基于层柱粘土固定辣根过氧化物酶及其在含酚废水处理中的应用 62页

Y870261层柱糕±露定辣根过氯健物酶及其在含酚废水处理中的应用HorseradishPeroxidaseImmobilizedOnPillaredInterlayeredClayanditsApplicationinthe∞reatmentofPhenolicW嚣stewater作者姓锅一。。撼俊．．～学盛类擞堂埋i熬±．．学群、专遵。，．焦整王董。。。磷究方向⋯丝墨越攮筮珏蕉．。。⋯导师放职称。王业盟。教援一．。。．2006筚隼冀5瓣n鼷柱糖±固定辣裰过氧化物酶及其在含酚废水处理中豹应用摘要娃辣根过氧化搦辩阑是亿褥率和固定他酶的催纯性能为摆舔，从蒙脱石糙±矿耪及箕无疆或鸯壤敬瞧产兹孛往遥窭773K滚浇爨褥豹锫麓继稔±灸酶霾定化的适宜载体，进雨研究了酶的固定纯条件：透过DTA、Xl≈D、N2吸附．脱附、FTIR技术对载体和阑定化酶进行了表饺，探讨了酶的固定机理；以含酚废水为处理对象研究了固嫩化酶的催化性能和催化动力学。结果袭明：铝层柱粘土怒～种良好的酶固定化树料，可以通过氯键等作用力将酶固定在其上，固定条{串篱擎，固定化褥率褰；与滚滚酶裰魄，豳定健酶笼理含酪袋窳孵的透宣萤珏氇藏阑更宽，贮藏稳定缝也大大提高，登蕊商一定静锤环使髑靛；当含酚废水浓魔为250mg／L时，固定化酶的用量为O．4U／mL，体系中PEG与苯酚质量比为0．4，H202与苯酚摩尔比为1．5，反应时间为3h，苯酚去除率可选95％以上：辣根过飘化物酶催化氧化酚类化合物的反应机制是乒乓双双反应机制，溶液酶相比予强定他酶对苯酚的綮鄹性更好，但固定化酶在苯酚氧化反疲中表现出最大爱簸速率更太，嚣耪不闲形态豹酶蘑苯酚麴楚瑾难易程度一致。关键词；层柱粘土，酶阐定化，辣根过氧化物酶，含酚废水处瑷，反应动力学nHorseradishPeroxidaseImmobilizedonPillaredInterlayeredClayanditsApplicationintheTreatmentofPhenolicWastewaterAbstractBycomparisonofenzymeimmobilizationyieldandcatalyticperformanceofimmobilizedenzyme，aluminumpillaredinterlayeredclaycalcinedat773KwasselectedouttobeusedasthemostappropriatesupportforinunobilizationofPeroxidaseamongmontmorilloniteanditsinorganicororganicmodifiedsamples+Thus，theimmobilizationconditionsofHRP0nthematerialsuchasdoseofsuppoft，pHvalue,ionicstrengthandimmobilizationtimewereinvestigated。ThesupportandimmobilizedenzymewerecharacterizedbywayofDTA，XRD，F鞠§℃Nra瓠orptionanddesorpfion．Themechanismofenzymeimmobilizationwasdiscussed．TheeamlyticperformanceoftheimmobilizedHRPappliedinthetreatmentofphenolicwastewaterandenzymaticreactionmechanismweFealsostudiedindetail。TheresultsshowedthatAI—PILCWaSapromisingmaterialusedasthesupportforenzymeimmobilization．Enzymecouldbeefficiemlyattachedtothesupport蛾魄遍妻immobilizationyieldundersimpleconditions。Comparedwiththesolubleenzyme，HRPimmobilizedonA1-PILChadbetterstoragestabilityandbroaderappropriateoperatingpHrange，Moreover,immobilizedHRPcouldbemused．Wheninitialconcen拄ationsofphenolwas250mg／L。asweltasthenlassratioofPEG／phenolandthemolarratioofhydrogenperoxide／phenolwere0．4and1．5，respectively，Phenolcouldberemovedover95％ofinitialvalueafterthreehoursretentiontime+ThereactionmechanismofoxidationofphenoliccompoundcatalyzedbyHRPcouldbeconsideredasping-pongkinetics。Freeenzymeexhibitedhigheraffinitytosubstratethanimmobilizedenzyme．However，themaximumreactionvelocityofoxidationofphenolcatalyzedbyboundHRPWaSgreaterthanthatobtainedfromfreeHRP．Thetwoshapeofenzymetookonsimilardifficultyintermsofphenolicwastewatertreatment．Keywords：Aluminapillaredinterlayeredclay,Enzymeimmobilization,HorseradishPeroxidase，phenolicwastewatertreatmentIreactionkinetics珏。n插图清单图1．1HRP的一些结构特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3图1-2函定亿酶的模式示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5图1．3Na基蒙脱石微粒的SEM图片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7图1-4A113聚体结构示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7图l一5A1-PILCi爨100磊殛方向的蹇傍邀镜圈砖⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。．8图2．1蒙脱石粘土矿物结构示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11图2-2层柱粘土制备原理示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11图2—3辣根过氧化物酶的催化循环⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12图2_4Lineweaver-Burk双倒数佟嚣法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．14图3．1苯酚浓度对吸光度的标准曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17图4-1基质粘土和A1．CLC的DTA图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20图4．2不同粘土材料的x一射线衍射图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2l图4．3基震粘土的N2吸附等温裁线圈⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22图4-4673K煅烧的AI．PILC的N2吸附一脱附等温曲线图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22图4．5773K煅烧的A1．PILC的N2吸附一脱附等温曲线图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22图4．6673K煅烧的A1．PILC豹介孔孔径分布圈⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23图4．7773K煅烧的A1．PILC的介孔孔径分布图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23图4—8673K煅烧的A1．PILC的微孔孔径分布图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24图4-9773K煅烧的A1．PILC的微孑L孔径分布图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24图4．10糕士片层堆积模式示意鹫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24图4—11基质粘土经不同温度处理厝的红外谱圈⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25图4．12A1．CLC和不同温度煅烧的A1．PILC的红外谱图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25圈4．13酶粉末、载体和固定化酶的经步}谱图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26圈4一14酶在不同载体上的固定纯得率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26图4—15不同载体上固定化HRP的催化性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27图4一16戏体的用量对酶固定化得率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27图4．17不翔霾载量豹蠢定纯HRP豹健亿蛙毙⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28图4．18pH值对HRP的酶活和固定化得率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28图4．19戊二醛浓度对酶固定化得宰的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29墨4．20圈定化时闻对酶固定化得率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30图4，2l离子强度对酶活和酶固定他得率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30图4．22PEG用量对苯酚去除率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32图4．23光PEG存在时酶用量对苯酚去除率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32圈4．24固定纯酶髑激对苯酚去除率豹影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33V儿n图4．25图4—26图4．27图4．28图4．29图4．30图4．31图4．32图4．33图4．34图4．35图4．36图4．37图4—38图4．39图4．40图4．4lH202用量对苯酚去除率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34pH值对苯酚去除率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35离子强度对酶催化性能的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35反应时间对苯酚去除率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36不同浓度时苯酚的净去除量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37酚液浓度对苯酚去除率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37固定化酶贮藏稳定性实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39溶液酶24h内失活曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40固定化酶不经处理循环使用性结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40溶液酶在丙酮溶液中的失活曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41载体经戊二醛预处理的固定化酶循环使用性结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42不同H202浓度下溶液酶催化苯酚氧化的酶反应动力学曲线⋯⋯⋯43不同H202浓度下固定化酶催化苯酚氧化的酶反应动力学曲线⋯⋯43溶液酶催化苯酚氧化时底物抑制作用的双倒数曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45溶液酶催化苯酚氧化时底物抑制作用的1／v对【s】作图⋯⋯⋯⋯⋯⋯46固定化酶催化苯酚氧化时底物抑制作用的双倒数曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯46固定化酶催化苯酚氧化时底物抑制作用的1／v对【S】作图⋯⋯⋯⋯⋯46n表格清单表l-1酶固定化方法及其特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5表3一l实验用原料和试；}l|汇总表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．。ls表3-2实验蠲仪器和设备汇总表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16表3—3苯酚氧化正交实验条件和实验计划表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．19表4-l酶霾定氆重复实验豹续果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3|表4—2苯酚氧化正交实验结果和数据处理表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38表4—3固定化酶催化反应重笺实验结聚⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39表4-4不同H202浓度下苯酚氧化的酶反应动力学参数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44表4．5H202抑制的动力学常数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47表4．6不同样晶豹CODc，值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48IXn独创性声明本太声骥所呈交羽学霞论文莛零入在弹爹}|；指导下进行静研究工俸及彀褥豹醑究成果。据我所知，除了文中特别加以标洼和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过熬研究域莱，也苓毽含隽获褥．金鍪薹潼盔堂或其恁教育机构的学位或证郫而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在谂文孛作了明确豹说明著袭示巍意。学位论文律者签名：签字目期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解金魍王些盔鍪有关保留、使用学位论文的舰定，有投保留势两国家蠢关部门或机构邀交论文躲复印传秘磁盘，允许论文被查阂帮借阅。本人授权合肥工业大学可以将学位论文的全部成都分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(僚密静学蕴论文在瓣密蕊透藤本授权甍)学位论文作者签名：j4i缓导师签名：寸彳川迅签字日期：20铆6m4-月7日签字日期；细6年啦月ca日学经溶文律蠢毕盈爱去淘工作单位：遥谖遗址：电话：稚编：n致谢本论文是在导师于少明教授的悉心指导和无微不至的关怀下完成的。在论文的撰写过程中，导师提出了具体详细的指导意见，并逐字审阅全文。于老师渊博的学识、细致严谨的治学态度、富于创新的学术思想、忘我工作的敬业精神、平易近人甘当人梯的高尚品质，永远是我学习的榜样。三年来，他在学习、工作和生活上给了我许多关心和照顾，更在科学研究方法、实验技巧、科技论文撰写等诸多方面给了我许多教诲与培养，这将成为我在今后人生道路上汲取道德和学术滋养的基础。我的成长倾注着于老师的心血，在此，我谨向他表示深深的谢意、崇高的敬意和美好的祝愿!论文工作期间，还得到了许多老师的帮助与关怀。本教研室的陈敏老师、应化系的何建波老师、理化测试中心的唐述培老师和杭国培老师等都给我提供了各方面支持和帮助，向他们致以衷心的感谢。还要特别感谢中国科技大学的蒋长龙师兄、万勇师兄，美国佛罗里达大学的梅建国师兄，安徽理工大学的李忠师兄，中国天辰化学工程公司郝文正师兄，黄山学院王靖宇师姐等人给予的诸多帮助，女友在生活上的照顾和精神上的支撑。在三年的学习过程中，许多同学都给予了我最深切的友谊。本课题组的左鹏同学，在实验工作中给了我很大的帮助，另外，任安平、冉亮、余从立、胡晶、吴金华、郭茂峰、常朋朋等同学也从各方面给了我帮助。在此，一并表示由衷的感谢。最后感谢亲友对我的鼓励和支持。难忘师恩，惜别母校!作者：程俊2006年4月Illn第一避前言1。1含酸褒水麓奔1．t．1含酪壤承蘩来源、危害及各国鬣视情况含酚废水是常见的一种高毒性、雅降解且有很滩闻气味的肖机污染物，它广泛来源予磊涟、媒纯王、裁药、蜓脂、纺缓、皮犟、造纸、烽熬、怒斟、油漆、橡获、蠢耱裁晶、本毒砉爨褒、塑辩、瀵毒裁等行垃拉5，蟊轰证厂、漂气厂、石油化工斑姚等排放的废水中，酚含搬可达2000～12000mg／Lt21#1吨酚醛树脂的生产需要排放750L废水，其中含酚爨可达600—42000mg／L[3l。蘩类纯合褥是一静原鍪}震毒辏，对一落生龠令体舔春毒蓉终瘸。酪嚣饺蛋自质凝蓠，使细胞失去滔力，竞其对神经系统有较大的亲和力。人体摄入～键量高浓度的酚能引起急性中毒，甚至死亡；若长期饮用被酚污染的水，会出现慢性中毒，葶l起头痛、头媾、疲劳、失眠、写鸣、馥盎跌及毒枣经系统病症；在为羧瘸拳缎爨瀵毒薅，鼹使铰含有0．00l撵g琵酪类勃囊，邃会产生臭戆；酪遵是一种公认的致癌物。当水体中酚含墩太于5mg／L时，就会使惫中毒死亡；酚的毒性能大大抑制水中微生物的生长速度，影响水的生态平衡。用未经处理的禽酚褒承(酚>'50mgfL)整接灌溉农疆，会使农佟物枯露蠢减产14j。窘酪疲承煞撵藏对环壤造成蕊污絷日盏严重，不纹危害人体健瘫，焉盈造成了农业和濑业的损失，对含酚废水的处理显得日髓重要。防治禽酚废水的污染己引起了器国的普遍繁视，我国将其列为需要重点治理的有毒霄害废水之一，美藿拜保馨将其舞为129耪往宠控裁鲢污染饕之一骖j。在窦黪含翳废零翡处爨中，对高浓庹的含酚废水，通常应首先考虑将酚加以隧收利用；对含酚浓度较低、无回收价值的废水溅经回收处理腊仍留有残余酚的废水，摊放前必须采用合适的处毽技术进纷处理，使乏达到圜窳要求的排放标准(《污水综合撵放标凇》(GB8978．1996)串援定黔为第二类污染麴囊，一、=缓撵鼓滚凌蝣为0。5mg／L，三级排放浓度为2．Omg／L)，以实现经济效益与环境效益的统一。1．1．2含酚废水的处理方法及其特点番蠢，满内终凳鼗客熬凌承靛鬻爝方法主要霄貉理法、纯学法寒生稼法。物理法和化举法主要包括吸附、萃取、气提及蒸馏、离子交换、膜分离、澡娥催化氧化、光化学氧化、超声化学氧化、超临界水氧化等方法和电催化等新技术；垒三纯法努潘性污涎法、生臻貘法襄茨襞法等。玉红娆、繇美玲等天详镪斓述了酚类壤水这些处理方法的优缺点教其适用范mt2,4,tl。总的来讲，这些方法均有显著效果．某些方法在实际应用中是实际可行的，但各种方法从经济性、技术性和使惩性考虑还撵在一定的缺陵，或成本麓，或操作复杂，袋冷化不物纛，蓑生成霄毒翁戮产貔，或楚理藏潮窄等|7-9]；因蕊开发一秘爨窳捷速、囊捷、n廉价、没有有毒副产物产生的处理含酚废水的方法和工艺仍十分必要。自从上世纪80年代Klibanov等人17J首次尝试用过氧化物酶催化氧化废水中酚类和芳香胺类化食物以来，酶佟为一摹孛离效◇一的生物馁纯裁应瘸子食酸类或／和黢炎的工业褒求处理越来越受到入稍的荚浚。近年来，髓着酶酶分离和纯纯技术的进步，酶类产品更易获得，成本大大降低，这提简了酶促反应猩含酚废水处理应用中的可能性。I。2含酪羧零酶毽楚遴麓余1．2．1含酚废水酶促处理的特点酶作为一种生物催化剂，回一般催优剂相比，具有底物专一性、催化离效牲、反应条传瀣零瞧等撬纛，一些矮黻遘孬豹纯学反瘟在骛豹壤稼下§ij壤穰逡完成，酶催化符合绿色化学的要求。对酶的开发利用在20世纪得到了巨大的发展，现已被人们广泛应用在生物技术、生物医学、医药化工、食品酿造等行业，如生物传感器、疾病治疗靼诊断试刹、住学及生物纯学反应豹倦化赛4等fml。每传统豹秘瓒纯学过程秘整镪楚瑾遥程穗眈，酶处毽窍辊废永寿戳下凡个优煮渊：(1)能处理难以降解的宥机化合物；(2)高浓度或低浓度废水都适用；(3)操作时的pH、温度、浓度和盐魔的范围都很宽；(4)不会因生物物质的凝集而减慢处瑗速度，处壤避程匏控铡麓蠖萎孬；《5)零易被毫生貔毒性麴物羧掰捧薏遴。裂弱浆的催纯氧化作用来处理酚类、芳香胺炎、染料类废水的污染是：i眨年来受到重视的新方法，降解的结果有效地降低了有毒有机污染物的含量，同时也降低了潦性，是一种缀有潜力的废水处理方法【121。l。2。2应灏于含酪寝零煞瑾的生物酶应用于宙酚废水处璁的生物酶宥过氧化物酶、酪氮酸酶和漆酶等，NelsonDu始n和ElisaEspositoi攀缨会绍了这些游在废水处联中应用的霹§％性D3]。过载怯穆酶麓继纯授多反应，经都要求有i誊筏往秘，翔遗氧纯氢豹存在来激活；酪氮酸酶和漆酶代表另外一类催化酚类物质氧化的氧化还原酶，它们都需要氧分子的参与。酪氨酸酶又名多酚氧化酶或儿茶酚酶，它催化单酚羟基化生成邻二酚，遘蔼逶过黩氯终爱转健为苯酝H“。濠瓣是一秘含键耱蛋白酶，熬催豫酸类秘震氧化是通i晒个钢离子协弼传递电予和价态变纯实现的H51。在所有的酶类中，豳内外学者对过氧化物酶处理研究得较多【16]。过氧化物酶是一种常见的酶，根据来源的不阈，又可分为槭物过氧化物酶如辣根过氧化物酶、花嶷过氧化物酶翻蕊苹过氧豫携酶，羲貔避氧纯携酶魏徽遘氧纯榜酶，寞蘩遂氧德粝酶黧本袋索过氧化物酶蒋。其中有关辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase，简称HRP)的研究最为广泛⋯J，它是从植物辣根浆中提取出来的一种性质稳定、价格便宜的酶，更重要戆是它能在较宽的浸度、p珏、污染物浓度秘盐度范黧疼保持其镶亿活往。另外，不像其它嶷有同样功能的酶，HRP对肖杌底物静专一经要求不赫。2n胺类、酚类等芳香纯会物均可成为箕底物，因此它糁别逶舍予含多种芳褡牲物质嚣工潼褒承瓣憝瑾【’"雉。泛第寨，辍怼还在医学骚臻诊藜、孩酸分辑、袋秘传感器、生物修复、生物转化、食晶工业等领域中裔麓广泛的应用‘20-2甜。目前，人们已阐明HRP的哦L￡I索原子的一个獭囱结合点与驶链图t-1HRP的～些结构特征上鞠链蕊N瑟予缝合，蹙盘鲤素Fig．1-1SomestructuralcharacteristicsofHRP垂直连接在歉链上(如图1．1所承)；在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原子的结合位点，它们通过一个氢键群与血红素结合区域相连。每个钙原予都是供氧配合体，它们能同时与主肽链上含羰基的氨基酸。侧链上的Asp、Set和Thr，以及一个末端结构水分子结合。钙离子的丢失将会露敬HRP酶活和热稳怒性的下簿，还能搜纛经素戆擒型发生敬变渊。1．2．3酶褥赴毽中存在的阚怒及解决途径酶是由鬣白质组成的，其高级结构对所处的环境十分敏感，一般情况下，对热、强酸、强碱、有机溶剂均不够稳定。在传统的含酚废水酶促处溅中，使用的大多是淤液酶，其容易受废水中其它污染物的影响，稳定性差、易必潘、酶爱矮一次爨鞠藏惫赣懿污染魏、不戆重复谴蔫掰】。分瓷巍疆缝酶数及京翻戆一次往使丽郝大大增加了其佟为倦纯裁的成本，因谣辩在废水处理中徽浓褥蓟推广应用。阑内外学者通过研究发现诸多方法，如酶固定化(immobilization)、原位导向变黔(site．directedmutagenesis)、化学修饰和燮联(chemicalmodificationandcross．1inking)is]，均可以克服上述不足，延长酶的使用寿命，从而降低处理成本。其中懿霾定毽技本是最露毽的，逸是最其套磷究蘸景豹方法，宅誉投可解决贵重静辩瓣回竣、再羁霜、瓣污染阔题，瑟藏霹撵离酶豹稳定性，使酶辩环境的适废能力提高，对于耐酸、耐碱、耐高温等耐极端条件酶的开发舆有极其重要的意义【26】。采用固定化酶催化，还可简化反威操作。使酶促反成浅现连续化、自动化【27】。自从上世纪80年代，有关这方面的论文和专利超过一万篇【281。1。3酶固定能麓奔1．3。1国定豫酶魏研究凝~嚣1916年Nelson和Griffin最先发现了酶的固定化现象后，科学家就开始了n固定化酶的研究工作129l。1967年Chibata及其同事在日本TanakeSeiyaku公司首次实现固定化酶工业化应用，他们将固定化米曲霉(Aspergillusoryzae)的氨基酰化酶酶柱用于拆分合成的外消旋DL．氨基酸得到相应的旋光性对映体，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元【301。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工程以及整个生物工程中占有的重要作用，它在应用上和理论上的巨大潜力吸引了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作，此后，许多单位相继进行了固定化酶和固定化细胞的应用研究【29】。所谓固定化酶就是指通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合或被载体包埋，在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用，它是近代酶工程领域中主要的研究内容之一。与溶液酶相比，固定化酶具有更多的优点【31】；(1)酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高，对热、pH等的稳定性提高，对抑制剂的敏感性降低，有的固定化酶还具有抗蛋白酶分解的特性；(2)反应完成后经过简单的过滤或离心，酶就可以回收再利用，这就降低了生产成本；(3)固定化体系适合于连续化、自动化生产，催化过程容易控制，且产品中不会带进酶蛋白或细胞，改善了后处理过程，提高了酶的利用效率，降低了生产成本。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求【32】。虽然国内外学者对固定化酶的研究取得了丰硕的成果，但真正投入工业化应用的固定化酶却不多，主要原因是固定化使用的试剂和载体成本高；其次是由于固定化效率低，稳定性差，连续操作使用的设备比较复杂。目前，人们正进一步开发更简便、更适用的固定化方法以及性能更加优异的载体材料，以期有更多的固定化酶取得工业规模的应用。1．3．2酶固定化的方法经过四十多年的研究和发展，固定化酶技术已取得了长足的进步，先后开发了多种固定化方法，主要为以下几种132埘】：(1)吸附法。利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法。吸附法包括物理吸附法和离子结合法。工艺简便和条件温和是该方法显著的优点，可供选择的载体涉及天然或合成的无机与有机高分子材料，有时酶的纯化与固定化也可同时实现。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少，但酶附着在载体上，易于脱落。离子结合法是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上用途颇广。(2)包埋法。将酶包埋于聚丙烯酰胺等凝胶的细微n囊中，或包蠼予具农半透性的尼龙浆骣等聚奁物或凝胶内瑟戏露定他酶躲方法。此法较为简便，酶分子仅怒被包域起来，莉未受到化学作用，故可得到活力较高的固定化酶，但是此法对作用于大分子廉物是不遥用的。(3)共价键结合法。将酶蛋白岛不溶性簸体班凝价键形式结合成固定纯酶的方法。根鬻共价键不同又分为重氮法、肽键法和烧基化法。酶与载体的结合较为牢固，酶不易脱落，毽黼反应条侔较兔藕l烈，酶活不兔损失，登销各手续繁杂。(4)交联法。这是使用双功能的试剂与酶分子之间进行分子间的交联的固定化方法。由于酶蛋白的富憝鋈，麴氨基、鹣基帮辣疆!墓，参与魏鬏应，掰辍酶静活往中·&擒造胃能受到影响，而使酶显藩失活。总结各方法的特点如表I-1所列，固定化酶的模式图翔图l一2瑟示，在这些方法孛瘦耀最广泛懿是吸辩法和交联法。表l-1酶固定化方法及其特点Table1-1Methodsofenzymeimmobilizationandtheircharacteristics图1-2瀚定化酶的模式示意图(a)物理吸附法：(b)离子结合法{(c)微囊包埋法；(d)凝胶包埋法；(e)共价结合法；(f)交联法Fig。1-2Modeschemesofenzymeimmobilizationmethods(a)physicaladsorption；(b)ionicbinding；(c)microencapulation；(d)gelentrapment；(e)covalentbinding；(Oeross-linking固定毒乏酶刳务冀季盛矮淀意维持酶静经纯潺注及专一注。由予薅豹裹缀缝稳是凭借氢镳、疏水键和离予键等弱键维持，所以固定化时薅采取尽量温和的条{牛，尽霹熊保护好滚蛋自瓣活性嫠塑。霜定讫酶逐应毫最大魏稳定瞧，爨迭载体不与底物、产物戚反应液发生化学反应。1。3。3鏊豳定{￡戆簸髂n酶毽定佳技零兹竣一孙润题是载葵耱耱静翻鍪与选择，固定纯鹬豹往能就取决予阐定化酶所使用的载体材料的性质和潮寇化方法。近年来辣根过氧化物酶的固定化技术得到了人们的重视，出现了多种固定化方法和载体。但以往采用的多怒化学结合法和凝胶包埋法，且选取的裁体多为有机类载体。如利用羧基基隧凝价偶联至聚丙烯臆膜上【35l，用海藻酸镪凝胶包埋固定【36】，先通过共价偶联壤穗蛋鑫蒺然惹餍蘩瓣爝酝蒎凝菠毫毽睁”，竣歪硅酸乙蘸(TEOS)建蘸驱戆翻备翡溶胶一凝胶包埋固怒p鳓等。但是由予露梳载体本身酌缺陷(机械强度不高，容易破碎)，以及由于戴价结合法反应条件复杂，操作繁琐，引怒酶蛋白高级结构变化，破坏了部分活性中心，因此往往得不到酶活高的酶，从而限制了其在实际中的应用。针对这魃戴体的弱点，人们开发了一些无机类裁体，如多孔玻璃、多我硅球、磁性氧化铁以及多孑L硅酸黧毒苦辩f3朔2I。最近，入{f】还痘用皱米鬏羧袋嚣定HRp[43,441。与窍规载薅穗毙，这魏秃撬载薅耪瓣蠢燮离酶熬稳定蕊和黧低的价格，且眈有机藏体机械强度商、照耐生物降解、更耐化学破坏M瓠。但它们在用于固定化酶时需要活化，载体的制备和固定化过程繁琐，且氨基含量不离L46l，因此研究更加离效、低成本、易于制备的新型固定化栽体和新的固定化方法一直是众多科研工作者的目标。翳靛多孔硅酸盐材料作为酶固定化载镕爨啜零|越来越多嚣内终学卷趁疆竞兴趣[341，屡往穗±氇是一耱多琵硅酸薤薅料。1．4滕柱粘土简介1．4．1展柱粘土的定义及制备臻柱艇±(PillaredInterlayeredClays。篱稼PILCs)是利滗基袋旗±矿鐾在强缀穗分子作震下豹胃彩麟瞧器蘑闫离子煞茸交换缝，逮过芎|入交联裁《Pillaringagent)到粘土层问，经避一步加热、煅烧使褥脱水或脱羟基等，谯粘土层问形成稳定的柱状金属氧化物群，将粘土层问撑开，而得到的一类新猁的类分子筛结构的多孑L材料【471。制备层柱牯土选用的基质糙±必须其餐三个基本条件【48】：(1)屡闯具有霹交换懿鞭离子；(2)买鸯含逶豹离子交换容爱(CEC)；(3)奁溶裁◇缝发生澎骚，激便璃予交换能够进行。多糟糕±矿物可选为基质糖土，目麓研究较多且性能较佳纳基质粘土是蒙脱祗147'4BJ。它是一种硅酸盐矿物，具有2：l屡型的层状构造。即=个硅氧四面体片中夹一个铝氧八面体片所组成的T-O，T屡【49,50]，二者之闯攥欺用氧原子连接。这种四面体片和八蕊体片的紧密堆积结构使其具有高疫鸯澎豹鑫辏接歹4著鸯缀寒豹嚣g度，层惩不荔溪动。蒙聪夏续稳豹层与屡之闯没蠢焚翔静氧或羟基，灏褥层与层鞠结合力缀弱，在溶裁中客翁发生膨张，甚至相邻的两个层可完全分离，即层离。蒙脱前按层间阳离子的不同分为钙基、钠基和锂基等蒙脱石，天然蒙脱石大部分为钙撼。钙基蒙脱石离子交换含量CEC6n毽较小，谯水中分数憾较差i”l。钠基蒙脱石CEC值较大，在水中能掰蹙分数，形成辍薄煞冀，羹厚度接逶一个或几个革挝最藏的簿度，困此在研究中一般都采用钠基蒙脱石，强1-3展示了镳基蒙腻磊叛粒酌SEM嚣冀。赣主矿繇熬这些耱薤表臻精±矿物魏结稳存在着露澎酝毽和层间离予可交换性，是粘土应用静基础。获毽论主讲，翼凝戆送入鞑±鞠1-3Na基蒙脱石激粒的SEM圈片槌邻两个片层耀，除丧溶剡嚣，程Fig，1-3SEMofsodiummontmorillonite粘主片联间能形成稳定孔结构的任showingveryfin。particle$1ZO餐甥爱郯冒终蠹交联裁，蠢掇纯会椽、寄糗金撼整合锈、金属簇辩赛予、聚合羟蒺阳辫予和金满氧化物游胶等郝珂蔹作为交联莉【52l。多数交联粼在活褴能或热稳定性姆方面均存谯缺陷，其中聚羟基阳离子髓研究十分广泛鲍。通过攘制盐粪承麓所褥笺不同聚合耩度豹聚念羟基辩离予，其舂电荷麓、体积大和瓣脱零黢篪飘蒸为稳定靛载纯貔等甓杰，特囊逶会交袋装蒜娶。较多壤醭究攥入麓±瀑舔豹聚合羟瑟鞠臻予莛Al、鼢，筵拜还有Si、越、ice、Cu、Ga、Cr、Mg、Ta、Ni、Bi、Be、B、Nb和Mo锌[531。在众多交麟剂中，只肖聚羟基铝离子的钱学缝戏、结稳静电饕鲍磷究鼗透餐。铝离子取决予铡蘩条{串承熊成[AI(OH)x(H20)6-x]‘卜渺、【A12(OH)x(H20){秘x】妒擀、[A11304(OH)24+x(H20)12一xP料聚髂【s4l，鼷蠹篱稼Al|3聚傣，分子姣楚馥凳【All§04(0I壬)24(H20)l塌静，宅燕～较稳定的Keggin结构Johasson离子，其结构如图l堪所示。它怒由中心铝配悦四蔼体环绕卡二个键配位，℃鬣钵擒成辂辩。本矫究褥浆焉毙转交联蘩。交联裁萼|天到粘土麓间，它们以静电弓{力、范德华力娥氢键掰粘土片层俸用存在于攥问，构成牲予的翦驱体，褥经煅烧脱水期聪羟基转变艘永久、穗嫩、缝搀援整舱稷apolyhedronbStickandhall嚣i4AlB蘩毒辜蘩褥零煮露Fig1-4StructuralschemeofAll30ligomern应众嘱氧能物群，撑嚣皴土片屡，搜层撞旗±基蠢彳￡尺寸毙抟缆沸蚕更大鹣二维孔道结构。图I-5给出了AI．PILC的高储电予鼹微镜图片{561。爨1-5AI-PILC淤100最甏露囱翡舞蘩毫镜嚣片Fig。1-5HREMimagesofAllrPILCalongthe(100)direction嘏and13)l+4．2豢校赣主秘狻攥袍攀性凌层棱鞑±不仅绦黧了基震糙主煞屡凌缝梅，述萼l天了辫戆皴绩-孑I结构秘淫缝缀分，两者协同谗溺，使层柱精主获褥了主客休物覆没膏的物璇耗学穗缀。突出表现为以下几个方面；(I)可调控的多孔性。艨柱粘土的联想结构是由均匀癸奄戆囊满氧纯物柱子樽嚣两令稷锦鹄冀艨形成辩教旃夹心式结橇。它懿魏结稳_墨要镶嚣交联裁在糖主麓瓣壤熬穰纯捧缮形袋，毽括瑟耱类整：一是蠢疆撵雩；憝瓣二雅琵遥；二怒藤穗秸主蠡麓遥遥袭瑟与滚缘(face-to-edge)、边缘与边缘(edge-towedge)相曩吸附形成的“卡片宣”结构。孔结构的规则性、孔径分布状撬受嫠袋糕±戆浓浚、稳健物藏熬辫鹁窳解耱悫、裁备过程爱挺证嚣懿±戆予瓣方法、簸浇溢纛餐条佟影响，臻柱糙主静魏绦梅一般显现为双重孔分褥(韶分斡微魏，熬分粒会魏或太强)157删。篷褥关注鹣楚，分裂采取三耱手澡骞蕊，孔的大小按照空气中加热干燥(air-drying)、真空下冷冻干燥(freezedrying)和超褡爨滚予澡(supercritiealdrying)嬲潮l。装臻笈含金疆氧纯秘柱予是扩太骚露距韵有效方法，例如Si厂n．PILC(60A)，Si／Cr-PILC(47A)，Si／Fe，PILC(63A)州j。层桂粘土掰控的孔尺寸使其在应用中具有择形吸嫩秘分子识别催化蛇能力嗽l。《篓大蛇姥液面积。鏊矮糖主桂亿爱蠢予多筏弼终瓣形成，葵毖袭蕊积显著糖瓷，交藤亲50《穗左右瑶太弱2薅秘500蠢搿6孤。大豹繇袭嚣莰春裁予活缝孛·玉薅葳建分予发登擞多熬有效碰撞，因此魄袭面积对材料黼吸辩和催俄应瘸尤为鬣灏。比表面积戗括外表面移{和微孔内袭砸积两部分，其中内表馘秘的敬变是总比表露积改变黝差要暴爨。(∞讶诿变懿袭蟊酸缝。鬈拣装±丞予凌覆羧疑雩l超憨铃键不饱和造成表面其祷两种酸性中心；Br6nstedt睃性串心和Lewis酸经中心。前者豢要来爨穗主瑟结秘羟蒸，荔受滋度影哟；麓糟主要来源予瀑瀚的金穰毓佬物柱子，冀强度可达甚至越过沸夏的酸性强度。(4)赢的稳定饿。糠定性主骚是蠢撵辩熬热穗定毪窝零熬稳定瞧。鼯英魏缝穆、葳庭接簸瑟裁在窝瀑窝承热嚣境中的稳定状况，主骚源于粘土的艨状结构稳定性和柱体崩蛹的两方面因紫。n(5)塞会功§§基团。在层柱糖±的表嚣和缝构孛，逐存在饕麓能性熬疆，热疆氧烷：：旗---Si．O。Si-=，铝醇基=AlOH，硅醇基=SiOH等。以上这些特镬表明层棱糙土的表面、爆间和结构三个不同层次内存农藩活经和可交憾。它们是层柱粘士应用的基础。1．4．3层棱粘±的痰用层柱粘土研究开发已有近30年的历史，作为一种新型多孔材料已日益受到重援，在谗多领域具有广泛应用{l誊荣。(1)袁瓿反巍催促荆矮城。蒺撞糙土疫雳于石油和精细化工的催化剂或催化剂载体，具有很高的选择性催化活性，如：醇脱水和脱氯反应，醇、飘和氨的反应，辫和羧黢的反应，烯烃的齐聚反疲和裂化反应，烯丙基醇中烯镳的环氯化反应，苯环的烷基化反应，三甲苯蛾化反应，烷基苯脱氢和脱烷基反应等150l。层柱粘土分子筛，是继沸石分子筛芹n磷酸盏分子筛麓，在倦亿工监中具有广泛应焉潜力的獾纯裁箨“。(2)环境保护领域。由于层柱粘士具有比表面积大、孔隙度大等特点，因此可戍用于有机物的吸附、离子交换、络舍秘交换等。茏其慧麓予去滁各类污染裙更摄示密箕瘟矮静潜力。Srinivasan替人使用铝交联蒙脱石除去农药八氯二苯并吲哚，效果超过活性炭，羁瓣该啜瓣麴霹菇釜澎l；我稳瀑鬈维还褒报道中余绥了蘑柱粘±在澹瑾大气孛氮飘化物的研究概况【531，综述了层柱粘土在有机废水处理中的应用研究进展，分绥了层棱糕±嚣形吸瓣、催纯澎式过氧纯穆氧纯窝选择牲走镗纯海解去豫有机污染物的方法，指出了层柱粘土在有机污染物处理领域中广阔的应用前景【651。(3)择影分予薅领域。Yang等A166l罄次掇邋了星棱糙±奁气体动力分离(黪基于气体在层柱材料中扩散性藏异来分离气体的过程)中的应用。他们用层柱粘土作为幼力分离吸附刻，应用予空气以及二甲苯同分舞构体的分离。Baksh等人[67】测定了02、N2、C融、NO、S02在五种层柱粘土(Zr、A1、Cr、Fe、Ti-PILC)中的吸附等溆线，结果表明，cH4／N2农A1．PILC达到吸附平衡时的选择性超过了任何已知的吸附捐。另外，S02／CO程这些屡柱秸±土的平衡吸附选择性也缀高。(4)新型功能材料领域。聚合物中加入少量层柱粘士实现纳米复合后，能使机械澄能丈大掇离，辩燕性能驻著增强删。1．5本课题的来源、目的、意义及研究任务目前，酶固定化使用较多的载体主要有高聚物及多孔无机材料。虽然近年采以离分予聚合物作为酶圈定化裁体的报遂较多，但其结构及性矮决定了它所存在的弱点，如机械强度不高，容易破碎。针对商聚物载体的弱点，人们开发了一些无机类载体。与有机类载体相比，涎机载体在稳定性方面无疑具鸯明显的优势。潮于分予筛具备许多令入感兴趣的性质，如高院表面积、亲水绒憎水性、耐溶剂性、表面富含富能性基团——端部硅烷醇基等，因此，在酶蹰定化方瑟表现穗诱入静前景箨4t。层柱精主氇燕一季申无梳多孔材料，然褥国内乡}较少拿n有文献报道其在酶固定化领域中的应用。本课题组近年来在层柱粘土的制备、改性及应用方面开展了较深入的研究，已积累了～定的经验，取得了一定的研究进展。其中，曹江海曾较系统地研究了铝层柱粘土的制备方法及其作为吸附剂在环境保护中的应用【69】；梅建国曾较系统地研究了钛层柱粘土的制备、改性及其作为催化剂和吸附剂在环境保护中的应用【70l；郝文正曾较系统地研究了PILC固体超强酸催化剂的制备及其在酯合成中的应用【7lJ：任安平较系统地研究了重金属离子在蒙脱石及其改性蒙脱石中的吸附性能【”j。本文在查阅文献及本课题组已有工作的基础上，基于层柱粘土的上述性质，拟研究对酚类物质具有高效催化能力的HRP在层柱粘土上的固定化，并将该固定化酶作为催化剂应用于含酚废水处理中。此课题是粘土矿物学、材料学、酶工程及环境保护学交叉基础上的新生点，如果研究成功将为提高粘土附加值、开拓粘土应用领域增添了新途径，为酶的固定化寻找了新载体，为酶的经济有效利用提供了一种新方法，具有较高的理论研究价值和实际应用意义。本课题为合肥工业大学中青年科技创新群体培养计划资助项目。综上所述，本课题拟开展研究工作为：(1)、不同载体(基质粘土、有机粘土、铝交联粘土、铝层柱粘土等)对HRP的固定化能力的研究，及HRP在最佳载体上的固定化条件的摸索；(2)、通过差热分析(DTA)、X．射线衍射(XRD)、傅立叶变换红外(FTIR)、低温N2吸附脱附等手段对载体材料进行表征，研究载体在酶固定化前后的结构变化，探讨酶固定化机理；(3)、以含酚废水处理为探针反应对固定化酶的催化性能进行评价，研究其最佳的催化条件，并对其储藏稳定性和循环使用性进行考察；(4)、研究反应助剂对固定化酶催化性能的改善作用；(5)、固定化酶催化动力学研究，测定酶反应动力学参数和H202的抑制系数，探讨HRP催化氧化酚类物质的反应机制；(6)、通过CODc，评价含酚废水酶法处理后的产物，探讨固定化酶催化机理，分析酶法在实际含酚废水处理中的可行性。On第二章实验原理2．1层柱粘土的制备原理蒙脱石的四面体片和八面体片中存在着广泛的类质同象替代。四面体片中心离子四配位si“可被A13+、Fe3+甚至P5+和Ti4+等离子替代，八面体片中心离子六配位Al”可被Fe”、Fe2+、M92+、Zn2+、Li+等离子替代。不等价离子的替代使蒙脱石片层带有负电荷，平衡这些负电荷的是层间水化度较高的Ca2+、M孑+、Na+等可交换性阳离子[511(如图2．1所示)。本研究中层柱粘土的制备采用钠基蒙脱石为主体，由Al翟卜“■=～图2-1蒙脱石粘土矿物结构示意图Fig．2-1Ideals仇lcnlreofasmectiteclaymineral金属盐水解形成的低聚带高正电荷的羟基物种作为客体，将大的客体无机羟基阳离子与主体层间的水合Na+进行离子交换反应，交换后的样品经过干燥即得到交联粘土，再经煅烧处理使之进一步脱水和脱羟基，客体形成稳定的金属氧化物柱子，从而把主体片层联结并柱撑开，形成具有开IZl的二维孔道‘631。其制备原理如图2．2所示。fcI带layerId∞ll●calci|蜩幽n图2-2层柱粘土制备原理示意图Fig．2-2SchemeofMechanismofpreparationofPILCs交联粘土在煅烧过程中，A113聚体转化为氧化铝柱、水和电荷平衡质子：2[AIl304(OH)24(H20)12】7+——_+14H++13A1203+41H20一彳n2．2辣根避氧化物酶催化甄化酚类化合物的原理在双氧水存在的条件下，HRPf强催化许多芳香族化合物的聚合反应。催化苯黔聚会过程蛇枫理熟下f73’74l：HRP(Fe3+)+H202————_+Compound-I(1)Compound-l+AH2(aq)———_Compound-ll+AH·(2)Compound—jI+AH2(aq)—————+HRP(Fe3+)+AH·+H20(3)式中Fe3+为HRP的辅因子，AH2为电子供体，常为酚类或芳褥胺化食物，AH·为氧纯后产生的鑫由蘩17”。爱瘫(1)串HRP技H202或低分子濑静青椒过氧化物氧化，失去两个电子嫩成中间化合物I(氧化态为+5价)，该中间体由含氧镶(Fe4+=0)帮一令#}曦阳燕子缝袋；在蘧黯懿反浅(2)中，证合麓l鼓第一令邀予供体AH2上得到一个电予，被还原为中阆化合物II(氧化态为+4价)：反应(3)孛，中阕化舍物鞋钛第二个电子供体AH2上又褥到一令惫子，至l}l：HRP竣还原为初始状态。辣根过氧化物酶的催化循环如图2-3所示。N(his)窆》一c《+叱。弋入毫》一c喾／-窆》一G《H3cX—c妒H3C7、HCompoundH图2-3辣檄过氧化物酶的催化循环Fig+2-3Catalyticcycleofhorseradishperoxidase电子供体被氧化成自由基以质，又可能经过羹排、偶联等非酶反应过程生成溶解经麓静聚合物《A2№等)嘎聚合物在未形藏沉淀褥爨蔚，能继续被氧纯形成长链聚合物(A3H3、舢心等)糍到从溶液中沉淀出来㈣。2．3反应瀚荆对酶的保护滁理在馒用辣根过氧化物酶处理会酚废水时，酶凌黔聚合过程中失活，达到鼹需转化率则要增加酶量，从而增加了处理费用，成为其谯实际应用中豹瓶颈。如何采取一定措施保护反废体系中的酶活，减少其用量是其应用予实际废水处理工艺的关键。HRP失活是多种因素的综合效应。总结文献报道主要有三个因素，其一是HRP在催伉循环书生成没有活性静惰毪中阉产物t771。其二是催纯反应中生成豹酚飘自由攘进攻酶的活性中心，从而导致HRP失活17s,791。其三是在催化反应中垒袋懿聚合产稳滚狡在固定往酶上，包裹了酶静滔槛中，blso．懿l。l王n毒文献报道[13,81-831，攘反应体系中掮入助剂，如聚己二醇(PolyethyleneGlycol，简称PEG)、明胶、硼酸钠、壳聚糖、高分子电解质和蛋翻质等，在处理建浓度‘811或低浓度【82l含酚废水时都可以鼹著降低所需酶攮。其桃理在予它们对产物的浆和性大于酶对产物的亲和性，产物优先与助剂结合，翁效防也酚氧自幽基对酶活性中心的攻蠢和产物对酶的包裹【阱l。在实际应用中，聚乙二醇、萌胶、硼酸镳对酶的保护佟用最佳。碉狡{誊为一种含氮量巅酌有税纯台镪(质量分数18％)，即使擞其最小用量时，仍然有相当的数量存在于溶液中，增加了处理螽废本审靛毒撬氮黧BOD谴，遭藿兹臻胶不仅醛低了酸豹去豫率瑟显菠应嚣聚台物形成不了沉淀。硼酸钠由于其有杀呶荆的性质，对环境有较大的副作用，实际应曩孛缀少暴J毽l。PEG是一耪无毒熬窍凝纯会戆，旱已证实箕薅人类身钵健康没有影响，环境危害相对低，且具有良好的生物适应性【85】。而殿在最适PEG用爨下，发应完成艨，溶液中仅鸯少量的PEG残窝，大部分随沉淀分离逛来。此外在工业上，PEG还具肖价格上的竞争优势弹1。因此，PEG是最具有潜力的助剂，被广泛用作酚类物质酶促处理中HRP的保护剂【871。PEG晌平均摩尔分子威量影晌其作为助剂对酶活的保护作用，当PEG平均分子量大予1000时，其对酶活的保护作用离效显著[sq。不同的研究小组采用了不间平均潆尔分子质量豹PEG，本研究逸取了平均摩尔分子震鬃为4000的PEG。2。4动力攀参数酌测定及黼捉反巍杌翩的确定原邀Michaelis和Menten提出了酶与底物形成中阀复合貔瓣理论，募攫警港著名的米氏方程，很好地将酶反应的速度和底物浓度的关系通过一方程式表达了出来，该式已成为动力学研究的基础【88】。米氏方稷式：V=iv=__可[s粥l式中v为酶促反应速度，【s】为底物浓度，vm。为最大反应速度，而K。即为米氏常数。动力学参数的测定方法很多，～般都是将米氏方程进行变换，然后通过作图法面得，最常用驰是Lineweaver-Burk作图法，又称双倒数{乍图法【88】。它是把米氏方程敬写成：三：上+墨。三VV㈣Vm¨pj选择不感躲fs】，溅定其棚应瓣v，秀鼓l起黠1／[Sl佟图，绘出妻线，癸攘与X轴相交，横轴截距为．I／K。，与纵轴交于1，v。。，如图2-4所示。辣根避氧化物薅属于氧化还原酶类，它对酚类化合甥的催他氧化反应属于双底物酶键反应，其反应通式为A+B+E=E+P+Q。反应中，若酶与底物结合形n1／VJl溉越cj石。／一l，Km01，lS】图2-4Lineweaver-Burk双倒数作图法F毽2-4Lineweaver-BurkdoublereciprocaleonsWuctme氇od成三元络台物称为序列双双机制，若酶与底物不形成三元络合物则为乒乓双双援制。Alberty爱整态动力学努辑，推导密双底貉爱瘫一般豹速度方程鲡下[89,90l：V=蕊蕊蠹檄犏式中：v一酶反应速率，v。。—_A、B都饱和时的最大初速度，砖一B饱和时v=l忿v。。熬A静浓发；醚一A镱帮对v=l彪v。。麓B酶浓度：砖一E+A=EA的解离常数。当固定[B01时：V=铡(米氏方程的一种形式)冀中K1一【Bo]／(x盖+【B。】)，K2=(KA,x三+K畚【B01)／(K：+【Bo])，戳I／v对I／[Ao]作图为线性。在序列双双机制中，固定tB0]取一系列不同的数值时，作图得到的动力学趋线不平行，瑟乒乓双双梳稍的动力学藩线粼相互平行，帮斜率X0‰。为常数。当固定【Ao】时也可以得到类似的结果。因此，根据固定底物不同的浓度辩凌力学隆凌是否平行，瑶激翔舔酶反应燕穿列撬翻还是乒乓辊翻【辨,901。n第三章实验部分3．1实验原料与试剂表3-1实验用原料和试荆汇总表Table3-1Materialsandreagentsofexperiment名称撬搿生产厂家H}WNa蒺蒙脱蠢十六烷基三甲基溴化铵苯酚30％过氧纯氯4．氨基安替比林PEG-4e∞碘酸钾碘饯铘溴酸钾溴化钾磷虢=氢钾磷酸～氢钠柠檬酸镳高锰酸钾二袋忧锰硫代硫酸钠氢氧化钠结龋氯讫铝硝酸银重镑酸舞硫酸噩铁六求虢酸铁(II)铵硫酸银硫酸汞邻藜秽秣浓硫酸浓盐酸可溶性淀粉无农碳酸镑碳酸氢钠丙酮戊二醛RZ=3，A>250U／mg[1302-78嘲，Merck13，1053，}分析纯AR分析绝AR分析纯AR分砉蠹缝AR分析纯AR分板缝AR分析纯AR分析缝AR分耩缒AR分析纯AR分橱缝AR分析纯AR分援缝AR分析纯AR谯缀筑GR分析纯AR分梃缝AR分析纯AR努糖缝AR分析纯AR分援统AR分析纯AR分掇纯AR生他试嗣上海源聚生物技术有限公司Sigma公霹中国凝药(集团)上海化学试剂公司广东泓l头市西陇化工厂广东油头市西陇化工厂国药集团化学试剂有限公司中国藏菸(集戮)主海证擎试藜公键广东汕头市西陇化工厂上海健学试舞《采赡供成站试裁厂北京市化学试剂研究所上海殿火化工厂广东浊头市西蹴化工厂广东汕头市西陇化工厂孛国凝药(集强)上海纯学试齐j公司中国上海试剂工厂天津大茂化学仪器供应站上海人民化工厂合肥医药站化玻部天津夫茂纯学仪器供成站天津太茂化学仪器供应站串嚣上海漓江亿工厂上海东懿化学试剂公司广东浊头枣嚣陇诧工厂中国隰药(集团)上海化学试剂公司贵州省银仁化学试剂厂北京游草医药化工厂研制公司上海薄河精细化学品有限公司中国摆翔诧学试裁厂浙江菱湖化工试剂厂中毽上海蛙毙纯工厂中国宿州化学试剂厂中国隰药(集团)上海化学试赛《公震中国隰药(集团)上海化学试剂公司n3．2实验仪器与设备表3-2实验用仪器和设备汇总表Table3-2Apparatusesofexperiment3。3HRP酶活静测定菰壤遵氧纯臻骛戆活毪弱测定暴弼浚辛逶《Worthington)法戮1，溪{；|；试刘及箕鬻割方法如下：4。氨基安替比林溶液：取810．Omg苯辩(C6HsOH)溶于大终40mL蒸馏水中，加25．0mg4-氨基替比林(C1lH13NaO)，溶解，用蒸馏水定容至50．OOmL。磷酸盐缓冲溶液(pH=7。0)：用磷酸鼠=钠溶液(35．69Na2HP04'2H20溶于蒸馏水，并定容至1000mL)将100mL磷酸：氢钾溶液(27．29KH2V04溶于蒸馏水，并定容至1000．OOmL)的pH值调至7．0。过氧化氢溶液：用蒸馏水将1．0mL过氧化氢(30％H202)定容至100．OOmL，再取出1．00mL用磷酸盐缓冲液将它稀释歪50．00mL。测定步骤：用移液管将1．4mL4-氮基替跑拣溶液和1．5mL过氧化氢溶液穆入～必lcm毙色盈孛，势谲滋至25℃。擞O。lmL0。05～O。25U／mL酶溶液，溪会，n按幼妙表，用分光必度计(波长为510m，耀尔消光系数为7100L+mol-Lcml)以蒸馏水为参比测定吸光度，每隔lmin测一次，崽至每分钟内吸光度的增大值达到稳定为止。按下列公式计算酶活：酶活(U／mL)2丽12,510X,3式中：E5l旷010nm处每分钟内吸光发的增大值；3一反废液的总体积；6．58一1个单位在1min内使吸光度增大6．58。3。4双氧水浓度秘苯酚浓度的测定双氧水浓度的测定采用高锰酸钾法【刚。苯酚浓度豹测定采用溪健滂定法【931移4。氨基安替E＆栋魄琶法斟】。蓑誊逶瘸予高浓度的苯酚溶液，后者适用于低浓度的苯酚溶液。实验测得苯酚浓度——吸光度的标准兹线如图3．1所示：q口口J1口I，z口i'{4P№nm∞n洲1口鲥4^々崎L’翻3．1苯酚浓度对吸光度的标准曲线Fig．3-1Standardcurveofconcentrationofphenoltoabsorption3．5载体的制备邋程及材料的表鬣本实验室的裁期工{擘爨对铝鼷撞糙主螅剃鍪条磐遴露了详缨躲磅究Is9】，本文直接采用其最佳制备条件，具体合成过程如下：配制质艇比为1％的Na基蒙脱嚣悬浮波，掌滠下搅拌24h。将水浴锅瀑度调至80℃，按0H弘l摩尔比必2．4的比例量取一定量O．2mol／L的NaOH溶液在强烈揽拌下滴入到一定量O．2mol／L的A1C13溶液中，滴完后在80℃下再搅拌lh，然聪将交联荆在30℃下水浴老化12h。将交联荆按A1／士比为10mmol／g豹比例逐滴滴入粘±惫浮液中，强烈搅拌，滴宪后再搅拌6h。结束后在30"C下陈化12h。抽滤(或离心)洗涤至用AgN03检验没有AgCI生成为止，在60℃下干燥6h，研磨，200嚣过筛即得铝交联糖土(AluminumCmsslinkedClay，简称Al-CLC)。将铝交联牯土400～500'C煅烧2h褥铝瑟柱秸土(A1．PILC)。17咐哺嘣谢啡妣Ⅲ豫Ⅲ5#e塞2n鸯枫蒙脱石魄割备是农500mL鳇三口烧瓶中避行的，蹙如入滔量蒙脱±和蒸馏水，搅拌至蒙脱土分散均匀后，按季铵盐，土质量比为O．7的比例加入计量的CTAB，在50"C下强烈搅拌1．5h，抽滤分离，用蒸馏水洗涤滤墩至无Br"，滤饼在120℃下干燥4h，冷却、研磨，过200日筛，密封保存。实验邋过DTA、XRD、FT—IR、液氮吸附一脱附等现代测试技术对原土、A1，CLC、鬻定HRP旃后静A1．PILC豹结梅2蓖HRP与裁俸A1．PILC闻静相互{窜瘸进行了研究。DTA测试：氮气流速必20mL／min，舞温速率iO℃融汛。XRD测试：管压为40kV，管流为lOOmA，CuKa辐射，石墨单色器滤波。撩攒速度必1。／min，担{ll钓莛垂为2～504。发数狭缝戈lmm，接牧狻缝戈0．15mm，防反射狭缝03mm。FT-IR测试；K＆压冀，分辨攀为4cm"‘。孔特性测试：SA3100型比表面积孔隙分析仪测定时，样品预先393K脱气4h。OMNISORP。100CX型比表露积孔隙分析仪测定时，撵品预先573K脱气8h。根据液氮吸附-脱附等温线，成用不丽的方法褥到孔性数据。3。6酶固宠化实验称取一定质量的载体加入一定体积一寇酶浓度的HRP溶液中，室温下用聚疆懿乙爆镘裹戆搅拌予磁力揽搀一定时阉，过滤分离，雳蒸镲承冲洗露宠亿酶多次，用沃辛通法测定原酶液和滤液的酶活。由固定化时HRP的用量(总酶活)和翱定化鼷滤液中瓣酶涯慧量计冀HRP固定位褥搴，计葵公式热下：HRP阉定得率=堡堂塑案薹曩主≯×，。。％3．7酶促魇应实验在烧杯中分剐加入已知浓度的苯酚溶液，一定量的助荆(PEG)和A1-PILC固定HRP，控制反应总体积为50mL。在宣温下，置于磁力搅拌器上搅拌至设定时间，盏土玻璃蕊防止箕溅出，献滴期n202开始计时。反应结束后，酴考察其藏复使用性外，加1+1的硫酸调节pH值至小于2，终止反皮，定容歪100．00mL，逶滤，取卷祥分轿荤酚浓度，计算苯酚去滁率，计算公式如下：苯翳去除率=垦塑史苎堕丛蓁主辇篓磊鋈鎏生塑×，。。％腺狻甲零l!|i}葳黧3．8CODcr值的测定CODcr值的测定采用熏铬酸钾法，所需试剂及其配制方法、察验过稷详见文黻[931。n3．9含酚废水酶促处理条体优化实验安排在含酚废水酶促处理单因素实验的基础上选取固定化酶用量、PEG用基、珏2妫用量、苯酚浓度和反斑慰问纛个因素，每个粥素选取露个水平，属“歪交设计助手II”软件辅助设计含酚废水酶倪处理条件优化实验，条件和实验计划表如下：表3-3苯酚氧纯正交实验条件和实验计划袭Table3-3Conditionsandlabplanoforthogonalexperimentsofphenoloxidation19n4．1材料的表征结果4．1．1DTA分析第嚣章结梁与讨论基矮蒙残石粒AI—CLC袭现塞蝴骰的热分辑瞧状，翅爨4．{葳暴，善先纛35～250℃温度范围出现低温吸热谷，其后是350～700℃温度范围内韵第二个吸热谷，最后是800～950℃温嶷下的～个赦热峰。第一个吸热谷是由{{}出吸附求赝引起的吸热效应，层间饱和阳离予和与样品平衡的相对湿度决定了吸热谷系统的大小、形状和温度15“。AI．cLc妞于带络合配位水的All3聚体交换了层阕水会Na+离子，蔽热谷的强度更大，中心温度更离。第二个吸熟铸是由摊出结构水(脱羟箍)所引起的。交联粘土在脱羟熬过程中，先是交联剂岛粘土层褒面Si．OH发生交联反疯麓羟羹，在层闻形成校仡物，鼯±层国现较麓整且具有一定强度的二维孔道结构，再是柱子结构中羟基的脱除，层间柱子塌陷【95】。由图可见交联裁艇羟基与秸±J跨层发生菠盔生成氧纯耪柱是在350～700。C溘度稼蠢瘫较低溢度时完成的，因而层柱粘土制备时煅烧温度控制襁这一温度范围内较为有利。懑发超过8004C露，嚣秘耪葶萼戆冀瑟缝援均舞始酸豁，{三l致罄警瑗大嚣放热峰。整4-1基爱糖±襄A1．CLC翡DTA固Fig，4-IDTAprofilesof(a)originalmontmorilloniteandCo)AI。CLC4。l。2XRD分辑图4．2给出了原士(333K、773K)、AI．CLC及固定HRP前后的A1．PILC的XRD圈。所有毒手料兹dool峰都窭现在20<100的范强蠢，由它稍的其体使置可班看出材料的结构差别。缀过333K干燥6小时后的基质蒙脱石在20=7．200出现一个相对强麓麓赫峰，对寂豹螽蟊润距为12．267A，餐经773K滚浇2夺露君，由予蘩闻承失去。dora峰的20变为9．140，对应的晶面间距变为9．668A。交联后，由于A1137+成功插入戮蒺阕，磊瑟溺距增大兔19。621A，d∞l燎对痤-T20=4。5∥戆戆蓊漳。n773K缓烧2小聪鹾，All37+转交为金鼹氧化物柱，艨闯距璇徽变小为18．947A(204．66。)。dool峰的增强，说明了经过热处理后，蒙脱褥能得到取向有tI葶的层状结构。Mokaya和Jones认为煅烧温度控嚣4在673～773K怒重要的，在这个温度范围内，柱化剂脱水脱羟基196]，运也与DTA的研究结果相一致。另一方颇，交联齐lJAll37+分解时产生质子，生成的质子渗入粘土的八匾体片层间，增熬了垂控糯±靛寨溃往，魄时镭联柱糖i农薤和滋润柱子上产生大量静镀醇墓和徽酸的羟基mJ。大部分HRP可能通过其柒水部位与这些旗团相飘作用(巍键、范德华力稿静电雩}力)固定在层轻精±上，麸蔼阻止了萁流失戮溶液中。秩盈还可猎出，载体固定HRP后，其dool假为18．868A，与A1．PILC相比，并未发生明显变纯，这与文簸【97】爨投邀鹣基震蒙鹱石瓣定HRP嚣鑫嚣阕篷增大憝瑗象不一致。这是由于本研究中层枝粘土通过氧桥按价键将层间柱子和粘士片层牢固地联结形成稳定的结槐，以致HRP分子只毙逶应魏道戆大小部分逢扩教裂载体层问的柱廊中，不能改变其鼎面间距。图4-2不I司粘土材料的x一射线衍射图Fig，4-2XRDpatternsofdifferentclaymaterials4．1．3Nr一吸附脱附分析实验毒鼙霜液氮汲辩一耱辫技术溺定了铺基蒙驻磊鞠暇附等溢线和673K、773K两种温度下煅烧所得A1．PILC样品的吸附一脱附等温线，分别如图4．3、4-4、4-5爨示。嚣雳BET静方法褥翻籀瘦黪跑表瑟穰分巍为37。3m2／g、225．4m2／g和170．3m2／g，孔裙分别为0．0106mL／g、O．1849mL／g和O．1535mL／g。铝层柱粘±瓣毙表甏获蠢我容都较镶基蒙翼筵夏寿缀大提褰，表弱锈矮层裁黾经避入糖±层间，将粘土片层撑开。另外，煅烧温度升高，比表面积和孔容的下降可能是出少量柱予爨塌造成兹。从图4—3可见，原土的N2吸附曲线中吸附量在较低的相对压力时迅速增加，达到一定驰提对聪力屡吸附量增加缓慢，藤筹I型吸瓣等滠线。途类等澄线是微乳吸附剂的特征，这与黎质粘土的层间域(小于Irma)一致。图4-4和4．5中的nn趋势，这碟能是夕}波面的继续吸辫造成数，铝层栋糙土奁较毫的棚对压力范围内的吸附行为与介孔固体的相同。由此可见，两种铝层柱粘土的等温吸附线在较低的相对压力范围内也德台第l型，但程接近馓和蒸气压时呈现出介孔吸附剂的特征掷1。扶两种铝层柱稿土的介孔尺寸分布豳(图4-6、图4-7)可以蕾出，}H强●⋯—’、’’kPw·㈨“H伽吣图4．6673K煅烧的AI—PILC的介孔iL径分布圈Fig．4-6MesoporesizedistributionofAI-PILCcalcinedat673KHL—册虫口^●l’甲’：：}i；；i}7～图4-7773K煅烧的AI-PILC的介孔孔径分布图Fig．4-7MesoporesizedistributionofAI-PILCcalcinedat773K它们的孔径尺寸集中分布在3．8nm为中心的临近微孔的介孔区域内，孔径分布牵，舅癸逐存在饕少量较大豹孑L遂，其强径分布东20nm为中心懿较大蔻阑肉，这可能是吸附等温线表现出上述吸附特征的原因。两种铝层柱粘土的吸附滞后环攘钍，焚形状终会B类潆震繇懿特点，每鼗类型滞磊臻穗应豹魏是距离较近的平行板构成的狭峰【9剐，遮与层柱粘土实际的层柱状结构相一致。前文XRD研究结果表明屡撞数±的晶_l鬟}闯距只必t．89nm，小予辑粒懿孑L径，这是由予层桂粘土的孔径取决于柱间距而非层间距的原因1661。较高温度处理的朦柱粘土介孔尺寸分布圈中峰的强度耀对较弱，这是层阙柱子糍温下烧缝或坍塌鳇缝暴，扶而导致徽孔增多，这也正与微孔孔径尺寸分布图(阕4-8、图4-9)的差异和比表隧积的变化一致。牯土片层交联校化过程中可能会杂乱堆积形成“卡片室”结构(图4—1o)，从而造成铝朦柱粘士具有孔径分布谯20rim为中心的较大藏围内啡¨临虻啪”i耋。il譬嚣-l#(|，{．1君暮l{n的孑L道。以多孔层棱粘土为酶固定化的载体材料，其孑L径大予或接避HRP鲍分子赢径(4．8nm)[97，991，柔褴的HRP能完整地扩散到介孔中。霉夏曾墓l季圈4—8673啦浇驰AI-PILC鹣羧藐魏经分蠢籀Fig．4-8MicroporesizedistributionofAl—PILCcalcinedat673K，lll图4-9773K煅烧的A1．PILC的微孔孑L径分布图Fig．4-9MicroporesizedistributionofAI-PILCcalcinedat773K羲再雷霸王羹雾r留钐雩噩蓦f妇ace⋯-to-f．a姆house．of-cardsIikeaggregation圈4-lo糕圭片层堆积楼式苯意图Fig．4-10Schemeofmodesofclaylayeraggregationedge·to-faceorientation#lI_翌誊￡*i～面n4．1，4FT-IR分析图4-11给出了两种温度下原土的红外光谱图，从中可见两者的峰形和峰的位鼹相同，只是经过773K煅烧的鼹土在3631em-1处对应予未结鑫羟基的搏绩振幼峰更强，说明原土经煅烧后未结合羟麓增多。图4．12给出的是A1．CLC和不阀温度下煅烧的A1-PILC的红外光谱图，AI．CLC在3631cm-1处基本炙吸收峰，经673K缓烧稻，该处出现徽弱的吸收峰，随麓煅烧游度升商，吸收峰强度增大，说明高温煅烧有利于结构裸褥出未结合羟基，这与原士的红外谱图及DTA努耩结采怒一致静。图4-11罄质粘±经不葡溢度处理船的红外谱图Fig．4-11FT-IRspectrumof(a)Originalclaydriedat333Kand秘)Originalclaycalcined敲773K圈4-12AI—CLC耜不鄹漫度煅烧的AI．PILC的级女}谱圈Fig，4-12FT-IRspectrumof(a)AI·PILCcalcinedat773K，(b)AI—PILCcalcinedat673Kand(c)AI-CLCA1一PILC与HRP的稠互作用穗是通过簿立许变换红矫光谱来研究的，如图4．13所示，游离HRP有三个特征吸收峰：1655cm“处的C=O键伸缩振动吸收蜂，1540cm。娃豹N一}重键弯蘧振劫蔽狡蟑及1071em’筑豹C-N键律缩擞动蔽n收峰。在固定化酶的红终必谱图上，这些燎均出现，但未搬现Al-pILC落豳上3631cm-1处对应予未结合羟基的伸缩振动蜂，且3392em-1处N-H镳伸缩振动谱带宽化。这些说明酶与AI．PILC上来结合嬲羟基发生了氢键缔合。酶成功固定在A1一PILC上。酶与载体闻的相互律霜导致2876～2961cm4处归属为HRP骨架主链c—H键的振动吸收，527cm“处和470cm。1处矜别对_陂于AI．PILC的Si．0键霸si一0一Al键酌簿螽豢动吸收，在固定织酶静谱强中均绢显减弱。圈4一13酶餐末、载俸帮龋定纯酶静红外谱图Fig．4-13FT-IRspectrumof(a)AI-PILCcalcinedat773K，《砩FreeHRPand(c)immobilizedHRPonAI—PILC4．2酶固寇化实验4。2。1最毯载体静选择实验中取载体用量为0A5mg／U，将繁质粘土、A1．CLC及不同湿度煅烧的AI—PILC分剐船入歪13．40U／mL酌HRP酶溶液中，制得不同载休阐定化酶。分别取20U围定化酶作含酚废水氧化的催化剂，反成体系中PEG与苯酚质量比为图4m14酶在不同载体上的固定化得率Figt4-14Enzymeimmobilizationyieldsofdifferentsupports∞嚣o$、口哥暑‘星舞一霉EEiE套￡un洼：Enzyme1一原土固定化酶：Enzyme2一有机土固空化酶；＆鳓e3—铝交袋土辫定纯酶#Enzyme4—673K煅烧的铝层柱土嘲定化酶Enzyme5一"3K煅烧的铬屡桂±麟定佳醵豳4—15不同载体上固定化HRP的催化性能Fig+4-15CatalyticperformancesofHRPimmobilizedOildifferentsupports2：5，过氧纯氢与苯酪静簿尔魄为3：2。遵遘笼较HRP在这些载体上静裁定纯得率和这蚺固定化酶对含酚废水的催化性能，得出773K煅烧的AI．PILC为最佳载俸，结巢熟圈4-14、4。15掰示。簇覆蒙栽虿逶过吸辫对酶有一定豹固载髓力，酶能部分进入层间，但酶的活性中心可能发生改变。另外撩质蒙脱石的分敞性、悬浮性好，片屡霹糖包裹寒进入联阕戆鹜，导致撼性中心与疯物鹣接皴受整，以墩催化活性大大降低【9”。AI—CLC由于聚合羟基阳离子的插入，对酶的吸附能力大大提离，但出于层闼物体积大，终用力小，续构松教，使褥阑定的懿仍不能充分与底物接触，催化涌性较低。A1．CLC经过煅烧，带电荷的桩子前驱物发生脱水和脱羟基及废，生成中性盼氨化物棱永久越撑开粘土片层，形成稳定靛结构，同时产生大基未结龠的羟基，如铝静基=AIOH，硅醇基--=SiOH等，增加了对酶的圃载能力。400～500。C的煅烧温度对层校粘土层柱状结构的形成是至美蓬妥的骖q，由筑井竞谱W翔，较高温度簸烧后豹产物未结合酌羟基吸收峰更强，此时栽体与酶间的作用力更强，以致酶保持了较高的催化活性。4．2．2载俸用量韵彩晌5'。。椭。警。iZ禹⋯l。{暑。l。0102O}0,40IDOHⅣlup∞ff／mgU’鹜4-16裁嚣蠡各矮量对魏固定诧褥率静彩构Fig．4-16EffectofdoseofsuppononHRPenzymeimmobilizationyield母～∞w量**叠Ⅻ##so￡尊Ⅲn用不闻质量的AI．PILC固定同样量的HRP，酶固定化得率随载体用量的变化如图4．16所示。随潜载体用量的增加，吸附中心增多，酶阐定化得率增大。攀经质爨靛载俸酉载的酶减少。弱栉爨(20U)的嚣定位酶由予载体静增多，与底物碰撞的几率交大，镁纯活性提高，如图4一t7所示。综合酶阐定纯得率帮潮定化酶催化性能得出，固定每单位的HRP需要载体的量大于0．45mg。图4-17不同固载麓的固定他HRP的催化性能Fig．4-17CatalyticperformancesofimmobilizedHRPwithdifferentonloading4．2．3pH懂的影响固定化时体系的pH值不仅影响酶韵活度。而且影响酶的固定化得举。文献报道中多以磷酸盐缓冲溶液来稳定体系的pH饿，但未给出原刚1001。图4．18给出了此缓冲体系中不阅pH值时HRP的槌对活发和酶的固定化褥率。由图W曼：HRP静滔发遗pH俊秀意丽爵离，6～9为最佼范围，这与文献【18】一致；毽酶固定化褥率随pH值升高而显著降低，当pH值火于7时接近零。实验还研究了酶在同样条件、非缓冲体系中(此时pH值为4．9嶷右)的固定化得率为98．21％：霜0．01mol／L瓣HCl鞫NaOH溶滚羧割酶霞定鼗反应傣系戆雄篷，当磷链在圈4*{8pH值对HRP的酶活翱瓣定佳褥率的影响Fig．4-18EffectofpHvalueOnrelmiveenzymeactivityofHRPandenzymeimmobilizationyield水、是工荨》w≯口g∞巨可；#霎∞g僦船髀蚰嚣。水～≈摹HS∞月日11冒F5s∞E}#斟n5．4左右时，酶固定化得率为93．45％；当pH值在8．0和9．8间波动时，酶固定化得率为0。这与磷酸盐缓冲体系中酶固定化得率的变化趋势熄一致的。但非缓冲体系巾的酶固定亿褥率更离。HRP可戳透过簸镶、静毫弓l力秘共徐键等幸筝霞力固定在簸俸上，pH德越低，由予藏离子的电子诱导效应，飘键越易形成，酶的亲水性基团．CONH2与载体表面的功能性基团作用力越强。HRP越易固定。pH值升掇7．0以上，溶液中游离羟基增多，酶与载体间的氢键又无法形成，静电弓l力等其它臻震力，l、，鑫定瓣酶在洗涤霹怼落，鞋致HRP戆霾载量接_l莛零。pH值对潮载效果的影响从另一方丽验证了红外液征中推测的氯键机制。文献[691报道了A1一PILC在酸性范围(pH假为4．1～6．6)30分钟内对浓度为50ppm的磷酸根离予寅很强的吸附能力，且随pH值舞高吸辨率由100％降低至77。16％，说凌HRP豢缓；孛薅系中与j≥缓狰诲祭牢熬霉定纯褥率豹差舞蔻翻磷酸疆离予较易在越-pILC上吸附，占据了大量的吸附中心造成的。由上可风：HRP只在酸性条件下才能固定在载体上，pH值越低，固定化效果越好；固定化时不调节体系驰pH镶羧§l达到理憋豹匿载效暮，竣磷酸楚缓潞体系控制体系戆蠼僮爱嚣不利酶酌溺定。4．2．4交联剂戊二醚的影响圈4-19戊=醚浓度对酶固定化得率的影响Fig。4-19EffectofconcentrationofglutaraldehydeOnenzymeimmobilizationyield菠二蘸{睾兔一耱双功藐交联赛萼，其势子两溃麓嚣拿醛蒸霹|：圭分剐与羧俸及酶分子上的氨基以五碳桥的形式党联起来，来强化载体的强度．提高固定化酶的稳定性，因而在酶羽定化中得到广泛应用[87,101,1021，尤其魑在以海藻酸盐和壳聚耱为裁体款酶固定纯研究孛f鼢‘嘲。本疆究也考察了戊二蒺浓度对HRP在A1一PILC上固定纯的影响。将O．Ig载体分别在15mLl％、3％、5％、15％、25％的戊二麟水溶液中磁力搅拌1h，分离出载体，用蒸馏水洗涤多次，加入4．1U／mL的酶液30。OmL，搅拌45min，分离、洗涤，测定滤液酶活总避。HRP在不同浓度戎二簸处理夔载侮上戆霾定托褥率磐霾4。19掰示。绥莱袭鞠，载嚣经戊二醛$～％％Sl#li$女∞n处毽艇菰不髑予酶静弱您，疆着戎二醛浓嶷熬舞裹，酶固定仡褥攀下降。这是因为戊二醛浓度增加时，戊二醛与载体发生烫强烈的交联反应。交联程度从载体袭灏至内部，由强到弱，呈梯度降弱。另外，高浓度戊二醛猩躐体表面形成更加敞密的聚电解质膜，抑制了酶的扩散，阏此，戊二醛浓度增加时，酶固定他得睾下降。这与IdaGenta研究戊二醛对药物在徽胶囊释放影响一致lI蛳。但是，波二醛对鼗钵透露袭藤掺馋，霹略微毅蛰霸定魏酶鹣疆嚣馊溺毪，觅嚣文中其体阐述。4．2．s固定化时间的影响；舳il，。la。转图4-20固定化时间对酶围定化得率的影响Fig．4-20EffectoftimeonHRPenzymeimmobilizationyieldHRP能迅速固定在鲇-PILC上，当用0．29Al—PILC固定400UHRP时，15分镑戆酶露定像得率趋予稳定，接近100％，细弱4．20瑟示，耄_l魄可霓AI．PILC愚～耱较姆静酶固定纯载体，霾载靖闷短，褥率商。两文if交[36，97，lOO]报遴HRP固定至其他几种载体上所需的时间至少为l小时，且固定化得帛相对较低。4．2．6离子强度的影响I∞i拜p鼍。§75w口韩釜坤l。喜{”蓦量件弛图4-2l离子强度对酶活和酶固定化得率的影响Fig．4-21EffectofionicstrengthonactivityoffreeHRPandenzymeimmobilizationyield3en文献[107，t081搬道固定化对离子强度会影响酶固定化的效果，为了礤究这个影响，实验以中性的NaCl来改嶷溶液中的离子强度，结果如图4—2l所示，离子强度对酶活的影响也程同图中展示。酶活受离子强度影响很小，随鹦子强度的增大，酶的掴对活度略微减小，这可能是由予盐溶液影响了酶在溶液中的构象导致的，但离子强度对酶固定化的影响显著。随着缓冲溶液离子强度的提高，酶霹载量逐渐下降，这是霞兔涟着离子强度静灞藏，离子稻A1．PILC表面功能基团的相互作用增强，削弱了端部羟旗与酶分予基团之间的相互作用。4．2。7小结通过以上实验对HRP在AI．PILC上的固定化条件的磺究，可以得出如下结论；(1)、在考察的几种载体中，773K级烧的A1．PILC是辩固定纯的最佳虢体，红外分析缩果表明酶通过氯键或其它作用力固定在载体的表面上和孔邋中；(2)、茂二簸对载俸的颈楚瑷、俸系中离子强度翡增大璃不鞴于酶豹西定纯；(3)、体系的pH值影响HRP的活性及其在载体上的固寇化得率，pH值越低，活性越拳，固定像效采熬蟹。鋈定辩无器缓摔溶液控麓体系静蛰}差值；(4)、当载俸用量为每单做活度酶不小于0．45mg时，固定15分钟后酶的固定化得率近100％。取露襻量戆载体积弱搀量静薅，京不弱噻阙接上述最佳条{孛重复潮定琵实验，结果如表4-1所示，七次实验中酶的固定化得率平均值为99．10％，标准偏差为O。74％，谈骥酶霪定纯实验薰复性较好。袭4-1酶圆定化羹复实验的结果Tablo4-IDatasheetofrepeatedexperimentsofenzymeimmobilization序母1234567酶固定化褥率／％98．9199+8798。9099．2499．7499．3797。654．3酶促处理含酚废水实验4。3+1PEG罴曼豹影翡PEG能在固定化酶驸避形成保护层，阻止催化过程中形成的酚氧自由基对酶话往中心静进攻。另卦，与固定亿HRP相院，PEG对聚合产物肖更大酌亲和性，大部分聚合物优先与其偶联，从而有效阻止聚食物在固定化HRP上的吸附，浚免酶豹满往中心被惫裹，大大减缓了琢谨静失灞速率，延长了酶的使用瀚期。实验原理部分对这个保护机理进行了详细的探讨。为了评价PEG作为反应助剂在会聚废承楚理露对嚣定能HRP鹃绦护效暴，及确定处瓒不同浓浚麴含酝凌承时PEG的最佳用激，实验研究了两种不同浓度酚液体系中PEG的加入量对苯酚去除率戆影嚷，其它反疲条箨为体系孛糨岛与苯夔熬黪尔毙为1、霾定纯酶用擞为0．4U／mL、反应时间为4h，实验结果如图4．22所示。对于两种不同浓度的羚液来说，不加PEG验辩娱，黔驰去除攀纹为20％左农。堡燕薅若PEG燕入凝的增加，直到mPEc／m。h。。。l(质量比)为0,4时，苯酚去除率直线增加，而后n薹l藿葛喜墨0002040．6n31．010I416tn咖／m““鹜4-22PEG羽量对苯酪去豫攀的影晌Fig．4-22EffectofPEGOntheefficiencyofphenolremovalasafunctionofinitialphenolconcentrations]／／”j厂—≤㈨⋯。⋯”{／-▲-e一-2∽53辆,5mg。＆t．‰Immotld㈣llzed。“”””诊／-一一一一一“”{．———一L———。一图4-23元PEG存在时酶用爨对苯酚岳除率的影响Fig．4-23EffectofdoseofenzymeOnefficiencyofphenolremovalintheabsenceofPEG缓慢地增大到最大值，此时mpEcSm。h锄ol约等于1．0。再增加PEG用量时，苯酚静去除率爱嚣有微小豹下降。这秀筑是由予过量静PEG对酶稳高级结稳宥影响。结果表明，最佳PEG加入量与溶液中初始苯酚浓度呈线性关系。这个结论与Nakamoto耨Machida靛绥慕戮l一教，爰瘦体系孛苯酚浓庭越毫，形或秘酚氧蠢由基及产擞的聚合物沉淀也就越多，要分散它们从而有效减缓酶失活所需的PEG量逸麟越大。实验还考察了没有PEG参与，菸宅条终辐弱辩溺定耗懿热入量对苯酚去除率的影响。从图4．23所示的结果可以看出：酶用量的增大能提高苯酚去除搴，毽髂系中鸯PEG存农鼓影嚷更显萋；显定傀薅匏攫纯效暴傻予溶液酶，苯酚浓度升高时，固定化酶的用量较大时举酚去除率仍较低。以上实验泌明：PEG对酶遗的保护l乍用骧曼，不仅显萋提嶷了苯酚去除率，两且大大降低了酶的阁量。当mpEG／m。h。。。I等于0．4时，再增加PEG的詹对苯酚的去除率并无疆著改蒜，而且此时苯酚的去除率已经超过了92％。从减少排放废水中有极物豹含量和操作费用考虑，在以下窟验中，PEG的加入质量均为体系中苯酚质n鬃懿0，4傣。4，3。2固定耗酶聪量的彩躺鬻4．24攘透了在季瓣辩滚滚发下，AI-PILC嚣是HRP熬入璧越簿酚去豫攀抟澎瞧。爨痤嚣廷辩葵系串强02与苯黔耱露零凌瓷1，爱癜簿瓣凳4h，凌阐器缝襞霹酝灌定筵HRP戆≤}露毒效缝蠹豫笨懿。其壤蘧撬莲与滚滚酶懿罐键撬瑗糯阕，翔翦文簸述。蠹’}确定载辖韬藻捡拣±对苯瓣蘸去豫霉兹黪噙，逡行了搬下实验：在摇固瓣条锌下，加入簿爨豹A卜黻LC代替At。PILC瓣定}珏骠，黪槊袋麓AI-PILC邋过催能柿物理吸掰寸侔翔对苯酚去除率的露献粮小(<3％)，国此W知酚的去除主要是由予AI，PILC嘲斑HRP的催化作用导致的。N口?口-■{碍Q,ll确№§№dHRP《*tfu，m一图404固定化酶用鬣对举酚去除率的影响Fig。4-24Ef搀clofimmobilizedHRPdoseOntheefficiencyofphenolremovalasafunctionofinitialphenolconcentrations娄秘始辇酪滚疫分涮为t05，5瓣錾热、253．5獭g纯，对盛熬A1．PILC毽意HRP热入嚣努黧为0．IUImL秘0．2U／mL辩，苯酚髓去除率六魏在8瓣6藏右。瞧虢燕说，～令单位的固怒纯HRP可以去昧lmg发套的酸，这个催他效祭和Klibanov簿人{燃擐遵夔渗浚藩镬稼散累一致。麴祭霾霆撼藜热天堂灌燕羹03U／mL，体系串浆苯酪可鬻囊去豫竣滚度甄予2mg／L，达蘩≯藿家蕊定熬三豢簿鼓棘猴，髓怒簿僬了蘩翡壤键效攀，辩每纂爨溪宠稼I-臻．P去豫摹辩鹣蘩。蠹予鞋歉P瓣徐樯第爨，酶鹣费瘸～燕是酶挺凝威柱袭农处理串熬瓶颈，困建褒实舔纛鼷求皮警器帮黢豹提裹荚毽谯效率。4．3．3H202用量的影响蜜验磷究了H202麓激对苯瓣毒蟓攀的影噙，反应孛滏宠豫酶瓣入繁海0。《珏怒k爱应辩秘梵4魏，结采麓囊嬉如5辨添。凳爨囊双氧窳爨辩浓度遘菇，骥羧鞠露l酶灏{{毋l，擞{睾对采取溺鼗嬲八骥裁农靛方法，每3够}镑肉邋瓣蕊入2+0mL旗爨浓发为0．3％豹H202溶液，直婪设定荆鹫。由予残留双载承豹狂在会影响港黥浓塞翡分疆，反霾嚣搿巍撵漂郄热入少IMn02，羧蠢嚣枣露魏童至秃气潦产蒌专￡2薯基盖奄器毒强譬器nO0，530●}B075MolarratiootHp2ophenol图4-25H202蠲量对苯瓣去豫率的影响Fig．4-25EffectofH202doseontheefficiencyofphenolremovalasafunctionofinitialphenolconcentrations生为止，以使过量的双氧水分解，过滤后取滤液分析。由图4-25可知当苯酚去除率达到最大时，H202和苯酚的黪尔比近似为1．5。当Mm02加曲刚(摩尔比)小于l时，苯酚去酴率与双氯水浓魔呈线性关系；溺M}120∞山h。l大于1．5时，随着粳氧水浓度的增加，酚去除率反而呈下降趋势。这是由于固定化酶催化酚类物质的聚合是依靠活往中心的铁离子酌价态的交纯采传递电予的，当双氧承浓度超过一定值时，因双氧水的氧化作用使郏分铁离子被氧化成高价态，从而失去了谨纯功戆#疆。实验串褥羁的媛佳MP,202fMphe僦为1．5，Hewson帮Dunford报道酶促反威中理论计量比是0．5【7孔，而Nicell等人的研究表明反应中酚与H202的纯学计量魄为I：l辩阁，哥虢褥弱苯翳静最大转纯攀。I-1202疆论需簧量与实际需要凝之间的差异是多种因索造成的，其中煅重要的一点是催化过糨中的产物为魄二聚体大戆多聚俸。翔暴反寂产椽二聚傣竞全不溶予拳，薅么爰应豹M№02，MDhenol即为0．5，当二聚体不能形成沉淀析出时，可以继续魇应形成三聚傣残受大熬多聚傣，直到形或沉淀放溶液审爨出。这些过程都要溃耗氆02，辨以H202的消耗量就比理论值高踏J。4。3．4爱瘫pH簸憨影璃HRP的等电点为9．O[⋯1，酶蛋白分子上有很多酸性、碱性氨基酸残基，随pH蓬豹交亿哥娃予不霜鹃解骞袄态，麸i嚣会直接影嫡与蕊物的结合，或者影桶酶的空间结构以致影响酶的活性⋯21。固定化后，酶分子处于与溶液状态相差极大戆载俸徽环境条俘下，鼯致了；篷氧纯耱稳在国跫亿螽最逶宣瓣薅{发生交纯。一般说来，带负电载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶，其最适宜的pH值较溶滚黪穰毫，帮囱碱蛙方囱移魂，这是因曳多凝骤窝子载髂吸弓|溶液孛豹阳离予，包括H+，使其附着于载体寝面，结果使固定化酶扩敝层H+浓度比阚围的外部溶液麓，露镳羧，这撂穸}郝添滚孛鲍砖l基必须自碱憋猿移，劣§％援淡微珏境终躅，使其可表现酶的最大活力。反之，使用带珏：电荷载体固定的酶其最适pH慎向酸—％I一§#§l。IJq蓦≈》g日嚣n性德移l¨3】。'∞一巷韩l昙∞羞暮柏S薹znO图4，26pH值对苯酚去除率的影响Fig．4-26EffectofpHvalueOiltheefficiencyof盐enolremoval为了确定A1-PILC固定HRP处理含酚废水的最佳pH范围，在磷酸赫或柠檬酸盐缓冲体系中，进行了一系列的实验，实验条馋选取上述各罄医素实验中最佳的点，结果如圈4．26所示。从中可以褥出，溶液酶的最佳pH值范围在6～9，这与Nieell等人删的报道一致。HRP固定化后遗用的pH值范围交宽为4。5～9．3。pH假范围向酸性方向扩大可以由铝层柱粕土的徽环境效成来解释。在越．PILC载体的表颇存在露未反J瓯睫子化的Si．OH，它能阻止质子靠近载体表面，从而德载钵表黼附近溶液的pH值眈童体溶液偏高，傻得HRP催仡酚类化合物的表观pH值降低。实际废水的pH值是微酸到微碱性，因此A1．PILC固定HRP戆较好遗逶敷予实舔凌求处爨。在鲶疆蓠螽不需诵节废水静pH值，不仅节销了废水处理中调节pH值的费用，还降低了设备的腐蚀损耗。内于没脊缓冲溶液翡爰疯体系p辩篷略夸于7，农霾定纯酶静最逶工俸蔻圈肉，阂魏，实验都可在没有缓冲溶液的体系中进行，以下实验都不添加缓冲溶液。4．3．5离子强度秘影确；：r≮l{～～～t喜珥l一。一8州“州。“898-ll曲jn为了考察离子强度对酶活的影响，取蝴同量固定化酶秘溶液酶各六份，以NaCI为离子强度调节剂，分别在不同离予强度条件(O～lmol／L)下测定两种形态酶催化的苯酚去除率，继果如图4-27所示。当反应体系中NaCI浓度逐渐升高科孪，两种酶活性都随之减小，但潜液酶呈现由较大程度的掷制作阁。文献【114】报邋较高的离子强度有利于酶的解离，而任何一种基团的解离形式发生变化都将後酶转入“无活髓”狡态，离子强度静影缩与酶灞性帮谯的解离形式有关#强l。酶阉定化詹，能削弱酶与反应体系中离子的作用，从而降低抑制作用。4．3。6覆液靖溺酌影璃05191∞1辨2∞2503∞Reactionlime，mh图4-28反应时间对苯鼢去除翠的影响Fig．4-28EffectofreactiontimeOI]efficiencyofphenolremoval加入A1-PILC圈定化HRP和双飘水后，反应体系颜色或即变成黄棕色，随着反虑时间的延长，溶液的颜色迅速由黄棕色向棕色、黑色变化，港酚逐濒形成聚合物戳溺态出现在溶液巾。不如双氧永或AL-PZLC圈定HRP都躐察不到溶液颜色的变化。由图4。28可知，不同苯酚浓度的反应体系，谯开始的20min内，固定／t,HRP倦纯苯酚聚合静爱应速攀是籀当恢静，苯酚韵去除率超j遣了50％，雨随精反应时间的延长，到T90min腋，由于反应体系中底物(苯酚、双氧水)的减少弱国定纯HRP的失活，反盛逐渐趋囱平缓。旋应速率可潋逶道其它方法翔快，Entezariill61等人报道增加酶的浓度和引进超声分散可以加速酶反应。Klibanov[791等爻投遴嚣群麓酶耀璧，分熬蕊入，帮滋翡显缩短这爨穗嚣去豫率的时间。4．3．7鼙滚滚度酌影响处理高浓度含酚废水(>1000mg／L)的方法通常分为二步：先对废水中高含量的苯酚殿衍生物进行颈处理，包括溶剂帮取、浓缩回收或加醛茅珏酸遣行缩聚等方法，使苯酚质蹙浓度降至1000mg／L以下；然臌进行二级处理，达到排放要隶【i”l。，—，叫，10，j^乎一葛器g一譬w墨等舟t曼瓣n文献报道工业中禽酚废水浓度一般从微量到几百毫克每升f821，因此实验考察了20U的圃定化HRP在50raL不同初始苯酚浓度溶液中的催化能力，其它反应条馋为器因素最佳蕊，为了达到尽量好的去滁效果，催毒乏爱瘫时阗大予碡h。初始浓度不同露，苯酪靛净去除煮不同，结果鲡强4—29所示。在实验的苯鼯浓O200帅0e∞l∞1∞01200Phonol∞n∞BhIIon，mg·LI霾4-29不弱浓度嚣苯聚熬净去羚量Fig．4-29Massofphenolremovalatdifferentconcentration度范围内固定化HRP对苯酚的去除都有一定的催化效果，苯酚的净去除擞随苯酚的襁贻浓度增大蕊增加。当苯酚浓度低于600mg／L时，笨酚的净去除鬃与苯赘豹秘鲶浓度残委魄，其惹苯黪熬洚去除耋酶裔蹭热，霆定纯酶懿镬纯黢宠酝乎达到极限。从苯酚去除率与苯酚初始浓度的荧系(图4-30)W知：当苯酚浓度较低时，固定化酶也不能彻底催化瓴化污染物；当苯酚浓度为300mg／L时，苯酚去除察最离。低予越滚度时，苯懿去除率虽然较低，毽体暴中残余斡苯黔懿量较少。这可能是宙予体系中PEG的分散作用，在西定纯酶酣近形成边界艨，增大了苯酚与酶的活性中心的碰撞阻力，导致体系中低浓度的苯酚不能彻底被催化氧化掉。从以上实验可以看出，固定化酶谯较宽浓度范围内对含酚废水处理豢其蠢骏妊豹谨纯效采，实舔疲麓孛霹隘终为颈楚鬓工芑与其它楚毽方法连O±∞4伸曲0a呻10001200P№删∞∞ew口越bnt哪L。强4-30酸滚滚整对摹酪去豫攀静影豌Fig．4-30Effectofphenolconcentrationontheefficiencyofphenolremoval∞躺摊”坩0口鞲￡～甍藿2受wo^鼍嚣莓《纂n用，从而发挥酶促处理的最大效熬。4．3．8反应条件的优化襄验遥遘孳嚣素实辍发瑶：对鏊定纯酶经纯效条影懿钓霞索缀多，蔟串匿怒纯酶用缴、PEG用量、H202用量、苯酚浓度、反应时间的影响较为显著，本研究通过正交实验遴一步疆究了这咒个嚣索越霾定纯HRP偻纯经麓瓣影嚷+蜜验安撵已在第三章中阐述。研究结果如表4．2所列。表412苯酚氧纯正交实验结果联数据处理袭Table4-2Datashcetoforthogonatexperiments因素露定纯酶尾量PEG用量H202用蘩苯醣浓度反瘫黠闽实验结鬃燃实验1实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9实验实验14实验151l57．25l265．221369．451450．422l23473．38214358．82234l284．232432180．533l34264．613243l75．873124891363421396．894142392．05423l4100．004324168，99塞整!i主一!i!!：!≥．均值160．85871．82372．84084．59370．660均篷274，24074．97776．12081．79074．998均值381．68378．00878．64876．15779．303均毽486，74378+44275．64260，71078+290极差26．1586．6195．80823．8838．643——_m———_-一’_——。——————””一。”1’’—’———9“”’“一峦歪交实验缝莱虿躲；器嚣索瓣实验彩镌鹩大，l、簇穿燕霾定繇薅溺量>苯酪浓发>反应时间>PEG用量>H202用量；苯酚去除率随固毙化酶用量、PEG用量增大嚣璜大：至{2。2震量存褒最佳毽，罄抟系孛Hz02与苯黪豹摩尔滋秀l+5；实验中初始苯酚浓度对苯酚去除率影响较大，钥始苯酚浓度较低时苯酚去除率较高；苯敬氧让集巾在反应开热爨戆lh，继续反应苯酚熬去除率交纯不大。这些缕粟热单闵素条件基本一致。n绥余孳毽素实验抟臻暴逸联嚣霆毪骜熬簸经徨凭条{孛为：鹭禽黔废拳戆浓瘦为250mg／L时。每麓升滚水需O．4U瀚定佬酶，体系中PEG与苯酚的质量比为2／5，H202岛苯酚的摩尔比为3／2，反应时间为3h，质成光器缓冲体系撩倦8pH值。此条俘下七次炎验结采知表4．3掰莉，苯酚去陈率激满为98．36％，最低为93．27‰平均傻为96．04％，标壤偏差为1．78％。在上述祭传下，以溶液酶取代霞定纯懿，苯酚去滁搴为95，90％，酶霆迩他蘑不莰没毒簿低蕻整纯效果，嚣且罐鸯珏了一垫德点。袭4_3固定纯酶疆纯反威爨复囊验结果Table4-3Resultofrepealedexperimentsofimmobilizedenzymecatalyticreaction4。3．9《、缝通泣戳主实验对A1-PILC固定纯HⅪ，在禽酚泼永处理中的键纯靛能研究，可以锝出如下结论：(1)、凝己二醇作为反应助浏能有效地减缓固滗化酶的失活，使苯粉晌去除率1螽20％盥稽提高至495％戳上{(2)、与溶液酶相魄，固定化酶催化孵遁用的p}噬范围更巍，鼠受离予强度的影响鬓小；(3)、固定他酶在较宽浓度蕊濑巍瓣食酪覆痰燕攥帮其蠢薮磐鹣镤纯效熙，程宅誉链镯残蕊纯氧斑污染耪；(4)、溺定诧酶在簸能催纯条俘下能去酴溶液中96。04％窆E右苯酚，与溶液蘸静镤豫效聚差不多。4．4圈建化酶稳定性实验4，4。1镩蔽稳定饿Storagelm4，day醒4-3l贮藏不弼融闻后熬固定他酶镁恁苯酚去滁率Fig。4-3lEfficiencyof癫enolremovalcatalyzedbyimmobilizedHRPofdifferentstoragetime为了考察A1-PILC阉蹴化HRP的贮存稳定性，HRP经A1。PILC同定化后不缝子爆，立骤封装予玻璩糕巾，饕予踩籍绦移《碡℃)。每臻一定瓣溜，取爨毽论量为20U牌AI—PILC固定HRP，在含酚废水最佳处理工艺条件下考察其催化性n能，结果如图4—31所示。由图可知，贮存两个星期后的固定化辣根过氧化物酶处理含酚废水的效果并未降低。一个月后，苯酚去除率还有81．OO％，两个月后下降到35．94％。而溶液HRP储备液平时也需保存在冰箱中，随放星时间的增加测定荧光响应值降低，放置5天后，荧光响应值降至原响应值的50％以下，且不能熏复使用Ill2I。Pfieeter和Becker也曾报道在室温或4"C条件下保存溶液HRP的活性每天降低10％11is]。实验考察了24h内酶溶液失活的曲线，如图4．32所示，结果与文献报道一致。HRP经固定化后贮藏稳定性大大提高，原因在于HRP与载体结合后，酶活性中心所处的微环境发生了变化，固定化后酶的蛋白结构更稳定，活性中心得到了保护，不易受外界环境影响。因此固定化酶与溶液酶相比更容易保存，适合长期使用。Time，h图4．32溶液酶24h内失活曲线Fig．4-32InactivationcurveofsolubleHRPin24h4．4．2循环使用性及其改善和溶液酶不同，固定化酶可以从溶液中分离出来循环使用。为了考察A1-PILC固定HRP的循环使用性，每次反应后把固定化酶过滤分离出来，用蒸圈4．33固定化酶不经处理循环使用性结果Fig．4-33ResultofreusabilityofimmobilizedHRPwithoutanyothertreatment∞仙帅邗曲知柏册术、j菩■tEN5i毒∞￡Il—I■●■●●■∞帅∞o术=≈§￡E≈c盖芑分c∞∞E茄n壤拳瀵淡蔻次，立嚣霜予下次镳热菠痤。实验镳暴拯篷垂33辫添，《躲瓣羲疆定化HRP循环使用次数的增加，纂对苯酚的袅陈率迅速下降，循环使用4次后，固定化HRP对苯酚驰去躲率仅为4．94％。这谶瞬阉定纯酶摆偻他釜妻程中移在失活现皴。翔慕在健亿反应中簿{蕊聚合稳熬分子璧。使之聚合度下降，乃瑟笼淡淀生蔽，鼹赣在继往反纛续索屠稳健炎潘羹酶舞燮，蒋会疆嘉霾定键酶麓镶嚣捷震注。文皴辫螽】蠢遂在滚液HRP壤终爨含酸菠拳繇键筵莲逮纛孛萼iA怒声势毅接术，蕊缎时体系颜色逖邋鼹成棕熊色，且茏淡淀生成。本研究墩将超声分散技术弓I入宙酚废水酶促成应中，反应条件参港文献[116】，体系中皇I芝酚浓度为105．5mg／L，测定酶促疑座中超声套散对苯酚去滁率鲍影响，缝暴技瑷：溶液酶镤髭穗攀酪去豫率受98菇S冁，与文藏摄道蕊臻梁羧运，毽酃鬣予100％；褥霆定纯酶臻拖静摹酪去蒎率爨抵，霞襄72。87％。在藏撵象嚣下秣磁办撼箨蛰我莛声分敝+笨酚去除率都达翱100％。说明超声结敝掇能加速及疯，撇小产物钓聚台壤，能蔟对酶活鸯影嘲。这是由予超声波瓣游诞反应豹影响怒个稼合皴疲，耪璞方鞭，超声波黥遁；窭翮速扩散过程来减少瓣的包裹，它也W以对酶翡结构产生澎蟪，导致酶潼拣巾·§有效谯瓣改变；傀攀方覆，超声生成虢羟基爨盎基舞熊了憋赡美溪驻瓣。辩耩键羧率鳇下舞霹熊靛是滚援嚣鬟太予教掇箨瓣蕊黎累，鬻宠往薅鹱兹过程中，纛予戆雾癸羧苓簸巍羚骞效遮蒋黩褴较大羲瓣定蘧酶努敞，还可能改交了酶的构象，导致了其倦化效率更低。燕验原理部分已舟绍了酶失溜的三种可自＆蛾径；一是酶岛H302反应，如化合妨*l帮佳舍携．】l与避爨翡H202反应生艘誉瓣黪失活物霞；=怒游离鲢跨氧蠡蠹鏊笃酶囊痉，导蒙一耱袅活瓣姨态；三憝苯臻耩会玺簌稳溅淀耪霰蒸薅，番被卷燕超来，获蒙酶瓣活往孛套蘧塞。祷翁种途径与酶毽菠盛枫瑾考美，零易改燮，但丙酮等有机溶剂可以溶勰反应过程巾艇成的低聚物lll91，反应艏将固定继瓣分离逛寒爱这黧浚潮浸逡絮鼹滚勰骥魏糍褒瑟豹霾傣产戆，这部分失滔嘲4*34滚液酶在雨酮涔溅巾的失堰益线Fig。4-34Inaefivafioncurveoffre2}释撵inthesolutionofacetone霉、空，#莓爱譬Np$孽≈m嚣一n的酶可能得以再生，固定化酶循环使用性将褥到改善。实骏选用50％(V／V)的丙酮溶液为褥生液，首先考察了游离HRP在该溶液的失活情况，其相对活性随时间的变化如图4．34所示。从中可知，随赘时间的增长，酶活在下降，但前十分镑影响不大，选敬为罐纯反应爱麓再生时闯。按照蓠述循环实验豹条件，霉生处理后前两次催化的结果分别为84．72％和4320％，说明该处理有利于固定化酶鹣德嚣甓震洼静波善。实验还研究了戊二醛交联的固定化酶的循环使用性，用不同浓度戊二醚溶液辩载俸：l鼗行该娃壤60min，分褒浚涤嚣溺予酶霆迩犯，实验结暴艇圈4．35瑟示，从前文可知，戊二醛溶液预处理的载体对酶固载性能下降，假从图中可见其对循环使用性很蠢帮助。龙其是5％灼戊二醛溶波预处理熬载体豳定的酶罐诧循环性最好。如果在每次间歇反应中间用50％丙酮溶液洗涤固定化酶，则第二次至第四次的结果分别为85．84％、72．91％、24．83％，中闯鼹次略露提高，但第四次反而下降，这是洗涤分离过程中酶的损失造成的。1‘d●Cyde6m日5圈4-35载髂经戊二酸预处理翡圈定纯酶循环使麓性结采Fig．4-35ResultofreusabilityofimmobilizedHRPwithsupportpretreatedbygtutamldehydeofdifferentconcentrateion4．4．3小绐通过戳上实验对固定能酶稳定性费研究，可以得出如下结论：(1)、HRP经A1，PILC固定后，储藏稳定性得到提高；(2)、超声分散能加速反廒，减小产物煞黎舍废，毽其对薅活畜彰镌，且不麓充分骞簸穗分散固定耗酶，不宣弓l入催化反应中：(3)、用5％的戊二醛水溶液对栽体进彳亍预处理和用50％(VⅣ)的丙臻溶液清洗使I鼋遘稳因定纯酶对酶的锤强筏嗣往都有改善作蔫。4．5酶促殷应动力学研究和化学反应动力学一样，酶葳应动力学是研究酶反应速度的规律以及研究各种因素对酶反应速度的影响。酶反应的基本动力学主要是指酶反应速攀与酶赢物之间的韵力学蔟系。酶和底物是酶反斑系统中两个最基本的闲素，决定了$，IⅢ，l世icaud等苦篆虽n酶及应的熬零性质。其他嚣融因素也都是遴过这鼹个因素产生影响的。暇此磷究酶浓度和底物浓度对酶葳应速度之间的关系是熬个酶反应动力学的基础。实验研究了固定化酶和溶液酶的反成机理和动力学特征及H202的抑制作用。4．5．1酶懈反应机骥的确定实验巾酶鼹量阑定戈1162U／L，选择三耱H202浓度，改交苯翳浓度，在室温溉缓冲溶液存在的条件下反应30min，研究酶{醍反应机理，结果如图4。36、4．37和表4-4j；l；示。在不同靛H202浓度下，溶液酶和固定他酶的发应动力学趋线都几乎平行，斜率基本相等，由酶促反成杌制确定原理可知该反应符合乒乓双双反应的特征。由此判断辣根过氯化物酶催化畿化酚类化舍物的反应机制是乒乓双双旋应机制，且酶阐定纯焉没有改嶷这个爱应机制，验证了第二章中阐嚣4nm∥图4，36不同H202浓度下溶液酶催化苯酚氧化的酶反皮动力学曲线Fig。4-36Thel理S】一1／vlinesofphenolcatalyzedbyfreeHRP鞋differentconcentrationsofH2023j302j、三24星、，5’4a5a∞an2口04n∞00IOm012l《#‘mr圈4．37不同H：02浓度下固定化酶催化苯酚氧化的酶反应动力学曲线Fig+4-37The1／IS】一llvlinesofphenolcatalyzedbyimmobilizedHRPatdifferentconcentr=ionsofH202珏¨孙¨协”¨誉Je{、、n述豹爨髂菠痤羲毽，箕菠褒邂程魏下；酶晒类他岱物}—————-主——一聚合物珏202强辣校过氧傀物酶蛉佟惩下，生成糯璧杰裁，它具鸯缀强懿畿纯经，可将蓊癸鬣合秘氧讫，生蔽鹣戴强由鏊等孛阖产携，爨由基蘧进分子润聚台或与酸类忧食物发生聚合，生成=聚物或多聚镑，溆种菠应被称为氧化耦合。它与单缝瓣瓣穰稼反痤过程不鬻，先是酶反瘟，接麓楚鬣：学爰藏，簸藤筑藏了酶反应对箍威特弊性的要求，使～种酶可以处理多种禽澉环的化合物，扩大了酶的适惩穗瀚删。马秀玲等人鬻磷究了HRP对憨鹣浓发操嚣、戏努不溺麴凌东《含一耪黪、二耱酪和三耱酚)懿楚理效祭，绪暴发瑷：娄会聚袋零豹藏努越复杂，酸浆去豫率麓褰。遂滋鹈程浚台黪褒窳戆憝毽巾存燕一定黎辐蔓撵鼹效痘，迄获侧面印证了上述HRP倦化鼢类物质氧化的过稷【25】。表4越苓剃H202浓疫下苯酚镀豫翘臻反应动力学参数Table4-4ThekineticsparametersofphenolatdifferentconcentrationsofH2024。S。2酸攘爱痉旗袁攀褥挺K。和vm。是研究酶殷应动力学酌两个主露参数。K。韵物溅慧义是稽当酶反成速度达到最大反应遴废一半时的底物浓魔，霞的大小反映酶姆底物蛉亲和力，}％越小，酶与底物韵激和力越大。K。和v。。的比值越小，底物越容易发生反艘，因此可以用K。～。。}E懂寒判颤污絷物是套是酶锉他反殿的合适底物秘在处遴避簇中是否骞荔去滁{4避。囊表每毒霹辩：溶液酶毒嚣是健黪程毙，季蘑H2魄浓度下}‰都较，j、，说翳溶液酶穗眈予溺定纯酶对苯酚鹃浆颓性更好t但苯酪糕仡蔽痘中，与溶液猕褶院，霾定纯酶不荔簧酚羲鑫囱基浚漆，不荔被生成的聚含物包裹，熊活性持久。表现出最大威威速率更大；K。／v。。值相差很小，这是瓣为对两释不强形态瓣臻来谈，底麴释魑一样酶，氇诞臻濒辩酶对苯酚瓣笼毽滚易程度一襄。4。5。3H202簿裁系数秘淄定辣根过氧化物酶催化飘化酚类化台物的魇疵为双底物反应，避氧化氢是氧讫翔，困诧过氧化氛的浓液悬影响酶反应的～个冀蘩因素。对笨酚进行酶催化毒毒n糕化察验，测定它们在不躺过氧化瓶浓殿下的去滁率。由阁4．25艇见：过载他甄的加入羹超过一定量时，苯酚去除率鼹下降趋势，说明过氧纯氯是抑制性底物，遭氧他氢躲投擞量存在最佳缓，最佼授艇量鸯酸类亿套物熬浓度及辩浓发帮蠢荚。麓浓褒藤魏霹魏会与懿缝合黪裁獯臻复会懿，簌嚣攘露l其鑫巍转纯兔产麓，这就是巍甥簿裁。过蕉酶疯辏分子掰税笼及竞争健撺蠲裁，赢豁搀测靛爱皮飘毽可用下式表示【113}；琶÷S二=二兰=烹ES——o生—啼E÷Pk+k，s；气三=竺Es2(死端复合物)懿爱巍速率：v=k2【Es]，令Ks·=k-s酶，*‰=(k2+k-0&I，刚推导疆：v一两恭瓤丽踟。!垫趔坐选Vm馘嬲《2》式≮菇着凄，受【s】《嗨随(褒耨浓嶷穰低》，方程霹撬兔米氏蠢程式，采用漱镧数俸图可戳求出l≮；当fS》>}‰嚣孪(底物浓度很巅)，方穰可筒纯成；l／v=(1+【s】压≮)旭。，以l&对【s】佟黼，取其直线延长部分，可骧求出l≮(磁t为张端复合物ES2的解离常数)，由}‰和Ks求出Km,／Kr。按照该思路取酶用缀为1720U／L，苯酚溶液的浓度为104，36mg／L，改变H202浓度，在嶷温无缀挣滚液存在的条件下发应30分钟，研汽№魄抑制作用。溶液酶和固定他酶德仇笨酚氧化反威中底物抑制作用结果分别如图4-38、4．39和图4140、4，4l所承。她瑷数锤求褥由溶液酶帮国定亿酶经纯鹣笨鼯氧讫疑应串H20：抑制动力学常数，楚袭4．5所捌。a2：t警24{：。亏，。{2Oa捧r≠t∞mr翻4-38溶液酶催化苯瀚飘化时底物抑制佧用的毅翻数魏线Fig．4-38Thel舟——1／ts]托f转ofH202inhibitioneffect{ntheoxidationreactionofphenolcatal)7_z毙lbyfreeHRPn3220k2‘E，，1^'200Isllret001．一图4—39溶液酶催化苯酚氧化时底物抑制作用的1～对【s】作圈Fig．4-39Thel／v一【S1cLffveofH202inhibitioneffectintheoxidationreactionofphenolcatalyzedbyfreeHRPISl-'，L,rnm0F’匿4．40固定健酶催{七苯酚氧髭时底豹攒谁《捧鼹的双俄数趋绞Fig．4-40Thel／v—l／IS】curveofH202inhibitioneffectintheoxidationreactionofphenolcatalyzedbyimmobilizedHRP3．22．82．4、l2．0毛、16{20．8048121SISl?㈣}{j圈4-．41固定化酶催化身芏酚氧化时底物抑制作用的l～对[s】作图Fig。4《lThe1／v一【S】curveof掩02inhibitioneffectintheoxidationreactionofphenolcatalyzedbyimmobilizedHRP扎拍¨抽博他¨一肇u_一c琶、～n袭4-5H202撺刳鹩动力学耄数Table4*5Thekineticsparametersfort11einhibitioneffectofH202}‰鳘小，说爨珏202与酶靛亲窥经好；＆篷大，说碉死端爱会产穆ES2荔解离。Km／K,值越大，则H202的抑制作用越大【90】。由表4-4可见：在溶液酶和露定纯酶臻伍苯酚镊纯懿爱应孛，I-1202豹秘裁季筝翔稳返，这是峦予酶霾爱在载体上虽改炎了其在反应体系中的存在状态，但不能改变其反应机瑕。然而从K。秘＆的馕可以看出，溶液懿催化隧，珏202与酶的袋彝性嗡好，僵弱定优懿健化时死端复合产物ES2易解离。4。5。4小缝通过以上实验对酶促反应动力学的研究，可以得出如下结论：(1)、HRP催耗苯酸氧纯籍合乒乓双双菠痉静特征，酶潮定往磊这令爱纛撬裂没有凌变；(2)、两种形态的酶对苯酚的处理难易程度一致。但溶液酶对苯酚的亲和性更好；(3)、氇侥是掇铡洼底甥，夔固定纯不裁改交掩。2慰黪熬瓣铡露蘑。4．6舍酚废水酶促处理的综合评价4．6。lCODc，徨考察水体中的污染物质含夜大量的有机物，它们l扶毒性和使水体溶解氧减少的形式对生态系统产生影响。已经奁明，绝大多数致癌物质是有毒的有机物质，所以有机物污染指标是水质十分羹要的指标。化学需氧量(CODc，)是指水体中黥被氧纯豹物囊遴李亍化学氧纯辩消耗氧鹣鏊，作为有梳黪相对含鏊静综会指标之一，反映了水中受还原性物质污染的程度佛】。隽了考察含酚褒拳楚疆蔫磊鹣毒往，实验测定了最镶条终楚疆蘸爱禽酪瘦水及有关样品的CODe，值，结果如表4-6所示。在最佳处理条件下，苯酚去除率先98。36％，CODer去除率荧73．58％{蓑反疫中苓添热PEG，瑟将霾定纯骜震量由20U增加到80U，此时苯酚去除率为36．82％，CODc，去除率为28．43％。按照酶毽缘过氧豫氯氧必会黔废农戆机理霹妇，攀酸瓣去除是通过聚合溅淀实现的，那么在无反应助剂存在时，苯酚去除率应与CODc。去除率一致，丽实验续果表瑷蜒CODe，去除率低于苯黔去除攀，这是出于反墩生成熬小部分聚会物没达到沉淀的聚合度，仍怒浮于溶液中造成的。反应中如聚添加反应助剂PEG，则处理前的废水CODc；僮大大增加，但是处理屡濒液的CODc，值显著降低，说明体系中PEG在反应过獠中大部分可随聚合物排出，这与PEG对酶活傲保护帆理是一致的，因此可认为残留CODc，主要由体系中未结合的PEG造成的，其对环境驹影响甚小。n袭4．6不嗣样品的CODc,德Table4-6CODcrvaluesofdifferentsimples样晶。。蠹黧翥t举酚溶液0．5070mg—mL"‘(禽PEG氇30mg-mL"5)最健条件处理质的溶液不蕊PEG燕PEG曼Q壁亟望血蕊兰!!!!!：!!!i!：!!!!!：!14。6．2与其宅楚理方法斡挠较在含酚废水传统处理方法中，广泛使用的Fenton氧化法与其它高级氧化工艺辐毖，嚣其爨捧籁擎、豪痰浃逶、莓产囊蘩凝等撬焘嚣嵇受毒辣，装逐裙是一种去除有机污染物高效的方法，瓤化效率商达98％。尽臀如此。Fenton氯化法还是套三个暖显豁不是：蓠先，遮尾磷镶蓬嚣较窄，鸯24之瓣，这簧爨楚理设备为耐腐蚀性的：其次，该反成为均相反应，产生二次污染，催化剂托法凰收，嚣处理复杂；褥次，凝应湛发较高，超过100℃，鼹源灌耗也增熬了处理成本驴”l。莽彤森等人用溶液HRP催化氧化处理兰州石化公司石油化工厂的实际越浓度废水，与Fenton法处理相魄，酶矬化氧化法处理黢水可戮丈幅度泼善工律环境，麓纯操髂，洚低处理成本雌翻。我们实验窿曾经嗣用合成的二氧化钛层桂粘土{乍为催化剡载体，通过离予掺杂反应负载活性铁露子，制餐锝到了铁离子交换镰艇柱精±，疆巍了荬佟为菲臻楣继纯粼在温式催记过氟纯氢氧纯降解恭酚中的催化性能，虽然港酚去除率高，但其反应条件骘Fenton氧化法的根颓，嚣蠡热，辩蕊灏遣较窄。在2-5之t'霹t701。辕爨之下，本实验研究靛酶鼹经理法有自已I的优势，如催化效果好，苯酚和CODc，去除率较高，反威条件温和，遥臻涎pH德蓬露铰宽，袁；4。5-9+3之阕，磁强牧剩糯，并逶含手连续铯、爨凌化生产，因此该法值得研究以推进艘在工业含酚废水处理中作为前序处理的应霜。处理嚣煞低滚囊痊拳(凡至蔻卡rag／L)黢淫往凝藏黪满±暖辫舞这蠡接放。{嚣n第五章结论与展望本文尝试丁层柱粘士在酶固定化载体中的应用，以铝层柱粘土为载体固定了辣根过氧化物酶，并利用DTA、XRD、FT-IR、液氮吸附一脱附等现代测试技术对原土、A1．CLC、固定化HRP前后的Al—PILC的结构及HRP与载体间的相互作用进行了研究。同时以苯酚的去除率为目标函数，系统地研究了固定化HRP处理含酚废水时的最佳工艺条件和聚乙二醇作为助剂对酶活的保护作用。通过实验得到以下结论；(1)、蒙脱石经聚合羟基铝离子交联、煅烧后，得到一类微／介孔材料，它的晶面间距由原土的12．267A增大到18．9A左右，比表面积由原土的37．3m2幢扩大到200m2／g左右，孔容由O．0106mL／g增大到0，1535mL／g以上，孔径较集中分布在3．8am左右的范围内，并伴有较大的介孔出现；(2)、AI．PILC是一种良好的酶固定化载体。在其表面及层间裸露出大量的硅烷醇基团和铝羟基，可以通过氢键、范德华力或静电引力与酶的亲水部分相互作用，使HRP有效地固定在其上。HRP在AI．PILC上的固定化速率快，得率高。当载体用量为每单位活度酶不小于0．45rag时，15分钟后酶固定化得率可达99％以上：(3)、聚乙二醇作为反应助剂能在固定化酶表面形成保护层，有效地减缓酶的失活，不仅显著提高酶的催化效果，丽且大大降低酶的用量；(4)、AI．PILC固定化HRP处理含酚废水的适宜pH值范围更宽。由溶液酶的6～9扩大到4．5～9．3；(5)、固定化酶的储藏稳定性更好，4'0下密封储存两周后，催化效果基本不变，而溶液酶活性每天降低10％左右：(6)、在苯酚浓度为250mg／L的间歇反应体系中，当mPEo／I～he。0l为0．4，Mm02／Mpho。_为1．5，固定化酶用量仅为o．4u，rnL时，反应3小时后，苯酚的去除率超过95％，CODcr去除率为7358％；(7)、辣根过氧化物酶催化氧化酚类化合物的反应机制是乒乓双双反应机制，溶液酶相比于固定化酶对苯酚的亲和性更好，但固定化酶在苯酚氧化反应中表现出最大反应速率更大，两种不同形态的酶对苯酚的处理难易程度一致。我们的工作较先开展了层柱粘士在酶固定化载体中的应用研究，尝试了铝层柱粘土固定化辣根过氧化物酶在台酚废水处理中的应用研究．取得了一定成果，但仍有许多工作尚需完善。如在我们研究中使用的含酚废水是人工配制的模拟废水，实际废水的组成是十分复杂的，因此有必要考察其在实际含酚废水处理中的催化性能；由于在间歇反应中，酶的重复使用性并不理想，一方面需进一步探讨酶再生的方法，另一方面可蛆尝试研究该固定化酶在连续反应cp的催化性能或在电化学分析中等其它领域的应用；层柱粘±是一种良好的酶固定化载体，今后可以探索不同的层柱粘土在其它酶或多酶固定化中的应用。n参考文献中国化工防治污染技术协会。化工废水处理技术，北京：化学工业出版社，2000李玉标．净水技术，2005，24(2)：51．54OonzalezG．BioresoureeTechnology，2001，80(2)：137—142王红娟，奚红霞，夏启斌，等．工业水处理，2002，22(6)：6．9张芳’李必翳，麓惠藤，等。纯工遗震，2005，24(8)：860．864陈美玲．化学工程师，2003，95(2)：48．51KlibanovAM，Albe曩iBN，MorrisED，eta1．JournalofAppliedBiochemistry，1980，2：412-414LiuJZ，SongHY，WengLP，薛al+JournalofMolecularCatalysisB：Enzymatic，2002，18：225-232MeiJG，YuSM，ChengJ．CatalysisCommunications，2004，5：437-440JanbvbZ．CurrentOpinioninBiotechnology,2002，13：338—344邵风琴，韩庆榉．石油化工高簿学校学报，2003，16(2)：36—40孙伟，韩军英，陆路德．环境科学与技术，2003。26(增刊)：75．77NelsonD，ElisaE．AppliedcatalysisB：Environmental，2000，28：83-99欧志敏，王瞽，王鸿，等．中国生物工程杂志，2005，瑶翻：163．169陈辉，张剑波，刘小鹏．北京大学学报，2005，41(4)：605．61l颜流窳，黄智敏，王承宣，等．鬻菩舷空工遣学貌学报，1999，13(1)：67．71wuYM，TaylorKE，BiswasN，eta1．JournalofEnvironmentalEngineering。1999，125(5)：451-457NicellJA，SaadiKW，BuchananID．BioresourceTechnology，1995，54：5-16VenkataMohanS，KrishnaPrasadK，etal。Chemosphere，2005，58：109％1105洪鞲杰，张朝晖，芦困蓉。现代食晶科技，2006，22(1)：177．180LimogesB，SaveantJM，YazidiD．JournaloftheAmericanChemicalSociety2003，t2500)：9192-9203“uXJ，HuangYX，ShangLB，eta1．Bioelectrochemistry，2006，68：98-104SongHY，YaoJH，LiuJZ，etal。EnzymeandMicrobialTechnology，2005，36：605．61l洪伟杰，张朝晖，芦国营．生命的化学，2005，25(1)：33．36马秀泠，陈盛。黄丽耩，等．广髑纯学，2003，28(1)：17．22PencreacHG，LeullierM，BarattiJC+BiotechnologyBioengineering，1997，56：l客l。189i{{Ol23456789叼H曩马q嗡嗡Ⅲ阱瞄刚漆嘲唾殴噬㈣叫㈦㈦㈧㈣隧邮畔眇郾Ⅲ阱m阱瞄嘶n【27】HertzbergS，KvittingenL，AnthonsenT，eta1．EnzymeandMicrobialTeclmology，1992，14：42·47【28】AyeletF，IlanL，UriC，etal。JournalofMolecularCatalysisB：Enzymatic，2002，18：121-131[29】肖海军，贺筱蓉．生物学通报，2001，36(7)：9-10[30】杨节非编译．国外医药——会成药、生化蕊、制剂分册，1994，15(4)：209．212【31】BomscheuerUT．AngewandteChemic，InternationalEdition，2003，42：3336．3337[32]【3习[34】【35]【36】[37]【38】[39】[40】【4l】[42】[43][44】[45】[46】攀7】[48】[49】【50】贾鹏翔，刘雪莹，刘京龙，等．皮革科学与工程，2004，14(s)：31．37黪建茏，毒§建缄，謦纹毽，等，德学与生锈纯工，2006，23(2)：7．9MaH，HeJ’DavidGE，DuanX．JournalofMolecularCatalysisB：Enzymatic，2004，30：209-217HusalnS，HusalnQ，SaleemuddinM。IndianJournalofBiochemistryBiophysics。1992，29(6)：482-486胡龙兴．环境科学，1996，17(3)：57．60IshikawaT，TamuraM，YamazakiI．JoumalofBiologicalChemistry．1980,255(22)：10764，10770谭学才，梁汝滓，李荫，等．分析试验室，2004，23(6)：1-4LaurellT，DrottJ’RosengrenL．BiosensorsandBioelectronics，1995，10(3-4)：289-299MartinB，SimonE，GyorgyM，eta1．Talanta,2002，56(2)：341。353DyalA，LoosK，NotoM，eta1．JoumaloftheAmeriCanChemicalSociety。2003，125：1684-1685Deerej，Magner嚣，WallJG，e￡alCatalysisLe鹱ers，2003，85(112)：19-23RakeshKS，ShraboniD，AmamathM．JournalofColloidandInterfaceScience，2005，284：358-361RajivK，MaitraAN，PatanjaliPK，eta1．Biomaterials，2005，26：6743．6753ModyHM，ModyKH，MairhOP，eta1．IndiaJournalofChemis姆，1999，38：1200．1207穰凡亮，陈伶利，王卫，等．生物工程学报，2004，20(2)：287．290SchoonheydtRA，PinnavaiaT，LagalyG，etal。PureAppliedChemstry。1999，71(12)：2367．237i曾江海，于少明．化工矿物与加工，2001，30(9)：卜4VarmaRS．Te娃ahedron，2002。58：1235．1255辫楚骧+=嚣酒纯工。t998。27(4)：292-29951n【70】【71]【72】【73】【74】赵密嫒，张有瑜．粘土矿物与粘土矿物分析，北京：海洋出版社，1990丁臀军，安太成，傅家谟，等．地球化学，2005，34(6)：626-634稷俊，于少明。屡柱粘土的测餐、表征及&耀研究进展．2004，第24属中国纯工学会无梳簸举本年会论文集，张家界BotteroJY，CasesJM，eta1．JournalofPhysicalChemistry，l980，84：2933—2939瘸褰簿，葛惠牮，李春生，等。犷物岩磊遮球豫学逶掇，2002，21(4)：242．246OccelliML，BenrandJA，GouldSAC，eta1．MicropomusandMesoporousMaterials，2000，34：195-206CristinaV．MicroporousandMesoporousMaterials，2001，49：197-202MaesN，Heylen{，CoolP，etal。AppliedClayScience，1997，12：43-60HanYS，YamanakaS，ChoyJH．AppliedCatalystsA，1998，General174：83．90KlopmggeJT．JournalofPorousMaterial，1998，5：54l求妙琴．浙江教商学院学报，2004，6：60-65陶龙骧，邹多秀．化学进展，2002，14(3)：200-206DingZ，KlopmggeJT，FrostRL．Journalofporousmaterials，2001，8：273。293SdnivasanKR，FoglerHS．ClaysandClayMinerals，1990，38：287-293于少明，梅建国，郝文正．有机废水处理中的应用研究．2003，中国化学会第八属应用化学霉会论文集，嚣安LindaSC，YangRT．MicroporousMaterials，1997，8(3《)：177-186Bal(shMSA，YangRT．AICHEJournal，1992，38(9)：135MurrayHH．AppliedClayScience，2000，17：207-221骛涯海。皱寒多琵枣孝辩一Al溪撬旗±豹合成及表征。会腮工篷大学矮±学披论文，2002梅建国．钛层桂粘土的合成、改性及其在环境保护中的应用研究．仓肥工业大学硕士学饿论文，2004菸文正。PILC溺俸超强酸镁纯翔熬秘备及葜在酯舍袋巾豹应矮研究．含耱工业大学硕士举位论文，2005锫安平．蒙脱石及其改性蒙脱石吸附重金属离子的研究．合肥工业大学硕士攀霞论文，2006DunfordHB，StillmanJS+CoordinationChemicalReviews，1976，19：187*251BuchananID，NicellJA．JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology。1998，72：23—32㈣酗雠刚隧冈舰隧㈣雠酬㈣㈣㈣嘲嘲吲㈣鹾n【75】HewsonW；Dunford秘B．JournalBiologicalChemistry,1976，251：6043—6052[76】f77]≯羽【79】【80]瑟l】[82lf83】[84】18嚣[86】[87】【88】【89】p镄≯t】[92】f93]【蚓[95】[96】f97】[98】【9鳓DeclBoUagJM。ArchivesofEnvironmentContaminationandToxicology．1990，19：543-550BayntonKJ，BewtraJK，BiswasN，eta1．Bio曲imicaetBiophysicaActa,1994，t206(2)：272-278HuangQ，HuangQG，PintoRA，爨a1．JournaloftheAmericanChemicalSociety,2005，127(S)：1431一t437KlibanovAM，TuTM，ScottKP．Science，1983，221：259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