微生物电化学系统生物阴极的构建及其在难降解有机废水处理中的应用 160页

⑧万方数据论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人l：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：、’觑莎-赢名1∥◇隆名诬室隍刍递塑隆名透空隆名迸塑隆名透宝答辩委员会主席：扬垫塾援逝迤太堂委员1：重压盛塾援逝迤太堂委员2：李住教授浙江盔学委员3．闰杰平塾授浙江太学委员4：旌耀数拯逝堑太堂委员5：n万方数据wastewatertreatmentAuthor’Ssignature：Supervisor’Ssign|IIIllIIl{IIlllIIIlUlY2663692ExternalReviewers：!堑Q壁Y堡Q丝墨gQ望!塾堡垒1．△塾Q娶Y堡Q丛墨gQ班盟堡垒l』塑Q堕Y堕Q塑￡Q堡堡曼堕△廷Q廷Y堡Q坚￡Q垫m曼巫△垒Q鲤堡Q坚gQ堡墅曼堕ExaminingCommitteeChairperson：逝g!垒塑坠，￡至Q鱼曼墨QL圣塾自i垄堕g堕旦iY星￡墨i!YExaminingCommitteeMembers：L垒i墨曼星塾星坠g，￡!Q垒墨墨Q邑Z塾自i垦塾g!塑iY星r墨丛Y圣i鳖i，￡!Q鱼曼墨QLZh自i垒坠g堕墼iY星!墨韭Y筮塑K竺pi垒g：￡!Q堡曼墨QL塑!自i堑喀堕堑∑星坠ilYS塾i)鱼Q，望!Q鱼曼曼QL圣塾自i垒壁g!塑iY曼茎曼韭YDateoforaldefelice：2014．6．4n万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：孝-]嘲签字日期：珈f垆年6月罗曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝江太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：妄)嘶导师签名：签字日期：加f毕年6月7日签字日期：沙lV年6月7日n万方数据n万方数据浙江大学博士学位论文摘要针对难降解有机废水B／C(生化需氧量／化学需氧量)低、生物毒性强，传统生化法处理效果差的问题，本论文提出采用微生物电化学系统(BES)中的生物阴极处理该类有机废水，以解决传统生化处理工艺的不足。论文取得了如下主要研究成果：以活性蓝13(RBl3)和五氯苯酚(PCP)为典型难降解有机污染物，建立了一套适用于难降解有机污染物处理的电化学活性细菌(EAB)筛选与驯化方法，分别获得了高效降解RBl3和PCP的EAB。利用该两种EAB启动BES，生物阴极挂膜时间大大缩短。在此基础上，考查了生物阴极对RBl3和PCP的处理效果，结果显示：在优化条件下，RBl3经8h处理后，脱色率达到80．244-5．5l％；PCP经100h处理后，去除率达到89．66±3．66％。重点研究了生物阴极上EAB生物膜与电极之间的电子传递机制。结果发现生物阴极中电极到EAB存在直接电子传递途径。循环伏安法测试发现生物阴极表面生物膜在+0．2v左右有氧化还原峰，对应于细菌细胞膜上的C型细胞色素蛋白，为直接电子传递途径的存在提供了有力的证据。对EAB生物膜菌落组成进行了分析，454高通量测序结果显示Proteobacteria(45．51％)、BacWroideWs(33．95％)、Firmicutes(15．92％)为脱氯生物阴极上三类优势菌种。对EAB生物膜在电极表面的形成过程及其影响因素进行了研究。论文建立了一套基于微电极的EAB生物膜厚度原位连续测试的方法。以ShewanellaoneidensisMR．1为模型微生物，通过铂探针微电极对＆oneidensisMR．1生物膜厚度进行了测试，测试结果与激光共聚焦扫描显微镜测试结果基本吻合。利用该方法对SoneidensisMR．1生物膜形成过程中的影响因子进行考查，发现较负的电极电势以及较高浓度的乳酸钠、核黄素可加速SoneidensisMR．1生物膜的生长。无氧条件下，Soneidens&MR．1生物膜厚度增长的限值大约为100gm到110gin。利用Capdeville生物膜增长动力学模型对观察到的生物膜生长过程进行数学模拟。拟合结果显示当乳酸钠浓度为20mM，电极电势为+100mV时，SoneidensisMR．1生物膜厚度的比增长速率为O．27h～。n万方数据浙江大学博士学位论文摘要构建了基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈，为生物阴极在难降解有机废水处理中的工程化应用提供了设计指导。当外接电阻1000Q时，含50mg／LRBl3的模拟废水经反应器处理8h后，RBl3脱色率和TOC去除率分别为85．4±2．4％和33．4±3．4％。本论文以难降解有机废水生物处理新工艺开发为目标，系统整合了BES和生物阴极，阐明了污染物降解过程中的电子传递机制，揭示了生物膜形成的机制和调控手段，拓宽了BES在废水处理中的应用范围。关键词：微生物电化学系统，生物阴极，难降解有机污染物，电子传递机制，生物膜形成机制n万方数据AbstractMoreandmorerecalcitrantorganicwastewaterwasgeneratedwiththerapiddevelopmentofchemicalindustryrecently．DuetothelowB／C，poorbiodegradabilityandhightoxicity，traditionalbioremediationcannoteffectivelytreatthiskindofwastewater．Abioelectrochemicalsystem(BES)equippedwithbiocathodewasemployedforrecalcitrantorganicwastewatertreatmentinthiswork．Reactiveblue13(RB13)andpentachlorophenoi(PCP)weretreatedastypicalrecalcitrantorganicpollutantsinthispaper．Firstly，anovelmethodforscreeningandacclimatingelectrochemicallyactivebacteria(EAB)forthedegradationofrecalcitrantorganicpollutionswasprovided．EABforRB13degradationandEABforPCPdegradationwereobtained，whichcansignificantlyreducethetimeofbiocathodeset‘uP．BiocathodesusedforRB13andPCPtreatmentwerealsobuilt，andtheperformanceofbiocathodesforRB13degradationandPCPdegradationweresignificantlyimproved．Intheoptimizedconditions，thedecolorinationrateofRB13inBESreached80．2±5．5％during8hoursoperation，andthePCPremovalrateinBESreached89．7+3．7％after1OOhourstreatment．Forunderstandingthedegradationpathwaysofrecalcitrantorganicpollutantsonbiocathode，theelectrontransfermechanismsofEABonbiocathodewerestudied．TheelectrontransferpathwayfromelectrodetoEABwasdetermined．WeprovedthatdirectelectrontransfermechanismfromtheelectrodetoEABcouldbeinvolvedinbiocathode．Apairofoxidation-reductionpeaksaround+O．2Vexistedinthecyclicvoltammograms，whichcouldbecausedbycytochromeCprotein．454pyrosequencingtestsshowedthatProteobacteria，BacteroidetesandFirmicuteswerethreepredominantphylainBES，whichwerethreedechlorinatingmicroorganisms．GiventheimportanceofEABbiofilminbiocathode，EABformationmechanismswerestudied．AnovelmethodforinsitudeterminationoftheEABbiofilmthicknesswasdeveloped．Byemployingaplatinumultramicroelectrode(PtUME)asthedetector,thicknessofShewanellaoneidensisMR．1biofilmwasmeasured，andtheresultswerealsoconfirmedbyconfocallaserscanningmicroscopetests．Accordingtoourresults，n万方数据浙江大学博士学位论文Abstractlowerelectrodepotential，higherconcentrationsofsodiumlactateandriboflavincouldacceleratetheformationofSoneidensisMR．1biofilmontheelectrode．Themaximumbiofilmthicknesswas100gmto10gmwhens．oneidens趣MR一1grownintheanaerobicmedium．CapdevilleequationwasfounddescribingtheformationofEABbiofilmwell．Whentheconcentrationofsodiumlactatewas20mMandtheelectrodepotentialwas+100mY,thespecificgrowthrateofSoneidensisMR一1biofilmthicknesswas0．27h一1．Abipolarmicrobialfuelcellstackequippedwithbiocathodewasconstructed．Itprovidedaguidelineforthedesignationofthelargescalereactorforrecalcitrantorganicwastewatertreatment．Whentheextemalresistancewas1000QandtheinitialRB13concentrationwas50mg／L，theRB13removalrateandthetotalorganiccarbon(TOC)removalrateinthisreactorwere85．4±2．4％and33．44-3．4％respectivelyduring8hoursoperation．Thisworkfocusedonthedevelopmentofanoveltechnologyforrecalcitrantorganicwastewatertreatment．ByemployingbiocathodeinaBES，recalcitrantorganicpollutantsweredegradedeffectively．Furthermore，theelectrontransfermechanismsduringtheprogressofpollutantsdegradationandtheformationmechanismsofEABbiofilmweredetermined．ThisworkextendedtheapplicationofBESinwastewatertreatment．Keywords：bioelectrochemicalsystem，biocathode，recalcitrantorganicpollutions，electrontransfermechanism，biofilmformationmechanismVn万方数据浙江大学博士学位论文目录l绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1课题背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．2微生物电化学系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．2．1微生物电化学系统的定义及分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2．2微生物电化学系统性能的影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．3微生物电化学系统的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．3生物阴极⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．3．1生物阴极概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．3．2生物阴极中的电子传递途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．3．3电化学活性细菌生物膜的形成机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一141．4生物阴极在污染物降解中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．4．1生物阴极处理无机污染物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．161．4．2生物阴极降解有机污染物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．161．5存在的问题与研究思路⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．6研究内容与技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯181．6．1研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一181．6．2技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192电化学活性细菌的筛选与驯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．1实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．1．1实验试剂及营养液组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一202．1．2实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一222．1．3亲氢气自养菌的筛选方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．242．1．4电化学活性细菌的驯化方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．262．1．5分析测试方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．262．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．2．1亲氢气自养菌的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一272．2．2电化学活性细菌的驯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一302．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32Tn万方数据n万方数据浙江大学博士学位论文目录5．1．1实验试剂及营养液组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．765．1．2接种细菌及实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．775．1．3反应器及测试装置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一785．1．4电化学活性细菌生物膜厚度原位测试方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．805。1．5生物膜测试方法的可行性验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．825．1．6ShewanellaoneidensisMR．1生物膜形成机制研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯845．1．7分析测试方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．855．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯865．2．1不同电解液的渐近曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一865．2．2核黄素的电化学表征及扩散层的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．885．2．3激光共聚焦扫描显微镜验证生物膜厚度测试结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯一915．2．4氧气对ShewanellaoneidensisMR．1生物膜形成的影响⋯⋯⋯⋯．935．2．5电极电势对ShewanellaoneidensisMR．1生物膜形成的影响⋯⋯．955．2．6乳酸钠对Shewanellaoneidens&MR一1生物膜形成的影响⋯⋯⋯．975．2．7核黄素对ShewanellaoneidensisMR．1生物膜形成的影响⋯⋯⋯．995．2．8ShewanellaoneidensisMR．1生长动力学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1015．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1046基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用⋯⋯⋯⋯．．1066．1实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1076．1．1实验试剂及营养液组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1076．1．2实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1076．1．3反应器结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1086．1．4反应器启动方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1096．1．5微生物燃料电池堆栈降解活性蓝13实验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1106．1．6分析测试方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1126．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1126．2．1微生物燃料电池堆栈的启动⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1126．2．2微生物燃料电池堆栈运行条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1156．2．3不同反应器对活性蓝13去除效果的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一120IIIn万方数据浙江大学博士学位论文目录6．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1237结论与建议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1257．1主要结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1257．2创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1267．3存在问题与建议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一126参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．128作者简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯148IVn万方数据浙江大学博士学位论文绪论1绪论1．1课题背景随着化工行业的快速发展，人工合成的有机物种类与数量与曰俱增，随之而来的是大量难降解有机污染物的产生。这些污染物一般不能被微生物降解，或需要较长的时间才能被降解，一旦进入环境中，容易通过食物链在生物体内富集，并对生物体细胞产生不可逆的影响，造成致癌、致畸、致突变等一系列危害[1,21。随着我国加入《斯德哥尔摩公约》，难降解有机污染物受到了越来越多学者的关注和研究【31。2012年，我国工业废水排放总量达到221．6亿吨，其中50％以上为石化、印染、染化、焦化、制药、农药等行业产生的废水[41。这些废水中含有大量的氯苯类、多环芳烃、硝基化合物、偶氮化合物等难降解有机污染物，一旦进入到水体中，会给人类健康和生态环境带来严重的危害。因此，需要采取切实有效的手段对这类工业废水进行处理，以控制废水中难降解有机污染物的排放。目前，对难降解有机废水的处理主要采用生物法、物化法和化学氧化法等方法，其中以生化处理工艺研究最为广泛、应用最为普遍。这类方法通常是针对某一特定废水的水质特征对微生物进行驯化培养15，6】或基因改造【71，并在此基础上对处理工艺进行改良，通过物化预处理或多级串联等技术强化对难降解有机污染物的去除效果。一般情况下，难降解有机污染物不能作为营养物质被微生物利用，微生物对这些污染物的降解需要通过共代谢作用实现，即难降解有机污染物的降解是伴随着微生物对葡萄糖、乙醇等易降解有机物的降解而实现的【81。然而，难降解有机废水中所含的易降解有机物非常少，其B／C(生化需氧量／化学需氧量，biochemicaloxygendemand／chemicaloxygendemand，BODs／COD)往往非常低【9，1们。因此，很难直接采用生化处理工艺对难降解有机废水进行处理，需要引入新的方法和技术对其进行改进。微生物电化学系统(Bioelectrochemicalsystem，BES)是近年来能源和环境领域中兴起的研究热点，是在电化学、微生物学、过程工艺学等学科交叉与综合的基础上所构建的体系[111。BES最显著的特点是电荷可在微生物和电极间相互迁移。在BES中，电化学活性细菌(Electrochemicallyactivebacteria，EAB)具有其独特的生理特性，可以外源导电性介质(如电极)作为细胞代谢过程中的电子供1n万方数据浙江大学博士学位论文绪论体或电子受体【12】。因此，可利用EAB这一特点，构建用于处理难降解有机废水的生物阴极，以电极作为EAB的电子和能量供体，驱动其对难降解有机污染物的降解。但是，目前对于BES中生物阴极的构建缺乏系统的方法，用于处理难降解有机污染物时，反应器的启动时间较长，运行效果一般【13，14】。另外，生物阴极的电子传递途径以及EAB在电极表面的生物膜机制仍不明确，对BES中电极和微生物的相互作用机制认识不足，也给进一步提升BES对难降解有机污染物的去除效率带来了困难。深入系统地研究BES对难降解有机废水的去除规律、电极表面电子传递机制及生物膜形成机制，有助于为该技术的推广应用提供设计参数和科学依据，对我国的水资源保护和环境污染治理具有重要意义。1．2微生物电化学系统1．2．1微生物电化学系统的定义及分类微生物电化学系统是指利用EAB作为催化剂来催化电极表面电化学反应(氧化或还原反应)的体系。这类细菌可通过特定的细胞膜蛋白【15】、细胞结构[16】或可溶性的氧化还原电子介体【17】实现电子在固体电极和细胞间的传递。与传统生物催化剂(酶、细胞器等)相比，利用微生物作为生物催化剂，催化剂具有自我复制性、种类多样性以及可定向选择性等优点，因此受到了广泛的关注与研究。根据BES中电能是净输入还是净输出系统，可将其划分为微生物燃料电池(MicrobialFuelCell，MFC)和微生物电解池(MicrobialElectrolysisCell，MEC)两大类(图1．1)。在MFC中，阴极表面还原反应的电势高于阳极表面氧化反应的电势，电池反应的电势差大于0，相对应的吉布斯自由能小于0，反应器会自发地向外输出电能。在MEC中，阴极表面还原反应的电势低于阳极表面氧化反应的电势，电池反应的电势差小于0，相对应的吉布斯自由能大于0，电池反应不能自发进行，需要通过电源输入一定电能以驱动反应发生。此外，某些热力学上能发生的反应，在开路或外接负载时，电极表面反应速率极慢，则也需要通过外电源施加一定过电势来维持电池反应的正常进行【18】。根据电子在EAB与电极间的移动方向，可将BES中的电极划分为生物阳极(Bioanode)和生物阴极(Biocathode)两大类。在生物阳极中，EAB以电极作为电子受体，将氧化某些有机物或无机物(如硫化物等)过程中产生的电子传递到电极表面。MFC中所使用的阳极即为典型的生物阳极【19】，EAB通过呼吸作用n万方数据浙江大学博士学位论文绪论将葡萄糖【201、乙酸【211、乳酸[22】等易降解的有机物氧化成二氧化碳和其它氧化产物，并将氧化得到的电子通过微生物细胞膜上的电子传递链最终传递到电极，进而在外电路的引导下到达阴极表面参与氧气【23域铁氰化钾【24】等的还原反应。在生物阴极中，EAB以电极作为电子供体，电子由电极转移给微生物，并最终用于还原阴极液中的电子受体或参与细菌体内的代谢过程。由于生物阴极需要电极持续不断地为EAB提供外源电子，因此往往将其与直流电源[251、电化学工作站[26]或电势较低的阳极127】相连。生长在电极表面的微生物利用外电路提供的电子氧化阴极液中的电子受体，将这一过程中释放的能量以ATP或NADH2的形式固定到细胞内，进而参与微生物体内一系列合成代谢反应[281。因此，通过对生物阴极上EAB代谢途径进行定向选择或改造，可实现某些高附加值产品的微生物电化学合成(MicrobialElectrosynthesis)【291。图1．1两类微生物电化学系统及其运行原理【301Figure1．1Twotypesofbioelectrochemicalsystemandtheiroperationalmechanisms．130]n万方数据浙江大学博士学位论文绪论1．2．2微生物电化学系统性能的影响因素电极、电化学活性细菌以及反应器是组成BES的三个主要部分，任何影响这三个要素的因素都会对BES的性能产生一定的影响。在对BES运行性能进行优化时，需要对这些因素进行综合考虑。(1)电极区别于传统电化学系统中所用的电极材料，BES中所使用的电极除了应具有良好的导电性和稳定性，还必须具有较高的生物相容性。因此，通常选用碳材料作为BES的电极材料，如碳布[31]、碳纸[26】、碳毡[32】、石墨纤维斥lJ[33]、碳纳米管[34】等。这些碳材料或者表面凹凸不平，或者内部充满孔道结构，具有较大的比表面积，为EAB的附着生长提供了广阔的空间，从而有利于提高BES的运行性能。由于金属电极在电化学体系中容易被腐蚀，并且部分金属对微生物具有一定的毒性，因此金属电极在BES中的应用较少，只有少数电化学稳定性较强的金属或合金电极被用在BES中。近年来，随着BES向微型化方向的发展，金电极因其自身所具有的较强导电性与延展性，在毫升／微升级MFC【351、生物传感器【36】以及微流控反应器【37】中得到了广泛地应用，为生物电极材料的研究开辟了新的方向。除了选择性能较好的电极材料之外，还可通过对电极材料进行改性修饰以实现BES性能的提升。用氨气对碳布【38】或碳网【39】电极进行弱氮化处理，可增加电极表面分布的正电荷基团，有利于吸附带负电的EAB，从而可缩短反应器启动时间，并促进电子在电极和微生物间的传递。利用过硫酸铵[40】、硝酸[41】等对碳材料电极进行高温酸化处理，同样可使电极表面带有更多的正电荷，并且还能使碳材料内部形成塌陷，产生更大的比表面积。将少量的pt[421、Fe304[43]等金属或金属化合物涂覆在电极表面，可实现对电子由微生物向电极传递的介导，并起到一定的催化作用。除了对定型的电极材料进行表面改性，利用碳纳米管与某些导电聚合物(如聚苯胺【441、聚吡咯145】等)进行复合，同样可制成用于BES中的电极材料，这样制成的电极生物相容性得到了提升、电极内阻大大下降。对BES中非生物阴极的研究主要是集中在阴极催化剂的开发上。在一个完整的MFC中，为了提高体系的运行性能，除了应尽可能提高生物阳极上的氧化反应速率和电子传递速率外，还必须对非生物阴极的还原速率加以提升，使其不会成为整个电池反应的限制因素。传统的MFC以氧气作为非生物阴极的电子受n万方数据浙江大学博士学位论文绪论体，通过在电极表面负载金属铂以催化氧气的还原[46】。然而，这类贵金属催化剂成本过高，不利于MFC在实际应用中的推广，因此，以氧化锰[471、二氧化铅【48]等为代表的非贵金属氧化物催化剂以及以铁酞菁【49](FePc)、钴卟啉[50](CoTMPP)等为代表的过渡金属大环化合物催化剂被开发出来，用以取代价格昂贵的金属铂催化剂。近年来，学者们又发现，利用活性炭【51】或掺氮碳纳米管【52】作为MFC阴极，电极材料本身可对氧气还原进行催化，从而进一步降低了阴极材料的造价。电极电势作为生物电极一项主要的电化学参数，对于BES的启动和运行均起到非常重要的作用。许多研究工作表明，在BES启动即EAB挂膜阶段，通过给电极施加一定的电势(生物阳极挂膜时施加较正的电势，生物阴极挂膜时施加较负的电势)，有利于加速EAB生物膜在电极表面的形成[53,54】。这是由于，当电极处于极化状态下时，一方面可限制某些非电化学活性细菌在电极表面的生长，另一方面可作为EAB稳定且唯一的电子受体或电子供体，促进EAB向电极表面的集中生长。电极电势对BES性能的影响，还表现在生物阴极对不同电子受体的还原过程中，如生物阴极产氢【551、产甲烷【56]反应，均需要电极电势低于某一特定闽值才能发生，并且电势越低反应速率越快。(2)电化学活性细菌EAB是一类在代谢过程中可以外源导电性介质作为电子供体或电子受体的具有电化学活性特征的细菌。为了研究不同EAB的电子传递机制以及获得BES的优化运行条件，通常会采用纯种菌作为研究对象，以排除不同种细菌间的干扰[57-60]。在BES中，研究最多也是最典型的EAB主要有Shewanellaoneidensis和Geobacters．1f．rreducct'lS两种细菌。这两类细菌在自然环境中，都可以Fe3+作为电子受体，具有比较强的向外输出电子的能力。在BES中，这一能力得到了强化，细菌产电能力得到大幅提高。由于纯种菌不存在菌落组成变化等问题，因此BES运行达到稳定时波动较小，非常适合于对BES相关机理及条件优化的研究。在实际应用中，纯种菌对BES的运行条件有非常严苛的要求，例如Geobactersulfurreducens需要在严格厌氧的环境下生长【6¨，Shewanellaoneidensis也需要在较低的氧气浓度下才能实现电子的高效输出【62】。此外，实际的废水或电解液中往往混杂着其它细菌。因此，学者们的研究中更多地是采用混合菌作为反应器的接种源。其中，最为常见的是以生活污水[63域污水处理厂活性污泥[64】作为接种源，n万方数据浙江大学博士学位论文绪论或者以长期运行一段时间后的BES反应器中菌液[65】作为接种源。在用混合菌构建的BES中，菌落结构[66】、碳源种类【67】、污染物负荷[13】等均会影响到细菌的活性，从而影响BES的运行性能。在某些EAB中，用于电子传递的氧化还原活性中心被蛋白质结构包裹，电子在细胞和电极间的转移在空间上受到了阻隔。因此，需要通过一些可被微生物和电极反复氧化和还原的可溶性电子介体作为介导，完成电子在微生物和电极间的传递。甲基紫【68】、硫堇【69】、腐殖酸【701、蒽醌．2，6．磺酸钠【71]等均是在BES中应用较为广泛的氧化还原电子介体，这些外源电子介体一般都具有如下几个共同特点：1)无生物毒性；2)稳定性强，可重复多次被氧化还原；3)分子量小，水溶性好。通过向BES中投加适宜浓度的氧化还原电子介体，有助于加速电子传递，提升系统的电子传递效率，进而提高BES的运行性能【72’73】。然而，这些电子介体的投加同样会造成BES运行成本的增加，并且会对环境造成潜在的危害。除了上述影响EAB在BES中的组成及活性的因素外，其它对微生物新陈代谢造成影响的因素，均会对BES的性能产生一定影响，如pH值[741、温度[751、底物浓度【76】等。只有当这些影响因素均处在微生物生长最适宜的范围时，BES的运行才会达到最佳的状态。(3)反应器根据氧化还原物种的差异以及实际用途的不同，BES反应器也各不相同。在设计BES反应器的过程中应遵循一条必要的原则，即在保证阴阳两极相互不受影响的前提下尽可能地减小两电极间的离子传质阻力。双室BES反应器，以H型双室反应器为代表，是BES中研究得最早，并且最广泛使用的一种反应器【77，7引。由于质子交换膜在其中很好地阻隔了阴阳两极室，使两个反应室在运行过程中保持相对的独立，因此这一类反应器特别适合于实验室的基础研究。但是，质子交换膜的使用不仅提高了反应器运行和维护的成本，还会对阴阳两极室间的离子传递造成一定的阻碍，增加了反应器的欧姆内阻，降低了BES的整体性能。因此，该反应器在实际应用中受到了一定的限制。针对这一问题，学者们开发出了新型的单室反应器。这类反应器都是以空气中的氧气作为阴极电子受体，省去了两极板间的质子交换膜，使阴阳两极同时存在于一个极室中。反应器中，阴极外侧一般覆盖有一层防水透气层，空气中的氧气可透6n万方数据浙江大学博士学位论文绪论过这一扩散层结构到达阴极表面，并在电极的作用下发生还原反应。根据阴阳两极所处的位置不同，单室反应器又可分为方形反应器和圆筒反应器两类。在方形反应器中，阴阳两电极分别位于反应器的两端，阳极板端密封，阴极板端则通过防水透气层与空气直接接触【79，801。在圆筒反应器中，阴极位于阳极的外侧，折成圆筒状覆盖在反应器外表面，多个阳极则均匀分布在反应器内部【81】。单室反应器省去了BES中的质子交换膜结构，但同时也带来了另一个问题，即氧气可能透过阴极扩散到电解液中甚至到达阳极表面，进而造成反应器库仑效率的下降【801。为了解决这一问题，有学者提出通过设计挡板结构以尽可能减缓氧气向电解液的扩散【63，82】。除了上述两类典型的BES反应器，还有一类上流式反应器在BES的研究中应用较为广泛。这类BES的阴阳两极选用多孔碳材料[83域颗粒状碳材料【84】，阳极位于反应器下半段，阴极位于反应器上半段，中间以多孔绝缘材料相阻隔，电解液从反应器下端流向上端。这一结构设计，不仅解决了质子交换膜对离子的传质阻碍作用，也确保了曝入阴极室的氧气不会扩散到阳极表面。由于受到EAB附着量、细菌代谢反应速率及电子传递速率等的影响，单个BES反应器的电能输出总是会受到一定的限制。解决这一问题最有效的办法就是将反应器串联成电池组。Dekker等(85】设计将阳极和阴极整合为一块双极性(bipolar)电极，从而省去了连接几个反应器阴阳极极板间的导线，降低了MFC堆栈的欧姆电阻。通过将4组MFC反应器串联成MFC堆栈，使其能量密度达到了144W／m3，为原来单个反应器的13倍。Zhuang等【86】通过在管状MFC反应器外侧间隔地包裹碳布阴极，并将相邻的阴阳两电极通过钛丝相连接，不仅增加了反应器的产电量，也大大提升了反应器的处理水量。MFC堆栈理念的提出为BES反应器向着大型化、实用化方向的发展提供了技术支持。然而，实际应用中，由于MFC堆栈各组成单元电极电势的不稳定性，有可能造成反应器的电压反转(voltagereversal)，从而导致反应器运行效率的急剧下降【64】。1．2．3微生物电化学系统的应用BES的应用非常广泛，根据在BES中反应场所的不同，可对不同的应用进行归类。(1)生物阳极在BES中，以EAB为催化剂，生物阳极可实现化学能向电能的转换，因此，n万方数据浙江大学博士学位论文绪论电流成为了这一系列反应装置的主要产物。底泥MFC(SedimentMFC)是将生物阳极置于海底底泥中，将阴极板放在海水中，构建出的BES体系【87，881。由于海底底泥中含有大量的可生化降解的有机物，海水中则含有溶解氧及其它氧化性物质，因此，在EAB的催化下，即可实现反应装置的向外输电。这一系统适合于远洋环境下对某些装备或仪表的持续供电。no辨鼯l渤￡铡溉蜷f蝗一熏一’毋：Jt_浔．．L_I翻I隧．oo霉o：000—0C图1．2几种常见的微生物电化学反应器A：双室反应器：B：空气阴极单室反应器【891；C：圆筒形单室反应器【90】；D：管状微生物燃料电池堆栈【86】；E：上流式反应器1831；F：微生物燃料电池堆栈【91】Figure1．2Severaltypicalbioelectrochemicalreactors．A：dual．chamberreactor；B：single．chamberreactor[89】：C：tubularsingle-chamberreactor[90]；D：tubularMFCstack[S6]；E：up．flowreactor[S3]；F：MFCstack[911．生物芯片是BES微型化的一个应用分支。EAB针对特定的底物或氧化还原电子介体会产生强度不同的电流信号，这些信号被特定仪表检测到后可被赋予1oE童一一一一一一一一i一骥盥一)n万方数据浙江大学博士学位论文绪论或0的代码。通过对实验条件加以控制，或对EAB基因进行修改，可使BES针对不同的条件产生不同的信号代码，实现由生物化学分子信号到模拟信号再到数字信号的转化【92】。Li等【93]以户aeruginosaPAl4lasI／rhlI双变异体为研究对象，通过控制两种信号分子oxododecanoylhomoserinelactone(3-oxo·C12一HSL)和N-butanoyl．1．homoserinelactone(C4一HSL)的投加，实现了生物电化学逻辑与门的构建。在自然环境中，某些污染物的存在会对EAB的正常代谢产生一定影响，从而会降低或提高BES生物阳极的电流输出。利用EAB的这一特点，学者们构建了各种类型的BES传感器，以对环境中的污染物进行监测。Li等【36】构建了层流微流态BES，用于测试不同化学刺激下G．sutfurreducens的响应电流。Kaur等【94】构建了MFC型的生物传感器，用于对水样中挥发性有机酸的含量进行测试。除了利用生物阳极产生的电能及电信号，对BES生物阳极最主要也是研究的最为广泛的应用还是在污水处理方面。由于MFC不仅可实现微生物对有机物的降解，还能够实现化学能向电能的转化，因此被认为是一种可持续的废水处理工艺。利用BES生物阳极处理废水，要求废水中的污染物以易降解的有机物为主，如市政污水【95】、酿造业废水【961、食品加工业废水(97】、造纸废水【98]、养殖业废水【99]等均可在MFC中取得较好的处理效果。除了EAB的直接降解，利用生物阳极导出的电子同样可在BES阴极中实现对某些污染物的还原去除。如对于某些重金属废水，通过在阴极表面将Cr6+[1001、CU2+【101】等重金属离子进行还原沉淀，即可实现对这些有毒重金属的高效去除。(2)生物阴极在BES中，生物阴极上的EAB可接受外电路的电子，用以还原特定的电子受体，并将电能转化成化学能储存在还原产物中。利用生物阴极驱动EAB代谢反应，其最初的能量可来源于多种形式，如生物质能【1021、电能【1031、光能[104]等。这些能量最终以电能的形式输入到BES中，并被EAB加以利用。生物阴极产氢[105]、产甲烷【106】就是利用这一特点，以EAB为催化剂，将电能储存到氢气或甲烷等化学能源物质中。当生物阴极用于还原产氢或产甲烷时，反应发生所需要的电势一般比较低(产氢电势低于．0．42V，产甲烷电势低于．0．24V)。因此，研究者们一般将生物阳极与生物阴极相联用，先通过阳极反应降低生物阴极的电势，n万方数据浙江大学博士学位论文绪论再在此基础上通过外电源的控制，进一步降低阴极电势。微生物电化学合成作为近年来兴起的一个热门领域，就是在生物阴极的基础上所发展出的一类BES技术。用于微生物电化学合成的原料可以是二氧化碳或小分子有机物，这些物质可通过EAB的还原进入到细胞内，并通过一系列的代谢途径转换为所需的目标产物。Ishizaki等[107】人用氢气作为能源物质驱动C02向聚p．羟基丁酸酯的转化，后者是一种常见的生物塑料，而氢气在BES反应器中通过控制阴极电势即可源源不断产生。Cao等【1080】构建了固碳生物阴极，在光照条件下，可将C02转化为生物质沉积在电极表面。可见，利用BES进行生物合成，不仅可获得所需的化学产物，还能实现对C02的捕捉，有利于对温室气体的吸收。同样是以BES阴极产生的氢气作为电子和能量来源，Steinbusch课题组【109】通过生物阴极中的混合菌，实现了乙酸向乙醇的还原转换，其库仑效率高达49％。Shin等[110】人通过将电化学与生物还原过程相结合，将6．溴．2．四氢萘酮转化为6．溴．2．四氢萘酚，实现了低附加值产品向高附加值产品的转化。微生物的代谢途径具有多样性，通过对EAB的改造可实现微生物电化学合成产品的多元化。因此，利用BES生物阴极进行生物合成受到了越来越多人的关注。和生物阳极一样，生物阴极上的EAB除了可催化能量和物质的转化，同样也可应用于对污染物的去除。在生物阴极体系中，EAB取代了传统非生物阴极上的催化剂，通过其细胞内自身的酶系催化重金属[27】、硝酸盐[111】、硫酸盐【112】等的还原。甚至，某些原本在非生物阴极中难以被还原或降解的污染物，都可在生物阴极微生物作用下被去除【1131。(3)阴阳两极室间微生物脱盐电池(MicrobialDesalinationCell，MDC)是在MFC基础上所发展起来的一类特殊的BES，它利用MFC阴、阳两极间电势差异所形成的电场，驱动溶液中的正负离子定向移动，从而可将海水中Na+和C1。进行分离。Cao等【114】最先提出了这一概念，经过20小时左右的处理，MDC的脱盐效率可达90％，与此同时，输出的最大能量密度达到了2W／m2。此后，多个课题组【11_5，116】又对这一装置进行了改进，通过引入堆栈式的淡化池结构，从而提高了BES对海水的脱盐效率，并大大提升了处理水量。n万方数据浙江大学博士学位论文绪论1．3生物阴极1．3．1生物阴极概述生物阴极是相对于非生物阴极所提出的。生长在生物阴极上的EAB体内具有种类繁多的酶系，它们可替代非生物阴极中的金属催化剂，用以催化电极表面电子向溶液中电子受体的快速转移。与非生物阴极相比，生物阴极具有造价低廉、催化剂种类多、不会发生催化剂中毒等特点，且微生物的存在还能消耗多种污染物，因此越来越多的BES开始选用生物阴极进行一系列的研究f!i23。03q／H】02{028v、硼00咖m觚mt。{003V赴’，HO文-／me廿qne卜024v=8e’-oj／户NCOl-／aeetate}nz8V，轴1—够Hc。，一／butjnd∞，30V：24e_)∞互之：爱弼eMthan∞ol嚣臀一一o·孓裟怒瓣箸翟测忙4e}、卜HCOf／fotmne}矗41v，2一-0。5LHyH：∽．41V：2e-)图1．3微生物化学系统中阴极表面常见反应的氧化还原电势塔(pH=7)【30]Figure1．3RedoxpotentialtowerforcommonchemicalsonthecathodeofBES．【30】不同的氧化还原反应具有不同的氧化还原电位(如图1．3)。理论上而言，只要阴极电势低于某一阈值，特定的氧化还原反应就能在电极表面发生【301。但是，在实际中，为了让氧化还原反应以较快的速率进行，往往需要给电极施加更负的电势。这部分多施加的电势在电化学研究中被称作过电势[117]。EAB的存在可以让氧化还原反应的过电势得到降低，这样，在同一电势水平下，原本非生物阴极中很难发生的反应在生物阴极中便能快速地进行。除了可提高氧化还原反应的速率，生物阴极中的EAB往往还具有另一显著特点，即部分细菌可将溶液中的C02／HC03一转化为小分子的有机物[118，119]。这类细菌的代谢表现出了自养型微生物的特点，这使得生物阴极的运行摆脱了对有机n万方数据浙江大学博士学位论文绪论碳源的依赖。1．3．2生物阴极中的电子传递途径在BES中，电子在EAB和电极间的传递速率，对整个系统的运行效率起到关键的决定性作用。因此，EAB与电极间的电子传递途径，一直以来都是BES中最核心的研究内容。通过对这一途径加以研究，有助于针对性地降低电子在电极和微生物间传递过程中的过电势，提升BES整体效率。EAB在阳极表面的电子传递机制目前已研究得比较清楚，根据电子由微生物向电极传递过程中是否需要电子介体的参与，可将生物阳极的电子传递分为直接电子传递和间接电子传递两类。以Shewanellaoneidensis为代表，研究者们认为，在这类细菌的代谢过程中，存在着直接和间接两种类型的电子传递方式。Shewanellaoneidensis通过呼吸作用将有机物降解，产生的电子经电子传递链进行传递，最终通过二氢泛醌(QH2)传导至细胞内膜上的C型细胞色素CymA。在细胞膜上，由CymA、MtrA、MtrC三类细胞色素以及细胞外膜蛋白MtrB构成了一个贯穿于细胞内外膜的导电通道。因此，当电子传导至CymA后，能够通过C型细胞色素快速地由细胞内传递至细胞外【15，12002列。如果此时细胞色素蛋白MtrC与电极板有接触，则可实现电子由Shewanellaoneidensis向电极的直接传递。除了直接电子传递，研究者们还发现，Shewanellaoneidensis自身可分泌一种氧化还原电子介体——黄素(flavin)【17，1231。它是一种带三环二甲基异咯嗪结构的化合物(图1．4)，其中1、5位上的N存在着活泼的共轭双键，因此很容易发生可逆的氧化还原反应。这些黄素随着Shewanellaoneidensis细胞的生长而不断分泌到细胞外，并在溶液中不断积累1123]。由于在Shewanellaoneidensis中，细胞色素蛋白MtrC不可能全部都能与电极直接接触，因此细菌所产生的大量电子最终是通过MtrC的介导传递给了黄素分子。这些被还原的黄素分子扩散到电极表面，并在电极表面发生氧化，将电子转移到电极。大量研究表明，黄素对于Shewanellaoneidensis的电子传递起着非常重要的作用。Marsili等[124]指出在Shewanellaoneidensis纯种培养的BES中，73％的电流是由核黄素(riboflavin)的氧化所形成的。Jiang等【125]通过将培养液进行置换，并用微电极进行测量，认为95％的电流均是由核黄素等可溶性的电子介体所产生的。n万方数据浙江大学博士学位论文绪论图1．4SoneidensisMR．1生物膜中检测到的三种类型的黄素分子结构图[126]Figure1．4ThestructureofthreeprimaryflavinsdetectedinSoneidensisMR·lbiofilms．[126]与Shewanellaoneidensis不同的是，在Geobactersulfurreducens中，电子的转移只能通过直接传递的形式到达电极表面。研究指出，Geobactersulfurreducens基因组中存在着111中C型细胞色素所对应的编码基因，这比迄今为止报道的所有种类的微生物均要多[127]。因此，针对不同的电子受体，Geobactersulyurreducens中电子经由C型细胞色素进行传递的途径也不同[128。1301。除了通过细胞外膜上的细胞色素蛋白与电极接触进行电子传递外，EAB还可通过细胞表面的特殊结构进行电子传递。近年来的研究表明，在生物阳极中，Shewanellaoneidens&[131，132】和Geobactersu@rreducens[16，1331等细菌可通过细胞表面鞭毛状的突起结构将电子传递到电极。这些突起结构内部由一系列的C型细胞色素组成，具有较好的导电能力，因此又被称作“纳米导线”【1343】(nanowire)。正是由于有了这些“纳米导线”的存在，使得一些远离电极表面的EAB能将代谢产生的电子传递到电极，实现了电子在微生物和电极间的长距离传输。和生物阳极相比，目前对生物阴极上电子在电极和EAB之间传递途径的研究还不多，很多的机理只是停留在假设阶段，缺乏相关的证据。近年来，不断有研究者发现，对接种有EAB的生物阳极进行驯化，能够使其转化为生物阴极1119，1351。因此，有学者参照生物阳极中EAB的电子传递机制，提出了几种生物阴极中可能存在的与生物阳极相逆的电子传递机制(图1．5)[28,30]，认为EAB同样可以直接或间接的方式从电极表面获得电子。在直接电子传递中，外源电子通过与．(N≥岜害口luo|c薹k．^o《巴qp{甘里骘暑-譬-毫薏暑}^曙l‰n万方数据浙江大学博士学位论文绪论阴极表面相接触的细胞色素蛋白传递到细胞内膜，并将其转移到细菌的电子传递链中，用于对最终电子受体的还原。在间接电子传递中，除了常见的氧化还原电子介体外，某些EAB还能以电极表面产生的氢气作为其电子供体，这些间接电子供体可穿过细胞外膜，并在氢化酶的催化下发生氧化，将电子转移到细胞内电子受体。抽M一⋯铆∥弋／。lTermina{eIe靠∞n$徽雠Of}e蓥．ox》'gen．$讲魄e．e锄⋯j图1．5生物阴极可能的电子传递机制A：直接电子传递[28】；B：氢气间接传递；C：电子介体间接传递【28】Figure1．5Proposedelectrontransfermechanismsonbiocathode．A：directelectrontransferbyc-哆pecytochromeelectrontransferchains；B：theproductionofhydrogenforsubsequentmicrobialconversion；C：mediatedelectrontransfertoahydrogenase．1．3．3电化学活性细首生物膜的形成机制在BES中，EAB的生长受到很多因素的影响，除了常规的影响微生物代谢的温度[136]、pH值【60，137，13引、碳源类型和浓度【67'139-141】等因素外，电极材料[35,38】、电极电势[95，141，142]、溶液中电子供体／受体的种类【65，143】等也会对EAB在电极上的生长以及电子传递过程产生一定的影响。有研究指出，在生物阳极构建的过程中，如果给电极施加一较正的电势，则EAB生物膜能在阳极表面快速的形成【95】。这是由于较正的电势可以使得EAB在电子由细胞内传递到细胞外的过程中获得更多的能量。因此这些微生物会有选择性地集中在这一适宜其生存的环境中，即在14n万方数据浙江大学博士学位论文绪论电极表面大量富集。同样，对生物阴极施以较负的电势，也有利于EAB生物膜在阴极表面的快速形成【541。通过在挂膜过程中给电极施加电势，实际上是对接种进反应器的细菌进行了一次定向的筛选。Jeremiasse等【139】的研究则发现，在构建产氢生物阴极的过程中，往溶液中添加低浓度的乙酸有助于BES的快速启动。这是因为相较于无机碳源(HC03一)，乙酸能为微生物提供更多的能量，从而在BES启动的初期阶段促进包括EAB在内的微生物快速生长。对Shewanellaoneidensis而言，在其生物膜生长过程中，氧气扮演了非常重要的角色【62，1441。由于氧气具有较高的氧化还原电位，因此，当溶液中存在微量氧气时，Shewanellaoneidensis在代谢过程中能获得更多的能量，从而在电极表面大量富集。然而，如果氧气浓度过高，更多的Shewanellaoneidensis会选择氧气而非电极作为电子受体，从而使得电极上富集的生物量减少。虽然针对EAB在电极表面形成机制的研究已开展了不少，但这些研究主要都是集中在宏观层面上对生物电极运行效能的考查。为了直观深入地对生物膜的形成机制及影响因素进行考查，需要从微观层面上对EAB生物膜的生长过程加以研究，因此有必要对电极上的生物膜厚度进行在线的连续测试。目前，有关生物膜厚度测试的方法有很多。根据微生物菌种以及测试体系的不同，每种方法所利用的原理也不同。利用生物膜生长过程中会对容器内溶液浊度／吸光度【145，1461、管道压力[147]以及导热性【148】等产生影响的特点，可设计特殊基底的装置，用于对生物膜的形成进行在线监测。通过对生物膜进行特殊的染色或标记，并利用专门的仪器对这些标记物进行定量测试，同样可以得到生物膜厚度的数据，如生物发光法【1491、荧光法【150-1521、核磁共振光谱法【153】等都是利用了这一原理。除此之外，对于生长在易被腐蚀基底表面的生物膜，可通过三电极体系测试溶液的氧化还原电势，用以间接衡量生物膜厚度的变化【1541。尽管，以上这些方法都能满足对生物膜厚度的测试，然而它们都或多或少地具有各种缺陷，例如在测试过程中需要特殊加工的基底或者需要对样品进行染色标记，且部分方法难以实现在线的连续监测。因此，急需针对BES中EAB的特点开发出一套适用于实验室中微生物膜厚度连续在线监测的方法。n万方数据浙江大学博士学位论文绪论1．4生物阴极在污染物降解中的应用1．4．1生物阴极处理无机污染物生物阴极处理无机污染物，是将微生物的催化作用与阴极的电化学还原作用进行的结合，其中最典型的是生物阴极对重金属污染物的还原。某些重金属离子存在于污水中会对人类健康造成危害，通过生物阴极的催化还原，可将这些重金属离子转换成低毒价态的离子，或是可直接使其沉淀，达到去除的目的。Tandukar等[27】在MFC中采用生物阴极对含Cr6+的废水进行处理，最大还原速率达到了0．46mgCr6+／gVSS·h，同时输出的电流密度达到123．4nlm／m2，能量密度达到55．5mW／m2，经过还原处理的Cr6+最终以Cr(OH)3的形式沉积在电极表面，大大降低了重金属废水的毒性及重金属离子的浓度。除了对重金属的催化还原，生物阴极还可为某些具有电化学活性特征的微生物正常代谢提供所需的电子和能量。例如某些反硝化细菌【111，155,1561(G．metallireducens等)或硫酸盐还原菌【112，1571(D．desulfuricans等)，其细胞内具有还原硝酸盐或硫酸盐所需的一系列酶系，在自然环境中可通过化能自养过程将硝酸盐还原为氮气或将硫酸盐还原为硫化氢等低价态硫化物。通过生物阴极的构建，可通过外电路为这些微生物提供代谢过程所需的能量和电子，从而便可实现生物阴极对废水的脱氮或脱硫处理。1．4．2生物阴极降解有机污染物根据处理对象以及处理工艺的不同，生物阴极对有机污染物的去除所涉及到的原理也各不相同，但所有的污染物去除过程均是以电子由电极向EAB的定向转移为前提的。Huang等1137]以乙酸钠为碳源驱动MFC产生电子，并用于生物阴极对五氯苯酚的脱氯，当五氯苯酚初始浓度为30mg／L时，反应器运行3天后对五氯苯酚的去除率达到60．6％。在阴极表面，氧气和五氯苯酚均作为电子受体竞争电极上的外源电子。Aulenta等[113]构建了用于对三氯乙烯进行脱氯处理的BES反应器，通过电化学还原使得氢气在电极表面大量生成，并到达EAB细胞内参与三氯乙烯的还原。Wang等【25】考察了生物阴极对苯胺的去除效果，微生物在电极表面以电极和乙酸钠为电子供体，通过对BES施加0．5V的电压，24h内即实现了88．2％的苯胺去除率。同样地，Hou等【13】构建了用于对刚果红进行脱色的MFC反应器，以葡萄糖和阴极作为EAB共同的电子供体，170h内取得了90％n万方数据浙江大学博士学位论文绪论的染料脱色率。在阴极中，微生物除了可以电极作为电子供体外，还可以有机碳源作为电子供体，因此细菌的生长速度非常快。但同时有机碳源和电极间形成了竞争电子受体的关系，电子由电极向微生物的传递受到了一定的影响。除了以上几种直接或间接以有机碳源作为电子供体处理有机污染物的生物阴极，还有学者构建了以电极和污染物同时作为电子供体的生物阴极，Li等【78】构建的BES中，微生物在阴极室曝气的情况下，实现了对偶氮染料脱色产物的矿化降解。尽管利用生物阴极对有机污染物降解的方法和条件各不相同，但为了使微生物能耐受较高浓度的污染物，都需要向其中直接或间接地加入有机碳源，这在一定程度上给BES处理有机污染物时的稳定性和经济性造成了一定的影响。1．5存在的问题与研究思路随着化工行业的快速发展，产生了大量的难降解有机污染物。含有这些污染物的废水一旦排放入水体中，会对人类健康和环境安全造成严重的危害。生化法处理工业废水，由于该工艺具有成本相对低廉、运行操作相对简单等特点，因此得到了广泛的研究和应用。利用生化法处理难降解有机废水时，一般要求废水中存在一定量易被微生物降解的有机碳源。然而，难降解有机废水往往B／C低、可生化性较差，传统的生化处理工艺对这类废水的处理效果有限，需要对其进行改进。生物阴极以电极作为电子和能量供体，驱动EAB一系列代谢反应，取代了传统生化处理工艺中的有机碳源，从而使得微生物代谢过程摆脱了对有机碳源的依赖。因此，生物阴极技术的发展为BES处理难降解有机废水提供了可能。然而，由于BES是近几年才兴起的概念，很多的关键问题仍未有明确的答案，这给研究生物阴极处理难降解有机废水带来了一定的困难。主要存在的问题包括：(1)在利用BES处理难降解有机废水的研究中，针对高效去除难降解有机污染物的EAB筛选和驯化方法以及生物阴极构建方法的研究较少，生物阴极处理难降解有机污染物的参数优化研究也不够系统。(2)生物阴极表面电子传递机制仍停留在假设阶段，电子由电极向EAB传递进而参与难降解有机污染物降解的途径仍不明确。(3)在生物电极表面EAB生物膜生长动力学研究中，无法对生物膜生长情况进行原位地连续监测，导致对EAB生物膜生长过程的研究都主要集中在宏观层面。微观层面对EAB生物膜形成机制的研究较少。n万方数据浙江大学博士学位论文绪论因此，研究用于高效去除难降解有机污染物的EAB筛选和驯化方法、生物阴极构建方法，并在此基础上研究电极表面EAB的电子传递机制以及生物膜形成机制，对于BES中生物阴极处理难降解有机废水原理的深入研究，以及对BES的性能优化和工业化应用均具有重要的作用。本文选用活性蓝13和五氯苯酚作为目标污染物，分别代表偶氮染料及氯酚类两种常见的难降解有机污染物，针对上述关键科学问题，本论文的研究思路为：(1)建立一套适用于难降解有机污染物处理的EAB筛选与驯化方法，在此基础上构建用于处理难降解有机污染物的生物阴极。(2)考查生物阴极表面电子传递途径。通过宏基因组测序，研究生物阴极上的EAB种群分布，并分析其对于电子传递的影响。(3)建立一套用于对产生氧化还原电子介体的EAB生物膜厚度进行测试的方法，研究生物电极表面EAB生物膜的形成机制及影响因素，并在此基础上对EAB生物膜的生长过程进行动力学分析。在解决以上关键问题的同时，对生物阴极运行条件进行优化，以提高BES对难降解有机污染物的去除效率，缩短污染物处理所需要的时间。构建用于处理难降解有机废水的含双极性电极的MFC堆栈，用以实现市政污水与难降解有机废水的同步处理，为生物阴极在难降解有机废水处理中的应用提供理论依据和设计指导。1．6研究内容与技术路线1．6．1研究内容本论文以活性蓝13和五氯苯酚为代表，构建了用于处理难降解有机废水的微生物电化学系统，从菌种筛选和驯化、生物阴极构建和优化、反应器结构和运行条件优化等方面着手提高难降解有机污染物在基于生物阴极的BES中的去除效率，并对生物电极表面的EAB电子传递机制与生物膜形成机制进行了研究。本论文主要研究内容包括以下几个方面：(1)建立一套适用于难降解有机污染物处理的EAB筛选与驯化方法，对不同的筛选与驯化方法进行对比和评价。构建用于处理难降解有机污染物的生物阴极，考查电极电势、污染物初始浓度、氧化还原电子介体以及pH值等对生物阴极污染物去除效率的影响，并对生物阴极的运行条件加以优化。n万方数据浙江大学博士学位论文绪论(2)对生物阴极表面电子传递途径进行研究，通过对多种间接电子传递途径进行排除，证实生物阴极中存在直接的电子传递途径。采用454高通量测序技术对脱氯生物阴极表面菌落组成进行全面分析。(3)利用铂探针微电极对生物电极表面生物膜厚度进行测定，建立一套用于对产生氧化还原电子介体的EAB生物膜厚度进行原位测试的方法。以ShewanellaoneidensisMR．1为研究对象，考查EAB生物膜的形成机制，研究氧气、电极电势、有机碳源浓度以及外源氧化还原电子介体等对EAB生物膜形成过程的影响。在此基础上，对EAB生物膜进行生长动力学分析。(4)构建基于生物阴极的MFC堆栈反应器，对比其它反应装置，评价MFC堆栈对难降解有机污染物的去除效率，并对反应器运行条件进行优化。1．6．2技术珞线本论文以处理难降解有机废水的BES生物阴极为主线，构建了高效去除难降解有机污染物的生物阴极，在此基础上对BES电极表面EAB的电子传递机制及生物膜形成机制进行探究，并从实际应用的角度对BES反应装置进行改进。论文具体技术路线如图1．6所示。■_商圈震l生物阴极表面电子传递ll机制；目翻浮罾鳓确疆㈣|形成机制lr誓_搿：篓焉纛黧”鬟*鬻i麓：j、。。。i纛i—》l掣需慧鬻镖l臣垂巫刃i。翥}。赢攀。攀&堪撒腿刈L蔗燃一j区囝巨圈图1．6本论文研究技术路线Figure1．6Reserchplanofthethesis．19构建基于生物阴极的。一一一嗲篡携掇⋯。。～．i“}“—。-‘’。“⋯x*E。⋯⋯wE～、1：EE"反应器运行条件优化；。篡篙；蠢赫嚣I；：I．；：篡雾冀。；：嚣耋：!篡篆：：嚣薹萋i反应嚣运行效果评价i一。⋯。⋯一。。。一。。⋯．：§n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化2电化学活性细菌的筛选与驯化在生物阴极中，EAB被看作是催化电极表面一系列电子转移的催化剂。这些微生物本身具有接受外源电子的能力，电极表面电子能传导至细胞膜或细胞内，参与微生物新陈代谢。因此，作为生物阴极中重要的组成部分，EAB的生理特性直接决定着生物阴极乃至整个BES的运行性能。在生物阴极的研究中，用于接种的污泥一般取自生活污水处理厂或污染源现场水样，这些污泥中含有种类繁多的微生物。为了使BES达到较高的运行效果，确保污泥中EAB尽可能多地成功生长在电极表面，需要对接种的细菌进行一系列筛选与驯化。目前，大多数学者都是利用微生物燃料电池或微生物三电极体系对菌种加以筛选及驯化，通过给工作电极施加负电势，使具有接受外源电子能力的EAB在电极表面附近大量富集。然而，在筛选与驯化具有难降解有机污染物高效去除能力的EAB过程中，难降解有机污染物对微生物往往具有一定的毒害作用，会抑制微生物的正常生理活性，从而影响电化学筛选与驯化的效果。因此，有必要对传统筛选和驯化方法加以改进，使其适用于处理难降解有机污染物EAB的筛选与驯化。本章分别以活性蓝13(ReactiveBlue13，RBl3)和五氯苯酚(Pentachlorophenol，PCP)作为目标污染物，建立了一套适用于难降解有机污染物处理的EAB筛选与驯化方法，为构建用于高效去除活性蓝13的生物阴极和高效去除五氯苯酚的生物阴极提供了菌种来源。本章主要考查了不同筛选与驯化阶段的微生物活性，评价了筛选与驯化方法的效果，并对不同的筛选与驯化方法进行了对比和分析。2．1实验材料与方法2．1．1实验试剂及营养液组成本章节用于HPLC分析的试剂为色谱纯，其余化学试剂均为分析纯。其中，活性蓝13购于阿法埃莎(天津)化学有限公司，五氯苯酚购于杭州惠普化工有限公司，其分子结构见图2．1。组成维生素溶液的所有试剂购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，其余试剂购于杭州惠普化工有限公司。本章节中所用气体购于杭州今工特种气体有限公司，高纯氢纯度为99．999％，混合气为80％氮气与20％二氧化碳。由于实验中用于细菌生长的营养液中存在着大量的NaCl、NaH2P04、Na2HP04、NaHC03等钠盐，因此五氯苯酚在溶液中以五氯酚钠的形式存在。20n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化图2．1活性蓝13(a)和五氯苯酚(b)的分子结构Figure2．1Molecularstructureofreactiveblue13(a)andpentachlorophen01(b)．活性蓝13及五氯苯酚高效降解菌的初始富集阶段采用添加有目标污染物的LB液体培养基，其组成如下：表2．1细菌富集阶段LB液体培养基组成Table2．1ComponentsofLBmediumduringtheperiodofbacteriaenrichment．⋯含量(g／L)成分——活性蓝13高效降解菌富集五氯苯酚高效降解菌富集亲氢气自养菌筛选过程所使用的营养液以及EAB驯化过程中的工作电极室溶液均为厌氧基础培养液。根据所筛选菌种的不同，其组成如表2．2所示：其中，微量金属元素溶液配方为：氨三乙酸1．5g／L，MgS04，7H203g／L，NaCllg／L，FeS04’7H200．1gm，CoCl0．1g／L，ZnS04O．1g／L，CuS04·5H200．01g几，AIK(S04)20．01gm，H38030．01gm，Na2M004‘2H200．01g／L。维生素溶液配方为：pyridoxine5mg／L，riboflavin2．5mg／L，thiamine2．5mgm，nicotinicacid2．5mg／L，D—Calcium2．5mg／L，p-aminobenzoicacid2．5mg／L，thiocticacid2．5mg／L，folicacid1mg／L，biotin1mg／L，vitaminB120．05mg／L。对电极室中的营养液除了不添加NaHC03溶液、微量金属元素溶液与维生素溶液外，其余组成与厌氧基础培养液一致。21n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化表2．2每升厌氧基础培养液组成(pH=7．O)Table2．2Componentsofanaerobicbasalmediumperliter(pH=7．0)．含量成分——活性蓝13降解菌驯化五氯苯酚降解菌驯化为确保营养液不受杂菌的污染，LB液体培养基、厌氧基础培养液(不含微量金属元素溶液、维生素溶液)在配置完成后均需进行高压灭菌。微量金属元素溶液及维生素溶液在配置完成后经0．22岬滤膜过滤，于超净工作台内转移到厌氧基础培养液中。2．1．2实验材料本章节实验中所用血清瓶(125mL)、顶空铝盖(直径20mm)、封口器、一次性医用注射器(1mL、5mL、10mL)等购于杭州米克化工有限公司。丁基胶塞购于美国chemglass公司，型号为CLS．4209．14。EAB驯化所采用的反应装置如图2．2所示。其中工作电极为高纯石墨块电极(5cm×3cm×1cm，纯度99．99％，北京吉兴盛安工贸有限公司)。石墨块顶端用微型车床(CJ0618，扬州真牛机床有限公司)凿出直径0．6cm、深2cm的圆形小孔，将直径0．6cm、长17cm的高纯石墨棒(纯度99．99％，北京吉兴盛安工贸有限公司)插入其中，石墨棒与石墨块接触处用碳导电胶(美国SPISuppliesn万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯1化公司)黏连。对电极为直径0．6cm，长20cm的高纯石墨棒(纯度99．99％，北京吉兴盛安工贸有限公司)。参比电极为上海精密科学仪器有限公司232—01型饱和甘汞电极(相对标准氢电极电势为+240mV，本章所有电势均指相对标准氢电极电势)。实验中使用的质子交换膜为NationTM117质子交换膜(美国Dupont公司)。gas蕊et。Nafi。。nlembran。9图2．2微生物电化学反应器装置示意图Figure2．2Schematicofbioelectrochemicalreactor反应器为双室反应器，由两个对称的玻璃反应室组成，每个反应室有效容积为340mL。工作电极室底部设有进气口，顶部设有出气口，反应器运行过程中持续向营养液曝N2／C02混合气。反应器外层由玻璃夹套包裹，实验过程中，通过潜水泵将恒温水浴锅内蒸馏水循环泵入玻璃夹套内，从而保证反应器内营养液维持在恒定温度。工作电极室和对电极室相连处通过质子交换膜相阻隔，其横截面积为15．9cm2。质子交换膜在使用前参照Liu等【80】的报道先进行预处理，将质子交换膜依次放入30％的H202溶液、去离子水、0．5MH2S04溶液、去离子水中进行80℃水浴加热，每一步处理分别持续1小时。两个极室间以及反应器瓶体与瓶盖间通过铁夹固紧。为了保证反应器的密闭性，顶端开口处用胶塞密封，在胶塞与反应器以及反应器瓶体与瓶盖接触处均涂上真空油脂(美国Dowcoming2tn万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化公司)。实验中使用的主要仪器设备如表2．3所示。表2．3实验中所用的仪器设备Table2．3Equipmentsusedinexperiments．2．1．3亲氢气自养菌的筛选方法本章节实验用于驯化的菌种来自实验室厌氧／好氧生物流化床中厌氧室，该反应器内原始污泥取自杭州市四堡污水处理厂厌氧工艺段，并用于处理含活性蓝13和五氯苯酚的染化废水连续运行了两年。取自流化床的菌种先通过LB液体培养基进行富集。在超净工作台中将70mLLB液体培养基分装至经灭菌处理的血清瓶中，盖紧胶塞后用顶空铝盖加以密封。将灭菌后的针头插入血清瓶底部，通N2／C02混合气30min，排出瓶内氧气。之后，取10mL流化床菌液，通过一次性注射器注入到密封的血清瓶中，并将接种后的血清瓶置于30。C的恒温培养箱中振荡培养。每隔5天为一周期，取10mL菌液转移到已经过灭菌及曝气处理的含70mLLB液体培养基的血清瓶中继续培养。富集过程持续6个周期，每个周期均设置三组平行实验。为了保证电极成为EAB唯一的电子供体，需确保营养液中无有机碳源的存在，微生物以外源电子作为能量来源维持其生长代谢。此类以电极作为电子供体的EAB，其同化代谢类型为自养型。因此，本章节以氢气作为能量来源，通过对24n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化活性蓝13降解菌和五氯苯酚降解菌进行筛选，分别获得具有降解活性蓝13能力和降解五氯苯酚能力的亲氢气自养菌。为了防止高浓度的活性蓝13和五氯苯酚可能对细菌的筛选过程产生抑制作用，污染物的投加采用了梯度递增的方式，具体操作步骤如下：(1)用于降解活性蓝13的亲氢气自养菌的筛选1)在超净工作台中将70mL厌氧基础培养液分装至经高压灭菌后的三组平行的血清瓶中，并分别投加O．5mg活性蓝13。取10mL活性蓝13降解菌富集菌液加入到血清瓶中，盖紧胶塞后用顶空铝盖加以密封。2)将灭菌后的针头插入血清瓶底部，通N2／C02混合气30min。之后，充入高纯氢气，使瓶内氢气分压达到0．2MPa。3)每隔12小时，取2mL样品，测试活性蓝13浓度。当活性蓝13被完全降解时，更替厌氧基础培养液，每次营养液更替计为一个培养周期。4)更替培养液时，先将血清瓶中30mL营养液取出，然后再添加新鲜的厌氧基础培养液以及一定量的活性蓝13，使血清瓶内营养液维持在80mL，活性蓝13达到特定的浓度。培养液更替完成后，重复步骤2)、3)。5)筛选过程中，每一培养周期的活性蓝13投加量遵循梯度递增的原则，分别为0．5mg，0．5mg，1．0mg，2．5mg，2．5mg，2．5mg，5．0mg。(2)用于降解五氯苯酚的亲氢气自养菌的筛选1)在超净工作台中将28mL厌氧基础培养液分装至经高压灭菌后的三组平行血清瓶中，并分别投加0．04mg五氯苯酚。取2mL五氯苯酚降解菌富集菌液加入到血清瓶中，盖紧胶塞后用顶空铝盖加以密封。2)将灭菌后的针头插入血清瓶底部，通N2／C02混合气30min。之后，充入高纯氢气，使瓶内氢气分压达到0．2MPa。3)每隔12小时，取0．5mL样品，测试五氯苯酚浓度。当五氯苯酚被完全降解时，更替厌氧基础培养液，每次营养液更替计为一个培养周期。4)更替培养液时，先将血清瓶中10mL营养液取出，然后再添加新鲜的厌氧基础培养液以及一定量的五氯苯酚，使血清瓶内营养液维持在30mL，五氯苯酚达到特定的浓度。培养液更替完成后，重复步骤2)、3)。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化5)筛选过程中，每一培养周期的五氯苯酚投加量遵循梯度递增的原则，分别为0．04mg，0．04mg，O．10mg，0．10mg，O．10mg，O．10mg，0．10mg，0．21mg，O．21mg，O．42mgo2．1．4电化学活性细菌的驯化方法EAB的驯化在微生物三电极体系中进行。取335mL厌氧基础培养液添加到已经过高压灭菌的三电极反应器中，并通过反应器底部的进气口对营养液曝N2／C02混合气30min。之后，将亲氢气自养菌液进行稀释，使OD600值(微生物悬浊液在600nln处的吸光度，用以衡量微生物浓度的常规指标)达到0．6。取5mL稀释后的菌液加入到反应器中，并投加一定量的目标污染物，使活性蓝13初始浓度达到100mgm或五氯苯酚初始浓度达到20mgm。为了使电极具有提供外源电子的能力，采用计时电流法(Chronoamperometry,CA)对EAB进行驯化，通过电化学工作站对工作电极电势进行控制，使其稳定在．0．2V，并每隔10min记录一次电流值。驯化过程中，每隔12小时对反应器内活性蓝13或五氯苯酚的浓度进行测定，并及时投加活性蓝13或五氯苯酚，以保证反应器内活性蓝13浓度维持在100mg／L，或五氯苯酚浓度维持在20mg／L。当工作电极电流达到稳定时，将石墨块电极表面的生物膜刮下，并用厌氧基础培养液定容到5mL，重复以上步骤，对EAB进一步驯化。经过三个周期的连续驯化，EAB的活性基本达到稳定的水平。为比较筛选及驯化方法的效果，另设置两组反应器作为对照，分别取厌氧／好氧生物流化床中厌氧室内污泥以及经LB液体培养基富集培养后的菌液稀释至OD600值到0．6，并取5mL菌液加入到反应器中，平行重复以上步骤。2．1．5分析测试方法活性蓝13浓度的测定采用分光光度法。活性蓝13溶液在570am波长处有最大吸收峰，且峰高值与其浓度成正比。测试前，活性蓝13溶液需先经过0．22lam水系滤头过滤处理，以消除溶液中悬浮微生物对该波长段吸光度的干扰。五氯苯酚浓度通过高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)进行测定。HPLC分析所使用的设备为Agilent1260，检测器为紫外检测器，色谱柱为ODS．C18反相柱。采集的样品经过0．22lain滤膜过滤后，取滤n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化液进行HPLC分析。流动相组成为：15％超纯水(pH=3．0，以H3P04调节)，85％L腈(acetonitrile)。流动相流速为1mL／min。紫外检测器测试波长为220rim。样品浓度测试前，先对新鲜配置的已知浓度的五氯苯酚标准溶液进行测试，以吸收峰面积相对五氯苯酚溶液浓度的变化绘制标准曲线。五氯苯酚标准溶液的浓度分别为0mg／L、5mg／L、10mg／L、15mg／L、20mg／L、25mg／L。为了排除活性蓝13在长波长段对生物量测定的干扰，OD600值的测定参照Walker课题组的方法[160】：分别测试高速离心前悬浊液及高速离心后上清液在600Flm处的吸光度值，取离心前后吸光度的差值作为样品的OD600值。2．2结果与讨论2．2。1亲氢气自养菌的筛选利用微生物对偶氮染料或氯酚类污染物进行降解，涉及到细胞外和细胞内一系列的酶促反应，其中最关键的限制步骤是破坏偶氮染料分子中的偶氮键[1611及脱除氯酚类物质苯环上的氯原子【1621。这一反应步骤的实现不仅需要微生物本身具有破坏偶氮键或还原脱氯所需的相应酶系，还需要外源电子的供给和能量的输入。在传统生化处理工艺中，葡萄糖等容易被微生物降解的有机碳源所扮演的便是电子供体及能量来源的角色【81。微生物在氧化这类有机碳源的过程中，所产生的电子被转移到NADH2等辅酶中，并伴随一部分的能量固定在其中【281。通过这些辅酶在细胞内的运输，便可将电子和能量转移到酶促反应部位，实现微生物对难降解有机物的共代谢降解。在生物阴极中，电极取代了有机碳源，为EAB提供外源电子及代谢所需能量。为了确保EAB以电极作为唯一电子供体，需要将有机碳源从BES中排除。最终获得的生物阴极上EAB应是以无机碳为碳源的自养型细菌。考虑到对这类细菌进行直接电化学筛选的困难性，我们在进行电化学筛选与驯化之前先用氢气替代电极对菌种进行筛选培养，以氢气作为无机的电子供体及能量来源，从而筛选出高效降解活性蓝13的亲氢气自养菌及高效降解五氯苯酚酶系的亲氢气自养菌。难降解有机污染物对微生物往往具有一定毒害性，因此在筛选的过程中，采用了污染物梯度投加的方式，即在确保其它条件不变的情况下，开始先投加低浓度的目标污染物，待微生物逐渐适应这一浓度的污染物后再逐步提高目标污染物的投加量。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化图2．3所示为高效降解活性蓝13的亲氢气自养菌筛选过程，以活性蓝13浓度的变化作为考查亲氢气自养菌活性的指标。筛选初期，由于菌液中可利用氢气作为能源的细菌所占比例较少，活性蓝13的去除速率非常低，仅为1．51+0．02mg／L·d。随着筛选过程的推进，血清瓶中富集了大量以氢气作为电子供体及能量来源，并可高效降解活性蓝13的菌种，菌液对活性蓝13的去除速率不断加快。经过14个周期的连续筛选，活性蓝13的去除速率达到了17．41+0．32me,／L·d。筛选过程中，活性蓝13投加量的变化对微生物的活性表现出了一定的抑制作用。当活性蓝13初始浓度由31．25mg／L上升到62．5mg／L时，微生物对活性蓝13的去除速率立即从8．60-a：0．21mgm·d下降至3．71土1．03mg／L·d。经过2天的培养，微生物逐渐适应溶液中高浓度的活性蓝13，其去除速率不断提高，最终达到了12．41土0．72mg／L·d。图2．3高效降解活性蓝13的亲氢气自养菌筛选过程(血清瓶氢气分压：0．2MPa，营养液：70mL，接种菌液：10mL)Figure2．3TheprocedureofhydrogenophilicautotrophicbacteriascreeningforefficientdegradationofRB13．(I-12partialpressure：0．2MPa，nutrientmedium：70mL，bacterialculture：10mL)图2．4所示为高效降解五氯苯酚的亲氢气自养菌筛选过程。经过17个周期的连续筛选，菌液对PCP的去除速率由初始时的0．30-J：0．02mg／L·d上升到2．12土0．05mg／L·d，亲氢气自养菌在血清瓶内不断富集。从筛选过程中看，五氯28n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化苯酚与活性蓝13一样，对微生物具有一定的毒性，甚至其抑制作用比活性蓝13更大。当五氯苯酚初始的浓度由7mg／L上升到14mg／L时，去除速率迅速从1．90士0．07m扎．d下降至O．11士0．03mg／L·d，经过7天的适应后，其去除速率才逐渐恢复到1．86+0．13mg／L·d。实验结果说明，经过一段时间的定向筛选，亲氢气自养菌得到了富集，并可在缺少有机碳源的环境中利用氢气作为电子和能量来源驱动EAB一系列代谢过程以及对难降解有机污染物的去除。尽管经筛选后的菌种对活性蓝13、五氯苯酚等难降解有机污染物具有较强的去除效果，但这些污染物本身对微生物具有一定的毒害作用，因此非常有必要采用污染物梯度递增的方式对亲氢气自养菌进行连续筛选，以尽可能减小污染物对微生物的毒害。通过连续的筛选，具有高效降解活性蓝13或五氯苯酚酶系的微生物得以在体系中保留，并将这一性状传递给子代细菌，从而表现为血清瓶内的菌种逐渐适应高浓度的难降解有机污染物，且污染物去除速率不断提升。01020304050607080Time(day)图2．4高效降解五氯苯酚的亲氢气自养菌筛选过程(血清瓶氢气分压：O．2MPa，营养液：28mL，接种菌液：2mE)Figure2．4TheprocedureofhydrogenophilicautotrophicbacteriascreeningforefficientdegradationofPCP．(H2partialpressure：0．2MPa，nutrientmedium：28mL，bacterialculture：2mL)2840一rl＼∞声I)昌。=矗k-昌∞u昌。u(1U厶n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化2．2．2电化学活性细菌的驯化在微生物三电极体系驯化EAB的过程中，采用电流密度作为考查EAB活性的指标。电流密度是指单位时间内通过单位面积的电量，它可以用来描述电极表面氧化还原反应的速率。在生物阴极中，EAB催化电极表面的电子发生迁移，使电极被氧化。因此，电极表面还原反应的速率即代表了EAB催化还原反应的能力，电流密度绝对值越大代表电极表面EAB活性越高。图2．5所示为高效降解活性蓝13的EAB的驯化过程。在驯化初期，因为电极表面没有EAB的附着，所以电子转移速率非常低，电流密度仅为．0．88mA／m2。这一时期，由于微生物的生长环境发生了变化，电子及能量供体由原来的氢气变成了电极，因此微生物仍处在缓慢的适应期。在接种7天后，电流密度的绝对值开始逐渐增长，并在10天时达到了稳定水平，电流密度维持在．18mA／m2至．20mA／m2范围内波动。随着驯化周期的持续，接种至反应器内的EAB所需的适应期逐渐缩短。在进入第3个周期的驯化时，电流密度绝对值在反应器重新接种2天后就出现了明显的跃升，在接种5天后，电流密度绝对值达到最高的24mA／m2至25mA／m2。由此可见，通过连续的驯化，能使得活性较强的EAB在反应器内不断富集，缩短生物阴极挂膜所需要的时间，提高生物阴极的电子传递性能。电流密度绝对值的不断增大，也说明EAB已成功附着在电极表面。图2．6所示高效降解五氯苯酚的EAB的驯化过程与高效降解活性蓝13的EAB的驯化过程相似。微生物的生长同样经历了适应期、增长期和稳定期。随着驯化周期的推进，EAB的适应期从9天减少到了3天，稳定期电流密度的绝对值从25mA／m2左右提升到31mA／m2左右。经过电化学驯化，为构建高效处理五氯苯酚的生物阴极提供了优良的菌种。为了比较本章筛选与驯化方法与传统的EAB筛选与驯化方法的差异，特设立了两组实验进行对照。以高效降解活性蓝13的EAB驯化为例，图2．5中以厌氧／好氧生物流化床中厌氧室内污泥作为接种源的反应器代表了传统的取生活污水或污染现场水样直接进行三电极体系筛选与驯化的方法，以取自LB液体培养基富集后的菌液作为接种源的反应器代表了经污染物驯化后再进行电化学驯化的筛选与驯化方法。不难发现，经过前期含有活性蓝13的LB培养基富集n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化培养后，接种液中的细菌较厌氧／好氧生物流化床内厌氧室的细菌对高浓度的活性蓝13溶液具有更好的适应性，其电流密度绝对值的上升速度为后者的3—4倍。然而，和本章实验中所采用的筛选与驯化方法相比，虽然细菌已经过活性蓝13溶液的定向筛选，但其在BES中挂膜所需的时间远超过本实验结果(接种14天仍未达到稳定)，其最终的电流密度仅为本实验筛选方法的1／6。’25p，20曼《暑=’15售云=‘10暑匕5-505101520253035Time(day)图2．5高效降解活性蓝13的电化学活性细菌驯化过程中电流密度的变化(反应器体积：340mL，接种菌液OD600值：0．6，工作电极电势：一0．2V，活性蓝13浓度：100mg／L)Figure2．5ChangesofcurrentdensityduringtheelectrochemicallyactivebacteriaacclimationforefficientdegradationofRBl3．(reactorvolume：340mL，OD600ofbacterialculture：0．6，workingelectrodepotential：一0．2VRBI3concentration：100mg／L)通过在电化学驯化之前引入亲氢气自养菌的筛选过程，能够有效地从难降解有机污染物降解菌中筛选出潜在地可以电极作为电子供体的菌种。因此，当将经过筛选后的亲氢气自养菌接种到反应器中时，菌种能够较快速地适应电化学驯化体系。另外，通过前期的筛选排除了大量的非电化学活性细菌，从而消除了这些细菌在电化学驯化阶段与EAB的竞争，为EAB在电极表面的附着提供了更多的空间，因此大幅缩短了电化学驯化所需要的时间，提高了生物阴极中EAB的“纯度”，提升了BES整体的运行性能。11n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化图2．6高效降解五氯苯酚的电化学活性细菌驯化过程中电流密度的变化(反应器体积：340mL，接种菌液OD600值：0．6，工作电极电势：．0．2V，五氯苯酚浓度：20mg／L)Figure2．6ChangesofcurrentdensityduringtheelectrochemicallyactivebacteriaacclimationforefficientdegradationofPCE(reactorvolume：340mL，OD600ofbacterialculture：0．6，workingelectrodepotential：一0．2VPCPconcentration：20mg／L)s2．3本章小结本章分别以活性蓝13和五氯苯酚作为目标污染物，分别筛选与驯化出了高效降解活性蓝13和五氯苯酚的EAB，主要结论如下：(1)通过对亲氢气自养菌进行梯度筛选，分别获得了以氢气为电子供体的活性蓝13高效降解菌和五氯苯酚高效降解菌，前者对活性蓝13的去除速率达到17．41m0．32mg／L·d，后者对五氯苯酚的去除速率达到2．12i0．05mgm’d。(2)活性蓝13和五氯苯酚等难降解有机污染物对微生物具有一定的毒害作用。当活性蓝13初始浓度由31．25mg／L上升到62．5mg／L时，微生物对活性蓝13的去除速率立即从8．60-4-0．21mg／L·d下降至3．71+1．03mg／L·d。当五氯苯酚初始的浓度由7mg／L上升到14mg／L时，去除速率迅速从1．90+0．07mgm‘d下降至0．11土0．03mg／L·d。对于筛选与驯化用于处理难降解有机污染物的EAB，不能1’n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌的筛选与驯化采用高浓度污染物溶液直接驯化，而应采取污染物浓度梯度递增的方式进行驯化。(3)建立了一套适用于难降解有机污染物处理的EAB筛选与驯化方法。通过对原始污泥进行污染物定向富集、亲氢气自养菌梯度筛选以及微生物三电极体系驯化，分别得到了高效降解活性蓝13和五氯苯酚的EAB。该方法大幅缩短了生物阴极挂膜时间，并有利于提高生物阴极的运行性能。与传统的直接电化学筛选与驯化方法相比，该方法特别适用于高效去除难降解有机污染物的EAB的筛选与驯化。。n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化3生物阴极的构建与优化利用细菌、真菌等微生物处理生活污水及工业废水，由于工艺流程简单、运行维护费用低、适用范围相对较广，因此一直都被受以广泛的关注和研究。如何对传统生化工艺进行改进，将其应用到难降解有机废水处理中，已成为近年来热门的研究课题。目前，较为普遍的方法是：针对某一类特定的污染物，先从自然界中筛选出可降解该污染物的细菌或真菌，并对菌种加以驯化[5,61或基因改造【7】’培育出能在工程上应用的菌株，之后再将其运用到污水处理工艺中，对相关运行参数进行优化。一般来说，环境中存在的难降解有机污染物并非微生物代谢所必须的营养物质，相反，这些污染物在细胞外环境中的积累往往会对微生物代谢过程造成一定的毒害。能够耐受某一类高浓度难降解有机污染物的微生物，其细胞内都具有相应的污染物降解酶系，并可通过共代谢途径对污染物进行去除。这类微生物可通过呼吸作用将葡萄糖等初级代谢底物进行分解，并利用氧化得到的电子和呼吸作用获得的能量驱动一系列难降解有机污染物酶促降解反应【8，1611。利用生物阴极处理难降解有机污染物，就是在此基础上对传统生化处理工艺所做的改进。用电极替代葡萄糖等初级代谢底物，为微生物处理难降解有机污染物持续地提供电子和能量。由于该方法在对污染物进行处理的过程中不需要额外添加有机碳源，不会造成二次污染，因此特别适用于对低B／C的难降解有机废水进行处理。此外，生物阴极上EAB与电极间的相互作用可通过电化学参数直观表现出来，因此该方法还可实现对生化处理工艺中污染物降解细菌活性的在线监测。构建用于处理难降解有机废水的生物阴极，就是将高效去除特定难降解有机污染物的EAB与碳电极材料相整合，使其可作为模块化组件，用于不同条件下的污染物处理。本章以第二章中驯化得到的高效降解活性蓝13的EAB及高效降解五氯苯酚的EAB作为接种源，分别构建了用于处理活性蓝13和五氯苯酚的生物阴极，并对生物阴极的运行条件进行了优化。本章主要监测了生物阴极构建过程中EAB的活性，考查了电极电势、污染物初始浓度、氧化还原电子介体以及pH值等对生物阴极去除污染物效果的影响，得到了生物阴极运行的优化条件，并对活性蓝13在BES反应器中的代谢产物进行了分析。n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化3．1实验材料与方法3．1．1实验试剂及营养液组成本章节所使用活性蓝13购于阿法埃莎(天津)化学有限公司，五氯苯酚购于杭州惠普化工有限公司，均为分析纯。实验中用于HPLC和离子色谱(IonChromatography，IC)分析的试剂为色谱纯，其余所有试剂均为分析纯。其中组成维生素溶液的所有试剂购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，其余试剂购于杭州惠普化工有限公司。本章节中所使用的气体购于杭州今工特种气体有限公司，其中高纯氢纯度为99．999％，混合气为80％氮气与20％一-氧化碳。实验中工作电极室营养液为厌氧基础培养液，活性蓝13和五氯苯酚的投加量根据不同实验而变。对电极室中的营养液除了不添加NaHC03溶液、微量金属元素溶液与维生素溶液外，其余组成与厌氧基础培养液一致。厌氧基础培养液的组成详见第二章2．1．1小节。3．1．2实验材料本章节所用的工作电极、对电极及参比电极与第二章2．1．2小节中EAB驯化阶段所使用的电极一致。电极在使用前需进行预处理，将经过砂纸打磨后的电极在丙酮溶液中浸泡30rain，之后再用蒸馏水反复清洗电极表面。实验中使用的质子交换膜为NationTM117质子交换膜(美国Dupont公司)，取样使用的一次性医用注射器购于杭州米克化工有限公司。丁基胶塞购于美国chemglass公司，型号为CLS．4209．14。实验中使用的主要仪器设备如表3．1所示。3．1．3反应器结构本章节所使用的反应器与EAB驯化阶段所用反应器一致，反应器的连接及质子交换膜的预处理均参见第二章2．1．2小节。3．1．4生物阴极构建方法生物阴极的构建是在微生物三电极模式下进行的。针对不同的污染物，生物阴极构建方法有所不同。对于构建降解活性蓝13的生物阴极，先将335mL厌氧基础培养液添加到已经过高压灭菌的BES反应器工作电极室中，曝N2／C02混合气30rain，以去除营养液中的溶解氧和反应器顶部的空气。曝气后，向工作电极室内投加34mg的活性蓝13，并从之前高效降解活性蓝13的EAB驯化装置n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化内取菌液5mL加入到反应器工作电极室内。反应器启动过程中，通过电化学工作站对工作电极电势加以控制，交替执行循环伏安法(CyclicVoltammetry,CV)和计时电流法程序。采用计时电流法对EAB进行驯化，工作电极电势维持在．0．2V(本章所有电势均指相对标准氢电极电势)，电流值每隔5min采集一次。驯化过程中，每隔48h对工作电极执行循环伏安扫描。CV扫描范围为．O．8V到0．8V，扫描速率为5mV／s，每次扫描重复3次。为了保证反应器内活性蓝13不被耗竭，每隔12h取2mL样品测试活性蓝13的浓度，并通过投加一定量的活性蓝13使其浓度恢复到100mg／L。实验过程中，持续对工作电极室曝N2／C02混合气，反应器温度控制在35℃。表3．1实验中所用的仪器设备Table3．1Equipmentsusedinexperiments．对于构建降解五氯苯酚的生物阴极，先将五氯苯酚添加到厌氧基础培养液中，浓度为20mg／L，在棕色瓶中过夜搅拌，待完全溶解后开展后续实验。接种前，先取335mL含有五氯苯酚的厌氧基础培养液添加到反应器工作电极室中，曝n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化N2／C02混合气30min，之后取5mL高效降解五氯苯酚的EAB菌液添加到工作电极室内，启动挂膜。反应器启动同样采用CV和CA交替的模式。CV每隔24h执行一次，扫描电势范围为．0．56V到1．04V，扫描速率为5mV／s。执行CA时，工作电极电势控制在．0．2V，并每隔5min对电极电流进行采集。启动过程中，每隔24h测试反应器内五氯苯酚浓度，并对其浓度进行调节，使反应器内五氯苯酚浓度维持在20mg／L的水平。所有反应器均以铝箔包裹，以防止五氯苯酚发生光解。实验过程中，持续向反应器中曝N2／C02混合气，并控制温度在30℃。为消除不同生物阴极间差异所造成的实验误差，所有实验均设置了三组平行反应装置。3．1．5生物阴极优化实验为了实现生物阴极对难降解有机污染物的去除，并评价其去除效果，需对生物阴极处理难降解有机污染物的运行条件进行优化，具体包括对以下几个影响因素的考查：(1)污染物初始浓度：工作电极电势控制在．400mV，改变活性蓝13的初始浓度从50mg／L上升到200mg／L(50mg／L、100mg／L、150mgm、200mg／L)。类似地，研究五氯苯酚初始浓度的影响时，控制工作电极电势恒定在．400mV，改变五氯苯酚的初始浓度，考查五氯苯酚初始浓度由10mgm交到40mg／L(10mg／L、20mg／L、30mg／L、40rag／L)时，生物阴极对五氯苯酚的去除效率。(2)工作电极电势：活性蓝13初始浓度维持在100mg／L，改变工作电极电势从一100mV变到．600mV(．100mV、．200mV、．300mV、一400mV、．500mV、．600mV)，并设置一组开路实验作为对照。类似地，考查工作电极电势对生物阴极去除五氯苯酚的实验中，五氯苯酚初始浓度控制在20mg／L，改变工作电极电势进行污染物去除实验。(3)氧化还原电子介体：以氧化还原电子介体蒽醌．2,6．磺酸钠(anthraquinone．2,6．disulfonate，AQDS)作为研究对象，考查其浓度分别为0mM、O．01mM、0．05mM以及0．1mM时，对生物阴极去除活性蓝13和五氯苯酚的影响。实验中，工作电极电势恒定为．400mV，活性蓝13的初始浓度为100mg／L，五氯苯酚的初始浓度为20mg／L。(4)pH值：调节营养液pH值，分别考查pH值在5．5、6．0、6．5、7．0、7．5、n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化8．0时，生物阴极对活性蓝13以及五氯苯酚的去除效率。实验中，工作电极电势恒定为-400mV，活性蓝13的初始浓度为100mgm，五氯苯酚的初始浓度为20mgm。以上实验均在序批式条件下运行，电化学工作站每隔20秒对工作电极电流值进行采集。为了对比生物阴极和非生物阴极在不同条件下对活性蓝13及五氯苯酚的去除效率，实验过程中另设三个平行的非生物阴极反应器，其所有实验条件及操作程序均与生物阴极反应器一致，唯独电极表面未附着EAB。每一组实验开始前，先取出工作电极存放于厌氧基础培养液中，对反应器进行超声清洗及高温灭菌。之后，将工作电极放入反应器中，并将340mL已经过N2／C02混合气曝气处理30min的含有目标污染物的厌氧基础培养液添入反应器中，开始实验。在考查生物阴极对活性蓝13去除效果的实验中，每组实验运行8h，每隔1h取3mL样品，用于紫外分光光度计及HPLC分析。实验结束后，取50mL样品进行总有机碳(TotalOrganicCarbon，TOC)含量分析，剩余溶液取200mL进行气相色谱质谱联用(GasChromatograph-MassSpectrometer,GC—MS)分析。在考查生物阴极对五氯苯酚去除效果的实验中，每组实验运行100h，每隔一定时间取3mL样品，用于HPLC及IC分析。实验结束后，取50mL样品进行TOC分析。为了对实验前后溶液中微生物浓度的变化进行监测，在每组实验开始和结束时，分别取3mL样品，用于OD600值的测定。3．1．6分析测试方法利用瑚PLC对活性蓝13降解过程进行分析，检测器为紫外检测器，检测波长570nm，色谱柱为ODS．C18反相柱。采集的样品经过高速离心(10000r)后，上清液经0．22lma滤膜过滤处理，取滤液进行HPLC分析。流动相组成为：15％0．002M四正丁基磷酸铵溶液(tetrabutylammonium—dihydrogenphosphatesolution)，15％O．02MNaH2P04溶液和70％乙腈。流动相流速为0．8rnL／rnin。利用GC．MS对活性蓝13降解中间产物进行分析，方法参照Lin等【8】的报道，采用与HPLC分析时相同的处理方法，对样品先进行预处理。得到的滤液经二氯甲烷萃取三次后用旋转蒸发仪于45℃条件下水浴旋蒸至1mL。气相色谱配备的色谱柱为HP．5毛细管柱(30mx0．25minx0．25lam)，柱温先在70℃维持5min，之后以5。C／min的速度升至150℃。进样口温度及检测器温度则控制在n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化260uC。利用IC对五氯苯酚脱氯效率进行分析，检测器为电导率检测器，色谱柱为ASl8柱，流动相为25mM的KOH溶液，流速为1mL／min。样品在测试前，同样需进行预处理，其方法与活性蓝13样品的预处理方法一致，TOC采用总有机碳分析仪直接测定，样品在进入仪器前需进行预处理，去除其中的悬浮微生物，其方法与上文一致。库仑效率(CoulombicEfficiency,CE)在本论文中是指用于还原活性蓝13或五氯苯酚的电荷数与外电路传递来的电荷数的比值，它可用来衡量生物阴极在降解污染物的过程中对外源电子的利用效率。其计算公式为：CE=VcFbAC／MQ其中，Vc表示的是工作电极室的有效容积(340mL)，F表示的是法拉第常数(Faraday’Sconstant，96485C／mole-)，Q代表的是总电量，即电流对运行时间的积分。在活性蓝13降解实验中，b代表的是每还原1mol活性蓝13分子所转移的电子数(4mole／molRBl3)，AC代表的是实验前后活性蓝13降低的浓度，M是活性蓝13的分子量(1003．5g／molRBl3)。在五氯苯酚降解实验中，b代表的是每脱去一个氯原子所需要的电子数(1mole-／molC1一)，AC表示的是实验前后C1。浓度的增加量，M是Cl‘的相对质量(35．5g／m01)。对活性蓝13进行紫外分光光度法测定、对五氯苯酚进行HPLC测试以及对样品OD600值测定的方法见第二章2．1．5小节。3．2结果与讨论3．2．1生物阴极的构建构建用于处理活性蓝13的生物阴极持续18天，通过测试电极电流密度以监测电极表面生物膜的形成过程。如图3．1所示，电极表面生物膜的生长经历了迟滞期、增长期和稳定期三个阶段，从第4天开始到第6天，电极电流密度绝对值发生明显增长，由4m刖m2到5m刖m2快速增长至22iiiA／m2到25mAfm2，之后电流密度绝对值稳定在20nlA／m2左右。反应器启动不同阶段的CV图谱如图3．2所示，在运行18天后，生物阴极CV图中氧化还原峰值较启动初期有了明显的增高，而对照组实验中，非生物阴极的CV图氧化还原峰与之前相比则几乎没有变化。这说明，EAB已成功附着在电极表面，并可催化电子由电极向活性蓝13n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化的转移。图3．1用于处理活性蓝13的生物阴极构建阶段电流密度的变化(工作电极电势：一0．2V，活性蓝13浓度：100mg／L)Figure3．1Changesofcurrentdensityduringtheperiodofbiocathodeset—upforRB13degradation．(workingelectrodepotential：一0．2VRB13concentration：100mg／L)构建用于处理五氯苯酚的生物阴极耗时11天，电流密度随运行时间的变化如图3．3。EAB的生长在第6天开始进入到增长期，稳定期电流密度达到了迟滞期的6-8倍。通过对CV图谱(图3．4)的分析可发现，反应器启动前后，电极的CV图谱有了显著的差异。在生物阴极构建初始以及非生物阴极运行11天后的CV图中，没有出现明显的氧化还原峰，而在运行11天后的生物阴极CV图中，在+0．2V左右出现了一对明显的氧化还原峰。这说明，由于EAB的存在，使得电极具有了对五氯苯酚等的还原能力，生物阴极的构建基本成功。对比以往的文献【1393】，本论文中反应器的启动时间明显加快，这主要是因为前期的筛选和驯化工作为生物阴极的构建提供了具有高效去除难降解有机污染物能力的EAB，从而省去了反应器启动过程中对细菌的筛选过程。另一方面，在反应器启动过程中除了HC03。，还添加了活性蓝13或五氯苯酚，这些污染物的氧化还原电势均高于HC03。，微生物在对其进行催化还原的过程中能获得更多的能量，从而加速了细菌的生长。40n万方数据浙江大学博士学位笙茎竺塑堕壑塑塑堡兰垡些图3．2用于处理活性蓝13的生物阴极构建过程不同阶段的循环伏安图谱(扫描范围：一0．8V到+O．8V，扫描速率：5mV／s)Figure3．2Cyclicvoltammogramsatdifferentperiodsofbiocathodeset—upforRB13degradation．(scanningrange：一0．8Vto+O．8Vscanningrate：5mV／s)图3．3用于处理五氯苯酚的生物阴极构建阶段电流密度的变化(工作电极电势：一0．2V，五氯苯酚浓度：20mg／L)Figure3．3Changesofcurrentdensityduringtheperiodofbiocathodeset—upforPCPdegradation．(workingelectrodepotential：一0．2VPCPconcentration：20mgm)41n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化图3．4用于处理五氯苯酚的生物阴极构建过程不同阶段的循环伏安图谱(扫描范围：一O．56V到+1．04V，扫描速率：5mWs)Figure3．4Cyclicvoltammogramsatdifferentperiodsofbiocathodeset—upforPCPdegradation．(scanningrange：一O．56Vto+1．0Vscanningrate：5mV／s)3．2．2生物阴极对活性蓝13的去除实验开始前，先进行了一组开路条件下的空白实验，考查石墨电极对活性蓝13的吸附效率。由于活性蓝13分子中的偶氮键起到了关键的显色作用，一旦偶氮键被破坏，则活性蓝13分子就会失去显色能力，因此可通过脱色率来衡量反应器对活性蓝13的去除效果。反应器经过8h的连续运行后，活性蓝13的脱色率为2．9+0．9％。与后续的实验结果相比较，该脱色率基本可忽略。在此前提下，开展了一系列条件实验，考查生物阴极去除活性蓝13的优化运行条件。(1)活性蓝13初始浓度的影响图3．5展示了利用生物阴极处理活性蓝13时，不同活性蓝13初始浓度对于活性蓝13脱色率、TOC去除率以及库仑效率的影响。随着活性蓝13初始浓度的增加，生物阴极对活性蓝13的去除速率不断加快，由库仑效率可知，更多的外源电子在EAB的催化作用下被转移给活性蓝13。当活性蓝13初始浓度为100mg／L时，生物阴极对其脱色效率最高，8h后的脱色率达到80．2士5．5％。这一效率较传统的生化处理工艺有了很大的提升(Lin等【8]利用厌氧／好氧流化床工艺4’n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化对活性蓝13进行处理，20h内的脱色效率为67．48％)。TOC测试结果显示，50％左右的经过脱色处理后的活性蓝13分子能被生物阴极中的细菌加以利用，进而被矿化。通过与非生物阴极进行对照，生物阴极明显提升了活性蓝13的脱色速率和脱色效率，对于溶液中有机物的去除效率也有着显著的提高。图3．5活性蓝13初始浓度对生物阴极(A)活性蓝13脱色效率、(B)活性蓝13初始脱色速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(工作电极电势：一400mV，pH=7．0，T=35oC，t=8h，三组反应器平行)Figure3．5EffectsoftheinitialRB13concentrationon(A)RB13decolorizationefficiency,(B)initialRB13decolorizationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．(workingelectrodepotential：一400mV,pH=7．0，T=35。C，t=8h，threeidenticalreactors)(2)工作电极电势的影响工作电极，作为EAB代谢过程中唯一的电子供体和能量来源，其电极电势的高低直接影响着电极表面的氧化还原反应及其速率，并决定了EAB从电极可获得的最大能量。由图3．6可见，生物阴极对活性蓝13的脱色效率和脱色速率随着电极电势的下降而上升，这主要是由于在较低的电极电势下电极表面的电43n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化子能量更高，电子更易从电极迁移到活性蓝13偶氮键中氮原子的空电子轨道上，用于打破活性蓝13分子的偶氮键[1631。在此基础上，还原产生的中间产物被微生物进一步分解矿化，因此TOC也随着电极电势的下降而升高。当电极电势由．400mV下降至．600mV时，尽管生物阴极对活性蓝13的脱色效率仍在不断提升，但库仑效率却迅速下降。这主要是由于当电极电势低于一400mV时，产氢反应成为电极表面发生的主要反应，质子和活性蓝13分子在电极上竞争外电路电子。为了提高能量利用效率，在生物阴极处理难降解有机污染物的过程中，应尽可能避免电极上产氢反应的发生，即需将电极电势控制在产氢电势(一420mV，pH值为7．0时)以上。图3．6电极电势对生物阴极(A)活性蓝13脱色效率、(B)活性蓝13初始脱色速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(活性蓝13初始浓度100mg／L，pH=7．0，T=35。C，t=8h，三组反应器平行)Figure3．6Effectsoftheappliedpotentialon(A)RB13decolorizationefficiency,(B)initialI出13decolorizationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．finitialRBl3concentration：100mg／L，pH=7．0，T=35。C，t=-8h，threeidenticalreactors)n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化和非生物阴极相比，生物阴极大大提升了反应器对TOC的去除效率。尽管在没有EAB的情况下，单一电化学还原作用已能实现对活性蓝13较高的脱色效率，但通过EAB的进一步催化，能够明显提高反应器对活性蓝13的脱色速率(一400mV时，对活性蓝13脱色速率的提升达到55％)。在生物阴极中，除了有EAB的催化降解以外，电极本身也可对活性蓝13进行还原，从而一定程度上降低了溶液中活性蓝13的浓度，进而减小了难降解有机污染物对EAB的毒害。值得注意的是，生物阴极库仑效率均低于非生物阴极，这主要是由于电极上电子除了被用于催化还原活性蓝13分子外，还有一部分被微生物所接受，参与其自身的一系列代谢反应。当BES反应器处于开路状态下时，反应器中活性蓝13脱色率和TOC去除率均处在较低的水平(活性蓝13脱色率为2．8±0．7％，TOC去除率为2．0±1．8％)。此时，活性蓝13在体系中的去除不再受到电化学还原作用的影响，仅取决于电极表面EAB对活性蓝13的降解和吸附作用。这说明，当体系中无外源电子提供时，则无法实现EAB对活性蓝13的高效催化降解。而当在开路条件下向反应器中投加1g／L葡萄糖作为碳源时，经过8h的运行处理后，反应器对活性蓝13的脱色率可达到23．9±1．3％。这说明，只要有充足的外源电子提供，EAB即可实现对活性蓝13的还原脱色。但是，当EAB以葡萄糖作为电子供体时，其电子传递至细胞电子传递链的速率受限于细菌自身对葡萄糖的分解代谢速率，且低于电极作为电子供体时的电子传递速率。因而，以葡萄糖作为电子供体时，EAB对活性蓝13的脱色效率较低。另外，经过筛选和驯化后，部分菌种已适应电极作为电子和能量供体的新环境，葡萄糖无法再被这些细菌加以利用，这也可能导致上述的实验结果。(3)氧化还原电子介体的影响AQDS是微生物燃料电池研究中常用的氧化还原电子介体，在微生物阳极室中，某些EAB本身不能将代谢产生的电子直接传递给电极，需要自身合成或外源添加一定的电子介体，实现电子由细胞内向细胞外的转移。图3．7是就AQDS在生物阴极中对电子传递的介导作用进行的一系列考查。结果显示，无论是在生物阴极还是非生物阴极中，外源电子介体都对活性蓝13脱色的促进作用都不明显。造成这一结果的原因可能是：1)活性蓝13的脱色还原主要在电45n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化极表面进行，AQDS不能起到电子由电极到活性蓝13分子之前的传递作用；2)AQDS不能被降解活性蓝13的EAB利用，因此不能促进生物阴极对活性蓝13的降解。随着AQDS浓度的增加，反应器库仑效率逐渐下降，AQDS与活性蓝13分子之间构成了竞争电极电子的关系。互7．5专曼三∞董5．0二暑置名2．5甚!粤三0．0图3．7蒽醌一2，6一磺酸钠浓度对生物阴极(A)活性蓝13脱色效率、(B)活性蓝13初始脱色速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(活性蓝13初始浓度100mg／L，工作电极电势：一400mV，pH=7．0，T=35。C，t=8h，三组反应器平行)Figure3．7EffectsoftheAQDSconcentrationon(A)RB13decolorizationefficiency,(B)initialRB13decolorizationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．(initialRB13concentration：100mgm，workingelectrodepotential：一400mY,pH=7．0，T=35。C，t=8h，threeidenticalreactors)(4)pH值的影响图3．8反映了pH值由5．5变到8．0时，反应器中活性蓝13脱色效率、脱色速率、TOC去除效率以及电极库仑效率的变化。由图可知，生物阴极降解活性蓝13的最适pH值在6．5—7．0之间，此时生物阴极对活性蓝13的脱色效率达到n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化80％以上，对TOC的去除效率达到29％。此外，在非生物阴极体系中，较低的pH值有利于电极对活性蓝13的还原脱色。这主要是因为在还原破坏偶氮键的过程中，除了需提供外源电子，还需要提供足够的质子，其反应式如下：10一N=N—R’+4H++4e‘—}Io—NH2+R’～NH2图3．8pH值对生物阴极(A)活性蓝13脱色效率、(B)活性蓝13初始脱色速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(活性蓝13初始浓度100mg／L，工作电极电势：一400mV，T=35。C，t=8h，三组反应器平行)Figure3．8EffectsofpHon(A)RB13decolorizationefficiency,(B)initialRB13decolorizationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．(initialRB13concentration：100mg／L，workingelectrodepotential：一400mV,T=35。C，t=8h，threeidenticalreactors)同样地，当EAB参与到对活性蓝13的催化降解时，在一定范围内，质子浓度越高越有利于还原反应的进行。然而，当pH值过低时，会对细菌体内的酶系造成一定的破坏，从而抑制微生物的活性，影响其正常的代谢过程。因此，当pH值由6．5降到5．5时，生物阴极对活性蓝13和TOC的去除效果均大47n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化幅下降。当pH值达到5．5时，活性蓝13脱色率和TOC去除率在生物阴极反应装置中分别为73．1士1．5％和8．1+2．2％，仅略高于非生物阴极的71．1+1．9％和3．8士1．5％，说明EAB在该pH值下对活性蓝13去除的贡献已非常低。(5)活性蓝13的降解过程分析实验中，对不同运行模式(开路模式、电化学处理模式、生物电化学处理模式)下的活性蓝13残留液进行了HPLC定量分析，并通过GC．MS对样品组成进行了测试。如图3．9所示，在开路条件下，HPLC谱图中没有新的峰出现，活性蓝13的浓度也和初始条件下几乎一致。在电化学体系中，活性蓝13的浓度显著降低，并伴随有一系列还原产物的生成。经生物阴极处理后，残留液中除了活性蓝13的电化学还原产物外，还检测到了2．氯．4，6．二氨基．1，3，5．三嗪、苯胺等小分子芳香族化合物。这些化合物同样在传统的生化法处理染料的工艺中被检测到，并被认为是较易被微生物进一步降解与吸收的[8，1611。”J1．’JHI、．1Jh‘Jl二15lin¨I,,IinlIi¨I‘_InIinl图3．9不同处理条件下活性蓝13降解产物的高效液相色谱和气相色谱质谱联用分析；A：活性蓝13；B：2．氯．4，6．二氨基．1，3，5．三嗪；C：苯胺Figure3．9HPLCandGC—MSanalysisofRBl3anditsdegradationproductsbydifferenttreatingmethods；A：reactiveblue13；B：2-chloro一4，6一diamino-1，3，5一triazine；C：aniline．48仃Un呐h粤Jm矗0^J舯i2●●n0o_一E-0c2lJ．至《n、^Jm石0鼻JmIfl=ulo兰三k蔫‘l《n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化综合以上实验结果，推测在本论文构建的生物阴极处理活性蓝13的体系中，可能存在着三种电子的转移途径(图3．10)：1)电子在电极表面直接转移给活性蓝13；2)外源电子传递给EAB，并通过微生物的催化转移到活性蓝13；3)电子被EAB接收，进而用于细胞自身的合成代谢。因此，不排除体系中可能存在某些可利用EAB产生的有机物作为碳源进行代谢的细菌，通过对这些有机物加以利用，这部分细菌同样可驱动活性蓝13的还原降解。另外，生物阴极上的活性蓝13降解细菌通过对活性蓝13中间产物的进一步降解，会使电化学还原反应平衡发生偏移，这样一来，同样能促进电极表面活性蓝13的电化学及生物电化学还原[1641。CO2，1CO，organiccarbonSOUrce辟RBl3喜。。舻RBl3穿ntermediate一_，一，products‘一’一／，／●一●÷一一．一4electrochemicallyactivebacteria●RBl3degradingbacteria图3．10生物阴极降解活性蓝13可能的电子转移途径Figure3．10ProposedmechanismofelectrontransferpathwaysforRB13degradationonbiocathode．3．2．2生物阴极对五氯苯酚的去除如第二章所述，五氯苯酚在溶液中以五氯酚钠的形式存在，为了排除石墨电极的吸附作用对五氯苯酚降解实验结果的影响，在条件实验开始前，设立了空白吸附实验。实验结果显示，当五氯苯酚初始投加浓度为20mg／L时，经过100h的运行后，电极对五氯苯酚的去除率为5．6+2．O％。后续实验将在此基础49n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化上对生物阴极以及非生物阴极的去除效果进行评价和讨论。(1)五氯苯酚初始浓度的影响通过对五氯苯酚初始投加浓度的考查可发现，生物阴极对五氯苯酚的去除率以及脱氯速率随着五氯苯酚初始浓度由10mg／L上升到20mg／L而增加。但是，当五氯苯酚初始浓度进一步由20mg／L上升到40mg／L时，生物阴极对五氯苯酚的去除能力迅速下降(图3．11)。这一结果和生物阴极处理活性蓝13时相差很大，主要原因是高浓度的五氯苯酚对EAB具有较强的毒性，尽管通过电化学还原可使一部分五氯苯酚在电极表面被还原去除，但电化学还原对五氯苯酚的去除能力不如对活性蓝13的去除能力强，因此继续增加五氯苯酚的初始投加量，会使得其在溶液中大量积累，进而对微生物造成毒害。图3．11五氯苯酚初始浓度对生物阴极(A)五氯苯酚去除率、(B)脱氯速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(工作电极电势：一400mV，pH=7．0，T=30。C，t=-100h，三组反应器平行)Figure3．11EffectsoftheinitialPCPconcentrationon(A)PCPremovalrate，(B)dechlorinationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．(workingelectrodepotential：一400mV,pH=7．0，T=30。C，t=100h，threeidenticalreactors)气nn万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化与非生物阴极相比，生物阴极对五氯苯酚具有更强的去除能力，当五氯苯酚初始浓度为20mg／L时，生物阴极对五氯苯酚的去除率为非生物阴极的3倍，对TOC的去除率为非生物阴极的2．7倍，脱氯速率为非生物阴极的5．4倍。实验结果说明，生物阴极上的EAB能够利用电极作为电子供体，催化五氯苯酚的高效降解。(2)电极电势的影响图3．12所示为电极电势对生物阴极去除五氯苯酚的影响。随着电极电势的降低，生物阴极对五氯苯酚、TOC的去除率以及五氯苯酚的脱氯速率均得到了提升。当电极电势下降至．500mV时，生物阴极对五氯苯酚的去除率在70h时就已超过90％，而此时的库仑效率却远低于电极电势为．100mV到．400mV时的库仑效率值，仅为．400mV时的7％。尽管较低的电势能加速对五氯苯酚的去除，但对阴极电流同样也有促进作用。和生物阴极处理活性蓝13时一样，当电极电势低于．400mV时，除了对五氯苯酚的催化还原外，电极表面的EAB还能催化产氢反应。产生的氢气迅速被排出反应器或直接被微生物加以利用，更进一步加速了电极表面还原产氢反应。另外，当电极电势下降到一定水平后，外源电子不再成为限制生物阴极对五氯苯酚去除的因素，细菌自身的代谢能力和生物量成为了限制因素。因此，较低电势下产生的电流，大部分流向了质子，造成生物阴极库仑效率下降，能量利用率不高。通过与非生物阴极进行比较，在同一电极电势条件下，生物阴极的库仑效率均高于非生物阴极。这说明，在生物阴极中，EAB起到了催化剂的作用，能够催化外电路中的电子定向地向五氯苯酚转移，用以脱除氯原子。值得注意的是，当BES反应器处于开路条件下时，五氯苯酚去除率仅为7．2±1．7％，TOC去除率仅为1．1±0．1％。这说明当无外源电子提供时，单一的微生物作用对于五氯苯酚的去除效果不佳，即EAB对五氯苯酚的高效降解需要利用外电路作为驱动反应的电子供体和能量来源。当在开路条件下向反应器中投加1g／h葡萄糖时，反应器对五氯苯酚的去除率在100h的运行时间内可达到13．6±1．9％。这说明生物阴极上的EAB本身是具有对五氯苯酚还原脱氯的酶系的，而这一还原过程需要外源电子的提供。与电极相比，葡萄糖作为外源电子供体时，其供电子能力受限于细菌自身的代n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化谢反应速率，因而五氯苯酚在微生物共代谢降解作用下的去除率远低于极化后生物阴极作用下的去除率。图3．12电极电势对生物阴极(A)五氯苯酚去除率、(B)脱氯速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=-100h，三组反应器平行)Figure3．12EffectsoftheappliedpotentialON(A)PCPremovalrate，(B)dechlorinationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h，threeidenticalreactors)(3)氧化还原电子介体的影响图3．13展示了不同AQDS浓度下，BES及电化学系统(Electrochemicalsystem，ES)反应器中的五氯苯酚去除率、脱氯速率、TOC去除率以及库仑效率。在ES中，AQDS对五氯苯酚的去除没有任何影响，说明AQDS不能直接将电子转移给五氯苯酚。当AQDS浓度增加时，非生物阴极的库仑效率随之下降，说明AQDS与五氯苯酚在电极表面存在着竞争电子的关系。而在BES中，尽管库仑效率随着AQDS浓度的增加同样也下降，但是其对五氯苯酚和TOCn万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化的去除率均有一定的提升。通过对不同反应器中生物量进行测试，添加有0．01mMAQDS反应器中的残余液较未添加AQDS反应器中的残余液的OD600值有了显著提升(0．01mMAQDS反应器中为0．147，未添加AQDS反应器中为0．025)。由于AQDS可作为氧化还原电子介体，所以当其添加进反应器后，一部分可利用外源电子介体作为电子供体的EAB不再需要附着在电极上与其它细菌竞争空间。这部分EAB可在溶液中悬浮生长，通过AQDS的介导，间接地利用外电路电子催化五氯苯酚的降解反应。图3．13蒽醌一2，6一磺酸钠浓度对生物阴极(A)五氯苯酚去除率、(B)脱氯速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(五氯苯酚初始浓度20mg／L，工作电极电势：一400mV，pH=7．0，T=30。C，t=100h，三组反应器平行)Figure3．13EffectsoftheAQDSconcentrationon(A)PCPremovalrate，(B)dechlorinationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．(initialPCPconcentration：20mg／L，workingelectrodepotential：一400my,pH=7．0，T=300C，t=100h，threeidenticalreactors)之所以AQDS对降解五氯苯酚的EAB的生长促进作用较降解活性蓝13的EAB明显，可能是因为在利用生物阴极处理活性蓝13时，反应器运行时间较53n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化短，生长在电极上的EAB还未来得及适应溶液环境的变化。另外，也有可能是降解活性蓝13的EAB本身不具备以AQDS作为电子介体的能力。(4)pH的影响与活性蓝13的电化学还原相类似，对五氯苯酚的还原脱氯除了需要外源电子，还需要有质子的参与，其反应式如下：C6C150H+5H++10e一—÷C6H60+5C1一因此，pH值对于生物阴极中五氯苯酚的去除同样具有一定的影响(图3．14)。图3．14pH值对生物阴极(A)五氯苯酚去除率、(B)脱氯速率、(C)总有机碳去除率及(D)库仑效率的影响(五氯苯酚初始浓度20mg／L，工作电极电势：一400mV，T=30。C，t=100h，三组反应器平行)Figure3．14EffectsofpHon(A)PCPremovalrate，(B)dechlorinationrate，(C)TOCremoval，and(D)CE．(initialPCPconcentration：20mg／L，workingelectrodepotential：一400mY,T=30。C，t=l00h．t11reeidenticalreactors)当pH值由8．0下降至5．5时，非生物阴极对五氯苯酚的去除率不断增强，n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化即较低的pH值有利于五氯苯酚的电化学还原。在生物阴极中，当pH值由8．0下降到6．5时，五氯苯酚去除率逐渐增高，在pH值6．5的条件下，生物阴极对五氯苯酚的去除效果达到最佳(89．7+3．7％)。然而，继续降低pH值，生物阴极对五氯苯酚的去除率却迅速下降，说明当pH值低于6．0时会对EAB产生抑制作用。这一结果与传统生化处理方法中五氯苯酚降解菌最适的pH值范围(6．0到7．0)相一致【165l。3．3本章小结本章在第二章基础上，以筛选和驯化得到的高效降解活性蓝13的EAB和高效降解五氯苯酚的EAB作为接种源，分别构建了用于处理活性蓝13和五氯苯酚的生物阴极，并对生物阴极的运行条件进行了优化，主要结论如下：(1)成功构建了用于处理活性蓝13和五氯苯酚的生物阴极，电极电流密度分别在接种6天和7天后达到稳定。与以往文献相比，通过前期的筛选和驯化，大大缩短了反应器启动时间。(2)生物阴极可有效去除活性蓝13，与单一电化学作用(．400mV)和单一微生物作用(无有机碳源)相比，其脱色率分别可达两者的1．3倍和28．8倍，TOC去除率分别可达两者的8．3倍和14倍。电极电势和pH值对活性蓝13的去除影响显著，最佳电极电势为．400mV，最适pH值为7．0。活性蓝13的脱色主要在电极表面进行，几乎不受AQDS的影响。生物阴极对活性蓝13初始浓度具有较宽的适应范围，但高浓度的活性蓝13初始浓度会导致生物阴极对TOC的去除效率下降。在pH=7．0，电极电势为一400mV，活性蓝13初始浓度为100mg／L的条件下，运行处理8h后，BES对活性蓝13的脱色率达到80．2±5．5％。(3)生物阴极处理活性蓝13体系中，存在三种可能的电子传递途径：1)电子在电极表面直接转移给活性蓝13：2)外源电子传递给EAB，并通过EAB的催化转移到活性蓝13；3)电子被EAB接收，进而用于细胞自身的合成代谢。活性蓝13在生物阴极上的降解是电化学还原、EAB催化以及活性蓝13降解细菌共同作用的结果。(4)生物阴极可有效去除五氯苯酚，与单一电化学作用(-400mV)和单一微生物作用(无有机碳源)相比，其去除率分别可达两者的3倍和12．1倍，TOC去除率分别可达两者的2．7倍和14．6倍。五氯苯酚在溶液中以五氯酚钠的形式存n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极的构建与优化在。最适的五氯苯酚初始浓度为20mg／L，当初始浓度达到30mg／L及以上时，会对微生物产生毒害作用。电极电势越低，生物阴极对五氯苯酚的去除速率越快，但当电极电势低于．400mV时，大部分电子被用于产氢反应。AQDS能促进EAB的悬浮生长，间接促进五氯苯酚的降解。pH值越低越有利于五氯苯酚的还原脱氯，但较低的pH值会抑制EAB的活性，最适pH值为6．5。在pH=6．5，电极电势为．400mV，五氯苯酚初始浓度为20mg／L条件下，运行处理100h后，BES对五氯苯酚的去除率达到89．7±3．7％。n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制4生物阴极电子传递机制生物电极中电子传递的途径一直以来都是研究者们所关注的问题，它关系到BES能量利用效率及污染物去除效率的提升。生物阳极表面电子由EAB向电极传递的机制已得到了深入的研究，几条可能的电子传递途径已被学界广泛认可。然而，和生物阳极相比，目前针对生物阴极电子传递机制的研究还不多。由于生物阴极的构建较生物阳极更加复杂，并且电极表面某些氧化还原反应(如还原产氢反应)会干扰电子传递机制的研究。因此，现有的生物阴极电子传递机理仍然停留在假设阶段，缺乏关键的证据。本章节实验在第三章的基础上以高效去除五氯苯酚的生物阴极作为研究对象，发现在生物阴极中存在着可能的电子由电极直接向EAB传导的途径，并对这一电子传递机制加以证实。本章实验主要考查了生物阴极电势控制在产氢电势以上时，反应器的电流密度、库仑效率以及生物阴极对五氯苯酚的催化去除效率，并研究了BES中EAB分泌物的电化学特性及其对五氯苯酚去除的影响。在此基础上，采用454高通量测序技术对生物阴极表面菌落组成进行了全面的分析，并讨论了可能存在的电子传递机制以及五氯苯酚降解途径。4．1实验材料与方法4．1．1实验试剂及营养液组成本章节所使用五氯苯酚购于杭州惠普化工有限公司，纯度为分析纯。实验中HPLC流动相溶剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。其中，组成维生素溶液的所有试剂购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，其余试剂购于杭州惠普化工有限公司。本章节中所使用的混合气组成为80％氮气和20％2氧化碳，购于杭州今工特种气体有限公司。实验中工作电极室营养液和对电极室电解液组成与第三章3．1．1小节一致，五氯苯酚的初始浓度为20mg／L。4．1．2反应器结构及实验材料本章节所使用的BES反应器装置、工作电极、对电极、参比电极等与第三章一致，详见第三章3．1．2小节和3．1．3小节。无菌真空过滤器购于广州洁特生物过滤制品有限公司(JETBIOFIL)，型号为FPE．204．150。实验中使用的主要仪器设备如表4．1所示。n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制表4．1实验中所用的仪器设备Table4．1Equipmentsusedinexperiments．4．1．3生物阴极构建方法本章实验中所用生物阴极为高效去除五氯苯酚的生物阴极，接种源为第二章中筛选和驯化得到的高效降解五氯苯酚的EAB。生物阴极的构建方法参见第三章3．1．4节，挂膜成功的生物阴极直接用于BES中对五氯苯酚的序批式处理。4．1．4电子传递机制的考查所有涉及五氯苯酚降解的实验均在双室反应器微生物三电极体系中进行，电化学工作站每隔20秒采集工作电极电流值。在加入反应器之前，对溶液曝N2／C02混合气30min。为保证反应器无氧状态，实验中持续向反应器内曝N2／C02混合气。反应器温度控制在30℃。实验设置三组平行反应装置，所有反应器均用铝箔包裹。(1)考查电化学活性细菌对电子转移的催化作用将含有20mg／L五氯苯酚的厌氧基础培养液加入到工作电极室中，考查BES和ES在序批式条件下对五氯苯酚去除率以及电流密度等的影响。电极电势由5Rn万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制．100mV逐渐下调至．600mV(本章所有电势均指相对标准氢电极电势)，并设置开路实验作为对照，反应器运行时间为100h。每隔一段时间，取3mL样品测试溶液pH值，并用于HPLC和IC分析。实验结束后，对BES和ES反应器中残留液进行HPLC分析，测试其中五氯苯酚脱氯中间产物的含量。实验中，重点考查电极电势控制在产氢电势以上(-420mV，pH=7．O)时，EAB对电流密度及五氯苯酚降解的催化效果。(2)考查生物阴极极化状态对五氯苯酚还原的影响取经过一段时间运行的生物阴极和非生物阴极，在新鲜配置的厌氧基础培养液中反复浸润3次，去除吸附在电极或微生物表面的五氯苯酚。电极清洗完成后，将其组装入双室反应器中，加入经除氧处理后的含五氯苯酚的厌氧基础培养液。反应装置在序批式条件下运行。实验开始时，生物阴极和非生物阴极均处于非极化状态，每隔一段时间取3mL样品，用于HPLC和IC分析。反应器在电极非极化状态下运行28h后，通过电化学工作站给生物阴极和非生物阴极施加．400mV的极化电势。反应器在极化状态下共运行47h，每隔一段时间取3mL样品，对其进行HPLC和IC分析。(3)考查电化学活性细菌分泌物对电子传递的影响取．400mV电势条件下运行100h后的BES反应器残留液，对溶液中五氯苯酚的浓度进行调节，使其达到20mg／L，溶液在无菌环境中经0．229m滤膜过滤，取滤过液进行后续实验。测试所用工作电极为之前在．400mV条件下运行100h后的生物阴极及非生物阴极。为消除吸附在电极表面的五氯苯酚或可能存在于生物膜内的氧化还原电子介体对实验结果造成的干扰，实验前将电极浸润在新鲜配置的厌氧基础培养液中，并重复3次。实验先对反应器滤过液进行CV测试，分别考查生物阴极和非生物阴极在滤过液中的CV图谱。其中，CV扫描电势范围为．0．56V到1．04V，扫描速率为5mV／s，每次扫描重复三次。之后，将电极电势设定为．400mV，反应器在序批式条件下运行100h，考查生物阴极和非生物阴极对五氯苯酚的去除效果。为了研究EAB分泌物是否会促进生物阴极电子传递及五氯苯酚的降解，实验中以新鲜配置的厌氧基础培养液作为对照。所有的实验在三组反应器中同时进行，以消除微生物活性或电极差异对实验结果的影响。59n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制4．1．5分析测试方法实验中五氯苯酚及其脱氯中间产物通过HPLC进行测试。进样前需对样品进行预处理，将其经过高速离心(10000r)后，取上清液用O．22岬滤膜过滤，滤过液用于进样分析。HPLC测试所用的色谱柱及测试方法等参见第二章2．1．5节。标准样品在制备过程中，除了加入五氯苯酚外，还添加了一系列可能的五氯苯酚脱氯产物，用以对样品中的降解中间产物进行定量分析。氯离子浓度通过IC进行分析，样品经预处理后进行测试，测试条件参见第三章3．1．6节。每组实验中，均需对厌氧基础培养液中初始的氯离子浓度进行测试，并作为背景值加以扣除。库仑效率用以表征电化学反应器及生物电化学反应器的电子传递效率，其计算公式参见第三章3．1．6节。4．1．6生物阴极首落分析方法生物阴极菌落组成采用454高通量测序技术进行分析。取．400mV电势条件下运行100h后的生物阴极作为研究对象，将电极表面的生物膜刮下，用于测序分析。首先，按照操作指南，利用DNA提取试剂盒(thePowerSoilDNAextractionkit，美国MOBIOLaboratories)将样品中的DNA提取出来。并通过通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG．3’)和533R(5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC．3’)将含有V3区域的16sRNA基因片段进行扩增。DNA扩增通过DNA扩增仪进行，其扩增程序如下：先在95℃条件下运行4min，使DNA预变性。之后进入扩增循环，在每个循环中先于95℃下保持30秒，使模板变性；然后将温度降到55℃，维持30秒，使引物与模板充分退火；之后在72℃保持30秒，合成DNA。循环程序重复40次，最后在72℃保持10min，使DNA产物延伸完整。DNA扩增完成后，对扩增后的样品进行纯化，取1腭扩增子，并用UNIQ．10PCR纯化试剂盒(上海欧易生物医学科技有限公司)进行纯化。纯化后的样品则可参照测试手册，对其进行454高通量测序。测试获得的原始序列通过唯一的标签序列筛选出来，并丢弃长度小于70bp的基因序列。之后对这些序列进行去杂，修剪或去除掉序列中存在的非特异性扩增片段、特异性引物信息或某些标签序列。经过优化后的序列被认可为有效序列，直接用于后续生物信息学分析。提取非重复序列，与NCBIBLAST和SILVA数n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制据库相比对，采用最远邻近法聚类生成运算分类单位(OperationalTaxonomicUnits，OTU)。每一个OTU代表了相似性水平达到97％的序列，即认为是代表了一个种类的细菌。数据分析过程中涉及的距离计算、分类学分析、稀释性曲线绘制以及ace、chao、simpson、shannon等生物多样性及物种数指标的计算均通过MOTHUR软件进行。4．2结果与讨论4．2．1电化学活性细菌对阴极电子转移的催化作用电流值可以反映电子由电极转移到五氯苯酚或者其它电子受体的反应速率[1641，因此实验中用电流作为监测生物阴极脱氯过程的一个指标参数。图4．1所示为不同电势条件下利用BES去除五氯苯酚时的电流密度情况。由图可见，当电极电势控制在一500mV和．600mV时，阴极电流远远高于电极电势为一100mV到一400mV时的电流。这主要是因为当电极电势低于一400mV时，阴极表面发生了质子还原产氢的反应，大量的电子转移到电极还原产生的氢气中。当pH=7．0，电极电势处在．100mV到一400mV范围时，产氢反应在热力学上是不可能发生的，此时阴极电流主要是由五氯苯酚在电极表面的还原脱氯所造成的。值得注意的是，当电极电势高于一400mV时，BES中生物阴极所产生的电流较同一电势水平下ES中非生物阴极的电流要高，这说明BES中的EAB对于五氯苯酚的还原脱氯和电流的形成均起到了非常重要的促进作用。当电极电势低于一400mV时，其实验结果与电极电势处在．100mV到一400mV时一致，即BES中电流总是高于ES。这主要是因为生长在阴极表面的EAB可作为生物催化剂来催化阴极表面的电化学还原产氢过程。此外，也可能是因为这些EAB可利用电极表面产生的氢气作为电子供体，则微生物对氢气的消耗同样也会加速电子由电极向溶液中质子的转移[55，1021。通过对基于五氯苯酚脱氯量而计算得到的库仑效率进行分析，有助于深入了解生物阴极的电子传递过程。由库仑效率和电极电势的关系(图4．2)可以发现，当电极电势控制在一100mV到．400mV时，BES的库仑效率随着电极电势的下降而稳步上升。这说明，在这一电势范围内，电子由电极向EAB的传递成为了五氯苯酚脱氯的限制步骤。更负的电极电势有助于加快五氯苯酚的还原脱氯，更多的电子从阴极转移给五氯苯酚，从而提升了电极的库仑效率。在电极电势为一400n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制mV时，生物电化学作用对五氯苯酚的脱氯效果达到最佳，生物阴极脱氯的库仑效率达到最大的72．7％。和电流密度的变化趋势一致，当BES和ES中的电极处于相同极化电势下时，BES的库仑效率总是要高于ES的库仑效率。这进一步说明，生物阴极表面上生长的EAB能催化五氯苯酚的还原脱氯反应。-1200F_———————1020406080100Time(h)图4．1阴极电势对电流密度的影响O：电化学反应器阴极电势一100mV；●：生物电化学反应器阴极电势一100mV；☆：电化学反应器阴极电势。200mV；-k：生物电化学反应器阴极电势一200mV；△：电化学反应器阴极电势一300mV；▲：生物电化学反应器阴极电势一300mV；V：电化学反应器阴极电势一400mV；V：生物电化学反应器阴极电势一400mV；◇：电化学反应器阴极电势一500mV；◆：生物电化学反应器阴极电势一500mV；口：电化学反应器阴极电势一600mV；■：生物电化学反应器阴极电势一600mV(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h)Figure4．1Effectofimposedpotentialoncurrentdensity．O：一100mVinES；●：．100mVinBES；☆：．200mVinES；★：一200mVinBES；△：一300mVinES；▲：一300mVinBES；V：一400mVinES；V：一400mVinBES；◇：一500mVinES；◆：一500mVinBES；口：一600mVinES；■．_600mVinBES．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30℃，t=100h)n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电予传递机制．100．200．300-400—500-600Potential(mV)图4．2阴极电势对库仑效率的影响(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h，三组反应器平行)Figure4．2Effectofimposedpotentialoncoulombicefficiency．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h，threeidenticalreactors)然而，当生物阴极电势继续降低到一500mV及以下时，BES的库仑效率急剧下降。造成这一现象主要可能有两方面的原因：1)尽管从理论上来说，较低的电极电势以及在这些电势条件下产生的氢气会有助于生物阴极还原脱氯，但是相比于五氯苯酚还原脱氯，还原产氢的反应从电化学的角度来看更容易发生，从而表现为大量的电子参与到质子的电化学还原过程中。2)生物阴极五氯苯酚脱氯的速率受限于EAB自身的代谢速率以及电极表面总的生物量。因此，尽管电极电势下降到．400mV以下，但是由于生化反应过程的限制，多余的电子无法参与EAB一系列代谢反应。4．2．2电化学活性细菌对五氯苯酚电化学降解的催化作用图4．3所示为序批式条件下运行100h，BES和ES在不同电极电势条件下对五氯苯酚的去除效率。无论是BES或ES，反应器对于五氯苯酚的去除速率均随着电极电势由0mV下降到一600mV而不断加快。当电极电势控制在产氢电势以上时，生物阴极对五氯苯酚的去除效果均明显高于非生物阴极。当电极电势控制在一400mV时，反应器运行100h后，生物阴极对于五氯苯酚的去除率达到了86．463∞蛐加一(}兮一≯u昌。一uⅢ嚣ou一丑暑=IoUn万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制±2．9％，而此时非生物阴极对于五氯苯酚的去除率只有28．4-+-0．9％。这一结果与之前讨论的BES和ES中电流密度及库仑效率的差异类似，说明EAB在阴极表面能催化电子由电极向五氯苯酚快速地定向转移。图4．3阴极电势对五氯苯酚去除率的影响左：电化学系统；右：生物电化学系统(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h，三组反应器平行)Figure4．3EffectofappliedpotentialonPCPdegradation．1eft：PCPdegradationinES；right：PCPdegradationinBES．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=l00h，threeidenticalreactors)在序批式降解实验的基础上，通过IC和HPLC对经过处理后的溶液中氯离子浓度和脱氯产物浓度进行了分析(图4．4和图4．5)。当电极电势设定在．400mV时，经过100h运行后，BES中C1一的积累量达到247．5±16．5uM，相当于每降解lmol的五氯苯酚即脱下3．8tool的Cl。，而ES中Cl一的积累量则仅为45．7±4．4uM，相当于每降解1mol的五氯苯酚还原脱下2．1mol的C1’。在BES中，超过75％的五氯苯酚被还原成了2，6．二氯苯酚，2，3一二氯苯酚，3,6一二氯苯酚，3，5一二氯苯酚，4,6一二氯苯酚，2．氯酚，3．氯酚等二氯或一氯代苯酚，甚至5％的五氯64ll_^工T1|)皇。召畏暑皇ou皇oU厶U知n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制苯酚已被还原为苯酚。而在ES中，五氯苯酚的去除率非常低，且大部分的脱氯产物为四氯苯酚(2，3，4，6．四氯苯酚，2，3，5，6．四氯苯酚)或三氯苯酚(2，4，6．三氯苯酚，2，3，6．三氯苯酚，3,4，5．三氯苯酚)，还原脱氯并不彻底。这一结果说明，生物阴极表面生长的EAB不仅可提高五氯苯酚的还原速度，还能使五氯苯酚脱氯降解更为彻底。Potential(mYVs．SHE)图4．4阴极电势对溶液中氯离子浓度的影响(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h，三组反应器平行)Figure4．4EffectofimposedpotentialontheconcentrationofCl。．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h，threeidenticalreactors)为了进一步研究生物阴极中外源电子和EAB在五氯苯酚电化学催化降解中的作用，特设计了另一组序批式实验，考查BES和ES在极化和非极化条件下对五氯苯酚的去除效果。如图4．6和图4．7所示，反应器在前28h时，电极处于非极化状态，此时BES和ES对五氯苯酚的去除率均非常低，溶液中几乎没有Cl-的积累。这说明，当没有外源电子输入到系统中时，五氯苯酚的还原脱氯反应是无法进行的。少量五氯苯酚的去除是由石墨电极对五氯苯酚的吸附作用所造成的。反应器运行28h后，对电极施加．400mV的电势，BES和ES中五氯苯酚的浓度均开始呈现下降的趋势。此时，由于有了外源电子的供给，为EAB的正常代谢提供了电子和能量来源，从而实现了EAB对五氯苯酚的催化还原。对比五氯苯65^阜、ITl。蛊o_=l爵．I_岛∞u暑oU_IUn万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制酚在BES和ES中的去除效率可发现，在有EAB的BES中，五氯苯酚的去除速率明显快于ES，这也进一步说明，EAB可加速电子由电极向五氯苯酚的传递，并且更快更彻底地催化五氯苯酚的降解。图4．5．400mV电势下运行100小时后溶液中五氯苯酚及其脱氯产物浓度TeCP：2，3，4，6一四氯苯酚，2，3，5，6．四氯苯酚；TCP：2，4，6．三氯苯酚，2，3，6．三氯苯酚，3,4，5．三氯苯酚；DCP：2，6．二氯苯酚，2，3．二氯苯酚，3,6．二氯苯酚，3，5．二氯苯酚，4,6．二氯苯酚；CP：2．氯酚，3．氯酚(五氯苯酚初始浓度：20mg／L，工作电极电势：．400mV，pH=7．0，T=30。C，t=100h，三组反应器平行)Figure4．5ConcentrationofPCPanditsdegradationintermediatesafter100hoursoperationwith-400mVappliedpotential．TeCP：2，3，4，6一tetrachlorophenol，2，3，5，6一tetrachlorophenol；TCP：2,4，6-trichlorophenol，2，3，6一trichlorophenol，3,4，5-trichlorophenol，DCP：2,6-dichlorophenol，2，3一dichlorophenol，3,6一dichlorophenol，3，5一dichlorophenol，4，6-dichlorophenol，CP：2-chlorophenol，3-chlorophen01．(initialPCPconcentration：20mg／L，workingelectrodepotential：-400mV,pH=7．0，T=30℃，t-=100h，threeidenticalreactors)^叫’Ii-∞o：l矗州它曾—葺．Io_盘一盘。墨矗它矗．I咖p口协=它暑肖tIU‘I-o盎o=穗．I_盘∞u口oUn万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制综合以上实验结果，说明利用BES对五氯苯酚进行降解，外源电子和EAB缺一不可。与非生物阴极相比，在BES中，生物阴极对五氯苯酚的催化降解速率明显提高，说明EAB可以电极作为电子供体催化五氯苯酚的还原过程。实验中，生物阴极极化电势控制在．400mV。在这一电势水平下，电化学还原产氢反应在热力学上不可能发生，因此排除了氢气在这一体系中存在的可能性。从而说明，在本实验体系中，EAB所表现出的对阴极电子转移的催化和对五氯苯酚的高效催化还原并非是以氢气作为电子供体而实现的。进而排除了生物阴极表面EAB以氢气作为介体间接获得电子的途径。图4．6序批式条件下在极化与非极化状态下生物电化学系统和电化学系统对五氯苯酚的去除效率(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，三组反应器平行)Figure4．6ChangesofPCPconcentrationinBESandESwithandwithoutappliedcathodepotential．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30。C，threeidenticalreactors)67n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制图4．7序批式条件下在极化与非极化状态下生物电化学系统和电化学系统中氯离子浓度的变化(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，三组反应器平行)Figure4．7ChangesofC1一concentrationinBESandESwithandwithoutappliedcathodepotential．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30。C，threeidenticalreactors)4．2．3电化学活性细菌分泌物对阴极电子传递的影响通过前两节的实验，说明生物阴极可催化外源电子向五氯苯酚等电子受体的转移，并证实了这一电子传递过程可在没有氢气产生的前提下发生。然而，也有学者报道，某些氧化还原电子介体对于生物电化学还原可能存在着一定的促进作用[681，通过这些氧化还原电子介体的介导，同样可以实现BES在不产生氢气的前提下对污染物进行还原。为了考查本实验BES中是否存在可促进电子传递的氧化还原电子介体，在序批式实验结束后对反应器残留液进行了CV测试。测试前，取运行100h后的BES反应器残留液经0．229m滤膜过滤，去除溶液中的悬浮微生物。滤过液分别加入到BES和ES中，以生物阴极和非生物阴极作为工作电极，对其进行CV扫描，并以灭菌后的新鲜营养液作为对照(图4．8)。n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制图4．8生物阴极和非生物阴极在不同溶液中的循环伏安图谱(扫描范围：一O．56V到+1．04V，扫描速率：5mV／s)Figure4．8Cyclicvoltammogramsofdifferentmediumwithabioticcathodeandbiocathode．(scanningrange：一0．56Vto+1．04Vscanningrate：5mV／s)和其它学者的报道有所不刚71，1”1，在本论文实验中，用未经挂膜的石墨电极作为工作电极进行扫描时，无论电解液是滤过液还是新鲜营养液，得到的CV图谱中均未出现明显的氧化还原峰，这说明溶液中不存在氧化还原电子介体，或者这类介体的浓度非常低，以致不会对EAB的电子传递产生影响。而当把生物阴极放入滤过液中，并以其作为工作电极进行CV扫描时，可在+0．2V左右发现一对明显的氧化还原峰。由于这一氧化还原峰在滤过液和新鲜溶液中均被测试得到，因此可判断这并非是属于EAB所分泌的氧化还原电子介体。这对氧化还原峰最有可能是由EAB生物膜中的C型细胞色素蛋白或是其它一些导电性的结构[581所产生的。这一实验结果说明在本论文研究体系中存在着电子由电极向EAB的直接传递途径。为了进一步确认CV分析所得出的结论，对滤过液营养成分进行调节后又重复了五氯苯酚序批式降解实验。如图4．9所示，在BES反应器中，用生物阴极处理含相同浓度五氯苯酚的滤过液和新鲜营养液时，五氯苯酚去除率随时间的变化曲线基本一致。在ES反应器中，也表现出同样的结果。这说明，EAB的分泌物69n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制中不含有氧化还原电子介体类物质，或者即便有氧化还原电子介体存在，也不参与EAB的催化脱氯过程。结合CV图谱分析的结果可得出如下结论：在本实验所构建的生物阴极中，直接电子传递是阴极表面电极与微生物间最主要的电子传递方式。图4．9—400mV电势条件下，生物电化学系统和非生物电化学系统中电化学活性细菌分泌物对于五氯苯酚降解的影响(五氯苯酚初始浓度20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h)Figure4．9EffectofelectrochemicallyactivebacteriasecretiononPCPdegradationinESandBESat一400mVimpliedpotential．(initialPCPconcentration：20mg／L，pH=7．0，T=30。C，t=100h)4．2．4生物阴极菌落组成及其电子传递机制分析在已有的报道中，利用生物阴极进行脱氯总需要向其中加入特定的氧化还原电子介体(如甲基紫[68]、蒽醌一2，6一磺酸钠【137】等)，以确保电子在电极和EAB之间进行传递。在本论文中，生物阴极表现出另一种电子传递机制，即无需外源电子介体和氢气的介导，且在自身不分泌氧化还原电子介体的前提下便可实现电子的直接传递。造成这一现象的可能原因是生物阴极上的微生物群落有所不同。因此，采用454高通量测序技术对生物阴极菌落进行了全面深入的分析。在对所有可分类的序列进行分析后，可将生物阴极上的细菌归类到7个门15个纲中。相比于其它生物阴极或生化处理法中的污泥，本实验中生物阴极上70砷加一_^ITl一=o一_矗k_岳。u口。u．1u厶n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制菌落的生物多样性要明显低很多。以Proteobacteria(45．51％)、Bacteroidetes(33．95％)、Firmicutes(15．92％)为代表的三个门的细菌占据了阴极表面95．38％的菌落组成。对16s核糖体RNA基因序列测试显示阴极生物膜样本主要包含了8个纲的细菌(相对丰度大于0．5％，如图4．10所示)：Betaproteobacteria(39．62％)、Bacteroidia(32．32％)、Clostridia(15．54％)、Gammaproteobacteria(5．24％)、Deferribacteres(3．76％)、Flavobacteria(1．58％)、Actinobacteria(0．78％)、Alphaproteobacteria(0．63％)。表4．2中具体列出了阴极生物膜中所鉴定出的优势菌种。a图4．10不同纲的细菌在微生物电化学系统阴极生物膜菌落中的分布情况Figure4．10ClassdistributionofbacterialcommunityfromthecathodicbiofilmofBES．值得注意的是，本实验中的三类优势菌Proteobacteria、Bacteroidetes以及Firmicutes均在之前的生物阴极研究中有过报道【99，1舔1691。特别是在本系统中大量存在的Betaproteobacteria，被认为是一类铁氧化细菌【170，171】，具有将二价铁中的电子转移给其它电子受体的能力(如硝酸盐)[172]。而这一过程与Geobacters”拖rreducens等产电菌正好是相反的，Geobactersulfurreducens在自然条件下可利用代谢产生的电子还原三价铁。因此，有可能Betaproteobacteria也具备了以电极作为电子供体还原其它物质的能力。另外，在生物阴极中还发现了部分可通过自养代谢实现C02还原固定的细菌(Achromobactersp．)，这些细菌同样被证n万方数据实存在于某些用于固定C02的生物电化学反应器中[118]。因此，在利用生物阴极处理五氯苯酚的过程中，可能会有一部分来自电极的外源电子被这类细菌加以利用，催化C02的还原。表4．2生物阴极菌落的系统发生学分类(相对丰度大于O．5％)Table4．2Phylogeneticclassificationoftheclustersonbiocathode(relativeabundance>O．5％、．门纲目科属种系型相对丰度数量(％)ProteobacteriaBetaproteobacteriaRhodocyclalesRhodoeyclaceaeUnclassified11502184BacteroidetesBaeteroidetesBacteroidetesFirmieutesProteobacteriaBacteroidetesDeferribacteresProleobacteriaProteobacteriaBacteroidetesFirmicutesProteobacteriaBacteroidetesProteobaeteriaBacteroidiaBacteroidalesPorphyromonadaceaeBacteroidiaClosmdiaBetaproteobacteriaBacteroidiaDefembacteres(class)GammapmteobacteriaBetaproteobacteriaBacteroidiaFlavobacteriaClostridiaCloslridiaCIosmdiaBetaproteobaeteriaGammaproteobacteriaBacteroidiaBetaproteobacteriaBacteroidalesClosmdialesBurldaolderial∞BactemidalesDefetribacteralesXanthomonadalCSBuddaolderialesRhodocyclalesBacteroidalesFlavobacterialesCloslridialesClostridialesClostr／dialesPorphyromonadaceaeCloslridiageaeComamonadaceaeDysgonomonasProtciniphilumDysgonomonasClostridiilnlAcidovoraxPorphyromonadaceaeProteiniphilumDeferr／bactemceaeGeovibrioXanllaomonadaceaeAlcaligenaceaeRhodoeyclaceaePorphyromonadaceaeFlavobactcriaceaeClostridiace,aeLachnospiraceaeRuminococcaceaeClostridiaceacRhodocyclalesRhodocyclaceacPseudomonadalesPseudomonadaceacBacteroidalCSRhodocyclalCSPorphyromonadaceaeRhodocyclaceaeProteobacteriaBetaproteobacterlaRhodocyclalesRhodoeyclaceaeProteobacteriaBetaproteobaeteriaRhodocyclalesRhodocyclaeeaeProteobacteriaBetaproteobacteriaRhodocyclalesRhodocyclaceaeProteobacteriaGammaproteobactefiaEnterobacterialesEnterobacteriaceaeUnelassifledUnclassifiedDysgonomonasChryseobacterittmClostridisinUndassifiedOscillibacterClostridiumUnclassifiedPseudomonasProteiniphilumUnclassifiedUnclassificdUnelassifiedUnclassifiedCitrobacterFirmicutesClostridiaClosb-idialesRuminococcaccaeUnclassified29O．55除了拥有以电极作为电子供体的能力外，在本实验中鉴别出的大多数菌种也被发现存在于一些生化法处理氯化物的污泥中，这些细菌都具有一定还原脱氯的能力。例如，Firmicutes和Bacteroidetes可用于对三氯乙烯和顺式．二氯乙烯进行72∞竹弭"”¨弘粥酷舛船H孵鳄∞斛％船舶彤胛＆≯i王孓王ZL，●O仍粥暑|粥m；坌mM"针他∞记珐拍¨柏∞拍驺弘如n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制脱氯[1731，Betaproteobacteria可实现对高氯酸盐的还原【170】，Actinobacteria可用于处理某些二嗯英污染物[174】。其中，Firmicutes门下的Clostridium属细菌可以乳酸或氢气作为电子供体对五氯苯酚进行降解，将其还原为苯酚等物质【”51。由于五氯苯酚的脱氯降解过程相较于三氯乙烯、高氯酸盐或其它氯化物的降解均要复杂得多，降解过程中会产生种类繁多的中间产物，因此涉及到的细菌种类也相应的有所增多。通过对生物阴极表面生物膜样品进行454高通量测序分析，获得了阴极表面EAB的种群分布信息。分析结果表明，阴极生物膜上的大部分细菌均具有以电极作为电子供体维持代谢活动并对五氯苯酚等氯化物进行还原降解的能力。但是，对于生物膜内不同菌种间的相互作用，以及不同菌种在五氯苯酚降解不同阶段所起的作用仍不明确，需要今后的工作对其进一步探究。4．3本章小结本章在第三章的基础上以高效去除五氯苯酚的生物阴极为研究对象，考查了生物阴极的电子传递机制，并对生物阴极表面菌落组成进行了全面的分析，主要结论如下：(1)当电极电势控制在产氢电势以上时，EAB可催化阴极电子传递和五氯苯酚的降解，说明生物阴极电子传递可在没有氢气产生的条件下进行。电极电势在．400mV时，反应器运行100h后，生物阴极电流密度为非生物阴极的3．3倍，库仑效率为非生物阴极的1．6倍，对五氯苯酚的去除效率为非生物阴极的3倍。生物阴极不仅能提高五氯苯酚的还原速率，还能催化五氯苯酚更加彻底的脱氯，每降解lmol的五氯苯酚即脱下3．8mol的Cl‘，其脱氯产物以苯酚、氯酚以及二氯苯酚为主。(2)利用非生物阴极对BES反应器滤过液进行CV测试，溶液中未检测出具有氧化还原电子介体特性的物质。对生物阴极进行CV测试，在+0．2v左右检测到氧化还原峰，有可能是EAB生物膜中的C型细胞色素蛋白氧化还原峰。EAB分泌物对五氯苯酚生物电化学降解及电化学还原均无明显促进作用，说明EAB的分泌物中不含氧化还原电子介体，或者即便存在氧化还原电子介体也并未参与生物阴极催化降解五氯苯酚的电子传递过程。(3)对本实验BES中生物阴极的电子传递途径进行考查，排除了氢气及氧n万方数据浙江大学博士学位论文生物阴极电子传递机制化还原电子介体等可能促进五氯苯酚降解的间接电子传递途径，证实了在生物阴极中存在着电子由电极直接向EAB传导的途径。(4)采用454高通量测序首次对脱氯生物阴极上菌落的组成进行了全面的分析。以Proteobacteria(45．51％)、Bacteroidetes(33．95％)、Firmicutes(15．92％)为代表的三个门的细菌占据了阴极表面95．38％的细菌总量，其中大部分的细菌均可利用外源电子供体进行代谢活动并对五氯苯酚等氯化物进行还原降解。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究5电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究研究EAB生物膜在电极表面的形成过程，有助于掌握影响生物膜形成的相关因素，以及这些因素在EAB生物膜形成过程中的作用。从而，可在BES构建初期对生物电极进行优化，提升BES对难降解有机污染物的去除能力。目前，针对生物电极表面生物膜形成机制的研究主要集中在宏观层面，以电流密度作为衡量指标来描述生物膜的生长过程。这一方法在一定程度上为早期研究BES的快速启动方法提供了数据上的支持。但生物膜的生长和电流密度的增长之间并非线性相关，并且，这一方法也无法直观地对EAB生物膜生长过程进行描述。因此，有必要对生物膜的生长过程进行连续地在线监测，从微观层面揭示EAB生物膜形成机制。目前，针对生物膜厚度测试的方法种类繁多。根据测试菌种及体系的不同，每种方法所利用的原理也不同。然而，大多数测试方法均需对生物膜进行特殊的染色或标记，并且需要通过专门的仪器进行测试[149-153】，难以用在对BES中生物电极上生物膜厚度的原位测试。在某些可用于生物膜厚度原位测试的方法中，则需要特殊设计的基底或装置[145-148]，因此也不适用于BES体系中的生物膜厚度测试。在BES中，某些EAB可通过分泌氧化还原电子介体，实现电子在电极和微生物间的传导。这类电子介体可在电极表面发生氧化或还原反应。利用EAB的这一特点，可设计对其分泌的氧化还原电子介体进行检测，定位到生物膜与电解液的界面，进而实现对生物膜厚度的原位测试。本章以ShewanellaoneidensisMR．1为研究对象，建立了一套用于对分泌氧化还原电子介体的EAB进行生物膜厚度测试的方法，为微观层面上研究生物电极表面EAB生物膜的形成机制提供了技术支持。本章研究内容主要分两部分，第一部分是对铂探针微电极(Ptultramicroelectrode，PtUME)测试生物膜厚度的方法进行讨论，从机理上对该方法的可行性进行考查，并利用激光共聚焦扫描显微镜(Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)对测试方法的准确性进行验证。第二部分考查了氧气、电极电势、乳酸钠初始浓度以及核黄素等对于SoneidensisMR．1生物膜形成过程的影响，并在此基础上对SoneidensisMR．1生物膜的生长过程进行了动力学分析。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究5．1实验材料与方法5．1．1实验试剂及营养液组成本章节用于HPLC分析的试剂为色谱纯，其余所提及化学试剂均为分析纯。其中4一羟乙基哌嗪乙磺酸(2一【4一(2．hydroxyethyl)一l—piperazinyl]ethanesulfonicacid，Hepes)、二茂铁甲醇购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，其余试剂购于杭州惠普化工有限公司。本章节所用气体为99．999％高纯氮，购于杭州今工特种气体有限公司。实验中，＆oneidensisMR-1的富集使用LB液体培养基，其溶液配方参见第二章2．1．1小节，其余所有实验均采用修正后的M4培养基作为营养液，其组成如下：表5．1每升修正后的M4营养液组成(pH=7．0)Table5．1ComponentsofmodifiedM4mediumperliter(pH=7．0)．成分含量K2HP04KH2P04NaHC03(NH4)2504NaClHepesYeastextractTrypton100×金属元素溶液lOOxCaCh贮存液乳酸钠(40％w／w)2．21gO．99g0．168g1．189g7．305g1．192g0．5g0．5g10mL10mL5mL其中，lOOx金属元素溶液的配方如表5．2所示，lOOxCaCh贮存液浓度为7．13g／L。100×金属元素溶液、100×CaCl2贮存液、乳酸钠(40％w／w)等溶液配置完成后需在无菌环境下经过O．22岬滤膜过滤处理，之后放于4℃冰箱内冷藏保存。在加入这些溶液之前，需先将营养液进行高压灭菌处理。待溶液冷却后，在76n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究超净工作台中按照配方加入以上三种经过灭菌处理的溶液。表5．2100×金属元素溶液组成Table5．2Componentsof100xMineralMixStock．成分含量(mg／L)Na2EDTA2501．18MgS04‘7H20MnS04NaClFeCl2·2H20CoChZnS04CuS04·5H20H3803Na2M004·2H20NiCh·6H20Na2Se0424893．475．1．2接种细菌及实验材料由于生物阳极中电子传递机制较生物阴极更为明晰，因此，本章实验针对生物阳极中的EAB进行测试，用以考查PtUME对BES中产生氧化还原电子介体的EAB生物膜厚度进行测试的可行性。为确保体系稳定，且微生物代谢途径明确，实验选用Soneidens&MR．1纯种菌作为研究对象，菌种购于美国模式培养物集存库(ATCC)，ATCC编号700550，在．86℃超低温冰箱(Dw．86W100，海尔集团)内，通过甘油封存保存。实验前，用LB液体培养液唤醒菌种，之后转移到M4培养基中振荡培养。本章节实验中用于测试生物膜厚度的PtUME为CHlll6铂探针微电极(上海辰华仪器有限公司)，电极尖端铂丝直径为10岬。为确保PtUME可被夹持在微操仪上，需将其粘连在玻璃套管(9”吸量管，编号13．678．20C，美国Fisherbrand)77∞舛舶舯9；睨甜笛"川舛m凹5姗喊m缀n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究内，电极末端与铜导线相连，连接处用焊锡固定，防止导线移动造成的接触电阻波动。参比电极为CHllllAg／AgCI电极(上海辰华仪器有限公司)，相对标准氢电极电势为+200mV(本章所有电势均指相对标准氢电极电势)。利用CLSM检验测试方法准确性时，所使用的工作电极为铟锡氧化物(IndiumTinOxide，ITO)玻璃电极(杭州米克化工有限公司)，电极有效工作区域为直径6．5mm的圆形区域。研究SoneidensisMR．1生物膜形成机制时，所用的工作电极为CHll01金盘电极(上海辰华仪器有限公司)，金盘直径为2mm。对电极为铂丝电极，直径0．5mm。实验中一次性医用注射器及曝气针管购自杭州米克化工有限公司，O．22岬灭菌滤头购于天津贺世科技发展有限公司。实验中使用的主要仪器设备如表5．3所示。表5．3实验中所用的仪器设备Table5．3Equipmentsusedinexperiments．5．1-3反应器及测试装置。用于SoneidensisMR．1生长的反应器为聚四氟乙烯圆柱形反应器，反应室直径4cm，深1．5cm(图5．1)。反应器壁上开有一直径6mm、深1．5cm的槽，用以放置Ag／AgCl参比电极，反应器与深槽连通，槽内的电解液可与反应室内电78n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究解液相连通。反应器底部开孔，直径6．5mm，用以放置金盘电极。金盘电极在放入反应器前需缠绕一层生料带，以确保电极可牢固地插在反应器底部。工作电极为ITO玻璃电极时，选电极导电一侧朝上，贴在聚四氟乙烯反应器底部，并用AB胶(德国Pattex)将其固定。铂丝电极由反应器壁顶部插入，从反应器壁底端伸出到反应室内，伸到反应室内的铂丝长度为1．5cm，并通过石蜡固定。高纯氮经管道输出后，先接0．229in灭菌滤头，再通过针管曝入到反应器中，针管尽可能靠近工作电极表面。图5．1用以测量生物膜厚的聚四氟乙烯反应器(左)及微操仪(右)Figure5．1PTFEreactor(1eft)andmicromanipulator(right)formeasuringthethicknessofbiofilm．实验中使用微操仪作为PtUME的定位装置，通过对微操仪上三个螺母的旋转，可实现移动臂在三维尺度上的位置变动(图5．1)。其中，微操仪在两个方向上的移动精度为1009m；在一个方向上的移动精度为109m，并可估读到1lam，在这一方向上的移动通过微调螺母实现。微操仪底端通过强力磁铁固定在超净工作台上，PtUME固定在微操仪移动臂上，微调螺母垂直朝下。膜厚测试在三电极体系下运行，PtUME为工作电极，铂丝电极和Ag／AgCl电极分别为对电极和参比电极(图5．2)。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究一一i．；：biofilm⋯一一⋯～———i而丽FK丽叮一图5．2生物膜厚度测试装置及铂探针微电极测试原理示意图I心H2：还原态核黄素；RF：氧化态核黄素Figure5．2Schematicofbiofilmthicknessmeasuringdeviceandthemechanismsofthemeasuringmethod．RFH2：flavohydroquinoneform；RF：flavoquinoneform．5．1．4电化学活性细菌生物膜厚度原位测试方法以金盘电极作为工作电极为例，对SoneidensisMR一1生物膜厚度的测试按照以下步骤依次进行：(1)将抛光绒布贴放在培养皿底部，取0．05岬抛光粉少许放于抛光绒布上，加蒸馏水润湿。将金盘电极朝向绒布，反复轻磨，使金盘电极表面研磨平整。之后，用去离子水反复冲洗金盘电极，并用吹风机吹干。(2)配制电极清洗液，清洗液组成为浓硫酸：30％过氧化氢=7：3。将反应器、铂丝电极、金盘电极前段以及PtUME尖端浸没于电极清洗液中，在50℃下水浴清洗。待电极表面无气泡产生后，取出电极，并用去离子水反复冲洗。(3)将工作电极、参比电极和铂丝电极、曝气针管等固定在反应器中，工作电极和参比电极表面缠以生料带，以确保牢固地固定在反应器中。将PtUME固定在微操仪移动臂上，确保微调螺母垂直朝下。微操仪底部强力磁铁开关打开，使其吸附在超净工作台。实验中，为防止尘埃落入，可在反应器顶部包裹一层封1：3膜(美国Parafilm)。(4)测试Soneidens&MR一1菌液OD600值，在无菌环境中将其稀释至0．6后，转移到灭菌后的离心管中，用作后续实验接种源。R0n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究(5)将灭菌后的二茂铁甲醇溶液(1．0mM二茂铁甲醇+O．1MNaCl)、M4营养液、蒸馏水及其它灭菌实验材料放入超净工作台中。开启超净工作台紫外灯，灭菌30min。(6)超净工作台开到最大通风模式，工作台玻璃门打开约10cm，并在后续实验中一直保持风机运转和玻璃门开启(10cm)。向反应器中加入10mL二茂铁甲醇溶液，确保参比电极也浸没在电解质溶液中。之后，向反应器中通入高纯氮30min。(7)调节PtUME的水平位置，使其尖端位于金盘电极中部，之后让PtUME垂直下降，浸没在二茂铁甲醇溶液中，并尽可能接近反应器底部的金盘电极。(8)将PtUME、Ag／AgCl参比电极、铂丝电极分别与电化学工作站相连。设置PtUME在CA程序下运行，电极电势为+0．1V，静置时间为20S，电流采样间隔为0．001S。CA启动后，旋动微调螺母，使PtUME以大约29m／s的速度匀速下降。当电流值下降到初始电流值的50％时，认为PtUME已逼近电极表面，记录此时微操仪刻度位置，并重复三次测试。之后，操作微调螺母，使微操仪移动臂抬升O．2cm。(9)用注射器将反应器内二茂铁甲醇溶液抽出，并用蒸馏水反复润洗反应器及PtUME。润洗过程中，确保不触碰到反应器、电极、微操仪等任何测试装置。(10)向反应器中加入10mLM4营养液，确保参比电极也浸没在营养液中。之后对基底的位置进行确认。设置PtUME运行在CA模式下，电极电势控制在．0．4V，用以测试溶液中溶解氧浓度的变化，静置时间为20S，电流采样间隔为0．001S。PtUME开始以较快速度下降，待接近之前定位到的初始位置刻度值时，放慢探针下降速度，以约2gm／s的速度匀速下降。当电流值下降到初始电流值的50％时，记录此时微操仪刻度值，并重复三次测试。三次读数相差较小且与之前测试数据基本一致时，认为测量基本准确，将平均数值标记为基底所在位置。之后，操作微调螺母，使微操仪移动臂抬升O．8cm，确保PtUME位于营养液液面之上。(11)反应器曝高纯氮30min，之后取O．1mLSoneidensisMR．1纯种菌液加入到反应器中。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究(12)将电化学工作站用于接工作电极的线缆与金盘电极相连，其它线缆保持与原电极相连，之后启动CA程序。CA模式下，电极电势被设定在恒定值，根据不同实验设置不同的电势值。为保证SoneidensisMR．1可以电极作为电子受体正常生长，一般情况下，电极电势设定为正值。CA静置时间为20S，电流采样间隔为0．001S，运行时间根据不同实验要求而变。实验过程中，持续向溶液中曝高纯氮气。(13)测试SoneidensisMR．1生物膜厚度时，将电化学工作站用于接工作电极的线缆重新与PtUME相连，设置CA程序工作电极电势+0．1V，静置时间20S，电流采样间隔0．001S。PtUME开始以较快速度下降，待定位到基底以上约300岬处时，放慢探针下降速度，以约2pm／s的速度匀速下降。当电流值上升到初始电流值的1．5倍时，认为PtUME已进入SoneidensisMR．1生物膜表面核黄素扩散层，并足够接近生物膜，记录此时微操仪刻度值。之后，重复三次独立的测试，取平均值作为这一组测试的结果。将该数值与之前测得的基底所在位置刻度值相减，即为经过一段时间生长后，电极表面生物膜的厚度值。若需继续测试生物膜厚度的变化，则将微操仪移动臂抬升O．8cm，确保PtUME位于营养液液面之上。之后，重复(12)、(13)步骤。5．1．5生物膜测试方法的可行性验证通过实验对5．1．4节所介绍的方法进行了验证，从原理上和实际测试结果两方面对上述方法的可行性和准确性进行了考察。主要进行的实验如下：(1)扩散层边界的确定在生物膜厚度测试实验结束后，利用PtUME对溶液进行CV测试，电势扫描范围为．0．4VN+o．4V，扫描速率为10mV／s，静置时间为20S，扫描次数为3次。记录此时微操仪的刻度值，并以此值为基准，调节微操仪移动臂分别抬升和下降10岬，重复CV测试实验，测试条件参数不变。为探究CV图谱中出现的氧化还原峰是否属于核黄素，另设置一组实验作为对照。以添加了核黄素的M4营养液作为电解液，对其曝高纯氮30min后，将PtUME浸没到溶液中，重复CV测试。(2)信号响应物质的确定重复5．1．4节中生物膜厚度测试的步骤，反应器接种菌液以后，在进行生物n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究膜厚度测试时，需进行两次CV测试，分别在CA程序开始和结束时。两次测试时，PtUME分别位于本体溶液中和生物膜附近。生物膜厚度测试结束后，取2mL反应器溶液，经10000r高速离心后，取上清液进行HPLC分析。对测得的CV图谱进行求导处理，以确定每组实验中氧化还原峰的位置，并进行比较。(3)激光共聚焦扫描显微镜测试SoneidensisMR．1生物膜厚度利用CLSM对PtUME的测试结果进行验证时，使用ITO电极作为工作电极，对经过不同挂膜时间生长后的SoneidensisMR．1生物膜厚度分别进行单独测试。PtUME测试生物膜厚度的方法和步骤与用金盘电极作为工作电极时一致。测试完成后，对样品进行染色处理，用CLSM对样品生物膜厚度进行测试，并将测试结果与PtUME的测试结果进行比较。样品荧光染色方法参照Mcleod等【176]的报道，先将反应器中的M4营养液抽出，加入0．5mL已预热到30℃的染色剂，并将反应器用铝箔纸包裹，放入到30℃的生化培养箱中染色20h。其中，染色剂的组成为0．75MNaCI、5．0mMEDTA、100mM三羟甲基氨基甲烷、0．01％(m／v)十二烷基硫酸钠、5“g罗丹明标记的SPN3探针。染色完成后，用无菌滤纸将染色剂析出，并用预热到30℃的清洗缓冲液清洗反应器中未与细菌结合的染色剂，清洗过程共持续1h。清洗缓冲液的加入和析出均需缓慢进行，以防止破坏生物膜。清洗缓冲液(pH=7．8)的组成为30mMNaCl、0．2mMEDTA、4mM三羟甲基氨基甲烷。清洗完成后，用无菌滤纸将溶液析出，并将ITO电极与反应器分离，待电极自然干燥后，进行CLSM测试。CLSM测试时，先通过可见光场定位到样品所在位置，并手动调焦，使显微镜聚焦到生物膜上。之后，将CLSM转换到激光场下进行测试，测试参数为：激发光波长为543nm，滤光片通道波长为595／50nlTl(570nm．620nm)。以可见光场聚焦到的位置为基准点，显微镜在Z轴方向上以5岬的步程分别向上和向下逐层扫描生物膜样品，直到图像中不再能探测到荧光信号。将逐层扫描的图像进行叠加，消除背景值干扰，从而确定检测到的生物膜范围。通过计算荧光信号从出现到消失的整个过程中CLSM所扫描的距离，确定生物膜厚度大致的范围。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究5．1．6ShewanellaoneidensisMR-1生物膜形成机制研究研究SoneidensisMR．1生物膜形成机制时，使用的工作电极为金盘电极，主要从以下几个方面进行考查：(1)氧气考查有氧气存在时和没有氧气存在时，SoneidensisMR．1生物膜生长情况的差异。挂膜共持续24h，分别在电极电势为．100mV、+100mV以及+300mV下进行，每隔12h对生物膜厚度进行测试。在进行有氧条件实验时，实验过程中不对反应器中的M4营养液曝高纯氮：在进行无氧条件实验时，测试步骤与之前标准程序一致。每个条件下平行进行三组实验，每次测量时需切换连接电化学工作站的工作电极，在进行＆oneidensisMR．1挂膜时，工作电极为金盘电极；在进行生物膜厚度测试时，工作电极为PtUME。(2)电极电势电极电势对＆oneidens&MR．1生物膜形成的影响分两阶段进行考查。在第一阶段实验中，挂膜共持续48h，每隔一段时间对生物膜的厚度进行测试，其中前24h每隔4h测试一次，后24h每隔8h测试一次。考查的电极电势分别为．100mV、0mV、+100mV、+200mV以及+300mV，每个条件下测试一条曲线。整个过程中需不断切换连接电化学工作站的工作电极，在进行SoneidensisMR．1挂膜时，工作电极为金盘电极；在进行生物膜厚度测试时，工作电极为PtUME。实验结束后，取2mL反应器溶液，经高速离心(10000r)处理后，对核黄素浓度进行HPLC分析。在第二阶段实验中，挂膜时间持续24h，每隔8h对生物膜厚度进行测试。考查的电极电势分别为．100mV、0mV、+100mV、+200mV以及+300mV，每个条件下平行进行三组实验。每次测量时需切换连接电化学工作站的工作电极，在进行SoneidensisMR．1挂膜时，工作电极为金盘电极；在进行生物膜厚度测试时，工作电极为PtUME。(3)乳酸钠初始浓度考查乳酸钠初始浓度对＆oneidensisMR．1生物膜形成的影响，启动电极电势设定为+100mV，挂膜共持续48h，每隔一段时间对生物膜的厚度进行测试，其中前24h每隔4h测试一次，后24h每隔8h测试一次。考查的乳酸钠初始浓n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究度分别为5mM、10mM、20mM以及40mM，每个条件下进行一组实验。整个过程中需不断切换连接电化学工作站的工作电极，在进行SoneidensisMR一1挂膜时，工作电极为金盘电极；在进行生物膜厚度测试时，工作电极为PtUME。实验结束后，取2mL反应器残留液，经高速离心(10000r)处理后，对乳酸钠浓度和核黄素浓度进行HPLC分析。(4)核黄素核黄素对&oneidensisMR．1生物膜形成的影响分两阶段实验进行考查。在第一阶段主要考查核黄素浓度对SoneidensisMR一1生物膜形成的影响，启动电极电势设定为+100mV，挂膜共持续24h，每隔12h对生物膜厚度进行测试。考查的核黄素投加浓度分别为0nM、10nM、20nM以及40nM，每个条件下进行一组实验。每次测量时需切换连接电化学工作站的工作电极，在进行&oneidensisMR-1挂膜时，工作电极为金盘电极；在进行生物膜厚度测试时，工作电极为PtUME。第二阶段主要考查在挂膜不同阶段添加核黄素，对SoneidensisMR．1生物膜形成的影响，启动电极电势设定为+100mV，挂膜共持续48h，其中前24h每隔4h测试一次，后24h每隔8h测试一次。分别考查在生物膜生长初期(0h)以及生物膜生长达到稳定时(24h)投加20nM核黄素对生物膜生长的影响，每个条件下进行一组实验。整个过程中需不断切换连接电化学工作站的工作电极，在进行SoneidensisMR．1挂膜时，工作电极为金盘电极；在进行生物膜厚度测试时，工作电极为PtUME。实验结束后，取2mL反应器溶液，经高速离心(10000r)处理后，对核黄素浓度进行HPLC分析。5．1．7分析测试方法利用HPLC对乳酸钠浓度进行测试，检测器为紫外检测器，检测波长为210nm，色谱柱为ODS—C18反相柱。流动相组成为：10％甲醇：45％20mmol／L磷酸二氢铵溶液(pH=2．0)：45％1．4mmol／L2，3，6。三甲基．p．环糊精。流动相流速为1．0mL／min。核黄素浓度同样通过HPLC进行测定。检测器为荧光检测器，激发波长为450nm，发射波长为510nm，色谱柱为ODS—C18反相柱。流动相组成为：1％冰醋酸：43％甲醇：56％超纯水。流动相流速为1．5mL／min。n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究OD600值的测试方法见第二章2．1．5小节。5．2结果与讨论5．2．1不同电解液的渐近曲线如图5．2和5．3所示，进行生物膜厚度测试时，PtUME在三电极体系下运行。由于电极尖端只有非常小的区域与电解质溶液接触，当给微电极施以恒定电势时，溶液中的氧化还原性物种会在电极尖端迅速被氧化或还原，产生扩散控制电流，其电流值满足如下公式[164，177]：i。=4nFDcba其中，n代表每氧化／还原1mol氧化还原电对所转移的电子数，F是法拉第常数(96485C／mole-)，D代表氧化还原性物种的扩散系数，C6代表的本体溶液中氧化还原性物种的浓度，a是PtUME尖端半径(5肛m)。、、+‘1rkingelccll’odeTipcurrent(hA)图5．3接种前二茂铁甲醇溶液渐近曲线及测试示意图(工作电极：金盘电极d=2mlTl，探测电极：铂探针电极d=10gm，探针电极电势：+O．1V，电解质溶液：1．0mM二茂铁甲醇+0．1MNaCl)Figure5．3Approachcurveinhydroxymethylferrocenesolutionbeforeinoculation．(workingelectrode：goldplateelectroded=2miil，detectingelectrode：PtUMEd=10gm，detectingelectrodepotential：+0．1Vmedium：1．0mMhydroxymethylferrocene+0．1MNaCl)以二茂铁甲醇溶液作为电解质溶液，当PtUME远离基底(金盘电极)时，二茂铁甲醇在探针尖端迅速被氧化，本体溶液中二茂铁甲醇不断向电极尖端扩散，86n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究产生扩散控制电流，电流值遵循上述公式。当PtUME接近基底时，金盘电极处于非极化状态，二茂铁甲醇在基底附近由本体溶液向微电极的扩散受到了金盘电极的阻隔。随着PtUME尖端与金盘电极的间距缩小，二茂铁甲醇向PtUME的传质受到的阻碍迅速上升，从而导致电流急剧下降。经10um的移动，由1．2nA左右下降到0．6nA左右。当基底上生长有Soneidens&MR一1时，PtUME检测的电活性物种变为Soneidens&MR．1所分泌的核黄素。此时，PtUME对氧化还原物种的检测变得复杂，探针尖端一方面可在接近基底(Soneidens&MR．I生物膜)时对核黄素浓度的变化进行探测；另一方面又可与基底间形成相互反馈模式，经微电极氧化后的核黄素被生物膜重新还原，进一步增强了微电极尖端电流信号(图5．4)。biofilm图5．4接种24小时后M4溶液渐近曲线及测试示意图RFH2：还原态核黄素；RF：氧化态核黄素(工作电极：金盘电极d=2IIull，探测电极：铂探针电极d=10pm，探针电极电势+O．1V，电解质溶液：M4营养液，菌种：Soneidens&MR一1)Figure5．4ApproachcurveinM4mediumafter24hinoculation．RFH2：flavohydroquinoneform；RF：flavoquinoneform．(workingelectrode：goldplateelectroded=2mm，detectingelectrode：PtUMEd=10pm，detectingelectrodepotential：+0．1Vmedium：M4medium，bacterialculture：Soneidens&MR．1、n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究由启动电极电势+100mV下，SoneidensisMR-1挂膜24h后，PtUME对生物膜厚度进行测试时的渐近曲线可发现，在微电极尖端靠近基底时，电流值从9nA左右迅速增长到13nA左右。当PtUME远离基底时，本体溶液中核黄素分布均匀，在探针尖端可被迅速氧化，其对应的电流值满足上文中描述的公式，并维持在基本恒定的水平。当PtUME接近基底时，一方面，由＆oneidensisMR一1所分泌的核黄素在基底附近大量富集，使得PtUME尖端探测到的响应电流迅速上升；另一方面，SoneidensisMR．1生物膜重新还原被PtUME氧化的核黄素，从而使得反馈给微电极的电流信号进一步得到放大。5．2．2核黄素的电化学表征及扩散层的确定通过PtUME测试溶液中核黄素浓度变化来确定SoneidensisMR-1生物膜与溶液的界面，其有效性的前提是当微电极尖端进入到生物膜表面核黄素扩散层时已足够接近生物膜。因此，有必要对生物膜附近核黄素扩散层厚度进行测试。图5．5所示为PtUME在溶液中不同位置处的CV测试结果。为方便起见，将检测到电流跃升时PtUME停止下降的位置定义为定位点(setpoint)。实验之前，先进行了一组空白对照，考查PtUME在添加了20nM核黄素的M4本体溶液中的CV图。与常规CV图谱不同的是，利用PtUME对核黄素溶液进行CV测试时，在正电势范围内出现了个明显的平台。这是因为，尽管电势不断上升，但受限于在溶液中的扩散速率，核黄素在电极表面的氧化速率达到饱和，电流值达到稳定。之后对PtUME在定位点附近不同位置处的CV图谱进行了考查。当PtUME停留在定位点以上10gm处时，CV图谱与在含核黄素的M4本体溶液中测得的一致，说明在这一位置上，探针尖端核黄素的扩散过程与本体溶液中基本一致。当PtUME移动到定位点时，CV图谱发生了明显的变化，电流平台消失，CV图谱中出现了平滑的氧化还原峰。这是由于核黄素浓度的急剧升高，探针尖端消耗的核黄素可迅速得到补充。这也同时说明，此时的PtUME已进入到生物膜表面核黄素扩散层内。当PtUME下降到定位点以下10gm处时，其CV图出现了杂乱的扰动，这很有可能是因为探针尖端已触碰到SoneidensisMR-1生物膜，使得电极上的氧化还原反应也不再具有规律性。对CV图谱综合进行分析，当PtUME在下降过程中检测到电流跃升超过50％时，其尖端已伸入到Shewanellaoneidensis生物膜表面核黄素扩散层中。电极抬n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究升10lam，则离开了扩散层；电极下降10¨m，则会触碰到生物膜。据此推断，在本实验体系中，核黄素扩散层的厚度小于20岬，且定位点距离生物膜表面少于10pm。在实际的生物膜厚度测试中，由于厚度值是通过计算前后两次PtUME的位置差而获得的，因此这部分误差可在一定程度上得到消除。50{它矗0警L昌oQ■．50鲁U图5．5铂探针微电极在不同位置处的循环伏安图谱a：含20nM核黄素的M4溶液；b：定位点之上10lxm处；c：定位点处；d：定位点之下10pm处(扫描范围．0．4V至JJ+o．4v，扫描速率lOmWs，扫描次数3次)Figure5．5CyclicvoltammogramsofM4mediumwithPtUMEatdifferentpositions．a：inM4mediumwith20nMriboflavin；b：10IJJmabovethesetpoint；c：atthesetpoint；d：10¨mbelowthesetpoint．(scanningrange：-0．4Vto+0．4Vscanningrate：10mV／s，repeated3times)值得注意的是，在本实验中，测得的SoneidensisMR．1生物膜所分泌的核黄素在生物膜表面的扩散层厚度小于20I．tm。与其他学者报道的生物膜分泌物扩散层厚度(10岬到400rtm)相比【126，1781，这一测试结果属于较低的水平。这主要是因为，一方面，在SoneidensisMR．1挂膜生长以及膜厚测试过程中，始终在电极附近对溶液进行了曝气，这增强了核黄素由生物膜表面向本体溶液的传质，压缩了核黄素扩散层厚度。另一方面，在＆oneidensisMR．1生物膜生长的过程中，由于消除了溶液中的氧气，使得金盘电极成为唯一的电子受体，因此电极会R9lOl一《皇一一。一口置露一曩一Q≯．I昌。-。-葺。-．I暑Un万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究对核黄素由Soneidens&MR．1生物膜外侧向电极的定向移动产生驱动力，进一步压缩了扩散层的厚度。此外，本实验中的金盘电极的面积较小(相当于反应室横截面积的O．25％)，＆oneidensisMR．1生物膜产生的核黄素浓度有限，因此其扩散层可能本身就比较薄。为了确定PtUME在M4溶液中获得的电流信号是否由核黄素产生，特对CV图谱进行了分析。当PtUME处于本体溶液中时，其CV图谱表现为在超过某一电势时，电流会急剧上升，通过对CV图进行求导，可获得电流跃升时的电势(如图5．6)。根据对氧化峰和还原峰进行定位，得到该电活性物质的氧化还原电位为一0．205V。对定位点处的CV图谱进行分析，同样可得到电活性物质的氧化还原电位为一0．21v。这与Marsili等1124]报道的核黄素的氧化还原电位是一致的。通过将反应器残留液进行HPLC分析，同样确定了在+100mV下挂膜24h的反应器中产生了核黄素，其浓度为17．6nM。这说明，随着＆oneidensisMR．1生物膜的生长，大量的核黄素被分泌到细胞外，用于承担胞内到电极的远距离电子传输。这些核黄素会在生物膜表面形成扩散层，并可被施加有正电势的PtUME所检测到。图5．6接种24小时后M4溶液循环伏安图谱中电流导数的变化Figure5．6ThechangeofthederivativeofthecurrentinthecyclicvoltammogramsofM4mediumafter24hinnoculation．n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究5．2．3激光共聚焦扫描显微镜验证生物膜厚度测试结果PtUME测试的生物膜厚度结果通过CLSM进行验证，测试结果如图5．7所示。利用PtUME对SoneidensisMR-1生物膜厚度进行测试，+100mV下挂膜生长8h、16h、24h和48h时，测试得到的生物膜厚度分别为47±4¨m、67±4¨m、78±7um、105±6gm。同样的样品经CLSM检测，得到的生物膜厚度范围分别为40Um．60岬、60岬一65pm、60pm一80pm、95“m一105岬(图5．8)。图5．7激光共聚焦扫描显微镜对Soneidens&MR．1生物膜厚度的测试结果A：挂膜8小时；B：挂膜16小时；C：挂膜24小时；D：挂膜48小时(工作电极：ITO玻璃电极d=6．5mm；挂膜电极电势+100mV；菌种：SoneidensisMR一1；激光共聚焦扫描显微镜激发光波长543am，滤光片通道波长595／50nm)Figure5．7S．oneidens&MR一1biofilmthicknessmeasuredbyCLSM．A：8hinoculation；B：16hinoculation；C：24hinoculation；D：24hinoculation．rworkingelectrode：ITOglasselectroded=6．5mm；workingelectrodepotential：+100mV；bacterialculture：SoneidensisMR一1；CLSMexcitation：543nm，long-passemissionfilter：595／50nm)91n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究100皇75o卫．竺50上仨o25∞0图5．8铂探针微电极和激光共聚焦扫描显微镜测试生物膜厚度的结果比较红：铂探针微电极测试结果；黑：激光共聚焦扫描显微镜测试结果(工作电极：ITO玻璃电极d=6．5Iili／1，探测电极：铂探针电极d--10pm，菌种：SoneidensisMR一1，探针电极电势+O．1V，挂膜电极电势+100mV，电解质溶液：M4营养液，乳酸钠浓度20mM，T=30。C)Figure5．8ThebiofilmthicknessmeasuredbyPtUMEandCLSM．red：PtUME；black：CLSM．(workingelectrode：ITOglasselectroded=6．5i／lnl，detectingelectrode：PtUMEd--10)am，bacterialculture：&oneidensisMR一1，detectingelectrodepotential：+0．IVworkingelectrodepotential：+100mV,medium：M4medium，sodiumlactateconcentration：20mM，T=30。C)用CLSM测试生物膜的厚度，通过对生物样品进行逐层扫描，可获得生物样品垂直方向上的图像信息，因而可据此获得生物膜厚度信息。该方法精度高、测试结果直观、测试方法较为成熟，因此，很多学者在进行生物膜厚度测试时均采用了这一方法[57，”9。1811。对比两种方法的测试结果，利用PtUME测试获得的SoneidensisMR一1生物膜厚度值与CLSM测试得到的数据基本相吻合。这说明，用PtUME对生物电极表面生物膜的形成机制进行检测是可行的，其测试得到的生物膜厚度结果与实际值相吻合。值得注意的是，对同一样品进行测试，PtUME测得的生物膜厚度均落在q，n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究CLSM测试的生物膜厚度偏高的范围内。这主要是因为，一方面，利用PtUME测试生物膜厚度，实际上是通过测试核黄素在生物膜表面的扩散层来实现的。尽管核黄素扩散层在生物膜表面是非常薄的，但当探针尖端定位到扩散层中时，其到生物膜与溶液的界面还是有一定距离，因此，测试结果会稍微偏高。另一方面，利用CLSM测试生物膜厚度时，需要对生物膜样品进行染色和反复清洗，在这一过程中难免会对生物膜造成一定的破坏，使得部分位于表层的生物膜脱落，造成测试结果比实际结果要偏小。除此之外，利用PtUME测试生物膜厚度时，由于测试过程中，微操仪在X轴和Y轴方向上不能移动，这就使得该测试方法实际上是针对生物电极表面某一点的生物膜厚度进行的检测，而并非像CLSM一样是对整个视野范围内的生物膜厚度进行的检测。因此，这也造成了两种方法在测试结果上一定程度的差异。尽管利用PtUME测试生物膜会产生一定的误差，但随着SoneidensisMR．1生物膜的不断生长，生物膜的厚度不断增加，会使得相对误差不断下降。在24h和48h时测得的生物膜厚度误差分别为8．9％和5％，属于可接受的误差范围。因此，采用这一方法对生物电极表面生物膜的生长情况进行连续原位地监测是可行的。5．2．4氧气对ShewanellaoneidensisMR-1生物膜形成的影响SoneidensisMR．1是一类兼氧型微生物，在有氧气存在时，呼吸作用产生的电子可经过电子传递链传导给氧气；在无氧条件下，代谢产生的电子则可通过核黄素的间接传递或是C型细胞色素的直接传递转移给电极等外源电子受体。因此，溶液中的溶解氧决定了SoneidensisMR．1的代谢途径，并影响生物膜的形成【62，1441。图5．9所示为不同电势条件下，SoneidensisMR．1在有氧和无氧环境中生长24h后生物膜厚度的变化情况。可以发现，当溶液中有氧气存在时，＆oneidensisMR．1的生长速度明显加快，生物膜厚度明显增大。这可以从微生物能量代谢的角度加以解释。在有氧条件下，SoneidensisMR-1可将呼吸作用产生的电子传递给氧气，在电子由低电势的有机物向高电势的氧气传递过程中，产生的能量以ATP的形式固定在细胞中，用于微生物代谢。在无氧条件下，同样存在着电子由低电势的有机物向高电势的细胞色素蛋白的传递过程。这部分细胞色素蛋白位于n万方数据n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究5．2．5电极电势对ShewanellaoneidensisMR-1生物膜形成的影响在研究BES启动的过程中，很多学者提出，若给电极施加一恒定的电势(生物阳极挂膜施加较正的电势，生物阴极挂膜施加较负的电势)，则能缩短EAB的挂膜时间[95，141,1421。可见，作为SoneidensisMR．1等EAB代谢过程中的最终电子受体，电极的极化电势对于生物电极表面生物膜的形成具有重要的影响。图5．10所示为不同电极电势下，SoneidensisMR．1挂膜生长48h的生物膜厚度变化情况。当电极电势控制在恒定水平时，随着挂膜时间的推进，电极表面＆oneidensisMR．1生物膜的厚度不断增加。在挂膜24h后，尽管生物膜厚度仍在继续增长，但其增长的速度已明显放缓，生物膜厚度已趋于稳定。当电极电势为+100mV时，在接种24h后，Soneidens&MR．1生物膜的厚度就达到了104岫，但在接种48h后，SoneidensisMR．1生物膜的厚度仅比24h时的厚度增加了91．tm。这可能是由于，当给金盘电极施加一较正电势时，SoneidensisMR．1可以其作为电子受体进行呼吸代谢，从而在电极表面大量富集，生物膜则表现为越来越厚。但是，一方面，金盘电极的面积较小，其可供核黄素发生氧化反应的场所有限。另一方面，随着生物膜厚度的不断增加，生物膜外侧SoneidensisMR．1产生的核黄素在向电极扩散的过程中受到的阻力增大。这使得生物膜在达到一定厚度后，微生物的继续生长受到了阻碍。因此，在经过一段时间的快速增长后，＆oneidensisMR．1生物膜的厚度基本达到稳定，其厚度的增长速度开始放缓。当电极电势同为+100mV时，＆oneidensisMR．1生物膜在金盘电极和ITO电极上的生长情况有所不同，这可能是由于基底电极材料的不同或工作电极面积的差异所造成的。由于SoneidensisMR一1生物膜厚度在24h时已基本达到稳定，因此对不同电势条件下SoneidensisMR-1挂膜生长24h后的生物膜厚度进行了考查。实验平行进行了三组测试，以尽可能消除细菌生长速率差异所造成的误差。由图5．11可发现，随着电极电势的提高，挂膜24h后的SoneidensisMR．1生物膜厚度也逐渐增加。当电极电势由．100mV提高到+100mV时，生物膜厚度由30士2lam增长到112士5gm。可见，较正的电极电势有利于SoneidensisMR．1在电极表面的生长。然而，Soneidens&MR．1在无氧环境中主要是依靠核黄素或细胞色素蛋白进行电子传递的，与氧气作为电子受体不同的是，无论电极电势控制在多少，n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究只要其高于核黄素或细胞色素蛋白的氧化还原电位，则Soneidens&MR．1在代谢过程中所获得的能量都是恒定的，都是由有机物与核黄素或细胞色素蛋白之间的电势差所决定的。因此，提高电极电势，更有可能影响的是核黄素或细胞色素蛋白的电子传递速率。较高的电极电势能驱动电子更快地到达电极表面，并加速细菌代谢产生的电子向胞外传递，进而加速细菌的代谢速率和生长速度。图5．10不同电极电势下挂膜48小时，SoneidensisMR．1生物膜厚度的变化(工作电极：金盘电极d=2mm，菌种：＆oneidensisMR．1，乳酸钠浓度20mM，T=30。C，严格厌氧，t=48h)Figure5．10ThechangeofS．oneidensisMR-lbiofilmthicknessduring48hinoculationwithdifferentappliedpotentials．(workingelectrode：goldplateelectroded=2mm，bacterialculture：＆oneidensisMR一1，sodiumlactateconcentration：20mM，T=30。C，anaerobiccondition，t=48h)和生物膜厚度随着时间的变化趋势一致，随着电极电势的不断升高，SoneidensisMR．1生物膜厚度的增长也表现出了一定的饱和。当电极电势由+100mV提高到+300mV时，＆oneidens&MR．1生物膜的厚度仅从113+5grn增加到120±7岬。虽然电极电势的提升可促进EAB的胞外电子传递速率，使其不再成为胞内电子传递的限制因素。但微生物本身的代谢速率以及胞内电子传递速率是有限的，继续提高电极电势并不能改变微生物自身的最大代谢能力，因此，微生物的生长表现出了一定的饱和。除此之外，上文中所提到的较厚的生物膜会阻碍96n万方数据n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究这类有机物当中的能量固定到细胞内，用于自身的生长和代谢过程。较高的乳酸钠浓度为Soneidens&MR．1的生长提供了更多的能源物质，因此可加速生物膜的形成。昌e甥。互．2专昌毫．2∞Time(h)图5．12乳酸钠浓度对Soneidens&MR．1生物膜厚度的影响(工作电极：金盘电极d=2mm，菌种：SoneidensisMR-1，挂膜电势+100mV，T=30。C，严格厌氧，t=48h)Figure5．12Effectofsodiumlactateon＆oneidensisMR-1biofilmthickness．(workingelectrode：goldplateelectroded=2mm，bacterialculture：＆oneidensisMR·1，workingelectrodepotential：+100mV,T=30。C，anaerobiccondition，t=48h)值得注意的是，当乳酸钠浓度为5mM、20mM以及40mM时，＆oneidensisMR．1生物膜厚度的增长均出现了平台期。其中，当乳酸钠浓度高于20mM时，生物膜的厚度基本维持在110gm左右，这与之前在不同电极电势条件下测试得到的＆oneidensisMR．1生物膜厚度变化情况一致，即在生物膜厚度达到100gm以上时，其增长速率开始变得缓慢。当乳酸钠浓度为5mM时，SoneidensisMR．1生物膜在经过20h的挂膜后即表现出增长速率的放缓。造成这一变化的原因主要是随着时间的推移，乳酸钠已逐渐被＆oneidensisMR．1耗竭(48h后，残留液中乳酸钠浓度已低于检出限)，溶液中没有足够的碳源维持细菌的生长，微生物只能通过内源呼吸维持能量代谢。因此，此时的生物膜厚度也会维持在一个相对稳定的水平。9Rn万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究5．2．7核黄素对ShewanellaoneidensisMR-1生物膜形成的影响作为Soneidens&MR-1所分泌的一类独特的氧化还原电子介体【60，”81，核黄素参与了＆oneidensisMR．170％一95％的电子传递【124，1251。尤其是位于生物膜外侧的Soneidens&MR．1，难以通过C型细胞色素实现直接电子传递，这部分细菌主要是依靠核黄素的介导作用才能完成细胞的能量代谢过程。图5．13所示为在生物膜挂膜初期添加一定浓度的核黄素后，生物膜厚度在12h和24h时的变化情况。随着初始核黄素浓度的增加，＆oneidens&MR-1的生长速度也逐渐加快，当初始核黄素的浓度由0nM增长到40nM时，12h时SoneidensisMR．1生物膜的厚度由39岬上升到68lam，增幅超过了70％。昌i、-，甥。皇■．2二_暑薯．宝∞图5．13初始核黄素浓度对＆oneidensisMR．1挂膜12小时和24小时后生物膜厚度的影响(工作电极：金盘电极d=2mm，菌种：SoneidensisMR．1，乳酸钠浓度20mM，T=30。C，严格厌氧，t=24h)Figure5．13EffectoftheinitialriboflavinconcentrationontheSoneidens括MR-1biofilmthicknessafter12hand24hinoculation．(workingelectrode：goldplateelectroded=2mm，bacterialculture：SoneidensisMR．1，sodiumlactateconcentration：20mM，T=30。C，anaerobiccondition，t=24h)在挂膜初期，细菌生物量较少，代谢速率较慢，核黄素的产生量也较少，不利于远距离传输Soneidens&MR。1代谢过程中产生的电子，这给生物膜厚度的99n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究增加造成了一定的限制。当向溶液中添加一定量的核黄素后，这些核黄素便可弥补之前因核黄素浓度较低导致的生物膜生长缓慢，从而促进SoneidensisMR一1在挂膜的初期快速生长。后续实验考查了在＆oneidens&MR．1挂膜的不同时期添加20nM的核黄素后，生物膜生长速率的变化。如图5．14所示，当在挂膜初期向溶液中添加核黄素时，能够有效地提高电极表面生物膜的形成速度，在12h时，SoneidensisMR．1的生长速率为未添加核黄素时的1．4倍。当在SoneidensisMR．1生长基本达到稳定后(24h后)向溶液中添加核黄素时，核黄素对于细菌的生长几乎没有促进作用(生物膜厚度的变化较未添加核黄素时仅增加2pm)。这再次对之前实验结果的推断分析进行了验证。图5．14挂膜不同时期添加核黄素对＆oneidens&MR．1生物膜厚度的影响一：不添加核黄素；●：挂膜开始时添加；▲：挂膜24小时后添加(工作电极：金盘电极d=2mm，菌种：Soneidens&MR-1，乳酸钠浓度20mM，T--30。C，核黄素添加浓度20nM，严格厌氧，t=-48h)Figure5．14ThechangeoftheSoneidens&MR一1biofilmthicknesswith20nMriboflavinaddedatdifferentperiodofinoculation．■：noriboflavinaddition；●：addedatthebeginningoftheinoculation；▲：addedafter24hinoculation．(workingelectrode：goldplateelectroded=2mm，bacterialculture：SoneidensisMR·1，sodiumlactateconcentration：20mM，T=30。C，riboflavinconcentration：20nM，anaerobiccondition，t=48h)100n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究5．2．8ShewanellaoneidensisMR-1生长动力学分析对不同条件下电极表面Soneidens&MR．1生物膜的生长过程进行动力学分析，有助于全面认识SoneidensisMR．1生物膜的形成机制。本论文采用Capdeville生物膜增长动力学模型来描述SoneidensisMR-1生物膜的形成过程。在这一模型体系中，Capdeville等人对载体表面生物膜结构的变化进行了动态的分析，认为生物膜的增长存在一种典型的自我催化．抑制过程【184。1861。一方面，生物膜的增长随着载体表面生物量的积累会加快；另一方面，生物膜的增厚会限制底物的扩散，某些由微生物分泌的抑制性物质的浓度也会增加，从而限制活性生物量的进一步增长。如前文所述，在远离电极的生物膜外侧生长的SoneidensisMR．1，其代谢过程中产生的电子主要通过核黄素的间接传递而转移给电极，直接电子传递对＆oneidensisMR．1生物膜外侧细菌的生长影响较小。当不考虑Soneidens&MR．1的直接电子传递时，EAB生物膜的增长也符合Capdeville生物膜增长动力学模型所描述的规律。所不同的是，Soneidens&MR．1通过核黄素的介导实现电子由微生物向电极的传递，电极作为反应体系中唯一电子受体参与Soneidens&MR．1代谢过程，成为＆oneidens&MR．1能量代谢中的限制性因素。因此，随着生物膜厚度的增加，生物膜外侧核黄素扩散到电极表面所受的阻力不断增大，外侧微生物生长受到的抑制作用不断增大。&oneidens&MR．1挂膜时间相对较短，假设生物膜内微生物以活性微生物为主，并且在同一平面上微生物的生长速率一致，则电极表面生物量的积累速率可表述为：dX面2rg叶i其中，X为生物电极表面＆oneidensisMR-1生物量浓度(pg·lam。2)，rg为生物量积累速率(pg·I_tm-2．hJ)，ri为微生物失活速率(gg‘lam-2’h‘1)。SoneidensbJMR．1活性生物量的增长发生于生物膜动力学增长期，其生物量的增长是底物浓度的零级反应，即：rg=¨’X其中，u’为特定条件下Soneidens&MR．1的比增长速率(h’1)。Soneidens&MR．1生物膜外侧微生物的失活速率取决于生物膜自身对微生物增长的禁锢作用以及生物膜内某些抑制性物质的浓度，其值符合如下关系101n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究ri=klCX其中，kl为生物膜微生物失活系数(L·btg-1"h。1)，C为生物膜抑制性产物的浓度(1．tg·L。)，其产生量正比于生物膜中活性生物量，即：其中，a为常数(L。)。将以上三式进行合并，则得到如下关系式：idX：la'X．k2x2面2。k2Ⅳ其中，k2=akl(p91·h1)，为一常数。当生物膜生长进入稳定期时，生物膜厚度达到最大，其生物膜外侧生物量积累速率和失活速率一致，即：面。o此时，X=Xm觚通过以上关系式，可求得k2=士。1maX其中，Xmax为生物电极表面＆oneidensisMR．1最大生物量浓度(“g’岬‘2)。由此可得：警2p’x(1-去方程积分后可得到SoneidensisMR-1生物量浓度的表达式：k审Xmax其中Xo为SoneidensisMR．1初始生物量浓度(肛g·岬之)。假设＆oneidensisMR．1生物膜在生长过程中密度P(“g·“m。3)均匀不变，则上式可转化为SXL=——=PXma)【Lma)【[1+【百Xmax-1)e-fft]p其中L为生物电极表面SoneidensisMR．1生物膜厚度(iam)，Lo为SoneidensisMR．1初始生物膜厚度(岬)，其值与生长在电极表面的初始生物量浓度有关。Lm戤为SoneidensisMR．1最大生物膜厚度(岬)。通过PtUME对不同条件下生物膜的生长进行监测，当生物膜厚度基本达到稳定时，认为生物102n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究膜厚度达到最大，此时的膜厚即为Lm觚。在本论文中，SoneidensisMR．1以菌液的形式加入到反应器中。假设在电极极化后，SoneidensisMR．1在电极表面迅速富集，形成由一层细胞组成的贴附在电极表面的生物膜，则Lo可由Soneidens&MR．1细胞的尺寸来表示。取SoneidensisMR．1细胞尺寸的中间值1gm作为Lo的取值【1321。在此基础上，通过OriginPro8软件对实验结果进行拟合。图5．15为基于Capdeville生物膜增长动力学模型的推导方程在不同电势下对＆oneidens&MR一1生物膜厚度变化的拟合结果。从图中可以看出，模型方程和实验结果具有较好的相关性(R2>0．98)，这说明Capdeville生物膜增长动力学模型能够较好地描述生物电极表面EAB的生长过程。昌3臻。互．2专昌墨．2∞图5．15SoneidensisMR-1生物膜的Capdeville增长动力学模型拟合Figure5．15CapdevillemodelfittingofS．oneidens&MR-1biofilmgrowth．表5．4列举了不同操作条件下，＆oneidensisMR．1生物膜厚度的比增长速率的拟合结果，通过对这一数值进行分析，可从一定程度上揭示SoneidensisMR．1生物膜的生长机制。改变电极电势，对比增长速率没有明显的影响，即电极电势对于微生物代谢速率的提升影响较小，影响生物膜厚度的是不同电势条件下核黄素所受电场力的大小，及其在生物膜中扩散的阻力。与之不同的是，提高乳酸钠浓度和核黄素浓度，则会提升Soneidens&MR．1生物膜厚度的比增长速率。这说明，乳酸钠和核黄素作为微生物代谢过程中重要的底物，直接影响了＆1n3n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究oneidensisMR．1的生长速率。表5．4不同条件下拟合得到的Soneidens&MR-1生物膜厚度的比增长速率Table5．4SpecificgrowthrateofS．oneidensisMR-1biofilmindifferentconditions．5．3本章小结本章以SoneidensisMR．1为研究对象，建立了一套用于对分泌氧化还原电子介体的EAB生物膜厚度进行原位测试的方法，并对生物电极表面生物膜的形成机制进行了研究，主要结论如下：(1)成功构建了一套用于BES中EAB生物膜厚度原位连续测试的方法。本论文中PtUME所测得的Soneidens&MR．1生物膜厚度与CLSM测试得到的结果基本吻合。挂膜24h和48h时后的生物膜厚度测试结果的误差分别为8．9％和5％，属于可接受的范围。CV测试结果显示，生物膜厚度测试过程中，PtUME探得的电流信号来源于SoneidensisMR．1所分泌的核黄素。核黄素在生物膜表面的扩散层厚度小于20lam，当渐近曲线产生电流跃升时，PtUME尖端已伸入核黄素扩散层中，距离生物膜表面小于10Ixm。(2)当溶液中有氧气存在时，SoneidensisMR．1的生长速度较无氧条件下明显加快，生物膜厚度明显增大。电极电势可促进生物膜的形成，电极电势越高，SoneidensisMR．1生物膜的生长速度越快。较高的初始乳酸纳浓度有利于电极表面生物膜的快速形成。乳酸钠浓度较低时，碳源的耗竭会影响SoneidensisMR．1的生长。核黄素浓度越高越有利于＆oneidensisMR．1生物膜的生长，且这一促进作用在挂膜初期最为明显。在无氧条件下，Soneidens&MR．1生物膜厚度存在一个增长的限值。当生物膜厚度达到100“m一110pm时，继续提高电极电势、初始乳酸钠浓度或核黄素浓度，对生物膜增长的促进作用不明显。104n万方数据浙江大学博士学位论文电化学活性细菌生物膜的形成机制与动力学研究(3)生物电极表面Soneidens&MR．1生物膜的增长存在一种典型的自我催化．抑制过程，随着EAB生物膜的增厚，一方面，生物电极表面生物量的积累会加快；另一方面，生物膜外侧核黄素扩散到电极表面的阻力不断增大，外侧微生物生长受到的抑制作用不断增强。Capdeville生物膜增长动力学模型能够较好地描述这一生长过程，相关系数可达0．98。不同条件下，SoneidensisMR．1的比增长速率不同。当乳酸钠浓度为20mM，电极电势为+100mV时，比增长速率为0．27h。1。n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用6基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用通过构建高效去除难降解有机污染物的生物阴极，可实现BES对某些难降解有机废水的处理。利用外电路提供的电子和能量，可驱动电极上的EAB以共代谢途径降解这类有机污染物。在微生物三电极体系下，以电化学工作站作为“电源”可使生物阴极电势维持在恒定水平，并可对污染物去除速率进行控制。但是，受限于工作电极面积、参比电极机械强度以及电化学工作站成本等一系列因素，微生物三电极体系难以实现工程应用。MFC为生物阴极的应用提供了可能，通过MFC生物阳极对市政污水、食品工业废水等废水进行处理，可将氧化有机物得到的电子输出给生物阴极。然而，单个MFC输出电能有限，生物阳极电势存在一定限值。在pH中性条件下，当电极表面发生的是乳酸氧化为乙酸的反应时，其理论上的氧化还原电位为．O．42V【1241，实际的阳极电势往往远高于这一电势值。为了尽可能降低连接生物阴极的电极电势，可将多个MFC反应器进行串联，通过多个电池电能的累积驱动生物阴极污染物降解。而在实际操作中，尽管通过这一设计可提升反应器的输出电压，但却同样会影响反应器的稳定性。在MFC中，难降解有机污染物在电极表面的降解速率往往较慢且不稳定。一旦阴极表面氧化还原电位低于相邻阳极氧化还原电位，则可能发生电压反转，从而造成整个反应器性能不可逆的下降【641。将生物阴极引入到MFC中，可提高电极对难降解有机污染物的还原速率，使反应器维持在基本稳定的水平，一定程度上避免电压反转现象的发生。本章利用第二章获得的高效去除活性蓝13的EAB，构建了含双极一t生(bipolar)电极的基于生物阴极的MFC堆栈反应器，利用易降解有机废水中的生物质能实现了对难降解有机废水的原位处理，为生物阴极的工程化应用提供了设计指导。本章主要考查了活性蓝13进水浓度、乳酸钠浓度、阳极液水力停留时间、生物阴极液水力停留时间等因素对基于生物阴极的MFC堆栈电化学性能及活性蓝13去除效率的影响，并以单个的MFC反应器及多个串联的MFC反应器为对照，评价了这一反应装置的运行效果。n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用6．1实验材料与方法6．1．1实验试剂及营养液组成本章节所提及化学试剂均为分析纯，其中活性蓝13购于阿法埃莎(天津)化学有限公司，4．羟乙基哌嗪乙磺酸及组成维生素溶液的所有试剂购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，其余试剂购于杭州惠普化工有限公司。本章节中所用气体购于杭州今工特种气体有限公司，混合气组成为80％氮气和20％---氧化碳，高纯氮纯度为99．999％。实验中，生物阳极挂膜时阳极液为M4营养液，阴极液为去除了NaHC03、微量金属元素及维生素之后的厌氧基础培养液。生物阴极挂膜时，阴极液为厌氧基础培养液，阳极液为去除了NaHC03、微量金属元素及维生素之后的厌氧基础培养液。在MFC堆栈处理活性蓝13的实验中，阳极液为M4营养液，生物阴极室溶液为厌氧基础培养液，非生物阴极室为去除了NaHC03、微量金属元素及维生素之后的厌氧基础培养液。M4营养液配方参见第五章5．1．1小节，厌氧基础培养液配方参见第二章2．1．1小节。6．1-2实验材料本章节生物阳极和生物阴极均为碳布电极(有效工作范围为直径3cm的圆形区域，上海河森电气有限公司)，并通过碳导电胶(美国SPISupplies公司)将其粘贴在高纯石墨块电极上(5cm×5cmXO．5cm，纯度99．99％，北京吉兴盛安工贸有限公司)。电极在使用前均需用丙酮溶液进行预处理，处理方法参见第三章3．1．2小节。参比电极为CHllllAg／AgCI电极(上海辰华仪器有限公司)，相对标准氢电极电势为+200mV(本章所有电势均指相对标准氢电极电势)。生物阳极挂膜时，对电极为空气阴极，即在碳布电极外侧贴上一片防水透气膜(上海河森电气有限公司)。实验中使用的质子交换膜为NationTM117质子交换膜(美国Dupont公司)，使用前需参照第二章2．1．2小节中的方法对质子交换膜进行预处理。一次性医用注射器购于杭州米克化工有限公司，0．22p．m灭菌滤头购于天津贺世科技发展有限公司。实验中使用的主要仪器设备如表6．1所示。n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用表6．1实验中所用的仪器设备Table6．1Equipmentsusedinexperiments．6．1．3反应器结构本章实验所用反应器为有机玻璃方形反应器，反应器由独立的模块化组件构成，其结构如图6．1所示。用作反应室的组件规格为5cmx5cmx2cm，反应室有效工作体积为14．13mL。用于固定生物阳极和生物阴极的挡板规格为5cm×5cmx0．5cm；用于固定空气阴极的挡板规格同样是5cmx5cm×O．5cm，但中部开有一直径为3cm的孔洞，便于空气透过。每块组件之间垫有硅胶垫片及O型圈，以确保反应器完全密封。进水和出水管从反应器顶端插入，其中进水管伸入到反应器底部，出水管插入在反应室上部，距离反应室底部3cm。反应器运行时，通过调节连接进水管和出水管的蠕动泵转速，确保反应室内溶液体积维持恒n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用定。各组件在四个边角处均开有孔洞，以便于螺杆的穿过。通过固紧反应器两端螺杆上的蝶形螺母，完成方形反应器的搭建。图6．1组成微生物燃料电池堆栈的方形反应器Figure6．1CubereactorusedforconstructingtheMFCstack．6．1．4反应器启动方法MFC堆栈反应器启动的关键在于对生物阳极和生物阴极的挂膜。在本章实验中，生物阳极和生物阴极挂膜通过电化学工作站进行控制，分别在不同的单个MFC反应器中完成(图6．2)。当进行生物阳极挂膜时，阳极接种菌为ShewanellaoneidensisMR一1，阴极采用空气阴极。M4营养液以3．5mL／h的流量注入反应器阳极室，与此同时，另一蠕动泵与反应器出水管相连，以5mL／h的速度向外抽出多余的营养液。电化学工作站控制阳极电势维持在+300mV，每隔5min对电流值进行采集。CV每隔24h执行一次，扫描范围为一0．5V到0．5V，扫描速率为5mV／s。在注入反应器之前，M4营养液通过低温恒温水浴维持在4℃，并持续曝入经无菌处理的高纯氮气。反应器置放于生化培养箱中，温度控制在35℃。当进行生物阴极挂膜时，阴极接种菌为第二章中高效降解活性蓝13的EAB，厌氧基础培养液中添加了50mg／L的活性蓝13，营养液以3．5mL／h的流量注入反应器阴极室，与此同时，另一蠕动泵以5mL／h的速度向外抽出多余的营养液。挂膜过程中，通过电化学工作站控制阴极电势维持在一200mV，并每隔5min对电流值进行采集。CV每隔24h执行一次，扫描范围为。0．8V到0．8V，扫描速率为5mV／s。厌氧基础培养液在反应器外需持续曝入经无菌处理的N2／C02混合气，培养液保存方法与M4营养液一致。反应器置放于生化培养箱中，温度控制在35℃。n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用A4Ci趸≥B至{，{i兰i≤二-2羞；PP图6．2生物阳极和生物阴极构建过程中反应装置示意图Figure6．2SchematicoftheBESforbioanodeandbiocathodeset—up．6．1．5微生物燃料电池堆栈降解活性蓝13实验设计反应器挂膜成功后，将电极从原BES反应器中拆卸下来，并按照图6．3所示组装成MFC堆栈反应器。在MFC堆栈中，两相邻的MFC反应器单元通过石墨块电极相阻隔，石墨块一侧为生物阳极，另一侧为非生物阴极，从而使得一块电极同时表现出阳极和阴极的双极性。通过蠕动泵向各个反应室注入营养液，其中生物阳极室内为M4营养液，生物阴极室内为添加有活性蓝13的厌氧基础培养液，非生物阴极室为去除了NaHC03、微量金属元素及维生素之后的厌氧基础培养液。与此同时，通过另一个蠕动泵控制各个反应室内溶液体积保持稳定。MFC堆栈在原电池模式下运行，反应器最外端生物阳极和生物阴极与变阻箱(zX21a，上海东茂电子科技有限公司)相连。MFC堆栈各组成单元的电池电压、电极电势以及MFC堆栈总的电池电压通过数字多用表连续监测，每隔10min采集一组数据。所有营养液在注入反应器之前均在4℃低温水浴槽中低温保存，并持续曝入经无菌处理后的气体。其中，M4营养液通入高纯氮，含活性蓝13的厌氧基础培养液通入N2／C02混合气，非生物阴极液通入空气。实验过程中，MFC堆栈n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应_}=}l反应器放置在生化培养箱中，温度保持在35℃。所有实验均设置三组平行反应器，以消除因微生物活性差异所造成的实验误差。一j；：一■嚣偷f州。一二一}殍}匡{闷朗涠。l‘——一。一一一一一一一一●，一一一一一一图6．3微生物燃料电池堆栈示意图Figure6．3SchematicofaMFCstack．实验首先就活性蓝13进水浓度、乳酸钠浓度、生物阴极液HRT以及阳极液HRT几个因素对MFC堆栈处理活性蓝13的影响进行了考查，并比较了生物阴极和非生物阴极MFC堆栈的差异。具体包括如下：(1)活性蓝13进水浓度：外接电阻设定为1000Q。所有极室均在连续流条件下运行，营养液在极室中的水力停留时间为4h。改变活性蓝13的初始浓度，考查浓度为30mg／L、50mg／L、100mg／L以及150mg／L时，不同反应器连续运行24h后的活性蓝13去除率及生物阴极液TOC去除率。(2)乳酸钠浓度：外接电阻设定为1000Q。所有极室均在连续流条件下运行，营养液在极室中的水力停留时间为4h。改变M4溶液中乳酸钠的浓度，考查乳酸钠浓度为5mM、10mM、20mM以及40mM时，不同反应器连续运行24h后的活性蓝13去除率及生物阴极液TOC去除率。(3)生物阴极液HRT：外接电阻设定为1000Q。所有极室均在连续流条件下运行，除了生物阴极液以外，其余所有极室中营养液的HRT均恒定为4h。改变生物阴极液HRT，考查HRT为1h、2h、4h以及8h时，不同反应器连续运行24h后的活性蓝13去除率及生物阴极液TOC去除率。@}剖。纠。引：引1-一．。．引：叫：■一1一面茵一n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用(4)阳极液HRT：外接电阻设定为1000Q。所有极室均在连续流条件下运行，除了阳极液以外，其它所有极室中营养液的HRT均恒定为4h。改变阳极液HRT，考查HRT为1h、2h、4h以及8h时，不同反应器连续运行24h后的活性蓝13去除率及生物阴极液TOC去除率。在条件优化实验的基础上，比较了在单个MFC反应器、多个MFC反应器串联以及MFC堆栈反应器中，生物阴极和非生物阴极对于活性蓝13及TOC的去除效果，并对这些反应器的电化学参数(电池开路电压、电极电势、内阻、最大功率密度等)进行了表征。活性蓝13的降解在序批式条件下进行，每隔2h采集1mL样品，活性蓝13的初始浓度为50mg／L，乳酸钠浓度为20mM，阳极液水力停留时间(hydraulicresidencetime，HRT)为4h。6．1．6分析测试方法生物阴极液中活性蓝13的浓度通过紫外分光光度计测试，分析测试方法参见第二章2．1．5小节。TOC采用总有机碳分析仪测试，测试方法参见第三章3．1．6小节。极化曲线的测试通过数字多用表进行，测试开始前先将连接反应器的变阻箱电阻值调节到最大，待电压稳定后，记录下数字多用表读数。之后逐渐减小变阻箱电阻，并记下相应的电池电压读数，直到电压值接近0V。根据不同电阻值下对应的电压值，计算出相应的电流密度。以电流密度为横坐标，对电池电压作图，得到对应反应器的极化曲线。反应器功率密度曲线的绘制在极化曲线测试数据的基础上进行，功率密度的计算公式如下：p=U2／RV其中，U为测试得到的电池工作电压(V)，R为外接变阻箱的电阻值(Q)，V为反应器的工作体积(1．413×10。5m3)。以电流密度作为横坐标，功率密度作为纵坐标进行绘图，得到的曲线即为反应器的功率密度曲线。6．2结果与讨论6．2．1微生物燃料电池堆栈的启动MFC堆栈顺利启动的关键是要成功对组成堆栈的每一块电极完成EAB挂膜。如图6．4所示，生物阳极挂膜持续3．5天。在挂膜10h后，反应器电流密度n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用即出现明显的上升，挂膜60h后，电流密度达到最大的40A／m2左右，并维持了20h。这说明，Soneidens西MR一1已成功生长在碳布电极表面，并达到较为稳定的水平。CV扫描结果也证明电极上已覆盖有产电微生物，挂膜完成后的CV图谱中出现了明显的氧化还原峰，其氧化还原电位大致位于一0．15V(图6．5)。Time(h)图6．4生物阳极和生物阴极构建阶段电流密度的变化(阳极液：M4营养液，阳极液HRT：4h，阳极挂膜电势：+300mV；阴极液：厌氧基础培养液，阴极液HRT：4h，活性蓝13浓度：50mg／L，阴极挂膜电势：一200mV)Figure6．4Changesofcurrentdensityduringtheperiodsofbioanodeandbiocathodeset—up．(anolyte：M4medium，HRTofanolyte：4h，anodepotential：+300mV,catholyte：anaerobicbasalmedium，HRTofcatholyte：4h，RB13concentration：50mg／L，cathodepotential：一200mV)相较于生物阳极，生物阴极挂膜所需的时间更长，反应器电流在经过30h后才开始缓慢上升，70h后电流值基本稳定在15A／m2左右。这主要是由于生物阴极中的细菌代谢类型以自养型为主，其生长速度一般较异养菌慢。并且，由于生物阳极中接种的是SoneidensisMR一1纯种菌，该细菌本身就是一种产电能力很强的EAB，因此生物阳极上表现出了更高的输出电流密度。对挂膜后的生物阴极进行CV扫描，同样表现出了与挂膜前不同的CV图谱，氧化还原峰电流明显111n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用增强(图6．6)。这说明EAB成功生长在阴极表面。图6．5生物阳极构建过程中不同阶段的循环伏安图谱(扫描范围：一O．5V到+0．5V，扫描速率：5mV／s)Figure6．5Cyclicvoltammogramsatdifferentperiodsofbioanodeset—up．(scanningrange：一O．5Vto+0．5Vscanningrate：5mV／s)《宣、-，皇o■k暑UPotential(V)图6．6生物阴极构建过程不同阶段的循环伏安图谱(扫描范围：一0．8V到+0．8V，扫描速率：5mV／s)Figure6．6Cyclicvoltammogramsatdifferentperiodsofbiocathodeset—up．(scanningrange：一0．8Vto+0．8Vscanningrate：5mV／s)114n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用6．2．2微生物燃料电池堆栈运行条件优化(1)活性蓝13浓度图6．7展示了不同活性蓝13进水浓度下，基于生物阴极和非生物阴极的MFC堆栈反应器在稳定运行24h后的工作电极(用于处理活性蓝13的阴极)电势、内阻值、活性蓝13去除率以及TOC去除率的变化。图6．7活性蓝13进水浓度对基于生物阴极和非生物阴极的微生物燃料电池堆栈中(A)工作电极电势、(B)反应器内阻、(C)活性蓝13去除率及(D)总有机碳去除率的影响(外电阻：1000Q，阳极液HRT：4h，乳酸钠浓度：20mM，阴极液HRT：4h，三组反应器平行)Figure6．7EffectsoftheinitialRB13concentrationon(A)workingelectrodepotential，(B)internalresistance，(C)RB13removaland(D)TOCremovalinMFCstackswithbiocathodeorabioticcathode．(externalresistance：1000Q，HRTofanolyte：4h，sodiumlactateconcentration：20mM，HRTofcatholyte：4h，threeidenticalreactors)随着活性蓝13进水浓度的增加，反应器的内阻略有下降，高浓度的活性蓝n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用13为生物阴极还原反应提供了更多的电子受体，降低了反应器活化内阻。随着更多的活性蓝13分子在生物阴极表面发生还原降解，反应器对TOC的去除速率也随之提高。当活性蓝13进水浓度为150mg／L时，反应器对活性蓝13的去除速率达到17．4+0．8mg／L·h，对TOC的去除速率达到5．2±1．0mg／L·h，分别是活性蓝13进水浓度为30mg／L时的3．2倍和1．7倍。工作电极电势受活性蓝13进水浓度的影响不大，当浓度由30mg／L上升到150mg／L时，基于生物阴极的MFC堆栈工作电极电势在一0．392V到一0．382V之间波动。这是由于决定生物阴极电势水平的主要因素是与之相连的生物阳极电势以及各MFC反应器的电池电压，而活性蓝13浓度对于其它反应单元的影响较小，因此活性蓝13进水浓度对生物阴极电势不造成影响。通过与非生物阴极的MFC堆栈反应器相比较，将生物阴极整合到MFC堆栈反应器中可有效降低反应器内阻及工作电极电势，提高反应器对于活性蓝13和TOC的去除效率。(2)乳酸钠浓度乳酸钠作为生物阳极的有机碳源，其浓度直接决定了阳极表面EAB的产电量，从而间接影响生物阴极对活性蓝13的去除效果。图6．8所示为进水乳酸钠浓度从5mM提高到40mM时，MFC堆栈反应器的电化学特性及其对活性蓝13的去除效果。随着进水乳酸钠浓度的持续升高，工作电极电势和反应器内阻不断下降，MFC堆栈对活性蓝13和TOC的去除率不断上升。乳酸钠浓度的提升，为&oneidensisMR．1提供了丰富的碳源，降低了反应器的活化内阻，从而使工作电极电势能达到一个较低的水平。当进水乳酸钠浓度为40mM时，工作电极电势为一0．407V左右，反应器内阻为1092．44-53．0Q，活性蓝13去除率为75．9±2．6％，TOC去除率为24．1--+3．8％。由此可见，较高浓度的乳酸钠有利于MFC堆栈对污染物的去除，但是，高浓度的乳酸钠同样会导致SoneidensisMR一1对乳酸钠的利用率下降，当进水乳酸钠浓度为40mM时，SoneidensisMR-1对乳酸钠的去除率仅为30．1±1．4％。因此，有必要对阳极液有机碳源浓度进行控制，在确保其利用率的基础上最大限度地提高MFC堆栈对活性蓝13的去除效率。n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用图6．8乳酸钠浓度对基于生物阴极和非生物阴极的微生物燃料电池堆栈中(A)工作电极电势、(B)反应器内阻、(C)活性蓝13去除率及(D)总有机碳去除率的影响(外电阻：1000Q，阳极液HRT：4h，阴极液HRT．4h，活性蓝13浓度：50mg／L，三组反应器平行)Figure6．8Effectsofthesodiumlactacteconcentrationon(A)workingelectrodepotential，(B)internalresistance，(C)RB13removaland(D)TOCremovalinMFCstackswithbiocathodeorabioticcathode．(externalresistance：1000Q，HRTofanolyte：4h，HRTofcatholyte：4h，RB13concentration：50mg／L，threeidenticalreactors)(3)生物阴极液水力停留时间图6．9所示为不同生物阴极液HRT下，MFC堆栈的工作电极电势、反应器内阻以及对溶液中活性蓝13和TOC的去除效率。随着生物阴极液HRT的提高，活性蓝13分子在阴极室有更多的时间参与电极表面的还原降解反应。因此，延长生物阴极液HRT的作用相当于提高了活性蓝13在阴极室内的浓度。与活性蓝13进水浓度对反应器性能的影响一样，随着HRT由1h延长到8117n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用h，活性蓝13去除率和TOC去除率不断提高，而MFC堆栈工作电极电势变化不大，基本维持在一0．38V到一0．39V左右波动。当生物阴极HRT由1h上升到8h时，活性蓝13去除率由22．9±1．2％上升到78．6+2．1％，TOC去除率由7．4±2．O％上升到33．i±3．7％。然而，反应器内阻随着HRT的提高却不断上升，由1087．1±54．3Q升至1401．9±49．2Q。这主要是由于，在进水活性蓝13浓度一致的情况下，随着生物阴极液HRT的延长，阴极室内活性蓝13的浓度会相对下降。较低的活性蓝13浓度则使得电极反应活化内阻上升。图6．9生物阴极液水力停留时间对基于生物阴极和非生物阴极的微生物燃料电池堆栈中(A)工作电极电势、(B)反应器内阻、(C)活性蓝13去除率及(D)总有机碳去除率的影响(外电阻：1000Q，阳极液HRT：4h，乳酸钠浓度：20mM，活性蓝13浓度：50mg／L，三组反应器平行)Figure6．9EffectsofHRToftheelectrolyteintheworkingelectrodechamberon(A)workingelectrodepotential，(B)internalresistance，(C)RB13removaland(D)TOCremovalinMFCstackswithbiocathodeorabioticcathode．(externalresistance：1000Q，HRTofanolyte：4h，sodiumlactateconcentration：20mM，RB13concentration：50mg／L，threeidenticalreactors)11Rn万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用(4)阳极液水力停留时间除了乳酸钠浓度，改变阳极液HRT同样会影响SoneidensisMR一1的产电量。(图6．10)图6．10阳极液水力停留时间对基于生物阴极和非生物阴极的微生物燃料电池堆栈中(A)工作电极电势、(B)反应器内阻、(C)活性蓝13去除率及(D)总有机碳去除率的影响(外电阻：1000Q，乳酸钠浓度：20mM，阴极液HRT：4h，活性蓝13浓度：50mg／L，三组反应器平行)Figure6．10EffectsofHRToftheanolyteon(A)workingelectrodepotential，(B)internalresistance，(C)RB13removaland(D)TOCremovalinMFCstackswithbiocathodeorabioticcathode．(externalresistance：1000Q，sodiumlactateconcentration：20mM，HRTofcatholyte：4h，RB13concentration：50mg／L，threeidenticalreactors)当阳极液HRT由1h提升到8h时，工作电极电势和反应器内阻都有不同程度的升高。较短的阳极液HRT，意味着在同一段时间内进入到反应器中的乳酸钠分子的数量增加，相当于提升了反应器的底物浓度，从而提高了SoneidensisMR．1的产电量。因此，较短的阳极液HRT有利于驱动活性蓝13的119n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用还原降解过程。在基于生物阴极的MFC堆栈中，随着阳极液HRT的缩短，反应器对活性蓝13的去除率逐渐提高，由44．6+2．0％上升到82．1±213％。相应地，随着越来越多的活性蓝13分子被分解为小分子芳香族化合物，生物阴极中的EAB对溶液TOC的去除率也不断提升。在HRT为1h时，反应器对TOC的去除率达到30．1±2．9％，是HRT为8h时的2倍(15．4±1．8％)。6．2．3不同反应器对活性蓝13去除效果的比较在本实验中，MFC堆栈将阴阳两极板相整合，形成的电极在相邻的两个MFC单元中分别扮演着阳极和阴极的角色。这样，在将各单个MFC反应器串联的基础上，最大限度地减少了导线的欧姆电阻以及导线和电极连接处的接触电阻。通过这种形式的串联，可有效提高反应器的输出电压，降低生物阴极电势。图6．11和6．12分别展示了不同类型MFC反应器的极化曲线和功率密度曲线。实验结果表明，MFC堆栈可大幅提高反应器的电池电压，与单个MFC反应器及三组MFC串联反应器相比，其开路电压(1．171V)分别为两者的3．6倍(0．321V)和1．1倍(1．025V)。之所以MFC堆栈的开路电压会超过单个MFC反应器开路电压的三倍，是因为在MFC堆栈中只有一个阴极是以活性蓝13作为电子受体，其余两个都是以氧气作为电子受体。氧气的氧化还原电位远高于活性蓝13的氧化还原电位，因此以氧气作为电子受体的电池电压会高于以活性蓝13作为电子受体的电池电压。尽管MFC反应器在组成堆栈后造成了内阻的增大(MFC堆栈为1332．7Q，单个BES反应器为449．7Q)，但相较于三组MFC串联的反应器(1701．4Q)，MFC堆栈内阻却下降了将近21％。这说明，通过此类结构设计的MFC堆栈，可有效提高MFC堆栈的电化学性能，减少不必要的电能损耗。值得注意的是，在同一类型的MFC反应器中，当使用生物阴极处理活性蓝13时，其开路电压、输出功率密度均高于非生物阴极反应器，反应器内阻值也远低于非生物阴极反应器。这说明，生物阴极可催化活性蓝13在电极表面的还原反应，极大地降低反应器的活化内阻。n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用0．8矗皇o山0．4图6．1l不同反应器的极化曲线o：非生物阴极单个反应器；口：生物阴极单个反应器；V：非生物阴极反应器串联：△：生物阴极反应器串联；☆：非生物阴极微生物燃料电池堆栈；◇：非生物阴极微生物燃料电池堆栈Figure6．11Polarizationcurvesperformedindifferentreactors．o：singleMFCwithabioticcathode；口：singleMFCwithbiocathode；V：MFCsconnectedinserieswithabioticcathode；△：MFCsconnectedinserieswithbiocathode；☆：MFCstackwithabioticcathode；◇：MFCstackwithbiocathode．对各反应器处理活性蓝13过程中的工作电极电势、活性蓝13去除率以及TOC去除率进行测试的结果表现出了与电化学特性一致的变化趋势。如图6．13所示，反应器运行稳定后，基于生物阴极的MFC堆栈较单个MFC反应器，工作电极电势由．0．221V左右下降到．0．441V左右，8h后活性蓝13去除率由10．3±1．6％上升到85．4±2．4％，TOC去除率由5．6±1．9％上升到33．4±3．4％。由第三章结论可知，在生物阴极降解活性蓝13的过程中，工作电极作为EAB唯一的电子和能量来源，其电极电势直接决定了EAB的活性及反应器对活性蓝13的去除效率。通过构建MFC堆栈，可使工作电极电势降低到原本单个MFC反应器不n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用能达到的水平，甚至低于产氢电势。这样极大地提高了生物阴极对活性蓝13的还原降解能力。当MFC通过非生物阴极处理活性蓝13时，其工作电极电势值波动较大，活性蓝13处理效果仅为生物阴极下的50％左右。这主要是因为，相较其它MFC单元中阴极上发生的氧气还原反应，非生物阴极对活性蓝13的还原属于整个MFC堆栈中较不稳定的环节。一旦阴极表面氧化还原电位低于相邻阳极氧化还原电位时，则可能导致电压反转的发生，从而降低整个反应器的性能【64]。利用生物阴极处理活性蓝13，可提高反应单元对活性蓝13的还原速率和还原效率，使反应器维持在相对稳定的水平，从而在一定程度上避免了电压反转的发生。图6．12不同反应器的功率密度曲线O：非生物阴极单一反应器；口：生物阴极单一反应器；V：非生物阴极反应器串联；△：生物阴极反应器串联；☆：非生物阴极微生物燃料电池堆栈；◇：非生物阴极微生物燃料电池堆栈Figure6．12Powerdensitycurvesperformedindifferentreactors．O：singleMFCwithabioticcathode；13：singleMFCwithbiocathode；V：MFCsconnectedinserieswithabioticcathode；A：MFCsconnectedinserieswithbiocathode；☆：MFCstackwithabioticcathode；◇：MFCstackwithbiocathode．1’'n万方数据n万方数据浙江大学博士学位论文基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈在活性蓝13降解中的应用1．171V，内阻值为1332．7Q，最大功率密度为14．9W／m3。外接电阻为1000Q时，废水经8h处理后，活性蓝13脱色率及TOC去除率分别为85．4±2．4％和33．4±3．4％。MFC堆栈大幅提升了反应器的产电量，降低了工作电极电势和反应器内阻。利用生物阴极催化活性蓝13降解，提高了反应器的稳定性，避免了电压反转现象的发生。基于生物阴极的MFC堆栈反应器，可对废水中生物质能原位进行回收，实现市政污水或食品工业废水与难降解有机废水的同步处理。124n万方数据浙江大学博士学位论文结论与建议7结论与建议7．1主要结论(1)建立了一套适用于难降解有机污染物处理的电化学活性细菌筛选与驯化方法。通过对原始污泥进行污染物定向富集、亲氢气自养菌梯度筛选以及微生物三电极体系驯化，分别得到了高效降解活性蓝13和五氯苯酚的电化学活性细菌。以氢气作为电子供体时，筛选得到的细菌对活性蓝13的去除速率达到17．41土0．32mg／L·d，对五氯苯酚的去除速率达到2．12士0．05mg／L·d。利用筛选和驯化后得到的细菌分别构建用于处理活性蓝13和五氯苯酚的生物阴极，电极电流密度分别在接种6天和7天后达到稳定，大幅缩短了生物阴极挂膜时间。(2)生物阴极可有效去除活性蓝13，与单一电化学作用(-400mY)和单一微生物作用(无有机碳源)相比，其脱色率分别为两者的1．3倍和28．8倍，TOC去除率分别为两者的8．3倍和14倍。电极电势和pH值对活性蓝13的去除影响显著。活性蓝13的脱色主要在电极表面进行，几乎不受AQDS的影响。在pH=7．0，电极电势为．400mV，活性蓝13初始浓度为100mg／L的条件下，经8h处理后，脱色率达到80．2±5．5％。(3)生物阴极可有效去除五氯苯酚，与单一电化学作用(．400mY)和单一微生物作用(无有机碳源)相比，其去除率分别为两者的3倍和12．1倍，TOC去除率分别为两者的2．7倍和14．6倍。当五氯苯酚初始浓度达到30mg／L及以上时，会对微生物产生毒害作用。电极电势越负，生物阴极对五氯苯酚的去除速率越快，但当电极电势低于．400mV时，大部分电子被用于产氢反应。AQDS能促进电化学活性细菌的悬浮生长，间接参与五氯苯酚的降解。pH值越低越有利于五氯苯酚的还原脱氯，但较低的pH值会抑制电化学活性细菌的活性。在pH=6．5，电极电势为．400mV，五氯苯酚初始浓度为20mg／L条件下，经100h处理后，去除率达到89．7±3．7％。(4)排除了氢气及氧化还原电子介体等可能促进五氯苯酚降解的间接电子传递途径，证实在生物阴极中存在着由电极向电化学活性细菌的直接电子传递途径。生物阴极表面生物膜在+0．2V左右有氧化还原峰，可能为C型细胞色素蛋白的氧化还原峰。454高通量测序结果显示Proteobacteria(45．51％)、Bacteroidetes(33．95％)、Firmicutes(15．92％)为脱氯生物阴极上三类优势菌种。12Sn万方数据浙江大学博士学位论文结论与建议(5)利用铂探针微电极成功构建了一套用于对电化学活性细菌生物膜厚度进行原位连续测试的方法。测试结果与激光共聚焦扫描显微镜测试结果基本吻合。铂探针微电极电流信号来源于Shewanellaoneidens&MR-1所分泌的核黄素。当渐近曲线产生电流跃升时，铂探针微电极尖端距离生物膜表面小于109m。较负的电极电势以及高浓度的乳酸钠、核黄素，有利于Soneidens&MR．1生物膜的形成。在无氧条件下，＆oneidensisMR．1生物膜厚度的限值大约为100岬一110!am。生物电极表面＆oneidensisMR一1生物膜的增长存在一种典型的自我催化．抑制过程，Capdeville生物膜增长动力学模型能够较好地描述这一生长过程，相关系数可达O．98。当乳酸钠浓度为20mM，电极电势为+100mV时，SoneidensisMR．1生物膜厚度的比增长速率为O．27h-I。(6)构建了基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈反应器。和传统反应器相比，用该反应器处理活性蓝13时，反应装置具有更好的电化学特性和污染物去除能力，反应器开路电压为1．171V，内阻值为1332．7Q，最大功率密度为14．9W／m3。外接电阻1000Q，活性蓝13初始浓度为50mg／L时，废水经8h处理后，活性蓝13脱色率和TOC去除率分别为85．4+2．4％和33．4±3．4％。7．2创新点(1)建立了一套适用于难降解有机废水处理的电化学活性细菌筛选与驯化方法，分别构建了用于处理活性蓝13和五氯苯酚的生物阴极，实现了生物阴极对难降解有机污染物的高效去除，为微生物电化学系统在难降解有机废水处理中的应用提供了有益的参考。(2)发现了生物阴极表面存在的电极向电化学活性细菌的直接电子传递途径，探明了生物阴极上参与直接电子传递的电化学活性细菌的菌落组成。(3)开发了一套基于铂探针微电极的电化学活性细菌生物膜厚度原位测试方法，为从微观层面研究电化学活性细菌生物膜的形成机制提供了技术支持。通过对电化学活性细菌生物膜的生长过程进行动力学分析，揭示了电化学活性细菌生物膜的生长规律。7．3存在问题与建议(I)本论文以活性蓝13和五氯苯酚为处理对象，在此基础上构建的生物阴极对特定污染物具有较好的去除效果。然而，实际的难降解有机废水成分复杂，1’6n万方数据浙江大学博士学位论文结论与建议污染物浓度波动大。为了使生物阴极能适用于实际废水的处理，有待对电化学活性细菌筛选和驯化的方法进行改进，并采用实际废水进行研究。(2)本论文证实了生物阴极表面存在直接电子传递途径。但是在电化学活性细菌细胞内参与直接电子传递的结构还不明确。今后的工作应该从基因学和细胞学的角度研究电化学活性细菌中参与电子传递的细胞结构和物质，阐明外源电子在微生物代谢过程中的转移途径，并对直接电子传递途径加以直接证实。(3)利用铂探针微电极能够实现对Soneidens&MR．1等电化学活性细菌生物膜厚度的原位测试。但探针的位置需要手动调节，会造成一定的误差。另外，由于微操仪的精度限制了探针在水平方向的移动，导致对生物膜厚度的测试只能限于电极表面的某一点。因此，今后研究可对探针定位系统进行改进，引入电动装置。其次，由于生物阳极中电化学活性细菌的电子传递机制相对比较明确，因此本论文中对电化学活性细菌生物膜形成机制的研究选用生物阳极为研究对象。随着生物阴极电子传递机制的研究深入，今后工作应该针对生物阴极中电化学活性细菌生物膜的形成机制研究开发一系列测试方法。此外，在对电化学活性细菌生物膜生长过程进行动力学分析时，为使模型简化，忽略了SoneidensisMR．1的直接电子传递途径，并假设生物膜厚度均匀、生物膜密度不变。随着今后对生物膜形成机制的研究深入，应把这些因素都纳入考虑的范畴，对＆oneidens&MR．1生物膜生长模型进行补充和完善。(4)采用基于生物阴极的微生物燃料电池堆栈对难降解有机污染物进行处理，为生物阴极工程化的应用提供了设计指导。在本论文中，重点是考查微生物燃料电池堆栈利用易降解有机废水中的生物质能驱动难降解有机废水处理的可行性，为便于对实验条件加以控制，采用了小型的反应装置。今后工作应就反应器的扩大化进行研究，使微生物燃料电池堆栈适用于对实际废水的处理。此外，与传统生化处理工艺相比，本论文采用的石墨电极机械强度较差，质子交换膜成本较高。这一弊端在将反应器放大到工程中时会更加凸显。因此，后续工作还应针对反应装置的扩大化问题，对电极材料、反应器结构、污水循环方式等一系列因素进行优化。n万方数据浙江大学博士学位论文参考文献VALLACKHW：BAKKERDJ，BRANDTI，eta1．Controllingpersistentorganicpollutants-whatnext?[J】．EnvironmentalToxicologyandPharmacology,1998，6(3)：143-175．刘征涛．持久性有机污染物的主要特征和研究进展[J】．环境科学研究，2005，18(3)：10．沈平．《斯德哥尔摩公约》与持久性有机污染物(POPs)[J]．化学教育，2005．6：6-10．中华人民共和国环境保护部．2012年环境统计年报——废水[EB／OL]．(2013—12—25)[2014-04—25]．http：／／zlsmepgovcn／hjtj／nb／2012tjnb／201312／t20131225—265553htm．MIKESELLMD，BOYDSA．Completereductivedechlorinationandmineralizationofpentachlorophenolbyanaerobicmicroorganisms【J】．AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1986，52(4)：861-865．SIMARROR，GONZALEZN，BAUTISTALF，eta1．Biodegradationofhigh—molecular-weightpolycyclicaromatichydrocarbonsbyawood-degradingconsortiumatlowtemperatures【J1．FemsMicrobiologyEcology，2013，83(2)：438．449．TAKAGIK，KATAOKAR，YAMAZAKIK．Recenttechnologyonbio—remediationofPOPsandpersistentpesticides[J】．Jarq-JapanAgriculturalResearchQuarterly,2011，45(2)：129—136．LINJ，ZHANGXW，LIZJ，eta1．BiodegradationofReactiveblue13inatwo—stageanaerobic／aerobicfluidizedbedssystemwithaPseudomonasspisolate叨．BioresourceTechnology,2010，101(1)：34-40．WUHF．WANGSH．Impactsofoperatingparametersonoxidation—reductionpotentialandpretreatmentefficacyinthepretreatmentofprintinganddyeingwastewaterbyFentonprocess[J]．JournalofHazardousMaterials，2012，243：86．94．128】11=1¨1Ⅲ圜斟问吲嘲矿降pn万方数据浙江大学博士学位论文参考文献[10】【11]【12】[13】[14】[15】[16】【17】[18]ZAHARIAC，SUTEUD．Coalflyashasadsorptivematerialfortreatmentofarealtextileeffluent：operatingparametersandtreatmentefficiency[J】．EnvironmentalScienceandPollutionResearch，2013，20(4)：2226—2235．LOGANBE，RABAEYK．Conversionofwastesintobioelectricityandchemicalsbyusingmicrobialelectrochemicaltechnologies[J】．Science，2012，337(6095)：686—690．BABAUTAJ，RENSLOWR，LEWANDOWSKIZ，eta1．Electrochemicallyactivebiofilms：factsandfiction．Areview【J】．Biofouling，2012，28(8)：789—812．HOUB，SUNJ，HUYEffectofenrichmentproceduresonperformanceandmicrobialdiversityofmicrobialfuelcellforCongoreddecolorizationandelectricitygeneration[J】．AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2011，90(4)：1563-1572．SUNJA，BIZ，HOUB，eta1．Furthertreatmentofdecolorizationliquidofazodyecoupledwithincreasedpowerproductionusingmicrobialfuelcellequippedwithanaerobicbiocathode[J】．WaterResearch，2011，45(1)：283—291．CAIPJ，XIAOX，HEYR，eta1．InvolvementofC-typecytochromeCymAintheelectrontransferofanaerobicnitrobenzenereductionbyShewanellaoneidensisMR一1【J】．BiochemicalEngineeringJournal，2012，68：227-230．MALVANKARNS，TUOMINENMT，LOVLEYDR．Lackofcytochromeinvolvementinlong-rangeelectrontransportthroughconductivebiofilmsandnanowiresofGeobactersulfurreducens[J]．Energy&EnvironmentalScience，2012，5(9)：8651-8659．BRUTINELED，GRALNICKJA。Shuttlinghappens：solubleflavinmediatorsofextracellularelectrontransferinShewanella叨．AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2012，93(1)：41-48．LIUH，GROTS，LOGANBE。Electrochemicallyassistedmicrobialproductionofhydrogenfromacetate【J】．EnvironmentalScience&Technology,2005，39(11、：4317-4320．129n万方数据浙江大学博士学位论文参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