用eric-pcr结合分子杂交监测焦化废水处理系统(a2o)中微生物群落结构的变化 5页

第24卷第7期生态学报Vol.24,No.72004年7月ACTAECOLOGICASINICAJul.,2004用ERIC-PCR结合分子杂交监测焦化废水处理系统2(AöO)中微生物群落结构的变化1,211111陈敏,魏桂芳,高平平,王凌华,庞晓燕,赵立平(1.上海交通大学生命科学技术学院,微生物分子生态学与生态基因组学实验室,上海200240;2.杭州师范学院生命科学学院,杭州310012)摘要:建立一种不依赖纯培养,可以在废水处理工业现场使用的监测微生物群落结构变化的分子技术。以处理焦化工业废水(A2öO生物膜工艺)不同构筑物中的悬浮污泥的微生物群落为研究对象,每周采样1次,连续4周。获得悬浮污泥总DNA的ERIC2PCR指纹图谱,结合分子杂交进一步区分相同条带间的不同序列信息。结果表明,在缺氧池(A2池)和好氧池(O池)之间,各个采样点的ERIC2PCR图谱差异不大,悬浮污泥在各构筑物之间交流充分;同一采样点的图谱在不同采样时期具有明显差异,显示了在此期间微生物群落的连续动态变化过程。通过对生物膜系统中悬浮污泥的微生物群落结构的指纹图谱分析,可开发出对该系统微生物群落结构动态变化进行检测的技术。关键词:ERIC2PCR;指纹图谱;分子杂交;污水处理UsingERIC-PCRandmolecularhybridizationformonitoringchangesinthestructureofmicrobialcommunityincokingwastewatertreatmentsystem1,211111CHENMin,WEIGui2Fang,GAOPing2Ping,WANGLing2Hua,PANGXiao2Yan,ZHAOLi2Ping(1.SchoolofLifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China;2.SchoolofLifeScience,HangzhouNormalCollege,Hangzhou310012,China).ActaEcologicaSinica,2004,24(7):1330～1334.Abstract:Aculture2independentapproachtomonitorchangesinthestructuresofmicrobialcommunitiesinindustrialscale2treatmentbasinswasdeveloped.Sludgesamplesweretakenfromthewastewatertreatmentsystem(AöO,A1:Anaerobictank;A2:Anoxictank;O:Oxictank)ofalocalcokingplant.Suspendedsludgewascollectedweeklyfromsixdifferentlocationsindifferenttanksoveraperiodoffourweeks.ThetotalDNAwasextractedandERIC2PCRwasusedtogenerateDNAfingerprints.Southernblotwascarriedouttocomparesequencehomologybetweenidenticalbandswithmicrobialcommunityprobes,whichwerelabeledfromtheERIC2PCRproductsofonesample.TheresultsshowedthattheERIC2PCRbandingpatternsoftheA2andOtankswereidentical,andthemicrobialcommunitystructuresinthesetanksweresimilar,whichsuggeststhatthesuspendedsludgewasmixedcompletelybetweenthetwotanks.Incontrast,theERIC2PCRprofilesproducedfromtheA1samplesweredistinctfromthoseoftheA2andOsamples,withbothcommonanduniquebandsapparent.Thus,themicrobialcommunitiesofthedifferenttankscouldbedifferentiatedonthebasisoftheirERIC2PCRbandingpatterns.ThebandingpatternsofERIC2PCRfingerprintanalysisofsamplescollectedsimultaneouslyfromdifferentlocationswithinasingletankwereidentical.Thisindicatedthatthecompositionsofmicrobialcommunitiesfromdifferentlocationswithinasingletankwerecomparable.DynamicchangeswithtimeinthemicrobialcommunitystructuresintheA2andOtankswerevisualizedbybandingpatternshiftsaftermolecularhybridizationoftheprofileswithtotalERIC2PCRproductsoftheOtankasmixedprobes.Theshiftsrecordedduringthefour2基金项目:国家高科技研究发展计划项目(“863”项目计划)(SZ203201204,2001AA214131)收稿日期:2003212210;修订日期:2004204210作者简介:陈敏(1963～),女,浙江绍兴人,副教授,主要从事微生物分子生态学研究。E2mail:mchen63@163.com3通讯作者Authorforcorrespondence,E2mail:lpzhao@mail.sjtu.edu.cnFoundationitem:theHi2Tech.ResearchandDevelopmentProgramofChina(No.SZ203201204,2001AA214131)Receiveddate:2003212210;Accepteddate:2004204210Biography:CHENMin,Associateprofessor,mainlyengagedinmolecularmicrobialecology.E2mail:mchen63@163.comn27期陈敏等:用ERIC2PCR结合分子杂交监测焦化废水处理系统(AöO)中微生物群落结构的变化1331weekstudyindicatedthatthestructuresofthemicrobialcommunitieswerenotstaticbutratherdynamic.Thiswasparticularlyapparentduringthethirdweekwhenthenumberofbandsdecreasedandoneband(1125kb)disappeared.ERIC2PCRbandingpatternsofsludgesamplesat4stagesrecordedmeanCsvaluesof4912%intankA2and5617%intankO.ERIC2PCRfingerprintingcoupledwithmolecularhybridizationmaybeapracticalmethodtomonitorthechangesinmicrobialcommunitystructuresinwastewatertreatmentsystems.Keywords:ERIC2PCR;microbialcommunityprobes;wastewatertreatment文章编号:100020933(2004)0721330205中图分类号:Q93811文献标识码:A污水生物处理技术是环境保护中最重要的技术方法之一,其原理主要是通过微生物对各种有机污染物的降解作用。无论是活性污泥或生物膜装置,其反应的主体都是由各种细菌、真菌、藻类和原生动物等构成的一个复杂的微生物生态系统。装置的运行是以其中的微生物种群为基础的,种群结构的变化决定了其处理功能的变化。通过研究微生物群落结构动力学变化与降解功能的关系,就有可能在提高装置的处理效果、降低运行成本、扩大处理能力等方面取得显著效果。因此,污水处理装置中的微生物相可以起到指标生物的作用,由此来检查、判断处理装置的运转情况和污水处理效果。但是,过去受传统分离培养方法的限制,人们对环境中的复杂微生物群落的组成及功能没能得到深入的认识。以污水生物处理为例,由于技术的局限,毫无疑问使一些关键问题无法得到解决,如活性污泥的膨胀;主要优势功能菌的鉴定及其生长速率的测定等等。对微生物群落结构变化规律的认识不足,直接影响了生产实际中污水处理的效果。[1]近年来,人们开始发展一些新方法来研究环境中的微生物群落,其中BIOLOG鉴别系统是重要的方法之一,它是通过微生物对一系列(95种)唯一碳源利用能力上的差异来加以鉴别。这种方法的局限性是仍然必须基于微生物的可培养性。完整细[2]胞的方法也一直用于对微生物群落的鉴别上,它是基于在添加了不同底物的各种土壤中对微生物细胞呼吸作用的测定。此[3]外,White等人也曾描述了用脂质生物标记的方法来鉴别微生物群落。而作为分子生物学方法引入生态学研究的结果,人们[4][5]可以通过直接分析自然环境中微生物的DNAöRNA来分析和鉴别微生物,这些方法包括RFLP,TGGEöDGGE,以及[6]ERIC2PCR指纹图的方法等。ERIC序列(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensusSequence)是首先在肠道细菌基因组中发现的长为126bp的非[7]编码保守重复序列,随后相继又在其他许多肠道的、非肠道的细菌中发现了ERIC序列。ERIC序列在不同细菌中的拷贝数和定位都不同。利用ERIC保守序列设计的引物对细菌DNA进行PCR扩增,可以得到反映细菌基因组结构特征的谱带,因此可[8][9,10]广泛用于细菌鉴定、分类等研究。在后来Gillings等人的工作中发现ERIC引物在扩增过程中并不一定匹配ERIC序列,而实际上是随机结合的,ERIC2PCR实际上是随机的扩增技术。人们曾以肠道微生物区系和活性污泥微生物区系为研究对象,探讨了ERIC2PCR在分析和检测细菌种群结构动态变化中的作用。研究表明,用ERIC2PCR分析所得到的指纹图谱,在比较不[11]同群落结构特征的差异以及同一群落在一段时间内微生物种群的变化过程是有效的。本研究直接以污水处理构筑物为研究对象,旨在以ERIC2PCR为基础并结合分子杂交,建立一种不依赖于纯培养、可以直接对构筑物中微生物群落变化进行动态监测和精细比较的分子方法。1材料与方法111污泥样品2取自上海某焦化厂AöO生物膜污水处理系统(A1:厌氧池;A2:缺氧池;O:好氧池)。共设置6个采样点,分别是A1池中间、A2池进水、A2池中间、O池进水、O池中间、O池出水。每个点采集悬浮污泥水样约2000ml。每间隔1周采样1次,连续4周。1.2样品处理污水样品,10000×g5min,收集沉淀。加5倍体积的TENPbuffer加玻璃珠充分旋涡,10000×g5min,收集沉淀(重复2次)。加5倍体积的PBSbuffer,旋涡,收集沉淀(重复2次)。加PBS悬浮,分装试管(10ml离心管,每管加4ml悬浮液和1ml甘油),旋涡均匀,-70℃保藏。1.3总DNA提取及纯化样品013g～015g(10ml离心管),加2mlextractionbuffer悬浮,加2粒玻璃珠漩涡5min。加入2ml2%SDSbuffer,上下颠倒10min(放置冰上)。13000×g10min,收集上清。加入4ml酚轻轻混匀。13000×g15min,取上清。加入2ml酚和2ml氯仿,颠倒几下混匀,13000×g15min,取上清。加入4ml氯仿,颠倒几下混匀。13000×g15min,取上清。加入016倍体积异丙醇,混匀。-20℃1h或过夜。14000×g20min,弃上清。沉淀用70%乙醇洗1次,冷冻干燥。100LlTE或超纯水悬浮,加入115LlRNaseA(20mgöml)37℃消化20min。-20℃保藏。必要时,DNA样品用“MOBIO”DNApurificationKit过柱纯化。1.4ERIC2PCR引物序列n1332生态学报24卷ERIC1R:5'2CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA23';ERIC2:5'2AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG23'。[8]反应体系与反应参数见文献。1.5探针标记与DNA分子杂交选ERIC2PCR图谱中条带数最多的污泥DNA样品(O池进水点样品),PCR扩增后产物过柱纯化,地高辛标记做成微生物[12]群落结构探针(DIGDNALabelingandDetectionKit)。1.6图谱的相似性分析[13]用Sorenson配对比较相似性系数(pairwisesimilaritycoefficient,Cs)比较ERIC2PCR指纹图谱的相似性。2结果与分析2.1不同处理池微生物群落遗传指纹图分析图1所示是同一时间分别采自A1、A2和O池中央悬浮污泥样品的ERIC2PCR指纹图谱。结果显示,A2和O池的指纹图相似,均显示约14条清晰可辨的条带,且主带位置一致,Cs值为100%;而A1池指纹图明显不同于A2和O池,既显示了共同的条带又存在独特的条带,其条带数较少,Cs值仅为40%。此图谱反映了在同一时间不同处理池悬浮污泥中微生物群落结构的基本状况,可以初步判断A2和O池悬浮污泥中微生物的组成是相似的。分析原因可能与两池之间污水有交流有关,因为A2池的水直接流入O池,而O池的水有部分回流至A2,即两池的水是循环交流的,这样可能就导致了A2和O池的悬浮污泥中微图1同一监测时期AöO池的ERIC2PCR指纹图生物群落结构的相似性。另一方面,为了考察总DNA提取、PCRFig.1ThebandingpatternsproducedbyERIC21CRanalysisof扩增以及凝胶电泳分离方法的可重复性,分别将A1、A2和O池samplescollectedfromA1、A2andOtankatthesametime的样品分成相同的两份进行平行重复实验,结果表明重复试验1:分子量标记Mr(1Kbladder);2:阴性对照Negativecontrol;产生的指纹图非常一致。3～4:厌氧池Anaerobictank;5～6:缺氧池Anoxictank;7～8:好氧2.2同一处理池不同采样点微生物群落遗传指纹图分析池Oxictank除A1池以外,A2和O池均设置了进水处(S1)、池中间(S2)和出水处(S3)3个采样点。因A2和O池有管道相通,即A2出水就是O池进水,故A2池实际只有两个采样点(进水和池中间)。如图2(a)所示,A2或O池不同采样点悬浮污泥样品的DNA指纹图相同,说明各采样点之间的微生物群落组成没有显著差异。但这种以比较条带的数目、位置和亮度的指纹图方法,只能是初步判断样品间微生物组成的异同,确切的判断还应该提供相应条带之间的序列信息。为此,使用了微生物群落结构探针的图2同一监测时期AöO池不同采样点的ERIC2PCR指纹图(a)方法,即选取图谱中条带数最多的O池进水点样品[如图2(a)Southernblot(b)Lane6],ERIC2PCR扩增后用地高辛标记PCR产物,做成探针。Fig.2ThebandingpatternsproducedbyERIC21CRfingerprint如图2(b)所示是A2和O池不同采样点样品的ERIC2PCR图谱analysisofsamplescollectedfromdifferentlocationswithintheA1、与群落结构探针杂交所得到的相应的Southernblot图谱,基本A2andOtankatthesametime(a)Southernblot(b)显示了与ERIC2PCR指纹图分析相一致的结果。1:分子量标记Mr(1Kbladder);2:阴性对照Negativecontrol;3:根据以上结论,在以后的研究中,每个处理池只需选择一个A1;4:A22S1;5:A22S2;6:O2S1;7:O2S2;8:O2S3A1:厌氧池Anaerobictank;A2:缺氧池Anoxictank;O:好氧池Oxic采样点即可。tank;S1:进水处inlet;S2:池中间middle;S3:出水处outlet2.3不同监测时期AöO池中微生物群落结构的变化图3所示是4个不同时期T1、T2、T3和T4(每间隔1周)分别从A2和O池采集样品的ERIC2PCR指纹图(A)以及与群落结构探针杂交所得的相应的Southernblot图谱(图3b)。结果表明,这4个时期系统中的优势种群是相对稳定的,但同时也显示了整个群落的连续变化过程。前者表现为共有一些主带,后者则主要表现为条带数目及条带亮度上的变化,较明显的是1125Kb处的条带变化(红色箭号所示),第1、第2周时此条带清晰可辨,第3周时条带消失,第4周又重新出现,但较弱。此外,图3也显示了A2池的变化过程与O池是一致的,这再次说明了这两个池子悬浮污泥的主要微生物组成及数量是相n27期陈敏等:用ERIC2PCR结合分子杂交监测焦化废水处理系统(AöO)中微生物群落结构的变化1333似的。4个不同时期A2和O池样品的ERIC2PCR指纹图谱的Cs值分析如表1所示。从以上实验结果充分说明了ERIC2PCR指纹图结合微生物群落结构探针的方法,可用于监测复杂微生物群落的结构特征及优势种群的动态变化。3讨论311关于ERIC2PCR图3不同监测时期AöO池的ERIC2PCR指纹图(a)SouthernblotERIC2PCR是以分布在细菌基因组中的重复共有序列为(b)基础的DNA指纹分析技术。从环境样品中提取的总DNA为Fig.3TheERIC2PCRbandingpatterns(a)producedfromA2and模板进行ERIC2PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离Otanksamplescollectedatoneweeklyintervaloverafour2week形成每一微生物群落所特有的条带图谱。条带的数量、确切的periodandtheanalysisofSouthernblotting(b)1:分子量标记Mr(1Kbladder);2:阴性对照negativecontrol;31A22位置和亮度,反映了微生物群落结构的特征。这样,对环境微T1;4:A22T2;5:A22T3;6:A22T4;7:O2T1;8:O2T2;9:O2T3;10:O2生物群落结构的分析已转化为对其DNA指纹图的分析。就一T4些图谱会比较复杂的微生物系统而言,可通过建立数量测定A2:缺氧池Anoxictank;O:好氧池Oxictank;T1～T4:第一周至第[13]的方法对图谱进行客观的分析,如用Cs系数比较图谱间的四周的样品samplesobtainedfromfirsttoforthweeks[14]相似性;用Shannon指数来计算群落多样性的变化。图谱中每一条带来自源于不同的细菌,同一条带DNA片段大小相同表14个时期A2和O池样品的ERIC-PCR指纹图谱的相似性系数而序列可能不同,为此通过分子杂交技术进一步分析更深层Table1CsmatrixvaluesforsamplesfromA2andOtanks次的序列信息。Cs(%)样品A2OERIC2PCR指纹图谱分析技术已被赵立平研究小组成功SampleT1T2T3T1T2T3[15]地用于对活性污泥中微生物区系结构变化的研究上,利用T24176这一技术研究了AB工艺焦化废水处理系统曝气池的微生物T349446244种群结构的动态变化与污染负荷以及主要污染物降解效果变T4534267504565化之间的关系。结果显示,在系统对苯酚和氰化物去除效率相A2缺氧池anoxictank;O好氧池oxictank;T1～T4第1对稳定的状态下,ERIC2PCR整体图谱特征保持稳定,反映出周～第4周的样品samplesobtainedfromfirsttoforthweeks监测期间该活性污泥处理系统微生物种群结构比较稳定。与此同时,通过指纹图谱分析鉴定出了亮度变化与苯酚降解效率大致呈正相关的DNA条带。通过对该条带的分子克隆、物理图谱分析和部分克隆的测序,找到了反映苯酚降解效率功能菌的特异[16]标记。我们的研究也证明了通过ERIC2PCR的方法能产生不同时间或空间微生物群落的特征性指纹图,并在动态监测过程中反映出群落结构特征的变化。3.2种群结构与功能的相关性一般来说,在由多种细菌组成的微生物群落中,各种细菌只有当其种群数量超过总数量的1%～10%时,其特征性的条带才可以在群落结构DNA指纹图中表现出来。因此,图谱所反映的应该是群落中数量占优势的种类。但是,不同的环境样品DNA分子的组成及相对数量不同,重复序列在不同基因组DNA分子中分布及拷贝数均不同,这种差异可以反映在ERIC2PCR获得的指纹图谱中,因此图谱反映的是某一环境样品中微生物种群组成的特征。本文作者用ERIC2PCR结合分子杂交技术来分析和比较系统的微生物优势种群结构与功能的相关性。微生物的群落结构决定了其生态功能。因此,污水处理装置中微生物群落结构的变化将能反映该系统的运行状况及降解效率。在整个监测时期,根据水样分析数据(数据未显示),有一次较大的波动是在第3周,此时原水中的COD、酚及氨氮含量远高于前两周。对应于指纹图分析来看,第3周样品的条带数量明显减少,特别是大约1125Kb处一条较亮的条带消失。这可能是[17]由于受到高负荷的冲击后,使微生物群落结构发生了明显的变化,有时甚至使整个群落崩溃。关于这方面的结论还有待进一步的研究证实。3.3液相悬浮微生物与生物膜的相关性生物膜是由固定在附着生长载体上的细胞所组成。生物膜形成的第一步就是液相中的悬浮微生物在载体表面的可逆附着过程,即液相中的微生物附着与脱析的双相动态过程。此时附着的微生物密度与悬浮微生物浓度间存在着正比例的关系。随着微生物的不可逆附着过程,固着的微生物增长繁殖,同时会向水中释放出游离的细胞。最后,生物膜老化剥落,然后又开始新的生物膜形成过程。因此,生物膜的微生物组成与液相中悬浮的微生物具有相关性。通过分析悬浮微生物的结构与组成,在一定程n1334生态学报24卷度上能够反映出生物膜上的微生物生长和功能的特点。所不同的是,由于生物膜上的微生物没有悬浮生长的微生物那样承受强烈的曝气搅拌冲击,因此生物膜上除大量细菌生长外,还可能出现大量真菌、线虫类、轮虫类等生物。此外,由于生物膜上生物平均停留时间较长,能够生长世代时间较长、增殖速度慢的微生物,如硝化菌等。所以,在某种程度上,生物膜上的生物多样性和相互作用会更加复杂。有关生物膜的微生物群落结构以及与悬浮微生物间的关系有待进一步的研究。References:[1]GeorgeDD,LidiaSW,RamonJS,etal.FingerprintingofmixedbacterialstrainsandBIOLOGGram2Negative(GN)substratecommunitiesbyenterobacterialrepetitiveintergenicconsensussequence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