高效降解聚乙烯醇纺织废水处理系统中菌群结构与多样性研究 67页

分类号：X172密级：单位代码：10422学号：201111978⑧∥羹办呈硕士学位论文论文题目：高效降解聚乙烯醇纺织废水处理系统中菌群结构与多样性研究Researchesonmicrobialcommunitystructureanddiversityintextilewastewatertreatmentsystemsforhigh--efficiencybiodegradationofpolyvinylalcohol合作导师2014年05月08日n附件一：原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：篮堡筮纫日期：盈丝堕丝关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：碍脚导师签名：逮!尘羔日n山东大学硕士学位论文目录捅要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．II第一章前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1研究课题背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2聚乙烯醇生产消费现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．3基于WebofScience的聚乙烯醇文献计量学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．3．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41．3．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．4基于WebofScience的聚乙烯醇降解的文献计量学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．4．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．4．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一71。5基于WebofScience的焦磷酸测序文献计量学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l1．5．1焦磷酸测序简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．5．2数据来源和检索方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l11．5．3数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．5．4结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．6研究内容与技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．6．1研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．6．2研究思路⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14第二章研究材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．1采样过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2预实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．3DNA扩增和焦磷酸测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．182．4数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20第三章含聚乙烯醇纺织废水中微生物群落多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1OTU分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．223．2多样性指数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．1菌群丰度指数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．2菌群多样性指数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．3测序深度指数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．2．4均一性分布曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．3稀释性曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．4OTU分布Venn图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．5群落heatmap图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．5．1细菌群落heatmap图分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．5．2古菌群落heatmap图分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．5．3真核生物群落heatmap图分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．6群落结构组分图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．6．1细菌组分图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32n山东大学硕士学位论文3．6．2古菌组分图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38第四章聚乙烯醇降解菌群分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．1聚乙烯醇降解菌细菌域分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．2聚乙烯醇降解菌古菌域分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45第五章结果与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯475．1结论和工业应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯475．2创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯475．3建议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．49致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55硕士研究生期间撰写论文目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．57n山东大学硕士学位论文CONTENTSABSTRACTinChinese⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I√、J3STRACTinEnglish⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IIChapter1Introduction⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1Researchbackground⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．2Productionandconsumptionofpoly(vinylalcoh01)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．3Bibliometricsanalysisonpoly(vinylalcoh01)basedonWebofScience⋯⋯41．3．1Materialsandmethods⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41．3．2Resultsanddiscussion⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．4Bibliometricsanalysisondegradatonofpoly(vinylalcoh01)basedonWebofScience⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．4．1Materialsandmethods⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．4．2Resultsanddiscussion⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．5BibliometricsanalysisonpyrosequencingbasedonWebofScience⋯⋯⋯111．5．1Briefintroductiontopyrosequencing⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．5．2Materialsandmethods⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．5．3Statisticanalysis⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l1．5．4Resultsanddiscussion⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．6Researchcontentsandtechnicalroute⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．131．6．1Researchcontents⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．141．6．2Technicalroute⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14Chapter2Materialsandmethods⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．1Samplingprocedure⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2Pre．experiment⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．3DNAamplificationandpyrosequencing⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．4Statisticanalysis⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20Chapter3Microbialcommunitystructureanddiversityintextilewastewatercontainingpolyrvinylalcoh01)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1OTUclustering⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．223．2Richnessanddiversityestimators(alpha-diversity)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．1Communityrichnessestimators⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．2．2Communitydiversityestimators⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．3Good’Scoverage⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．4Pareto．Lorenzcurves⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．253．3Rarefactioncurve⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．4Venndiagramof0TUdistribution⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．5Heatmapofmicrobialcommunities⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．5．1Heatmapofbacterialcommunities⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．293．5．2Heatmapofarchaealcommunities⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．5．3Heatmapofeukaryalcommunities⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．303．6Constitutionaldiagramofmicrobialcommunities⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32n山东大学硕士学位论文3．6．1Constitutionaldiagramofbacterialcommunities⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．6．2Constitutionaldiagramofarchaealcommunities⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38Chapter4AnalysisofPVA··degradingmicroorganism⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．434．1AnalysisofPVA．degradingbacteria⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．434．2AnalysisofPVA．degradingarchaea⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．45Chapter5Conclusionsandthefollowingworks⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯475．1conclusionsandindustrialimplication⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一475．2Innovationsofthepaper⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯475．3Theshortageandthefollowingworks⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．47References⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．49Acknowledgements⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55Achievements⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57n山东大学硕士学位论文摘要聚乙烯醇由于具有良好的粘附性、浆膜强韧性、耐磨性等性能而被广泛应用于纺织、造纸等行业。美国信息处理业务公司估计2012年中国生产和消费了超过世界一半的聚乙烯醇，并且预计从2012到2017年中国的需求会以平均每年5．8％的速度增加。1克聚乙烯醇产生0．016克5日生化需氧量(BODs)或1．6克化学需氧量(COD)，较低的BODs／COD比值(0．01)表明聚乙烯醇很难生物降解。好氧环境下聚乙烯醇的降解效率为74．5％～81．3％，厌氧环境下则为17．2％。然而，这些研究大多是基于实验室反应器短期实验获得的数据，长期原位稳定运行的污水处理系统的报道并不多。幸运的是，在一个纺织公司中发现了一个长期稳定运行的具有高效去除聚乙烯醇的污水处理系统。因此对这个系统的研究，尤其是对该系统中微生物群落结构、组成和功能的研究，对于聚乙烯醇降解来说有重要意义。本研究利用454焦磷酸测序分析了隶属同一个公司的原位长期稳定运行的传统好氧纺织废水处理系统(W1)和好氧厌氧处理系统(W2)，前者有较高的聚乙烯醇降解效率，后者降解效率一般。在97％的相似性下，共检测到1678个(W1)和578个(w2)细菌分类操作单元，440个(W1)和434个(W2)个古菌分类操作单元，以及694个(W1)和1000个(w2)个真核生物操作单元。虽然两个样点中细菌和古菌是高度功能组织化的，但是三个不同域的主要微生物依然有很大的不同。在纲水平上，W1qbProteobacteria的几个纲(0【-，p-，6一，7-proteobacteria)分布相对均匀，而W2中的1，．proteobacteria是优势纲(75．65％)。在属水平上，W1中的Methanosaeta是优势的古菌属(70．07％)，并且可能促进聚乙烯醇的生物降解。因此，^r．proteobacteria和MeⅡ1aIlosaeta可能是导致两个系统中聚乙烯醇降解效率不同的关键原核微生物。W1中脱氮细菌Nitrosomonadaceae(AOB)和Ottowia的相对丰都高于W2，而W1中的脱氮古菌MarineI低于，表明两个系统脱氮细菌和古_Group．W2菌可能共同作用脱氮。关键词：焦磷酸测序，聚乙烯醇，生物降解，纺织废水，群落结构nABSTRACT山东大学硕士学位论文Basedonexcellentphysicochemicalproperties，suchasviscosity，filmforming，andadhesivestrength，PVAiswidelyused，especiallyintextileandpapermanufacturing．TheproductionofPVApeakedasthevolumeofsynthetic，water．solublepolymersintheworldin2007．Morethanhalfof2012worldconsumptionwasproducedandconsumedinChina，andthedemandisforecasttogrowatanaverageannualrateof5．8％from2012to2017．Itwasestimatedthat1gofPVAgenerates0．016g5-daybiochemicaloxygendemand(BOD5)or1．6gchemicaloxygendemand(COD)，BODs／COD=0．01，alowratioindicatingthepoordegradabilityofPVA．ThebiodegradationofPVAhasbeenreviewedbyChiellinieta1．，Matsumura，KawaiandHu，andAmannandMinge．Biodegradabilityefficiencyunderaerobicconditionswas74．5％．81．3％orinanaerobicsludgeabove17．2％．However．onelong-termsteadilyrunningtextilewastewatertreatmentsystemwasfound，inwhichPVAexhibitedhi．gh-efficiencybiodegradation．Therefore，itwascriticalandnecessarytoestimatemicrobialcommunitystructure，composition，andfunctionalorganizationofthespecificsystem．Forunderstandingofthemicrobialcommunitystructureandcompositionoftextilewastewatertreatmentsystemsforbiodegradationofpolyvinylalcohol(PVA)，454high-throughputpyrosequencingwasappliedtoanalyzethe16SrRNAgeneofbacteriaandarchaea，and18SrRNAgeneofeucaryainafullscaleconventionaltextilewastewatertreatmentsystem(W1)withhighlyPVA—degradingefficiencyandanotherfullscaleone(W2)affiliatedtothesametextilecompanywithgeneralPVA．degradingefficiencyasacomparison．Intotal，1678(W1)and578(W2)operationaltaxonomicunits(OTUs)wereclusteredrespectivelyforbacterialcommunitiesata3％distance，440(W1)and434(W2)OTUsforarchaealcommunities，and694(W1)and1000(W2)OTUsforeukaryoticcommunities．454-pyrosequencingcouldalsodetecttheminoritybacteriathatwerehardlydetectedbytheconventionalmolecularbiologymethods．Althoughbacterialandarchaealcommunitieswerehighlyfunctionallyorganized佰o>IIn山东大学硕士学位论文80％)，cleardifferencesofthreedomainsbetweenthesampleswererevealedbyrichnessanddiversityindicators．Attheclasslevel，mainsubgroupsofProteobacteria(0【-，p-，6-，y-proteobacteria)weredistributedrelativelyevenlyinW1，while丫-proteobacteriawasthepredominantbacterialclass(75．65％)inW2；atthegenuslevel，Methanosaetawasthedominantarchaealgenus(70．07％)inW1andmayacceleratethedegradationofpolyvinylalcoh01．Thus，y-proteobacteriaandMethanosaetamaybethekeyprokaryoticorganismcontributingtothePVA-degradingefficiencydifferencebetweenthetwosystems．TherelativeabundanceofunculturedNitrosomonadaceae(AOB)andOttowiainW1weremorethanthatinW2，whileMarine_Group_IinW1lessthanW2，revealingdenitrifyingbacteriaanddenitrifyingarchaeaworkedtogethertosupporttheammoniumoxidationinthetwosystems．Keywords：pyrosequencing，polyvinylalcohol，biodegradation，textilewastewater，communitystructureIIIn第一章前言1．1研究课题背景聚乙烯醇(polyvinylalcohol，简称PVA)是一种以(C2H40)n为分子式的水溶性高分子合成聚合物(n表示聚合度)。按聚醇解度分类一般有完全醇解(醇解度98～lOO％)、部分醇解(醇解度87％～-89％)和醇解度78％--种。产品牌号中一般将聚合度的千、百位数字放在前面，醇解度放在后面，例如聚乙烯醇17—99即表示聚合度为1700，醇解度为99％。1799．PVA为完全醇解型，习惯上称为纺织级的聚乙烯醇；1788．PVA为部分醇解型，习惯上称为非纺织级或浆料级的聚乙烯醇。独特的化学结构使得排入到环境中的PVA不易生物降解(Kawai2010)。lgPVA产生0．0169BOD5或者1．69COD(Cheneta1．2013)。BODs／COD=0．01，远小于难生物降解的标准0．25，属于难以生物降解的物质。普通处理含PVA废水的方法是物化和生化联用，但去除率仅为60％～80％，一般很难满足行业废水排放达标标准(钱建栋2009)。虽然PVA本身并不具有生物毒性(朱谱新和姚永毅2005，张波等2011)，但是由于它具有很强的表面活性，容易产生大量的泡沫，使得水体复氧困难，对水生生物有较大危害，也影响水体美观，因此需要对排放的含PVA的污染物进行研究和处理。1977年，沃斯通过比较不同来源的16SrRNA或18SrRNA的序列同源性，发现极端微生物与传统细菌(原核生物)不同，却与真核细胞具有较多的相似性，从而提出在地球上存在第三种生命形式——古菌(Arcnaghacteha)。后来为了突出它和细菌的区别，更名为古菌。1990年，沃斯正式提出了三界分类系统：生物分为真核生物、细菌和古菌(Woeseeta1．1990)，从而使古菌和细菌及真核生物处在了同等分类地位上。因此，对含聚乙烯醇废水的群落研究有必要从这个三个方面开展。然而直到现在，筛选出来的聚乙烯醇降解菌菌株也只覆盖很少的几个科(AmannandMinge2012)，其中大部分是假单胞细菌和鞘氨醇单胞菌(KawaiandHu2009，AmannandMinge2012)，一些则属于真核生物，如青霉菌(Sonakshieta1．2013)币I黑曲霉(Jecueta1．2010，Stoica．Guzuneta1．2010)。古菌被认为是在微生物阶段扮演重要角色(Jarrelleta1．2011)，因此在含聚乙烯醇废水中的古菌及n山东大学硕士学位论文其所扮演的角色也值得重视和研究。根据2014年年初美国商业新闻社(BusinessWire)报道，L纺织公司是中国和世界上最大的染色织物和衬衫生产公司。L公司生产线集棉花种植、纺纱、染色、编织、精加工和衬衫缝纫于一体。年产出色织布1．78亿米，匹染布8千万米，衬衫2千万件。L公司拥有较为完备的纺织废水处理系统，其中第一套为好氧处理系统(W1)，第二套为厌氧好氧(～，O)处理系统(W2)。这两套处理系统都有较长的稳定运行时间。其中第一套处理系统有较高的聚乙烯醇去除率，但一直无法将其经验成功复制到其它处理系统上，包括无法复制到第二套处理系统上。因此，目前研究的主要目标是基于焦磷酸测序表征长期稳定运行的含聚乙烯醇废水处理系统中微生物群落，包括细菌、古菌和真核生物群落。深入揭示含聚乙烯醇废水中微生物种类以及它们之间的相对丰度，并探讨微生物与环境之间的关系，为环境治理和微生物资源利用提供理论依据和实践指导。1．2聚乙烯醇生产消费现状这种独特的结构使它具有优良的性能和在严酷的环境下较长的生命周期fKawai20LO)，广泛用作聚乙烯丁醛(polyvinylbutyral，PVB)树脂生产、粘合剂、织物浆料、造纸浆料和涂层、维尼龙纤维和聚合剂助剂等方面，2009年世界主要地区(贾明芬等2012)矛I2010年中国(崔小明2012)聚乙烯醇消费结构见表l—l。我国聚乙烯醇主要消费领域为纺织浆料和聚合剂助剂。表1．1世界主要地区聚乙烯醇消费结构(百分比)Table1．1PVAconsumptionstructureintheworld’Smajorregionsin2009％n山东大学硕士学位论文2010年世界PVA的生产总量达到158．5万吨，其中中国大陆地区生产总量为78．1万吨，约占世界生产总量的49．27％，其次是日本、美国(崔小明2011)。2012年，中国、日本和美国依然是世界上最大的聚乙烯醇生产者和消费者(IHSBook，2013)。美国和日本较高的聚乙烯醇的生产水平由大宗出口支撑。中国虽然生产并消费了超过一半的世界总量，但聚乙烯醇的生产能力却在进一步加强。在中国，除了作为聚合剂助剂外，聚乙烯醇最大的用处是作为纺织上浆试剂、建筑利用、织物、造纸浆料和涂层。虽然中国在2012年的聚乙烯醇的产量和消费量都占到了全球的份额的一半，但是跟踪长期数据(许献智和魏唯濂2011，崔小明2013)发现，我国在1995年的产量和表观消费量都较低。随着国民经济的快速发展，1995—2012年中国聚乙烯醇数据表明，我国聚乙烯醇产量从1995年到2008年一直持续增长，虽然在2008—2009年有所减少，但从2010年开始产量又在逐步上升(图卜1)。根据美国信息处理业务公司(InformationHandlingServices，IHS)估计，我国年平均需求量将持续增加，预计2012—2017年平均年增长率为5．8％，我国聚乙烯醇的出口量和进口量都一直保持较低量，但从2010后出口量小有增加(IHSBook。2013)。o勺2蓄翟R垂、岩萋专川X墓季≥图1-1我国聚乙烯醇供需平衡情况(1995．2012)Figure1-1Balancebetweensupplyanddemandsituationsofpolyvinylalcoholinchina(1995—2012)n山东大学硕士学位论文113基于WebofScience的聚乙烯醇文献计量学分析文献计量学是借助文献的各种特征的数量采用数学与统计学方法进行分析，以评价和预测科学技术现状与发展趋势的图书情报学分支科学。这一术语最早是1969年由英国人A．普里查德提出的。研究内容包括文献的增长、文献的传播、文献的老化、文献的引用、文献的分布规律等方面。研究成果己作为文献计量指标广泛应用于评价科技生产力、科技期刊质量、人才、研究机构、高等院校的科技产出能力乃至整个国家的科技水平等方面。文献计量学的一个重要理论假设是一般来说科学文献与科学知识具有同步增长趋势并且它们增长规律也具有相似性。科技文献数量和结构的变化以及相互引用的规律可以反映相关科技领域的发展特征。因此，文献计量可以反映和预测某一领域科学技术发展的历史、现状和趋势(黄卓泳等2009)。1．3．1材料与方法1．3．1．1数据来源美国科技信息研究所(ISI)的《科学引文索引》(ScienceCitationIndex，SCI)是目前国际比较公认的一种对自然科学基础研究成果进行评价的相对客观、易定量和便于操作的文献检索工具。被它检索到的论文代表了目前国际的研究水平。因此，本文利用SCI网络数据库WebofScience进行SCI扩展库(SCIE)的检索。检索时间范围为1998年至2013年。1．3．1．2检索策略在WebofScienceⅣcorecollection[v．5．13．1】(Datalastupdated：2014-02-19)的高级检索(AdvancedSearch)模式下，以(TS=(polyvinylalcoholORpoly(vinylalcoh01)))AND(PY=(1998--2013))ANDLANGUAGE：(English)为检索策略，检出13，542篇英文文献。1．3．1．3数据处理利用WebofScience和Sigmaplotl2．5提供的统计功能，以文献计量学的基本定律作为数据分析的基本方法，从文献的发表时间、主题词分类、被引用情况等对检出文献进行统计分析。n山东大学硕士学位论文1．3．2结果与分析(1)研究趋势从图1．2可以看出，从1998年以来论文发表数量几乎逐年增长(按照本节索引标准)，2013年的论文发表数量是1998年的4倍，并呈现明显的二次曲线关系。以论文发表年为自变量，以每年论文发表数量为因变量进行二次曲线拟合(f：y。+a+x+b+x，、2)，拟合曲线见图1．2，拟合参数如表1．2。二次曲线拟合结果具有很强的显著性，R2为0．9956，P值<0．0001。拟合结果表明，在接下来的年份里，关于聚乙烯醇研究的每年论文发表数量将会增加，聚乙烯醇研究在未来几年也将会得到持续的研究。图1-2全球不同年份论文发表数量_(1998．20131Fig．1-2Globalrecordaccountofpoly(vinylalcoh01)basedonbibliometricanalysis(1998—2013)表l-2论文发表年份对每年论文发表数量二次曲线拟合结果(1998．2013)Table1-2Fitresultsofrecordaccountofpoly(vinylalcoh01)peryearbasedonbibliometricanalysis(1998-2013)n(2)研究热点山东大学硕士学位论文从图1—3结果表明，高分子材料、材料科学综合、化学物理和化学综合等是聚乙烯醇研究的主要方向(按照本节索引方法)，有众多的论文发表，是研究的重点和主攻方向。而环境类研究并不在论文记录数排名前一百中，表明聚乙烯醇在环境方向的研究并不是重要方向。离铮：f甏料Po【。YMER瓤；!ENC-E铐辑转錾综会MA陇RIM，SSC．IENCE～¨ⅪI‘IDISCIP[．INARY化学物磁cl豫xIISTRh7p}{ySIC：AI。纯学练会(》f￡M阳、RYMUI；f‘IDISC!PI{NARY亿学王残ENGINEERINGCI：iEMICA!，寝弼物瑗HIYSICSAPPI，[ED缩水褥学菠零NANOSCIENCENANO～1ECttNOLOGY药瑗药劐mtARMACOf。OGY纠[ARMACv凝聚绣履物缓学P}IYSICSCONDENSEDMAT’1。tR耢辩辩学生钧豺g；I-MA—IERIA[一sSGIENCEBIOX．1ATERIA[．S泛录敬／镌图1-3论文记录数排名前十的WebofScience分类(1998-2013)Fig．1-3Top10WebofSciencecategorybasedonbibliometricanalysis(1998-2013)(3)中国聚乙烯醇产量和论文发表趋势分析淫＼豁鹾雹199820002002200420062008201020122014午份图1．4中国聚乙烯醇产量和每年发表论文(1998-2013)二=】点R＼盏亿Fig1-4Productionofpoly(vinylalcoh01)andrecordaccountperyearinchina(1998-2013)6n山东大学硕士学位论文图l。4表明，聚乙烯醇持续增长的大量使用使得对聚乙烯醇的研究逐年增加，虽然2007．2009年聚乙烯醇的产量有所下降，但由于滞后性，在2010-2011年论文的数量才有所减少，并随着聚乙烯醇在2010年产量的增加2011年后年发表的论文数量也在持续的增加。1．4基于WebofScience的聚乙烯醇降解的文献计量学分析1．4．1材料与方法在WebofScienceTMcorecollection[v．5．13．1】(Datalastupdated：2014—02-19)上做高级的文献搜索，以((TS_(degrad木ORbiodegrad*))AND(TS=(polyvinylalcoholORpoly(vinylalcoh01))))ANDLANGUAGE：(English)为检索字段。采用ScienceCitationIndexExpanded(SCI-EXPANDED)～1998．2013进行限制性检索，共检索到英文文献1816篇。先按照WebofScience分类，从前100个分类中选择化工、纺织、环境、微生物方面相关类进行分析，精炼得到文献356篇。再按照WebofScience分类对上述356篇论文进行反向精炼，剔去纯粹医学和应用化学上的分类，精炼得到文献167篇。1．4．2结果与分析对反向精炼后的167篇文献做WebofScience分类分析显示，所有分类都和PVA降解相关。对筛选下来的167篇文献进行阅读，归类整理。筛选出其中报道聚乙烯醇降解菌的文献，并将报道的菌群汇总至表1．3。noo勺磊。苦曩专砖H)∞营勺=o案装。仓^一寸吼乱一．一时苗。母_In山√一n卜仓一．≮苗一uInN；∽一^n卜甙H．一2QocfB磊葛≥一一寸甙⑦一．I时苗时JTl吕11∞葛叫邑(coo心．1对苗吕一涮v一岭o。N．一时苗=∽苗g∞净v一一ooN．I四苗砖参互。卜一一n昏⑦_【．一日苗对案蠹甚墨一∞高≈它卜I”．Io酋时装nn∞奇勺卜In．Io口时装oo一0∞}Bpn矗篮对装。仓^∞蕾它寸矗蓝母装n昏八∞言勺岭8篮时装。甙^摹．【．0装_【．o装n．o装一．o装n．o装．【．0∞QJt5一；oo一潍盘一∞∞Q比勺；一∞勺Q苗>一_o矗∞oJn=；Qo一潍II一∽∞o∽它j一∞勺。葛>口。两∞o．I—；一TlQQ一眦II一∽∞Q比它j一∞它Q甍>口。意∞莹兰；uo一∽IIIsTIo∞∞pH；=joQ叫M岛一力．10葛亭-o>=∞pH—#一声Q它。嗣一叫之∞o∽pn一∞日Q苗>召。对∞oJl暑一tloQ—MII一∽∞Q比勺j一∞勺。苗AI_o四∞言勺寸．Io《日装n△^摹n．o∞o-；=；oQ一∞II一∽-o苗k嗲o=l∞矗≈，们o．】[T5一floo一比口一∞∞Q潍日nl∞口Q苗>召。时时宦Q_譬ooo_^)J山．／L时一．IQ_q四D030h山时薯o_o对Doo_2山．／L时一-o芑时(Ioo=12山时仨o_o时Doo_o-山．／L对口o_Q时(Ioo_o-山∞'【JBI『jo一∞o>％IIo—IIo口；o∞■_【寸《．Q∞∞时IIo—IIo勺；o∞山n．o∞时IIo昌。勺Tlo们山时薯3譬Doo芑-山。／L盘矗_譬ooD_2山Q山∞州急一罩u一们o>∞砖IIo暑。它；o∞山对仨o=lo时DoQ_凸i山．皿时C3q∞DoQ_olJ厶母IJo_u矗ooo_o-阻．百砖一．Io_u对DoQ_o-山盘．133Booo=12d-o霄LIo芑Bqoo_2山砖一-o_o岛0030-阻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所对应的纵坐标值作为解释值(Marzoratieta1．2008)。共25％，50％和80％三个档次，分别代表高均一性，相对前者的低均一性和少量物种占绝对优势的低均一性。这一解释是基于一个微生物群落中物种的分布是和功能性相关的假设，即使在一定受扰动条件下也是如此。图3．1显示，无论是细菌还是古菌，W1和W2的在x轴取值为20％所对应的Y值都达到90％，高于80％。表明在这两个污水处理系统中，在纲水平上，细菌和古菌中存在少量种类的微生物占据绝对优势，即存在功能上的优势菌。3．3稀释性曲线(Rarefactioncurve)稀释性曲线是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。采用对序列过行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建rarefactioncurve，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样品的测序深度情况。利用Mothur软件做rarefaction分析，利用R语言软件制作曲线图。n山东大学硕士学位论文1．O8642O．O24星81．OCumulativeproportionofspecies(OTU)图3．1W1和W2中OTUs的Pareto-Lorenz曲线。Fo是在横轴累积丰度为O．2时对应的纵坐标轴的值。W1．Bac和W2．Bac分别代表细菌中W1和W2中的OTUs，W1-Arc和W2-Arc分别代表古菌中W1和W2中的OTUs。Fig．3-1Pareto-LorenzcurvesderivedfromW1OTUsandW2OTUs．FoisquantifiedasthecumulativeproportionofOTUabundanceswhenthecumulativeproportionofspeciesis0．2．W1一BacandW2一BacrepresentOTUsofbacteria，andW1．ArcandW2．ArcrefertoOTUSofArchaea．26①oc町Dc3D田3卜o-oco一七oQo-IQo>；∞一3E30n山东大学硕士学位论文‘疗3I--oNumberofReadsSampled图3·2Wl和W2细菌(w1．Bac，W2一Bac)、古菌(W1一Arc，W2一Arc)币[1真核生物(Wl—Euk，W2．Euk)焦磷酸测序稀释曲线。OTUs相似水平为97％。Fig．3-2RarefactioncurvesbaseonpyrosequencingofWlandW2bacterialcommunities(Wl—Bac，W2一Bac)，archaealcommunities(Wl—Arc，W2一Arc)，andeukaryoticcommunities(Wl—Euk，W2一Euk)．TheOTUsweredefinedby3％distances．从图3—2中可以看出，使用焦磷酸测序方法在测到24000个序列(reads)的时候依然有新的微生物物种出现。而且，在97％相似水平下，古菌和真核生物测序深度基本饱和，细菌也接近饱和。所以所测得到的数据能够反映样品中微生物的情况。3．4OTU分布Venn图Venn图可用于统计多个样品中所共有和独有的OTU数目，可以比较直观的表现环境样品的OTU数目组成相似性及重叠情况。通常情况下，分析时选用相似水平为97％的OTU样品表。图3—3显示，细菌中有147个OTUs为Wl和W2共用，约占Wl总量的27n山东大学硕士学位论文8．8％，占W2总量的25．4％；古菌中有103个OTUs为W1和W2共用，约占W1总量的23．4％，占W2总量的23．7％；真核生物中有82个OTUs为Wl和W2共用，约占W1总量的11．8％，占W2总量的8．2％。古菌的测序盖度较高(不少于96％)，且文氏图中共有OTUs较多，表明古菌中有较大的共有微生物。细菌古菌真核生物WlW2图3-3微生物文氏图(相似水平97％)Fig．3-3Venndiagramofmicrobialcommunity．TheOTUsweredefinedby3％distances．3．5群落heatmap图Heatmap图可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行物种或样品间丰度相似性聚类，将聚类后数据表示在heatmap图上，可将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样品在各分类水平上群n山东大学硕士学位论文落组成的相似性和差异性。软件及算法：R语言vegan包，其中heatmap作图，vegdist和hclust进行距离计算和聚类分析，距离算法为Bray．Curtis，聚类方法为complete。图中颜色梯度可自定为两种或两种以上颜色渐变色。样品间和物种间聚类树枝可自定是否画出。3．5．1细菌群落heatmap图分析W1W2ProteobactenaChlorobfWCH87-60①CandidatedivisionTM7DictyoglomiNPL—UPA2CandidatedivisionWs3AcidobacteflaVerrucomicrobiaLentisphaeraePlanctomycetesNitrospirae①Candidatedivision¨，S6ArmatimonadetesSpirochaetesCandidatedivision0D1Deinococcus-ThermusCyanobactefla丁』Ⅵ6JL-ETNP—Z39ActinobacteriaBacteroidetesGOUTA4GemmatimonadetesDeferribacteresTenencutesFirmicutesC力Ioroflexf①⑩Candidate_division_BRC1ThermotogaeSynergistetesCandidate—division—OPl7oOlo．18377853Relativeabundanceofcommunity(％)图3—4细菌heatmap图(相似水平97％)Fig．3-4HeatmapofbacterialcommunitiesfromWlandW2．TheOTUsweredefinedby3％distances．29n山东大学硕士学位论文图3—4显示，污水中的细菌共聚成4个大簇，第一簇中Proteobacteria，第二簇中Planctomycetes，第三簇中Bacteroidetes和第四簇中Chloroflexi分别是W1和W2中的优势菌，也是各簇中的优势菌。从进化关系上看，第二簇和第三簇相比其它两簇近，它们表现出来的丰度和结构也相似。从总体上看，W1中四个簇的优势菌的丰度相近，而W2中第一簇的Proteobacteria和第二簇的Planctomycetes尤其是第一簇的Proteobacteria在第一簇中占据绝对优势，并且比W1中第一簇的Proteobacteria的丰度要大。因此，接下来的细菌分析将主要针对这四个簇的优势细菌展开进一步的分析。3．5．2古菌群落heatmap图分析W1W2ThaumarchaeotaEuryarchaeota00．10．97g．5297．82Relativeabundanceofarchaealcommunity(％)图3—5古菌heatmap图(相似水平97％)Fig．3-5HeatmapofarchaealcommunitiesfromW1andW2．TheOTUsweredefinedby3％distances．图3—5显示，只有两个门在这两个废水处理系统中检测到。W1中Euryarchaeota中丰度较大，在W1中占的比例较大。在W2中Thaumarchaeota和Euryarchaeota的丰度相对均衡。因此需要对这两个门做进一步的分析。3．5．3真核生物群落heatmap图分析从图3-6可以看出，W1中Craniata(脊椎动物门)占优势，W2中Opisthokonta(后鞭毛动物)、Intramacronucleata亚门、Craniata(脊椎动物门)和SAR占优势。W1中的真核生物种类和数量高于W2，而能够确定到门但是还没有清晰分类的物种30n山东大学硕士学位论文(NoRank)也比W2中多。W1中有能够指示水质较好的原生动物和后生动物，但量显然较W2中的少。但是聚乙烯醇降解菌中的真核生物的部分在这次实验中并没有检测到。文献调研表明，454高通量测序技术和本研究扩增真核生物DNA时所使用的引物在其它报道多样性的分析中得到成功的应用(e．g．(Ree2010，Liueta1．2012，Lineta1．2013，L沁erllloreandMattes2013))。推测可能是本研究的纺织废水中存在真菌抑制剂，但这个结果需要进一步的研究证明。因此以下对聚乙烯醇降解菌的真核生物部分只做简单的分析。OpisthokontaCraniataAscomycotaBasidiomycotaMucoromycotinaStreptophytaChlorophytaArthropodaAmoebozoaStramenopflesSA尺fntramacronucleataAIveolataHoloz08W1W2o0020375．689179Relativeabundanceofeukaryoticcommunity(％)图3-6真核生物heatmap图(相似水平97％)Fig．3-6HeatmapofeukaryoticcommunitiesfromWIandW2．TheOTUsweredefinedby3％distances．n山东大学硕士学位论文3．6群落结构组分图根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样品在各分类水平上的分类学比对情况。在结果中，包含了两个信息：1)样品中含有何种微生物；2)样品中各微生物的序列数，即此各微生物的相对丰度。因此，可以使用统计学的分析方法，观测样品在不同分类水平上的群落结构。将多个样品的群落结构分析放在一起对比时，还可以观测其变化情况。根据研究对象是单个或多个样品，结果可能会以不同方式展示。通常使用较直观的柱状图或饼图等形式呈现。群落结构的分析可在任一分类水平过行。基于不同分类水平上的数据，利用R语言工具作图或在Sigmaplotl2．5中编辑作图。3．6．1细菌组分图3．6．1．1细菌群落分类复杂性构建种系谱图表征不同操作条件下细菌群落结构和组成的不同。图3．7在门水平上显示了细菌群落丰度。总共有21个确定的门，其中Proteobacteria，Planctomycetes，Bacteroidetes，和Chloroflexi是优势门，这些结果和利用相同方法研究纺织废水处理厂中污泥所得的结果一致(Hueta1．2012，Sanchezeta1．2013，YeandZhan92013)。大约4．6％(W1)和O．6％(W2)的总OTUs即使在门水平上也没有被454焦磷酸测序所确认并分类，表明这些细菌还是未知的。有6个f-i，Cyanobacteria，Deferribacteres，Dictyoglomi，Lentisphaerae，Tenericutes和Thermotogae只在W1中发现，并且总量占到总OTUs的2．8％，不同的操作环境也导致了在优势门上的相对丰度的差异。Planctomycetes(28．52％)，Proteobacteria(25．24％)，Chloroflexi(19．18％)和Bacteroidetes(14．47％)在不同操作环境下高度富集，并且总量占到了W1中的87．41％，而Proteobacteria(84．64％)和Planctomycetes(9．18％)是W2中的最主要的细菌群落(图3—8)。W2的功能组织(functionalorganization，Fo)高于W1，尽管后者也接近90％(图3—7)，表明W2中有更高度特殊的微生物群落结构存在。虽然W2在群落水平上功能更稳定，但W1中相对均一化的分布可能更有利于降解。n1e一11e-21e一31e．41e一51e+O1e．21e．31e41e一5山东大学硕士学位论文02004006008001000120014001600180020002200OTU图3．7W1和W2中细菌群落种系谱图(OTU相似水平97％1Fig．3-7PhylogeneticspectraofbacterialcommunitiesfromW1andW2．TheOTUsweredefinedby3％distances．33ou亡田Dcjo∞o>；町一oY∞ocmDc3Q町o>Il町一or冗一cckc一；-—qo：LL口>∞∞口oloEL∞cJ．∞oln。IJ9c∞F∞o苟lSl6．I∞cx∞∞m苟∞cuoJI△∞BIJal。∞Do∞10．J乱∞∞苟。xEoI。cmId∞eJld∞oJllz∞—哪．J∞∞c△∞；c∞一∞8l∞D∞仁oEll∞EE∞3∞olnu一∈JI：I—Eol60juIa∞丁EJacJ--s30080uf∞Q∞aJ∞l。∞DIJJ＆∞o∞|Jo芑∞Doc∞xoIx∞；o．JoZo五o．Jo王o∞∞苗里oJal3m∞∞m苟刁毋co∈Il∞∈L《∞co_o∞ooc；o《∞cm—Q∞Do口一o《)Ic∞叱oZn山东大学硕士学位论文3．6．1．2不同的环境下细菌的差异构建文氏图来分析和展现两个微生物群落(Wl和W2)物种多样性和丰度的相似性(图3—8)。对于物种多样性，两个群落中总OTUs达到2019个，其中147个OTUs(约占总量的7．O％)为两个群落共有(图3-8A)。共有OTUs中优势物种(76．9％)为Proteobacteria(42．2％)，Planctomycetes(21．2％)和Chloroflexi(13．6％)。根据聚类得到的OTUs，W1．U(W1独有OTUs)，W1．W2(W1和W2共有OTUs)和W2．U(W2独有OYUs)的细菌群落结构存在显著的差异。然而，在某种程度上讲，W1和W2的物种多样性存在相似性，因为它们都是含有PVA的纺织废水。对于每个个体群落独有的OTUs的数量分别为1531(W1．U)和43l(W2一U)，占总OTUs的93．0％，并且它们分别各自贡献群落基因信息的78．7％和16．3％。这表明共有OTUs占W1中reads的少数，而占W2中reads的多数。值得一提的是，共有OTUs中优势f-jProteobacteria，Planctomycetes和Chloroflexi占W1的相对丰度为28．O％，42．0％和13．8％，而占W2中相对丰度为85．9％，10．6％和1．2％。从这些结果可以推断出Proteobacteria在纺织废水的处理中扮演重要的角色。为了获得更多的微生物群落结构的信息，对这两个系统中的优势门Planctomycetes，Proteobacteria，Chloroflexi和Bacteroidetes分别从纲和属的水平上做进一步深入的研究(图3．9)。在纲水平上，上述的四个门在W1和W2的群落结构上都表现出显著的不同。Proteobacteria门中主要的亚群按照丰度的多少依次是y-Proteobacteria，a—Proteobacteria，13-Proteobacteria和&Proteobacteria．然而，1，．Proteobaeteria在W2群落中的丰度显著高于(大约15．2倍)在W1群落中的丰度，并且它也是W2中在纲水平上的优势微生物，大约占W2中丰度的75．65％，这个比例和W1中所有纲水平上的Proteobacteria的数值相当。其余三个门Planctomycetes，Bacteroidetes和Chloroflexi中主要的亚群分别占W1和W2中总reads的27．92％和9．07％fPhycisphaerae)，12．86％和1．49％(Sphingobacteria)，15．88％和O．73％(Anaerolineae)。n山东大学硕士学位论文ACommunitystructure(OTUsinphyla)[BPoputationcomposition(OTUabundanceinphyla)图3．8W1和W2细菌群落文氏图A)基于97％相似水平的OTUs；B)基于454焦磷酸测序读长。分类限定在门水平上。W1一U和W2一U分别代表W1和W2中独特群落，W1一W2则代表共有群落。(OTU相似水平97％)Fig．3-8VennofthebacterialcommunitiesofW1andW2basedonA1OTUsat3％distanceandB)readsby454pyrosequencing．Thetaxonomicidentitiesareatphylumlevel．W1-UandW2-UrepresenttheuniquecommunitiesofW1andW2，andW1一W2referstothesharedcommunity．TheOTUsweredefinedby3％distances．35兰}兰三兰三兰善一～一～一～一■一一n山东大学硕士学位论文基于属水平上的分析可以更深入确定群落的功能(图．3-9B)。虽然大多数可培养的氨氧化细菌(ammonia．oxidizingbacteria，AOB)属于13．Proteobacteria纲Nitrosomonadaceae科(Arpeta1．2007)，本研究发现的不可培养的Nitrosomonadaceae在属水平是很丰富的。Ottowia与Nitrosomonadaceae(UC)在W1和W2上具有相同的丰度，是一种兼性厌氧产N20菌，属于能够产生菌胶团的(Pearsoneta1．2004)。上述两种脱氮微生物和Thaumarchaeota(图3．12)一起成功脱去了纺织废水中的氨(表2—1)。其它主要的属包括很多嗜热菌(Thermophiles)，如Caldilinea(W1中1．23％，W2中0．15％)，Caldilineaceae(UC)(Wl中1．54％，W2中0．17％)，Haliangium(Wl中1．43％，W2中0)，Sinobacteraceae(uc)(Wl中0．56％，W2中0)，Anaerolineaceae(UC)(W1中14．67％，W2中0．7％)，和Kosmotoga(W1中1．8％，W2中0)(Fig．3-9B)。从生态的角度来看，这些嗜热菌和Methanonmicrobia(图3．12B)一起都是嗜热微生物，能够耐受高温而且需要提高温度来生长和存活(ItohandIin02013)。从这两个反应器中获得的微生物的丰度不同，这和之前的研究相似(Schonbergereta1．1997)。即在某种程度上微生物降解依赖温度。n山东大学硕士学位论文ABaeleriaIclasses／“日b●口№f_p口口k嘶虻锄哺6≯q“女^舸_￥90*oh‘瀚¨P圮Ieobacle怕j：，蛰∥，’=，门；lI。-”i|，“?』j、多。二三：篡二：J釜赢≥膏再∥馐。lIm图3-9在纲水--TZ(A)和属水平上(B)W1和W2中细菌优势种系群落相对丰度和基于相似水平97％及纲水平454焦磷酸读长的W1和W2细菌群落文氏图。相对丰度是指隶属该分类的序列数占每个样品序列总数的百分比(％)。相对丰度低于0．5％的被归并到others中。UC表示不可培养微生物。OTUs相似水平97％。Fig．3-9TherelativeabundancesofthepredominantphylogeneticgroupsofW1andW2atthe(A)classleveland(B)genuslevel，andVennofthebacterialcommunitiesofWlandW2basedonOTUsat3％distanceandreadsby454pyrosequencingatclasslevel．Relativeabundanceisdefinedasthenumberofsequencesaffiliatedwiththattaxondividedbythetotalnumberofsequencespersample(％)．Generamakinguplessthan0．5％ofthetotalcompositioninbothlibrariesaredefinedasothers．UCstandsforuncultrued．TheOTUsweredefinedby3％distances．37||j。j||?||I—■||||j||一，。|0。。+J影／j。●皇==。。—L||||j?—厂||||?||j多I|||||『√i；|『?。0j一。。0I．{。～詈∥一卜黧～一题～n山东大学硕士学位论文3．6．2古菌组分图3．6．2．1古菌群落分类复杂性构建不同环境下种系谱图表征古菌的群落结构和组成。图3．10显示门水平上古菌的相对丰度。总共有两个确定的门，其中Euryarchaeota(97．77％)是Wl中的优势f-j，Thaumarchaeota(61．32％)和Euryarchaeota(37．99％)是W2中的优势门．大约有0．05％(W1)和0．69％(w2)的总OTUs不能被454焦磷酸测序在门水平上确认，表明这些古菌目前未知。W2的Fo大于WI的值，并且W1的Fo值接近90％(图3．2)，但是它们很近，表明这两个微生物群落都有高度特殊的古菌微生物群落。3．6．2．2不同环境下古菌的差异构建文氏图来评估和可视化展示W1和W2中古菌物种(图3．11)多样性和丰度的相似性。对于物种的多样性，在两个群落中共有769OTUs，其中103个OTUs(约占总量的13．4％)为两个微生物群落共有(图3．11A)。共有OTUs中的多数(99．1％)是Euryarchaeota(70．O％)和Thaumarchaeota(29．1％)。基于OTUs，W1-U(wl独有OTUs)，W1．W2(wl和W2共有OTUs)和W2．U(w2独有OTUs)三者的古菌群落结构显著不同。W1独有OTUs(W1．U)和W2独有OTUs(W2一U)分别为337和329，一共占总OTUs的86．6％，并且分别为W1和W2贡献了29．1％和71．2％群落基因信息。n山东大学硕士学位论文1e+O1e一11e．21e．31e-41e．51e+O1e-11e．21争31e-40100200300400500600700800OTU■№一咖x■卧阿cnaeotaThaumarchaeota图3一lOW1和W2中古菌群落种系谱图(相似水平97％)Fig．3-10PhylogeneticspectraofarchaealcommunitiesfromW1andW2．TheOTUsweredefinedby3％distances．39∞oc∞Dc丁。叮o>；叮一①Z①oc∞口c30叮①>Il∞一①rn山东大学硕士学位论文ACommunitystructure(OTUsinphyla)W1一W21030TUsRankBPoputationcomposition(oTUabundanceinphyla)图3—11W1和W2古菌群落文氏图A)基于97％相似水平的OTUs；B)基于454焦磷酸测序读长。分类限定在门水平上。W1一U和W2．U分别代表W1和W2中独特群落，W1．W2则代表共有群落。(OTU相似水平97％)Fig．3—11VennofthearchaealcommunitiesofW1andW2basedonA、OTUsat3％distanceandB)readsby454pyrosequencing．Thetaxonomicidentitiesareatphylumlevel．W1一UandW2一UrepresenttheuniquecommunitiesofWlandW2，andW1-W2referstothesharedcommunity．TheOTUsweredefinedby3％distances．n山东大学硕士学位论文对主要的f-jEuryarchaeota和Thaumarchaeota在纲和属水平上进行比较，揭示更多的微生物群落的信息。在纲水平上，W1和W2的群落结构Euryarchaeota和Thaumarchaeota存在显著的不同。Euryarchaeota门中的主要亚群是Methanomicrobia，接下来是Halobacteria，Thermoplasmata和Methanobacteria(图3．12A)。这一发现和此前对污水处理厂(Gomez．Alvarezeta1．2012)，低地泉水(Vasileiadiseta1．2013)和红杉沉积物(Pireseta1．2012)qb群落结构调查的结果相似。然而W1群落中Methanomicrobia和Halobacteria的相对丰度较W2中的大，前者分别是后者的2．65倍和2．97倍，并且也是W1中的优势纲，比例分别为82．01％和12．16％。Thaumarchaeotaf-1中的主要的亚群为MarineI(也就是后来的．GroupThaumarchaeota)(Brochier—Armaneteta1．2008，Schubotzeta1．2009)，分别占W1和W2群落中reads的1．75％和56．18％。基于属水平上的数据分析显示，所有相对丰度大于O．5％的属都属于Methanomicrobia，其中优势属Methanosaeta分别占总W1和W2中总reads的70．07％和O．59％(图3-12B)。MarineI是重要碳氮循环微生物，并在地球．Group碳氮循环中扮演重要角色(e．g．(Lelieveldeta1．1998，Simankovaeta1．2003))。4ln山东大学硕士学位论文AArchaeaIclassesF飞。yz；獬l』、㈣㈣啜／_圉点5．一“。搦缓HalobacteriaThermop{asmata№manobac耋er啦M柏anOmIa嘣aEuryarchaeota8ArchaealgeneraSoil—C憎na瞄1a∞tic-鼻∞up偈cG)ManneGroup～Thaumarchaeota—_W'E盈W2图3．12在纲水平(A)和属水平上(B)W1和W2中古菌优势种系群落相对丰度和基于相似水平97％及纲水平454焦磷酸读长的W1和W2古菌群落文氏图。相对丰度是指隶属该分类的序列数占每个样品序列总数的百分比(％)。相对丰度低于0．5％的被归并到其它中。UC表示不可培养微生物。OTUs相似水平97％。Fig．3—12TherelativeabundancesofthepredominantphylogeneticgroupsofW1andW2atthe(A)classleveland(B)genuslevel，andVennofthebacterialcommunitiesofWlandW2basedonOTUsat3％distanceandreadsby454pyrosequencingatclasslevel．．Relativeabundanceisdefinedasthenumberofsequencesaffiliatedwiththattaxondividedbythetotalnumberofsequencespersample(％)．GeneramakinguplessthanO．5％ofthetotalcompositioninbothlibrariesaredefinedasothers．UCstandsforuncultrued．TheOTUsweredefinedby3％distances．42∞始∞642o一掌一8c∞口c34日o^!苗|9叱∞∞∞∞∞柏∞"位∞06420一摹一8cm口c，盎再霉磊19《一辞一8cm∞coD日耋_盥∞《n山东大学硕士学位论文第四章聚乙烯醇降解菌群分析4．1聚乙烯醇降解菌细菌域分析虽然基于WebofScience的文献计量学分析表明具有降解聚乙烯醇能力的微生物不止两种(表1．3)，但本研究采用454焦磷酸测序所获得的22个门的结果(图3-4)显示只有两个细菌门涉及到PVA降解：Proteobacteria门和Bacteroidetesf-j(图4．1)。Proteobacteriaf-j中的许多微生物(包括Pseudomonas)构成了PVA降解菌(KawaiandHu2009，AmannandMinge2012)。细菌的降解效率在40％-50％，主要归功于y．Proteobacteria或Q．Proteobacteria(KawaiandHu2009，KimandYoon2010)，更高的PVA降解(超过80％)主要源自这两类微生物的混合培养(KimandYoon2010)。因此，Proteobacteria的不同亚群可能显著影响PVA的降解效率，这一点大约可以通过表2看出。Bacteroidetes门中的亚群Sphingomonas被认为是降解外源聚合物(如PVA)中扮演重要角色(Kawai1999，KawaiandHu2009，AmannandMinge2012)。由于一些Pseudomonads被重新划分为Sphingomonads(Yabuuchieta1．1990)，一些过去是Pseudomonads的微生物可能现在分类为Sphingomonads。PVA降解菌Pseudomonassp．113P3便是一个很好的例子，它最先被重新划分为Sphingomonassp．(Klomklangeta1．2005)，接着被划分为Sphingopyxissp．(Hueta1．2008)。因此，之前被划分为Sphingomonads的微生物现在可能并不准确，而Sphingobacteriia的相对丰度应该更小一些。43nn山东大学硕士学位论文4．2聚乙烯醇降解菌古菌域分析剁呷删∞惫jrOHOIIld。．西n《H2≮≮H2≮≮H3_7一●¨●¨J，-CH2--≮,一CH3+CH3COOH图4-2聚乙烯醇降解产乙酸途径。SAO，二级醇氧化酶；BDH，伊二酮水解酶。45n山东大学硕士学位论文AArchaeaIclasses／磷二二麟／露j《，S6MHalobacteriaTherrnoplasmalaMethanob8ctenaM酬M∞m}cr0轴aEuryarcttaeotaBArchaealgenem——IW’囫W2图4．3在纲水平(A)和属水平上(B)W1和W2中古菌优势种系群落相对丰度和基于相似水平97％及纲水平454焦磷酸读长的W1和W2古菌群落文氏图。相对丰度是指隶属该分类的序列数占每个样品序列总数的百分比(％)。相对丰度低于O．5％的被归并到others中。UC表示不可培养微生物。OTUs相似水平97％。Fig．4．2TherelativeabundancesofthepredominantphylogeneticgroupsofW1andW2atthe(A)classleveland(B)genuslevel，andVennofthebacterialcommunitiesofWlandW2basedonOTUsat3％distanceandreadsby454pyrosequencingatclasslevel．．Relativeabundanceisdefinedasthenumberofsequencesaffiliatedwiththattaxondividedbythetotalnumberofsequencespersample(％)．GeneramakinguplessthanO．5％ofthetotalcompositioninbothlibrariesaredefinedasothers．UCstandsforuncultrued．TheOTUsweredefinedby3％distances．瓣∞豫犯瓣诒∞¨镗婚8842o一零～。。u博可c：丑懵母^I|j耍母世一嚣一母蚰c辱可c，囊带∞三俘一篷n山东大学硕士学位论文第五章结果与展望S．1结论和工业应用本研究利用454焦磷酸高通量测序来表征聚乙烯醇高效降解纺织废水处理系统中微生物的群落结构和组成。结果表明，处理系统中，细菌和古菌都是高度功能组织化的，有核心功能菌群存在。种群中不仅包括普遍报道存在于废水中的门(女l：IProteobacteria和Euryarchaeota)，也存在不易被传统分子生态手段检测到的低丰度种群。纲和属水平上的进一步分析表明，y-Proteobacteria是W2细菌中的优势纲(75．65％)，而Proteobacteria的各亚群在W1中分布较均匀；Methanosaeta是W1古菌中的优势属(70．07％)，并且推测可能促进聚乙烯醇的生物降解。细菌和古菌群落结构的不同可能是导致两个处理系统中聚乙烯醇降解效率不同的重要原因。嗜热微生物在W1中的丰度均超过在W2中的丰度，推测温度是影响聚乙烯醇降解效率的一个重要因子。本研究揭示了长期稳定运行下对聚乙烯醇有高效降解效率的纺织废水处理系统中微生物的群落结构和功能多样性，为今后聚乙烯醇降解提供有益的参考和指导。5．2创新点本研究采用长期稳定运行下对聚乙烯醇有高效降解效率的纺织废水处理系统中微生物做群落结构和功能多样性分析。在聚乙烯醇功能基因研究尚不成熟的情况下，引入文献计量学，使之与高通量测序后的生物信息学分析相结合，寻找聚乙烯醇降解的功能菌群。5．3建议PVA由于具有优异的性能而得到广泛应用，产量和消耗量预计将在一段时间内继续增加，它所带来的环境负效应和相应的对策也将得到持续的关注。从污染治理的角度来看，纯培养和分子生态学手段相结合筛选PVA高效降47n山东大学硕士学位论文解菌和相应降解基因，研制适合工业用的酶制剂，调控PVA降解基因表达，研究合适的降解工艺，依然是今后工作的重点。从循环经济的角度来看，回收退浆后PVA实现资源再利用是今后研究的一个方向。从清洁生产的角度来看，开发既能与其性能媲美甚至超越PVA相关性能又能实现生物降解的新资源将是今后应用的一个趋势。从微观角度讲，以下四个方面是今后研究需要重视的几个点之一：1生物学重复和阴性对照在获取到前期实验数据的基础上，高通量测序成本的下降客观上有利于做生物学重复和阴性对照，更科学的检测微生物群落和功能微生物的多样性。生物信息学分析和工程上的工艺参数相结合，有助于分析影响聚乙烯醇降解的工艺参数，为降解效果的移植提供现实的操作性。2分环节检测系统中降解菌群污水处理系统中不同环节的聚乙烯醇都有不同程度降解，分环节测定降解效率有助于对纺织废水处理系统中聚乙烯醇降解菌的降解及其菌群结构进行重点研究。3测序重点在细菌无论是PL图，种系谱图还是文氏图，细菌这一个域的展现出来的结果最好。与废水中古菌和真核生物相比，细菌前期研究的成果较多和测序分析手段也更成熟。4筛菌的重点在退浆目前，筛菌是从富集聚乙烯醇的环境中筛选出聚乙烯醇降解菌。但是，这些菌是常温下的降解菌，大多只能用于末端治理。退浆过程中会有聚乙烯醇的降解，并且退浆过程本身是在高温(对微生物而言)的情况下进行的。筛选这一阶段的降解菌有助于在退浆阶段实现聚乙烯醇降解，也有助于实现纺织过程中的清洁生产。n山东大学硕士学位论文参考文献mlilann，M．andMinge，0．(2012)．Biodegradabilityofpoly(vinylacetate)andrelatedpolymers．AdvPolymSci(245)：137-172．Arp，D．J．，eta1．(2007)．Theimpactofgenomeanalysesonourunderstandingofammonia-oxidizingbacteria．AnnuRevMicrobiol61：503—528．Brate，J．，eta1．(2010)．Freshwaterperkinseaandmarine-freshwatercolonizationsrevealedbypyrosequencingandphylogenyofenvironmentalrDNA．ISMEJ4(9)：1144．1153．Brochier-Armanet，C．，eta1．(2008)．Mesophiliccrenarchaeota：proposalforathirdarchaealphylum，theThaumarchaeota．NatRevMicrobiol6(3)：245·252．Calder6n，K．，eta1．(2012)．Bacterialcommunitystructureandenzymeactivitiesinamembranebioreactor(MBR)usingpureoxygenasanaerationsource．BioresourTechnol103(1)：87-94．Chen，L．，eta1．(2013)．Soyproteinsasenvironmentallyfriendlysizingagentstoreplacepoly(vinylalcoh01)．EnvironSciPollutR20(9)：6085-6095．Cho，B．C．andC．Y．Hwang(2011)．Prokaryoticabundanceand16SrRNAgenesequencesdetectedinmarineaerosolsontheEastSea(Korea)．FEMSMicrobiolEcol76(2)：327—341．Choi，K．，etaL(2004)．PolyvinylalcoholdegradationbymicrobacteriumbarkeriKCCM10507andpaenibacillusamylolyticusKCCM10508indyeingwastewater．JMicrobiolBiotechnol14(5)：1009—1013．Cole，J．R．，eta1．(2009)．Theribosomaldatabaseproject：improvedalignmentsandnewtoolsforrRNAanalysis．NucleicAcidsRes37(Databaseissue)：D141-145．Fukae，R．，eta1．(1994)．Biodegradationofpoly(vinylalcoh01)诵mhighisotacticity．PJ26(12)：1381-1386．Gomez—Alvarez，V．，etaL(2012)．Metagenomeanalysesofcorrodedconcretewastewaterpipebiofilmsrevealacomplexmicrobialsystem．BMCMicrobiol12(1)：122．Hashimoto，S．andFujita，M．(1985)．Isolationofabacteriumrequiringthreeaminoacidsforpolyvinylalcoholdegradation．JFermentTechnol63(5)：471—474．49n山东大学硕士学位论文Hatanaka，T．，eta1．(1995)．Effectsofthestructureofpoly(vinylalcoh01)onthedehydrogenationreactionbypoly(vinylalcoh01)dehydrogenasefromPseudomonassp．13P3．BiosciBiotechnolBiochem59(7)：1229—1231．Hu，M．，eta1．(2012)．Microbialcommunitystructuresindifferentwastewatertreatmentplantsasrevealedby454-pyrosequencinganalysis．BioresourTechnol117：72．79．Hu，M．，eta1．(2012)．Microbialcommunitystructuresindifferentwastewatertreatmentplantsasrevealedby454-pyrosequencinganalysis．BioresourTechnol17：72-79．Hu，X．，eta1．(2008)．ThepvaoperonislocatedonthemegaplasmidofSphingopyxissp．strain13P3andisconstitutivelyexpressed，althoughexpressionisenhancedbyPVA．ApplMicrobiolBiotechnol78(4)：685—693．IHS，2013IHSChemicalEconomicsHandbook(2013)(PolyvinylAlcoh01)．IHS，Englewood，USAItoh，T．andT．Iino(2013)．Phylogenyandbiologicalfeaturesofthermophiles．Thermophilicmicrobesinenvironmentalandindustrialbiotechnology，Springer：249-270．Jarrell，K．F．，eta1．(2011)．Majorplayersonthemicrobialstage：whyarchaeaareimportant．Microbiology157(4)：919-936．Jecu，L．，eta1．(2010)．AbilityoffungalstrainstodegradePVAbasedmaterials．JPolymEnviron18(3)：284-290．Kawai，F．(1999)．Sphingomonadsinvolvedinthebiodegradationofxenobioticpolymers．JIndMicrobiolBiotechnol23(4-51：400-407．Kawai，F．(2010)．Thebiochemistryandmolecularbiologyofxenobioticpolymerdegradationbymicroorganisms．BiosciBiotechnolBiochem74(9)：1743—1759．Kawai，F．andX．Hu(2009)．Biochemistryofmicrobialpolyvinylalcoholdegradation．ApplMicrobiolBiotechnol84(2)：227-237．Khanh，D．，eta1．(2011)．Effectoftemperatureonlow—strengthwastewatertreatmentbyUASBreactorusingpoly(vinylalcoh01)-gelcarder．BioresourTechnol102(24)：11147．11154．Kim，B．C．，eta1．(2003)．DegradationofpolyvinylalcoholbySphingomonassp．SA3anditssymbiote．JIndMicrobiolBiotechnol30(1)：70·74．Kim，M．N．andM．G．Yoon(2010)．Isolationofstrainsdegradingpoly(vinylalcoh01)athilghtemperaturesandtheirbiodegradationability．PolymDegradStabil95(1)：89。93．Klomklang，W．，eta1．(2005)．Biochemicalandmolecularcharacterizationofan山东大学硕士学位论文periplasmichydrolaseforoxidizedpolyvinylalcoholfromSphingomonassp．strain113P3．Microbiology151(4)：1255-1262．Kongjan，P．(2011)．Performanceandmicrobialcommunityanalysisoftwo‘stageprocesswithextremethermophilichydrogenandthermophilicmethaneproductionfromhydrolysateinUASBreactors．BioresourTechnol102(5)：4028—4035．Lelieveld，J．O．S．，etaL(1998)．Changingconcentration，lifetimeandclimateforcingofatmosphericmethane．TellusB50(2)：128-150．Lin，W．F．，eta1．(2013)．Diversityanddynamicsofmicrobialcommunitiesateachstepoftreatmentplantforpotablewatergeneration．Waterresearch．52：218-230．Liu，R．，eta1．(2012)．Pyrosequencinganalysisofeukaryoticandbacterialcommunitiesinfaucetbiofilms．SciTotalEnviron435：124．131．Livermore，J．A．andT．E．Mattes(2013)．PhylogeneticdetectionofnovelcryptomycotainanIowa(UnitedStates)aquiferandfrompreviouslycollectedmarineandfreshwatertargetedhigh。throughputsequencingsets．EnvironMicrobiol15(8)：2333-2341．Ma，B．C．，eta1．(2006)．Correlationbetweendissolvedoxygenconcentration，microbialcommunityandmembranepermeabilityinamembranebioreactor．ProcessBiochem4l(5)：1165-1172．Marzorati，M．，eta1．(2008)．HowtogetmoreOTUofmolecularfingerprints：practicaltoolsformicrobialecology．EnvironMicrobiol10(6)：1571-1581．Matsumura，S．，eta1．(1994)．Effectsofmolecularweightandstereoregularityonbiodegradationofpoly(vinylalcoh01)byAlcaligenesfaecalis．BiotechnolLett16(11、：1205．1210．Mori，K．，eta1．(2012)．AceticlasticandNaCl一requiringmethanogenMethanosaetapelagicasp．nov．，isolatedfrommarinetidalflatsediment．ApplEnvironMicrobiol78(9)：3416—3423．Mori，T．，eta1．(1996)．DegradationofvinylalcohololigomersbyGeotrichumsp．WF9101．BiosciBiotechnolBiochem60(7)：1188-l190．Mori，T．，eta1．(1996)．IsolationandcharacterizationofastrainofBacillusmegateriumthatdegradespoly(vinylalcoh01)．BiosciBiotechnolBiochem60(2)：330-332．Pearson，A．，eta1．(2004)．NonmarinecrenarchaeolinNevadahotsprings．ApplEnvironMicrobiol70(9)：5229-5237．Pires，A．C．，eta1．(2012)．Denaturinggradientgelelectrophoresisandbarcodedpyrosequencingrevealunprecedentedarchaealdiversityinmangrovesedimentand5ln山东大学硕士学位论文rhizospheresamples．ApplEnvironMicrobiol78(16)：5520—5528．Ree，D．K．(2010)．DevelopmentofaprotocolforenvironmentalPCRof18SrDNAV4regionanddiversitysurveyoffreshwaterprotistsusing454titaniumpyrosequencing．UniversityOfOslo．Oslo，Norway．Ronaghi，M．，eta1．(1998)．Asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate．Science281(5375)：363-365．Sakai，K．，eta1．(1986)．Degradationmechanismofpoly(vinylalcoh01)bysuccessivereactionsofsecondaryalcoholoxidaseand13-diketonehydrolasefromPseudomonassp．AgricBiolChem50(4)：989—996．Sakazawa，C．，eta1．(1981)．Symbioticutilizationofpolyvinylalcoholbymixedcultures．ApplEnvironMicrobiol41(1)：261-267．Sanchez，O．，eta1．(2013)．Assessingbacterialdiversityinaseawater-processingwastewatertreatmentplantby454-pyrosequencingofthe16SrRNAandamoAgenes．MicrobBiotechnol6(4)：435-442．Schonberger，H．，eta1．(1997)．Studyofmicrobialdegradationofpolyvinylalcohol(PVA)inwastewatertreatmentplants．AmDyestuffRep，86(8)，9—18．Schubotz，F．，eta1．(2009)．DetectionofmicrobialbiomassbyintactpolarmembranelipidanalysisinthewatercolumnandsurfacesedimentsoftheBlackSea．EnvironMicrobiol11(1O)：2720-2734．Shendure，J．andH．Ji(2008)．Next—generationDNAsequencing．NatBiotechnol26(10)：1135-1145．Simankova，M．V．，eta1．(2003)．Isolationandcharacterizationofnewstrainsofmethanogensfromcoldterrestrialhabitats．SystApplMicrobiol26(2)：312—318．Simpson，E．H．(1949)．Measurementofdiversity．Nature．Sonakshi，M．，eta1．(2013)．Isolationandcharacterisationofstarch／polyvinylalcoholdegradingfungifromaerobiccompostenvironment．IntBiodeterBiodegr，82，9—12．Stackebrandt，E．andB．M．Goebel(1994)．Taxonomicnote：AplaceforDNA-DNAreassociationand16SrRNAsequenceanalysisinthepresentspeciesdefinitioninbacteriology．IntJSystBacteriol44(4)：846-849．Stoica-Guzun，A．，eta1．(2010)．Biodegradationofpoly(vinylalcoh01)andbacterialcellulosecompositesbyAspergillusniger．JPolymEnviron19(1)：69-79．Su，Y．，甜a1．(2013)．FecalmicrobiotaofpigletspreferutilizingDL-lactatemixtureascomparedtoD—lactateandL-lactateinvitro．Anaerobe19：27-33．Suzuki，T．，eta1．(1973)．SomecharacteristiesofPseudomonasO．3whichutilizes气’n山东大学硕士学位论文polyvinylalcoh01．AgricBiolChem37(4)：747-756．Tokiwa，Y．，eta1．(2001)．Amodifiedmethodforisolatingpoly(vinylalcoh01)-degradingbacteriaandstudyoftheirdegradationpatterns．BiotechnolLett23(23)：1937．1941．Vasileiadis，S．，eta1．(2013)．Soilmicrobialdiversitypatternsofalowlandspringenvironment．FEMSMicrobiolEcol86(2)：172—184．Watanabe，Y．，eta1．(1975)．Formationofhydrogenperoxidebyapolyvinylalcoholdegradingenzyme．AgricBiolChem39：2447·2448．Wittebolle，L．，eta1．(2008)．Quantifyingcommunitydynamicsofnitrifiersinfunctionallystablereactors．ApplEnvironMicrobiol74(1)：286-293．Woese，C．R．，eta1．(1990)．Towardsanaturalsystemoforganisms：proposalforthedomainsArchaea，Bacteria，andEucarya．ProcNatlAcadSciUSA87(12)：4576-4579．Yabuuchi，E．，eta1．(1990)．ProposalsofSphingomonaspaucimobilisgen．nov．andcomb．nov．，Sphingomonasparapaucimobilissp．nov．，Sphingomonasyanoikuyaesp．nov．，Sphingomonasadhaesivasp．nov．，Sphingomonascapsulatacomb．nov．，andtwogenospeciesofthegenusSphingomonas．MicrobiolImmunol34(2)：99-119．Yamatsu,A．，eta1．(2006)．Isolationandcharacterizationofanovelpoly(vinylalcoh01)·degradingbacterium，Sphingopyxissp．PVA3．ApplMicrobiolBiotechnol72(4)：804-811．Ye，L．，eta1．(2011)．Analysisofthebacterialcommunityinalaboratory-scalenitrificationreactorandawastewatertreatmentplantby454一pyrosequencing．WaterRes45(15)：4390-4398．Ye，L．andT．Zhang(2013)．Bacterialcommunitiesindifferentsectionsofamunicipalwastewatertreatmentplantrevealedby16SrDNA454pyrosequencing．ApplMicrobiolBiotechnol97(6)：2681—2690．Zhang，T．，eta1．(2012)．454pyrosequencingrevealsbacterialdiversityofactivatedsludgefrom14sewagetreatmentplants．ISMEJ6(6)：1137-1147．Zhang，Y．，eta1．(2006)．Anewstrain，StreptomycesvenezuelaeGYl，producingapoly(vinylalcoh01)-degradingenzyme．WorldJMicrobiolBiotechnol22(6)：625·628．崔小明(2011)．聚乙烯醇生产技术进展及国内外市场分析．精细与专用化学品19(9)：l-8．崔小明(2012)．国内外聚乙烯醇的供需现状及发展前景．精细化工原料及中间体(4)：11．17．53n山东大学硕士学位论文崔小明(2013)．我国聚乙烯醇的市场分析预测．化学工业31(10)：34．39．黄卓泳，等．(2009)．SCI收录我国食品科技类文献的文献计量学分析．食品科学30(11、：280-283．贾明芬，等．(2012)．聚乙烯醇的生产现状及市场前景分析．云南化工39(5)：36．40．李朝，等．(2004)．红球菌J一5菌株降解聚乙烯醇的研究．中国环境科学24(2)：170．174．钱鼎，等．(2004)．由一株青霉菌产生的聚乙烯醇降解酶冰．应用与环境生物学报1O(2)：226—230．钱建栋(2009)．含聚乙烯醇浆料印染废水的处理方法．江苏丝绸38(006)：1．3．许献智和魏唯濂(2011)．聚乙烯醇的生产现状与市场前景．安徽化工37(5)：14．15．张波，等．(2011)．聚乙烯醇颗粒的急性毒性实验．化学研究与应用23(8)：1117．1120．张兴，等．(2006)．一株聚乙烯醇降解菌的降解特性．化工学报57(7)：1649．1654．朱谱新和姚永毅(2005)．PVA浆料的生物降解性及应用前景．棉纺织技术33(2)：62．64n山东大学硕士学位论文致谢论文由山东省自然科学基金(No．ZR2013CM042)和山东省科技计划项目fNo．2012G0021706)资助完成。三年前，由异乡来到山东，走进正在筹备110周年校庆的山东大学，开始研究生阶段的学习和生活。三年确实太长，寻求隐藏在表象后面的真相的时候总是嫌弃时间太慢；三年确实太短，解决暴露在眼前的难题的时候总是催促时间更快。岁月荏苒，毕业论文业已草成；白云苍狗，最后答卷即将付梓。回首三年，或欢乐与心酸，或喜悦与泪水，都成为日记中或板板正正或歪歪曲曲的笔迹。小心抚摸那段时光，不意触动满膛涟漪。首先感谢指导老师戴九兰副教授。研究生三年，每上升一个台阶，每品尝一颗硕果，都离不开她的支持与鼓励，帮助与关怀。戴老师学识渊博、治学严谨、处事谦和、工作勤奋，是学业上的良师生活上的益友。由环境工程专业转到微生物生态方向不仅需要补充大量的微生物和生态学方向的知识缺口，学习生态统计学和生物信息学方面的处理技巧，更重要的是将降解问题的思路从工程转向科研。在转变中，有挫折，有困惑，有矛盾，有迷茫。戴老师始终敏锐发现这些问题，为我指点迷津，开拓思路，精心点拨，热心鼓励，如同迷雾中隐现的灯塔，黑夜中指引的明星。温婉劝诫，她是释疑解惑的灵丹妙药；循循善诱，她是催人奋进的行家里手。戴老师对新技术的积极学习态度，对科研工作的踏实精神，以及面对问题的坚定信心，深深感染了我。在戴老师的培养下，我逐渐积极主动学习新技术，认真努力做实验，逐步端正面对问题和解决问题的态度，让我认识到科学研究的魅力和掌握新技术的意义。感谢历任债主们，他们在我困顿的时候给予我精神上的鼓励，在我贫乏的时候提供物质上的帮助。感谢徐州工地的工友们，砖石没有消磨他们的热情，砂浆也没有固化他们的希望，他们的赞许给予我最大的鼓励。感谢老友们，或玩耍，或学习，或实践，或支教，或赈灾，或观鸟，或趟过陇南的河流，或压过榆中的马路。段段时光如美酒，历久弥香。感谢王文兴院士，年近九十的老人仍然孜孜不倦的工作，是我辈楷模。感谢n山东大学硕士学位论文王仁卿老师，刘建老师、孙瑞莲老师、谢慧君老师、郭卫华老师、张治国老师、孟振农老师、张淑萍老师、贺同利老师、王玉志老师、王玉涛老师和魏英华老师。他们在我有疑问时给予了我悉心的指导并提出宝贵的意见，在学习科研方面给我的关怀与帮助。感谢孙廷利老师、王晓粉老师、胡敬田老师、孙孝敏老师、李卫军老师、王新锋老师、尹娜老师，感谢他们对我的鼓励、支持和信任。感谢师兄师姐～张娟、薛童、刘华、杜远达、付合才、王鹏、朱连鑫、梁晓琴、葛秀丽、张依然、余悦、谭向峰、常瑞英、李学明、王成栋，感谢师兄师姐们在学习科研以及生活上的关怀与帮助。感谢三年的同窗一张海杰、宋颖、王洪秀、刘健、郭亚丽、姚兰、杨飞、秦晶、张文馨、张月强、孙明星、金飞宇、任小凰、祁骞、冷泉。一起玩耍，相互学习，共同度过快乐时光。感谢所有的师弟师妹一刘慧、许芹、于政达、马文、曹情情、陈小翠，感谢大家在我学习和生活上提供的所有帮助与支持，尤其感谢马文师妹和许芹师妹在本文语言修改上提供的帮助。感谢三年的舍友一弓晨和吴秀超，一起看恐怖片，一起喝扎啤，一起锻炼。同为胖子，相互勉励，欢声笑语尤多。最后，最深沉的感谢献给我家人。他们是夏天遮阴的大树，是冬天温暖的房屋；是容纳太阳的黑夜，是庇护雏凤的桐花。他们让烦躁逐渐平静，让寒冷远离孤独；让伤口得以舔舐，让涅粲终究重生。再次感谢陪我一路走过并给予我关心和帮助亲朋师友156陈贻海2014年3月11日n山东大学硕士学位论文硕士研究生期间撰写论文目录陈贻海，戴九兰，王仁卿(2014)．聚乙烯醇生物降解的研究进展．环境污染与防治36(3)82-86．ZHANGYong—Li，CHENYi．Hai(并列第一)，WANGRen．Qing，eta1．，Influenceofmetal-enrichedsewagesludgeonsoilrhizospheremicrobialcommunityofwinterwheat(TriticumaestivumL．1．FrontiersofEnvironmentalScience&Engineering(Accepted)．CHENYi-Hai，WANGYu—Tao，YANGChun-Yu，eta1．，454-Pyrosequencingrevealsthemicrobialcommunitystructureofactivatedsludgefromtwotextilewastewatertreatmentsystemsforthehigh-efficiencybiodegradationofpolyvinylalcoh01．JournalofCleanerProdunction(Underreview)．LIUHua，CHENYi-Hai(并列第一)，DAIJiu-Lan，eta1．，ResponsesofbacterialandarchaealammoniaoxidizerstoCustressinfluvo—aquicsoil．AppliedSoilEcology(Underreview)．陈贻海，戴九兰基于文献计量学的聚乙烯醇生物降解研究进展．应用与环境生物学报(准备中)．57n学位论文评阅及答辩情况表专业技术是否博导总体评价姓名所在单位职务(硕导)※论惑羡赫爱窆山利矽莨卢j码、i聪怠鼢投窆山歙亏．4又评阅人专业技术是否博导姓名所在单位职务(硕导)i寐亵辜忽者墨是山琼t磁食寻．a谚寿沛霜是a东衣墨．答起出豫≠季．辩携辱勖勰委诵：躲眺撮是从徘号．口委贝会孙害蓟勿短星厶百笮；．成oI口贝口贝答辩委员会对论A答辩秘书I‘答辩日期沙f段乜tl眵文的总体评价※申透还备注※优秀为“A”；良好为“B”；合格为“C”；不合格为“D”。