46％；当提高进水量至1201／h后，废水中重金属对微藻产生毒害效应，藻细胞沉底，N、P去除率显著下降；Chinnasamy等(2010)用从当地分离的微藻n浙江大学博士学位论文第1章绪论(Chlorellasaccharophila，B．braunii和Pleurochrysiscarterae)处理地毯工业废水，结果显示，地毯工业废水中有充足的N、P且有毒物质含量较低，微藻能很好的在地毯废水中生长，培养后9d后，废水中96％的营养物质被去除，微藻的生物产量也达到9．2．17．8t／ha／year，油脂含量达6．82％，并且油脂中63．9％脂肪酸成分可用于制备生物柴油。此外，还有研究者尝试了微藻处理垃圾渗滤液等更高浓度的有机废水，如Lin等(2007)用氨耐受性菌株Chlorellapyrenoidosa和Chlamydomonassnowiae处理垃圾渗滤液，结果表明高浓度垃圾渗滤对菌株产生抑制效应，主要原因是高氨氮含量(>_670m∥1)，培养12d后，低浓度处理组(10％和30％)，微藻显著去除废水中NH4+-N、P04．P和COD，去除率均在75％以上，而高浓度处理组(50％、80％和100％)，污染物去除率均低于40％。随后，小白菜(Brassicachinensis)发芽实验表明，经微藻处理后，垃圾渗滤液毒性也显著降低，小白菜在微藻处理后垃圾渗滤液中发芽率要显著高于在未经微藻处理的渗滤液中。1．4徼藻生物能源1．4．1微藻生产生物能源的原理微藻，尤其是绿色单细胞微藻在很久以前就被认为具有作为可再生能源生产的潜力(Oswald和Golueke，1960)。藻细胞能通过光合作用将太阳能转化为生物能，再通过不同的加工过程可用藻细胞生产各种生物燃料。当然，藻细胞也可作为燃料直接燃烧产生能量，但这种能量获取过程很少被采用(Pittman等，2011)。目前，对藻细胞的不同加工过程主要包括生化转化和热化学转化(Brennan和Owende，2010；Rawat等，2011)，其中生化转化过程包括发酵和厌氧消化等将藻细胞生物能转化成生物乙醇和甲烷，而热化学转化包括气化、热解、水解和液化等把藻细胞生物能变成气体和液体形式的生物燃料(Miao和Wu，2004)。此外，藻细胞还可以通过生物光解过程生成氢气(Melis，2002)；从藻细胞中提取三酰甘油，通过酯交换方式可变成三酰甘油酯(Triacylglycerol，TAG)，即生物柴油(Chisti，2008)，已经成为目前主要研究热点之一。通过微藻获得生物能源的途径如图1．1所示。14n浙江大学博士学位论文第1章绪论光合作用油生物柴油淀粉耋差艺妻H2生物氢气图1-1利用微藻获得生物能源示意图Figurel·1Theschematicillustrationofbiofuelproductionbymicroalgae1．4．2徼藻生产生物能源的优势目前商业化流通的生物能源主要是利用陆生植物作为原料而制取的，如生物甲醇主要来源于甘蔗和玉米淀粉，生物柴油主要来自于油菜籽等油料作物。与化石燃料相比，基于作物生产的生物能源环境友好显著。但许多学者认为基于作物生产生物能源的方式上存在很多弊端，并不能长久进行，一方面陆生作物生长周期长、占地面积大、油脂产量低；另一方面，对农业生产会产生影响，容易形成“粮食危机”(Demirbas，2009)。利用微藻生产生物能源可克服上述缺点，作为目前已知的唯一可能代替化石燃料的原料，通过培养微藻生产生物能源主要具有以下几个方面的优势(胡洪营等，2009)：1．光合效率高。藻细胞的生长速率和油脂产率均远远高于陆生植物，据估计，微藻产油量约为47000．1900001／ha2／a，是农作物产油量的7．30倍；2．微藻生物质燃油热值高。微藻生物质燃油热值平均可达33MJ／kg，是木材或农作物秸秆的1．6倍。表1．2列出了微藻与其他作物生物柴油产率比较；3．藻细胞生长周期短。微藻的生长周期很短(0．10d)，因此收获周期也大大短于传统农作物，可以实现高产量的连续收获，使其产油效率大大增加。同时，微藻的油脂含量更高。据报道，葡萄球藻的油脂含量最高可达80％，单位面积微藻的油脂年产量是传统农作物的15．300倍；4．占地面积少，生产成本低。自然水体(海洋、湖泊等)每年能提供非常丰富的藻类生物量，以太湖为例，每年可从太湖获得约2．6万t藻类生物量。除湖泊外，诸多河湾、水库、池塘等都可提供大量的藻类材料，因而不需占用农业用地。表1．2列出了微藻与其他植物生物柴油产率用地面积比较。藻类细胞易烘干、粉碎，且细胞内含有较高的脂类、蛋白质核可溶性多糖等易热解的化学组分，而n浙江大学博士学位论文第1章绪论作物难粉碎，体内多木质素、纤维素等难热解成分为主，因此藻类所需热解条件相对较低，可降低预处理成本和生产成本。5．环境效益显著。微藻生长过程中需要吸收大量营养物质，可降低水体中富营养化元素含量。据估计，每年从巢湖中提取蓝藻1万t，相当于从湖水中提取860t氮和120t磷，从而极大地减轻湖内的营养负荷。通过光合作用，微藻生产生物能源的同时可固定C02，如利用8．4x103hm2的开放塘系统培养布朗葡萄藻，每年可吸收C021．5x105t。而目前利用烟道气和废水培养微藻，不仅显著降低温室气体CO：向大气中的排放，同时也能有效去除污水中氮磷等营养元素含量(葛亚明，2012)。此外，微藻生物柴油可生物降解、可再生、无毒性，燃烧后没有氮氧化物和硫化物(Peer等，2008)。表1-2不同植物生物柴油产率及用地面积比较(Chisti，2007；胡洪营等，2009)Table1-2Comparisonofbiodieselproducingefficiencyandoccupiedlandareaofdifferentplants注：藻8油脂含量30％(占藻细胞干质量)；藻6油脂含量70％(占藻细胞干质量)。Note：8and5indicated30％and70％oflipidcontentinthemicroalgae(basedondrybiomass)，respectively．1．4．3微藻培养的影响因素微藻生产生物能源的数量和质量取决于微藻生物量和脂肪酸组成及含量，而微藻的生长、油脂含量及组成与培养环境和条件密切相关，所以利用微藻生产油脂前，必须要深入认识培养条件对微藻生长和油脂积累的影响(刘斌等，n浙江大学博士学位论文第1章绪论2008；杨忠华等，2012)，而影响微藻生长和油脂含量及组成的因素主要包括培养的环境条件(光照、温度)，培养液(pH、盐度、c02浓度、培养基营养物含量)及培养时间等。(一)光照藻类的光合自养特性决定了光照是藻类生存的最重要条件之一，其中光照强度和光照时间影响着微藻的代谢率，进而可影响它的生长率和增值率(陈晓峰等，2009)。适宜的光照强度和光照时间利于微藻生物量和油脂的积累，过高或过低均会给微藻生长和油脂含量带来影响。如Suneerat等(2012)研究光照强度和光照时间对葡萄球藻(BotryococcusbrauniiKMITL2)生长和油脂积累的影响时指出，低光照利于葡萄球藻的生长，而高光照抑制其生长，但利于体内油脂的积累，当光照强度为538I-tmolphoton／m2／s时，油脂产量高达0．45g／l；同时还指出光照时间为24h时，葡萄球藻生物量最高(1．91g／1)j是光暗周期12：12时的4倍，但脂质含量和产量却是在光暗周期为16：8时达到最大，分别为33．3％和0．59g／l；Ho等(2012)研究了光照强度对栅藻(Scenedemsusob均UUSCNW-N)生长、C02固定、脂质和碳水化合物积累的影响。结果表明，随光照强度的增加(从180lunolphoton／m2／s增加到420laraolphoton／m2／s)，栅藻CNW-N的生物量产率、C02固定率和碳水化合物产率随之显著增加，当光照强度为420lamolphotol山2／s，生物量产率、C02固定率和碳水化合物产率达到最大，分别为840．6mg／1／d、1435．9mg／1／d、321．5mg／1／d，但继续增加光照强度至540“rnolphoton／m2／s时，上述指标均显著下降，这可能是产生光抑制的原因所致；Lv等(2010)培养小球藻(ChlorellaⅧ细廊)时也发现当光照强度从24岬olphoton／m2／s增加至60lamolphoton／m2／s时，其生物质产量随之从0．37g／1增加至0．75g／1，继续增加光照强度至120I．tmolphoton／m2／s时，其生物质产量反而下降至0．63酊；Yeesang等(2011)研究了光照强度对泰国南部宋卡府、董里府和甲米府的湖泊以及淡水池塘中4种绿藻油脂积累的影响，结果显示：当光照强度从33lamolphoton／m2／s增加到49．5p．molphoton／m2／s时，油脂含量均有所增加，进一步增加光照强度至82．5llE／m2／s后，油脂含量反而降低。因此，Xue等(2011)研究指出依据光照对微藻影响的阶段不同，可将光照强度对微藻生长的影响分为光限制、光饱和和光抑制三种情形，每株微藻对光照的需求都有一个n浙江大学博士学位论文第l章绪论饱和强度，低于或高于这个强度都会对其生长产生影响。Kitaya等(2005)证明Euglenagracilis的光照饱和强度为100lxmolphoton／m2／s；欧阳峥嵘等(2010)研究指出小球藻(Chlorellasp．XQ．200419)的适宜光照强度范围为100．1600tamolphoton／m2／s，饱和强度在500I-tmolphoton／m2／s附近，而海洋小球藻(ChlorellamarinaNJ．016)的适宜光照强度范围为400．1600lxmolphoton／m2／s，光饱和强度在1400／amolphoton／m2／s附近。光照强度不仅仅影响微藻生长和油脂积累，还影响其对一些营养物质的吸收，如方涛等(2012)研究指出，微藻对磷酸盐和硝酸盐的吸收效果在6000lux光照强度下要显著优于在3000lux光照强度下，在6000lux光照度下，在12、24、36、48和60h研究范围内，微藻对磷酸盐和硝酸盐的去除率分别为3000lux光照度下的3．53、3．03、1．2l、1．23、1．13倍和5．83、4．44、3．13、6．11、2．83倍，而无光照下磷酸盐呈释放状态，硝酸盐吸收不明显，且叶绿素a质量浓度呈下降趋势。(二)温度在微藻培养过程中，温度会通过影响代谢酶活性而影响微藻生长和油脂的积累。有研究表明大多数微藻的最适生长温度范围为16．27℃，当温度低于160C时，微藻生长缓慢；而高于35"C时可能会对某些微藻产生致死效应(杨忠华等，2012oConverti等(2009)研究了温度对微绿球藻(Nannochloropsisoculata)和小球藻(Chlorellavutgaris)生长和油脂积累的影响，通过对15、20和25*(2时微绿球藻的生长和油脂积累分析发现，在15"C时，微藻球藻的比生长速率最小但油脂含量最高，为14．9％；在20。C时，达到最大的比生长速率，但油脂含量却最低，仅有7．9％；25。C时油脂含量达到13．9％。而对小球藻的研究则表明，在30℃以下时，小球藻有较高的比生长速率和油脂含量，而高于35℃时，生长缓慢甚至出现死亡。欧阳峥嵘等(2010)指出小球藻(Chlorellasp．XQ．200419)的适宜温度范围为25．42．5"C，最适温度为37．5"C；海洋小球藻(ChlorellamarinaNJ．016)的适宜温度范围为25．42．50C，最适温度为37．50C；Nakazawa等(2012)研究指出Autrantiochytriumsp．18W．13a的生物量和二十二碳六烯的产率在25"C时达到最大；张桂艳等(2011)研究了温度对小球藻(Chlorellasp．XQ．200419)的生长速率、生物量、油脂含量和油脂产量的影响，结果表明，温度会显著影响小球藻的生长速率、生物量、油脂含量和油脂产量，在15．40"C范围内，随着n浙江大学博士学位论文第1章绪论培养温度的升高，上述指标值都经历了一个先升后降的过程，适合小球藻生长、油脂积累的温度范围是20．35"C，30．35℃时油脂产量最高，40。C时生物量、油脂含量和产量都最低。(三)C02浓度微藻的光合作用除需要光照外还要有碳源等营养物质。微藻生长所必需的碳源有两类，即无机碳源和有机碳源，其中无机碳源主要有C02和HC03"；有机碳源有葡萄糖、果糖、乳酸等简单有机物。c02分子因呈线性对称结构，非极性，且分子较小，能够被细胞以被动运输的形式自由扩散至细胞内部，因此，C02是自然界植物和绿藻进行光合作用的主要碳源(葛亚明，2011)。一般而言，大气中C02浓度(大约在O．04％)不能满足微藻光合作用碳源所需(Chiu等，2008)，向培养体系中补充一定浓度的c02已成为目前研究者提高微藻产量及降低温室效应研究的常用方法。张丽莉等(2008)向Conwey培养液内补充1000山，LC02后，显著促进了小球藻(Chlorellavulgam)的生长，并且补充C02后延长了小球藻指数生长期，显著提高了指数生长期的最大光合速率、光合作用效率和光合作用饱和光照度。但需要指出微藻的生长和油脂积累与C02浓度密切相关，对供应的c02浓度有阈值要求，过高c02浓度反而会不利于其生长和油脂积累，如Bhola等(2011)研究了C02浓度对小球藻(ChlorellaⅧ细胁)生长的影响，结果显示：当供应C02浓度在O．5％．4％范围内时，小球藻生物量随C02浓度的增加而增加，4％时达到最大生物量(1222mg／1)，是直接供应空气时的5倍(226mg／1)，但"-3C02浓度增大至15％时，其生物量显著下降，只达到4％C02浓度时的1／3；Lv等(2010)研究也指出小球藻(Chlorellavulgaris)在被供应1％浓度C02时，其生物产量和Chla含量达到最大，油脂含量也达到最大(20％)，是供应12％浓度C02时(14．2％)的1．5倍。此外，有研究指出低浓度C02抑制脂肪酸合成，高浓度C02利于脂肪酸的合成但会抑制碳链的去饱和与延长(Costa等，2011；Ge等，2011)，如Tang等(2011)研究了斜生栅藻(Scenedesmusob均UUSSJTU．3)和蛋白核绿藻(ChlorellapyrenoidosaSJTU．2)在不同浓度的C02下生长状态和油脂的积累情况。结果表明：这2种藻在10％C02浓度下生长最快，而高C02浓度(30％．50％)利于总脂和多不饱和脂肪酸的积累。n浙江大学博士学位论文第1章绪论(四)培养液pH培养液pH也是影响微藻生长和油脂积累的重要因素之一，通过影响藻细胞内代谢酶的活性和藻细胞对离子的吸收利用，进而影响微藻的生理代谢。欧阳峥嵘等(2010)研究指出小球藻(Chlorellasp．XQ-200419)的适宜pH值范围为6．5．9．0，最适pH值为7．O；而海洋小球藻(ChlorellamarinaNJ一016)的适宜pH范围为5．0．9．0，最适pH值为8．O；王翠等(2010)研究指出pH为6．5和7．0偏酸环境有利于小球藻(Chlorellavutgaris)生长，而pH在7．0．8．5偏碱性条件下有利于小球藻油脂的积累，因此综合小球藻生长和油脂积累2个因素，得到最适合小球藻生长和油脂积累的pH为7．0，并且在培养过程中，保持培养液pH恒为7．0时，所获小球藻的油脂含量要显著高于只调节初始pH为7．0时，培养后沼液中氮磷的去除率分别达到95％和97％。(五)N、P及其他营养物质微藻在自养培养条件下，培养基中营养物质特别是一些必需元素如N、P、Mg、Fe等对微藻生长和油脂的含量也有较大影响，因此通过添加或限制这些营养物质会对微藻生长或油脂含量的提高有很大帮助(杨忠华等，2012)。1．N源N源微藻生长的必需营养元素，培养基中不含氮时，微藻细胞几乎不生长，它也是影响微藻脂肪酸代谢最主要的因素。微藻可利用的氮源主要包括无机氮(N03‘、N02‘、NI-14+)和有机氮(溶解态)。Bhola等(2011)研究了KN03浓度对小球藻(Chlorellavulgaris)生长的影响，结果表明：随着KN03浓度从0酊增加至5酊，小球藻生物量也随之增加，5鲋时生物量达到最大(460mga)，是不添加KN03时的1．2倍(370m朗)；张桂艳等(2011)指出N03‘浓度对小球藻(Chlorellasp．XQ．200419)的生长和油脂产量均有显著影响，在KN03浓度0．05．0．3酊范围内，小球藻生长速率随KN03浓度的增加而提高，积累了更多的生物量，而油脂含量却随之递减。有研究表明氮素限制能显著抑制蛋白质合成，但是能显著增加脂质含量(Converti等，2009)，有时也增加碳水化合物的积累(Hu，2007)，而且从正常培养到N源限制培养，油脂组成也会由富含游离脂肪酸变为富含甘油三酯(Ho等，2010；Scott等，2010)。Mandal等(2009)研究指出，氮限制培养能将Scendesmusobliquus体内油脂含量从12．7％提高到n浙江大学博士学位论文第1章绪论43％。随后，再将Scendesmusobliquus预培养在含1．5％葡萄糖的N11培养基内，之后再转入含0．04酊硝酸盐、0．03酊磷酸盐和1g／l硫代硫酸盐的N11培养基内培养，Scendesmusob均UUS体内油脂产量暴增至2．16I鲋，是对照培养时的40倍。2．P源P与微藻细胞生长和代谢密切相关，是构成DNA、RNA、ATP和细胞膜的必需元素(Wang等，2008)。Suneerat等(2012)研究了P源浓度对葡萄球藻(BotryococcusbrauniiKMITL2)生长的影响，结果表明：随着培养基内磷酸盐浓度的增大(从22mg／1到444mg／1)，葡萄球藻的生物产量也随之增加，当P源浓度为444mg／1时，最大生物产量为1．9l酊，是磷浓度为22mg／1时的7．3倍。但同时指出，葡萄球藻(BotryococcusbrauniiKMITL2)体内最大油脂含量和油脂产量是当P源浓度为222mg／1时，分别为54．7％和0．479／1。Bhola等(2011)指出在磷酸盐浓度范围0-0．04酊内，小球藻(Chlorellavulgaris)生物产量随磷酸盐浓度增加也随之增加，培养1ld就进入稳定期，0．04酊磷酸盐浓度时最大生物产量为1．219／1，是未添加磷酸盐的1．3倍。但也有研究指出，微藻生长受磷酸盐浓度变化影响较小，如张桂艳等(2011)指出小球藻(Chlorellasp．XQ．200419)对P源浓度变化的适应范围很大，K2HP04浓度在10-160mg／1范围内变化对小球藻的生长和油脂产量都不会产生显著影响。此外，Mandal等(2009)通过磷素限制但补充硫代硫酸盐形式培养斜生栅藻，能显著提高藻细胞体内油脂含量，达到总生物量的30％左右；Li等(2010)也发现，在N源和P源(分别为2．5m酊和O．1m鲋)受限制的条件下，栅藻(Scenedesmussp．LXl)体内油脂积累分别为30％和53％。3．其他营养物质一些微量营养元素，如Mg、Fe和Mn元素的添加也可在一定程度上促进微藻的生长和油脂积累。re3+作为酶和氧化还原蛋白的辅助因子，在一些生化过程中起着重要的催化作用，Behrenfeld等(2006)研究指出Fe3+在调控微藻产量方面具有显著作用，尤其在微藻培养后期，只要向微藻培养基内补充一定量的Fe”，就利于藻细胞体内脂质的积累(Liu等，2008)，但Fe3+过多会对微藻产生氧化胁迫而改变生理结构，对生长产生负面影响(Yeesang和Cheirsilp，n浙江大学博士学位论文第1章绪论2011)。夏金兰等(2010)研究表明，在培养基内Fe3+浓度为lxlO。4mol／1时，三角褐藻(Phaeodactylumtricornutum)的生长速度最快且脂质含量最高，达到47．3％，是对照的4．2倍；当培养基内Fe3+浓度为lxlO‘5mol／1时，球等鞭藻(1socrydidgalbana)具有最大生长速率，脂质含量为41．9％，是对照的2．8倍；Liu等(2008)研究指出直接向培养基内补充FeCl3能增加小球藻(Chlorella础玛2廊)藻细胞密度，但不能增加藻体内油脂积累，而当向生长后期的藻培养液中添加1．2x10～moldFeCl3时，藻细胞体内脂质含量可增至56．6％，是不添加或添加低浓度Fe3+的3．7倍；张桂艳等(2011)研究指出在培养后期补加不同浓度Fe3+对小球藻(Chlorellasp．XQ．200419)生长速率没产生显著影响，但．fi心川目v,含量随着Fe3+浓度增加呈现上升的趋势，均比对照有极显著提高，Fe3+浓度为0．75mmol／1时油脂产量最高。此外，杨凯(2009)指出，M孑+是微藻增殖和脂肪酸合成必不可少的金属元素，它通过对脂肪酸合成关键酶(乙酰辅酶A羧化酶)活性的影响，从而促进脂肪酸的合成。进一步实验证明绿藻门的克里藻、枝鞘藻以及蓝藻门的真枝藻在分别添加不同浓度(分别为0．6、0．9、1．2、1．5和1．8mmol／1)的Mg+后，微藻体内的总脂含量均有不同程度的增加。与对照相比，克里藻在Mg+浓度为1．8mmol／1时生长最佳，总脂含量达到27．4％；枝鞘藻在M矿+浓度为1．5mmol／1时生长最佳，总脂含量达到22．1％；真枝藻在M矿+浓度为1．2mmol／1时生长最佳，总脂含量达到20．1％；袁程等(2012)研究了培养液中不同初始Mn2+浓度对斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)DHD．3的生长、油脂积累以及脂肪酸组成的影响。结果表明，培养液中不同初始浓度的Mn2+对Scenedesmusob砌UUSDHD．3早期叶绿素积累和生长会产生一定的调节作用，过高或过低的Mn2+都不利于Scenedesmusob砌UUSDHD．3细胞内叶绿素的积累、微藻的生长和油脂积累，但改变Mn2+的初始浓度并不对斜生栅藻脂肪酸组成产生明显影响，培养14d后，当初始Mn2+浓度为2．72mg／l时，斜生栅藻的生物量和细胞内油脂含量分别达到2．9e,／1和细胞干重的55．1％，细胞内油脂含量比对照组提高了11％。(六)培养时间藻类脂质含量和脂肪酸组成随培养时间(生长周期)的不同也会发生变化，掌握合适的培养时间，不仅利于微藻目标物的产生，也能节约成本，如n浙江大学博士学位论文第1章绪论Suneerat等(2012)在培养B．brauniiKTMITL2时发现，B．brauniiKTMITL2在培养20．40d时的生物量(1．34．1．42g／1)要显著高于10d时，但20d、30d、40d时之间并无显著差异；而最高油脂含量和油脂产量均出现在培养20d时，分别为43％和o．589／1；Zhila等(2011)指出，相较于培养3d时间，培养13d时RbraunffIPPASh．252的脂质含量更低。但也有研究者指出，培养时间越长越利于油脂积累，如Singh等(2007)研究指出，随着培养时间的延长，B．braunii和B．protuberans体内总脂含量也逐渐增加。此外，还有研究者用藻类的不同生长阶段来表征培养时间，藻类一般经历适应期、指数期、稳定期和衰退期四个生长阶段。一般而言，在稳定期，微藻的总脂含量最高，中性脂(主要是甘油三酯)的积累也会高于其他生长阶段，如Chiu等(2009)对微绿球藻(N．oculataNCTU．3)的研究发现，培养至指数期的微藻油脂含量为30．8％，而稳定期的油脂含量高达50．4％。1．5基于徼藻培养的养猪废水处理技术及存在的问题目前，微藻制备生物柴油的技术上是可行的，但高生产成本是制约该技术发展的主要限制因素(Benzadi等，2007)，如何降低微藻生物柴油的生产成本仍是今后科研攻关的重点(Wijffels和Barbosa，2010)。微藻生物柴油生产成本的构成主要包括藻种筛选、培养、采收、脱水及油质提取等五方面，其中微藻培养成本占到生物柴油生产总成本的70％以上(Chisti，2007)，主要表现在：(1)培养微藻(淡水藻种)需消耗大量淡水资源，不但成本高，而且与当前水资源短缺的大背景形成了鲜明矛盾；(2)为了获得较高的藻细胞生物量，微藻培养过程中需投加氮磷等大量无机营养盐，无机营养盐大量消耗而导致的高培养成本是目前微藻培养领域的世界性难题(胡洪营等，2010)。因此，降低培养成本是最终实现微藻生物柴油的商业化开发的关键措施之一(Wijffels和Barbosa，2010)。如前所述，微藻可在多种废水中生长良好，优于普通培养基条件下。换句话说，废水可以被当作培养基而用于微藻培养，废水中丰富的营养元素含量可满足微藻生长，无需外加无机营养盐，可显著降低微藻培养成本；同时微藻对废水中N、P等营养元素的高吸收利用率，可显著降低其在废水中含量，解决困扰目前污水处理系统N、P处理不彻底的顽疾，达到净化污水的目的，同时实现污水处理的无害化、资源化。基于上述情况，胡洪营等(2009)提出了基于微藻细胞培n浙江大学博士学位论文第1章绪论养的水质深度净化与高价值生物质生产相耦合的技术，微藻净化废水的同时获得的高价值藻细胞生物质可作为原料生产生物能源，克服了单一培养系统或污水处理系统的局限，实现污水处理从处理工艺向生产工艺的转化。而欲实现污水处理系统从处理工艺向生产工艺的转化，藻种的筛选与驯化是研究工作的前提和重点。针对水质净化与高价值生物质生产相耦合的目的，胡洪营等(2009)给出了藻种筛选的依据：在所要研究的废水中或废水处理池出水条件下生长速率快、氮磷去除效率高、生物质产量高以及单位微藻生物量的油脂产量高等。基于上述原则，Li等(2010)从城市生活污水处理厂二级出水池中分离、筛选得到了若干株藻种，这些藻株对生活污水二级处理出水中的氮磷去除效率均在90％1)J．上，单位藻细胞的油脂含量在33％．42％之间；Zhou等(2011)从明尼苏达州四种水体中筛选出17株在污泥离心后浓缩水中表现出生长速度快、油脂含量高的微藻。在藻种筛选的基础上，优化微藻的培养条件，构建培养系统是将实验室研究成果转化为实际工程应用的关键环节。本文主要以养猪废水为对象，在以本地适应性藻种筛选的基础上，优化微藻的培养条件，构建基于微藻培养的养猪废水处理系统。1．6论文构思(一)研究内容基于养猪废水处理与微藻生产油脂相耦合的目的，本文首先从杭州某养猪场污水处理池内分离纯化得到一株对养猪废水具有良好适应性和净化能力的优势微藻，以此为基础，主要研究内容包括：(1)微藻的分离、纯化及其鉴定；(2)微藻基本理化性质测定；(3)微藻培养条件优化研究；(4)微藻净化养猪废水可行性研究；(5)强化微藻生长及净化养猪废水条件的研究。(二)技术路线本文研究的技术路线如下。24n浙江大学博士学位论文第1章绪论混养培养强化净化养猪废水及分离藻生长藻体理化性质CNP含量脂类含量粗蛋白含量氨基酸含量元素流分析废水理化性质TP去除塞TN去除塞氨氮去除塞COD去除n浙江大学博士学位论文第l章绪论n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定2．1引言萧山是杭州市经济实力强、发展速度快的一个市属区，全区总面积1420平方千里，人口120万。自2001年我国实行“菜篮子”工程以来，萧山区养猪业发展迅速，截止至2011年底，全区生猪年饲养量为243．65万头，养猪场规模化程度较高，养殖区域多处在城乡结合部或乡下地区(杭州市统计年鉴，2011)。养猪业发展在满足城乡肉类供应的同时也给当地的生态环境带来了严重影响，尤其是养猪废水的任意排放。传统的污水处理设施基建投资和运行成本均较高且氮磷去除率低，给微利行业的养猪业带来了很大的成本压力，并且传统的污水处理工艺仅仅从处理过程考虑，做到了无害化目的，但并未做到把养猪废水资源化利用的目的，造成N、P等资源浪费，因此，寻找一种体系简单、成本低且能同时实现养猪废水无害化、资源化利用目的的污水处理工艺，给养猪场创造经济效益，是保障养猪场可持续发展的重要保证。基于微藻的污水处理技术或许是一种不错的选择(Rawat等，2011)。微藻能吸收利用废水中营养物质而净化废水，同时培养获得的微藻细胞富含蛋白质、油脂等成分，可用作蛋白质饲料或生产生物柴油(Pittman等，2011)。很多学者也成功地将这一技术应用于一些废水处理中，如城市生活污水(Li等，2011；Cho等，2011；李超等，2012)、养殖废水(Park等，2010；张强等，2011；马红芳等，2012)和工业废水(Lira等，2010；Chinnasamy等，2010；Su等，2011；郑子英等，2011)等，并且报道了很多适合此技术的藻种，如小球藻(Chlorella)(“等，2011；Cho等，2011；张强等，2011；李超等，2012；)、栅藻(Scenedesmus)(Park等，2010；Su等，2011；马红芳等，2012)、葡萄藻(Botryococcus)(Chinnasamy等，2010)。但随水质类型的不同，藻的活性会发生很大变化(Zhou等，2011)，因此，找到适合的藻种去处理既定类型水质是基于微藻培养的污水处理技术成功与否的关键。筛选合适的藻种可以从现有藻种资源入手，如贾越研等(2010)从蛋白核小球藻、斜生栅藻、月牙藻和螺旋鱼腥藻中筛选适合净化水产养殖废水的藻种。但大多研究者认为从当地水环境或污水环境内筛选藻种更为有效可靠(胡洪营等，n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定2009)，如Zhou等(2011)从当地水环境中筛选出17株净化浓缩污水废水的藻种；Li等(2010)从城市污水处理厂二级出水池内筛选出一株适合深度净化城市生活污水的栅藻(Scenedesmususp．LXl)。依据实验目的，本课题组在萧山区某养猪场废水处理池内观察到一株生长优势非常明显的绿藻，初步功能测试表明其对废水中氮磷有较好的去除效果。在验证此微藻净化养猪废水的可行性之前，需对此微藻进行分离纯化以得到纯种并对其进行种类鉴定，才便于进行基础理论研究。此外，为更深入了解此微藻性能，对其理化性质(如最佳光密度值、无机元素含量、油脂含量等)进行测定，为后续试验表征微藻生长、成分分析及微藻资源化利用提供基础，是保证基础理论研究顺利进行的关键。因此，本章主要围绕微藻的分离、纯化和鉴定及其理化性质的测定开展了研究。2．2材料与方法2．2．1徼藻的分离、纯化及扩繁(一)废水收集及微藻浓缩含藻样废水于2011年10月份采自浙江省杭州市萧山区某养殖场污水处理池内。沿污水处理池不同方位采集水样，充分混合水样后，储存于已灭菌的透明塑料瓶内，4"C下冷藏保存并立即送往实验室。在实验室内，先将采回的水样经筛绢过滤除去大型浮游生物和悬浮物，再将过滤水样经离心机(天美CTl4RD，中国)离心浓缩(10000rpm，4"C)，用无菌水悬浮浓缩样后，经真空抽滤机(KNFN86KT．18，Gemany)进行真空抽滤，滤膜孔径为0．45rtm；再次用无菌水多次冲洗停留在滤膜上的样品，随后将滤膜上的样品转移至250ml培养瓶中，瓶内含有150ml已灭菌BG．11培养液(Chinnasamy等，2010)，然后将培养瓶置于光照培养箱内(海曙PGX．350C，中国)，培养数天(27"C，全天光照，光照强度401xmolphoton／m2／s)，每日摇动两次，并仔细观察瓶内培养液中生物的生长变化情况。BG．11培养液具体成分见表2．1。n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定A5溶液组成：H38032．869，MnCl2·4H201．819，ZnS04‘7H200．229，CuS04。5H200．0799，(NI-14)6M07024。4H200．399，Co(N03)2‘6H200．0499，加水至1000ml。下文中所用的BG．11固体培养基是在上述BG．11液体培养基中加入1．5％琼脂粉而制的。(二)微藻分离、纯化目前报道的藻体分离纯化方法主要有三种：1)稀释分离法：取少量目标水样，用培养液稀释，直至稀释到单个生物体分离出来培养；2)水滴分离法：用微细管吸取稀释适度的目标水样，小滴滴到灭过菌的载玻片上，低倍镜视野下观察，如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取这滴水冲入含有培养液的灭菌试管或小三角瓶中，如未成功，需反复重做；3)微吸管分离：将直径较细的玻管在火焰上加热后快速拉成121径极细的微细管，将稀释适度的目标水样置于浅凹载玻片上，镜检。用微细管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹玻片上，镜检这一滴水是否达到纯分离的目的，如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。由于稀释分离法较简单易行，本实验采用此法分离纯化微藻，后将纯化出的藻进行逐级放大培养。具体过程简述如下：待上述置于光照培养箱内的培养瓶中长出明显藻体，将培养液摇匀，按四个浓度梯度将培养液稀释10到1000倍，取稀释后的样品1001．d均匀涂布在BG．11固体培养基上。涂布好的固体培养基放置于恒温光照培养箱中培养一段时间(温度27。C，全天光照，光照强度40pmolphoton／m2／s)，培养过程中仔细观察单菌落点的生长情况。挑选固体培养基上单一菌落装入含有5mlBG．11液体培养基的试管中，将这些试管放入上述恒温光照培养箱中相同条件下继续培养，每天摇动两次，观察其生长情况，主要包括培养液颜色变化、藻的聚集形态、是否含有可n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定见杂菌等。待试管中的单一藻体生长繁殖到一定浓度，取出lml培养液，离心浓缩(10000rpm，4。C)后再用无菌水稀释，吸取一定量稀释液在显微镜下观察藻细胞形态、大小、游动方式、是否含有可见杂菌和其他生物体。若含有其他可见菌则该管弃之；若无，该藻种仍要继续在LB培养液中摇床生长24小时检测是否含有看不见的杂菌，若通过检测确定该藻种为纯种，则将该藻种扩繁培养；若有别的藻种或杂菌混杂，则将该试管中的藻液按上述步骤重新于固体培养基中分离，重复上述操作，直至分离出纯的无杂菌的藻种为止。以上步骤中的稀释、涂布、接种等过程均在无菌操作台完成。LB培养液成分为1％蛋白胨、O．5％酵母粉、1％NaCl(pH7．0)。(三)藻种扩繁无菌条件下，将试管中的纯藻种接种于50ml培养瓶内，内含25ml已灭菌的BG．11培养液，置于光照培养箱内(温度27。C，全天光照，光照强度409molphoton／m2／s)培养20天，然后从上述培养瓶中再吸取20m1培养液接种于含100ml已灭菌的BG．11培养液的培养瓶中，其余操作同上，如此逐级扩繁放大培养，获得更多所需藻体供试验分析用。扩繁过程均为无菌操作，以避免污染纯化的藻种。同时，培养过程中定期摇动培养瓶，以使培养液中藻体混合均匀，防止沉淀，每日仔细观察藻的生长情况，确定其处于正常生长状态。2．2．2微藻种类鉴定对分离纯化后获得纯藻种进行种类鉴定，主要借助于形态观察和分子生物学技术手段。(一)形态观察借助光学显微镜(LAIKEDFC300FX，Germany)和透射电子显微镜(JEOLJEM．1230，Japan)对藻体形态进行观察，主要观察藻细胞大小和形状、叶绿体位置及形状、蛋白核、淀粉粒、鞭毛等。观察用藻细胞取自扩繁4周后的培养液。将上述培养液稀释10倍，吸取10pl稀释液置于载玻片上，盖上盖玻片后，置于光学显微镜下进行观察；在电子显微镜观察前需制作藻体的电镜切片，主要包括固定、脱水、包埋、染色和切片五个程序，具体制作过程描述如下：将上述培养液离心浓缩(3500rpm，15min)，200C下，用3％戊二醛溶液固定藻细胞2h，4。Cn浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定下，再用8％锇酸固定2h；随后，室温下用不同浓度的乙醇(50％、70％、80％、90％和100％)对上述固定的藻细胞进行脱水处理，每个浓度脱水处理15min；将脱水处理后细胞在环氧丙烷中浸透20min，然后将浸透的细胞分别在1：2环氧树脂+环氧丙烷混合液体、1：1环氧树脂+环氧丙烷混合液体和2：1环氧树脂+环氧丙烷混合液体中包埋lh；再将包埋好的藻细胞放在环氧树脂液体中过夜处理；最后，将上述包埋好的藻细胞在室温下用乙酸铀酰染色2h，然后用蒸馏水冲洗5min。用超薄切片机将上述包埋藻细胞制成60．80nm超薄切片，并将切片置于电镜载网上，用于电镜观察。(二)分子生物学鉴定1．基因组DNA提取基因组DNA提取采用Gem．CTAB法(Rouhibakhsh等，2008)。取2ml上述培养液，4。C下离心(12000rpm，5min)，然后用750kdTE缓冲液(10mMTris—HCl，lmMEDTA，pH8．0)稀释浓缩藻细胞，再次离心浓缩。称量O．2g浓缩鲜藻样，液氮速冻后研磨成粉。将藻粉转移到1．5mleppendorf管中，加入600I-tl提取缓冲液，充分混匀后65。C下水浴lh。DNA提取缓冲液主要由如下成分组成：100mMTris．HClpH8．0，10mMEDTA，1．4MNaCl，2％CTABand2％B．巯基乙醇。然后用氯仿．异戊醇(24：1)溶液使核蛋白变性沉淀，将核酸物质萃取出来，再向萃取液中加入适量乙醇，使DNA析出。首先向上述提取液体系加入O．8倍体积的苯酚．氯仿．异戊醇(25：24：1)溶液，充分混合10min后形成乳状液，4。C下离心(12500rpm，10min)，将上清液转移至一个新的eppendorf管中，再加入0．8倍体积已预冷的异戊醇，充分混合后室温下反应10min，离心(12500rpm，10min)，收集沉淀物，然后用70％乙醇洗提沉淀物两次，待乙醇挥发完全，将沉淀物溶解于20ftlTE缓冲液中，．20。C下保藏备用。DNA用于PCR扩增反应前将DNA提取液稀释5倍。2．18SrDNA扩增将上述稀释的DNA提取液作为模板扩增18SrDNA基因片段。PCR扩增体系为20rtl，其中含有lrtl50ng模板DNA，0．2rd1．6单位Taq．酶(TaKaRa．Otsu，日本)，21xl10xPCR缓冲液(TaKaRa．Otsu，Janpan)，2山2．5mMdNTP，0．2}tM的n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、签定及其理化性质测定正、反向引物各O．5山，双蒸灭菌水13．8山。扩增程序为：94。C预变性5min，94"C变性40s，58"C复性35s，72。C延伸35s(共36个循环)；最后再72"C延伸lOmin。用于扩增18SrDNA的引物为真核生物通用引物(Diez等，2001)，序列如下：正向引物(18SF)：5'-CAGGTCTGTGATGCCC．3’；反向引物(18SR)：5’一ACGGGCGGTGTG’rAC．3’。扩增产物经l％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(OMEGA，D2500．01)回收。3．测序及系统发育分析回收得到的PCR扩增产物交由上海华大基因测序。测序结果已提交至GeneBank，登录号为JX255841。将分离微藻的18SrDNA序列与GeneBank中近缘藻的序列一起用MEGA4．0软件进行多序列比对分析，并以邻接法(Neighbor-Joinfingmethod，NJ)构建系统发育树，重复100次计算Bootstrap值。2．2．3徼藻理化性质测定(一)藻体密度表征1．浊度法浊度法是较常用的藻体密度表征方法之一，原理是当藻体细胞处于稳定生长状况时，其体内的色素体种类和数量及其它影响藻体吸光值的因素就会相对稳定，藻体细胞的最大吸收波长也就相对较为稳定，培养液中的藻体细胞数与藻液的吸光值就会成线性相关，常以测定最佳光密度值(OD)来定性表征。本实验中，最佳光密度值是藻体在可见光区(600．700nm)的特征吸收峰，其测定步骤为：量取一定量生长稳定的藻细胞培养液，在600．700nm波段区，以10rim为间隔波段在可见紫外分光光度计(ThermoEvolution220，USA)上进行全波段扫描，记录藻液的吸收峰所对应的峰值及波长，即为该藻液的最佳光密度值。2．干重法干重法的原理较为简单，即量取已知体积的藻液，经过过滤或者离心将藻液中除藻体细胞外的培养液、杂质等去除，然后将藻体细胞在恒温下烘干或者通过冷冻干燥法获得干藻体，将干藻体称重后除以其所对应的藻液体积换算成单位体积藻液中的藻体干重，用于定量表征藻体密度。需要注意的是量取藻液的体积不n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定宜过小，否则会造成较大的试验误差，因此，干重法适于在藻种大量培养实验中使用(如在1l光生物反应器中的培养试验)，而不宜在藻种的小规模培养试验中使用(如在50．500ml的培养瓶中培养试验)；此外当培养基中存在易与藻体形成聚合物的杂质且不易去除时不宜采用称重法。为了反应小规模培养试验中培养液中藻体干重，通过最佳光密度值与藻细胞干重的回归方程，可借助藻液最佳光密度值来计算干重。干重法一般测定步骤为：量取一定体积的藻液，将藻液经洁净恒重的微孔滤膜抽滤，将滤膜置于电热鼓风干燥箱内，75"C下烘干至恒重，记录干重值。3．藻体C、N、H、P含量测定藻体C、N、H含量测定采用元素分析仪(TherrnoFinniganFlashEAlll2，USA)测定。量取一定体积的藻液，离心浓缩(10000rpm，15rain)后，用无菌水再悬浮浓缩藻细胞，再次离心浓缩，如此重复3次。随后，将浓缩藻体置于．20。C冰箱内速冻，速冻好的藻体放入真空冷冻干燥仪(博医FD．1．50，中国)内，冷冻干燥。称取一定量的冷冻干燥样品，直接利用元素分析仪测定。藻体P含量测定参照文献(姜宏波等，2009)。将上述冷冻干燥藻体研磨成粉，称量0．29干燥藻粉，加入5ml浓硫酸，超声水浴3min，盖上短颈漏斗，置于电热板上加热消煮约5min(注意控制电热板温度使瓶内发出的烟不外溢)，取下瓶子，冷却数分钟，慢慢沿瓶壁逐滴加入lml30％H202，再置于电热板上加热2min；若瓶内藻体为黑色，再加入数滴双氧水，直至溶液变为透明为止，然后移去漏斗，慢慢加热5min，以除去多余H202，冷却，定容。吸取一定量的消化液用钼锑抗比色法测定消化液中磷的含量(鲍士旦，2005)。4．藻体粗蛋白质和氨基酸含量测定藻体蛋白质含量参照文献(Ho等，2012)，粗蛋白含量=藻体N含量×6．25。准确称取冷冻干燥藻粉0．29，放入水解管中，加入10ml6mol／1盐酸，抽真空充入氮气封管。在110℃条件下水解20．24h，冷却后将水解液定量转移至50ml容量瓶中。吸取滤液lml，真空干燥后用1-2ml去离子水洗涤，蒸干后加入O．02moldHCllml溶解。所得溶解液在全自动氨基酸分析仪(HitachiL．8900，Japan)上分析测定(刘永红等，2008)。5．总脂含量和脂肪酸成分测定n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定总脂含量测定参照文献(Zhou等，2011)。称取O．19左右冷冻干燥藻粉，质量记为Ml，加入10ml2：1氯仿．甲醇混合液，30℃水浴超声30rain后，过滤至另一个带刻度的玻璃离心管中，管内含2mlo．9％NaCl溶液，4。C下离心(1000rpm，10raino待离心管内液体上下明确分层后，记录下层液体体积，记为V；吸取3ml下层液体，注入已称重的5ml玻璃管内，玻璃管质量记为Mo，氮吹发仪(奥特赛恩斯MIN-2800W，中国)上吹发至有机溶剂完全挥发，再放入干燥箱内，60。C烘干至恒重，冷却至室温后称重，记为M2。根据下列公式计算藻细胞总脂含量(LW)：LW(g／g)=(M2一Mo)xV／(3xMl)。脂肪酸成分测定是根据Lepage和Roy提出的脂肪酸直接甲酯化法(su等，2007)。称量0．19左右冷冻干燥藻粉，加入8ml0．5MKOH甲醇溶液，水浴超声3min后，1004C下加热15min，冷却至室温，用0．7MHCl甲醇溶液调整混合液pH至pH<2，再100。C下加热15min。冷却至室温后，加入2ml饱和NaCl溶液，再加入2ml正己烷，漩涡振荡1min。待液体分层后，吸取上层液体，GC．MS仪(AgilentGC6890N．HPl200，USA)测定。采用GC6890N．HPl200气质联用仪，氢火焰离子化检测器，色谱柱为DB．5．MS毛细管柱。升温程序：80。C保持5min以4*C／rain升至290℃，保持5min。进样口、检测器的温度分别为250℃和230。C。载气为氦气。流速为lml／min，进样量为1pl。面积归一化法计算脂肪酸各成分的相对含量。6．色素含量测定方法(殷国梁，2007)量取培养藻液10ml，过0．459m纤维滤膜真空抽滤，将滤膜放入25ml离心管内，加入10ml无水乙醇，聚四氟膜封口后，静置于4。C冰箱内浸泡过夜，24h后取出离心管，12000rpm下离心5rain，移出上清液至新的离心管内，在波长645nm、663nrn、470nm处测定上清液的吸光值，分别记作A663、A“5、～70。根据下列公式计算总叶绿素(C。+b)、叶绿素a(C。)、叶绿素b(Cb)和总类胡萝卜素(C；吒)含量，具体公式如下：Ca+b=20．2×A645+8．02×A663；Ca=12．21xA663—2．81xA645；Cb=20．13×A645—5．03xA663；n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定C；吒=(1000xA470—3．27xC。-104XCb)／229。7．藻体Cu、Zn含量测定藻体重金属含量利用电热板加热．原子吸收测定(王德鸿，2010)。简述如下：称取0．29生物体研磨干样于25ml锥形瓶中，用几滴水湿润样品，加入5ml硝酸(AR)，盖上漏斗，置于电热板低温加热至泡沫基本消失，沿瓶壁按滴缓慢加入O．5mlH202，盖上漏斗，于电热板160"C．200。C加热约20min，补加lmlH202，继续加热并蒸至约剩lml。再加lml硝酸、1．5mlH202，继续加热并蒸至o．5ml，全量装入10ml比色管中，并用去离子水定容待测。2．3结果与讨论2．3．1藻种的鉴定1．形态学鉴定、光学显微镜观察下，分离纯化所得藻体，呈绿色，常聚集成群，群体细胞上下2列细胞交相嵌合，呈卵形，间或有个别细胞单生。电子显微镜下观察，单个藻细胞呈椭圆形，细胞壁平滑，含有多个周生、呈条带状的色素体，几乎充满整个细胞，色素体内包含数个脂肪滴，中间含有一个清晰可见的蛋白核；细胞中心部分有一个细胞核，内含一个清洗可见的核仁(详见图2．1)。对照《中国淡水藻类．系统、分类及生态》书中对淡水藻类的描述(胡鸿钧等，2006)，初步判定此分离纯化微藻属于绿藻门绿藻纲绿球藻目真集结体亚目栅藻科栅藻属(Scenedesmus)，初步命名为Scenedesmussp．CHXl，已提供至中国普通微生物菌种保藏中心保藏(登记入册编号：CGMCCNo．6649)。栅藻是水体中常见微藻，常生长在湖泊、水库、池塘、水坑等各种静水水体中，自然条件下常聚集成群，为真性定型群体，但在实验室培养后，观察过程中，间或出现单个细胞生长现象，这可能与培养条件有关，deMorals等(2007)曾研究指出，栅藻在室内培养条件下也可单独生长，而不聚集成群。n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定，噻譬。擘羽图2-1分离藻在显微镜下的形态特征，其中CH代表色素体，PY代表蛋白核，V代表核仁Figure2-1Morphologicalcharactersoftheisolatedalgalinlightmicroscope(a)andTEM(b)，CH，PYandVaLsabbreviationforchromatophore，pyrenoidandnucleus，respectively．2．18SrDNA基因扩增及系统发育树构建用通用引物对纯化微藻的18SrDNA进行PCR扩增，得到了预期长度的扩增产物(如图2．2)，且产物条带单一。从图2．2中可以看出分离纯化所得微藻的18SrDNA扩增片段的长度在500bp附近，测序结果经GeneRunner软件分析，其具体长度为541bp。用BLAST(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST)对所测序列进行分析，选取GeneBank中已有的近缘藻株序列，用邻接法(NJ法)构建18SrDNA系统发育树，具体结果见图2．3。由图2．3可知，分离纯化所得微藻与已知藻株Scenedesmaceaesp．(登录号：AYl97639)及其亚属Desmodesmusintermedius(登录号：FR865703)和Desmodesmusintermedius(登录号：FR865700)位于系统发育树的同一个分支上，具有较近的亲缘关系。因此，基于18SrDNA部分序列和其相似序列多序列比对的系统发育分析表明分离藻属于栅藻属(Scenedesmus)的亚属Desmodesmus中的一种。由形态学与分子生物学结果相结合，可以确定分离纯化所得微藻属栅藻(Scenedesmus)，正式命名为Desmodesmussp．CHXl。测序结果已提交至GeneBank(登录号：JX255841)；分离纯化藻株也已提交至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏受理号为：CGMCCNo．6649。36n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定图2-2分离藻的18SrDNAPCR扩增产物，DNA提取物稀释5倍时(条带1)和稀释10倍时(条带2)Figure2-2PCRamplificationof18SrDNAgenewith5-fold(1ane1)and10·folddilutedDNAsamples(1ane2)Soen目由骶可naceaeso．(AYl97639)Desnlodesn’■。6i门h，nT'ed¨s(FF∞65703)Des开州esnlL●sir'ten他d÷us(FR865700)▲Dt岿；rr誓H，esrr■培sp．CHXl(dX25正HMl．1)oe昌rmde鼍rrl6‘rtefr”ed知Js伊F≈865698'Desn’a．de3nlusbr|日l{i■er墨is‘FF啪5705)Desn州esn‘■Jssp．(JX437624)Scer■}cl电}宣rr■．B‘Ad249514)DegT●DdegT■Js(FR86S711)Deg删e，TlJopamnkustFR865712)De噶膏T—)de鼍rr—塔interrrIdbusOF=F均654599)Desn’odes—1usb几日ls●¨er目s‘FF鼬5704)Desrnode曩’1LBbra囊Kt叮嚣is‘FR日蛄707)Desrrlo<|e薯rr■蓐par■'，r●●cus(FF≈86571o)[)esrrlode壹—I●宝irlerrnedius(FR865702)DesrT’odesn’usirte．rrnedhJs(FF≈B65701)S；cer—，de毫爿11LBatHJr●darB(X739薯，{5)Cllore41园p"enoido鞠(Ad242762)Desrrx)desn璩co几'Tunso‘73994>De9nlode曩几1L|spelforaluso：F乇B65714)Coccoidgreenaba‘AYl95982)C：occoids堰：er●ec●es膏。rtdsp．(A、’11)7638)S．cost毒瞳o-—granulatlJS(x91265)Scer誓}desrr日c堤}aesp(AY'97627)Scenedesnl辨●略sp．(AYl97634)[)鼍H；rr■，de暑，1_■．葺；s1．t，葛—》●c●'L■s(H(：拇3珥41485)Scenedesnl』sanT日tus‘FFt明5727)EnaIlaxacutiforT'■s(AB0370e9)Scenedesnluspan^。|s(-=R国85718)Scenedesnl■．■ssp．‘AF513373)T电瞳racIesrruswscor譬；‘r■er商S(AB037097)Scer誓一esrr●．BreQulans‘AB037095)Seer—，desrr■．●s均cLDk■tus(X5-E；104)G旧esietlae丌屯嘲i1’i(F同粥5旧旧7)Astera门cysquadriceIIul舯e‘AF3∞375)Scer■}de曙科1'Llssp．‘Ae2￡；5365)Coelaslrumastro‘deum(AF388300)Scenedesnlusot，舢quL-皇(AJ249S15)。苫五————曩夏■———志葛■———忑％=_———i妄i———i；j。。图2-3基于18SrDNA部分序列构建的系统发育树，NJ法100次计算Bootstrap值Figure2-3Neighbour-JoiningPhylogeneticTreebasedonpartial18SrDNAsquencesbeingcalculatedwith100repeats2．3．2藻密度表征方法的确定1．Desmodesmussp．CHX1最佳光密度(OD)值确定浊度法表征微藻培养期间的相对生长量，是目前很多研究中常用方法之一37n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定(Bhola等，2011；王翠等，2010；Ge等，2011)，而浊度高低一般用藻液的最佳光密度值大小来衡量。所谓最佳光密度值是指微藻在某个波长段的特征吸收峰。绿藻体内叶绿素a较为稳定，而叶绿素a在可见光区有一个特征吸收峰，如小球藻、葡萄球藻体内叶绿素a在可见光区680rim处有个特征吸收峰，此峰亦被定为小球藻、葡萄球藻的特征吸收峰来表征其相对生长量(王翠等，2010；Ge等，2011)，但需强调指出，在一定吸光值测量范围内，藻液的最佳光密度值能很好地表征相对生长量，反之，超过一定测量范围，其就不能有效反应微藻的相对生长量。取培养四周的Desmodesmussp．CHXl藻液，按一定稀释倍数进行稀释，同时对原培养液及稀释液进行可见光区(600．700nm)扫描，其吸光曲线如图2．4所示。由图2．4可知，在原液中，Desmodesmussp．CHXl在680nm处有个特征吸收峰，OD680值为1．206，而在不同比例稀释液中，Desmodesmussp．CHXl的特征吸收峰均在690nm处，OD690值分别为O．72(稀释2倍时)、0．29(稀释5倍时)和O．145(稀释10倍时)，折算后OD690均在1．44左右。综上，本实验认为OD690可作为栅藻(Desmodesmussp．CHXl)最佳光密度值，在此后的实验中可用OD690表征栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在培养液中的生长情况，但同时需要指出，OD690的测定值不易超过O．7，尤其是OD690值大于1时，就不易作为栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的最佳光密度值，更不能真实反应培养液中栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长情况，所以，在随后的测定过程中，对于藻细胞密度较高，吸光值大于1的培养液，在测定前都进行了适当稀释，以使其OD690测定值在O．7左右。n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定凸o600610锄啪枷650锄670锄690瑚710Ⅵh出l咖(坩砷鲫610啪630640瑚鲫670680690瑚710Wave蛐{rim)n720·698n黼n63n606006106200．147n1440．14l凸o01380135n132630640650660670鹋0690700710W州∞g山(m)d6∞610620630640650660670鹋0690700710wIvcI删IIran)图2-4不同稀释倍数栅藻(Desmodesmussp．CHXl)最佳光密度值，无稀释(a)，稀释2倍(b)，稀释5倍(C)，稀释10倍(d)Figure2-4TheODvalueofDesmodesmussp．CHX1indifferentdilutions，nodilution(a)，dilutiontwice(b)，dilutionfivetimes(c)anddilutiontentimes(d)2．Desmodesmussp．CHXl最佳光密度值(OD690)与藻体干重的关系为更直观的表达培养液中藻体生物量，常用藻体干物重来描述。而浊度法较为简单，更利于日常实验测定，所以探讨藻光密度值与藻细胞干重之间的关系就很有必要了。如图2．5所示，培养液中栅藻(Desmodesmussp．CHXl)最佳光密度值(OD690)和藻体干重的关系呈线性相关，两者的相关系数高达0．9942，且斜率小于1，这与之前的报道一致(Bhola等，2011；王翠等，2010o而Ge等(2011)测定葡萄球藻光密度值与藻细胞干重关系时指出，藻液OD680和藻体干重的关系呈线性相关，两者的相关系数达0．993，但线性斜率要高于1，达到1．2，与本实验结果存在一定差异，这可能与测定藻种不同有关。n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定00．10．20．30．40．50．60．70．8OD690图2-5Desmodesmussp．CHXl藻液OD690和藻体干重的关系曲线图Figure2-5CorrelationcurvebetweenOD690andalgaldrybiomassofDesmodesmussp．CHX13．Desmodesmussp．CHXl生长曲线图2-6显示了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在BG．11培养基中的生长曲线。从图2-6中可以看出栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在接种于新配制的BG．11培养基后，需要经过9天左右的适应期，在此期间培养基中的藻体密度缓慢上升。在经过9天的适应过程后，培养液中的藻细胞开始扩繁，藻体密度开始显著增加，这一时期主要是在接种后的第9天至第45天，培养液中的藻种处于指数生长期，这一时期的藻液浓度由第9天的0．33鲫快速增加至第45天的4．549／1。此后藻液的藻体密度出现下降趋势，即藻体进入衰亡期，藻液浓度由第45天的4．54g／l降至第50天的3．54鲈。【’，[U5．q3c_、|1nU0O0O一一＼M一口011对．I_IIouIIou∞∞砖go一∞n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定5．04．54．03．53．02．52．01．51．00．5O．O-303691215l葛2l24Z’73U3336394245485l54Cultivationtime(days)图2-6栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在500ml培养瓶中的生长曲线Figure2-6GrowthcurveofDesmodesmussp．CHX1in500mlconicalflasks2．3．3藻体无机元素含量测定栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内C、N、H及Cu、Zn含量测定结果见表2．2。由表2．2可知，Desmodesmussp．CHXl藻细胞体内C、N和H元素含量分别为45．68％、7．13％和7．90％，符合常见淡水藻类体内c、N、H含量范围(c含量(16．9％：68．8％)、H含量(3．O％．7．46％)、N含量范围(3．55％．11．2％))，但略低于已有报道的栅藻体内C(51．3％)、H(7．46％)和N(8．72％)值(曹吉祥等，1997oDesmodesmussp．CHXl藻细胞检测出较低的zn含量，而Cu未被检测到，这可能与培养液中cu、zn含量较低有关。表2-2栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内无机元素和色素含量Table2-2InorganicelementsandChlorophyllcontentofDesmodesmussp．CHX12．3．4藻体色素含量测定藻细胞的色素是微藻光合作用的基础，叶绿素、类胡萝卜素和藻胆色素是藻41^《M．)IIo一瓮皂矗。口oo∞∞霉口。一∞n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定类细胞中主要的三类色素，其中叶绿素a作为光合作用反应中心的色素．蛋白复合体的核心部分，出现在所有产氧光合营养的藻细胞中，能将光能转化为化学能；类胡萝卜素主要承担光捕获辅助色素以激活叶绿素a，参与构建光反应中心色素．蛋白复合体，保护色素体免遭过度光伤害等生物学功能。叶绿素含量的高低是描述微藻将无机营养物质转变为有机物质能力的一个重要指标，更能反映微藻对培养液中有机物等营养元素的利用程度(周文礼等，2009)。栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内色素含量测定结果见表2-2。由表2．2可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内总叶绿素含量为4．92mg／l，其中叶绿素a含量为3．86mg／l，显著高于已报道普通小球藻的2mg／1(殷国梁，2007)，这说明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能更高效捕获并利用光能，培养条件更倾向于有光条件下。2．3．5藻体总脂含量和脂肪酸组成测定微藻体内脂质含量和脂肪酸组成是考察微藻用途的主要参考指标之一(卢丽娜等，2009)，尤其是随着目前石化能源的日益减少和生物柴油作为石化能源替代品之一受到日益关注的情况下，利用微藻制备生物柴油在国内外受到了广泛的关注(卢丽娜等，2009；Ho等，2010；Mata等，2010；Sydney等，2011；Zhou等，2011；马红芳等，2012；杨忠华等，2012；黄雄超等，2012)，筛选适合制备生物柴油的藻种就显得尤为重要，因此明确栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内脂质含量和脂肪酸组成就很有必要。经测定可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内脂质含量范围为12．1％．14．6％，符合正常培养条件下已报道微藻的脂质含量10％．30％的范围(黄雄超等，2012)，但显著低于某些已报道的用于制备生物柴油的栅藻品种体内脂质含量，如Scenedesmussp．CNW-N(38．9％)(Ho等，2010)、Scenedesmussp．LXl(31．6％)(Li等，2010)、Scendesmusobliquus(43％)(Mandal和Mallick，2009)。这可能与藻种和培养条件不同有关，如Ho等(2010)采用两步培养法，首先将Scenedesmussp．CNW-N培养在富营养培养基内同时供给C02，随后再培养在营养物质匮乏培养基内用于油脂积累；Mandal等(2009)将ScendesmusobBquus培养于N缺失培养基内，细胞脂质含量高达43％，显著高于对照(12．7％)。微藻和高等植物一样，都是以脂肪酸三酰甘油的形式存储脂质，Meng等(2009)指出微藻中脂肪酸成分主要由C12．C22饱和和不饱和脂肪酸组成，且42n浙江大学博士学位论文第2章一株徼藻的分离、鉴定及其理化性质测定主要以不饱和脂肪酸为主。由表2．3可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内脂肪酸成分也是以C12．C22为主，占总脂肪酸含量的71．28％，而C12．C22脂肪酸成分中又以C16．C18脂肪酸成分含量为主，且以饱和和单不饱和脂肪酸含量为主，占脂肪酸总量的70．71％。Miao等(2007)指出微藻细胞内脂肪酸成分中以C16．C18成分最适合用于制备生物柴油(Zhou等，2011)，且从最终获得微藻生物柴油质量来看，选择含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸高的微藻作为原料最佳，这是因为如果微藻含有较多的不饱和脂肪酸会使生物柴油的氧化稳定性降低(黄雄超和牛荣丽，2012)。综上说明，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备用作制备微藻生物柴油原料的潜力，而其体内较低的油脂含量(12．1％～14．6％)可以通过改变培养条件的方法而显著提高，如Lv等(2010)通过改变培养基内KN03、C02供应量及光照培养条件，Chlorellavulgaris体内脂质含量比文献报道值提高了2．5倍；Xiong等(2008)通过改变培养方式将Chlorellaprotothecoides体内脂质含量从自养培养时的14％提高到异养时的55．2％。目前文献报道中还有一些常用的措施，如营养物质(N、P、Si)限制性培养(Mandal等，2009；Rodolfi等，2009；Griffiths和Harrison，2009)和向培养基内补充Fe3+(“u等，2008)。夏金兰等(2010)研究指出添加Fe3+能显著提高三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和球等鞭金藻(1socrydidgalbana)的生长速率和脂质含量，当培养基中添加Fe3+的浓度度分别为1xlO‘4mol／1和lxlO。5mol／1时，三角褐指藻和球等鞭金藻脂质含量分别达到47．3％和41．9％，是不添加Fe3+培养时的4．2倍和2．8仕J口。表2-3栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内脂肪酸组成成分Table2．3ProfileoflipidproducedfromDesmodesmussp．CHX1脂肪酸类型脂肪酸占总脂肪酸百分比(％)C12：0C14：0C16：0C16：2C18：0C18：lC18：2C18：3C20：1C22：0Unknown43343161823砭J4&石溶&9J石■姊O21O282OO强n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定2．3．6藻体粗蛋白含量和氨基酸组成测定蛋白质是构成藻体干物质的主要化学物质(硅藻除外)，而藻类在食物、饲料等方面的应用潜力，也正是基于藻类较高的蛋白质含量(曹吉祥等，1997)。而蛋白质中所含必需氨基酸的种类、数量和构成比例又决定了其营养价值(董黎明等，2012)。由表2．4可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内粗蛋白平均含量为49．3％，略低于已报道的可用作饲料的斜生栅藻的54．3％(曹吉祥等，1997)，这可能与藻体的种类和产地不同有关(董黎明等，2012)。由表2．4可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)含有16种氨基酸，并包括人体所需的7种必需氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸含量较高，缬氨酸、异亮氨酸含量较低，半胱氨酸含量最低，仅为2．27p∥g，这与之前的报道结果一致，曹吉祥等(1997)研究指出单细胞绿藻体内以天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸等为主要氨基酸。栅藻(Desmodesmussp．CHXl)中总氨基酸含量为198．4I_tg／g，其中总必需氨基酸含量为59．31“∥g，占总氨基酸总量(EAA／TAA，E／T)的29．9％，必需氨基酸与非必需氨基酸(EAA／NEAA，E／N)比值为42．6％，低于世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)提出的蛋白质饲料中EAA／TAA的比值应大于40％、EAA／NEAA比值应大于60％的参考值。但Desmodesmussp．CHXl氨基酸总量及成分含量要显著高于多科常见牧草体内含量，刘永红等(2008)指出豆科、菊科、禾本科等牧草体内氨基酸总量为5％-8％，各种氨基酸含量的范围为：天冬氨酸0．31％．1．97％、苏氨酸O．17％．0．91％、丝氨酸O．18％．0．94％、谷氨酸O．39％．6．80％、甘氨酸0．22％．0．65％、丙氨酸0．22％．1．15％、半胱氨酸0．24％．0．77％、缬氨酸0．28％．1．43％、蛋氨酸0．05％．0．32％、异亮氨酸O．17％．1．16％、亮氨酸0．25％．1．82％、酪氨酸0．10％．0．37％、苯丙氨酸0．16％．1．19％、赖氨酸0．21％．0．90％、组氨酸0．08％．0．39％、精氨酸0．20％．0．80％。此外，张丽君等(2001)研究指出微藻细胞内营养物质含量受培养条件和培养环境的影响，如培养基中营养盐、C／N、接种量及温度、pH值等，改变上述影响条件可显著改变微藻体内营养物质含量，如董黎明等(2012)就曾指出光自养培养小球藻体内氨基酸含量要高于异养培养，这可能与培养模式的改变导致其代谢方式和途径发生了改变有关。总之，虽然栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内现有必需氨基酸指数低于参n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定考模式，但其仍有较高的营养价值，尤其是作为动物第一限制氨基酸的赖氨酸含量较高的前提下，并且相信随着Desmodesmussp．CHXl培养条件的优化，其营养价值和应用潜力也会随之扩大。表24栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内氨基酸组成成分及含量Table2-4ProfileanditscontentofaminoacidfromDesmodesmussp．CHX1名称1含量(I_tg／g)名称舍量!丛咝!天冬氨酸(Asp)苏氨酸(m)‘丝氨酸(Ser)谷氨酸(Glu)甘氨酸(Gly)丙氨酸(Ala)半胱氨酸(Cys)缬氨酸(Val)‘总氨基酸(T从)非必需氨基酸(NEAA)蛋氨酸(Met)’异亮氨酸(Ile)’亮氨酸(Leu)。苯丙氨酸(Phe)‘酪氨酸(Tyr)赖氨酸(LyS)’组氨酸(His)精氨酸(Arg)总必需氨基酸(EAA)粗蛋白含量(％)EAA／TAA(％)29．9％EAA／NEAA【％)42．6％1色氨酸和脯氨酸未测；““’表示人体必需氨基酸。Note：·‘1’’and6(,+99indicatesnodetectionofTrpandProandEssentialAminoAcid(EAA)，respectively．2．4本章小结1．从养猪废水处理池内分离纯化获得一株优势微藻，借助形态学和分子生物学手段，鉴定此微藻为栅藻，命名为Desmodesmussp．CHXl。纯化藻株已提交至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏受理号：CGMCCNo．6649)，测序所得18SrDNA部分序列已提交至Genebank(登录号：JX255841)。2．栅藻(Desmodesmussp．CHXl)最佳光密度值为OD690，但OD690测定值不易超过O．7，在此测定范围内，光密度值与藻体干重问呈线性正相关关系(启=o．9942)；正常培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在BG．11培养液中生长45天后达到生长稳定期，最高浓度达4．54g／l。3．栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内C、N、H和Zn含量分别为45．7％、7．13％、7．90％和79．7mg／kg，Cu含量低于最低检测浓度；藻体总叶绿素含量为4．92mg／1，其中叶绿素a占总叶绿素含量的78．5％，类胡萝t-素含量为1．67mg／1；藻细胞总脂含量为12．1％．14．6％，脂肪酸成分中以C16．C18含量为主，占总脂肪酸含量的70．7％，适合作为生物柴油生产原料；藻体粗蛋白含量为49．3％，在所4512846；5¨弘m垃记鹏甜拍"钻ⅢⅢ”张：2饥M屹生H毁坝拍997●574供舢％垃n坻愀勉铋懈拽n浙江大学博士学位论文第2章一株微藻的分离、鉴定及其理化性质测定测定的16种氨基酸成分中含有人体所必需的7种氨基酸，其中天冬氨酸含量最高，达27．2I-tg／g，总氨基酸含量为198．4lxg／g，其中总必需氨基酸含量为59．31p,g／g，占总氨基酸含量的29．9％，可作为养猪场部分蛋白饲料的替代品。n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究第3章栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究3．1引言随着储存在地球上的化石能源和天然气资源的匮乏，能源危机已成为21世纪最大的挑战(Vasudevan等，2008)。在过去几年中，寻找替代能源和确定能提供稳定的高能源输出的生物品种来替代传统的化石燃料，已被广泛研究(Miao等，2004；Sun等，2008)。生物柴油因其具有无毒、可生物降解和可再生的优点而引起广泛关注，有望提供能源供应多样性的新机会(Gouveia和Oliveira，2009)。到目前为止，生物柴油大多是从含油作物体内获取，这些作物如大豆，油菜籽等，这些作物本质上是可食用作物(Mandal和Mallick，2009)，在实际应用中，这些植物油也被供应于人类的消费，而生物柴油的介入势必会引发食品级植物油价格的升高，进而引发粮食危机，反之，作物成本也会随之升高，导致生物柴油生产成本和价格增加，限制其市场竞争力，进而限制其可持续发展性(Demirbas，2009)。为了不与食用植物竞争，寻找替代能源原料势在必行。微藻作为一种可靠的替代传统作物用于生产生物柴油的新兴原料已被广泛认可，这是因为微藻具有生长周期短、油脂含量高、生长速率高且无需培养在耕地或淡水内，不会对农业产生影响等优点(Pittman等，2011)，此外，微藻培养可在人为调控条件下进行，可避免受到季节性限制，做到随时采收利用(Chisiti，2007；Hu等，2008；Rodolfi等，2009；Ho等，2010；Teresa等，2010；Li等，201l；Singh等，2011)。目前，用微藻制备生物柴油技术上是可行的，但是经济上却不可行(Chisiti，2008)，主要症结在于现有微藻藻种生物产量和油脂产率低，导致其培养周期长，生产成本较高(Johnson和Wen，2010)。最理想情况是所选微藻的生物产量和细胞体内油脂含量均高，使得油脂产率高(Griffiths和Harrison，2009)。目前报道了很多提高微藻体内油脂含量的措施，但这些措施均是在逆境条件下，如常见的N、P限制性培养(Converti等，2009；Dean等，2010；Li等，2010)，Rodolfi等(2009)用110l管状光生物反应器培养Namnochloropsissp．，把培养条件从N营养充足培养基转换到N元素缺乏培养内培养后，47n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究Namnochloropsissp．细胞内油脂含量从32％增加到60％。如上所述，这些措施的确提高了微藻细胞内油脂含量，但同时也显著降低了微藻生物产量，最后导致微藻油脂产率的下降。因此，在进一步开发藻类生产生物柴油的过程中，筛选生长速度快和油脂含量高的生产藻株，同时优化藻株的培养条件以提高微藻油脂产率是保障微藻生物柴油商业化运作的关键环节(Griffiths和Harrison，2009)。在之前的实验中，本实验室从养猪废水处理池内筛选分离出一株栅藻(Desmodesmussp．CHXl)，理化性质测定结果表明，此栅藻具有作为生物柴油生产原料的潜力，因此，本章主要针对提高栅藻CHXl生物产量和油脂产量的培养条件进行优化研究，筛选出适合栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂产率的最佳组合培养条件，以此制备种子培养液。影响微藻生长和油脂含量的因素很多，如光照(Lv等，2010；Suneerat等，2012)、pH(王翠等，2010)、培养温度(Converti等，2009；欧阳峥嵘等，2010)、培养基营养物含量(Bhola等，2011；张桂艳等，2011)、培养时间(Zhila等，2011)等。结合实验室现有条件，本章在优化一些培养条件(如培养方式、氮源、碳源)的基础上，通过正交优化和单因子试验进一步筛选优化了葡萄糖浓度、初始pH、硝酸盐浓度及种子细胞接种浓度，筛选出制备种子培养液的最佳条件组合，以使栅藻(Desmodesmussp．CHXl)获得最高油脂产率。3．2材料与方法3．2．1微藻及预培养研究所用栅藻(Desmodesmussp．CHXl)是上章中分离纯化所得，藻种保存于BG．11培养液内，培养条件是摇床培养(150rpm)，培养温度为27士2。C，由H管荧光灯管提供光照，光照强度为100lxmol／m2／s。在试验前7天，室温下将此微藻进行离心浓缩(5000rpm，10min)，然后用无菌水重新悬浮藻细胞，再次离心浓缩(5000rpm，10min)，如此重复3次，再将离心浓缩的藻细胞转移至已装有250ml已灭菌的上述BG．11培养液的培养瓶内，上述同样条件下预培养至对数生长期。将上述培养的藻细胞液作为余下实验的接种液。BG．11培养液成分见2．2．1。48n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究3．2．2培养方式优化微藻密度因培养方式不同会有很大差异，根据微藻对光源和碳源的需求，徼藻培养方式可分为光自养、异养、光异养和混养(或称为兼养)四种(Chen等，2011；刘振强等，2011)，其中光自养培养是指微藻利用光作为能量来源，以无机碳(如C02)为碳源的培养方式，是最常见最原始的培养方式，适宜于几乎所有微藻；异养培养是指微藻仅以有机碳源作为能源和碳源，无需光照，可克服光自养的缺陷，实现高密度培养，但只有特定藻种才适合异养培养；光异养是光照和异养相结合的一种培养方式，主要是通过有机碳源作为碳源的同时又提供光能；而混养又称兼养，是在利用光能和C02等无机碳源的同时，以有机碳作为补充碳源和能源的一种培养方法，是光和有机物的联合作用结果，有报道表明混养培养方式下的微藻比生产率是自养和异养培养方式之和。本实验主要考察了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对三种培养方式(光自养、异养和混养)的优化选择。以BG．11培养液为基础培养液，光自养(AT)和对照组(CK)为基础培养液，异养(HT)和光异养(MT)是在基础培养液的基础上再外加葡萄糖，添加量为100ga，灭菌(121℃，30rain)，待用。分别取20ml上述接种藻液，接种至180ml已灭菌的上述四种培养液中(初始OD690为O．1左右)，然后将光自养组和混养组培养瓶置于光照培养箱中静置培养，每天摇瓶并随机更换培养瓶位置，以避免光照不匀，设定光照强度为100I_tmol／m2／s，温度为27+2。C，光暗比24：0，培养时间3d；异养组和对照组置于完全黑暗条件下，除无光照外，其他培养条件同有光照组。每个处理设3次重复，分别测定培养液中起始时和结束时的OD690，根据OD690和藻细胞干重的关系式，将OD690折算成生物量浓度，以筛选适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的培养方式。3．2．3碳源优化碳源是微藻生长所必需的营养物之一，包括无机碳源和有机碳源，其中无机碳源有C02、C032-和HC03。，而有机碳源有葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、乳酸等简单有机物(Che：119等，2009)。不同碳源条件下，微藻的生长和生物量产率不同(马帅等，2011)，为寻找适合栅藻CHXl生长的碳源，本实验主要考察了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对两类碳源(无机碳源和有机碳源)的生长49n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究适宜性，其中无机碳源为Na：CO，和NaHCO，，有机碳源为葡萄糖和CH，COONa。以BG．11培养液为基础培养液，分别用葡萄糖、CH，COONa和NaHCO，以等摩尔碳浓度(0．19mmolC／!)替代培养基中Na：CO，，从而制备含不同碳源的培养基，灭菌(121℃，30min)(备注：为避免在高温高压下(121℃，1个标准大气压，30min)NaHC03发生分解，将配制好的含NaHC03的培养液在相对低温下灭菌(105℃，1个标准大气压，10min)，待用。取一定量的种子培养液，离心浓缩后(5000rpm，10min)，用已灭菌的无碳BG．11培养液洗涤2．3次后重新悬浮藻细胞，作为试验用的接种藻液。分别取20ml接种藻液，接种至内含180ml已灭菌的含不同碳源培养液的培养瓶中(初始OD690约在0．2．0．3之间)，随后，将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，每天摇藻并随机更换培养瓶位置，以避免光照不匀，设定光照强度为1001amol／m2／s，温度为27士2℃，光暗比24：0，培养时间3d。每个处理设3次重复，分别测定培养液中起始时和结束时OD690和叶绿素含量，根据藻细胞生物量产量及叶绿素含量，以优化筛选适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长的碳源。3．2．4氨源优化氮源也是微藻生长所必需的营养物之一，培养基中不合氮时，微藻细胞几乎无生长，它也是影响微藻脂肪酸代谢最主要的因素。微藻可利用的氮源主要包括无机氮(N03。、N02。、NI-h+)和有机氮(溶解态)(Bhola等，2011)。本实验主要考察了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对无机氮源(N03-N和NH4-N)的选择。以BG．11培养液为基础培养液，用NH4cl以等摩尔氮浓度来替代培养基中NaN03(17．6mmolN／1)，制备以NH4．N为氮源的培养基，以BG．11培养液作为N03-N为氮源的培养基，灭菌(121℃，30min)，待用。取一定量的种子培养液，离心浓缩后(5000rpm，10rain)，用已灭菌的无氮BG．11培养液洗涤2—3次后重新悬浮藻细胞，作为试验用接种藻液。分别取20ml接种藻液，分别接种至内含180ml已灭菌的含不同氮源的BG．11培养液的培养瓶中(初始OD690约在0．2．0．3之间)，随后，将培养瓶置于光照培养箱中静置培养，每天摇瓶并随机更换培养瓶位置，以避免光照不匀，设定光照强度为100I．tmol／m2／s，温度为27+2"C，光暗比24：0，培养时间7d。每个处理设3次重复，分别测定培养液中起始时和结束时OD690和叶绿素含量，根据藻细胞生物量产量n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究及叶绿素含量，以优化筛选适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长的氮源。3．2．5正交组合优化1．正交试验表设计在栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对不同培养方式、碳源和氮源优化筛选确定的基础上，选用L9(3)4正交表，以葡萄糖浓度、接种浓度(V：V)、培养基初始pH和硝酸盐浓度作四因素来研究适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂积累的最佳培养条件组合，每种因素取3个水平，其中葡萄糖浓度分别取1朗、3酊和5g／l；培养基初始pH分别取pH=6、pH=8和pH=10；接种浓度(V：V)分别取10％、20％和30％；硝酸盐浓度分别取1酊、2胡和3朗。具体试验因素及水平见表3．1。表3-1L9(3)4正交试验设计、Table3-1L9(3)4Orthogonaltestdesign因素处理组编(A)葡萄糖浓度(B)培养(C)接种浓度(D)硝酸盐浓号(酊)基初始pH(V：V)’度(朗)1A1lBl6C110％D】12A11B28C220％D223Al1B310C330％D334A23B16C220％D335A23BE8C330％D116A23B3lOC110％D227A35Bl6C330％D228A35B28C】10％D339A35B310C220％D11’10％接种体积时初始OD690为O．16左右，20％接种体积时初始OD690为0．38左右，30％接种体积时初始OD690为0．57左右。’Note：ThevalueofOD690wasabout0．16，0．38and0．57when10％，20％and30％(v：V)oftheinoculum，respectively．2．正交试验以BG．1l培养液作为基础培养液，根据b(3)4正交试验设计中的因素制备不同处理的培养液，吸取200ml已制备的上述培养液至500ml培养瓶中，灭菌(121℃，30min)，冷却至室温后待用。按照L9(3)4正交试验设计中的接种浓度，将预培养的接种藻液分别接种至各处理瓶中，再用已灭菌的1MNaOH或HCl51n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究溶液调节各培养液初始pH至正交表中设定值。随后，将培养瓶置于光照培养箱中，静置培养，每天摇瓶并随机更换培养瓶位置，以避免光照不匀，设定光照强度为100I．tmol／m2／s，温度为27士2。C，光暗比24：0，培养时间3d，每个处理设3次重复。分别测定培养液中起始时和结束时OD690、叶绿素含量和藻细胞油脂含量，根据藻细胞生物量产量及油脂产率来优化筛选适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂积累的最佳培养条件组合。3．2．6单因子优化根据正交试验结果，发现葡萄糖浓度和接种浓度对栅藻(Desmodesmussp。CHXl)的生物量产率和油脂产率影响最为显著，因此，为进一步优化栅藻CHXl生长和油脂积累的培养条件组合，在正交试验筛选出最佳条件组合的基础上，分别对葡萄糖浓度和接种浓度进行了单因子试验。正交试验条件下筛选出栅藻CHXl的最佳油脂产率组合条件为葡萄糖浓度3g／l、培养液初始pH=10、接种浓度10％(初始OD690=o．16)和硝酸盐浓度2g／1。在单因子试验过程中，只改变相应需要优化的指标浓度，保持其他组合条件不变。1．最佳葡萄糖浓度在上述组合条件基础上，改变葡萄糖浓度，设定葡萄糖浓度分别为1g／1、3鲫、5胡、7酊和10∥l，其他操作同正交试验设计中实施步骤。2．最佳接种浓度在上述组合条件基础上，改变接种浓度，设定接种浓度分别为5％、10％、15％、20％和30％，对应的初始OD690分别约为0．07、O．16、O．22、O．29、O．43，其他操作同正交试验设计中实施步骤。3．2．7测定方法(一)藻体生物量测定1．生物量干重测定取一定量培养液，在分光光度计上(ThermoEvolution220，USA)测定各个处理OD690。再根据OD690与栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量干重之间的关系换算成生物量干重，换算关系式如下：生物量干重(g／1)=0．99130D690-0．0215，R2=O．9942。生物量产率(mg／Vd)是栅藻(Desmodesmussp．CHXl)培养结束时生物量nn浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究o．042g／l和0．044酊显著增加至O．51g／1、o．31g／1和2．43酽，而对照条件下(CK)藻细胞浓度基本未变。这说明光照或外源添加有机碳源更利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长，相较而言，光照的增加作用更显著，而同时光照和外源添加有机碳源的增强作用要显著优于单一作用，即混养培养条件下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的生物产量、产率均显著优于光自养或异养培养条件下(P<0．05)。培养3d后，混养培养条件下，栅藻CHXl藻细胞生物量产率为784．8mg／1／d，显著优于光自养培养时的150．6mg／1／d和异养培养时的79．4mg／l／d，混养组藻细胞生物量产率比光自养和异养培养时生物量产率的总和还要高，分别是光自养组合异养组的5．2倍和9．9倍，与Bhamagar等(2011)和杨静等(2011)研究结果类似，如Bhamagar等(2011)研究指出混养培养微藻CMamydomonasglobosa、Chlorellaminutissima和Scenedemusb驴uga时的生物量达到最高，是光自养培养时的3．10倍。此外，Bhatnagar等(2011)还指出，葡萄糖、蔗糖、乙酸盐和废水均可用作光异养或混养培养时的有机碳源。用畜禽废弃物的提取液培养上述三种微藻时，其获得的藻细胞产量是BG．11培养液培养时的1．8倍，进一步指出混养培养是耦合废水利用和微藻培养较有潜力的培养方式，这可能因为混养生长囊括了光自养和异养生长，且两个过程是同步而又相对独立的过程，结果两个过程叠加效果具有协同促进作用(Gao等，2010)。虽然混养培养可以兼顾光自养和异养培养的优点，但并不是所有的微藻都适应混养培养，进行混养培养的藻种也要进行筛选(刘振强等，2011)。目前能应用于混养培养的微藻种类相对较少(Perez．Garcia等，2011)，如杨静等(2011)从6种微藻(包括3株绿藻、2株硅藻和1株金藻)中筛选出1株小球藻和1株栅藻可营混养培养，生物量产量分别达到2．17∥1和2．86鲫，是自养培养时的5倍和8倍，可作为生产生物柴油原料的藻种。由本实验结果可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能营混养培养，且在混养培养方式下藻细胞生长快、产量高(2．43g／1)，因此，适宜于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长的培养方式为混养培养。n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究CKATHTMT图3-1不同培养方式下培养前后栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量浓度Figure3-1BiomasconcentrationsofDesmodesmussp．CHXlinthepresenceofdifferentcultivationmodesbeforeandaftercultivation3．3．2碳源优化由图3-2可知，不同碳源条件下，栅藻CHXl生长速度不一，有机碳源条件下的生长速度要优于无机碳源，其中又以葡萄糖最快，Na2C03最慢，这也再次印证了栅藻CHXI能有效利用有机碳源，可营异养或混养生长。培养3d后，在Na2C03、NaHC03、CH3COONa和葡萄糖为碳源条件下，栅藻CHXl生物量产量分别从初始时的0．34g／1、0．28g／1、0．31酊、0．31虮增加到0．39g／1、0．97g／1、O．88g／1和1．68酊，生物量产率分别达到14．9medl／d、217．9mg／Vd、191．8mg／Vd和458．5mg／Vd，这说明Na2C03、NaHC03、CH3COONa和葡萄糖均可作为栅藻CHXl生长培养的碳源，其中葡萄糖作为碳源时，栅藻CHXl的生物产量和产率最高，最有利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长；其次为NaHC03作为碳源时，栅藻CHXl的生长也得到显著促进，而Na2C03作为无机碳源时生物量最低，说明最不利于小球藻生长，这和之前的研究报道相符，如马帅等(2011)研究了葡萄糖、麦芽糖、乳糖、乙酸钠、蔗糖和可溶性淀粉作为有机碳源时对藻株Hhw生长和油脂积累的影响，结果发现，相较于其他有机碳源，藻株Hhw在葡萄糖中生长最快，淀粉中生长最慢，并且葡萄糖作为有机碳源时，Hhw细胞内油脂2lO^罱v口。召爵扫口∞。—IoQ∞器昌。州∞n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究积累最高，达藻细胞干重的36．45％，类似报道还有刘平怀等(2012o郑洪立等(2011)研究三种无机碳源(Na2C03、NaHC03和C02)对小球藻生长和油脂积累的影响，结果指出，Na2C03、NaHC03和C02均可作为小球藻自养产油脂的的无机碳源，但在直接通C02时，小球藻生长最好，生物产量最高，而Na2C03作为无机碳源时生物量最低。一般认为，微藻生长是以c02为光合作用反应物经一系列代谢合成的结果，如果生长环境中c02浓度不足，微藻也能利用细胞表面的碳酸酐酶将HC03转化成C02供RUBPase固定，因此，培养液中易被微藻吸收利用的无机碳源是C02和HC03-两种形式的溶解无机碳(程丽华等，2005)，王立柱等(2010)研究也指出微藻培养过程中因受C02供应速率的限制影响藻细胞生物产量时，可向培养液中适量添加NaHC03，能显著促进藻细胞生物量的增加。此外，NaHC03的存在或添加不仅能作为无机碳源，而且也起到缓冲剂的作用，能调节培养液pH值，保持碱性环境，可抑制污染生物繁殖，保证藻培养质量(Yoo等，2010)。但同时也指出，不管是有机碳源还是无机碳源，其初始浓度对微藻的生长也有重要影响，过高或过低均不利于小球藻生长及产油，如刘怀平等(2012)指出适宜单针藻(Monoraphidiumsp．)生长、油脂积累的最佳葡萄糖添加浓度为10e,／1；郑洪立等(2011)指出小球藻生长的Na2C03、NaHC03和C02最佳初始浓度分别为40mmol／l、40mmol／l和6％空气浓度。因此，最适宜于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和生物量积累的碳源为葡萄糖。盆迪口皇叠gog：器g．Q∞0．30．ONallC03CH3COONaTreatmentsn浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究图3-2不同碳源条件下培养前后栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量浓度Figure3-2BiomasconcentrationsofDesmodesmussp．CHX1inthepresenceofdifferentcarbonsourcesbeforeandaftercultivation叶绿素是微藻的光合色素，其含量高低直接影响光合作用效率(郑洪立等，2011)，在叶绿素含量中，常见的是叶绿素a，其含量大约占藻细胞干重的1％屹％(吕洪刚等，2005)。殷国梁(2007)研究指出，小球藻细胞内叶绿素的合成取决于光照和培养液中有机物浓度，混养培养9d后，小球藻体内叶绿素含量达到18．15mg／l，显著高于异养培养时的1．00mg／1。本实验中也得到类似结果。图3显示了不同碳源条件下栅藻CHXl细胞内Chl(a+b)含量的变化。由图3可见，在相同光照培养条件下，与无机碳源相比，有机碳源更利于Chl(a+b)的积累，其中又以葡萄糖为碳源时藻细胞内Chl(a+b)含量最高，而Na2C03时藻细胞体内Chl(a+b)含量不升反降。培养3d后，在NaHC03、CH3COONa和葡萄糖为碳源条件下，栅藻CHXl细胞内的Chl(a+b)含量分别从初始时的1．34mg／l、1．58m鲫、2．52mg／1增加到1．71mg／1、3．75m胡和11．3mg／l，而Na2CO为碳源条件下，叶绿素含量从初始的1．22m鲫下降至0．60m朗。此外，培养3d后，不管是在何种碳源条件下，栅藻CHXl细胞体内Chl(a+b)含量中均以Chla含量为主，占Chl(a+b)总含量的71％．76％，也再次印证了绿藻体内叶绿素含量以Chla为主。因此，葡萄糖作为碳源时叶绿素含量最高，说明最有利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)进行光合作用，也最有利于栅藻CHXl细胞体内物质积累。n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究Na2C03NaHC03CH3COONaGlucoseTreatments图3·3培养3d后不同碳源条件下栅藻CHXl细胞内叶绿素a和叶绿素b含量Figure3-3ChlaandChlbcontentofDesmodesmussp．CHXlinthepresenceofdifferentcarbonsourcesafter3days’cultivation综合生物产量和叶绿素含量分析，在所研究的几种碳源中，最适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和叶绿素积累的碳源为葡萄糖，培养3d后，其生物产量和Chl(a+b)含量净增加量分别为1．37鲥和8．78mg／1。3．3．3氨源优化由图3．4可知，不同氮源条件下，栅藻CHXl生长速度不一，以N03"-N为氮源时生长快，而以NH4+-N作为氮源时生长较慢。培养7d后，在以N03-N和NH4+-N为氮源条件下，栅藻CHXl生物量产量分别从初始时的O．16g／l、0．16g／1显著增加到0．70朗和2．73朗，生物量产率分别达到77．1mg／l／d和367．1mg／1／d，这说明N03-N和NH4+-N均可作为栅藻CHXl生长培养的氮源，尤其以N03--N作为氮源时，更有利于栅藻CHXl生长。N03--N是最常用的培养微藻氮源，在培养过程中，微藻对N03--N的吸收常常要优于NH4+-N，主要原因可能是NH4+．N会对藻细胞产生直接毒害作用(Tam和Wong，1996；Park等，2010)，当培养液中NH4+-N浓度高于750mgq时，小球藻(Chlorellavulgaris)的生长就被完全抑制。而在本实验中，培养液中NH4+-N浓度高达941．6mg／1，可能对藻细胞产生一定直接毒害作用，从而降低了其生长速率。反之，在如此高NH4+-N浓度O8642O一一宙III一_I：B葛ou一一茸d‘)Jo—IIun浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究的培养基内，栅藻CHXl依然能存活且利用NH4+．N能生长，说明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具有较高的NH4+-N耐受性，这也为其在后续的养猪废水处理中应用提供了基础。另一方面，微藻对Nl-h+-N的吸收往往伴随培养液pH的降低，结果也会对藻细胞膜产生间接胁迫，如王顺昌等(2008)研究了不同氮源对蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生长的影响，结果表明，在不加入缓冲剂的条件下，不同氮源对蛋白核小球藻的生长具有显著影响，其中NI-14+-N作为氮源抑制微藻生长，接种后96h到240h，细胞密度较N03"．N显著降低；而当加入缓冲剂Hepes稳定培养液pH后，以NH4+-N为氮源时，蛋白核小球藻生长恢复正常，生长速率反而较硝态氮快，这可能与pH波动有关，因为在以N03‘-N作为氮源时，N矿等离子并未伴随N03--N的吸收而被吸收，因而导致pH上升，而当以NH4+-N作为氮源时，非离子态氮主要以扩散方式进入细胞内，因而导致pH下降。NH4-NN03-NTreatments图3_4不同氮源条件下培养前后藻细胞生物量浓度Figure3-4BiomasconcentrationsofDesmodesmussp．CHX1inthepresenceofdifferentnitrogensourcesbeforeandaftercultivation图3．5显示了不同氮源条件下栅藻CHXl细胞内Chl(a+b)含量的变化。由图3．5可见，在相同光照培养条件下，N03--N更利于栅藻CHXl细胞内Chl(a+b)的积累。培养7d后，在以N03--N和NI-h+-N为氮源条件下，栅藻CHXl21O^一面v口。口母扫go口oQ∞∞砖暑。一∞n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究细胞内叶绿素(a+b)含量分别为0．71m酊和6．54mg／l，且不管是在何种氮源条件下，栅藻CHXl细胞体内叶绿素含量中均以Chla含量为主，占Chl(a+b)总含量的70％以上，这与王顺昌等(2008)研究结果类似。因此，N03"-N作为碳源时叶绿素含量最高，说明最有利于栅藻CHXl进行光合作用，也最有利于栅藻CHXl细胞体内物质积累。NH4一NN03一NTreatments图3-5培养7d后不同氮源条件下栅藻CHXl细胞内叶绿素(a+b)含量Figure3-5Chl(a+b)contentofDesmodesmussp．CHXlinthepresenceofdifferentnitrogensourcesafter7days’cultivation综合生物产量和叶绿素含量分析，在所研究的两种无机氮源中，最适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和Chl(a+b)积累的氮源为N03--N。3．3．4正交试验优化在栅藻CHXl对不同培养方式、碳源和氮源优化筛选确定的基础上，选用b(3)4正交表，以葡萄糖浓度(A)、培养基初始pH(B)、接种浓度(C)和硝酸盐浓度(D)四因素来研究适宜栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂积累的最佳培养条件组合，结果见表3．2。由表3-2可知，最大生物量产率的组合条件为A382ClD3，即葡萄糖添加浓度为5鲫、培养液初始pH=8、细胞接种浓度为10％(初始OD690=0．16)、硝酸盐浓度为3g／l；而筛选出的最大油脂产率组合条件为A283ClD2，即葡萄糖添加浓度为3g／l、培养液初始pH=10、细胞接种浓60654321O一一bIII—IIo一瓮葛8DIl8一一茸厶20—IIun浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究度为10％(初始OD690=O．16)、硝酸盐浓度为2g／l。极差分析结果表明，4个因素对栅藻CHXl生物量产率的影响顺序为：A>C>B>D，即葡萄糖添加浓度>细胞接种浓度>培养液初始pH>硝酸盐浓度；而对油脂产率的影响顺序为：A>C>D>B，即葡萄糖添加浓度>细胞接种浓度>硝酸盐浓度>培养液初始pH，具体结果见表3．3。总之，葡萄糖添加浓度对栅藻CI-IXI的生物量产率和油脂产率的影响最大，其次为接种浓度。根据上述优化条件组合，栅藻CHXI的最大生物量产率达到814．1mg／1／d，显著高于现有一些藻种生物量产率报道值，见表3．4。微藻生物量通过优化条件得以提高，只是一个手段，关键是通过条件优化能得到较高微藻高附加值物质的生产，目前，微藻用于生物柴油的生产成为研究的热点，为提高微藻资源化利用目的，本实验不仅仅从微藻生长考察栅藻CHXl的条件优化，同时也将产油脂情况作为考察指标之一。筛选出合适的藻种是保证微藻生物柴油应用的前提和基础，而考察微藻是否适合作为微藻生物柴油原料藻种的关键参数是油脂产率(Griffiths和Harrison，2009)。通过本实验优化条件组合，栅藻CHXl的最大油脂产率高达160．8mg／1／d，显著高于现有一些用作生物柴油原料的藻种油脂产率报道值，见表3．4，这表明栅藻CHXl具有作为生产生物产油原料的潜力。此外，优化后，栅藻CHXl达到最大油脂产率时的油脂含量仅为21．7％，略高于已报道的正常生长条件下栅藻(Scenedesmussp．)细胞体内油脂10．18％含量的范围(Gouvda等，2009；Mandal等，2009)，但显著低于一些特殊生长条件下栅藻(Scenedesmussp．)细胞内油脂含量31％一55．1％(Mandal等，2009；Li等，2010；Ho等，2010；袁程等，2012)。这特殊生长条件，包括逆境条件下培养(如N、P营养元素限制和高盐条件)和改变微量元素浓度(如Fe”、Mn2+)，研究较多的是N、P营养元素限制性培养来提高藻细胞油脂含量。虽然N、P源缺乏能极大增加藻细胞油脂含量，但同时因营养缺乏也会抑制藻细胞生长，从而使油脂产率降低(Mandal等，2009；Ho等，2010)。为了实现既能提高藻细胞生物产量，同时又能提高藻细胞体内油脂含量，Li等(2008)提出了微藻细胞的两步培养法，所谓的两步培养法就是将微藻生长和油脂积累分开进行，首先是将微藻细胞培养在富营养条件下，保证微藻生长所需的营养元素供应，积累微藻生物量，当藻细胞达到最大生物产量时，再将藻细胞转移至N、P等营养元素缺乏的培养液内，提高藻细胞内油脂含量，最终使藻细胞61n浙江大学博士学位论文第3章棚藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究达到最高油脂产量。可以说，两步培养法是能实现藻细胞生物产量和油脂产量均达到最大的双赢措施。基于上述事实，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在本实验中所得的油脂产率均是在富营养条件下取得，其较高的油脂产率是在其较高的生物产率的基础上获得，而并未进行逆境条件下的油脂积累，所以，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的油脂产率还存在进一步提升的空间，这更加能说明栅藻CHXl具有用作生产生物柴油原料的潜力。表3-2正交试验优化结果Table3-2L9(3)4Orthogonaltestresults表3-3正交试验优化结果分析Table3-3AnalysisofL9(3)4orthogonaltestresultsa正A-∑theamountoftargetatAib毛A_TjA／3cRiA=max{kiA)-min{kiA}n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究表34一些微藻种生物量产率和油脂产率的比较Table3-4Comparisonofbiomassandlipidproductivityinsomemicroalgalspecies3．3．5单因子试验正交试验筛选出最佳油脂产率的培养条件组合为：A283ClD2，即葡萄糖添加浓度为3g／1、培养液初始pH=lO、细胞接种浓度为10％(初始OD690=o．16)、硝酸盐浓度为2g／1。极差分析结果表明，葡萄糖添加浓度和细胞接种浓度是对栅藻CHXl油脂产率影响最大的两个因素。因此，基于正交试验基础上，对葡萄糖添加浓度和藻细胞接种浓度进一步进行单因子试验。1．最佳葡萄糖添加浓度图3-6显示的是葡萄糖浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量浓度的影响。由图3-6可知，随葡萄糖添加浓度的增加，藻细胞生物量呈先升后降的变n浙江大学博士学位论文第3章棚藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究化趋势，在葡萄糖添加量为3．0鲋时达到最大。培养3d后，在培养液中葡萄糖添加浓度分别为1．0g／1、3．0酊、5．0g／l、7．0g／1和10．0g／l时，栅藻CHXl生物量浓度分别从初始时的0．16酊左右显著增加到2．36酊、3．019／1、2．9g／l、2．44g／1和I．75酊，生物量产率分别达到737．6mg／]'／d、950．7me．／了硒、914．9m酊／d、764．6mg／1／d和536．8mg力／d。因此，适合栅藻CHXl混养生长的最佳葡萄糖浓度为3．0edL，特定生长率(GR)达到0．760／d，显著高于其他各添加浓度(见图3．7)。葡萄糖添加浓度也显著影响栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂含量，培养3d后，栅藻(Desmodesmussp．CHXI)细胞内油脂含量在13．7％％一18．7％之间，以葡萄糖浓度为lg／1时，藻细胞内油脂含量最高18．7％，显著高于其他葡萄糖添加浓度见(图3．8)。但与油脂含量变化不同，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂产率随葡萄糖浓度的升高呈先升后降再升的变化趋势，在葡萄糖添加量为3．0鲥时，达到最大油脂产率165．4mg／1／d(见图3．8)，这可能是由于藻细胞油脂产率的高低由藻细胞生物量产率和油脂含量共同决定，往往主要取决于藻细胞生物量产率(Pittrnan等，2011)，对比图3-6和图3-8，不难发现葡萄糖浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂产率的影响和葡萄糖浓度对栅藻CHXl的生物产量的影响保持一致。类似的结果在之前的研究中也有报道，如Mandal等(2009)研究了葡萄糖浓度(O．2％．2．25％，w／v)对Scenedesmusob脚UUS生物产量和油脂产量的影响，向培养液中添加葡萄糖可显著促进ScenedesmusobBquus生长，但随着添加葡萄糖浓度的增加，栅藻生物产量和油脂产量均呈先升高后下降的趋势，当添加浓度为1．5％(w／v)时，Scenedesmusob均UtlS的生物产量和油脂产量均达到最大，分别为5．11酽和585．9m胡，是不添加葡萄糖对照的10倍左右。因此，单因子筛选的适宜栅藻(Desmodesmussp，CHXl)生长及油脂产量的最佳葡萄糖浓度为3g／1。n浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXi细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究3．52．82．11．4O．70．0_0day口3day1g／13g／15g／17g／l10g／1Treatments图3-6葡萄糖浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量的影响Figure3-6EffectsofglucoseconcentrationonthebiomassconcentrationofDesmodesmussp．CHXl0．78O．5419／l39／159／l79／l109／lTreatments图3．7葡萄糖浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)比生长率的影响Figure3-7EffectsofglucoseconcentrationonthespecificgrowthrateofDesmodesmussp．CHXl^一／嚣_)IIo一巷口QQ口oQ∞叻母go一∞他硒∞O0O—p／v名on浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究200a阜10dcontentbc巨乙刁lipdproductivityb●—}工bd一+e●TC一d1．175户口△105鼍厶Co《70×巨∞厶35O19／l39／159／l79／I109／1Treatments图3-8葡萄糖浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂含量和油脂产率的影响Figure3-8EffectsofglucoseconcentrationonthelipidcontentandlipidproductivityofDesmodesmussp．CHX12．最佳接种浓度图3-9显示的是接种浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物产量的影响。由图3-9可知，随接种浓度的增加，藻细胞生物产量呈下降趋势，在接种浓度为(v／v)为5％时达到最大。培养3d后，在接种浓度分别为5％、10％、15％、20％和30％时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量产率分别达到855．2meCl／d、751．3mg／1／d、765．7mg／1／d、619．3mg／l／d和552．2mg／1／d，因此，适合栅藻CHXl混养生长的最佳藻细胞接种浓度为5％(v／v)，特定生长率(GR)达到0．905／d，显著高于其他各接种浓度(见图3．10)。接种浓度也显著影响藻细胞油脂含量，接种浓度在5％时，栅藻CHXl细胞内油脂含量最高，占细胞干重的17．3％，显著高于其他接种浓度时(见图3．11)。受藻细胞生物量产率和油脂含量的影响，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂产率在5％时达到最大，如图3．11所示，培养3d后，在接种浓度分别为5％、10％、15％、20％和30％时，栅藻CHXl油脂产率分别为148．0mg／1／d、101．4mgO／d、102．9mg／l／d、75．8mg／1／d和91．1mg／l／d。与本章之前实验结果相比，相同培养条件下，不同接种浓度下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的油脂产率和藻细胞油脂含量均低于之前实验结果值，这可能是与使6284一摹一__矗_IIoD它一A一广In浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究用的接种藻液不同有关，测定最佳接种浓度实验所用接种藻液是后培养批次的藻液，不同于之前用于正交试验和最佳葡萄糖浓度测定试验所用接种藻液，虽然初始OD690测定值相近，但藻液所处的生长期可能不同，培养3d后，导致藻细胞内油脂含量和油脂产率均低于先前实验结果值。但不管怎么说，在相同接种藻液条件下，当接种藻细胞浓度为5％(V／V，初始OD690为O．08左右)时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生物量浓度、特定生长率和油脂产率均达到最大。5％1O％15％20％30％Treatments图3-9接种浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量的影响Figure3-9EffectsofseedingcellconcentrationonthebiomassconcentrationofDesmodesmussp．CHXl1O％l5％20％Treatments672l10^I／∞v口。召-¨扛—_QQ口oQ∞∞对—IIo一∞2O8642O1lO0O^p／-名on浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究图3．10接种浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)比生长率的影响Figure3—10EffectsofseedingcellconcentrationonthespecificgrowthrateofDesmodesmussp．CHXl§、_一蕾苦8爱．鲁一960aT口lipidcontenta——|÷一囫lipidproductivity——目÷一b鱼bCT——目．_Cd5％10％15％20％30％Treatments1601289664320图3-11接种浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂含量和油脂产率的影响Figure3-11Effectsofseedingcellconcentrationonthelipidcontentandlipidproductivityof3．3．6栅藻CItXl在优化组合条件下的生长曲线从图3．12可以看出，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在500ml培养瓶内培养9天，其生长曲线为S曲线。接种后藻细胞的适应期较短，进入第2天后，直接进入对数生长期，培养液中的藻细胞浓度显著升高，至接种后第7天达到最大值4．63g／l；自接种后7天后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)进入衰亡期，培养液中的藻细胞浓度由第7天时的4．63酊下降到第9天时的4．12g／l。Pipid口r04uc_ti《～tv^暑g／l／en浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究O．1O123456Cultivationtime(days)图3．12栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在优化组合条件下的生长曲线Figure3-12GrowthcurveofDesmodesmussp．CHX1inoptimalcultivationconditions将图3．12和图2．4相比较可以看出，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在BG．11培养液接种后进入其指数生长期前要经历9天左右时长的适应期，以适应新的培养基环境；而该藻种培养在优化组合条件下只需要经历大约1天的适应期，即只有之前的1／9。另外，BG．11培养液中藻细胞浓度从适应期结束到最高需要36天左右；而优化组合条件下同一藻种只需经历大约5天。可见，在其他培养相同时，优化组合条件下培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)时的生长速率明显高于未优化前。因此，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在优化组合条件下预培养可制备种子培养液，以保证后续试验藻种的需求。3．4本章小结1．混养培养方式最利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长，而葡萄糖和N03-N分别作为碳源和氮源时，最适宜于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物产量和Chl(a+b)的积累；2．正交优化试验表明，在所测定的四个因素中，葡萄糖添加浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂产率的影响最大，其次为藻细胞初始接种浓度，筛选出最大油脂产率条件组合为：葡萄糖添加浓度为3g／l、培养液初始pH=10、细胞接种浓度为10％(初始OD690=0．16)、硝酸盐浓度为2g／l。单因子5432l^一／8v口。召叠IIou口ou∞∞时暑oIⅡn浙江大学博士学位论文第3章栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的培养条件优化研究试验进一步表明，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)获取最大生物量和油脂产率的葡萄糖添加浓度和藻细胞接种浓度分别为为3g／l和5％(V／V，初始初始OD690为0．08左右)。综上，筛选出最利于(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂产率的培养条件组合为：葡萄糖添加浓度为3酊、培养液初始pH=10、细胞接种浓度为5％(初始OD690=O．08)、硝酸盐浓度为2酊，在此培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)从适应期结束到稳定期只需5天左右，显著低于培养于正常BG．11培养液中时的36天，大大缩短了藻细胞培养时间。因此，可在优化后的培养条件下，制备栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的种子培养液。n浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXI应用于养猪废水处理的初试研究第4章栅藻(Desmodesmussp．CHXl)应用于养猪废水处理的初试研究4．1引言基于微藻培养的养猪废水处理技术是实现传统的养猪废水处理工艺向生产工艺转化的一种不错选择(Rawat等，2011)，也是保障猪场可持续发展的一种不错选择(ChesapeakeBayFoundation，2006)。然而欲实现此处理技术，找到合适的应用藻种是研究工作的前提与重点(胡洪营等，2009)，并且随着污水种类和理化性质的变化，只有特定的藻种才能实现污水的有效处理和微藻生物量的积累。本课题组从杭州市萧山区某养猪场废水处理池内分离纯化出一株微藻，经鉴定此微藻为栅藻，命名为Desmodesmussp．CHXl(见第二章)，具有较好的生长速率和油脂产率，并表现出一定的氨氮耐受性(见第三章)。为考察栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在养猪废水处理中应用的可行性，特开展本章试验研究。4．2材料与方法4．2．1微藻及预培养研究用栅藻(Desmodesmussp．CHXl)分离自杭州市萧山区某养猪场养猪废水处理池内，其他操作步骤同3．2．1。4．2．2养猪废水的收集及理化性质测定2011年5月，养猪废水取自于上述养猪场内的稳定塘。废水主要由猪粪尿和圈舍冲洗废水组成，自养殖区域直接流入猪场预设的稳定塘区域，无任何人为干预情况下，废水在稳定塘内自然生物降解处理。稳定塘区域由两个稳定塘串联组成，两塘相距1米左右，之间有一处浅沟渠连通两塘，沟渠两端预设在塘体2／3容积处，供本试验用养猪废水取自后置稳定塘内。沿稳定塘四周获取废水，将收集到的废水混合，储存于251干净的集水桶内，待废水取样完毕后，立即将集水桶送往实验室。在实验室内，从集水桶内取出部分废水转移至已灭菌处理的2．5l透明的聚四氟乙烯塑料桶内，为延缓废水理化性质随采集时间的延长而发生n浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXl应用于养猪废水处理的初试研究的变化，将聚四氟乙烯塑料桶置于4℃冰箱内储存，待用。同时量取一定量的废水，测定其基本理化性质，测定值见表4．1。表4-1试验用养猪废水的主要理化性质Table4-1Characteristicofthecollectedeffluentusedinthepresentstudy4．2．3试验设计本试验主要是为考察栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在养猪废水处理中应用的可行性，为评价其用作基于微藻培养的养猪废水处理技术中的藻种提供基础信息。养猪废水首先静置沉淀，再经0．45}tm孔径滤膜抽滤后，养猪废水进行灭菌处理(121℃，30min)，以清除其他杂菌和异养型微生物对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)性能评价的干扰。Park等(2010)考察过栅藻(Scenedesmussp．)去除养猪废水厌氧消化液中NH4+．N的情况，结果表明"-3废水中NH4+．N浓度为100ppm时，不会对栅藻(Scenedesmussp．)的生长产生抑制效应，而当NH4+-N浓度在200．500ppm时，藻细胞生长受到显著抑制，培养14d后，藻细胞密度只有NH4+-N浓度为100ppm时的70％，这表明相对较高的NH4+-N浓度会抑制微藻生长，因此，用部分养猪废水替代微藻培养液而非直接用废水培养微藻反而更能促进微藻生长(Kumar等，2010；Suneerat，2012)。用于本试验的养猪废水中NH4+-N浓度为322．9ppm，显著高于100ppm，因此，为保证栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能在养猪废水中正常生长，在以全废水作为培养液的同时，还研究了不同稀释度的养猪废水作为培养液时，栅藻CHXl生长和营养物去除情况。用去离子水对灭菌废水进行2倍(50％，v／v)、5倍稀释(20％，v／V)后，分别以全废水、2倍废水稀释液和5倍废水稀释液作为培养液，试验中对应处理名称分别为T-100％、T-20％和T-50％，同时设置BG．11培养液作为对照。吸取250ml各处理培养液置于500ml培养瓶内，将上述离心浓缩后藻种接种至各培养瓶中，使各处理瓶培养液中藻细胞初始OD690测定值在o．09左右，同时设置不接种藻n浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXI应用于养猪废水处理的初试研究液的各培养液处理瓶作为阴性对照，以考察养猪废水随培养时间的延长，其理化性质受培养条件影响的变化情况。每个处理重复3次，共计21瓶。将所有瓶子置于自制光源架上，静置培养，每天摇瓶并随机更换培养瓶位置，以避免光照不匀，光照由4根额定功率为55W的H管荧光灯管提供，温度为27士2*(2，光暗比24：0，培养时间12d。每2d取样一次，测定培养液的OD690和营养物质(NH4+-N、TP、COD)含量，以考察栅藻(Desmodesmussp．CHXl)随培养时间的变化其生长情况和对废水中营养物去除情况，取每个处理3次重复值的平均值作为报道值。4．2．4测定方法(一)栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量测定同3．2．7中生物量测定。(二)栅藻(Desmodesmussp．CHXl)比生长率测定同3．2．7中比生长率测定。(三)废水水质指标测定每2d量取一定量的培养液，测定值pH值后，再测定OD690值后，随后将培养液离心(5000rpm，lOmin)，上清液在经0．45pro孔径滤膜抽滤，滤液用于废水指标的测定，主要测定废水中氨氮(NI-14+．N)、总磷(TP)和化学需要量(COD)。测定方法依参照国家水质测定标准方法(国家环保总局，《水和废水监测分析方法》)和美国APHA方法(APHA，2008)，其中COD测定方法是重铬酸钾氧化滴定法，NH4+-N测定方法是纳氏试剂法，TP测定方法是过硫酸钾消解钼酸铵比色法。去除率的计算是基于起始时测定浓度和培养结束时测定浓度的差值与起始浓度的比值。4．2．5数据处理试验设3个重复，对测得数据进行方差分析及多重比较。所有统计均采用Excel2003和SPSS17．0软件，绘图通过Origin8．0完成。4．3结果与讨论4．3．1栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长情况图4-1显示的是栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在不同稀释度废水培养液和n浙江大学博士学位论文第4章棚藻CHXI应用于养猪废水处理的初试研究BG．11培养液中的生物量浓度变化情况。这里需要强调指出的是，图4．1中所示生物量浓度的计算是根据藻细胞OD690值与干物重之间的关系式换算而来，而藻细胞OD690值是接种栅藻CHXl培养液的OD690测定值与对应的阴性对照培养液的OD690测定值之问的差值，以扣除废水本身对OD690测定值的干扰，更能保证所得OD690值据实地反映培养液中藻细胞密度。由图4一l可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在所测试的不同培养液中均能存活并生长，但在不同培养液中，它的生长变化趋势不同。从培养起始至培养结束时，在高倍稀释养猪废水培养液(T-20％处理)中，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长快速，未出现任何生长抑制效应，生长速率显著高于在BG．11培养液中(CK处理)(P<0．05)，而在低倍稀释(T-50％处理)和无任何稀释养猪废水(T-100％处理)中，栅藻CHXl生物量均呈现先下降后上升的变化趋势，出现生长停滞期，其中在T-50％处理中，栅藻CHXl在培养4天后才开始快速生长，而在T-100％处理中，栅藻在培养6天后才出现缓慢生长。培养12d后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在CK、T-20％、T-50％和T-100％处理中的生物量浓度分别达到0．59g／1、2．39g／l、2．43g／1和0，13g／1，其中在T-20％和T-50％处理中的生物量浓度(2．39g／1和2．43g／1)显著高于CK(O．59g／1)(P<0．05)，也显著高于一般微藻培养时的生物量浓度(O．3．0．5g／1)(Wang等，2008)；栅藻CHXl在T-20％和T-50％处理中的生物量产率分别高达190．3mg／1／d和196．7mg／l／d，均显著高于CK处理的43．6mg／1／d。此外，栅藻CHXl在T-20％和T-50％处理中的比生长率分别达到0．275／d和0．279／d，高于现有栅藻报道值0．2／d(Li等，2010)。以上说明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备在不同浓度养猪废水中生长的潜力，尤其在高倍稀释后的养猪废水中，与之前的报道一致(Jimenez—Perez等，2004)。74n浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXI应用于养猪废水处理的初试研究O24681012Cultivationtime(days)图4．1栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在不同倍数稀释后养猪废水中的生长情况Figure4-1GrowthcurveofDesmodesmussp．CHX1cultivatedindifferentdilutedpiggerywastewaters4．3．2养猪废水水质变化栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在T-20％和T-50％处理中出现较高的生物量积累，说明栅藻CHXl能充分利用养猪废水中的营养物质进行生长；反之，养猪废水中的营养物质也会伴随着栅藻的快速生长而得到一定的去除。下面主要在T-20％和T-50％处理中，就栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对废水中营养物质(NI-14+．N、TP和COD)的去除情况进行分析。1．NH4．N由图4-2可知，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)并培养一段时间后，废水中的NH4+-N浓度显著降低，而在阴性对照处理中(未接种栅藻CHXl)，废水中的NH4+-N浓度基本保持不变，在后期还略有升高。培养12d后，接种栅藻CHXl的T-20％和T-50％处理中，NH4+-N浓度分别从132mg／1和56mg／1下降到4．4mg／1和1．0mg／1，大于96％的NH4+-N被去除，这一去除率显著高于现有研究的报道值(deGodos等，2009；Cheunbarm和Peerapompisal，2010)，这说明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备处理养猪废水，去除NH4+-N的潜力。废水中NH4+．N的去除可能与栅藻CHXl的直接吸收利用和NH3的间接挥发有关。10^一bvIJo召BJ芑。口IIo。∞％go一∞n浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXl应用于养猪废水处理的初试研究Park等(2010)和Lim等(2010)研究指出废水中NH4+-N可作为微藻生长的氮源，虽然过高的NH4+-N浓度会对微藻产生毒害效应，但在光照条件下，微藻可利用NH4+-N合成自身的细胞物质(He和Xue，2010o在本试验中，废水中NH4+．N变化趋势与栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长变化趋势基本吻合(见图4．1和图4-2)，这也进一步印证了废水中NI-王4+-N的去除可能被栅藻(Desmodesmussp．CHXl)吸收用于自身生长，而栅藻CHXl的生长代谢又会导致培养液pH值的升高，与阴性对照相比，在整个培养期间，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的培养液pH显著升高，均大于9．5(见图4．3)，这与之前的报道结果一致(Wang等，2010；Li等，2010；Li等，2011)。而当培养液pH>9．0时，培养液中的NH4+-N会变成NH3，直接挥发去除(Li等，2011)，这也可能是引起废水中NH4+-N被去除的间接原因之一。但具体是微藻的吸收利用对废水中NI-144-．N的去除占主要作用，还是由于NIl3挥发对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)去除养猪废水中NH4+-N贡献更大还有待进一步验证。150蔷1gao日-皇。乞)口oZ■一Z209060300O24681012Cultivationtime(days)图4-2T020％和T-50％处理下废水中Nl-h+-N浓度变化Figure4-2ChangesofNH4+-NconcentrationintheT-20％treatmentandT-50％treatmentn浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXl应用于养猪废水处理的初试研究lO．OO24681012Cultivationtime(days)图4-3"1"-20％和T-50％处理下废水中pH变化Figure4-3ChangesofpHintheT-20％treatmentandT-50％treatment2．TP由图4．4可知，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)并培养一段时间后，废水中TP浓度显著降低，而在未接种栅藻CHXl的阴性对照处理中，废水中TP浓度基本保持不变。培养12d后，T-50％处理和T-20％处理中，废水中TP浓度分别从5．67m酊和3．42mg／1下降到1．11mgn和0．83m酊，去除率为75．7％．80．4％，这一去除率略高于现有报道值(<75％)(Kebede．Westhead等，2006；Mulbry等，2008；deGodos等，2009；Cheunbarm等，2010)，这说明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备处理养猪废水，去除TP的潜力。废水中TP的去除可能是与栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的直接吸收利用和因培养液pH升高而形成磷酸盐沉淀去除有关。众所周知，P是微藻生长所必需的营养元素之一，是构成DNA、RNA、ATP和细胞膜的必需元素(Wang等，2008)。对比废水中TP变化趋势与栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长变化趋势会发现(见图4．1和图4．4)，TP的去除与微藻的生长趋势亦基本吻合，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)直接吸收利用可能是TP去除的主要原因。有研究指出微藻生长会提高培养液pH值，而当培养液pH值>8．0时，藻细胞会发生凝结而吸附无机磷酸n浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXl应用于养猪废水处理的初试研究盐离子，形成磷酸盐沉淀而去除TP(Song等，2002；Li等，2010；Li等，2011)。如图4．3所示，在整个培养期间，接种藻液的培养液pH均大于9．5，可能会引发磷酸盐沉淀或藻细胞吸附。但同时我们也发现，不接种藻液的阴性对照在整个培养期间pH也大于8．5，但阴性对照中废水TP并未被去除。因此，在本试验研究中，废水中TP的去除可能主要是由于微藻的吸收利用或吸附作用，而碱性条件下形成磷酸盐沉淀作用贡献可忽略不计。5．23．91．30．0O图4_4T-20％和T-50％处理下废水中TP浓度变化12Figure4-．4ChangesofTPconcentrationintheT-20％treatmentandT-50％treatment3．COD由图4．5可知，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)并培养一段时间后，废水中的COD浓度亦显著降低，而在未接种栅藻CHXl的阴性对照处理中，废水中的COD浓度基本保持不变。培养12d后，T-50％处理和T-20％处理中，废水中COD浓度分别从658m酊和413mg／l下降到414m酊和271m朗，去除率为35％左右，大于30％的COD去除率显著高于Cheunbarm等(2010)报道的23％，但显著低于deGodos等(2009)用高效藻类氧化塘处理养猪废水时的76％，这说明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备处理养猪废水，去除COD的潜力，但去除率不高。deGodos等(2009)报道养殖废水经藻类塘净化后，废水中76％的COD被去除主要是由藻菌共生系统共同作用的结果，而在本研究中，养猪废水在试验前已进行灭菌处理，COD的降解或去除只能靠栅藻(Desmodesmussp．^一奄III。IIo一葛口口ooIIoo山卜n浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXI应用于养猪废水处理的初试研究CHXl)的直接吸收利用，这一点在之前的研究中已得到印证，优化培养试验结果已表明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能利用有机质进行异养或混养生长，这也可能是造成养猪废水中COD降解的原因。8007003002000246810Cultivationtime(davs)图4-5T-20％和T-50％处理下废水中COD的变化情况Figure4-5ChangesofCODintheT-20％treatmentandT-50％treatment4．4本章小结12栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能在养猪废水中存活并生长，能有效去除废水中NH4+-N、TP和COD，具备应用于养猪废水处理的潜力，但在处理前，对养猪废水进行适当的稀释是保证栅藻(Desmodesmussp．CHXl)快速生长和有效去除营养物质的前提，而在现今的运作模式中，稀释是商业化应用过程中的一大限制，因此，如何降低养猪废水对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的抑制效应，寻找其他低成本的预处理方式而非稀释，有待进一步研究。^一瓷g-IIo一_譬aQoIIooQoUn浙江大学博士学位论文第4章栅藻CHXI应用于养猪废水处理的初试研究80n浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究第5章曝气对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞生长和油脂生产的影响研究5．1引言目前，大规模培养微藻生产生物柴油的研究备受关注，有关影响微藻生长和油脂积累的重要理化因子的研究也越来越多，但研究的目标多集中在少数几种因子上，如光照(欧阳峥嵘等，2010；Xue等，2011；Suneerat等，2012；Ho等，2012)、温度(Nakazawa等，2012；张桂艳等，2011)、盐度(张桂艳等，2011；Sunecrat等，2012；Nakazawa等，2012)、氮源(王顺昌等，2008；Bhola等，201l；张桂艳等，2011)、磷源(Bhola等，2011；张桂艳等，2011；Suneerat等，2012)和培养液pH(王翠等，2010；欧阳峥嵘等，2010)等。刘玉环等(2008)研究指出，为了提高光能利用率以及将细胞周围未被搅动的液膜降到最薄以促进气体交换和提高营养的有效性，高效的微藻培养系统需要藻类处于搅动混合并维持悬浮状态，而对藻培养液进行曝气是维持这种悬浮状态的一种较常用方法，只是因为曝气能够改变水体02和C02的含量组成，同时也对水体进行了搅动，从而改进了氧的传递和扩散，有助于微藻的生长，如Park等(2010)等研究指出培养过程中适当曝气后，栅藻(Scenedesmussp．)的生物量产率从未曝气处理时的66．8mg／Vd提高到曝气后的118mg／1／d。此外，为降低微藻培养成本，废水应用于微藻培养的研究越来越多，并因此而发展出一种新技术—基于微藻培养的污水处理技术。由于氮磷是藻类生长所必需的营养元素，不少研究者对利用藻细胞去除污水中的氮磷进行了一系列研究，也取得了较好的效果(Boelee等，2011；Cho等，2011；Pittman等，201l；马红芳等，2012)。但单纯利用藻类来处理污水存在一个问题，即虽然藻细胞能高效利用污水中的氮磷以供自身生长，但藻类对污水中碳源污染物的去除能力普遍较低，这样就容易导致出水的COD超标。因此，耦合微藻培养处理污水技术和其他生物处理法(如活性污泥法)或其他活性菌就成为一种新的研究趋势(邓旭等，2011；Su等，2011)，而无论是常规的生物处理技术(如好氧生物接触法、扬水曝气等)，还是生态处理技术(如氧化塘、人工湿地等)，溶解氧都是整个反n浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究应系统中最重要的控制条件之一，而溶解氧的控制往往通过人工曝气来实现(王云中等，2011)，而且曝气处理还有助于微藻去除污染物，如Park等(2010)利用栅藻(Scenedesmussp．)去除畜禽养殖废水的厌氧消化液时，增加曝气后(曝气量为o．71／min)，氨氮的去除率从未曝气时的6．3mg／1／d提高到18．4mg／Vd。因此，考察曝气对微藻生长及油脂积累的影响具有很重要的现实意义，为后续微藻的污水处理应用及微藻生物质开发都具有现实意义。栅藻(Demosdesmussp．CHXl)是本实验室筛选出的易培养、生长快、适应性强、油脂产率高的藻种，在之前的研究中，已证实其在养猪废水处理都具有较高的去除N、P潜力。在本章中，以栅藻(Demosdesmussp．CHXl)为研究对象，培养7d，初步考察了曝气及曝气量对栅藻(Demosdesmussp．CHXl)生长及总脂含量的影响，为进一步研究曝气应用于栅藻(Demosdesmussp．CHXl)处理污水过程中可行性提供基础信息。5．2材料与方法5．2．1徼藻及预培养同4．2．1。5．2．2试验装置试验装置为自制装置，主要包括充气、空气净化、培养瓶、搅拌、气体流量控制和光源等部分(见图5-1)。利用空气压缩泵导入空气(压缩泵进气口设置空气过滤器，膜孔径为0．2I_tm且具备油水分离功能)，经导流管进入气体混合箱内，充分混合后沿分流管至各处理瓶内，在分流管上安装玻璃转子流量计以控制气体流量。藻类培养瓶为2．01的广口瓶(带瓶塞)，加入培养液并接种后，旋紧瓶塞，置于磁力搅拌器上，随后一起置于自制光源架内的载物台上；自制光源架为铁架结构，长1．0mx宽O．5mx高1．5m；在距地1．0m高处设置光照装置，由8盏55WH型荧光灯管组成；在距地10crn高处设置载物台，载物台底板为银白色木板。培养瓶和磁力搅拌器放置在载物台上后，气体混合箱安置在光源架左侧，此时，培养瓶顶部距离上述光照装置为40cm，为补充两侧光照，在光源架左侧(距离培养瓶放置处10cm)再安防两根24WH型荧光灯管。测定培养装置周边光照强度分别为：底部(培养瓶底lcm处测定)：3980．4500lux，左侧：6500—6700lux；n浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究右侧：1600．2200lux。培养装置具体结构见图6-1。l27E；三=三==三=三；三；三；三；三=三=三；三；三；j1-空气压缩泵；2-空气过滤墨；3．空气混合箱；4-光源；5．气体流量计；6-藻类培养瓶；7-磁力搅拌器图5．1栅藻(Desmodesmussp．CHXl)培养结构示意图Figure5-1SchematicdiagramofthecultivationsystemforDesmodesmussp．CHXlwithdifferentaerationvolumes5．2．3试验设计向各培养瓶内加入1000mlBG．11培养液，随后将上述离心浓缩后藻种接种至各培养瓶中，使各处理瓶培养液中的藻细胞初始OD690测定值在0．2左右，旋紧瓶塞后，放置在上述装置上，开启磁力搅拌器(100rpm)。以流量计控制进入各瓶的空气流速，使气体流量分别达到161／h(约0．271／min)、40协(约0．671／min)、801／h(约1．331／min)和1601／h(约2．67I／min)，试验中对应处理名称分别为T-16、T-40、T-80和T-160，同时设置不曝气处理为对照(CK)。黄莹莹等(2008)研究指出，遮光条件下曝气能有效促进斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)和铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的消亡，衰减符合内源呼吸一衰减模型，因此，培养条件设定为温度为27士2。C，全天光照，培养7d。5．2．4取样与测定方法(一)取样每天取样一次，为避免曝气量不同可能带走的水分损失不同而影响培养液体积，进而影响测定的生物量浓度值，在取样前，向培养瓶中加入已灭菌的去离子n浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究水至1000ml，以补充曝气可能带来的水分损失，使每瓶的培养液体积相等。混合均匀后，取样，测定培养液OD690，以考察栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在不同曝气处理下的生长和油脂含量变化情况。(二)测定方法栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物量测定方法同3．2．1；栅藻(Desmodesmussp．CHXl)比生长率测定方法同3．2。1；栅藻(Desmodesmussp．CHXl)叶绿素(a+b)测定方法同3．2．7；栅藻(Desmodesmussp．CHXl)总脂含量测定方法同3．2．7。5．2．5数据分析所有的试验数据结果均采用3次重复试验的平均值，结果表示方法为：平均值士标准差。对测得数据进行方差分析及多重比较：所有统计均采用Excel2003和SPSS17．0软件，绘图通过Origin8．0完成。5．3结果与讨论5．3．1栅藻CI-IXl生长情况曝气对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长的影响见图5．2。由图5-2可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)培养液初始OD690约为O．2左右，培养1d后，曝气处理组和对照组藻细胞生物量浓度无显著差异(P>0．05)，但从第2d培养开始，各组间出现生长差异，曝气处理组藻细胞生物量浓度要显著高于对照组(P<0．05)。培养7d后，T-16、T-40、T-80和T-160处理下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生物量浓度和生物量产率分别为2．12酊、3．77酮、5．10酊、7．26酽和274．5mg／l／a、508．3mg／1／d、695．6mg／1／d和1003．6mg／1／d，显著高于CK处理下的0．47gn和39．9mg／1／d，这说明曝气处理能显著促进栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长，提高生物量产率，并且在所研究的曝气量范围内，随曝气量的增加，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生物量浓度和生物量产率，也随之显著提高，这与Park等(2010)研究结果类似，他指出曝气使栅藻(Scenedesmussp．)的生物产量从66．8mg／1／d显著提高到118mg／1／d。曝气显著促进微藻生长可能与曝气处理能增强培养液中溶解氧(DO)的去除有关。一般而言，微藻能利用光合作用产生氧气，但过高的溶解氧浓度又会反馈抑制微藻的光合作用过程，n浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的影响研究如Park等(2010)指出在单独分离试验中，培养液起始DO浓度为0．76mg／1，未加光照时培养栅藻(Scenedesmussp．)，培养液中DO浓度并未发生显著变化；而添加光照后，未曝气条件下培养栅藻(Scenedesmussp．)18min后，培养液DO浓度迅速升高至6．2m酊，35min后升高至10mg／1，60min后升高至15．5mg／1，而在曝气条件下，栅藻(Scenedesmussp．)培养液中DO浓度一直维持在6．2mg／1左右，达到饱和浓度，因此，研究者进一步指出适当的曝气有助于降低培养液中DO浓度，提高微藻的生物产量。类似现象在在本研究中也被观察到(见图5．3)。由图5．3可知，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)培养液初始溶解氧(DO)浓度为7．70mg／1左右，CK处理中，随培养过程的进行、微藻生物量的增加，培养液中的DO浓度显著升高，培养7d后，培养液中DO浓度最高达到16．8mg／1，而在曝气各处理组中，培养液中DO浓度在培养初期略有增加，但随后的培养时间内基本维持在9．0mg／1左右，达到了培养液的饱和浓度。O1234567Cultivationtime(days)图5-2不同曝气量处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长情况Figure5-2GrowthCuFvesofDesmodesmussp．CHXlunderdifferentcultivationconditions643l^一／8vIIo翟对扫口Q。口o。∞∞四IIIoIan浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究181686Ul23456，Cultivationtime(days)图5．3不同曝气量处理下培养液中DO浓度变化Figure5-3ChangesofDOconcentrationinthemediumunderdifferentcultivationconditions5．3．2藻细胞Chl(a+b)含量叶绿素含量的高低是描述微藻将无机营养物质转变为有机物质能力的一个重要指标，更能反映微藻对培养液中有机物等营养元素的利用程度(周文礼等，2009)。很多研究以微藻体内叶绿素含量高低作为衡量微藻生长情况的重要指标，尤其是叶绿素a是所有藻类都含有的叶绿素类型，其含量多用于表征浮游植物的现存量(刘波等，2008；朱义平等，2012；胡雪芹等，2012)。曝气对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内Chl(a+b)含量的影响见图5．4。由图5．4可知，与对照组相比，曝气处理显著增加培养液中Chl(a+b)含量，且随着曝气量的增加而显著增加(P<0．05)。培养7d后，T-16、T-40、T-80和T-160各处理中，培养液中Chl(a+b)浓度分别达到16．2m朗、29．0mg／1、37．3mg／1和60．5mg／l，显著高于CK处理下的2．81mg／l(P<0．05)。对比观察培养液中Chl(a+b)浓度变化和藻细胞生物量浓度变化趋势，会发现二者之间具有很好的吻合性，相关分析结果也表明培养液中Chl(a+b)浓度与藻细胞生物量浓度呈现显著的正相关关系，相关系数F=O．996，这说明培养液中叶绿素浓度也能很好的反映培养液中现存藻细胞密度，与之前的报道结果一致(胡雪芹等，2012)。曝气处理不仅仅提高了培养液中Chl(a+b)浓度，更重要的是提高了单位藻细^一瓷g_)IIo一—置luDoIIoooQn浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXI细胞生长和油脂生产的影响研究胞Chl(a+b)产量，曝气处理组藻细胞Chl(a+b)平均产量为7．75mg／g(范围是7．32．8．36mg／g)，显著高于对照组的5．97mg／g(藻细胞干重计)，进一步说明曝气处理能显著增加藻细胞体内叶绿素(Chl(a+b))含量，增强藻细胞的光合作用强度和将无机营养物质转变为有机物质的能力。藻细胞内Chl(a+b)含量增加可能是因为在光照条件下，曝气处理能带入一定量的C02，而适当的提高培养液中c02浓度可诱导藻细胞光合色素(Chla)含量的升高(LV等，2010)。由图5．4可见，培养7d后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内Chla为藻细胞叶绿素的主要组成成分，占Chl(a+b)含量的75％左右，这与之前测定栅藻(Desmodesmussp．CHXl)理化性质时的测定值78％左右相近，且随着曝气量的增加，Chla含量也显著增加，这可能是导致曝气条件下培养液中叶绿素浓度增加且随着曝气量增加而增加的主要原因。当然，藻细胞Chla含量还受到其他环境因子的影响，如吴阿娜等(2011)研究指出Chla含量与水体中水温、溶解氧、pH等呈正相关。在本研究中，培养体系温度设定为27士2"C，在培养期间，培养液温度通过磁力搅拌器进行恒温维持，温度基本保持不变，这一影响因素可排除。而培养液DO、pH变化也与叶绿素a含量变化不符，具体见图5．3、图5．5。因此，藻细胞内Chla含量的增加可能原因就是曝气向培养液中带入了一定量的C02，光照条件下诱导了其合成，且随着曝气量增加，带入培养液中的C02量会增加，此时，藻细胞体内Chla含量也随之增加，进一步说明Chla含量与培养液中C02浓度之间存在一定的正相关关系，这也为强化栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和物质积累的研究提供了一个方向，如何提高培养液中C02浓度。n浙江大学博士学位论文第5章曝气对栅藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究7056422814OCKT．16T．40T一80T·160Treatments图5-4不同曝气量处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞培养液内叶绿素(a+b)含量Figure6-4Chlorophyll(a+b)concentrationofthemediumforcultivationDesmodesmussp．12．011．210．4墨△9．68．88．0CHX1underdifferentcultivationconditionsO234567Cultivationtime(days)图5—5不同曝气量处理下培养液pH变化Figure6-5ChangesofmediumpHunderdifferentcultivationconditions88^一瓷g-g一苗扫8QIIoo一一净I：lQoJo一工Un浙江大学博士学位论文第5章曝气对棚藻CHXl细胞生长和油脂生产的影响研究5J．3藻细胞油脂含量和产率曝气对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内油脂含量和油脂产率的影响见图5-6。由图5-6可知，曝气处理显著增加栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内油脂含量，随曝气量增加，藻细胞体内油脂含量呈先降后升趋势。培养7d后，T-16、T-40、T-80和T-160各处理下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内油脂含量分别为11．9％、9．44％、11．4％和12．8％，显著高于CK处理下的8．54％(P<0．05)。与油脂含量变化趋势不同，随曝气量的增加，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂产率随之显著增加，培养7d后，T-16、T-40、T-80和T-160各处理下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的油脂产率分别为32．7mg／Vd、48．0mg／Vd、79．0megVd和128．7meCVd，显著高于对照组的3．33mgrl／d(P0．05)。培养8天后，藻细胞内TP含量也显著增加，从起始时的0．33mg／l(g显著增加培养结束时的0．79mg／kg(数据未列出)，这也可能是导致藻细胞在养猪废水中培养后，废水内TP显著降低的主要原因。100500InOculUmPWTreatments图6．3栅藻CHXl在养猪废水中混养培养前后藻细胞体内C、N、H含量Figure6-3Carbon，NitrogenandHydrogencontentofDesmodesmussp．CHX1beforeandaftermixotrophiccultivationinpretreatedpiggerywastewater98oooIl^o譬^^装√们如加∞8642一摹-菪Q备op王{JOZn浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXI细胞生长和净化养猪废水性能的研究2．粗蛋白和氨基酸含量混养培养对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内粗蛋白及氨基酸含量的影响见表6-2。由表6．2可知，混养培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内粗蛋白含量显著增加，由接种时的49．3％增加到培养结束时的59．7％(P<0．05)，这一值略高于已报道的可用作饲料的斜生栅藻54．3％N粗蛋白含量(曹吉祥等，1997)。粗蛋白含量的增加，也表明了构成蛋白质的氨基酸含量的显著增加。这里需要指出的是因为微藻生物量的关系，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内的氨基酸组成未测定，因此，借助之前氨基酸测定数据(见2．3．6)作为本研究中接种栅藻CHXl细胞内氨基酸含量数据而进行后续分析。由表6-2可知，培养8天后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内氨基酸总量显著增加，由培养初期的198．4p∥g显著增加到培养结束时的315．9p∥g。在所测定的16种氨基酸成分中，混养培养并未改变栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内主要氨基酸的构成，但均显著增加了各氨基酸含量，尤其是7种人体必需氨酸酸含量(P<0．05)，总必需氨基酸含量也由培养初期的59．31“g儋显著增加到培养结束时的96．45“g儋，必需氨基酸占氨基酸总量(EAA／TAA，E／T)由培养初期的29．9％增加到30．5％，必需氨基酸与非必需氨基酸(EAA／NEAA，E／N)比值也由原来的42．6％增加到44％。虽然混养培养后栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内必需氨基酸指数仍低于世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)提出的蛋白质中EAA／TAA应大于40％、EAA／NEAA应大于60％1均参考值，但研究者发现用相较于BG．1l培养液，养猪废水中混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)后藻细胞内氨基酸含量均能得到显著增加，强化了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)用于替代部分蛋白饲料和降低养猪场饲料成本的潜力。n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXl细胞生长和净化养猪废水性能的研究表6-2栅藻CHXl在养猪废水中混养培养前后藻细胞内粗蛋白和氨基酸含量Table6-2CrudeproteincontentandAminoacidprofileofDesmodesmussp．CHXlbeforeandaftermixotrophiccultivationinpretreatedpiggerywastewater1色氨酸和脯氨酸未测，“”’表示人体必需氨基酸。Note：‘‘1’’and^indicatesnodetectionofTrpandProandEssentialAminoAcid(EAA)．respectively．3．总脂含量和脂肪酸组成在先前的研究中已经表明，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在正交优化BG．11培养基中具有较快的生长速率和较高的油脂产量，分别达到741．0mg／1／d和160．8mg／1／d(油脂含量21．7％)，显著高于现有报道的一些富油微藻的生物量产率和油脂产率(Chinnasamy等，2010；Ho等，2010；Yoo等，2010；Zhou等，2011)，表明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具有作为生产生物柴油原料的潜力。而在之前的栅藻(Desmodesmussp。CHXl)净化养猪废水的初试研究中，因最后获得的微藻生物量较低，未能测定培养后栅藻CHXl体内油脂含量和油脂产率，为全面评价基于微藻培养的养猪废水处理技术留下了不足。因此，在本次试验研究中测定了混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)于预处理后养猪废水后，栅藻CHXl细胞内油脂含量和油脂产率，重点比较了不同处理对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂含量和油脂产率的影响。不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内油脂含量及油脂产率结果见图6．4。由图6-4可知，与T1处理相比，用不灭菌养猪废水(T2处理和T3处理)培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能显著100n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXI细胞生长和净化养猪废水性能的研究增加其细胞内油脂含量，培养8天后，T1、T2和T3处理下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内油脂含量分别为9．9％、14．5％和15．2％，混养培养(T3处理)条件下更利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)油脂的积累，与之前的研究一致，在第四章中本研究已指出曝气条件下能促进栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内油脂的积累，此外，Hu等(2012)研究也指出添加5％C02比添加1％C02更能促进微藻(Auxenochlorellaprotothecoides)的生物量和油脂积累，这可能与C02的加入增加了培养液中栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的有效碳源量，从而增加了其细胞吸收转化和利用效率，促进了细胞内油脂的积累有关。培养8天后，混养培养(T3处理)条件下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的油脂产率最高(132．1mg／1／d)显著高于T2处理(55．3mg／1／d)和T1处理(21．9mg／VdXP<0．05)，藻细胞的油脂产率受油脂含量和生物量产率的双重决定，T3处理条件下较高的生物量产率(869．0mg／1／d)和油脂含量(15．2％)是造成油脂产率高的直接原因。混养培养条件下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的油脂产率(132．1m酊／d)要显著高于现有一些富油微藻报道值(Zhou等，2010；Li等，2011；Hu等，2012)，这表明在养猪废水中混养培养所得栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备生产生物柴油的潜力，也为混养培养在基于微藻培养的养猪废水处理技术中应用打下基础，尽管这一油脂产率要低于正交优化实验获得的栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞油脂产率(160．8m酊／d)，这主要是与细胞内油脂含量不同有关，优化试验中栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内油脂含量为(21．8％)。当然，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内油脂含量可进一步通过一些逆境条件培养，如N、P等营养盐限制和添加微量元素浓度(如Fe3+、Mn2+)(Mandal等，2009；“等，2010；Ho等，2010；袁程等，2012)，来得到提高，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在获得较高生物量产率后，还具有进一步提高油脂含量的潜力。101n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXI细胞生长和净化养猪废水性能的研究9060300InoculumTlI’2lr3Treatments图64不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内油脂含量及油脂产率Figure6-4LipidcontentandlipidproductivityofDesmodesmussp．CHX1beforeandaftercultivationunderdifferentcultivationconditions进一步比较了接种栅藻CHXl和混养培养在养猪废水中的栅藻CHXl细胞内脂肪酸组成成分，结果见表6．3。由表6．3可知，在养猪废水内混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)改变了藻细胞内脂肪酸成分组成，显著增加了C16．C18成分的比例，由接种时藻细胞内的80．98％增加到培养结束时的83．11％，Miao等(2007)指出微藻细胞内脂肪酸成分中以C16．C18成分最适合用于制备生物柴油(Zhou等，2011)。综上说明，在养猪废水内混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)不仅能显著提高微藻的油脂含量和油脂产率，而且还能显著增加细胞内C16．C18脂肪酸含量，更加强化了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备用作制备微藻生物柴油原料的潜力。Lipi厶口r04二o^iV～t、r^富g／一／d’)8529630●ltl●I爹Q装_)菪D葛oupIdI—n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXI细胞生长和净化养猪废水性能的研究表6．3栅藻CHXl在养猪废水中混养培养前后藻细胞内粗蛋白和氨基酸含量Table6-3LipidprofileofDesmodesmussp．CHX1beforeandaftermixotrophiccultivationinpretreatedpiggerywastewater脂肪酸类型脂肪酸占总脂肪酸百分比(％)InoculumPW6．3．4废水水质变化1．TN和NH4+．N不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中NH4+-N和TN的去除情况见图6．5(a)和图6-5(b)。由图6-5(a)可知，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)并培养一段时间后，不同处理下废水中NH4+-N浓度均显著降低，培养8天后，T1、T2和T3处理中NH4+-N去除率在97．3％．99．6％，其中T1处理条件下，废水中NI-14+-N浓度从培养起始时的66．6mg／1下降到培养结束时的0．3rag／1，去除率为99．6％；T2处理条件下，NH4+-N浓度从培养起始时的102．9rag／1下降到培养结束时的0．86m酊，去除率为99．2％；T3处理条件下，NH4+-N浓度从培养起始时的109．3mg／1下降到培养结束时的2．97mg／1，去除率为97．3％。栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中NH4+-N的去除率与Wang等(2010)报道的NH4+-N去除率(100％去除)相近，但显著大于其他报道值(22．7％．93．9％)n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXl细胞生长和净化养猪废水性能的研究(deGodos等，2009；Cheunbarm等，2010；郑子英等，2011；Wang等，2011；Li等，2011)。T1、T2和T3三者间相比，用灭菌后养猪废水(T1)培养微藻时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对NH4+．N的去除率最高，而混养培养时NH4+-N的去除率最低，这可能与NH4+．N的去除机制不同有关。很多研究表明，培养微藻能升高培养液的pH，而当pH>9．0时，NH4+．N就易转化成NH3而挥发去除(Wang等，2010；Li等，2011；Li等，2010)，而微藻对废水中NH4+-N的直接吸收利用和NH3挥发被认为是微藻去除废水中NH4+-N的主要途径。由图6．5(a)可知，在未接种栅藻(Desmodesmussp．CHXI)的T1阴性对照处理中(T1一CK)，培养8d后，无菌废水中NH4+．N的去除率为50．3％，这可能主要是由于NH3挥发作用所致，因为在培养过程中，培养液pH>9．0(见图7-6)；而T2．CK处理条件下，废水中NH4+-N的去除率为60．1％，大于T1．CK处理时的50．3％，在培养期间，T2．CK处理培养液pH与T1．CK处理培养液pH间无显著差异(见图6-6)，因此，T2．CK处理中NH4+-N的去除可能主要是与NH3的挥发和废水中土著茵的吸收利用有关。在T3．CK处理中，培养8天后，废水中的NH4+．N去除率要显著低于TI．CK和T2．CK处理中，仅为15．5％，这可能是由于C02的添加导致培养液pH的下降，在整个培养期间，T3．CK处理培养液pH<7．0(见图6-6)，不能发生NH3挥发作用，NH4+-N去除的主要是与废水中土著菌的吸收利用有关。因此，综上可知，T1、T2和T3处理中NH4+-N的去除机制不同可能是引起三者之间NH4+．N去除率不同的原因，其中T1和T2处理中NH4+-N的去除主要是由于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的直接吸收利用和NH3挥发作用所致，而T3处理中NH4+-N的去除主要是由于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的直接吸收利用，导致栅藻CHXl细胞内N含量的增加(见图6．3)。作为废水中TN的主要组成部分，废水中的NH4+-N去除是导致TN去除的直接原因，T1、T2和T3处理中，TN的去除率分别达到80．5％、84．7％和87．9％(见图6．5(b))，混养培养条件下，土著茵对TN中其他形态N的进一步吸收利用也可能是导致其TN去除率高的原因。因此，在养猪废水中混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能增强微藻对养猪废水中NH4+．N和TN的去除。n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXl细胞生长和净化养猪废水性能的研究1111珏卫础BBQ(TIemmls11110(卫础B旅Tmmms图6-5不同处理下栅藻CHXl对废水中NH4+-N(a)和TN(b)的去除情况Figure6-5Removalof(a)ammoniumnitrogenandCo)totalnitrogenwhenthecultivationofDesmodesmussp．CHX1inpretreatedwastewaterunderdifferentcultivationconditions1210暑98762．TP02468Cultivationtime(days)图6-6不同处理下废水pH的变化Figure6-6ChangesofmediapHunderdifferentcultivationconditions不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中TP的去除情况见图6-7。由图6—7可知，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)并培养一段时间后，不同处理下废水中TP浓度均显著降低，培养8天后，T1、T2和T3处理中，TP105一一b暑一口oI_盘_c8口oQz～|{Zn浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXI细胞生长和净化养猪废水性能的研究去除率在47．6％．93．2％，其中T1处理条件下，废水中TP浓度从培养起始时的5．31rag／1下降到培养结束时的2．78mga，去除率为47．6％；T2处理条件下，TP浓度从培养起始时的8．39mg,q下降到培养结束时的3．83m酊，去除率为54．3％；T3处理条件下，TP浓度从培养起始时的8．53mga下降到培养结束时的0．58mga，去除率为93．2％。混养培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中TP的去除率达93．2％，显著大于其他报道的<10％．80．9％(deGodos等，2009；Wang等，2011；Wang等，2011；Li等，2011oT1、T2和T3三者间相比，混养培养时，TP的去除率最高，而用灭菌后养猪废水(T1)培养微藻时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对TP的去除率最低，这可能是与微藻生物产量不同有关。很多研究表明，微藻对废水中TP的去除与微藻的直接吸收利用和碱性条件下形成磷酸盐沉淀有关(Li等，2011；Wang等，2011；Wang等，2011)，而在本研究中，TP的去除主要是由于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的直接吸收利用。由图6．7可知，在未接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的T1阴性对照处理中(T1．CK)，培养8d后，TP的去除率仅为10．1％，这主要是由于培养液pH>9．0(见图6-6)而形成磷酸盐沉淀所致；T2．CK处理条件下，废水中TP的去除率为11．2％，略高于T1．CK，在培养期间，T2．CK处理培养液pH与T1．CK处理培养液pH间无显著差异(P>0．05)(见图6-6)，因此，T2．CK处理中，TP的去除可能主要是与磷酸盐沉淀和废水中土著菌的吸收利用有关。而在T3．CK处理中，培养8天后，废水中TP去除率要显著低于T1．CK和T2．CK处理中，仅为6．07％，在整个培养期间，由于C02的添加导致培养液pH的下降，T3．CK处理培养液pH<7．0(见图7-6)，不能发生磷酸盐沉淀作用，TP去除可能是与废水中土著菌吸磷作用有关，尤其在曝气或反应体系中DO含量升高的情况下废水中存在的菌群对磷的吸收作用也会随之加强(郑燕清等，2007；荣宏伟等，2008；任健等，2011o栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中TP的吸收利用是导致废水中TP含量显著降低的主要原因，也是造成栅藻CHXl体内P含量增加的原因(见6．3．3中无机元素含量分析)，而混养培养条件下(T3处理)，较高的栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物产量(见图6．2)是引起微藻对废水中TP的吸收利用量较大，从而使T3处理中TP的去除率显著高于Tl和T2处理中TP的去除率的原因。因此，在养猪废水中混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXl细胞生长和净化养猪废水性能的研究能增强微藻对养猪废水中TP的去除。1086420T1T1．CKT2T2．CKT3T3．CKTreatments图6-7不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对废水中TP的去除情况Figure6-7RemovaloftotalphosphoruswhenthecultivationofDesmodesmussp．CHX1in3．CODpretreateAwastewaterunderdifferentcultivationconditions不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中COD的去除情况见图6．8。由图6．8可知，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)并培养一段时间后，不同处理下废水中的COD均得到一定量的去除，培养8天后，Tl、T2和T3处理中，COD去除率在10．O％．41．8％，其中T1处理条件下，废水中COD浓度从培养起始时的1796．9mg／1下降到培养结束时的1607．7mg／1，去除率为10．o％；T2处理条件下，COD浓度从培养起始时的1698．5mg／1下降到培养结束时的1372．3mg／l，去除率为19．2％；T3处理条件下，COD浓度从培养起始时的1624．6mg／1下降到培养结束时的945．1mg／1，去除率为41．8％。栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中COD的去除率与Wang等(2011)报道的(27．4％．38．4％)相当，但显著低于现有其他报道值(70％．90％)(deGodos等，2009；Wang等，2011；Li等，201l；郑子英等，2011)。T1、T2和T3三者问相比，混养培养时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对废水中COD的去除率最高，而用灭菌后养猪废水(T1)培养微藻时，COD的去除率最低。养猪废水中COD的去除可能与栅藻(Desmodesmussp．CHXl)和废水中土著菌的吸收利用有关。之前的研究107^_瓷g-口。留鐾口。譬Ioo厶卜n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXI细胞生长和净化养猪废水性能的研究已表明，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能利用有机碳源进行异养生长，但在光照条件下对废水中COD的去除率较低(<16％．37．1％)。由图6．8可知，在未接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的T1阴性对照处理中(T1．CK)，培养8d后，无菌废水中COD不降反升；T2．CK处理条件下，废水中COD的去除率为2．5％，主要是与废水中土著菌的吸收利用有关；而在T3．CK处理中，培养8天后，废水中的COD去除率要显著高于T1．CK和T2．CK处理中，为15．9％，这可能是由于曝气条件下增强了废水中土著菌活性，在增加对磷吸收的同时也增加了对COD的降解(任健等，2011)。因此，在养猪废水中混养培养栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能增强微藻对养猪废水中COD的去除。24002000600200800400OIl1．CK12lZ-CKl3l3-CKTreatments图6-8不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对废水中COD的去除情况Figure6-8RemovalofchemicaloxygendemandwhenthecultivationofDesmodesmussp．CHXlinpretreatedwastewaterunderdifferentcultivationconditions4．Cu和Zn培养8d后，不同处理下养猪废水中Cu2+、Zn2+浓度见图6-9。与阴性对照相比，接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)后的养猪废水中Cu2+、Zn2+V舍量均显著降低，这表明栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中重金属cu2+、Zn2+具有一定的去除作用，这与之前的研究报道一致(Deng等，2008；邱廷省等，2009；Ji等，2012)，如Ji等(2012)研究了淡水绿藻(Cladophorafracta)对市政废水中cu2+、zn2+的吸附去除效果，结果表明，在培养温度为18"C，培养液^罨III-IIo召尝8QgoQOUn浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXl细胞生长和净化养猪废水性能的研究pH=5．0时，Cladophoraf,'acta对ct?+的吸附去除效率要显著高于zn2+，培养12天后，Cu2+、zn2+离子的去除率分别达到99％和85％。藻类对不同重金属的去除率不完全相同，表明其对重金属富集存在特异性，可能与细胞内产生不同的重金属结合体有关(浩云涛等，2001)。而在本试验中，假定在整个培养期间，阴性对照中废水中Cu2+、Zn2+浓度未发生变化，以阴性对照的废水中Cu2+、zn2+离子浓度作为接种栅藻(Desmodesmussp．CHXl)处理的养猪废水中Cu2+、Zn2+离子的起始浓度，则可知栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中的zn2+去除率要显著高于cu2+(见表6．4)。微藻对重金属离子的去除主要是与藻细胞的生物吸附作用有关(Ji等，2012)，而生物吸附过程可分为两步：第一步是不依赖于新陈代谢的被动物理吸附，为快速吸附阶段，在此过程中，金属离子可以通过配位、螯合、离子交换及微沉淀等作用中的一种或几种机制将重金属转运至细胞表面；第二步是依赖于新陈代谢的主动运输过程，为慢速吸附阶段，在该阶段金属被运送到细胞内。栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的主动吸收可能是导致养猪废水中Cu2+、Zn2+离子浓度降低的主要原因，这是因为与接种藻体相比，培养结束后所收获藻体内的Cu2+、Zn2+含量显著增加(见图6．10)。藻细胞生物吸附过程受外界环境条件影响，如藻细胞浓度、培养液pH、培养温度等(Deng等，2006；邱廷省等，2009；陈林等，2009)，这可能是导致T1、T2和T3处理间Cu2+、Zn2+离子去除率不同的原因。在碱性条件下，Zn2+易与OH。离子结合形成氢氧化物沉淀而降低培养液中zn2+离子浓度，而在吸附过程中，培养液中含有的H+会参与吸附位点的竞争，一些络合基团与H+结合也会引起导致zn2+的吸附效率下降(邱廷省等，2009)，而且H+存在的酸性条件也会引起藻体表面吸附的金属离子解吸过程的发生(Deng等，2008)。本试验研究中，在整个培养期间，c02加入导致T3处理中的培养液pH<7，而T1和T2处理培养液pH>9，因此，T1和T2中Zn2+氢氧化物沉淀的形成和T3处理中H+对Zn2+吸附位点的竞争和zn2+离子的解吸可能是导致T3处理废水中Zn2+离子残留浓度较高而去除率低的原因。栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对Cu2+的生物吸附也受培养液pH的影响，但受影响程度不如Zn2+强，这是因为T3处理中藻细胞cu2+离子浓度(152．9mg／kg)要显著低于T1处理时(276．5m班g)和T2处理时的(242．3mgkg-1)，约相当于Tl和T2处理藻细胞中cu2+浓度的55％．63％，而T3处理中藻细胞Zn2+n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化棚藻CHXI细胞生长和净化养猪废水性能的研究离子浓度(794．1mg／l【g)仅约占T1处理时Zn2+离子浓度(1736．7mg／kg)和T2处理时的Zn2+离子浓度(1427．4mg／kg)的45％．55％(见图6．10)，而较高的藻细胞密度可能是导致T3处理中废水中Cu2+离子残留含量低于T1和T2处理，而去除率高于T1和T2处理的原因。目前用藻体死细胞作为生物吸附剂去除废水中重金属离子的研究较多，丙用活体藻直接吸附去除重金属离子的研究较少(Ji等，2012)，虽然Deng等(2006，2008)研究指出藻体死细胞对金属离子的吸附能力强于活体细胞，但死体藻细胞在吸附重金属离子后容易下沉，导致底物中重金属含量的增加，而活体藻细胞则能克服此缺点，随藻体的收获而移出重金属(Ji等，2012)。本研究表明，活体栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对废水中重金属Cu2+、Zn2+离子具有较好的吸附去除效果，且栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞呈现出对Cu2+、Zn2+离子较强的吸收富集效果，更进一步证明了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)应用于净化养猪废水的潜力，且混养条件下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对废水中Cu2+的去除效率显著增强。oe0oa．2窭甚QCoQjU400300200lOO20080400Njojo=等∞皇o=，．、C畸≥T1T1．CKT2T2．CKT3T3-CK—Treatments图6-9培养8d后不同处理下养猪废水中Cu2+和zn2+浓度Figure6-9CuandZnconcentrationsinthepiggerywastewaterafter8days’cultivationunderdifferentcultivationconditionsn浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXl细胞生长和净化养猪废水性能的研究表6-4不同处理下栅藻(Desmodesmussp．CHXl)对养猪废水中Cu2+和Zn2+的去除效率Table6-4RemovalratesofCu2+andZn2+aftercultivationofDesmodesmussp．CHX1inthepretreatedpiggerywastewaterunderdifferentcultivationconditions∞_∞g、_一口旦二oQjU0TlT2T3800400ON=o=寄=^暑∞一们图6．10不同处理下培养前和培养后栅藻(Desmodesmussp．CHXl)体内中Cu和Zn含量Figure6-10CuandZncontentsofDesmodesmussp．CHXlbeforeandaftercultivationunderdifferentcultivationconditions6．4本章小结直接空气吹脱可以作为一种简单有效的预处理方法应用于基于微藻培养的养猪废水处理技术体系中，以降低养猪废水中过高氨氮对微藻的生长抑制作用；在养猪废水中混养培养藻菌共生系统时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生物产量和细胞内N、P含量、油脂含量及C16．C18脂肪酸成分和粗蛋白含量及氨基酸含量均得到显著提高，对于微藻而言，混养培养模式利于栅藻的生长和物质积O勰射H7n浙江大学博士学位论文第6章混养培养强化栅藻CHXI细脆生长和净化养猪废水性能的研究累；而对于净化养猪废水效果而言，混养培养条件能显著提高废水中NI-14+-N、TN、TP和COD等营养物质的去除和降低废水中Cu、Zn重金属含量，元素流分析表明，栅藻对N、P的直接吸收利用是引起废水中N、P去除的主要原因，而对cu、Zn离子的富集、吸附是导致废水中cu、Zn浓度下降的主要驱动因素。因此，混养培养具有强化栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长及净化养猪废水性能的作用，可应用于基于微藻培养的养猪废水处理技术中，在实现废水处理工艺由处理工艺向生产工艺的转化中具有重要的实践意义。但也必须指出，混养培养废藻菌共生系统时，较低的COD去除率并不能满足现有污水排放标准，如何进一步提高藻菌共生系统对COD的去除，实现COD显著减少和生物产量保持之间均能达到平衡的一种处理方式，还有待进一步研究。n浙江大学博士学位论文第7章主要结论和研究展望7．1主要结论本研究主要围绕微藻的分离培养及其在养猪废水处理中应用的基础条件进行了探讨，为构建基于微藻培养的养猪废水处理技术体系提供基础信息，主要研究了微藻的分离鉴定及其理化性质、微藻培养条件的优化、微藻处理养猪废水的可行性及强化微藻处理养猪废水的条件等方面。主要结论如下：7．1．1一株微藻的分离鉴定及其理化性质测定1．从养猪废水处理池内分离纯化一株优势微藻，借助形态学和分子生物学手段，鉴定此微藻为栅藻，命名为Desmodesmussp．CHXl。纯化藻株已提交至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏受理号：CGMCCNo．6649)，测序所得18SrDNA部分序列已提交至Genebank(登录号：JX255841)。2．栅藻(Desmodesmussp．CHXl)最佳光密度值为OD690，但OD690测定值不易超过O．7，在此测定范围内，光密度值与藻体干重间呈线性正相关关系(霞=O．9942)；正常培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)在BG．11培养液中生长45天后达到生长稳定期，最高浓度达4．54g／1。3．栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内C、N、H和Zn含量分别为45．7％、7．13％、7．90％和79．7mg／kg，Cu含量低于最低检测浓度；藻体总叶绿素含量为4．92mg／1，其中叶绿素a占总叶绿素含量的78．5％，类胡萝卜素含量为1．67mg／1；藻细胞总脂含量为12．1％．14．6％，脂肪酸成分中以C16．C18含量为主，占总脂肪酸含量的70．7％，适合作为生物柴油生产原料；藻体粗蛋白含量为49．3％，在所测定的16种氨基酸成分中含有人体所必需的7种氨基酸，其中天冬氨酸含量最高，达27．2mg／g，总氨基酸含量为198．4mg／g，其中总必需氨基酸含量为59．31mg／g，占总氨基酸含量的29．9％，可作为养猪场部分蛋白饲料的替代品。7．1．2栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞生长和油脂积累培养条件优化研究1．混养培养方式最利于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长，而葡萄糖和n浙江大学博士学位论文第7章主要结论和研究展望N03一N分别作为碳源和氮源时，最适宜于栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生物产量和Chl(a+b)的积累；2．正交优化试验表明，在所测定的四个因素中，葡萄糖添加浓度对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂产率的影响最大，其次为藻细胞初始接种浓度，筛选出最大油脂产率条件组合为：葡萄糖添加浓度为3酽、培养液初始pH=lO、细胞接种浓度为10％(初始OD690=o。16)、硝酸盐浓度为2g／l。单因子试验进一步表明，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)获取最大生物量和油脂产率的葡萄糖添加浓度和藻细胞接种浓度分别为为3g／l和5％(V／v，初始初始OD690为0．08左右)。综上，筛选出最利于(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂产率的培养条件组合为：葡萄糖添加浓度为3酊、培养液初始pH--10、细胞接种浓度为5％(初始OD690=o．08)、硝酸盐浓度为2矾，在此培养条件下，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)从适应期结束到稳定期需要只需5天左右，显著低于培养于正常BG．11培养液中对的36天，大大缩短了藻细胞培养时闻。因此，可在优化后的培养条件下，制备栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的种子培养液。7．1．3栅藻(DesmodesmussixCHXl)应用于养猪废水处理中的初试研究栅藻(Desmodesmussp．CHXl)能在适度稀释的灭菌后养猪废水中存活并生长，培养12天后，最大生物量产率和比生长率分别为196．7me2／d和0．279／d，对N盯-N、．TP和COD的最大去除率分别为98．2％、80．4％和37．1％。因此，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备应用于养猪废水处理的潜力，但在处理前，对养猪废水进行适当的稀释是保证栅藻(Desmodesmussp．CHXl)快速生长和有效去除营养物质的前提，而在现今的运作模式中，稀释是商业化应用过程中的一大限制，因此，降低养猪废水对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的抑制效应，寻找其他低成本的预处理方式以强化其商业化应用的可行性。7．1．4曝气对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和油脂积累影响的研究曝气能显著增加栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的生物产量、Chl(a+b)含量和油脂产量，且在所研究的范围内(16．160l／h)，随曝气量的增加而上述指n浙江大学博士学位论文第7章主要结论和研究展望标均显著增加，培养7天后，在曝气量为1601／h时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞的生物量浓度、Chl(a+b)含量和油脂产率分别达到7．269／l、60．5mg／1和128．7mg／Vd，这说明在栅藻(Desmodesmussp．CHXl)培养过程中，适当的曝气利于微藻生长和高价值附加物质的积累。7．1．5混养培养强化栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长和养猪废水净化性能的研究1．直接空气吹脱可以作为一种简单有效的预处理方法应用于基于微藻培养的养猪废水处理技术体系中，以降低养猪废水中过高氨氮对微藻的生长抑制作用；2．向不灭菌养猪废水中泵入含5％C02的空气(即混养培养)时，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生长、油脂积累和废水中NH4+-N、TN、TP和COD、cu、zn等去除均得到显著加强，培养8天后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生物量浓度、生物量产率和油脂产率分别高达7．91g／l、869．0mg／1／d和132．1mg／Vd(总脂含量15．2％)，而废水中NH4+-N、TN、TP和COD、Cu、Zn等去除率分别为97．3％、87．9％、93．2％、41．8％、50．1％和30．1％，元素流分析结果表明，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)直接吸收利用是N、P和cu、zn去除的主要原因。混养培养后，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)细胞内N、P含量、C16．C18脂肪酸含量、粗蛋白含量和氨基酸含量均得到显著提高，其中N、P分别为9．55％和0．79mg／kg，粗蛋白和总氨基酸含量分别为59．7％和315．9I．tg／g(EAA／TAA为30．5％)，C16．C18脂肪酸成分占总脂肪酸成分的83．11％。总之，本研究结果表明，从养猪场废水处理池内分离纯化的栅藻(Desmodesmussp．CHXl)具备应用于基于微藻培养的养猪废水处理技术中的潜力，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长速度快、油脂产率高和对养猪废水中的营养物质(如N、P)和重金属元素(Cu、Zn)具有较强的去除能力，为构建基于微藻培养的养猪废水处理技术体系提供了基础信息。7．2主要创新点率先开展了基于微藻培养的养猪废水处理技术的研究，并从废水处理池分离纯化得到一株栅藻(Desmodesmussp．CHXl)，为同时满足养猪废水的无害化处n浙江大学博士学位论文第7章主要结论和研究展望理和资源化利用，实现传统污水的处理工艺向生产工艺的转化提供了藻种；而围绕此微藻开展的培养条件优化和处理养猪废水条件的研究，为构建基于微藻培养的养猪废水处理技术体系提供了基础信息。实现以污水为原料获取新资源和新能源，不仅是一种新理念，而且为养猪场的可持续发展提供了有力保障，更为缓解当前资源匮乏、能源紧缺的形势提供了可能的解决途径。7．3研究展望本研究在实验室条件下，考察了栅藻(Desmodesmussp．CHXl)应用于养猪废水处理的可行性，确定了部分基于微藻培养的养猪废水处理技术应用的基础条件，初步取得了一些成果，但也存在一些不足。1．本实验只分离纯化出一株生长优势明显的微藻，更多种类的微藻有待进一步筛选研究。此外，实验过程中，仅对此微藻进行考察，未加入其他微藻(如已报道的微藻，小球藻、栅藻其他品种)进行全程对比，只是将本研究结果与已有的研究结果进行类比，对比实验有待进一步完善，以充分验证栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的性能优势，而且随微藻因品种不同，微藻生理性质略有差异，多藻种联用的研究也值得进一步考察；2．栅藻(Desmodesmussp．CHXl)应用于养猪废水处理中，只对部分条件进行了基础研究，更多条件需要探讨或优化(如微藻悬浮与固定化、温度、光照强度等)，而且本研究仅仅在培养瓶中开展，放大性的实验研究需要进一步拓展。此外，栅藻(Desmodesmussp．CHXl)处理养猪废水的生态适应性机制应开展研究，明确各种理化因子、环境因子及生物因子对栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生态稳定性的主要影响因子和作用原理，阐明基于微藻培养的养猪废水处理技术体系中栅藻(Desmodesmussp．CHXl)的生态稳定性的形成机制，进而通过对某些主要影响因子的调控优化，使该系统达到最佳效果；3。基于微藻培养的养猪废水处理技术的生物反应器的开发。目前，单一用作微藻培养的生物反应器研究进行的较多(如开放式和封闭式的生物反应器)，而对基于微藻培养的污水处理应用的生物反应器研究关注甚少，因此，高效、低成本光生物反应器的研制和开发是基于微藻培养的养猪废水处理技术系统构建的重要组成部分，是将实验室成果转化为实际工程应用的关键环节；4．筛选能显著促进栅藻(Desmodesmussp．CHXl)生长，同时又能对净化n浙江大学博士学位论文第7章主要结论和研究展望养猪废水起到促进作用的菌株或废水土著菌，构建藻菌共生体系，明确藻菌共生体系的作用机理，为扩大栅藻(Desmodesmussp．CHXl)应用具有重要的现实意义。总之，基于微藻培养的养猪废水处理技术本身固有的复杂性，对已经取得的众多单个研究结果进行归纳总结，继续开展更多徼藻、多环境因子、中试范围的试验考察，以便更加准确地了解栅藻(Desmodesmussp．CHXl)应用于养猪废水处理耦合高价值物质生产技术的操作性，真实反映基于微藻培养的污水处理技术的工程应用可行性。n浙江大学博士学位论文第7章主要结论和研究展望118n浙江大学博士学位论文参考文献AbreuAP’FemandesB，VicenteAA，TeixeiraJ，DragoneGMixotrophiccultivationofChlorellaⅧ忉胁usingindustrialdairywasteaSorganiccarbonsource．BioresourceTechnology,2012，118：61-66．AnJYSimSJ，LeeJS，KimBW．HydrocarbonproductionfromsecondarytreatedpiggerywastewaterbythegreenalgaBotryococcusbraunii．JournalofAppliedPhycology,2003，15(2—3)：185-191．AndradeMRandCostaJAVMixotrophiccultivationofmicroalgaSpirulinaplatensisusingmolassesasorganicsubstrate．Aquaculure，2007，264：130·134．APHA(AmericanPublicHealthAssociation)．StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater．20Ⅱ1ed．AmericanPublicHealthAssociation／AmericanWaterWorksAssociation／WaterEnvironmentFederation，WashingtonDC，2008．AravindhanR，RaoJR，NairBU．RemovalofbaSicyellowayefromaqueoussolutionbysorptionongreenalgaCaulerpascalpelliformis．JournalofHazardousMaterials，2007，142(1-2)：68-76．BehrenfeldMJ，WorthingtonK，Shen'eURM，ChavezFP，StruttonP，McPhadenM，SheaDM．ControlsontropicalPacificOceanproductivityrevealedthroughnutrientstressdiagnostics．Nature，2006，442：1025-1028．BehzadiS，FaridMM．Review：examiningtheuseofdifferentfeedstockfortheproductionofbiodiesel．Asia·PacificJournalofChemicalEngineering，2007，2：480．486．’BemetNandBelineF．Challengesandinnovationsonbiologicaltreatmentoflivestockeffluents．BioresourceTechnology,2009，100：5431—5436．BhatnagarA，ChinnasamyS，SinghM，DasKC．Renewablebiomassproductionbymixotrophicalgaeinthepresenceofvariouscarbonsourcesandwastewaters．AppliedEnergy,201l，88：3425-3431．BholaVDesikanR，SantoshSKSubburamuK，SannivasiE，BuxF．Effectsof119n浙江大学博士学位论文参考文献parametersa能c血gbiomassyieldandthermalbehaviourofCh／ore／／avutga胁．JournalofBioseienceandBioengineering，2011，111(3)：377-382．BoeleeNC，TemminkH，JanssenM，BuismanCJN，WijffelsRH．Nitrogenandphosphorusremovalfrommunicipalwastewatereffluentusingmicroalgalbiofilms．WaterResearch，2011，45：5952—5933．BonmatiAandFlotatsX．Airstrippingofammoniafrompigslurry：characterizationandfeasibilityasapre-orpost-treatmenttomesophilicanaerobicdigestion．WasteManagement，2003，23：261·272．BrennanLandOwendeP．Biofuelsfrommicroalgae—areviewoftechnologiesforproduction，processing,andextractionsofbiofuelsandCO—products．RenewableandSustainableEnergyReviews，2010，14：557-577．ChangDK，AnJYParkTH．AstaxanthinbiosynthesisfromsimultaneousNandPuptakebythegreenalgaHaematococcuspluvialisinprimary-treatedwastewater．BiochemicalEngineeringJournal，2006，31：234—238．ChangYWuZC，BianL，FengDL，LeungDYC．CultivationofSpirulinaplatensisforbiomassproductionandnutrientremovalfromsynthetichumanurine．AppliedEnergy,2012，102：427—431．ChenCYYehKL，AisyahR．Cultivation，photobioreactordesignandharvestingofmicroalgaeforbiodieselproduction：ACriticalReview．BioresourceTechnology,2011，102：71—81．Cheng巧LuKGaoCEWuQrAlga-basedbiodieselproductionandOptimizationusingsugarcaneasthefeedstock．Energy＆Fuel，2009，23：4166-4173．ChesapeakeBayFoundation．AguidetopreservingagriculturallandsintheChesapeakeBayregion：Keepingstewardsontheland．http：／／www．cbfiorg／site／DocServer／CbFPreservingFarmland—Finalpdf?docD=5934．Accessed26June2006．CheunbarmSandPeerapompisalYCultivationofSpirulinaplatensisusinganaerobicallyswinewastewatertreatmenteffluent．InternationalJournalofAgriculture&Biology,2010．12：586-590．ChinnasamyS，BhamagarA，HuntRW，DasKC．Microalgaecultivationina】20n浙江大学博士学位论文参考文献wastewaterdominatedbycarpetmilleffluentsforbiofuelapplications．BioresourceTechnology,2010，101：3097-3105．ChistiYBiodieselfrommicroalgae．BiotechnologyAdvances，2007，25：294-306．ChistisYBiodieselfrommicroalgaebeatsbioethan01．TrendsinBiotechnology,2008．26：126．131．ChiuSYKaoCYChenCH，KuanTC，OngSC，LinCS．ReductionofC02byalligh-densitycultureofChlorellasp．inasemicontinuousphotobioreactor．BioresourceTechnology,2008，99：3389-3396．ChiuSKKaoC巧TsaiMzLipidaccumulationandC02utilizationofNannochloropsisoculatainresponsetoC02aeration．BioresourceTechnology,、2009，100：833-838．ChoSJ，LuongTT'LeeDH，OhYK，LeeT．Reuseofeffluentwaterfromamunicipalwastewatertreatmentplantinmicroalgaecultivationforbiofuelproduction．BioresourceTechnology,2011，102：8639-8645．ConvertiA，CasazzaAA，OrtizEYPeregoP'DelBorghiM．EffectoftemperatureandnitrofenconcentrationonthegrowthandlipidcontentofNannochioropsisoculataandChlorellavutgarisforbiodieselproduction．ChemicalEngineeringandProcessing，2009，48(6)：1146—1151．CostaJAVanddeMoralsMGTheroleofbiochemicalengineeringintheproductionofbiofuelsfrommicroalgae．BioresourceTechn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