空间尿液废水处理重组菌株的构建及优化 58页

空间尿液废水处理重组菌株的构建及优化李丹2015年6月n中图分类号：UDC分类号：空间尿液废水处理重组菌株的构建与优化作者姓名李丹学院名称生命学院指导教师高海军副教授答辩委员会主席张建丽教授申请学位级别理学硕士学科专业生物学学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年6月nConstructionandoptimizationofrecombinantstrainsforspaceurinewastewatertreatmentCandidateName：DanLiSchoolorDepartment：SchoolofLifeScienceFacultyMentor:Assoc.Prof.HaijunGaoChair,ThesisCommeetee:Prof.JianliZhangDegreeApplied:MasterofScienceMajor:BiologyDegreeby：BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDenfence：June,2015n研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：n北京理工大学硕士学位论文摘要由于尿液废水中的有机酸、尿素和盐的含量很高，尿素又是极易分解的非离子污染物，处理难度较大，因此空间尿液废水处理一直是我国空间技术发展中一个较难攻克的问题。传统的物理化学方法如蒸馏法、高级氧化法等有很多缺陷，目前各国争相利用生物法来处理空间尿液。为更高效地对尿液废水进行处理，本研究基于实验室前期工作，进一步利用维氏硝化细菌中硝化基因和欧洲亚硝化单胞菌中亚硝化基因构建了重组大肠杆菌。本论文主要得出以下结论：获得具有硝化功能的重组大肠杆菌L2，L5，即DH5α(pDHC29::nxr)，DH5α(pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao)及亚硝化功能的重组大肠杆菌L3，L6，即DH5α(pTrc99a::pro-hao)，DH5α(pTrc99a::pro-hao+C554+C552)。2+2+2+重组菌株L3具有将盐酸羟胺转化为亚硝酸盐的能力，且Cu、Fe和Zn2+2+的加入对重组菌株的催化能力有促进作用，当加入不同浓度的Fe和Zn时，亚2+硝酸盐氮产量同比增长10倍左右，且加入0.5mM的Cu时，亚硝酸盐氮产量增至3.059mg/L，同比增长近15倍；将与氨氧化过程电子传递相关的两个色素蛋白C554和C552在大肠杆菌中与HAO共表达，HAO催化活性并未有显著的提高。采用离子色谱仪对重组菌株L2培养液进行分析表明，L2重组菌有将亚硝酸2+3+盐转化为硝酸盐的能力，产物最大生成量为63.5mg/L；无机离子如Mo、Fe对重组菌L2转化硝酸盐能力无影响；厌氧培养条件下表达NXR酶，说明重组菌L2可在厌氧条件下转化硝酸盐为亚硝酸盐。采用离子色谱仪对双质粒重组菌株L5培养液进行分析，终产物硝酸盐氮产量几乎为0，而中间产物亚硝酸盐氮有很少的产量，说明L5催化底物盐酸羟胺为硝酸盐的能力较弱。关键词：尿液废水；亚硝化反应；硝化反应In北京理工大学硕士学位论文AbstractTheorganicacid,ureaandsaltinurinewastewaterisveryhigh，whileureaiseasilybrokendownanddifficultlytotreat.SothespatialurinewastewatertreatmenthasbeenaprobleminspacetechnologyofChina.Thetraditionalphysicochemicalmethodssuchasdistillationandadvancedoxidationmethodhavemanydefects.Currently,manycountriesbegintodealwithspaceurinebybiologicalmethod.Inordertotreaturinewastewaterefficiently,theresearchfurtherlyconstructrecombinantstrainsusinggenesofNitrobacterwinogradskyiNb-255andNitrosomonaseuropaeaATCC19718.Themainresultsareasfollows:RecombinantplasmidspDHC29::nxr,recombinantE.coliDH5α(pDHC29::nxr)namedL2andE.coliDH5α(pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao)namedL5withnitrificationfunctionwereobtained,andrecombinantplasmidspTrc99a::pro-hao,recombinantE.coliDH5α(pTrc99a::pro-hao)namedL3andrecombinantplasmidspTrc99a::pro-hao+C554+C552,recombinantE.coliDH5α(pTrc99a::pro-hao+C554+C552)namedL6withnitrosationfunctionwerealsoobtained.TherecombinantstrainL3hasthecapacityofconvertinghydroxylamine2+2+2+hydrochlorideintonitrite,andtheadditionofCu,FeandZncouldpromotethecatalyticabilityoftherecombinantstrain.Whendifferentconcentrationsofironionandzincionwereaddedtotheculturefluid,theyieldofnitritenitrogenincreasedby2+about10times,andtheoutputofnitritenitrogenincreasedby3.059mg/LwhenCuwas0.5mM,upto15timesofthesameperiod;CoexpressionofCytochromesc-554andCytochromesc-552whicharerelatedtotheelectrontransferchainduringammoniaoxidationhasnosignificantimprovementtothecatalyticactivityofHAO.TheanalysisoftherecombinantstrainL2wascarriedoutbyionchromatographandtheresultsshowedthatL2hadtheabilityofconvertingnitriteintonitrate;The2+3+inorganicionssuchasMoandFehadnoeffectontheconversioncapacityofL2;AnaerobicincubationofrecombinantL2showedthatNXRcancatalyzenitratetonitriteunderanaerobicconditions.Theresultofshaking-flaskcultivationofL5atambientpressurewasundesirable.Theendproductwasalmost0,andtheintermediateproducthadlittleyield.Keywords:Urinewastewater;nitrosation;nitrationIIn北京理工大学硕士学位论文目录摘要.............................................................................................................IAbstract.....................................................................................................................III第1章绪论..............................................................................................................11.1研究目的和意义.............................................................................................11.2国内外研究进展.............................................................................................21.2.1氨氧化作用中的关键酶及其分子生物学研究...........................................21.2.2亚硝酸盐氧化作用的关键酶及其分子生物学研究.................................51.2.3总结与展望...............................................................................................................71.3研究内容和方法.............................................................................................8第2章材料与方法..................................................................................................82.1实验材料.........................................................................................................92.1.1菌株和质粒.............................................................................................................92.1.2引物............................................................................................................................92.1.3主要工具酶及试剂盒.........................................................................................102.1.4培养基和主要化学试剂的配制....................................................................102.1.5实验仪器...............................................................................................................112.2实验方法.......................................................................................................112.2.1常规分子操作克隆方法.....................................................................................112.2.2重组菌的摇瓶发酵方法....................................................................................122.3分析方法.......................................................................................................132.3.1离子色谱法测定硝态氮....................................................................................132.3.2分光光度法测定亚硝态氮...............................................................................13第3章实验研究...................................................................................................153.1尿素代谢基因重组菌株的构建.......................................................................153.1.1引言..........................................................................................................................153.1.2结果与讨论..........................................................................................................153.1.3小结..........................................................................................................................253.2尿素代谢相关基因重组菌株催化功能的研究...............................................263.2.1引言..........................................................................................................................263.2.2结果与讨论..........................................................................................................263.2.3小结.........................................................................................................................35结论与展望..............................................................................................................37IIIn北京理工大学硕士学位论文结论..........................................................................................................................37展望..........................................................................................................................37参考文献...................................................................................................................38附录...........................................................................................................45攻读硕士学位期间撰写和发表的学术论文..................................................49致谢...........................................................................................................50IVn北京理工大学硕士学位论文第1章绪论1.1研究目的和意义空间环境控制与生命保障系统（ECLSS）是集气体管理及环境控制、水处理功能、废物管理功能、食物供应功能和安全保障与消防功能于一体，是保障航天员的身心健[1]康和工作效率的一套功能保障系统，很多国家都在努力建成ECLSS以保障能量和物[2-4]质的再循环。其中，空间尿液废水处理是废水处理功能的主要组成部分，航天员尿液的日产量大（每人每天产1.5升，约占生理废水的43.86%），如何处理甚至回收利用这些废液，建立一个合理的尿液废水处理系统，对长期飞行、深空探测任务的航天[5]器至关重要。由于尿液废水中的有机酸、尿素和盐的含量很高，尿素又是极易分解的非离子污染物，因此空间尿液废水处理一直是我国空间技术中较难攻克的一个问题，传统的物[6-7][8]理化学方法如蒸馏法、高级氧化法不能有效回收利用尿液营养物质，且能耗高、[9-10]安全性能差，因此各国争相利用生物法来处理空间尿液。目前，应用微生物降解尿液废水的可行性已被确定，根据生物再生式生保系统的理念，利用生物技术，理化技术，使飞行器中初始的能量、物质形成闭合的回路，即稳定的生态系统，是本研究的意义所在。硝酸盐是极稳定的化合物，即使不加以利用，也会稳定的存在。针对尿液废水中的尿素，比较可行的方法是将其转化为植物营养液的主要成分，即硝酸盐。利用微生物，可以将尿素逐步转化（氨，亚硝酸盐，硝酸盐），最终以硝酸盐的形式进入植物营养液。针对以上问题，发现氨氧化细菌和硝化细菌极有潜力可以解决这一难题，实验室前期确定了尿液废水反应器中细菌的分布情况，选择欧洲亚硝化单胞菌（占克隆文库15%）、维氏硝化细菌作为反应器中亚硝化、硝化细菌的代表，克隆并确认活性污泥菌群中存在的欧洲亚硝化单胞菌amoCAB、hao基因，维氏硝化细菌nxrAXB基因。本研究旨在以双质粒表达载体为基础，构建具有亚硝化功能的重组大肠杆菌。针对发酵条件、基因表达方式进行优化，得到具有亚硝化功能的重组大肠杆菌。期望在以后的工作中进一步进行地面模拟，探讨在真实空间环境下微生物处理尿液废水的基本生物学问题。为进一步细化和完善空间废水处理系统的设计，以及长期在轨飞行和深空探测提供技术基础。1n北京理工大学硕士学位论文1.2国内外研究进展尿液废水中的尿素处理主要依靠两类菌：氨氧化菌（AOB）和亚硝酸氧化菌（NOB），[11-15]前者将氨氮转化为亚硝酸盐，后者将亚硝酸盐转化为硝酸盐，两类菌均为自养菌，+利用废水中的碳源，通过与NH4-N氧化还原获得能量。氨氧化菌中氨单加氧酶(AMO)[11]和羟氨氧化酶(HAO)的酶促作用是整个反应体系的限速步骤。具体反应方程式如下:-+亚硝化：2NH4++3O2→2NO2+2H2O+4H(如图1-1)--硝化：2NO2+O2→2NO3图1-1氨氧化反应途径Fig.1-1Passwayofammonium-oxidizingreaction1.2.1氨氧化作用中的关键酶及其分子生物学研究氨氧化过程主要有两个反应，首先是氨在氨单加氧酶(AMO)的催化下被氧化为羟胺，随后在羟胺氧化还原酶（HAO）催化下氧化生成亚硝酸盐。目前已经对AMO、[16]HAO的分离纯化以及相关基因序列分析与外源表达有了比较深入的了解。1.2.1.1氨单加氧酶(AMO)及其编码基因氨单加氧酶由3个亚基AmoA、AmoB和AmoC组成，是一种三聚体膜结合蛋白。它只能催化非离子态氨氧化，此过程在整个硝化作用中是一个限速步骤，是由于周围环境在铵离子与分子态氨的动态平衡中倾向于铵离子的方向，使得氨的浓度较低的原[16]因。amo是编码氨单加氧酶的基因簇，至少含有3个位于同一操纵子上的基因，分别[17]为amoC、amoA、amoB。该基因具有较高的排列相似性和序列保守性，一般在一个细胞中含有3个拷贝且有>99%的保守性，因此环境检测AOB菌群经常会以amo作为目[18-21]标检测基因。2n北京理工大学硕士学位论文1.2.1.1.1自养亚硝化细菌的AMO及其基因表达目前，有活性的自养硝化细菌中的AMO尚未获得，其亚基组成和三级结构也未完[22]全了解，但已分离得到几种可能的AMO亚基，如AmoA、AmoB和AmoC。其中，AmoA是一种膜结合蛋白，大小约为27kDa，含有活性位点；AmoB大小约为42kDa，是一种铜-铁蛋白，提供定位到细胞膜上的信号肽；AmoA和AmoB亚基形成一种复合[23-26]体，被认为是一种异源二聚体相关蛋白;AmoC大小为36kDa，是一种膜结合多肽，[27]预测其可能是分子伴侣。该酶底物多样化(如一些直链烷烃、烯烃、环己烷等)，这些底物能竞争性抑制其酶活，同时下一步亚硝化产物亚硝酸的积累也能使其失活。此外，自养硝化细菌中的AMO对乙炔较为敏感，2.5%的乙炔即可抑制其酶活。Cu离子被认为可能是AMO酶活性保持所必需的离子，其证据其一是加入Cu离子螯合剂可以明显抑制其酶活，其二是与AMO功能以及编码基因相似性很高的甲烷单加氧酶[28-29]（pMMO）活性中心含有Cu离子已有研究表明，加入0.5mM的Cu离子可以明显刺[22]激分子态氨的氧化，并能稳定细胞提取液中AMO的活性。此外，10mg/ml的牛血清[30]清蛋白(BSA)、2mM的精胺都可稳定其在细胞提取液中的活性。另外，利用顺磁光[31]谱共振技术（EPR）研究人员,在欧洲亚硝化单胞菌的细胞膜中检测到无血红色-Fe[32]离子的存在，然而不像Fe离子能显著促进pMMO的酶活，250uM的FeSO4未能提高甚至是稳定细胞提取液中AMO的活性。编码自养硝化细菌中AMO的基因共有三个，即amoA、amoB和amoC，其中amoA[33-35][35]基因编码AMO酶的活性位点。McTavish等在1993年首次对欧洲亚硝化单胞菌（Niortosmonaseuropaea）中AMO乙炔结合多肽及其其编码基因amoA进行分析，发现AMO与之前已发现的所有单加氧酶序列都无序列相似性，是一种全新的单加氧酶。amo基因在欧洲亚硝化单胞菌（Niortosmonaseuropaea）及亚硝化单胞菌[22]ENI-11(Nitrosomonassp.ENI-11)中各有2个拷贝,其中amoA和amoB位于同一操纵子上，具体排列顺序见图1-2。实验表明，amo基因对模式菌株大肠杆菌（E.coli）有[22]较强的毒害性，不能得到该基因片段的克隆或外源表达。1.2.1.1.2异养硝化细菌的AMO及其基因表达与自养硝化细菌中AMO不同，异养硝化细菌的AMO更稳定，首次是Moir等从脱[23]N副球菌Pd1222(ParacoccusdenitrificansPd1222)中分离得到。与自养硝化细菌中2+AMO相似，Pd1222中的AMO也是一个膜结合蛋白,也可能含有一个易变的Cu中心，2+Cu的加入可以使酶活增加。与自养硝化细菌中AMO不同的是，由于乙炔可能无法进3n北京理工大学硕士学位论文[36]入异养硝化细菌AMO的酶活中心，因此并不能抑制其酶活。迄今为止对编码异养硝化细菌AMO的基因研究表明，异养硝化细菌的amo基因在不同的菌属中相似性不一。如恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中的amo基因与上述提到的自养硝化细菌N.europaea中amoA序列有相似性；而Paracoccusdenitrificans[22]Pd1222中的amo基因与N.europaea的amoA差异却很大。而且，与自养硝化细菌中amoA不同，ParacoccusdenitrificansPd1222中的amoA基因能在大肠杆菌中克隆表达，对E.coli几乎没有毒害性。图1-2N.europaea基因位点图谱Fig.1-2AgeneticlocimapofN.europaea1.2.1.2羟胺氧化还原酶(HAO)及其编码基因HAO是一种附着在胞质膜上的三聚体细胞周质蛋白，是目前已知的结构最复杂的血红素蛋白之一，每个亚单位大小约为63KDa，包含7个C型血红素和1个P460血红素[37-38]。这些血红素蛋白都参与了氧化过程中的电子传递，其中P460血红素结构和光谱学性质与众不同，被认为是是HAO催化活性必不可少的物质。H2O2处理HAO会导致[39-40]酶活性缺失且会选择性破坏P460血红素结构。对HAO晶体结构的研究表明，HAO在氧化羟氨过程中能同时转运2对电子，一对用于氨的氧化，另一对用于细胞物质的[41-42]合成以及ATP的产生。欧洲亚硝化单胞菌中的羟氨氧化酶基因（hao）研究较为全面，该菌含有3个hao基因拷贝，它们距离相隔甚远；其编码区域的核苷酸序列几乎一样，除其中一个拷贝[43][44]的一个核苷酸外；但是它们编码区上游的序列却有差异。HOPPERT等对亚硝化[45]单胞菌的HAO的结构进行了研究，SAYAVEDRASOTO等对亚硝化单胞菌的hao[46]基因核苷酸序列进行了测定，BERG—MANN等也对γ一氨氧化细菌中的hao基因4n北京理工大学硕士学位论文进行了结构分析和测序，以期为氨氧化细菌的系统发育找出新的证据。而异养硝化细菌HAO的研究相对较少，且与自养硝化细菌有很大不同。1.2.1.2.1自养硝化细菌的羟胺氧化还原酶及其基因表达研究纯化后的羟胺氧化还原酶（HAO）的结构表明，自养硝化细菌的HAO是以一种多体蛋白，结构排列复杂,包含3个亚基，每个亚基为63kDa，含7个血红素C和1个血红素P-460，也有研究发现，有的硝化细菌如巴斯荚膜甲基球菌属（Methylococcus[47]capsulatusBath）仅有一个P-460血红素蛋白。欧洲亚硝化单胞菌的hao基因研究较为详细，其基因长度为1710bp，受氨及亚硝酸盐的诱导表达，该菌中含有3个hao基因拷贝，距离较远，它们除其中一个拷贝的一个核苷酸外，编码区核苷酸序列一致，且与编码细胞色素C554-HAO的电子受体的[48]hcy基因紧密地连在一起。与其他细胞周质蛋白一样，hao基因也编码一个前导肽，长度为18～24氨基酸，在HAO的转运和成熟过程中被切除。1.2.1.2.2异养硝化细菌羟胺氧化还原酶及其基因表达异养硝化细菌HAO在结构上与自养硝化细菌的HAO有很大差异，它是一种单体蛋白，如从假单胞菌PB16(Pseudomonassp.PB16)和脱氮副球菌GB17（ParacoccusdenitrificansGB17）中分离得到的HAO，大小为68kDa和20kDa左右；而且这些异氧型HAO中含非血红素Fe中心，这可以通过异氧型HAO酶活能被亚铁离子激活得到证实，[46]这种类型的HAO酶在异养硝化细菌中广泛分布；研究表明，HAO活性会受到EDTA的抑制。异养硝化细菌HAO在序列上也与自养硝化细菌HAO的蛋白无同源性，如脱N副球菌GB17中的HAO与自养硝化细菌如巴斯荚膜甲基球菌属或单胞菌属中的HAO没有序列同源性；即使是两个异氧型的HAO也无明显的相似性，如脱氮副球菌GB17中的HAO分子量较小，且是一种周质单体结构，而假单胞菌PB16中的HAO是由68KDa[49-50]大小的亚基组成的二聚体且含有不易察觉的辅酶因子，与自养硝化细菌HAO不同，异氧硝化细菌HAO氧化底物羟胺是一个好氧过程。同时，自养硝化细菌与异氧硝化细菌HAO在氧化羟胺过程中的电子受体也不一样，自养型巴斯荚膜甲基球菌属中为细胞色素C554，还原生成ATP和NADH，而异氧型气单胞菌属和莫拉克斯氏菌属中电子受体[22]分别为细胞色素C550和C551，且不产生能量。1.2.2亚硝酸盐氧化作用的关键酶及其分子生物学研究[51]亚硝酸盐氧化还原酶(nitriteoxidoreductase,NXR)催化亚硝酸盐氧化为硝酸盐，位于细胞膜靠近细胞质的一侧，与膜内电子传递链紧密相关，是一种可溶性的胞内酶。5n北京理工大学硕士学位论文它是一种双功能的酶，具备两种亚基，一种能催化亚硝酸盐氧化，另一种能将硝酸盐还原，因此，该酶从能量代谢的角度讲，可以根据氧化还原反应的电势方向工作。有[52-55]研究表明，环境因子如pH、温度、好氧情况及碳源供应等对NXR有较大的影响。NXR酶是由Sundermeyer等人1984年在汉氏硝化细菌（Nitrobacterhamburgensis）[56]中首次分离得到，表明此酶由3种蛋白组成，大小分别为115kDa、65kDa和32kDa。[57]接下来的一些研究却发现，第三种蛋白在热处理后的NXR中并不存在。1990年[58][59]Bock等人以及1998年SpieckE等人的研究进一步表明，NXR酶由两个大小亚基组成的异源二聚体，α亚基(大亚基)大小为116kDa(NxrA)，β亚基(小亚基)大小为65kDa(NxrB)；该酶是膜内酶，但研究人员却未发现两亚基的信号肽，可能是α亚基上有[60]2个或3个跨膜的α螺旋转角将NXR定位在细胞质膜上的缘故。除此之外，NXR复合3+2+体还含有Fe、Mo，推测这些离子在NXR酶行使功能方面起着一定的作用。由于传统的提取纯化方式不能很好的研究NXR，研究人员开始着眼于生物信息学的方法，利用基因序列推测其蛋白组成、结构以及功能。研究表明，虽然nxr基因序列[61]在不同菌株各不相同，但都含有2个大小分别为3000bp和1539bp的功能性基因：[62]nxrA和nxrB，且受到亚硝酸盐及硝酸盐的诱导表达。2006年，StarkenburgS等公布了首个亚硝酸盐氧化菌——维氏硝化杆菌-Nb255[60]（Nitrobacterwinogradskyi-Nb255）的全基因组序列，由此打开了序列分析亚硝酸盐氧化过程新的一页。研究表明，N.Winogradsky中的nxr基因簇有3个基因亚基组成，nxrA（大小为3000bp）、nxrB（大小为1539bp）和nxrX基因（大小为648bp），推测nxrX基因可能与NXR的空间折叠构象有关。三个亚基在染色体上的排列顺序如图1-3，依次是：nxrA、nxrX、nxrB，形成一个基因簇，同时这个基因簇与相邻的4个其他基因，如细胞色素C基因、narJ、narI等形成一个操纵子，推测这些相邻基因可能与nxr基因功能相关，现暂无明确证据证实这一点。nxrA亚基上游基因编码一种与NXR活性相关的的c型细胞色素（cyt.C），它可能是[63]2+电子传递系统的一部分。NxrB的双核中心含无血红素的Fe离子而非Cu，并且有4个谷氨酸残基（Gln）来协调控制无血红素Fe配基,据此推测Fe离子对NXR的酶活会有[64][59]一定的影响。有研究表明，NXR的酶活也依赖于钼离子（Mo）的存在。NXR酶催化亚硝酸盐氧化为硝酸盐,通过呼吸链的氧化磷酸化产生还原剂NADH。[65,66]具体过程如图1-4，产物硝酸盐中的O来自于水。6n北京理工大学硕士学位论文图1-3nxr基因簇操纵子Fig.1-3NitriteoxidoreductaseCluster图1-4亚硝酸盐氧化过程的电子传递示意图Fig.1-4Electrontransfersketchmapofnitriteoxidationnxr基因催化的硝化反应，会受到一些游离态分子氮或是其反应底物和产物的影响，其中研究最多的是游离氨(freeammonia,FA)。多年前Anthonisen等人指出游离氨对硝化反应的抑制作用会受到外界因素如温度等的影响，之后有很多研究也证实了这一点。在研究过程中，有一个问题很值得注意，即亚硝酸盐氧化菌中NXR活性虽会被游离氨抑制，但一段时间过后，该菌会对游离氨产生适应性从而使受到抑制的代谢系统得到恢复。其他实验表明，游离的亚硝酸盐也会对nxr基因催化的硝化反应起到一定的抑制[67,68]作用。NXR酶催化亚硝酸盐成为硝酸盐的过程是可逆的，在氧气不足的条件下NXR还原硝酸盐的过程被认为是Nitrobacterwinogradskyi-Nb255反硝化途径的一部分。NXR酶催化的反应除了受底物和产物影响外，外界环境因素对其影响也不可小觑，1999年王[52]歆鹏等的研究表明，温度、pH等外界环境因子的变化会对NXR酶活性以及硝化菌[55]群生长情况产生一定的影响，2005年陈旭良等进一步证实pH不仅影响硝化菌群的生[69]长代谢，还会影响硝化基质和产物的有效性和毒性。2007年TysonRV等的研究表明，培养基中的各营养成分也会对硝化速率产生影响。NXR酶活性尤其受溶氧量的影响，如Nitrobacterwinogradskyi-Nb255在氧气不足的情况下，会形成降解硝酸盐的短程硝化[51]代谢回路。1.2.3总结与展望以上综述了废水处理中相关硝化过程中的3个关键酶及其编码基因的国内外研究7n北京理工大学硕士学位论文进展，对于亚硝化和硝化作用关键酶及基因的研究，有助于彻底阐明其过程及机制，为相关酶的固定化和基因改造提供理论依据，并为本课题利用基因工程菌进行高效废水生物处理奠定基础。但由于膜蛋白的特殊性，对AMO、HAO、NXR这3个酶的研究仍有很大的局限性，由于其氧化呼吸链及能量传递机制迄今未有充分的解释，因此给在重组工程菌中提高[70,71]它们的酶活带来一定的困难。为此，有研究人员指出可从以下几方面加强对AMO、HAO和NXR的研究：①可以借助X射线衍射晶体结构分析法对酶的高分辨率三维结构进行深入研究，并可并通过与底物类似物结合形成复合物的结构分析来研究酶与辅助因子的结合形式；②利用生物信息学等方法，对3种酶的编码基因从转录、翻译等水平进行深入探究；③进一步研究底物、产物和外界环境因素对酶活的影响及其原因，并尽可能更好的从理论上研究酶的催化机理，以期找到提高酶活性的最有效途径。1.3研究内容和技术路线实验室前期工作已确定了具有尿素代谢功能的氨氧化细菌、硝化细菌及其代谢的关键基因，并针对氨氧化细菌中关键基因构建功能性重组大肠杆菌。本研究基于实验室前期工作，对具亚硝化功能的关键基因进行改造、优化，并对硝化细菌中的关键基因进行研究，构建具有亚硝化和硝化功能的重组大肠杆菌，进一步进行地面模拟，探讨在真实空间环境下微生物处理尿液废水的基本生物学问题。本实验研究技术路线如图1-5所示。图1-5本实验研究技术路线Fig.1-5Thetechnicalrouteofthisexperiment8n北京理工大学硕士学位论文第2章材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株和质粒菌株质粒参见表2-1。表2-1.菌株及质粒Table2-1.Stainsandplasmids名称来源编号E.coliDH5α实验室保存L1DH5α(pDHC29::nxr)本研究L2DH5α(pTrc99a::pro-hao)本研究L3DH5α(pDHC29,pTrc99a)本研究L4DH5α(pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao)本研究L5DH5α(pTrc99a::pro-hao+C554+C552)本研究L6pTrc99a（Km）本研究P1pDHC29::nxr本研究P2pTrc99a::pro-hao本研究P3pTrc99a::pro-hao+C554+C552本研究P42.1.2引物引物采用VectorNTI8.0设计，序列见表2-2.表2-2.引物名称与序列Table2-2.PrimersandtheirsequencesPrimersSequences(5’–3’)OutcomepHL413B-FataagaatgcggccgcgtagcttgcagtgggcttacatgpHL413B-Rataagaatgcggccgcgtcgcttggtcggtcatttc构建pTrc99apTrcbackbone–Fataagaatgcggccgcctgtcagaccaagtttactcatatatactttag（Km）pTrcbackbone–Rataagaatgcggccgcattgtctcatgagcggatacatatt9n北京理工大学硕士学位论文nxr1-SacI-Fccctcactaaagggaacaaaagctggagctatgagcaaaaagcccctagcgtc构建nxr1-XbaI-RaattcctgcagcccgggggatccactagttcgggctgagcgagttcgtcagpDHC29::nxrnxr2-XbaI-Fcacccctgacgaactcgctcagcccgagatagattctcgactgggccgaggnxr2-XbaI-Rggccccccctcgaggtcgacggtatcgatactatggtcctcttgccggatcgpro-hao-BamHI-Fagaccatggaattcgagctcggtacccgggcggagagcgctgcttacctgg构建pTrc99a::pro-haopro-hao-HindIII-RctgaaaatcttctctcatccgccaaaacagccaccaggcttgtgcaaccggttgagaccatggaattcgagctcggtacccgggtctagaaaagaggagaaaatgaaaaC554-BamHI-FaatgatagcctgcgggcC554-SalI-Rccaaaacagccaagcttgcatgcctgcaggtcgactgactactcctccggaacaaacttatgaggtttgttccggaggagtagtcagaaagaggagaaa构建C552-SalI–FatgatgaaaacagcttggttaggtacapTrc99a::pro-haoC552-HindIII–Rctgaaaatcttctctcatccgccaaaacagccatcatttgagcgtcaggatccagt+C554+C552pro-hao-SacI-Facacaggaaacagaccatggaattcgagctcctggatactgatttaacggagaatgpro-hao-XbaI-Rgctatcattattttcattttctcctcttttagctcgggtctgcttacgcttg2.1.3主要工具酶及试剂盒PCR聚合酶购于TaKaRa公司，限制性内切酶购于Fermentas公司，质粒小提质粒盒及胶回收试剂盒购于Axygen公司等。2.1.4培养基和主要化学试剂的配制-1（1）本研究中对菌体培养如无特殊说明均用LB培养基：NaCl,10gL;胰蛋白-1-1胨,10gL；酵母浸提物,5gL；pH7.0，121℃灭菌20min。固体培养基时琼脂加-1入量为15gL。（2）硝化重组菌株发酵培养基（M9液体培养基）：先配制1M的MgSO4:称取MgSO4•7H2O2.46g，加三蒸水10ml溶解，高压灭菌备用；配制1M的CaCl2:称取CaCl2•6H2O2.191g，加三蒸水10ml溶解，高压灭菌备用；再配制5×M9盐溶液：Na2HPO4•7H2O12.8g，KH2PO43.0g，NaCl0.5g，NH4Cl1.0g，加三蒸水200ml溶解，121度灭菌15分钟；配制20%的葡萄糖溶液：6g葡萄糖加双蒸水30ml溶解，0.1842微米滤器过滤除菌；无菌操作配制M9培养基：5×M9盐溶液200ml，1M的MgSO42ml，20%的葡萄糖溶液20ml，1M的CaCl20.1ml，加灭菌双蒸水至1000ml。（3）亚硝酸氮测定显色剂：取250ml三蒸水和50ml磷酸（15mol/L）置入500ml烧杯内；加入20.0g4-氨基苯磺酰胺（NH2C6H4SO2NH2）；再将1.00gN-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐（C10H7NHC2H4NH2•2HCl）溶于上述溶液中；移至500ml容量瓶中，用10n北京理工大学硕士学位论文水稀释至标线，摇匀、保存。注：贮存于棕色试剂瓶中，2-5℃，至少可稳定一个月。2.1.5实验仪器PCR仪：TProfessional型，Biometra公司，德国；电泳仪：DYY-6C型，北京市六一仪器厂，中国；紫外可见分光光度计：TU-1810/1810S型，北京普析通用仪器有限公司,中国；超低温冰箱：MDF-U53V型，Panasonic公司，日本；超纯水仪：Direct8型，Milli-Q公司，美国；高速冷冻离心机：Z-16PK型，Sigma公司，美国。2.2实验方法2.2.1常规分子操作克隆方法[72]本研究中涉及的常规分子操作包括：污泥样本总DNA的提取，引物设计，PCR，胶纯化回收，酶切，连接，TA克隆，Infusion克隆，Gibson无缝连接，感受态制备与[73]转化，质粒提取，菌落PCR等。选择载体、连接克隆目的基因是分子克隆工作的一个重要部分，在异源宿主中要最大化目标代谢产物的产量，需要编码代谢途经的多个基因的协调与平衡，过量的表[74]达外源基因可能对宿主细胞造成毒害从而导致终产物产量的减少。本研究选择可以共存的质粒pTrc99a,pDHC29作为表达载体。（1）引物设计根据已报道全基因组的亚硝化细菌欧洲亚硝化单胞菌（NitrosomonaseuropaeaATCC19718）中功能基因hao和硝化细菌维氏硝化细菌（NitrobacterwinogradskyiNb-255）中功能基因nxrAXB，选取基因上游和下游一段序列为引物互补序列部分，根据质粒pDHC29和质粒pTrc99a性质的不同选择合适的限制性酶切位点，引物序列如表2-2所示，根据引物的设计原则：引物3′末端不互补；引物分子内不互补；引物的组分、解链温度和长度适中；引物的内部稳定性；无引物自身二级结构等。利用软件VectorNTI，对引物进行分析，结果完全符合要求。（2）活性活性污泥模板基因组的提取根据实验室前期工作，已经确定了活性污泥中有代表性的亚硝化功能细菌NitrosomonaseuropaeaATCC19718，硝化功能细菌NitrobacterwinogradskyiNb-255，因此提取活性污泥全基因组作为后续基因克隆模板。具体步骤如下：取1ml污泥样品，12000g离心8min，弃去上清液；加1mlTENP缓冲液，加玻11n北京理工大学硕士学位论文璃球，振荡3min，12000g离心3min，弃去上清液；加1mlPBS缓冲液，振荡3min，12000g离心3min，弃去上清液；加100μLTE缓冲液（10μL10×TE+90μL三蒸水），再加少量溶菌酶，混匀，37℃水浴30min；加少量蛋白酶K，混匀，37℃水浴30min；加1ml裂解液，65℃水浴1h，12000g离心3min，取上清液；加Tris饱和酚500μL抽提3次，12000g离心3min，取上清液；加氯仿400μL抽提2次，12000g离心3min，取上清液；加入预冷的无水乙醇（上述上清液2.5倍体积），12000g离心5min，弃去上清液（如无DNA析出，加3mol/L1/10体积的NaAc溶液，-20℃沉淀20min）；加入1ml70%乙醇清洗2次，弃去上清液，放置几分钟使酒精挥发干净，加适量的TE缓冲液或灭菌的三蒸水溶解，-20℃保存。（3）质粒提取质粒提取过程参照Axygen公司的质粒小量提取试剂盒说明书进行。（4）PCR反应体系在200μL的PCR管中依次加入下列反应液，离心混匀，将PCR管放入PCR仪，设定反应程序:98℃5min，1个循环；98℃10s；50℃5s；72℃3min30s，30个循环；72℃10min，1个循环。进行反应，结束后取出离心管放置于4℃冰箱保藏。（5）重组质粒的构建及验证PCR得到的目的片段与由限制性内切酶双切后的载体经胶回收试剂盒回收后，加[73]入Gibson反应体系进行连接，电转化法导入DH5α感受态细胞中；参考文献，挑取阳性转化子进行菌落PCR，对所需验证基因进行扩增验证选取菌落PCR结果正确的阳性转化子进行质粒的提取，质粒提取方法参照2.2.1（3），同时将所提取的质粒进行单酶或双酶切，最后将提取的疑似质粒送至金唯智公司和中美泰和公司进行序列测定，克隆基因的测序结果可采用VectorNTI软件进行序列的拼接并与NCBI公布的序列进行比对。2.2.2重组菌的摇瓶发酵方法（1）硝化重组菌的摇瓶发酵方法r接种硝化重组菌株单菌落于含相应抗生素的LB培养基中（Cm），180r/min，37℃摇瓶振荡培养过夜；次日按100%（v/v）的接种量转接到30mL新鲜的M9培养基中培养1h，分别加入不同浓度的底物（亚硝酸盐，硝酸盐），180r/min，30℃继续培养，每隔几个小时取样分析。（2）硝化重组菌的厌氧摇瓶发酵方法12n北京理工大学硕士学位论文r接种硝化重组菌株单菌落于含相应抗生素的LB培养基中（Cm），180r/min，37℃摇瓶振荡培养过夜，次日按5%（v/v）的接种量转接到30mL新鲜的LB培养基中培养3h，加入不同浓度的底物硝酸盐，30℃厌氧培养，每隔几个小时取样分析。（3）亚硝化重组菌的摇瓶发酵方法r接种亚硝化重组菌株单菌落于含相应抗生素的LB培养基中（Amp），180r/min，37℃摇瓶振荡培养过夜；次日按5%（v/v）的接种量转接到30mL新鲜的LB培养基中培养3h，分别加入不同浓度底物盐酸羟胺，180r/min，30℃继续培养，每隔几个小时取样分析。（4）双质粒重组菌的摇瓶发酵方法rr接种双质粒重组菌株单菌落于含相应抗生素的LB培养基中（Cm、Amp），180r/min，37℃摇瓶振荡培养过夜；次日按100%（v/v）的接种量转接到30mL新鲜的M9培养基中培养1h，分别加入不同浓度的底物（盐酸羟胺），180r/min，30℃继续培养，每隔几个小时取样分析。2.3分析方法2.3.1离子色谱法测定硝态氮（1）离子色谱法分离原理及过程[76-77]离子色谱是高效液相色谱的一种，利用离子之间对离子交换树脂的亲和力差异而进行分离，适用于亲水性阴、阳离子及有机酸的分离。以阴离子的分离为例，样品进样后，先在分析柱的离子交换位置间进行离子交换，样品被保留，接下来用淋洗-2---液如NaOH分析样品中的阴离子如Cl、SO4、NO2和NO3，保留在柱上的阴离子由于对树脂亲和力强弱不同依次被洗脱下来，以上即为离子色谱分离原理及过程。（2）离子色谱法测定亚硝态氮、硝态氮配制一定浓度的亚硝酸盐和硝酸盐标准液，作为参考标准，利用出峰时间和峰面积得到每个样品中含有的亚硝酸盐和硝酸盐浓度。2.3.2分光光度法测定亚硝态氮[75]参考文献，测定亚硝态氮的显色剂配制方法如2.1.4（4），亚硝酸盐氮标准工作液cN=1.00mg/L，分别配制0.02mg/L、0.06mg/L、0.1mg/L、0.14mg/L、0.2mg/L标准液，测定在540nm处吸光度，并绘制标准曲线（光程长为10mm的比色皿，亚硝酸盐氮的浓度在0.2mg/L以内符合比尔定律，最大吸光度波长为540nm）。终得到计算浓度公式Y=1.4239X，相关系数R=0.9487，相关性较好。13n北京理工大学硕士学位论文20141202-LIDAN2CD_41.6μS2-NO2-3.08730.020.010.01-test-20110912-1-2.7403-test-20110912-3-3.7234-NO3-4.770min-4.61.822.002.202.402.602.803.003.203.403.603.804.004.204.404.604.805.005.205.405.605.806.10（A）20141202-LIDAN3CD_30.0μS4-NO3-4.74320.010.01-test-20110912-1-2.7402-3.2473-test-20110912-3-3.7370.0min-5.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.015.0(B)图2-1.亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱峰图Fig.2-1.TheIonChromatographicpeakfigureofNitriteandNitrate如图2-1（A）为50mg/L的标准亚硝酸盐的出峰图，图2-1（B）为50mg/L的标准硝酸盐的出峰图。取样分析：样品经过离心（10000g，10min）收集上清5ml，滴加显色剂100μL,充分混匀，静止20min-30min，进行分光光度法检测。14n北京理工大学硕士学位论文第3章实验研究3.1尿素代谢相关基因重组菌株的构建3.1.1引言本实验室前期工作包括：建立尿液废水反应系统，利用16SrRNA研究系统中微生物菌群结构；确定了两种主要菌株：欧洲亚硝化单胞菌NitrosomonaseuropaeaATCC19718与维氏硝化细菌NitrobacterwinogradskyiNb-255是代谢尿液中的主要污染物——尿素过程中的重要菌株；进而确定并克隆了亚硝化基因amoCAB，hao和硝化基因nxrAXB，并成功构建了亚硝化重组大肠杆菌DH5α(pTrc99a::amoCAB,pDHC29::hao)。在此工作的基础上，本研究克隆硝化基因nxrAXB到大肠杆菌DH5α中，构建较高丰度膜蛋白表达系统DH5α（pDHC29::nxr），使其拥有硝化功能，实现亚硝酸到硝酸盐的转化；再通过构建DH5α(pTrc99a::pro-hao)重组亚硝化菌株，进一步构建双质粒表达菌株DH5α(pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao)，实现从盐酸羟胺到硝酸盐的转化过程；并进一步优化DH5α(pTrc99a::pro-hao)催化体系，构建包含两个与电子传递链相关色素蛋白的催化体系DH5α(pTrc99a::pro-hao+C554+C552)，以期能提高HAO催化活性。3.1.2结果与讨论3.1.2.1亚硝化相关重组质粒pTrc99a::pro-hao的构建为较稳定的储存pTrc99a质粒，将其Amp抗性改为Km抗性。（1）pTrc99a（Km抗性）的构建:以pTrc99a（Amp抗性）（如图3-1）质粒为模板，与设计的引物pTrcbackbone–F和pTrcbackbone–R反向PCR扩增，以去除Amp抗性;以质粒pHL413B（如图3-2）为模板，与设计的引物pHL413B-F和pHL413B-R克隆Km抗性片段;T4连接酶将以上两片段连接，得到有Km抗性的pTrc99a质粒（如图3-3）。（2）pro-hao基因的克隆利用尿液废水反应器中提取的污泥样品总DNA，与设计的引物pro-hao-BamHI-F，pro-hao-HindIII-R扩增，纯化目的片段，得到以下的PCR凝胶电泳图谱如下：实验结果如图3-4所示，图（A）中M为marker，1为pro-hao基因纯化产物，大小在2000bp与2500bp之间，与实际大小2258bp相符。图（B）中1为pTrc99a载体经BamHI和HindIII酶双切纯化后的产物，大小在4000bp与5000bp之间，与载体15n北京理工大学硕士学位论文实际大小4294bp相符。r图3-1.pTrc99a（Amp）质粒图谱rFig.3-1.ThemapofthepTrc99a（Amp）图3-2.pHL413B质粒图谱Fig.3-2.ThemapofthepHL413B16n北京理工大学硕士学位论文r图3-3.pTrc99a（Km）质粒图谱rFig.3-3.ThemapofthepTrc99a（Km）图3-4.PCR扩增pro-hao产物回收的电泳图Fig.3-4.Electrophoregramofextractedgenepro-haoafterPCR图中（A）（B）中M为DNAMarker；（A）中1为pro-hao基因纯化产物；（B）中1为pTrc99a载体双酶切纯化后产物。（3）重组质粒的酶切验证提取重组质粒pTrc99a::pro-hao，分别用相应的限制性内切酶进行酶切得到的凝胶电泳图如下：实验结果如图3-5所示,图（A），泳道1~8是pTrc99a线性载体与pro-hao片段连接后的重组质粒，观察到重组质粒并非大小均一，选取相对较大的重组质粒（5、7号泳道）进行酶切验证。图（B），泳道1显示的是图（A）5号泳道的疑似质粒，泳17n北京理工大学硕士学位论文道2、3是利用限制性内切酶BamHI将疑似重组质粒5、7号进行单酶切的电泳图谱，理论上产生大小为6500bp左右的片段（pTrc99a质粒4294bp，hao2258bp）,重组质粒实验结果如图（B）泳道2、3所示的大小均较为合理（6~8kb之间），挑选其中之一送测序公司测序进一步验证。图3-5.pTrc99a::pro-hao酶切电泳图谱Fig.3-5.ElectrophoregramofplasmidpTrc99a::pro-haodigestedbyendonuclease图中（A）（B）中M为DNAMarker；（A）中泳道1~8是提取的pTrc99a线性载体与pro-hao片段连接后的疑似重组质粒图谱；（B）中泳道2、3泳道为图（A）泳道5的疑似质粒双酶切后的电泳图谱。对重组质粒的测序结果表明，克隆的基因插入的位置和顺序都正确，将测序公司测出的序列与Genbank公布序列相比对，结果基本与NitrosomonaseuropaeaATCC19718中hao基因序列（见附录）吻合，构建的重组质粒如图3-6所示。图3-6.重组质粒pTrc99a::pro-hao示意图Fig.3-6.ThemapofrecombinantplasmidsofpTrc99a::pro-hao18n北京理工大学硕士学位论文3.1.2.2硝化相关重组质粒pDHC29::nxrAXB的构建（1）nxrAXB基因的克隆由于nxrAXB基因片段较大（6925bp），将该基因分成2段nxr1片段和nxr2片段，分别进行PCR扩增，nxr1片段与载体pDHC29（图3-7）连接后，再将该重组质粒与nxr2片段连接。利用尿液废水反应器中提取的污泥样品总DNA，与设计的引物nxr1-SacI-F，nxr1-XbaI-R，nxr2-XbaI-F和nxr2-XbaI-R扩增,纯化目的片段，得到以下的PCR凝胶电泳图谱如下：实验结果如图3-8所示，图（A）为活性污泥样品细菌总DNA的提取电泳图，泳道M为marker，泳道1，2为污泥总DNA。图（B），图（C）分别为nxr1片段和nxr2片段纯化产物，大小分别为3492bp和3433bp。（2）重组质粒的酶切验证提取重组质粒pDHC29::nxr1，pDHC29::nxr，分别用相应的限制性内切酶进行酶切得到的凝胶电泳图如下：实验结果如图3-9所示，图（A）中泳道1为重组质粒pDHC29::nxr1在限制性内切酶HindIII作用后的电泳图谱，条带的长度在6000bp和8000bp之间，符合pDHC29质粒，nxr1基因片段长度总和，约7100bp（pDHC29质粒的长度3608bp和nxr1基因片段的长度3492bp）。图（B）为提取的疑似重组质粒pDHC29-nxr1-nxr2，图（C）中泳道1为重组质粒pDHC29-nxr1-nxr2在限制性内切酶NcoI作用后的电泳图谱，条带的长度在10000bp左右，符合pDHC29质粒，nxr1基因片段和nxr1基因片段长度总和，约10000bp（pDHC29质粒的长度3608bp，nxr1基因片段的长度3492bp和nxr1基因片段的长度3433bp）泳道2为重组质粒pDHC29::nxr在限制性内切酶NotI和NcoI作用后的电泳图谱，两条带的长度分别在4000bp左右和6000bp左右，符合pDHC29质粒，nxr1基因片段和nxr2基因片段长度总和，约10000bp。19n北京理工大学硕士学位论文图3-7.pDHC29质粒图谱Fig.3-7.ThemapofthepDHC29图3-8.PCR扩增nxr产物回收的电泳图Fig.3-8.ElectrophoregramofextractedgenenxrafterPCR图中（A）、（B）、（C）中M为DNAMarker；（A）中泳道1、2为活性污泥样品细菌总DNA的提取电泳图，图（B）和图（C）泳道1分别为nxr1片段和nxr2片段纯化产物电泳图谱。对重组质粒的测序结果表明，克隆的基因插入的位置和顺序都正确，将测序公司测出的序列与Genbank公布序列相比对，结果基本吻合，构建的重组质粒如图3-10所示。20n北京理工大学硕士学位论文图3-9.pDHC29::nxr1，pDHC29::nxr酶切电泳图谱Fig.3-9.ElectrophoregramofplasmidpDHC29::nxr1，pDHC29::nxrdigestedbyendonuclease图中（A）（B）（C）中M为DNAMarker；（A）泳道1为pDHC29::nxr1单酶切后的电泳图谱；（B）中泳道1为提取的疑似pDHC29::nxr质粒图谱；（C）中泳道1、2分别为pDHC29::nxr质粒单酶切和双酶切后的电泳图谱。图3-10.重组质粒pDHC29::nxr示意图Fig.3-10.ThemapofrecombinantplasmidsofpDHC29::nxr3.1.2.3双质粒表达系统的构建使用氯化钙法，将菌株DH5α(pDHC29::nxr)、DH5α(pDHC29)制备成为感受态细胞，并分别热击导入质粒pTrc99a::pro-hao、pTrc99a，筛选出阳性克隆子（见图3-11）。如图3-11(A)，泳道1为疑似克隆子双重组质粒（由pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao组成)电泳图谱，图谱显示泳道产生两条带，其条带位置分别与21n北京理工大学硕士学位论文pDHC29::nxr（图3-8-B，1号泳道），pTrc99a::pro-hao（图3-4-B，1号泳道）相近。3-11(B)中泳道1为双重组质粒在限制性内切酶NotI作用后的电泳图谱，图谱显示泳道产生两条带，由于重组质粒pTrc99a::pro-hao上，没有NotI单酶切位点，而重组质粒pDHC29::nxr上有，所以上面一条带大小在10kb左右，为单切后的重组质粒pDHC29::nxr（约10kb），下面一条带大小为未切的重组质粒pTrc99a::pro-hao，与图3-8-B，1号泳道相近。3-11(C)中泳道1为双重组质粒在限制性内切酶HindIII作用后的电泳图谱，图谱显示泳道产生两条带，由于重组质粒pTrc99a::pro-hao上有HindIII单酶切位点，而重组质粒pDHC29::nxr上没有，所以上面一条带大小在8kb左右，与3-2(A)泳道1中上面一条带大小吻合，即未切的重组质粒pDHC29::nxr，下面一条带大小在6000bp与8000bp之间，为单切后的重组质粒pTrc99a::pro-hao，大小与理论值（6.5kb）相符。图3-11.双重组质粒构建过程电泳图Fig.3-11.Electrophoregramofdoublerecombinantplasmidinconstruction图中（A）（B）（C）中M为DNAMarker；（A）泳道1为疑似克隆子双重组质粒（由pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao组成)电泳图谱；图（B）（C）中泳道1分别为双重组质粒经NotI和HindIII酶切后的电泳图谱。3.1.2.4重组质粒pTrc99a::pro-hao+C554+C552的构建（1）C554、C552编码基因及pro-hao基因的克隆利用尿液废水反应器中提取的污泥样品总DNA，与设计的引物C554-BamHI-F，C554-SalI-R，C552-SalI–F，C552-HindIII–R，pro-hao-SacI-F，pro-hao-XbaI-R扩增22n北京理工大学硕士学位论文C554、C552编码基因及pro-hao基因，纯化目的片段，得到以下的PCR凝胶电泳图谱如下：实验结果如图3-12所示，图（A）、图（B）和图（C）中M为marker，图（A）中1为编码C554基因纯化产物，2为pTrc99a质粒经BamHI和SalI双酶切后的纯化产物；图（B）中1为编码C552基因纯化产物，2为pTrc99a+C554质粒经SalI和HindIII双酶切后的纯化产物；图（C）中1为pTrc99a+C554+C552质粒经SacI和XbaI酶切后的纯化产物，2为pro-hao基因纯化产物，大小均与理论值相差无几。（2）重组质粒的酶切验证提取重组质粒pTrc99a::pro-hao+C554+C552，用相应的限制性内切酶进行酶切得到的凝胶电泳图如下：实验结果如图3-13所示，图中泳道1为重组质粒pTrc99a::pro-hao+C554+C552在限制性内切酶EcoRI作用后的电泳图谱，条带的长度在8000bp和10000bp之间，符合pTrc99a质粒，pro-hao、C554和C552基因片段长度总和，约9000bp（pDHC29质粒的长度4294bp、pro-hao基因片段的长度2258bp、编码C554基因长度为760bp、编码C552基因长度为315bp）。对重组质粒的测序结果表明，克隆的基因插入的位置和顺序都正确，将测序公司测出的序列与Genbank公布序列相比对，结果基本吻合，构建的重组质粒如图3-14所示。图3-12.PCR扩增C554、C552和pro-hao基因产物回收的电泳图Fig.3-12.ElectrophoregramofextractedgeneC554、C552andpro-haoafterPCR23n北京理工大学硕士学位论文图中（A）（B）（C）中M为DNAMarker；图（A）（B）中泳道1分别为编码C554基因和编码C552基因纯化产物的电泳图谱；图（A）泳道2为pTrc99a质粒双酶切后纯化产物的电泳图谱；图（B）中泳道2为pTrc99a+C554质粒双酶切后的纯化产物电泳图谱；图（C）中泳道1为pTrc99a+C554+C552质粒双酶切后的纯化产物，电泳图谱泳道2为pro-hao基因纯化产物电泳图谱。图3-13.pTrc99a::pro-hao+C554+C552酶切电泳图谱Fig.3-13.ElectrophoregramofplasmidpTrc99a::pro-hao+C554+C552digestedbyendonucleasepTrc99a::pro-hao+C554+C552图3-14.重组质粒pTrc99a::pro-hao+C554+C552示意图Fig.3-14.ThemapofrecombinantplasmidsofpTrc99a::pro-hao+C554+C5523.1.2.5讨论（1）载体的选择为了使重组菌株既能容忍一定的细胞毒性，又能同时行使硝化功能，本课题选取了可相容的质粒pTrc99a（中低拷贝）与pDHC29（中高拷贝）作为共表达系统的基本结构；期望可以将膜蛋白信号肽的封闭、开启，与两种基因拷贝数的高低有机地结24n北京理工大学硕士学位论文合，进一步实现重组菌株低细胞毒性与高效硝化功能的特性。图3-7所示为pDHC29表达载体的图谱，该质粒的复制子来自RSF1030突变菌株[78]，可以与复制子来自pMB1和p15A系列的质粒共表达。pDHC29表达载体为中高拷贝载体，启动子为lacZ启动子，多克隆位点位于lacZ区域中间，可利用蓝白斑进行筛选。除此之外，pDHC29表达载体含有氯霉素抗性表达基因，可通过抗性筛选阳性克隆子。图3-1所示为pTrc99a原核表达载体的图谱。该质粒的复制子来自pBR322，trc启动子为杂交启动子，是trp启动子和lac启动子的拼合，它同时运用到色氨酸和乳糖操纵子两种模型对基因转录进行调控，具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。pTrc99a原核表达载体为中低拷贝载体，防止目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒。本实验中用到的pTrc99a和pDHC29质粒，具有不同的复制子，为相容性质粒，分别构建了pDHC29::nxr，pTrc99a::pro-hao两种质粒，同时构建DH5α(pDHC29::nxr)，DH5α(pTrc99a::pro-hao)两种重组菌株，分别实现了硝化和亚硝化途径的构建；本研究采用双质粒共表达的方式实现nxr基因和hao基因的共表达，得到了重组菌株DH5α(pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao)，构建了以盐酸羟胺为底物合成硝酸盐的代谢途径。（2）氨氧化电子传递链中的两个关键色素蛋白C554和C552[79-80]通过文献查阅得知，在欧洲亚硝化单胞菌氨氧化过程中，两个色素蛋白——C554和C552在电子传递过程中起着至关重要的作用。在欧洲亚硝化单胞菌中，C554色素蛋白由cycA基因编码，位于HAO编码基因的下游，共有3个拷贝，其编码区域的核苷[81-82]酸序列几乎一样。C554色素蛋白被认为是HAO氧化盐酸羟胺释放出的电子的直接受体；[83-84]C552色素蛋白由cycB基因编码，其大小为9.1KDa，它接受来自C554色素蛋白的电子。这两个色素蛋白在HAO氧化过程中传递电子，而大肠杆菌中没有编码两个色素蛋白的基因，于是考虑通过构建质粒pTrc99a::pro-hao+C554+C552将这两个蛋白与HAO酶同时在大肠杆菌中异源表达，以期能提高HAO催化活性。3.1.3小结本试验构建了DH5α（pDHC29::nxr）重组硝化菌株和DH5α(pTrc99a::pro-hao)重组亚硝化菌株，并构建双质粒表达菌株DH5α(pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao)，以期实现从盐酸羟胺到硝酸盐的转化过程；构建包含两个与电子传递链相关色素蛋白的催化体系DH5α(pTrc99a::pro-hao+C554+C552)，以期能提高HAO催化活性。25n北京理工大学硕士学位论文3.2尿素代谢相关基因重组菌株催化功能的研究3.2.1引言3+亚硝酸盐氧化还原酶(NXR)的亚基NxrB的双核中心含无血红素的Fe并且有4个谷3+氨酸残基（Gln）来协调控制无血红素Fe配基,据此推测Fe对NXR的酶活会有一定[64]2+[59]的影响，又有研究通过抑制剂选择法表明，NXR的酶活也依赖于Mo的存在,本研究期望通过添加无机离子来提高NXR活性。实验室前期发酵工作已证明HAO在大肠杆菌中异源表达有一定的亚硝酸盐产生，[22]2+2+本研究在此基础上进行发酵及优化，进一步测定其催化情况；根据文献，Cu、Fe2+及Zn的加入会增加AMO酶活，提高其转化氨氮为盐酸羟胺的能力，依此推断这些无机离子的加入可能会影响HAO活性，本研究通过加入不同的离子浓度来验证这一[85-86]假设；通过文献查阅得知，在欧洲亚硝化单胞菌氨氧化过程中，两个色素蛋白——C554和C552在电子传递过程中起着至关重要的作用，而大肠杆菌中没有编码两个色素蛋白的基因，于是通过构建质粒pTrc99a::pro-hao+C554+C552将这两个蛋白与HAO酶同时在大肠杆菌中异源表达，以期能提高HAO催化活性。3.2.2结果与讨论3.2.2.1亚硝化重组菌株L3催化功能的研究（1）诱导温度对L3催化功能的影响如2.2.2（3）方式所述，分别在25℃、30℃和37℃下诱导催化，6h、18h测定亚硝酸盐含量，检测结果如图3-15所示，由图可知，诱导温度对L3催化功能的影响并不明显。后期实验诱导时间统一为30℃。图3-15.不同诱导温度下亚硝酸盐产量Fig.3-15.Nitriteproductionindifferenttemperature26n北京理工大学硕士学位论文（2）无机离子对L3催化功能的影响发酵方法如上2.2.2（3）所述，添加0.25g/L的底物盐酸羟胺，同时按照表3-1添2+2+2+加不同浓度的Cu、Fe及Zn，对照组添加0.25g/L的底物盐酸羟胺，不添加任何离子。30℃培养，检测18h时HAO转化盐酸羟胺为亚硝酸盐的能力。表3-1重组菌株L3的摇瓶发酵参数Table3-1ShakingflaskfermentationparametersofrecombinantstrainL32+2+2+编号盐酸羟胺-氮浓度Cu浓度Fe浓度Zn浓度(mg/L)(mM)(mM)(mM)000001106.10.10.10.12106.10.20.20.23106.10.30.30.34106.10.50.50.55106.10.60.60.6检测结果如图3-16所示，不加任何离子时，发酵18h亚硝酸盐氮产量为0.184mg/L,2+2+而分别加入3种不同的离子后，亚硝酸盐氮产量上升明显。可以看出，加入Cu、Fe2+2+和Zn的最适浓度分别为0.5mM、0.1mM和0.2mM。且加入0.5mMCu时，亚硝酸盐氮产量最高，达到3.059mg/L，同比增长15倍。图3-16.不同离子浓度下亚硝酸盐产量Fig.3-16.Nitriteproductionunderdifferentionconcentration（3）底物浓度对L3催化功能的影响发酵方法如上2.2.2（3）述，根据表3-2添加不同浓度的底物盐酸羟胺，同时添27n北京理工大学硕士学位论文2+加终浓度为0.5mM的Cu30℃培养，测量其6h、18h和24h时转化盐酸羟胺为亚硝2+酸盐的能力；对照组添加不同浓度的底物盐酸羟胺，不加Cu。表3-2重组菌株L3的摇瓶发酵参数Table3-2ShakingflaskfermentationparametersofrecombinantstrainL32+编号盐酸羟胺-氮浓度Cu浓度(mg/L)(mM)000153.50.52106.10.53212.10.54318.20.55424.20.5发酵结果如图3-17（A）、（B）、（C）所示，图（A）为发酵18h时对照组和2+-2+加Cu组在不同底物浓度条件下NO2的产量，可以看出，加入0.5mM的Cu比未加2+-2+Cu的对照组，NO2的产量显著增加了15倍。图（B）和图（C）分别为不加Cu和2+-加Cu情况下加入不同底物浓度时NO2的产量，由图可知，底物浓度为212.1mg/L时，--NO2的产量最高，而随着底物浓度上升，NO2的产量几乎为0。（A）28n北京理工大学硕士学位论文（B）（C）图3-17.不同时间段亚硝酸盐产量Fig.3-17.Nitriteproductionindifferenttimes2+图（A）为发酵18h时对照组和加Cu组在不同底物浓度条件下亚硝酸盐氮量；图（B）和图2+2+（C）分别为不加Cu和加Cu情况下加入不同底物浓度时亚硝酸盐氮量。（4）亚硝化重组菌株L3及优化菌株L6催化功能的比较发酵方法如2.2.2（3）所述，根据表3-2不同浓度的底物盐酸羟胺，同时添加终2+浓度为0.5mM的Cu30℃培养，测量并比较两者6h、18h时转化盐酸羟胺为亚硝酸盐的能力。29n北京理工大学硕士学位论文（A）(B)图3-18不同时间段亚硝酸盐产量Fig.3-18Nitriteproductionindifferenttimes图（A）、（B）分别为发酵6h、18h时重组菌株L3和L6产生的亚硝酸盐氮量如图3-18示，图（A）、（B）为分别为发酵6h、18h时L3和L6产生的亚硝酸盐氮量对比，用SPSS软件进行独立样本T检验，差异不显著（p>0.05），即DH5α(pTrc99a::pro-hao+C554+C552)菌株在添加了两个色素蛋白后并未比没添加色素蛋白的菌株DH5α(pTrc99a::pro-hao)催化盐酸羟胺能力提高很多。3.2.2.2硝化重组菌株L2催化功能的研究（1）底物浓度对L2催化功能的影响L2摇瓶发酵，方法如2.2.2（1）所述，根据表3-3添加不同浓度的底物亚硝酸盐，30℃培养，测量发酵4h、8h、20h后其转化亚硝酸盐为硝酸盐的能力。30n北京理工大学硕士学位论文表3-3重组菌株L2的摇瓶发酵参数Table3-3ShakingflaskfermentationparametersofrecombinantstrainL2编号亚硝酸盐浓度亚硝酸盐-氮浓度(g/L)(mg/L)10020.240.630.6121.741202.952405.863608.7发酵结束，各底物浓度条件下亚硝酸盐转化为硝酸盐情况如图3-19：(A)-(E)分别为底物亚硝酸盐氮浓度为40.6mg/L、121.7mg/L、202.9mg/L、405.8mg/L、608.7mg/L时生成的硝酸盐含量。（A）（B）（C）（D）31n北京理工大学硕士学位论文（E）图3-19.ICS测定不同时间段亚硝酸盐和硝酸盐的含量Fig.3-19.NitriteandnitratecontentindifferenttimeperiodswithICS图(A)-(E)分别为底物亚硝酸盐氮浓度为40.6mg/L、121.7mg/L、202.9mg/L、405.8mg/L、608.7mg/L时生成的硝酸盐含量。实验结果表明，30℃培养，5个底物亚硝酸盐-氮浓度（40.6mg/L、121.7mg/L、202.9mg/L、405.8mg/L、608.7mg/L）下都有一定量的硝酸盐氮产生，且在405.8mg/L浓度下硝酸盐氮产量最大（63.5mg/L），继续增加底物浓度为608.7mg/L，产量却几乎为0。分析可能是底物浓度过大，反而抑制了NXR的酶活。4h、8h和20h这3个时间段相比，4h时硝酸盐氮产生量最大，随着取样时间增大，硝酸盐氮产生量逐渐降[51]低，而底物亚硝酸盐氮量反而增加。由文献可知，NXR酶为双功能酶，在氧气不足的条件下会还原硝酸盐为亚硝酸盐，分析可能是因为随着培养时间的增长，培养环境里的溶氧量逐渐下降，NXR酶将已产生的硝酸盐还原成为亚硝酸盐所致。（2）厌氧条件下L2催化功能的研究针对上述NXR酶能在氧气缺乏情况下转化硝酸盐为亚硝酸盐的论断，设计实验：L2摇瓶发酵，方法如2.2.2（2）所述，根据表3-4添加不同浓度的底物硝酸盐，30℃厌氧培养，测量发酵5h后其转化硝酸盐为亚硝酸盐的能力。由表3-5可知，厌氧条件下，加入少量的硝酸盐未产生亚硝酸盐，逐渐提高底物浓度，亚硝酸盐氮产生量增加，说明NXR酶确实能在氧气缺乏情况下转化硝酸盐为亚硝酸盐。32n北京理工大学硕士学位论文表3-4重组菌株L2的厌氧发酵参数Table3-4AnaerobicfermentationparametersofrecombinantstrainL2编号硝酸盐浓度硝酸盐-氮浓度(g/L)(mg/L)00010.023.320.058.230.116.540.232.9发酵结束，各底物浓度条件下硝酸盐转化为亚硝酸盐情况如表3-5：表3-5重组菌株L2的厌氧发酵结果Table3-5AnaerobicfermentationresultsofrecombinantstrainL2编号硝酸盐-氮浓度亚硝酸盐-氮浓度(mg/L)（mg/L）00013.3028.20316.50.8432.918.4（3）无机离子对L2催化功能的影响[59，64]2+3+由文献可知，Mo、Fe对NXR活性有一定的促进作用，故设计实验测量添加无机离子对NXR酶活的影响。L2摇瓶发酵，如上述2.2.2（1）方法，根据表3-62+3+添加底物亚硝酸盐，分别添加不同浓度的Mo和Fe，30℃培养，测量发酵5h后其转化亚硝酸盐为硝酸盐的能力。发酵结束，各实验组重组菌L2发酵上清液经离子色谱仪分析检测，加离子组和未加离子组并未有明显的差别，分析原因可能是添加的各离子浓度不合适，未能起到促进NXR酶活的作用。进一步的实验应考虑在细胞可容忍的范围内扩大添加离子浓度范围，测量其转化亚硝酸盐为硝酸盐的能力。33n北京理工大学硕士学位论文表3-6重组菌株L2的优化发酵参数Table3-6OptimizationfermentationparametersofrecombinantstrainL22+3+编号亚硝酸盐-氮Mo浓度Fe浓度（mg/L）（mM）（mM）00001405.8002-1405.80.2502-2405.80.502-3405.8102-4405.8203-1405.800.253-2405.800.53-3405.8013-4405.8023.2.2.3双质粒重组菌株L5催化功能的研究L5摇瓶发酵，方法如2.2.2（1）所述，根据表3-7添加不同浓度的底物盐酸羟胺，30℃培养，测量其转化盐酸羟胺为硝酸盐的能力。表3-7重组菌株L5的摇瓶发酵参数Table3-7ShakingflaskfermentationparametersofrecombinantstrainL5编号盐酸羟胺浓度盐酸羟胺-氮浓度（g/L）（mg/L）00010.142.420.284.830.3127.340.5212.151424.234n北京理工大学硕士学位论文发酵结束，各实验组重组菌L5发酵上清液经离子色谱仪分析检测，终产物硝酸盐氮产量几乎为0，而中间产物亚硝酸盐氮有很少的产量。3.2.2.4讨论实验证明，重组菌株L3催化底物盐酸羟胺有一定的产物（0.184mg/L）生成，当2+2+加入不同浓度的Fe和Zn时，亚硝酸盐氮产量同比增长10倍左右，且加入0.5mM2+2+2+2+的Cu时，亚硝酸盐氮产量增至3.059mg/L，同比增长15倍，说明Cu、Fe和Zn的加入对重组菌株有促进作用，但产量仍与实际生产应用相距甚远；重组菌株L6发酵，结果表明，两个色素蛋白的加入对HAO催化活性并未有显著的提高，分析原因可能是色素蛋白在大肠杆菌中表达出现问题，色素蛋白表达有一定的菌株依赖性，而且对培养条件的要求也比较苛刻，还可能因为大肠杆菌与欧洲亚硝化单胞菌密码子偏好不同所致。实验证明，重组菌株L2催化底物亚硝酸盐有一定的产物（63.5mg/L）生成，证明NXR得到了一定的表达却只有些许活性，可能是由于：1、重组大肠杆菌中缺少与NXR酶活性密切相关的膜内电子传递链，NXR酶活性未能充分体现；2、大肠杆菌对外源基因nxrAXB的信号肽识别能力较弱，导致膜蛋白无法正确定位，行使功能；3、NXR酶为双功能酶，在氧气不足的条件下会还原硝酸盐为亚硝酸盐。[59，64]2+3+根据文献可知，NXR活性有赖于Mo、Fe的存在，而重组菌株L2加入无机离子检测后，加离子组和未加离子组的硝酸盐氮产量并未有明显的差别，分析原因可能是添加的各离子浓度不合适，未能起到促进NXR酶活的作用。进一步的实验应考虑在细胞可容忍的范围内扩大添加离子浓度范围，测量其转化亚硝酸盐为硝酸盐的能力。双质粒重组菌株L5摇瓶发酵，终产物硝酸盐氮产量几乎为0，而中间产物亚硝酸盐氮有很少的产量，分析原因可能是：1.发酵条件对双质粒重组菌株不合适，导致在该条件下无终产物生成。2.大肠杆菌对外源基因hao、nxrAXB的信号肽识别能力较弱，导致膜蛋白无法正确定位，行使功能。3.2.3小结本试验对硝化重组菌DH5α(pDHC29::nxr)和亚硝化重组菌DH5α(pTrc99a::pro-hao)催化能力进行验证，检测到有一定的产量，说明NXR、HAO在大肠杆菌中有一定的2+3+表达；加入不同的无机离子检测，发现Mo和Fe的加入对NXR催化活性无太大影2+2+2+响，而Cu、Fe和Zn的加入的HAO催化活性提高很大，产量提升近15倍；DH5α35n北京理工大学硕士学位论文(pTrc99a::pro-hao+C554+C552)催化体系的构建，即两个色素蛋白和HAO的共表达也未能明显提高HAO的活性；最后对双质粒菌株DH5α(pDHC29::nxr，pTrc99a::pro-hao)进行简单的发酵，未检测到产物硝酸盐的生成。36n北京理工大学硕士学位论文结论与展望结论本课题是对重组大肠杆菌代谢空间尿液废水的探索，理论上通过菌株将尿素代谢为可被植物利用的培养成分--硝酸盐，实现对氮素的物质能量循环利用。以在活性污泥中鉴定出自养亚硝化细菌和硝化细菌为基础，构建安全、高效处理尿液废水的重组菌株，主要完成的工作有：（1）连接构建出重组质粒pDHC29::nxr、pTrc99a::pro-hao，又经过重组质粒转化等步骤得到重组菌株L2、L3和L5，即E.coliDH5a（pDHC29::nxr）,E.coliDH5α(pTrc99a::pro-hao)和E.coliDH5α(pDHC29::nxr,pTrc99a::pro-hao)。（2）对重组菌株L2、L3和L5进行了摇瓶发酵并用分光光度法及离子色谱法检测亚硝态氮及硝态氮产量，证明其有一定的转化能力，并进一步无机离子的加入对NXR活性并未产生明显的影响，而对HAO活性有很大的促进作用。展望关于重组大肠杆菌代谢空间尿液废水的研究目前取得了初步的结果，但依然存在尚未解决的问题和需完善的工作，下一步的工作可以围绕以下几个方面进行：(1)对重组菌株L2催化能力进行检测，发现有一定的产物（63.5mg/L），证明NXR得到了一定的表达并有些许活性，可能是由于：重组大肠杆菌中缺少与NXR酶活性密切相关的膜内电子传递链，NXR酶活性未能充分体现；大肠杆菌对外源基因nxrAXB的信号肽识别能力较弱，导致膜蛋白无法正确定位，行使功能；NXR酶为双功能酶，在氧气不足的条件下会还原硝酸盐为亚硝酸盐。可以通过增加溶氧量或是进一步将膜内电子传递相关的蛋白克隆到大肠杆菌中来解决上述问题。(2)对双质粒菌株DH5α(pDHC29::nxr，pTrc99a::pro-hao)进行简单的发酵，未检测到产物硝酸盐的生成，后续实验可以考虑对发酵温度、底物浓度等进行调整。37n北京理工大学硕士学位论文参考文献[1]StephanieM.D.ChadH.T.EnvironmentalControlandLifeSupportIntegrationStrategyfor6-CrewOperations[J].AmericanInstituteofAeronauticsand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