耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用 52页

单位代码：10166硕士学位论文耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用论文作者：杨静学科专业：生物化学与分子生物学指导教师：张阳教授培养单位：化学与生命科学学院培养类别：全日制完成时间：2013年05月17日沈阳师范大学学位评定委员会n学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在导师的指导下取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示了谢意。作者签名：日期：。学位论文使用授权声明本人授权沈阳师范大学研究生处，将本人硕士学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索；有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，允许论文被查阅和借阅；有权可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本规定。作者签名：日期：。n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用摘要伴随工业化和城市化进程，我国的需水量和几乎同等数量的污水排放量都在逐年上升。日益严重的水体污染，不断恶化的水质，使可用的水资源日渐匮乏。寻找更为经济有效的污水处理技术成为社会持续健康发展的一项亟待解决的问题。高盐废水因高盐浓度对微生物的毒害作用，使传统的生物处理效果大幅度降低，增加了高盐废水的处理难度。耐盐微生物因其独特的生物学特性，为高盐废水的高效处理开辟了新的方法。SBR（序批式活性污泥法），因设备简单灵活，驯化污泥活性较高，抗冲击能力强，处理效率高等特点被广泛应用于高盐废水的生物处理。本论文从土壤样品中筛选出嗜（耐）盐菌株，对筛选出的菌株鉴定到属，测定其生长的盐度范围，初步研究菌株对降解高盐废水的能力。采用SBR法处理高盐模拟废水，逐步提高盐度，驯化耐盐活性污泥，收集和监测系统运行参数，利用PCR-DGGE技术对污泥驯化不同时期的出水水质做全面监测分析，研究群落结构的动态变化与活性污泥降解高盐废水各阶段的相互关系，主要得出以下结论：土壤样品中含有丰富的嗜（耐）盐微生物，共分离到24种形态差异明显，生长盐度范围较广的菌株，结合形态和生理学特征，初步确定其分类地位。不同耐盐菌群相比较普通活性污泥，对高盐模拟废水表现出更强的降解能力。采用逐步提高盐度的方法驯化耐盐活性污泥，驯化过程中，SBR反应器系统性能基本稳定，对COD、氨氮有较高的去除率。高盐环境下适应性较强的优势菌群占据主导地位，污泥系统中微生物之间相互作用，宏观上即表现出降解高盐废水的功能，标志着耐盐活性污泥驯化完成。对活性污泥驯化不同阶段的样品PCR-DGGE电泳分析的结果表明，随着驯化时间的增加以及盐浓度的提高，种群多样性经历了一个先减少，而后逐渐增多的演变过程，0.8％和1％盐度的污泥，在驯化成熟期群落结构的同源性最高。图谱显示结果精确反映了污泥驯化不同时期群落结构的变化情况。关键词：高盐废水，耐盐微生物，SBR，PCR-DGGEnIsolationofSalt-tolerantMicroorganismsandItsApplicationinHypersalineWastewatertreatmentAbstractWiththeprocessofindustrializationandurbanization,ourcountry'swaterrequirementandalmostthesameamountofsewageemissionsarerisingyearbyyear.increasinglyseriouswaterpollution,thedeterioratingwaterquality,makeavailablewaterresourcesarescarce.lookingformoreeconomicandefficientwastewatertreatmenttechnologybecomeapressingsocialsustainableandhealthydevelopmentoftheproblem.High-salinitywastewaterwithhighsaltconcentrationonthetoxicityofmicrobes,thetraditionalbiologicaltreatmenteffectissignificantlyreduced,Increasedthedifficultyofhighsaltwastewatertreatment.Uniquebiologicalcharacteristicsofhalotolerantmicroorganism,openingupanewwayfortheefficientprocessingofhigh-salinitywastewater.SBR(sequencingbatchtypeactivatedsludgeprocess)iswidelyusedinhigh-salinitywastewatebiologicaltreatment.becausetheequipmentissimpleandflexible,andthehigheractivatedsludge,andtheimpactedresistantability,andhighprocessingefficiencyetc.Thispaperisolatshalophilic(halotolerant)strainsfromsoilsamples,identifingtogenera,measuringthegrowthsalinityrange,andpreliminaryresearchesstrainsontheabilityofdegradationofhigh-salinitywastewater.ThemethodofSBRisadoptedtotreathigh-salinitysimulatingwastewater,withsteadilyimprovingsalinity,domesticatingsalt-tolerantactivatedsludge,collectingandmonitoringsystemoperationparameters,comprehensivemonitoringandanalysiseffluentqualityonvariousstagesofthecultivationanddomesticationprocessesbyPCR-DGGEtechnique,studyingtherelationshipbetweenthedynamicchangeincommunitystructureandtheactivesludgedegradationofhigh-salinitywastewaterfordifferentstages,drawingthefollowingmainconclusions:Soilsamplescontainedabundanthalophilic(halotolerant)microorganisms,totallyseparating24strainsofmorphologicalsignificantdifferencesandgrowthwithwiderrangeofsalinity.Preliminarydetermineditsclassificationstatuswithmorphologicalnandphysiologicalcharacteristics.Differentsalt-tolerantmicrobialcommunityshowedbetterdegradationabilitythanconventionalactivatedsludgeonhigh-salinitysimulatingwastewater.Salt-tolerantactivatedsludgewasdomesticatedbythemethodofgraduallyincreasingsalinity,duringtheprocessofdomestication,SBRreactorsystemshowedstablefunction,thehighofefficiencyonremovalratioofCODandammonianitrogen.AdvantageflorawhichhadstrongadaptiveabilitytotheHighsaltenvironmentleadedadominantposition,microbialinteractionsinthesludgesystemShowedthefunctionofdegradationofhigh-saltinitywastewateratthemacrolevel,whichmarkedthecompletedhalotolerantactivatedsludgedomestication.StudiedsludgesamplesoftheactivesludgeondifferentdomesticationstagesbyPCR-DGGE,thedifferencebetweendomesticationstageofdifferentsalinityandindifferentperiodsofthesamestage,performancewiththestripenumber,locationandbrightnessonontheDGGEfingerprint.Withthedomesticationtimeincreasingandthesaltconcentrationimproving,populationdiversityexperiencedtheevolutionprocessofadecreasingfirstandthengraduallyincreasing.Sludgecommunitystructureatsalinityof0.8%and1%hadhighesthomologyinthedomesticationmaturity.Fingerprintaccuratelyreflectedtheresultsthathowcommunitystructurechangedoverdifferentstagesofthesludgedomestication.Keywords：hypersalineWastewater，salt-tolerantmicroorganism，SBR，PCR-DGGEn目录第一章引言.........................................................11.1高盐废水的产生途径..........................................11.1.1海水代用排放的废水.....................................11.1.2工业生产过程产生的高盐度废水...........................21.1.3其他高盐废水...........................................21.2高盐废水生物处理的研究现状..................................21.2.1盐度对不同处理工艺的影响...............................21.2.2盐度对活性污泥系统变化规律的研究.......................31.2.3嗜盐菌强化高盐废水的处理...............................41.3嗜盐菌的特性................................................41.3.1嗜盐菌的分类...........................................41.3.2嗜盐菌的营养结构.......................................51.3.3嗜盐菌的嗜盐机理.......................................51.4高盐废水生物处理的研究方向..................................61.5PCR-DGGE....................................................61.5.1PCR-DGGE技术..........................................61.5.2PCR-DGGE的应用........................................71.6课题研究的意义及创新点......................................7第二章耐盐微生物的分离筛选及初步鉴定...............................82.1材料及方法...................................................82.1.1样品来源...............................................82.1.2仪器和设备.............................................82.1.3培养基.................................................82.1.4耐盐菌株的分离筛选.....................................92.1.5菌株的生理生化指标测定................................102.1.6菌株的耐盐性测定......................................112.2结果与讨论..................................................122.2.1耐盐菌株的形态特征....................................122.2.2耐盐菌株的生理生化特征................................142.2.3菌株的耐盐性研究......................................162.3小结........................................................22n第三章SBR处理高盐模拟废水的研究...................................243.1材料及方法..................................................243.1.1样品来源..............................................243.1.2仪器和设备............................................243.1.3SBR反应器............................................243.1.4测定指标..............................................253.1.5水样中总细菌DNA的提取................................253.1.616SrDNA扩增..........................................263.1.7PCR-DGGE..............................................273.2结果与讨论..................................................273.2.1耐盐活性污泥驯化各阶段的降解性能......................273.2.216SrDNA扩增..........................................283.2.3PCR-DGGE电泳.........................................293.2.4QuantityOne软件包分析...............................313.3小结........................................................34第四章混合耐盐菌株的降解特性......................................364.1材料与方法..................................................364.1.1材料来源..............................................364.1.2仪器与设备............................................364.2结果与讨论..................................................364.3小结........................................................37第五章结论与展望..................................................38参考文献...........................................................40n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用第一章引言随着人口的增长和社会经济的发展，水的需求量呈现急剧上升趋势，然而，日益严重的水体污染，不断恶化的水质，使可用的水资源日渐匮乏。国家实施了一系列保护水资源的法律法规，严格控制污水的排放，因此，寻找更为经济有效的污水处理技术成为社会持续健康发展的一项亟待解决的问题。高盐废水指来源于生活污水和工业废水的总含盐量大于1%（质量分数）的[1]-2-+2+排放废水，含有较高的如Cl，SO4,Na,Ca等无机离子，也含有如甘油[2]和中低碳链的有机物。由于其成分复杂多样，盐分高，对微生物生长具有较强的抑制作用，因此该废水处理技术难度远比普通污水处理要大得多。我国高盐废[3][1]水产生数量在总废水中达5%，每年仍以2％的速率增长。因此，高盐废水处理在污水处理中有重要地位，是废水处理研究的重点，也是难点。目前研究和常[4]用的高盐废水方法有蒸发法、电解法、膜分离法、焚烧法和生物法等。蒸发法是像盐生产一样的传统处理方法，对小量高盐废水经济有效，但处理大量的高盐废水则需要大面积的蒸发池和特有的设备，运行费用较高；电解法中有机物的电解质溶液本身也可能发生一系列的氧化还原反应，生成不溶于水的物质，经过沉淀(或气浮)或直接氧化还原为无害气体除去，从而降低COD。另外溶液中的氯化钠电解时，在阳极上所生成的氯气，有一部分溶解在溶液中发生次级反应而生成[5]次氯酸盐和氯酸盐，对溶液起漂白作用；膜分离法是一项先进的处理技术，在高盐废水处理技术中有巨大的潜力，目前的主要问题是设备昂贵，处理过程易堵、易污染，且浓液处理难；生物法，不仅能有效降低污水盐浓度，同时可降解C、N、S、P等成分，是目前高盐废水处理研究中的热点，具有重要的利用潜力和价值。本文就高盐废水处理的生物方法，介绍其来源、治理方法的技术关键和研究方向。1.1高盐废水的产生途径海水代用、石油开采、化工、制药以及食品加工等工业与生活废水，构成了高盐废水的主要组成部分。1.1.1海水代用排放的废水全球海水储量丰富，用海水替代淡水资源为生产和生活所用，对缓解淡水资源紧缺有重要意义。海水冲厕在香港已纳入法律强制执行。近年来，海水冲厕在香港已达到80%以上，我国内地沿海城市，在经济迅速发展的同时，也成为了主1n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用3[6]要的淡水紧缺地区。预计到2020年，海水直接利用量达到1000亿m/年。海水利用量增加将直接导致高盐废水的大量排放，这种海水废水若进入城市污水处理系统，将对普通污水处理程序产生严重冲击，如使生化处理效率降低、成本升高等，未处理的这种高盐废水直接排放到海洋会严重破坏海岸带生态环境。1.1.2工业生产过程产生的高盐度废水［7-8］煤化工、石油、印染化工在我国是高氯盐废水生产的大户，其次是制药，包括人畜生物制药和农药制造，在生产的过程中使用大量的无机盐；石油和天然［9］气的开采过程中也会产生大量高钠、钙盐废水。食品加工业包括肉食类、腌制类、海产品类等，生产和加工过程也产生一定的盐浓度的高中盐废水。这些行业属于重污染行业，废水生产量大，且还含有难降解或有毒的有机污染物、无机盐、[6]放射性元素等。1.1.3其他高盐废水个别地区的地下水异常，引起该区域水质中的盐分高于淡水，如河北平原部[6]分地区浅层地下水位咸水，总溶解固体浓度可达5g/L左右。沿海地区，海水渗透进入地下水系统，使地下水水质中的氯化物和硫酸盐浓度增加，同时带来了［10］高盐度的城市污水，另外，大型船舰上的污水排放，形成了高含盐生产污水。此外，由于技术的局限性，虽然严格控制了生产中废水的总排放量，却相对增加了其中有机物及无机盐的浓度。1.2高盐废水生物处理的研究现状微生物一般不能在高含盐的环境中正常生长，较高的盐浓度会对废水生物处理产生毒害作用，使处理效果大幅度降低。不同的盐浓度，采用不同处理工艺，处理效果也有所不同。两段接触氧化、传统活性污泥法、SBR、膜法SBR、UASB、[6]厌氧滤池和A/O工艺等被广泛应用在含盐废水的生物处理中。然而，处理设施庞大、处理工艺复杂、运行成本增加，也是这些方法存在的不容忽视的弊端。国内外学者的研究多集中在以下几个方面:盐浓度影响不同处理工艺；盐浓度影响活性污泥变化规律；嗜盐菌强化高盐废水处理。1.2.1盐度对不同处理工艺的影响Dincer等用生物转盘系统处理不同盐度的废水，研究了COD的去除率随盐浓度变化的规律。结果表明：COD的去除率随着盐浓度的提高而降低。盐浓度不2n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用[11]同时，COD的去除率也不同，盐浓度为5%时，COD的去除率可降低至85%。Dale等研究了利用生物滤池处理含高浓度的盐及有机物的石化废水。生物[12]膜受到高盐浓度的抑制，同时，也减小了BOD5的去除率。张明生等采用生物接触氧化工艺处理高盐废水，研究了盐浓度逐渐升高的条件下，COD去除率及系统稳定性的变化规律。研究发现，控制进水盐浓度在一定[13]范围内，COD去除率可达90%以上；增加进水盐度，系统的抗冲击能力也较强。1.2.2盐度对活性污泥系统变化规律的研究1.2.2.1盐度对活性污泥群落结构的影响Liu等通过对活性污泥的16SrRNA及FISH分析，研究了污泥中的种群多样[14]性变化，结果显示：除了少量的新类群出现外，变形杆菌和黄杆菌占93%左右。Onuki等在SBR反应器中添加乙酸盐后，研究其活性污泥中的菌群结构，通[15]过利用FlSH和DAPI染色，证明了红环菌属相关菌有聚磷作用，属于积磷菌。Limpiyakom等研究了氨氧化细菌的群落结构，通过分析活性污泥样品的PCR-DGGE图谱，证明了Nnitrosaminesoligotropha类似细菌可以在低氨浓度[16]的废水中大量繁殖。1.2.2.2盐度对活性污泥性能的影响M.S.Moussa等研究了在不同盐浓度的条件下，硝酸菌和亚硝酸菌活性以及活性污泥性能变化。结果显示，盐浓度发生改变时，硝酸菌活性改变更为明显，[17]在一定盐度范围内，驯化后的污泥仍可保持良好的性能。＋3-KargiF等研究了废水COD，NH4-N和P04-P的去除率随盐浓度的提高的变3－化规律。结果表明，盐度不同程度的影响高盐废水的处理效果，P04-P的去除率降低幅度较大。同时，盐度的增加，破坏了活性污泥内原有的群落结构，污泥[18]性能变差。王志霞等通过控制盐浓度，使其在一定范围内逐渐增加，研究了SBR反应器的运行情况。结果表明：污泥性能随着盐浓度的增加呈递增的趋势，出水水质良[19]好。汪善全等采用多种类型的接种污泥，在SSBR中处理高盐废水。研究显示，在盐度不断提高的情况下，驯化出的好氧颗粒污泥可以高效处理含盐废水。同时，得到的污泥与对照组相比，在抗盐度冲击，污泥活性，污泥稳定性等方面都有显3n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用[20]著优势。1.2.3嗜盐菌强化高盐废水的处理投加嗜盐的菌种，改善微生物组成，增强反应主体活性污泥的活性，可大幅度提高SBR法的处理效果，是其它驯化法无法实现的。筛选的菌种来源于海洋或河口底泥、晒盐场底物和其它高盐环境下的活性物质，筛选往往有一定的程序和基因化措施，筛选出的对特定污染物具有较高专性降解能力的嗜盐菌，能够显著[21]提高废水的处理效果。C．R．Woolard等研究了一株中度嗜盐菌对含高盐的苯酚废水的处理效果。经过一定时期的驯化，与普通的活性污泥相比，接种污泥的苯酚去除率，以及污［22］泥性能均有大幅度的提升。崔有为等用海口河底泥培养嗜盐活性污泥，可以实现高效稳定的氨氮去除，证明野生型嗜盐污泥对高盐废水硝化的可行性，为利用嗜盐混合菌群处理高盐废[23]水提供了可能。李维国等将分离出的嗜盐菌接种到SBR反应器中，对高盐制革废水进行处理。研究显示，该嗜盐菌可显著提升高盐制革废水处理效果，废水COD去除率在［24］80％以上。王祖佑等通过接种高效耐盐菌处理石化废水，研究了不同pH、盐度以及外加碳源等对废水处理效果的影响。研究显示，在盐浓度为3％时，COD去除率达[25]到最大；pH值随着处理时间有所下降；外加营养物质对COD的去除率影响不大。国内采用单一嗜盐菌及混合嗜盐菌处理有机废水的研究，如信欣等研究了一[26]株耐盐废水降解菌株的分离与特性；刘秀华等研究了嗜盐菌降解三聚氯氰废水[27]特性。对于混合嗜盐微生物菌群处理有机废水的研究较少。微生物群落在特定的环境下，可形成具有稳定的生物组成的生态位，即为生物处理中活性污泥工艺[23][28]的原理。单一嗜盐菌由于缺乏稳定的生物组成及生物多样性，种群结构单一，在实际废水处理中，很容易出现出水水质不稳定；菌种退化周期短；系统抗冲击[29]能力差等问题。1.3嗜盐菌的特性1.3.1嗜盐菌的分类自然界的高盐环境由于形成过程及所处地理位置不同，其中存在的微生物也4n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用呈现复杂的多样性，主要的微生物类群有绿藻、嗜盐古菌及嗜盐和耐盐的细菌等。依据嗜(耐)盐的程度不同，可分为非嗜盐菌、轻度嗜盐菌、中度嗜盐菌、边缘极[30]端嗜盐菌和极端嗜盐菌五类。耐盐菌属于非嗜盐菌，在很大的盐度范围内均能维持生长。非嗜盐菌的最适生长盐度小于1％。嗜盐细菌与嗜盐古菌和嗜(耐)盐真核生物相比，其代谢类型及生长的盐环境更具多样性，所能耐受的盐浓度范围[22]也更广。1.3.2嗜盐菌的营养结构嗜盐菌为革兰氏阴性菌,多营化能异养，碱性环境中生长，可利用多种碳源；[31]采用二分分裂法进行繁殖，无休眠状态，不产孢子；嗜盐菌菌体大部分呈圆形；外观呈红色、紫色或浅褐色；除少数靠丛生鞭毛缓慢运动外，大多嗜盐菌不运动；大部分嗜盐菌在多种营养物质下均可生长，利用多种电子受体，产生胞外多聚物[32]和溶解性微生物产物等；中度嗜盐菌，极端嗜盐菌，因其特殊的耐盐机理，使[33-35]其区别于一般的微生物，而更适于在高盐环境生长并降解有机物。蛋白质等水解后产生的一些小分子物质，如氨基酸等，可满足部分嗜盐微生物的生长需求。然而，大多数嗜盐菌的生长仅靠基本的碳源和氮源即可满足其营[36]养需求。盐浓度升高，嗜盐微生物需要合成更多的物质来抵抗环境的改变，因[22]而需要更复杂的营养结构来维持生长。1.3.3嗜盐菌的嗜盐机理高盐环境生物随着高盐生态系统中离子组成，盐浓度、pH值、氧气、养分供应等方面的变化而展现出复杂的微生物多样性。细胞内外的渗透压必须保持平衡，才能维持其正常的形态结构及生理功能。处于高渗环境中的生物细胞也需要[37]积累一定的物质来平衡渗透压，保持酶的活性，进而维持细胞的正常生长代谢。同理，嗜盐菌在长期的高盐环境中也形成了特殊的细胞结构以维持正常的生命活动。不同的嗜盐菌依靠不同的嗜盐机理来抵抗高盐环境：嗜盐厌氧菌，嗜盐硫还原菌以及嗜盐古菌依靠积累高浓度钾离子(4～5mol/L)来平衡高渗环境；嗜盐真核生物、嗜盐真细菌和嗜盐甲烷菌则依靠在细胞内积累不同的相容性溶质。如中度嗜盐菌既可以从环境中直接吸收甜菜碱和四氢嘧啶等，也可以通过吸收其底物在细胞内自行合成，这种机制可使微生物在高盐环境中抵抗渗透压的改变，进而[38]具有较强的适应力。5n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用1.4高盐废水生物处理的研究方向目前对高盐废水处理方法的研究，大部分是从高盐环境中筛选嗜盐菌，分离纯化，并进行富集培养，然后接种于高盐废水中，研究其处理效果，进而对高效[25]降解的菌种进行深入研究。利用生物法处理高盐废水技术上是可行的，我们认为今后可对嗜盐菌的培养驯化，处理工艺的改进等方面进行重点研究：（1）活性污泥的驯化，依然存在驯化周期过长，处理工艺复杂等难题，限制了活性污泥工艺在实际高盐废水处理中的广泛应用。同时，高盐废水处理过程中伴随的脱氮问题，大大降低了活性污泥工艺的处理效果，也有待于进一步深入研[39]究。目前，大部分学者研究的方向仍然是驯化活性污泥，使其逐渐耐受一定的[40]盐度，从高盐环境中直接利用高盐污泥处理废水的研究受到一定的技术限制。（2）国内外的研究，更多的是对某些特定的水质，针对生产实践中环境的复杂多变及难以控制的特点，实验室的小试实验要应用于实际生产中，仍有很多问[40]题亟待解决。因此嗜盐菌的降盐机理研究仍将是高盐度废水处理的研究热点，如何利用嗜盐菌的降盐机理，并结合合适的构筑物处理实际的高盐废水，还需进[41]一步的研究和探讨。(3)膜生物反应器以其无法取代的优点，成为当今学者研究的热点，新型生物工艺的应用，将为高盐废水的高效处理开辟新的方法与思路。如何简化嗜盐菌新种的开发和应用；多种基础工艺综合应用；同时研发新的工艺将其应用在高盐[42]废水的处理中，仍是今后研究的热点与难点。1.5PCR-DGGE1.5.1PCR-DGGE技术变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE），[43]是20世纪80年代初期被应用于检测DNA突变的技术。1993年，该技术首次[44]被应用于微生物群落结构及多样性的研究，并取得良好的效果。之后，PCR-DGGE技术便以其独特的优越性，逐渐在微生物群落结构的研究中得到广泛应用。DGGE不同于普通电泳技术区分不同分子量的DNA片段，可以将序列不同的分子量相同的DNA片段检测出来，误差率低，在研究种群多样性及遗传本质方面有着不可替代的优势。当碱基排列组成不同的DNA分子在含梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，DNA分子序列的差异直接决定了解链的温度和速度不同[45]。因此，采用DGGE分析微生物群落结构，为我们研究微生物的遗传多样性及6n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用其在环境中的动态变化提供了更为深入和精确的方法。1.5.2PCR-DGGE的应用传统的菌群动态分析，依赖于菌株的实验室分离纯化，然而不同种类的培养[46]基因其营养成分单一，难以模拟菌群真实生存环境，使可培养的微生物比自然环境中的要少得多，一些已分离纯化的，其形态也与自然环境中的有差异，各种生物特性进而也会受到影响。微生物群体的结构和功能之间相互影响，菌群的种类和数量的构造不同，表现在宏观上的功能也会有差异。DGGE可以摆脱传统纯培养条件的束缚，使更多的微生物种质资源得以被发现和利用，为微生物的群落[47][48]研究开辟了新的途径，精确的反映了群落的生态结构。罗海峰，李慧等均对比了DGGE与传统分析方法在反映群落多样性方面的优劣。实验结果显示，无论实验效率还是精确度方面，DGGE的分析效果均远远优于传统分析方法。1.6课题研究的意义及创新点伴随工业化和城市化进程，我国的需水量和几乎同等数量的污水排放量都在逐年上升。污水治理任务任务逐年增大，社会进步带来的环境代价在水利用上显现的十分突出，解决水污染问题的根本出路在处理，并且工业废水中的高盐废水，是废水处理的主要目标。在高盐度的环境条件下可能出现活性污泥系统的微生物数量减少，有机物及氨氮去除率降低、出水悬浮物浓度增加等现象，严重影响了高盐废水的处理效率。综合目前的研究情况，在一定盐度范围内，大部分基础工艺都可以取得较为理想的处理效果，有机物，氮磷的去除率均可达到国家规定的排放标准。我国丰富的高盐环境，为高盐有机废水的处理提供了广阔的资源优势。优化现有的处理工艺，研究新的降解方法，以期为生产生活中的高盐废水的高效处理提供依据。实验中所得到的嗜（耐）盐菌数量虽然有限，但也为嗜（耐）盐微生物物种资源研究提供材料，丰富嗜（耐）盐菌菌种资源。对筛选的菌株进行生理生化、生物特性、以及对高盐模拟废水的降解等发面的研究，为其应用于生产实践提供可能。序批式间歇反应器(SBR)处理高盐模拟废水的实验中，收集和监测系统运行参数，利用PCR-DGGE技术对污泥驯化不同时期的出水水质做全面监测分析，研究菌群的动态变化与活性污泥降解高盐废水各阶段的相互关系，为高盐废水的生物处理提供数据参考和技术支持。7n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用第二章耐盐微生物的分离筛选及初步鉴定2.1材料及方法2.1.1样品来源本实验的土壤样品取自于盘锦红海滩，样品采集后置于-4℃冰箱保存。2.1.2仪器和设备摇床光学显微镜超净工作台高压蒸汽灭菌锅电热恒温培养箱分光光度计电子分析天平2.1.3培养基富集培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水定容1000ml，pH7.0～7.2高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，NaCl0.5g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，蒸馏水定容1000ml，pH7.4～7.6PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容1000ml分离纯化培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水定容1000ml，pH7.0～7.2高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，NaCl0.5g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，蒸馏水定容1000ml，pH7.4～7.68n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容1000ml生理生化性质鉴定培养基淀粉培养基油脂培养基明胶培养基石蕊牛乳培养基尿素培养基糖发酵培养基醋酸铅培养基柠檬酸盐培养基蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基2.1.4耐盐菌株的分离筛选2.1.4.1富集取土壤样品10g于90mlddH2O中制成10％的土壤悬液，于恒温摇床35℃120r/min振荡培养48h，取1ml土壤悬液分别接种于NaCl浓度为3％、5％、10％、15％、20％的已灭菌的牛肉膏蛋白胨、高氏一号和PDA三种液体富集培养基中35℃培养5d，备用。2.1.4.2筛选纯化取富集后的菌液涂平板，37℃培养至长出明显单菌落，标记编号，挑取单菌落至平板划线培养，反复挑取分离纯化。选取菌落形态特征差异较大的菌株接种于对应盐浓度的斜面中，-4℃冰箱中保存以进行下一步的研究。2.1.4.3菌株的菌落与细胞观察观察在菌株在平板上一定培养时间内所形成菌落的大小、形状、颜色、透明度、边缘、突起、质地、与培养基结合程度等形态特征。用普通光学显微镜观察对数期的染色细胞。9n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用2.1.5菌株的生理生化指标测定1.革兰氏染色实验载玻片涂菌的部位先在火焰上烤一下，除去油脂。用接种环分别取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。涂片在空气中自然干燥后，菌膜朝上，通过火焰2-3次进行固定（以不烫手为宜）。加适量（以能够盖满细菌涂面为好）的结晶紫染色液染色1分钟后缓慢倾去染色液，水洗至流出水无色。滴加碘液，媒染1min后倾去碘液，水洗至流出水无色。吸去残留水，在白色背景下连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。滴加蕃红复染色2min，水洗。吸去残留水晾干。显微镜观察革兰氏阳性菌（G+）呈紫色，革兰氏阴性菌（G-）不易染色，呈红色。阳性细菌记为“+”，阴性记为“-”。2.淀粉水解试验淀粉培养基溶化后，冷至50℃左右制成平板。接种测试菌种后，将平板倒置于37℃温室中培养24小时。滴加少量卢戈氏碘液于平板上，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。透明圈的大小、说明该菌水解淀粉能力的强弱。3.油脂水解试验将溶化的油脂培养基冷至50℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布后，倒平板。将接种待测菌种的平板倒置于37℃温室中培养24小时后，观察平板底层长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。4.明胶液化试验取明胶培养基，以无菌操作用接种针穿刺接种所测菌种，20℃温室中培养2—5天，观察明胶培养基液化情况。5.石蕊牛乳试验取石蕊牛乳培养基试管，接种预测菌种后，置于35℃中培养24—48h。观察培养基颜色变化。石蕊在酸性条件下为红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为白色。培养基凝固且变红为酸凝。6.尿素试验取尿素培养基斜面试管，接种预测菌种后，置于35℃中培养24—48h。观察10n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用培养基颜色变化。尿素酶存在时为红色，无尿素酶时为黄色。7.糖发酵试验在糖发酵培养基中加入指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管。对于能够分解糖类产酸的细菌，溴甲酚紫指示剂可有紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。能够分解糖类产酸的记为“+”，反之为“-”。能够产气的记为“+”，反之为“-”。8.硫化氢试验用接种针将待测菌种穿刺接入醋酸铅培养基中，置37℃中培养48h。观察黑色硫化铅的产生。9.吲哚试验将待测菌种接入蛋白胨水培养基，培养48h后加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min。待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。10.甲基红试验将待测菌种接入葡萄糖蛋白胨水培养基，培养48h后，加入2滴甲基红试剂，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。11.V-P试验将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基的试管中，35℃恒温培养48h后，加入5～10滴40%KOH，然后加入等量的5%α-萘酚溶液，用力震荡，再放入37℃恒温箱中保温15～30min。培养物黄色或类似铜色为阴性，若呈红色，为V-P反应阳性。12.柠檬酸盐试验将待检菌接种于柠檬酸盐斜面培养基中培养48h后，观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色，蓝色为阳性，绿色为阴性。2.1.6菌株的耐盐性测定将纯化后保存于冰箱的斜面取出，制备菌悬液，分别接种于NaCl浓度为0，1％，3％，5％，7.5％，10％，15％，20％的液体培养基中，于35℃摇床中，120r/min震荡培养，采用分光光度计，以不接种菌悬液的对应培养基为空白对11n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用照，比浊法定期取样，平行三次测定菌液的OD600，取平均值。2.2结果与讨论2.2.1耐盐菌株的形态特征通过对土壤悬液的富集，三次平板划线分离，共筛选出24株形态差异明显的耐盐菌株。牛肉膏蛋白胨培养基中耐盐细菌8种，编号1-8；土豆培养基中耐盐真菌7种，编号9-15；高氏一号培养基中耐盐放线菌9种，编号16-24。对筛选出的部分耐盐细菌，耐盐真菌，耐盐放线菌分别采用革兰氏染色法，直接制片法，插片法制片于显微镜下观察菌株形态，如图2.1。12n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图2.1耐盐微生物的显微图片Figure2.1micrographofsalt-tolerantmicroorganism13n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用2.2.2耐盐菌株的生理生化特征反复划线分离得到的24种耐盐微生物，结合菌落，菌体形态特征，进行基本生理生化指标的测定，对其进行初步鉴定。结果如表1，表2所示。表1耐盐微生物生理生化指标Table1Physiologicalandbiochemicalofhalotolerantmicroorgaisms革葡麦甲柠硫淀油明尿蔗乳吲石蕊兰萄芽基VP檬化编粉脂胶素糖糖哚牛乳氏糖糖红试酸氢号水水液试发发试试验染发发试验试试解解化验酵酵验色酵酵验验验1--+产酸+++++---+++2+++产碱+++++---+++3+-+产碱+-+++-+--+-4+-+产碱+-+++-+--+-5--+产酸+-+-+-+--+-6---产碱-++++-+--+-7+-+产碱+++++-+--+-8+-+产碱+---+-+--+-9+++产酸+10+++产酸+11+-+产酸+12+++产酸-13+++产酸+14++-产碱+15---产酸+16+++产酸+17++-产碱-18+-+产酸+19+++产酸+20+-+产酸+21+-+产碱+22+++产酸+23+--产碱-24+--产碱+14n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用表2耐盐菌株的菌落特征及分类鉴定Table2Morphologicalcharacteristicsandclassificationidentificationofhalotolerantstrains菌株菌落形态特征属名编号乳白色，圆形，表面湿润，面积适中，不透丹毒丝菌属（Erysipelothrix1明，中间隆起，边缘辐射状Rosenbach）橙红色，圆形，表面湿润，面积适中，不透丹毒丝菌属（Erysipelothrix2明，中间隆起，边缘辐射状Rosenbach）乳白色，圆形，光滑湿润，面积适中，不透3盐球菌属（HalococcusSchoop）明，中间隆起，边缘齐整不蔓延棕红色，圆形，光滑湿润，面积适中，不透4盐球菌属（HalococcusSchoop）明，中间隆起，边缘齐整不蔓延乳白色，圆形，光滑湿润，面积较大，不透5弗朗西斯氏菌属（Francisella）明，中间扁平，边缘辐射状乳白色，圆形，表面湿润，面积较小，针点乳杆菌属（Lactobacillus6状分布，不透明，中间隆起，边缘辐射状Beijerinck）棕红色，圆形，光滑湿润，面积较小，不透丹毒丝菌属（Erysipelothrix7明，中间隆起，边缘齐整不蔓延，生长缓慢Rosenbach）乳白色，圆形，光滑湿润，面积较小，不透8盐杆菌属（HalococcusSchoop）明，中间隆起，边缘齐整不蔓延，生长缓慢乳白色，圆形，表面湿润，面积适中，不透9链霉菌属（Streptomyces）明，中间扁平，边缘齐整不蔓延乳白色，圆形，表面干燥，大而疏松，不透10链霉菌属（Streptomyces）明，中间隆起，边缘辐射状乳白色，圆形，表面粘稠，光滑湿润，面积链轮丝菌属（Streptoverticillium11适中，半透明，中间隆起，边缘齐整不蔓延Baldacci）土黄色，圆形，光滑湿润，面积较小，不透12链霉菌属（Streptomyces）明，中间隆起，边缘齐整不蔓延乳白色，圆形，表面干燥，大而疏松，不透13小单孢菌属（Micromonospora）明，中间隆起，边缘辐射状中间青绿色，边缘白色，圆形，表面干燥，14鱼孢菌属（Sporichthya）大而疏松，不透明，中间隆起，边缘辐射状乳白色，圆形，表面粘稠，光滑湿润，面积15鱼孢菌属（Sporichthya）适中，半透明，中间隆起，边缘齐整不蔓延橙红色，圆形，表面湿润，面积较小，不透16罗氏菌属（Rothia）明，中间隆起，边缘齐整不蔓延乳白色，圆形，表面干燥，小而致密，不透17罗氏菌属（Rothia）明，中间隆起，边缘齐整不蔓延白色，圆形，表面干燥，面积较小，不透明，18放线杆菌属（Actinobacillus）中间隆起，边缘齐整不蔓延白色，圆形，表面粉末状，并具放射状沟纹，19分枝杆菌属（Mycobacterium）面积较大，不透明，中间隆起15n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用白色，圆形，表面干燥，面积较小，不透明，游动单孢菌属20中间隆起，边缘齐整不蔓延（Planomonospora）淡青色，圆形，表面粉末状，并具放射状沟指孢囊菌属21纹，面积适中，不透明，中间隆起（Dactylosporangium）橙红色，圆形，表面粘稠，光滑湿润，面积22诺卡氏菌属（Nocardia）适中，半透明，中间隆起，边缘齐整不蔓延白色，圆形，表面干燥，小而致密，针点状指孢囊菌属23分布，不透明，中间隆起，边缘齐整不蔓延，（Dactylosporangium）生长缓慢白色，圆形，表面干燥，小而致密，针点状指孢囊菌属24分布，不透明，中间隆起，边缘齐整不蔓延，（Dactylosporangium）生长缓慢2.2.3菌株的耐盐性研究24株耐盐菌斜面，加入等量ddH2O，制备菌悬液。各取1ml菌悬液，均接种于盐浓度为0，1％，3％，5％，7.5％，10％，15％，20％对应液体培养基中，定期取样，用分光光度计平行三次测定OD600，取平均值。菌株的生长盐度范围如图2.2，根据生长曲线对菌株进行耐盐性分类如表3。图2.2菌株生长盐度范围Figure2.2Thegrowthsalinityrangeofstrains图2.2.11号菌株生长盐度范围图2.2.22号菌株生长盐度范围Figure2.2.1Thegrowthsalinityrangeofstrain1Figure2.2.2Thegrowthsalinityrangeofstrain216n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图2.2.33号菌株生长盐度范围图2.2.44号菌株生长盐度范围Figure2.2.3Thegrowthsalinityrangeofstrain3Figure2.2.4Thegrowthsalinityrangeofstrain4图2.55号菌株生长盐度范围图2.67号菌株生长盐度范围Figure2.5Thegrowthsalinityrangeofstrain5Figure2.6Thegrowthsalinityrangeofstrain717n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图2.2.78号菌株生长盐度范围图2.2.89号菌株生长盐度范围Figure2.2.7Thegrowthsalinityrangeofstrain8Figure2.2.8Thegrowthsalinityrangeofstrain9图2.2.910号菌株生长盐度范围图2.2.1011号菌株生长盐度范围Figure2.2.9Thegrowthsalinityrangeofstrain10Figure2.2.10Thegrowthsalinityrangeofstrain1118n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图2.2.1112号菌株生长盐度范围图2.2.1213号菌株生长盐度范围Figure2.2.11Thegrowthsalinityrangeofstrain12Figure2.2.12Thegrowthsalinityrangeofstrain13图2.2.1314号菌株生长盐度范围图2.2.1416号菌株生长盐度范围Figure2.2.13Thegrowthsalinityrangeofstrain14Figure2.2.14Thegrowthsalinityrangeofstrain1619n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图2.2.1517号菌株生长盐度范围图2.2.1618号菌株生长盐度范围Figure2.2.15Thegrowthsalinityrangeofstrain17Figure2.2.16Thegrowthsalinityrangeofstrain18图2.2.1719号菌株生长盐度范围图2.2.1820号菌株生长盐度范围Figure2.2.17Thegrowthsalinityrangeofstrain19Figure2.2.18Thegrowthsalinityrangeofstrain2020n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图2.2.1921号菌株生长盐度范围图2.2.2022号菌株生长盐度范围Figure2.2.19Thegrowthsalinityrangeofstrain21Figure2.2.20Thegrowthsalinityrangeofstrain22图2.2.2123号菌株生长盐度范围图2.2.2224号菌株生长盐度范围Figure2.2.21Thegrowthsalinityrangeofstrain23Figure2.2.22Thegrowthsalinityrangeofstrain2421n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用随着盐度的增加，菌株适应期变长，对数增长期生长速率变慢。如2、4、9、10、11菌株适应期较短，12、13、22、23、24号菌株稳定期较长，代谢活性较高，均可以用于后续生产实践研究。表3菌株的耐盐及最适盐度范围Table3Thesalt-tolerantandoptimalsalinityrangeofstrains1-8：细菌；9-15：真菌；16-24：放线菌菌株编号耐盐范围最适盐度耐盐性划分10～10％0～7.5％耐盐微生物20～20％0～15％耐盐微生物30～15％0～10％耐盐微生物40～15％0～10％耐盐微生物50～15％0～10％耐盐微生物60～15％0～10％耐盐微生物70～15％0～10％耐盐微生物80～20％0～15％耐盐微生物90～15％0～10％耐盐微生物100～20％0～15％耐盐微生物110～15％0～10％耐盐微生物120～20％0～10％耐盐微生物130～20％0～15％耐盐微生物140～25％0～20％极端耐盐微生物150～15％0～7.5％耐盐微生物160～20％0～10％耐盐微生物170～10％0～7.5％耐盐微生物180～10％0～7.5％耐盐微生物190～15％0～10％耐盐微生物203～20％5～10％中度嗜盐微生物211～15％3～10％中度嗜盐微生物220～20％0～15％耐盐微生物230～15％0～7.5％耐盐微生物240～20％0～15％耐盐微生物2.3小结土壤样品中含有丰富的嗜（耐）盐微生物，共分离纯化出24种形态差异明22n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用显，生长盐度范围较广的菌株，其中8株耐盐细菌，7株耐盐真菌，9株耐盐放线菌。比浊法测定菌株在不同盐浓度下的生长曲线，分析菌株的耐盐特性，筛选出的菌株大部分为耐盐微生物，其中，1株极端耐盐微生物，2株中度嗜盐微生物。结合菌株形态和生理生化特征，初步确定其分类地位。23n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用第三章SBR处理高盐模拟废水的研究本实验采用间歇式活性污泥法简称SBR法，此方法因具有处理效率高、运行方式简单灵活、脱氮除磷效果好、不易发生污泥膨胀等优点而被广泛采用。SBR系统有利于微生物逐步适应高盐环境，并且对有机物的生物降解发挥作用。3.1材料及方法3.1.1样品来源本实验的活性污泥来源于沈阳师范大学污水处理厂二沉池底泥。3.1.2仪器和设备高速离心机水浴锅PCR仪电泳仪以及电泳槽Bio-Rad凝胶呈像系统3.1.3SBR反应器SBR反应器装置如图3.1，材料为有机玻璃，有效容积为15L，采用间歇式曝气，每天曝气14h，运行周期为20h，每天换水一次，换水的有效体积为12L，通过空压机压缩的空气向反应器内供气，用转子流量计调节曝气量，控制溶解氧浓度为2mg/L。此装置无二沉池，无回流污泥。实验采用葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4按100:5:1的比例与10％的土壤悬液1000ml、NaCl、自来水配制而的高盐模拟废水COD为1000-1500mg/L。各阶段出水水质稳定后，通过加入不同量NaCl的方式，逐步提高进水盐浓度，来完成耐盐活性污泥的驯化。检测污泥驯化各阶段COD及氨氮的去除率，取驯化不同时期的水样，研究污泥驯化各阶段微生物群落的变化规律，分析优势群体及其动态变化。24n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图3.1SBR反应器Figure3.1ReactionequipmentofSBR1.空气压缩机2.搅拌器3.取样孔3.1.4测定指标实验连续进行210d，2012.6—2013.1，取耐盐活性污泥不同驯化时期的水样经12000r/min离心2min的预处理后，分别测定其COD、氨氮值，作为衡量水质状况的指标。3.1.5水样中总细菌DNA的提取样品总DNA提取方法是影响菌群多样性检测的关键因素，提取出的DNA应尽可能准确的反映样品的实际群落结构。采用的DNA提取方法能否使不同的环境样本中的微生物细胞完全裂解及DNA充分释放，对DGGE结果有显著的影响，进而决定了多样性检测结果的精确度和准确度。综合运用多种提取方法对DNA进行提取，效果明显优于单用一种方法。在实际研究中，应该根据不同样本情况，综合考虑试验目的以及条件等因素选择不同的方法进行研究，以提高DNA产率。本实验采用SK8225基因组DNA快速抽提试剂盒（生物工程上海有限公司）提取。提取步骤：25n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用1.a革兰氏阳性细菌：取1ml水样，加入1.5ml离心管中，室温8,000rpm离心1min,弃上清，收集菌体，反复离心20ml。加入400μlBufferDigestion，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。b革兰氏阴性细菌：取1ml水样，加入1.5ml离心管中，室温8,000rpm离心1min,弃上清，收集菌体，反复离心20ml。加入180μl的溶菌酶溶液（使用前将相应的溶解酶加入到Enzymaticlysisbuffer中，配制成20mg/ml的溶解酶溶液）重悬菌液，37℃水浴30-60min，再加入400μlBufferDigestion，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。(水浴过程中每10min颠倒混匀一次，促进样品裂解，在水浴后加入20μlRNaseA(20mg/ml)，室温放置2-5min，即可除去RNA。)2.加入200μlBufferPB，充分颠倒混匀，-20℃的冰箱放置5min。3.室温10,000rpm离心5min将上清液（500-550μl）转移到新的1.5ml离心管中。（若上清混浊，可再加入等体积氯仿混匀，12,000rpm离心取上清）4.加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3min。室温10,000rpm离心5min，弃上清。5.加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗1-3min(漂洗时一定要使沉淀悬浮起来），10,000rpm离心2min，弃上清。6.重复步骤5一次。7.开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。8.得到的DNA用50-100μlTEBuffer溶解。9.DNA产物0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。3.1.616SrDNA扩增采用引物序列27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT341GC：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG534r：ATTACCGCGGCTGCTGG26n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用27f-1492rPCR条件如下94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸3min，重复35个循环，72℃延伸10min采用25μl的PCR体系：模板1μl，10xBuffer2.5μl，10mmol/LdNTPs0.5μl，F-primer1μl（10pmol/L），R-primer1μl（10pmol/L），5U/μlTag酶0.125μl（MgCl2已添加），ddH2018.875μl1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。341GC-534rPCR条件如下94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，重复33个循环，72℃延伸10min采用50μl的PCR体系：模板(27f-1492rPCR产物稀释10倍)2μl，10xBuffer5μl，10mmol/LdNTPs混合溶液1μl，F-primer2μl（10pmol/L），R-primer2μl（10pmol/L），5U/μlTag酶0.25μl（MgCl2已添加），ddH2037.75μl1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。3.1.7PCR-DGGE制备约1mm厚度，浓度为8％(w／v)，变性剂浓度梯度为35％～60％(100％变性剂组成为7mol/L尿素，40％(v／v)去离子甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶。灌胶室温待其凝固后，清洗胶孔（1×TAE缓冲液），加样20μl，置于1×TAE缓冲液中100V电泳12h。电泳结束后，取下凝胶，置于1XTAE缓冲液中(含1：10000稀释的SYBRGreenI)，于摇床中缓慢避光染色20min。凝胶成像系统(GelDocSystems2000，Bio—Rad)采集凝胶图像，然后用图形分析软件(QuantityOne4.2.3，Bio—Rad)进行分析。3.2结果与讨论3.2.1耐盐活性污泥驯化各阶段的降解性能活性污泥生物相的不断变化，直接影响了系统的出水水质，使污水中有机物27n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用及氨氮浓度也随之发生变化，系统不同驯化阶段的污泥性能，有机负荷及氨氮负荷也呈现一定的相关性。污泥驯化初期，盐浓度为0，活性较差，颜色为黑色，有臭鸡蛋味，曝气2d后，臭味消失，进水COD为1500mg/L，初始COD去除率为52.31％，污泥开始进入驯化阶段。进入成熟期后的活性污泥，污泥颜色变为黑褐色，COD的去除率提高到80％左右，氨氮去除率为70％左右。20d时，由于提高盐浓度为0.5％，COD、氨氮去除率均大幅降低。到40d时，COD和氨氮的去除率均缓慢增加，COD的去除率恢复到90％以上。各驯化阶段的COD，氨氮去除率如图3.2所示。图3.2反应器培养驯化各阶段的处理效果Figure3.2Treatmenteffectforvariousstagesofthecultivationanddomesticationprocesses随着盐浓度逐渐提高发现，在盐度提高的初期，系统受到冲击，抑制了污泥活性，部分微生物由于无法适应高盐环境而死亡，出水水质变差，浊度增加，COD去除率均大幅下降，之后便稳步回升。其中，氨氮的去除率要在COD去除率稳定后才逐步提高。驯化时间越长，系统抗盐度冲击的能力也逐渐增强，最后污泥性能基本稳定，出水COD去除率达到80％左右，氨氮为60％左右。实验中，SBR反应器系统性能基本稳定，对COD、氨氮有较高的去除率，随着驯化时间的增长，在一定盐度范围内受到冲击后，恢复期逐渐变短。3.2.216SrDNA扩增28n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用PCR的扩增结果，受引物的浓度、种类，模板的浓度、纯度，以及扩增条件的设定等多种因素的影响。引物浓度偏高，会增加错配及非特异性扩增的几率，同时，也容易形成引物[49]二聚体，引物浓度偏低，则会降低扩增条带的亮度。使用不同的引物，可获得[50]不同的DGGE指纹图谱。实验室常用的引物为带有GC夹的引物，扩增出的产物[51]能够在DGGE凝胶上较好的分离。扩增模板浓度过高或过低，均会加大非特异性扩增产物，导致条带减弱。PCR反应体系内不同阶段温度及时间的设定对扩增结果也有一定的影响。实验采用细菌通用引物27f-1492r扩增全长，利用其产物进行V3可变区341GC-534r的PCR扩增。电泳结果如图3.3所示，PCR扩增的条带清晰，产物纯度较高，且无杂带，可以进行下一步实验。M#1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#11#12#13#14#15#16#17M#1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#11#12#13#14#15#16#17M图3.3耐盐细菌16SrDNA基因的PCR产物Figure3.3ThePCRproductsof16SrDNAgenefromsalt-tolerantbacteria#1：驯化前，#2：盐度0，5天，#3：0，20天；#4：0.5％，5天，#5：0.5％，20天，#6：0.5％，30天；#7：0.8％，5天，#8：0.8％，15天，#9：0.8％，20天；#10：1％，20天，#11：1％，30天，#12：1％，40天；#13：0.8％，20天，#14：0.8％，40天，#15：0.8％，50天；#16：1％，40天，#17：1％，50天。3.2.3PCR-DGGE电泳29n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用聚丙烯酰胺凝胶的浓度是由样品基因片段大小决定的。常用的凝胶浓度为6%和8%，前者分离大小约500bp的片段，后者为200bp左右。本实验采用的引物为341GC-534r，因此选择8%的凝胶。若研究的样品片段大小未知，设定凝[52]胶梯度，可提高检测的灵敏度和精确度。凝胶浓度的选取以及电泳条件的优化，对DGGE的结果起到至关重要的作用，任何一个选择不恰当都可能导致分辨率降低，序列相似的的DNA片段无法区分，影响后续分析的准确性。PCR扩增产物的纯度也对DGGE有较大的影响。DGGE指纹图谱如图3.4所示。图谱显示，SBR反应器内的菌种丰富度较高，且不同盐度的驯化阶段和同一阶段的不同时期，DGGE带谱的条带数量、位置及条带亮度上均有不同程度的差异。随着驯化时间的增加以及盐浓度的提高，微生物种类先逐渐减少，而后逐步增多，优势菌群显现，污泥驯化完成。说明群落系统的演变是一个渐进的过程。图3.4反应器驯化过程中总细菌的DGGE指纹图谱Figure3.4DGGEfingerprintofdominantbacteriainthecultivationanddomesticationprocesses30n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用由图3.4可知，活性污泥驯化过程中的菌群有以下5类：1.在整个驯化过程中始终作为优势菌群存在，如BandA、B。这些菌群由于适应性较强，在环境发生改变后，依然能够在系统中优势存在。2.存在但不占优势的菌群，如BandC、D。对环境有一定的适应性，在活性污泥系统的处理中也发挥着一定的作用。3.随着污泥驯化而逐渐消失的菌群，如BandN、E、M。由图可以看出，未经耐盐驯化的#1，#2，初始微生物种类十分丰富。随着运行时间的延长，适应性较差的菌群逐渐消失，因而导致这些条带已几乎不可见。4.初期活性被抑制，后期逐渐增多的菌群，如Banda、b、f、m、n。这类菌群更适合在高盐环境生长，随着反应器中盐浓度的提高，逐步成为优势菌群，有助于污泥性能的逐渐稳定。这类菌群将是我们以后研究工作的重点。5.在整个培养驯化期间出现异常的种属，如BandO。O在#11、#15泳道中较亮，即污泥低负荷膨胀期，可能为该时期的指示性微生物。3.2.4QuantityOne软件包分析实验中的图谱分析均采用凝胶定量软件QuantityOne，QuantityOne分析识别TIF格式的文件，其过程包括排除背景，优化图谱；泳道/条带识别；配对及定量分析。软件采用全自动的轨迹定量法，排除人为误差，群落结构可在图谱上得到直接显示。本实验对得到的泳道识别图、系统进化树图和相似性矩阵图作如下分析。3.2.4.1泳道/条带识别以#1为标准做出的17个样品的泳道识别图如3.5所示。泳道中的条带的粗细与其在胶上的密度相对应。31n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图3.5泳道/条带识别图Figure3.5Comparelaneimages3.2.4.2聚类分析由上述条带对比的结果，可根据戴斯系数Cs计算出各样品相似性的矩阵图3.6。最大相似度为75.4％（#9和#11），说明0.8％和1％盐度污泥的群落同源性最高，结构最相似。相似性最小的为4％（#5和#12），说明0.5％和1％盐度污泥的群落同源性最小，相似度大部分集中在20％-30％，说明盐度对微生物群32n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用落结构的多样性有较大影响，随着污泥驯化及种群结构的交替演变，在高盐环境中适应性较强的菌群占据主导地位，群落中各种微生物相互作用，进而决定了污泥系统降解高盐废水的功能。群落相似度较高的还有#5和#13（66.1％），#5和#10（62.8％），#12和#15（58.5％），#8和#9（56.4％），#4和#7（56.1％），#9和#14（54.4％），#6和#10（54％），#10和#13（53.8％），#5和#6（53.7％）。图3.6相似性矩阵图Figure3.6SimilaritymatrixofDGGEpatterns利用相似性矩阵数据，通过UPGMA算法可实现聚类分析，生成系统进化树，如图3.7。将17份泥污样品分为#1、#2、#3、#4、#7（不同盐度的活性污泥驯化初期），#5、#6、#10、#13（污泥驯化中期），#12、#15（污泥低负荷膨胀期），#8、#9、#11、#14、#16、#17（污泥驯化成熟期）四大类群。该结果与活性污泥驯化的不同时期相吻合，说明驯化过程，就是微生物功能菌群逐步演变的过程。33n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用#12，#15说明经长期盐度驯化后的活性污泥系统，由于微生物种群增多，竞争激烈，C/N值降低，营养缺乏，溶氧减少，致使丝状菌的大量繁殖，出现污泥膨胀。降低或提高盐度后，系统受到冲击，原有的微生物菌群结构发生改变，污泥上浮现象得到缓解。图3.7系统树图Figure3.7ClusteringanalysismapofDGGEpatterns3.3小结系统在高盐的选择条件下，耐盐微生物逐渐增多，非耐盐微生物因无法适应而被淘汰，种群结构不断调整，利用微生物间的共生或互生作用，完成耐盐活性污泥的驯化。活性污泥处理废水是靠功能菌群之间相互适应，相互协同作用得以34n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用实现。对活性污泥驯化不同阶段的泥污样品进行PCR-DGGE电泳分析，不同盐度的驯化阶段和同一阶段的不同时期的差异，表现在DGGE图谱上即为条带数量、位置及亮度。随着驯化时间的增加以及盐浓度的提高，种群多样性经历了一个先减少，而后逐渐增多的演变过程，0.8％和1％盐度的污泥，在驯化成熟期群落结构的同源性最高。图谱显示结果精确反映了污泥驯化不同时期群落结构的变化情况。高盐环境下适应性较强的优势菌群占据主导地位，污泥系统中微生物之间相互作用，宏观上即表现出降解高盐废水的功能，标志着耐盐活性污泥驯化完成。DGGE实验受PCR产物的纯度及特异性的影响较大。优化PCR的条件，是增强DGGE结果准确度的基础和前提。PCR-DGGE突破了传统生物培养技术的局限性，使系统内的微生物的群落结构及遗传多样性可以被更精确地描述。然而，DGGE也有缺陷，其指纹图谱无法确定菌群的数量，以及功能基因的表达情况。需综合多种方法才能获取更为完整的样品信息。35n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用第四章混合耐盐菌株的降解特性4.1材料与方法4.1.1材料来源2.1.4.1富集得到的的13种混合菌株4.1.2仪器与设备水质分析仪：多参数水质测定仪（型号：CM-05，北京双晖公司）。取100ml模拟高盐废水于14只250ml的锥形瓶中。经驯化进入稳定期的耐盐活性污泥10ml于锥形瓶中，编号为01#，作为对照。另取2.1.4.1富集的13种混菌各1ml，分别接种于1％盐度模拟废水中，于35℃摇床中，120r/min震荡培养。定期取样测定COD。模拟废水用葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4按100:5:1的比例与自来水、NaCl配制而成，COD为1500mg/L，定期取样测定COD，研究所筛选的耐盐微生物对高盐模拟废水COD的降解性能。4.2结果与讨论实验室因其有限的培养条件，使可培养的微生物比自然环境中的要少得多，因此，为减少菌株遗漏，选用液体富集培养中的混合菌株作研究，定期取样测定COD的去除率，探讨其对高盐废水处理的强化作用。结果如图4.1所示，混合菌株的COD去除率均高于活性污泥，其中混合的耐盐细菌较耐盐真菌和耐盐放线菌的整体效果要好，在盐度20％的培养基中生长的混合耐盐细菌15#的去除效果最好，可达90％以上。36n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用图4.1不同微生物菌群的COD去除率Figure4.1TheremovalrateofCODbetweendifferentmicroorganisms01#活性污泥；11#、12#、13#、14#、15#分别接种3％，5％，10％，15％，20％盐度的牛肉膏蛋白胨液体富集培养基；21#、22#、23#、24#分别接种3％，5％，10％，15％盐度的PDA液体富集培养基；31#、32#、33#、34#分别接种3％，5％，10％，15％盐度的高氏一号液体富集培养基。4.3小结不同菌群相比较普通活性污泥，对高盐模拟废水表现出更强的降解能力。然而，单一的嗜（耐）盐微生物接种于活性污泥后后，会导致污泥上浮，出水水质变差等一系列问题。因此分离筛选的嗜（耐）盐微生物如何应用于反应器中，进一步提高系统的降解效果，仍需要进一步探讨。37n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用第五章结论与展望1.土壤样品中含有丰富的嗜（耐）盐微生物，共分离纯化出24种形态差异明显，生长盐度范围较广的菌株，结合形态和生理学特征，初步确定分类地位。不同菌群相比较普通活性污泥，对高盐模拟废水表现出更强的降解能力。不同种类的培养基因其营养成分的差异而对不同种类的微生物进行富集分离，因此，多种培养基综合利用，将大大提高菌株的分离效率，增强选择性，避免重复较多，种类较少，菌株大量遗漏的情况。同时，现代分子生物学对菌种的鉴定手段依然有赖于能否从环境样品中获得菌株的纯培养。因此，优化培养条件，以获得更多菌种的纯培养，成为各项研究工作得以顺利进行的基础和前提。在今后的工作中，对培养条件进行优化，获得更多菌种的纯培养，丰富盐碱土中可培养耐盐微生物的菌种资源库，将菌株与DGGE结果相结合，对功能菌群进行对应分析，是耐盐微生物应用于高盐废水处理的基础和前提。2.采用逐步提高盐度的方法驯化耐盐活性污泥，驯化过程中，SBR反应器系统性能基本稳定，对COD、氨氮有较高的去除率。高盐环境下适应性较强的优势菌群占据主导地位，污泥系统中微生物之间相互作用，宏观上即表现出降解高盐废水的功能，标志着耐盐活性污泥驯化完成。由于污泥驯化期较长，驯化条件需要严格控制，污泥系统的微生物稳定性不高，因此，要应用于水质成分更为复杂的工业高盐废水中，仍有待于进一步的深入研究。接种高效嗜盐菌、菌群组合以及多种工艺相结合依然是高盐废水研究发展的方向。3.对活性污泥驯化不同阶段的泥污样品进行PCR-DGGE电泳分析，不同盐度的驯化阶段和同一阶段的不同时期的差异，表现在DGGE图谱上即为条带数量、位置及亮度。随着驯化时间的增加以及盐浓度的提高，种群多样性经历了一个先减少，而后逐渐增多的演变过程，0.8％和1％盐度的污泥，在驯化成熟期群落结构的同源性最高。图谱显示结果精确反映了污泥驯化不同时期群落结构的变化情况。今后的工作中，可以对DGGE中的特征条带进行回收纯化测序，进行系统分类学研究，研究耐盐活性污泥中的菌群多样性，尤其是优势菌群及其动态变化情况，为高盐废水的处理提供数据参考和技术指导。4.今后可对如下几个方面进行深入研究：（1）实验中自配的高盐废水营养单一，后期已不能满足大量耐盐菌群的营养需求，导致污泥出现膨胀现象。除了盐浓度，实验中的其它条件如pH、温度、时间、溶氧、进水水质等对污泥性能以及处理效果均有影响，因此优化污泥的驯38n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用化方式，也可以提高SBR的降解性能。（2）活性污泥处理废水是靠功能菌群之间相互适应，相互协同作用得以实现。单一的嗜（耐）盐微生物接种后，会导致污泥上浮，出水水质变差等一系列问题。因此，实验前期分离筛选的嗜（耐）盐微生物如何应用于反应器中，进一步提高系统的降解效果，仍需要进一步探讨。39n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用参考文献[1]LefebvreO.Treatmentoforganicpollutioninindustrialsalinewastewater:aliteraturereview[J].WaterResearch,2006,40:3671-3682.[2]SudarnoU,BatheS,WinterJ,GallertC.Nitrificationinfixed-bedreactorstreatingsalinewastewater[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2010,85(6):2017-2030.[3]CuiYW,PengCY,PengYZ,YeL.EffectsofsaltonmicrobialpopulationsandtreatmentperformanceinpurifyingsalinesewageusingtheMUCTprocess[J].Clean-SoilAirWater,2009,37(8):649-656.[4]ArulazhaganP,VasudevanN.Roleofamoderatelyhalophilicbacterialconsortiuminthebiodegradationofpolyaromatichydrocarbons[J].MarinePollutionBulletin,2009,58(2):256-262.[5]王蓉沙.电絮凝法处理油田污水［J],环境科学研究,1999,12(4):30-32．[6]成广勇.高盐度废水生物处理微生物相动态变化及其与污泥性能相关性研究,青岛大学硕士论文,2009.[7]何键,陈立伟,李顺鹏.高盐度难降解工业废水生化处理的研究[J].中国沼气,2000,18(2):12-16．[8]高欢,周岳溪,胡翔,等．含盐染料废水高温厌氧处理工艺特性研究[J].环境工程,2007,25(3):9-11．[9]陈长兴,付天华.油气田含盐水淡化和污水除盐现状及发展[J].油气田环境保护,1997,7(2):41-43．[10]HAMODAMF,AL-ATTARIMS.Effectofhighsodiumchlorideconcentrationsonactivatedsludgetreatment[J].WaterScienceandTechnology,1995,31(9):61-72．[11]ARDineer,FKargi.Performanceofrotatingbiologica1diessystemtreatingsa1inewastewater[J].ProcessBiochemistry,2001,36:901-906.[12]CJDale.SubmergedbiotowertechnologyfortertiarynitrificationofPoultryabattoirwastewater[J].JournaloftheCharteredInstitutionofwaterandEnvironmentalManagement,2000,11(8):245-257.[13]张明生,齐永红,段宝民.生物接触氧化工艺处理高含盐废水的研究[J].应用化学,2008,37(11):1342-1344．[14]LiuY,ZhangT,FangHH.Microbialcommunityanalysisandperformanceofa40n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用phosphate-removingactivatedsludge[J].Technol.,2005,96(11):1205-1214.[15]OnukiM,SatohH,MinoT.Analysisofmicrobialcommunitythatperformsenhancedbiologicalphosphorusremovalinactivatedsludgefedwithacetate[J].WaterScienceandTechnology,2002,46(1-2):145-153.[16]LimpiyakornT,ShinoharaY,KurisuF,etal.Distributionofammonia-oxidizingbacteriainsewageactivatedsludge:analysisbasedon16SrDNAsequence[J].WaterScienceandTechnology,2004,50(8):9-14.[17]M.S.Moussa,D.U.Sumanasekera.Longtermeffectsofsaltonactivity，populationstructureandflockcharacteristicsinenrichedbacterialculturesofnitrifiers[J].WaterResearch,2006,31(12):2203-2211.[18]F.Kargi,AUygur.SaltinhibitiononbiologicalnutrientremovalfromSalinewastewaterinasequencingbatchreactor[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2004(34):313-318.[19]王志霞,武周虎,王娟.SBR法处理含海水城市污水的脱氮除磷效果[J].工业水处理,2005,25(4):29-34.[20]汪善全,原媛,孔云华,等.好氧颗粒污泥处理高含盐废水研究[J].环境科学,2008,29(1):145-151.[21]陈舒,张培玉,郑猛,等.高盐条件下废水生物脱氮除磷及其工艺研究进展[J].生物技术通讯，2011,22(4):598-602.[22]WoolardCR.Treatmentofhypersalinewastewaterinthesequencingbatchreactor[J].WaterResearch,1995,29(4):1159-1168.[23]崔有为,丁洁然,李晶,等.野生型嗜盐混合菌群处理高盐生活污水的硝化性能[J].化工学报,2011,62(12):3511-3517.[24]李维国,马放,苏俊峰,等．一株中度嗜盐菌的分离鉴定及其强化高盐有机废水处理的研究[J].湖南大学学报,2008,35(2):84-88．[25]王祖佑,马庆霞,关迎春,等.高效耐盐菌处理高浓度石化废水的研究[J].化学与生物工程,2010,27(9):82-84.[26]信欣,王焰新,叶芝祥,等.一株耐盐废水降解菌株的分离与特性[J].环境科学与技术,2009,32(5):17-20.[27]刘秀华,李捍东,王刚,等.嗜盐菌降解三聚氯氰废水特性[J].环境科学研究,2009,22(5):526-530.41n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用[28]Abou-ElelaSI,KamelMM,FawzyME.Biologicaltreatmentofsalinewastewaterusingasalt-tolerantmicroorganism[J].Desalination,2010,250(1):1-5.[29]LimpiyakornT,SonthiphandP,RongsayamanontC,PolprasertC.Abundanceofammonia-oxidizingarchaeaandbacteriainactivatedsludgeoffull-scalewastewatertreatmentplants[J].BioresourceTechnology,2011,102(4):3694-3701.[30]周祯.新疆拜城地区盐矿山嗜盐微生物多样性及其系统演化研究.浙江大学硕士论文.2007:9-10.[31]刘会强,张立丰,韩彬,等.嗜盐菌的研究新进展[J].新疆师范大学学报,2005,24(3):84-88.[32]张锐,曾润颖.极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究[J].微生物学通报,2001,28(4):5-9.[33]周培瑾.嗜盐细菌[J].微生物学通报,1989,(1):31-34.[34]MarquezMC.Ataxonomicstudyofheterotrophichalophilicandnon-halophilicbacteriafromasolarsaltern.JournalofGeneralMicrobiology,1987,133:45-56.[35]田新玉.极端嗜盐细菌和耐盐细菌的区分[J].微生物学报,1990,30(4):314-317.[36]KamekuraM,WallaceR,AlanR,etal.Growthofvibriocosticolaandothermoderatehalophilesinachemicallydifinedminimalmedium.CanadianJournalofMicrobiology,1985,31:870-872.[37]任培根,周培瑾.中度嗜盐菌的研究进展[J].微生物学报,2003,43(3):427-431．[38]刘铁汉,周培瑾.嗜盐微生物[J].微生物学报,1999,23(3).[39]ChowdhuryP,ViraraghavanT,SrinivasanA.Biologicaltreatmentprocessesforfishprocessingwastewater-Areview[J].BioresourceTechnology,2010,101(2):439-449.[40]晁雷,邵雪,胡成,等.高盐废水处理工艺技术研究进展[J].安徽农业科学,2011,39(31):19387-19389.[41]郭艳丽,张培玉,于德爽,等.嗜盐菌与高盐度废水生物处理研究进展[J].环境科学与管理,2008，33(9):79-83.[42]钟璟,韩光鲁,陈群.高盐有机废水处理技术研究新进展[J].化工进展,2012,31(4):920-926.[43]CaiP，LiHY．Detectionofgenemutation．Carcinogenesis，TeratogenesisandMutagenesis，1992，4(4)：55-56．[44]MuyzerG，DeWaalEC，UitterlindenAG．Profilingifcomplexmicrobialpopulationby42n耐盐微生物的筛选及其在高盐废水处理中的应用denaturinggradientgelelectrophoresisanalysisofpolymerasechainreaction-amplifiedgenesencodingfor16SrDNA．AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1993，59(3)：695-700．[45]霍萍萍，耿晓娜，赵宝华．PCR-DGGE法在微生物群落检测中的应用．安徽农业科学．2011，39(14)：8204-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