废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究 66页

学校代号10532学号S12031013分类号密级硕士学位论文废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究学位申请人姓名谭琼培养单位环境科学与工程学院导师姓名及职称陈桂秋教授学科专业环境工程研究方向废水生物处理技术论文提交日期2015年5月20日n学校代号：10532学号：S12031013密级：湖南大学硕士学位论文废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究学位申请人姓名：谭琼导师姓名及职称：陈桂秋教授培养单位：环境科学与工程学院专业名称：环境工程论文提交日期：2015年5月20日论文答辩日期：2015年6月10日答辩委员会主席：汤琳教授nPhysiologicalresponsemechanismofcompositenano-biomaterialPhanerochaetechrysosporiuminthewastewaterByTanQiongB.E.(UniversityofSouthChina)2015AthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofEngineeringinEnvironmentalScienceandEngineeringintheGraduateSchoolofHunanUniversitySupervisorProfessorCHENGuiqiuMay,2015n細南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。本人完全意识到本声明的，均已在文中［＾明确方式标明法律后果由本人承担。、作者签名：日期；｝＾年月。日碑巧／［ｉ（学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１、保密□，在年解密后适用本授权书。２、不保密＂＂（请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）口作者签名：ｉ巧、曰期：年仁月／曰等导师签名；茶日期；年月５公日ｆ７＾／６１／n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究摘要用白腐真菌作为生物吸附剂已经广泛应用于去除废水中的有毒物质。作为白腐真菌的典型菌种黄孢原毛平革菌，可以通过抗氧化酶活性忍受一定范围内的镉和2,4-二氯酚。但是，用黄孢原毛平革菌去除有毒物质存在一些缺点：较长的培养时间和有限的去除能力。在这个实验中，氮修饰的纳米TiO2颗粒通过海藻酸钠成功地负载到黄孢原毛平革菌，来提高其对废水中有毒物质的去除效率和去除能力。到目前为止，镉和2,4-二氯酚对包埋黄孢原毛平革菌和纳米TiO2的复合吸附剂的影响还很少有人研究过。为了研究复合吸附剂在镉和有机物作用下的响应，+2+我们研究了H、O2、Cd的即时离子流速，同时三种抗氧化酶（SOD、CAT、NADH氧化酶）活性也被测量用来探究复合吸附剂的抗氧化机制。+2++H、O2、Cd的即时离子流速通过非损伤微测技术测量。H的流入速度在2，2+4-二氯酚添加之后呈增加趋势，然而添加Cd后流速由内流变成外流。O2的外流2+2+2+流速在添加2,4-二氯酚和Cd之后都增加了。Cd的流速在0.5mMCd作用下相2+2+比于0.1mMCd明显增加了，同样复合吸附剂对Cd的吸附量在0.5mM溶液中比0.1mM溶液中大很多。2+酶活性被分析用来探究复合吸附剂在不同Cd溶液中抗氧化保护机制。2+NADH氧化酶和CAT在0.25mMCd溶液中的酶活达到最大值，分别是6.5和-12+9.7UgFW。SOD的酶活在0.1-0.6mMCd溶液中逐渐增加，最终达到最大值-168.86UgFW。+2+2+H、O2、Cd的离子流速变化表明复合吸附剂在2,4-二氯酚和Cd的作用下2+的早期外部压力响应。复合吸附剂之所以对Cd有抵抗能力是因为它们的抗氧化性能。抗氧化酶（SOD、CAT、NADH氧化酶）保护复合吸附剂免受2,4-二氯酚2+和Cd引起的氧化损伤，复合吸附剂对有毒物质的抵抗能力是由于它们对氧化压力的有效响应。然而，抗氧化机制在高浓度有毒物质作用下会被破坏。关键词：微生物；生理流速；酶；镉；2,4-二氯酚IIn硕士学位论文AbstractBioremediationusingwhite-rotfungihasbeenlargelyemployedforremovingthetoxicpollutantsinwastewaters.Asamodelstrainofwhite-rotfungi,Phanerochaetechrysosporiumcantoleratecadmiumand2,4-DCPtosomeextentaftertheactivationofantioxidantenzymes.However,someofthedisadvantagesincludealongerincubationtimeforP.chrysosporiumandlimitedresistancetopollutants.Inthisstudy,nitrogen-dopedTiO2nanoparticlesweresuccessfullyloadedontoP.chrysosporium,andimmobilizedwithsodiumalgaacidtoenhancethedegradationefficiencyandresistancetowardstoxicpollutantsinaqueoussolutions.Untilnow,notmuchwasknownabouttheinfluenceofcadmiumand2,4-DCPonPTNs.InordertostudytheresponseofPTNstocadmium-pollutedorganicpollutants,+2+wemeasuredtheinstantaneousfluxesofH,O2,andCd.Theactivitiesofthreeenzymes(SOD,CAT,andtheNADHoxidase)wereevaluatedinanattempttoexploretheantioxidantmechanismsofPTNs.+2+Thereal-timechangesinH，O2andCdfluxesweremeasuredusingthe+noninvasivemicrotesttechnique(NMT).TheHinfluxincreasedaftertheadditionof2+2,4-DCP,andshiftedtoeffluxfollowingtheadditionofCd.TheO2fluxdecreased2+2+aftertheadditionofboth2,4-DCPandCd.AlargerCdfluxwasimmediately2+-2-12+observedafterexposureto0.5mMCd(-351.25pmolcms)thanto0.1mMCd-2-12+(-107.47pmolcms).TheremovalofCdbythePTNsincreasedmoreafter-1treatmentwiththe0.5mMexposuresolution(27.6mgg)thanwiththe0.1mM-1exposuresolution(3.49mgg).Theenzymeactivitieswereanalyzedtoreviewtheantioxidativedefensesystem2+ofPTNsinasolutioncontainingvariousconcentrationsofCd.Theactivitiesofthecoenzymenicotinamideadeninedinucleotide(NADH)oxidaseaswellastheenzyme-1-1catalase(CAT)plateauedat6.5UgFWand9.7UgFW,respectively,after2+exposureto0.25mMCd.Theactivityofsuperoxidedismutase(SOD)increased2+graduallyinsolutionscontaining0.1–0.6mMCd,andeventuallyreacheda-1maximum(68.86UgFW).+2+SignificantchangesintheH,O2,andCdfluxeswerethemanifestationsofan2+earlycellularstressresponseto2,4-DCPandCd.PTNsexhibitresistancetowards2+Cdbecauseoftheirantioxidantfunctions.TheantioxidativeenzymesSOD,CAT,IIIn废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究2+andNADHoxidaseprotectPTNsfromtheoxidativedamageinducedbyCdand2,4-DCP.TheresistanceofPTNstothetoxicpollutantspresentinaqueoussolutionsisduetotheirefficientresponsetooxidativestress.However,theantioxidativedefensesystemwasdamageduponexposuretohighconcentrationoftoxicpollutants.Keywords:Microbe;Physiologicalfluxes;Enzymes;Cadmium;2,4-DichlorophenolIVn硕士学位论文目录学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书...................................................I摘要......................................................................................................................IIAbstract...................................................................................................................III插图索引.................................................................................................................VII附表索引................................................................................................................VIII附表索引................................................................................................................VIII第1章绪论.........................................................................................................11.1重金属-有机物的危害..................................................................................11.1.1重金属-有机物复合污染...................................................................11.1.2重金属的危害....................................................................................21.1.3有机物的危害.....................................................................................31.2重金属-有机物污染的处理技术...................................................................31.2.1物理、化学处理技术.........................................................................31.2.2生物处理技术.....................................................................................41.2.3处理新技术.........................................................................................61.3白腐真菌及其重金属-有机物污染废水治理中应用的研究........................71.3.1白腐真菌介绍....................................................................................71.3.2白腐真菌的应用................................................................................81.3.3白腐真菌去除污染物的机理.............................................................91.3.4纳米材料TiO2的研究.....................................................................111.3.5生物固定化技术..............................................................................141.4非损伤微测技术的研究进展......................................................................171.5抗氧化酶体系的研究.................................................................................181.5.1氧化应激和抗氧化酶......................................................................181.6本课题的研究目的及内容.........................................................................201.6.1研究内容和意义..............................................................................201.6.2研究的技术方案..............................................................................20第2章复合纳米生物材料的制备..........................................................................222.1材料与方法.................................................................................................222.1.1仪器与主要试剂..............................................................................222.1.2菌种来源及培养基..........................................................................23Vn废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究2.1.3氮修饰纳米TiO2材料的制备..........................................................242.1.4复合纳米生物材料的制备...............................................................242.1.5包埋黄孢原毛平革菌的制备...........................................................242.1.6Cd(II)的测定与计算方法.................................................................242.1.72,4-DCP的测定与计算方法.............................................................252.2结果与讨论..................................................................................................262.2.1复合纳米生物材料对2,4-DCP的去除效果....................................262+2.2.2复合纳米生物材料对Cd的去除效果...........................................272.3本章小结.....................................................................................................27第3章复合纳米生物材料的离子流速的变化.......................................................293.1材料和方法.................................................................................................293.1.1非损伤微测技术简介......................................................................293.1.2非损伤微测技术工作原理...............................................................293.1.3测试系统及电极...............................................................................303.1.4质子流和氧流测定方案...................................................................323.1.5镉离子流速测定方案......................................................................323.1.6数据分析..........................................................................................333.2结果与讨论..................................................................................................333.2.1复合纳米生物材料的镉流测定结果分析........................................33+3.2.2复合纳米生物材料的H和O2流的测定结果分析.........................353.3本章小结....................................................................................................37第4章复合纳米生物材料的抗氧化酶活性的变化...............................................384.1前言............................................................................................................384.2实验方法和试剂.........................................................................................384.2.1实验仪器与试剂..............................................................................384.2.2复合纳米生物材料的破碎和上清液的提取....................................394.2.3酶活的测定......................................................................................394.3复合纳米生物材料的酶活结果分析..........................................................404.4本章小结....................................................................................................42结论...........................................................................................................................43参考文献...................................................................................................................45附录A攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录..............................................53附录B攻读硕士学位期间所申请国家发明专利目录..........................................54致谢...........................................................................................................................55VIn硕士学位论文插图索引图1.1研究技术路线................................................................................................21图2.1复合纳米生物材料在不同浓度2,4-DCP的作用下对2,4-DCP的的去除率和吸附量的关系图............................................................................................262+2+图2.2复合纳米生物材料在不同浓度的Cd的作用下对Cd的去除率和吸附量的关系图...........................................................................................................27[61]图3.1非损伤微测技术的工作原理示意图........................................................30[89]图3.2离子流测定的非损伤测试系统装置示意图.............................................30图3.3微电极在复合纳米生物材料表面信号采集图.............................................312+图3.4复合纳米生物材料在0.1mMCd(NO3)2和10mg/L2,4-DCP作用下Cd即时流速.......................................................................................................332+图3.5复合纳米生物材料在0.1mMCd(NO3)2和0.1mMGdCl3作用下Cd平均流速和流速变化图........................................................................................34图3.6复合纳米生物材料在0.1mMCd(NO3)2和0.5mMCd(NO3)2作用下，作用2+时间分别为0h,1h,6h时Cd流速..........................................................35图3.7（A）复合纳米生物材料在10mg/L2,4-DCP和0.1mMCd(NO3)2作用下+H流速；（B）复合纳米生物材料在10mg/L2,4-DCP和0.1mMCd(NO3)2作用下O2流速.............................................................................................36+图4.1NADH和NAD酶循环反应的机理图..........................................................40图4.2复合纳米生物材料（包埋TiO2）和包埋黄孢原毛平革菌（没有包埋TiO2）在不同镉浓度下的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NADH氧化酶）活性变化......................................41图5.1复合纳米生物材料在有毒物质作用下离子流和抗氧化酶的作用机制图...43VIIn废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究附表索引表1.1白腐真菌PhanerochaeteChrysosporium降解的环境污染物......................11表1.2几种固定化细胞载体材料的性能比较.........................................................17表1.3非损伤微测技术与其他离子流测量技术的比较..........................................18VIIIn硕士学位论文第1章绪论1.1重金属-有机物的危害1.1.1重金属-有机物复合污染重金属污染是指由于人们的生产和生活活动导致的重金属对大气、土壤、水体、生物圈等的环境污染。涉及环境污染方面的重金属主要包括具有显著生物毒性的汞、铅、镉、铬以及类金属砷，还包括具有毒性的铜、镍、钴、锡、钒等重[1]金属污染物。-6有机物污染物通常是指以微克级(10g/L)或更低级水平存在在水中，例如常见的BOD、COD等有机物，通过监测指标不能对它们进行实施有效监测的有机[2]污染物，主要包括以下几类：（1）多氯联苯(PCBs)是指联苯上的氢原子被氯原子取代后生成物的这一类物质的总称。（2）多环芳烃(PAHs)是含碳化合物经过400℃以上的温度的热解环化和聚合作用形成的产物，多由煤、石油等燃料以及可燃性气体和木材等经过高温处理或不完全燃烧产生的，将其排入大气中后经过沉降和雨洗等途径最终到达地表，导致地表水和地下水的污染。（3）有机氯农药是对环境造成严重威胁的有毒人工合成有机化合物，目前世界各国将其纳入优先控制污染物黑名单中，并且是非常重要的成员。（4）酚类化合物广泛分布于自然界中，大量排放的煤气、石油化工、焦化、制药、油漆等行业的工业废水中含有大量的苯酚。[3]对复合污染的概念和内涵，国内外学者的说法不一，大家的看法都不一样，没有一个统一的说法，归纳起来，他们从不同的领域、不同的角度，解释复合污[4]染中污染物之间联合作用，主要有三种类型：（1）简单相似作用。又可以将其称为相似联合作用、相对剂量相加作用和剂量相加作用。这种作用又称无相互作用，特点为各单一污染物之间无相互影响。所有污染物作用机制、作用方式均相同，只是强度有区别。（2）独立联合作用。也称为简单独立作用、简单不相似作用和效应相加作用。这种作用的特点是无相互作用，但污染物的作用方式、机制和部位都有区别。（3）交互作用。这种联合作用的特点是污染物之间有相互作用，所形成的联合作用效应大于或小于每种污染物单独作用所形成的效应之和。联合作用效应增[5]强的称为协同、加强或超相加，联合作用效应减弱的称为拮抗、抑制或亚相加。当前复合污染研究的方向和重点是重金属和有机污染物共存时的复合污染。1n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究目前研究的有机物主要集中在有机螯合剂、石油烃、农药及芳香类化合物。当各种农药(杀虫剂、杀真菌剂、除草剂等)、有机螯合剂及重金属都被排放到环境中，有机物难被降解，重金属和有机物形成复合污染物，所以研究复合污染机理都有[6]重要意义，包括以下几个方面：（1）竞争结合位点吸附位点的竞争是指一种污染物的作用途径和方式和另一种污染物相近，从而其物理化学性质相似，导致这种处于优势的污染物从结合位点上取代另一种污染物，因而这些污染物共存时的相互作用会受到生态介质(水体、土壤)、细胞表面结合位点的竞争及代谢系统的影响。参与竞争的各污染物的各自的吸附特性、种类和浓度比在很大程度上决定了竞争的结果。通常情况下致毒的污染物浓度比不同于污染物总浓度的比值。（2）影响酶的活性复合污染物可以改变与代谢有关的酶(系)的活性，进而污染物的转化、扩散和代谢方式在生物体内受到影响，污染物的行为和毒性在生物体内也受到影响。（3）干扰正常生理过程生理生化过程和生物体的正常生理活动都被复合污染物改变，同时某些化合物的转化、转移、代谢等生理过程也会受到污染物的交叉作用受到影响。（4）改变细胞结构与功能生物体或有关内含物与外界环境的生物学结构和功能屏障被各种复合污染破坏，导致其被动转运能力、主动性及透性都改变。（5）螯合(或络合)作用及沉淀作用复合污染物通过螯合(或络合)作用改变其形态分布和其生物有效性，从而直接影响其毒性。（6）干扰生物大分子的结构与功能复合污染物抑制生物大分子的合成与代谢，干扰基因的扩增和表达，使DNA[7]损伤或断裂，影响DNA修复，通过与DNA生成化学加合物等方法形成对生物[6]体的毒害作用。1.1.2重金属的危害重金属在过量的情况下产生毒害作用。重金属通过破坏正常的生物化学反应，抑制生物酶的活性造成危害作用。对人体产生危害主要表现在不再以离子形式存在，而是形成与体内有机成分结合成的金属络合物或金属螯合物。重金属与机体内的蛋白质、维生素、激素、核糖等反应。上述物质由于产生化学反应使丧失或改变了原来的生理化学功能最终导致病变。另外重金属还能破坏酶的活性，置换[1]起辅酶作用的金属，结合酶的非活性部位而改变活性部位的构象。2n硕士学位论文重金属(铅、汞等)在过量的情况下还会导致受孕期间母体的流产、畸胎、死胎等异常妊娠情况，影响胚胎的正常发育。长期暴露在铅环境中能够导致铅在人体骨骼、肾脏、牙齿和大脑等组织中的沉积。铅还会对儿童的成长发育产生严重影响。因为在这个阶段，是大脑发育的时期，血脑屏障还没有发育健全，如果铅通过血脑屏障进入大脑，将会和中枢神经的不同部位发生作用，导致中枢神经系统功能发生紊乱，引起儿童运动失调、易冲动、空间综合能力下降、注意力下降、侵袭性增加、多动、智商下降。环境中铅、铜、汞、锰、镉等重金属损害人体的健康，即使这些重金属的剂量很低，也会使机体代谢发生紊乱，引发疾病，甚至死亡。研究表明：镉作用于呼吸道可引起肺炎、肺气肿，进入消化系统则引起肠胃炎。镉中毒者肾功能受到破坏，导致肾小管对糖、蛋白质再吸收功能发生障碍，代谢发生紊乱，最终引起糖尿病、尿蛋白症。镉中毒者常常伴有骨骼变形、软化、骨折、萎缩，镉还能引发贫血，人体镉中毒还会诱发癌症。锰中毒者常常伴有肺炎和其它疾病；铅会损害成人消化系统、神经系统及心血管系统，尤其是神经系统受铅的影响更大；铜在过量的情况下引发心血管系统疾病，可使血红蛋白变性，破坏机体的正常代谢[8]。1.1.3有机物的危害有机物虽然在环境中含量甚微，但它们很难被生物分解，阻碍生物的化学氧化和吸附作用。大量生态毒理学研究结果表明，有机物通过在农作物、水生生物和其它生物体中转化、迁移和富集，导致三致作用(致癌、致畸、致突变)，虽然在急性及慢性毒性实验中有机物并不表现出毒性效应，但是在长期低剂量的有机物的作用下，人体的健康和生态环境会受到严重的、甚至是不可逆的影响。1.2重金属-有机物污染的处理技术水体重金属-有机物污染越来越严重，引起了人们的重视和关注。因此采取有效的治理方法显得十分重要，重金属和有机物的治理方法主要传统的物理化学方法、生物方法以及一些新技术。1.2.1物理、化学处理技术1.2.1.1物理处理技术对重金属的物理处理技术主要包括电动修复、电热修复和土壤淋洗三种修复方法。此外，物理修复方法还包括固化／稳定化土壤修复技术、稀释法、排土填埋法。但是物理修复方法经济实用性不高，容易引起“二次破坏”、“二次污染”的问题。3n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究电动修复技术的原理和电池的原理类似，即重金属离子在通电的情况下产生定向移动，从而达到去除的目的。这种技术的要求比较高，所以很难大规模的、广泛的应用到实际中去。电热修复技术的原理是一些重金属在高温下快速挥发，通过高频电压加热土壤，使重金属受热挥发，使得重金属离开土壤。这种处理技术的缺点是在高温加热的条件下土壤本身受到了严重破坏严重的破坏。土壤淋洗的原理是利用淋洗液把重金属从土壤固相中转移到土壤液相中去，[9]再把富含重金属的废水进一步回收处理。对有机物的物理治理方法有以下几种：（1）挖掘填埋法：它通过人工挖掘、运移受污染的土壤至指定地点填埋，并把未受污染的土壤填回，达到重新使用土地的目的，这是比较常用的物理治理方法。（2）通风去污法：这种方法对于清除石油类有机物的污染有效，特别是石油泄[10]漏等情况造成的土壤污染。1.2.1.2化学处理技术对重金属化学处理的原理是通过向土壤中加入沸石、污泥、生物固体、有机[11]质和磷酸盐等外源添加物，从而改变和调节重金属的物理化学性质，使这些外源添加物与金属离子结合，产生吸附、沉淀、离子交换、氧化还原和腐殖化等一系列反应，限制了重金属的迁移性，降低了其被植物吸收的可能性，从而也就减[12]少了其对动植物的危害作用。对有机物的化学治理方法有下列几种：（1）化学焚烧法：它通过高温焚烧使有机物在高温下分解，从而去除有机物污染，这是常用的化学处理技术。但是，这用方法的缺点是土壤的理化性质会被破坏，土壤不能重新利用。（2）化学清洗法：它的原理是利用一定的化学溶剂将土壤中的有机物洗脱下来，从而将有机物去除。（3）光化学降解法：这种方法能有效的去除难生物降解的、结构稳定的有机污染物，所以自80年代后期开始这种技术越来越受到人们的重视，并被广泛应用在环境污染控制领域，与其他处理方法相比，这种方法去除有机物高效、完全。（4）化学栅防治法：它利用固体化学材料能吸附或沉淀污染物，把固体化学材料置于土壤次表层的蓄水层或废弃物及污染堆积物的底层，达到截留污染物的目的，有效防止污染物扩散，去除污染源。这种方法近十年来广泛应用在土壤有机[13]物防治中。1.2.2生物处理技术目前，生物处理技术得到了广泛的发展与应用，其优点主要表现在以下几个4n硕士学位论文方面：处理效果好，几乎对环境没什么影响，不破坏植物生长所需要的土壤环境，不会产生二次污染；处理费用低，其处理的成本只有物化方法的二分之一到三分之一；处理的步骤简单，可以就地进行处理。基于上述这些优点，生物修复技术已成为当今污染治理技术研究的一大热点。1.2.2.1有机物污染生物处理技术生物修复有机污染土壤的方法主要有两种：（1）原位修复技术；（2）异位修复技术。原位修复是指不移动受污染土壤的条件下，向污染物中添加营养物、供氧等措施，使降解菌与污染物充分接触，快速去除污染物。异位修复是指将污染的土壤或沉积物移离原地，或向污染土壤中添加降解菌营养物、接种物及支撑材料并翻动土壤混合，达到集中降解污染物的目的。主要方法包括堆肥法、土地耕作法、厌氧处理法和生物反应器法。堆肥法是将土壤和一些易降解的有机物如稻草、粪肥、泥炭等混合堆放在一起，添加石灰调节酸度，发酵一段时间后，大部分污染物被降解的处理技术。它是结合了传统堆肥和生物治理方法，是生物治理的重要方法。厌氧处理法是针对好氧处理不理想但是用厌氧处理效果好的污染物，例如三硝基甲苯多氯联苯，但厌氧处理的缺点是条件难于控制，所以其应用比好氧处理使用更少。生物反应器法是通过在生物反应器中反应达到去除污染物的处理技术向将污染土壤加3一9倍的水混合使之呈泥浆状，同时添加必需的营养物质和表面活性剂，向其中泵入空气充氧，剧烈搅拌使污染物与微生物充分混合，降解完成后，快速过滤脱水。1.2.2.2重金属生物处理技术目前，重金属生物处理技术主要包括植物修复技术和微生物修复技术这两个方面，以下将从这两个方面重点阐述。所谓重金属污染植物修复的原理是利用超富集植物提取土壤中的重金属，重复种植和收获超富集植物达到降低污染土壤中的重金属浓度到可接受的水平的目[14]的。植物修复技术的优点是修复成本低，能大规模的应用，具有良好的社会和生态综合效益，被称为“绿色修复技术”，越来越受到人们的重视。其作用机制包括区域化作用机制、络合作用机制和较强的富集吸收能力机制。根据修复的过程和机理，植物修复技术可分为植物固化技术、植物提取技术、植物挥发技术和根[15]系过滤技术。但是，植物修复技术仍然存在一定的缺点。首先，目前发现的超富集植物不能普遍富集重金属，只能富集某一种重金属元素；其次，超富集植物生长条件有5n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究要求，只能在特定的气候和土壤条件下生长，不能广泛应用范围；再次，修复的周期长，前发现的超富集植物个子矮小，生物量较低，生长缓慢。微生物修复法的原理是利用某些微生物的生物活性对重金属沉淀、吸收、氧化和还原等作用，把重金属离子转化低毒或无毒产物，降低重金属毒性作用。它[16]的处理费用低、效率高、对环境影响小，是一种经济实用的绿色治理方法。它对重金属的作用机制可以分为胞外沉淀作用、胞外络合作用和胞内积累3[17]种作用。一些微生物如蓝细菌、动胶菌、硫酸还原菌以及某些藻类，通过产生多糖、糖蛋白等胞外聚合物，形成大量的阴离子基团，它们能吸附重金属，与金[18]属离子形成络合物，从而达到降低土壤中重金属的目的。通过使重金属沉积在细胞的不同部位，或结合到胞外基质上，被与可溶性或不溶性生物多聚体形成螯合物等作用，重金属离子如Cr、Mn、Pb、Cu、Cd、Hg等能有效去除，达到治理[19]重金属污染的目的。1.2.3处理新技术1.2.3.1纳米技术纳米技术是指尺度在1-100nm的原子、分子，通过研究和应用它们，由此发[20]展起来的基础研究与应用研究紧密联系的、多学科的新的科学技术。它结合了现代物理(量子力学、介观物理、分子生物学和混沌物理等)和先进工程技术(微电子、计算机和扫描隧道显微镜等技术)。纳米技术分为纳米材料和纳米结构。纳米材料指的是以纳米尺度构成材料的单元尺度，而且纳米材料具有常规材料没有的性质。纳米结构是指以纳米尺度为单元构建功能性结构。纳米颗粒因为具有极小的尺寸(粒径1-100nm)从而产生了一些新的效应：(1)小尺寸效应(又称体积效应)。当超细微粒的尺寸与传导电子的德布罗意波长、光波的波长、透射深度或超导态的相干长度等物理特征尺寸差不多或更小时，周期性的边界条件会被破坏，声、电、光、磁、热力学等特性会呈现出新的小尺寸效应。(2)量子尺寸效应。这种效应是指粒子的尺寸小于某个特定的值时，金属的费米能级附近的电子能级由准连续状态变为离散状态。对于纳米半导体材料来说，最高被占据分子轨道的不连续和未被占据的分子轨道的最低能级和能隙变宽。(3)宏观量子隧道效应。微观粒子具有贯穿势垒的能力。(4)表面效应。随着纳米结构尺寸的减小，表面原子数急剧增大引起的性质上的变化。纳米过滤(nanofiltration,NF)，是一种介于反渗透与超滤之间的技术，它由压力提供驱动力的新型膜分离过程。纳滤膜的孔径是纳米级水平，可以截留相对分[21]子质量数百(道尔顿)的物质。纳滤有以下特点：(1)可以截留小分子的有机物并使盐透析，透析的同时还能浓缩。(2)操作压力低，纳滤膜在透析的同时无机盐也能透过纳滤膜，所以渗透压比反渗透的压力低。纳滤广泛应用在工业生产过程中6n硕士学位论文回收资源和处理工业废水中。[22]光催化降解是指催化剂在光照下对污染物实现分解，这是具有发展前景的新兴的废水处理技术。经常使用的光催化剂有ZnO2、TiO2、SnO2、CdS、Fe2O3等。正是纳米颗粒具备以上这些纳米效应，才使得它们具有比常规颗粒更高的催[23]化活性。1.2.3.2新型介孔材料根据国际理论和应用化学联合会（IUPAC）定义，介孔材料指孔径介于2-50nm2的多孔材料。介孔材料的特点是长程结构有序，比表面大（>1000cm/g），孔径分布窄，水热稳定性好且孔隙率高。介孔材料对含重金属Cu、Hg、Cd、Pb等的[24,25,26]废水治理具有广阔的前景，已经成为研究领域的热点。近年来，研究出了许多新型功能化介孔材料，研究者对材料进行改性处理或化学修饰，使新型高效介孔材料有效的处理重金属废水。但是，目前将介孔材料应用还处于实验研究阶[27]段，主要是吸附剂的价格限制了它的工业应用价值。1.2.3.3基因工程技术基因工程技术去除废水中重金属是指通过转基因技术，向微生物细胞中转入[28,29,30]外源基因，使其具有优良遗传性状，最终达到高效富集重金属Hg、Cu、Cd等的目的。这项技术自20世纪90年代Wilson成功利用基因工程技术对微生物进行改造，处理含汞废水开始就越来越受关注，目前有其他研究者尝试利用基因工程技术处理不同类型重金属废水，并取得了较好的结果。但是，目前这项技术还处于实验研究阶段，真正应用于工业生产中面临一些难题，例如怎样实现基因工程菌连续化生产的问题。1.3白腐真菌及其重金属-有机物污染废水治理中应用的研究1.3.1白腐真菌介绍白腐真菌(Whiterotfungi)是腐生在树木和木材上的丝状真菌，它通过菌丝侵入木质细胞腔内并分泌、释放生物酶来降解木质素和其它木质组分，最终导致木[31]质腐烂，形成淡色的海绵状团块白腐。多数白腐真菌是担子菌纲，少数属于子囊菌纲，包括漏斗状侧耳、桦多孔菌、粉状侧孢霉、糙皮侧耳、拟革盖菌等200[32]多个品系。白腐真菌由于能腐朽木材呈白色而出名，是担子菌亚门中的一种真菌，木材主要成分能够被它降解。白腐真菌能在白腐过程中保持大部分木材纤维的完整性，同时对纤维素的结晶度影响不大。通过这个特性利用白腐菌对木质素降解选择性好用来生物制浆，是制浆方法的一大创新举措。白腐菌可以用来生物漂白、木质7n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究素降解预处理、生物制浆，还能分解大量有机异生物质。所以，白腐真菌在废水处理应用中显示了广阔的前景。[33,34,35]白腐真菌被广泛应用在去除废水中的有毒物质中。它能有效去除废水[36]中的重金属和有机物。在去除有毒物质过程中形成胞外结晶颗粒物是其重要的[37,38]解毒机制。白腐真菌之所以广泛应用于“三废”治理及环境修复中是因为它对木质素的特异性降解。木质素降解酶(简称木素酶或关键酶)能催发反应的发生，[39]是白腐真菌降解污染物的关键酶。这些关键酶主要包括锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶。(1)锰过氧化物酶(ManganesePeroxidase,简称MnP)。MnP的分子量约为46000，2+酶活中心由一个血红素基和一个Mn构成，另外还有两个起稳定结构作用的2+Ca，是糖蛋白，分子中有十条长蛋白质单链，一条短单链。(2)木质素过氧化物酶(Ligninperoxidase,简称LiP)。LiP的分子量约为41000，酶活中心由糖基胞外血红蛋白构成，血红素埋在蛋白质内；有氧条件下，低浓度H2O2引发一个双电子氧化反应和两个单电子还原反应，导致非酶型木质素成为阳离子自由基，引起非酶的自由基链式反应，以上过程就是LiP降解复杂有机物的过程。由于LiPs是唯一具有很高的氧化还原电势的酶，所以它是白腐真菌降解非[40]酚型木质素的关键酶。(3)漆酶(Laccase,简称Lac)。Lac是含铜的糖蛋白，存在于一些微生物、植物和昆虫中。在植物(漆树)体内，在利用氧化还原反应使木质素的聚合过程中，植物沉积形成生漆。真菌利用将酚型底物分子中获得的电子传递给分子氧的过程，把它还原成水，把酚型底物氧化成半醌自由基，从而实现漆酶降解木质素等复杂有机物。重金属离子被白腐真菌吸附去除的位置变化如下：重金属离子吸附剂固液边界层吸附剂表面吸附剂微孔与活性位点结合而被去除。在菌[41]丝球是活菌体的情况下，重金属离子还能进入菌体细胞内部积累下来。1.3.2白腐真菌的应用随着人们的环境保护意识增强，能源利用、人类生存、经济发展、环境问题等紧紧地联系在一起，环境保护已经成为全球关注的问题并且受到重视。因此，白腐真菌在自然界生态系统中发挥重要作用，是一种宝贵的生物资源，被环境科学研究当作有力的环境治理工具和模式对象。相对于国外白腐真菌研究现状和研究的积极性，我国的研究现状是迟缓和不积极。所以，我们要利用白腐真菌对环境治理的积极的现实意义，充分利用起白腐真菌，使其为治理环境问题作出贡献。(1)水污染治理生活污水和工业生产排放的有机物是我国水体的主要污染物，其中工业生产8n硕士学位论文性的污染物危害最大，因为它们排放量大而且浓度高。尽管对这种污染物进行治理过程中，它们经历集中、分离、转移，却难以从根本上得到清除。工业污水中的有机物有两个特点，一是难以被生物降解，二是以多种混合形式存在，比如纺织印染行业的染料废水，造纸工业中喊氯化芳族化合物的废水中的有机物就是以上说的这种。白腐真菌能非专一的彻底降解有机物，不仅能降低废水中有毒污染物的浓度，而且能将它们彻底消灭，能提高污水治理的质量和效益。(2)大气污染治理利用白腐真菌能缓解我国的大气污染是因为大气污染物的主要成分是SO2和煤排放的烟尘。美国的Bumpus通过白腐真菌的作用开发煤液化这项清洁而又高效的煤炭转化技术，它的原理是白腐真菌能解聚和增溶煤，这样可以避免燃烧煤带来的大气污染。Tien通过白腐真菌能脱去煤和石油中的硫元素，也可以减少燃烧煤和石油带来的大气污染，并且取得了一定的成果。以上研究的原理是煤和石油与木质素的结构组成具有同源性，并且白腐真菌在碳素循环中具有特殊作用，因此可以利用白腐真菌来治理大气污染。今后我们可以借鉴以上研究者的成果，创造新技术。(3)固体污染治理固体污染治理与大气和水污染治理比较起来，是薄弱环节，它缺乏理想的有效技术，但是固体污染是大气污染和水体污染的源头，能引起大气和水体的再次污染。我们能利用白腐真菌有效处置固体污染物，因为它能对固体形态的污染物同样适用。白腐真菌被用来治理受农药侵蚀的土壤位点和受污染的堆积地取得了非常理想的成果，我们应该利用这项技术有效治理我们的固体污染。综上所述，白腐真菌技术应用具有一定难度，但是只要环境科学界、生物学家、工程专家、化学及工业界积极探索和认真对待，对白腐真菌进行研究，相信白腐真菌能在环保事业中发挥重要作用。希望研究白腐真菌的工作者在我国环境保护的现状中突破研究瓶颈，使其得到广泛应用。1.3.3白腐真菌去除污染物的机理白腐真菌吸附重金属的作用机理包括：（1）表面络合作用。生物吸附剂本身的结构跟其对金属离子的吸收有很大的关系。当白腐真菌处于含重金属的溶液中时，重金属首先接触的是它的细胞壁。细胞壁含有各种多糖，它们和脂肪、蛋白质和其他物质（如色素）结合在一起，形成复合物。细胞中磷酰基、羧基、硫酸酯基、羟基、氨基和酰胺基等官能团含有N,O,P,S等电负性较大的原子，它们提供孤对电子和重金属相结合，导致重金属变成细胞表面的络合物或螯合物，最终重金属被吸附。（2）离子交换作用。离子交换是指结合能力更强的金属离子代替与细胞物质结9n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究合的金属离子的过程。通过研究表明，细胞吸附重金属离子的过程中，即细胞壁的金属离子交换过程，常常有其他阳离子的释放。[42][43]（3）其他作用：微沉淀、氧化还原反应和主动运输对微生物吸附重金属离子有一定的作用，但是这些作用对重金属的吸附量少，因此不易被检测出来。白腐真菌具体的降解原理非常复杂，主要包括氧化性的细胞外过程，也包括[44]还原反应及细胞膜结构。（1）依靠LiP的氧化。LiP被H2O2氧化成有活性的酶中间复合物Ⅰ，将污染物RH(如氧化物、多环芳烃、染料等)氧化成自由基R·后，成为中间复合物Ⅱ，它具有活性可以和另一化学物分子反应，自身被还原成原来状态的酶。直接氧化导致芳环开裂、C-C键断裂、去甲基化、苄基醇化、二聚化、羟基化等。某些化学物(如除草剂氨基三唑、一些有机酸)不能被LiP血红素所作用，依靠另一类易被LiP直接氧化成自由基的化学物质的相助下发生氧化的过程叫间接氧化。PhanerochaeteChrysosporium次生代谢中合成的藜芦醇(VeratrylAlcohol,VA)就是典型的这种中介辅助作用物质，它充当电子调节者。复合物Ⅰ、Ⅱ将XA直接氧化成藜芦醇阳++离子自由基VA·，VA·和污染物间发生电子转移，致使污染物经历间接氧化。++（2）依靠LiP的还原。LiP依靠H2O2将VA氧化成VA·，VA·与真菌所分泌-的草酸等有机酸反应产生羧酸根阴离子自由基，如CO2·，它的还原电位为-1.9V，是强还原剂，能还原各种化学物。白腐真菌还可以把已非常高度氧化的（即缺电子）化学物氧化成CO2。（3）MnP催化的氧化反应MnP的氧化机制和LiP直接氧化机制相似，区别在于MnP表现出对Mn的绝对需要。（4）污染物的解毒作用。甲基化过程是对酚类物质的一种解毒机制，白腐真菌可以使多种酚类产生甲基化。研究证明真菌处理三氯苯酚、五氯苯酚的第一步是甲基化，甲基化后的产物比原酚对应物毒性小，LiP氧化起来更容易。通过质膜上产生氧化还原反应，形成跨膜质子梯度，从而产生能还原物质的电动势，实现对TNT、DDT这些高度氧化物质的还原。表1.1是白腐真菌PhanerochaeteChrysosporium降解的环境污染物。10n硕士学位论文表1.1白腐真菌PhanerochaeteChrysosporium降解的环境污染物类别污染物茚并芘苯并芘苯并[k]萤蒽苯并[b]萤蒽荧蒽蒽油菲蒽芴芘杂酚油噻蒽多环芳族化合物PAHs煤焦油重油五氯苯酚PCP多氯联苯PCBs四氯苯酚2,4,5-三氯苯酚4,-氯苯胺2,4-氯苯酚氯化芳族化合物2,4,5-三氯苯氧乙酸3,4-氯苯胺三氯二苯二氯二苯并二噁英3,4,5-二噁英DDT高丙体六六六毒杀芬氨基三唑氯丹农药偶N染料杂环染料三苯甲烷染料聚合染料碱性亚甲蓝橙II刚果红金莲橙O天青蓝染料碱性品红直接蓝溴酚蓝接黄乙基紫结晶紫孔雀绿甲酚蓝亮蓝二硝基甲苯DNT三硝基甲苯TNT军火环四亚甲基四硝基胺HMX环三亚甲基三硝基胺RDT叠N化合物氰化物四氯化碳二氧芑其他氯化木质素漂白工厂排出液BPE1.3.4纳米材料TiO2的研究1.3.4.1TiO2的简介纳米级二氧化钛又名钛白粉。直径在100nm以下，产品外观为白色的疏松粉末。具有抗线、自洁净、抗菌、抗老化的性能，可用于功能纤维、化妆品、油墨、塑料、油漆、涂料、精细陶瓷等领域。纳米二氧化钛分为两种结晶形态：金红石型（Rutile）和锐钛型（Anatase）。金红石型的二氧化钛和锐钛型的二氧化钛比较起来更稳定而致密，有较高的密度、硬度、折射率及介电常数，有较高的着色力和遮盖力。而在可见光短波部分的反射率方面，锐钛型的二氧化钛比金红石型的二氧化钛高，带蓝色色调，有较低的紫外线的吸收能力和较高的光催化活性。在一定条件下，锐钛型的二氧化钛和金红石型的二氧化钛可相互转化。11n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究1.3.4.2纳米TiO2的制备方法目前，制备纳米TiO2的方法很多，基本上可分为物理法和化学法。物理法也可以称为机械粉碎法，要求粉碎设备很好；化学法包括液相法、气相法（CVD）和固相法。(1)物理沉积物理气相沉积法（PVD）是指利用高稳热源如高频、电弧或等离子体把原料加热，使之形成等离子体或气化，然后骤冷凝聚形成纳米粒子。其中经常使用的方法是真空蒸发法。可以利用控制加热温度和改变气体的压力来控制粒子的粒径分布及大小。这种方法也可以用来制备复合氧化物、单一氧化物、金属粉以及碳化物。(2)化学沉积化学气相沉积法（CVD）是指利用化学反应使挥发性金属化合物的蒸气生成所需要的化合物，该法制备的纳米TiO2化学的活性高，粒度细，单分散性好，粒子呈现球形，有较强的屏蔽吸收紫外线能力，可见光的透过性好。该过程容易被扩大，连续化生产容易实现，缺点是一次性的投资大，同时存放和收集粉体的问题难以解决。CVD法又可分为气相合成法、气相氧化法、气相氢火焰法和气相热解法。气相氢火焰法通过四氯化钛氢火焰燃烧得到，反应方式如下：TiCl4+2H2+O2=TiO2+4HCl液相制备法是指选择有机溶剂或可溶于水的金属盐类，使其充分溶解，并以分子或离子状态充分混合均匀，再采用结晶、蒸发、水解、升华等过程或选择一种合适的沉淀剂将金属离子结晶出来或均匀沉积，再经热分解或脱水制得粉体。液相制备法包括溶胶-凝胶法、胶溶法和沉积法。其中沉积法可以分为均匀沉积法和直接沉积法。(1)溶胶法加酸使其形成溶胶，表面活性剂处理后，形成浆状胶粒，经过加热得到纳米TiO2粒子。(2)溶胶-凝胶法溶胶-凝胶法（简称S—G法），把无机盐或有机盐作为原料，使其利用有机介质进行缩聚、水解反应，溶胶-凝胶化过程使溶液形成凝胶，对凝胶进行加热（或冷冻）干燥、锻烧处理得到产品。这种方法制备的粉末分散性好，均匀，煅烧的温度低，纯度高，副反应少，反应易控制，工艺的操作简单，缺点是原料成本较高。(3)沉淀法12n硕士学位论文A、直接沉淀法其反应机理为：TiOSO4+2NH3·H2O→TiO(OH)2↓+(NH4)2SO4TiO(OH)2→TiO2(s)+H2O这种方法的产品的成本较低，操作简单易行，对技术要求、设备不太严格，缺点是易在产品中引入杂质，洗涤沉淀困难，同时粒子的分布较宽。B、均匀沉淀法均匀沉淀法是指使溶液中的构晶离子通过某一化学反应由溶液中均匀缓慢地释放出来，这种方法中常用的沉液剂是尿素，它与被沉淀物质不立刻发生反应，而是使沉淀剂在化学反应过程中缓慢从溶液中生成。通过这种方法制备的产品颗粒致密、均匀，方便洗涤过滤，广泛应用在工业化生产中。固相法合成纳米TiO2是指通过固-固反应或固态物料的热分解。它可以分为热解法、氧化还原法和反应法。经常使用的是利用偏钛酸热解法制备纳米TiO2。这种方法制得的纳米TiO2工艺简单，粒径的分布较宽，可大批生成，操作易行。1.3.4.3TiO2的应用及修饰半导体的能带包含一个空的或不满的高能导带(conductionband,CB)和一个充满电子的低能价带(valenceband,VB)两部分，导带和价带之间的区域称为禁带，其大小叫做禁带宽度，也称为带隙(Eg)。禁带是一个不连续的区域，在能量等于-或大于带隙的光照射半导体的情况下，价带上的电子(e)被激发然后而跃迁到导+带，导致价带上产生相应的空穴(h)。光生电子、空穴通过电场的作用迁移、分[45]离到半导体表面，导致半导体表面形成具有高度活性的电子-空穴对。由于光生空穴具有很强的氧化性，它们夺取吸附在半导体表面的物质或溶剂的电子，使[46]这些物质被氧化；反过来，光生电子是还原剂，接收半导体表面的电子被还原。处于激发态的光生电子和空穴一方面能参与光催化反应，一方面存在电子-空穴对的复合。在没有适当的捕获剂和陷阱中心的情况下，光生电子和空穴就会发生复合，产生的能量以热能或其它形式的能量散发掉。在存在适当的捕获剂和陷阱中心时，电子-空穴对的复合就会受到抑制，就会发生氧化还原反应。在氧化还原反应中，价带空穴充当良好的氧化剂，导带电子充当良好的还原剂，空穴的氧化能力在光催化反应中起到直接或间接的作用。在所有的半导体光催化剂中，TiO2以其氧化能力强、光催化活性高、无毒、化学稳定性好、成本低而引起人们的关注，并得到了广泛的应用。但是TiO2在光催化技术的推广过程中受到能带结构特点的局限性。因为TiO2的带隙(Bandgap)较宽(3.2eV)，光谱响应范围较窄，光吸收波长主要集中在紫外区(<387.5nm)，而辐射到地面的光大部分为红外光，所以对太阳能的利用率不高，所以存在TiO213n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究利用太阳能的效率低的问题。[47][48]沈伟韧和孙奉玉等通过溶胶-凝胶法制备了TiO2纳米粉，研究结果表明，观察到该催化剂的粒径小、比表面积大，具有明显的量子尺寸效应，当TiO2的晶粒尺寸小于16nm时，对甲基橙溶液的脱色反应和苯酚降解具有较高的光催化活性。通过在TiO2中掺杂不同的金属离子或过渡离子，不仅可以提高表面羟基浓度，降低光致电子-空穴对的复合率，提高光催化效率；而且，由于掺杂过渡金属离子使TiO2更宽的光吸收范围，使TiO2的吸收波长范围扩大到可见光区域，提高对太阳能的转化率和利用率。从物理化学的角度解释，掺杂过渡离子可在半导体晶格中引入缺陷和改变结晶度，在能带中引入杂质能级，导致光致电子-空穴对的复合受到抑制。1.3.5生物固定化技术1.3.5.1生物固定化的方法所谓固定化是指用化学或物理方法使使细胞成为不易从载体上流失或酶成为不溶性衍生物的形式被固定在生物反应器上用以细胞数量的增殖、催化生化反应等。固定化技术可以分为固定化微生物技术与固定化酶技术。20世纪70年代后，固定化酶技术发展到固定化微生物技术。固定化微生物技术是用物理或化学手段将游离微生物限定在特定的空间区域内，微生物细胞的浓度得以提高，较高的生物活性得以保持并反复利用的方法。该技术既不需要从细胞中把酶提取出来，又不需要对酶加以纯化，所以酶活性损失小。应用和研究表明，固定化微生物技术有反应速度快、微生物密度高、微生物流失少、耐毒害能力强、处理设备小型化、产物分离容易等优点。目前，在环境污染治理方面，固定化微生物技术得到广泛应用和研究，重金属污染废水和难处理的有机废水是其主要的治理对象，同时研究还涉及到土壤和大气的污染治理。固定化(immobilization)技术是使生物催化剂更有效、更广泛应用的一种重要[49,50]手段，它具有去除效率高，去除时间短的优点。制备固定化生物催化剂是用来限制生物催化剂自由流动的。目前经常使用的生物固定化方法主要有包埋法、[51]吸附法、截留法和交联法。（1）载体分隔法：指生物催化剂被载体的物理阻挡作用而固定化下来的方法。载体分隔法包括包埋法和微胶囊法。生物催化剂被限制在聚合网络中的方法称为包埋法；微胶囊固定化法是指生物催化剂通过乳化作用(emulsification)被包埋在由各种多聚物制成的半透性微胶囊内的方法。细胞固定化的最常用方法是包埋法。根据包埋系数的结构可分为微胶囊法和14n硕士学位论文凝胶包埋，指将细胞包裹于半透膜聚合物的超滤膜内或凝胶的微小格子内，该方法操作简单，成本低，固定化细胞球有较高的强度，对细胞活性影响较小，但缺点是传质的阻力较大。（2）载体结合法：根据生物催化剂和载体间的作用方式，载体结合法又可分为四类：共价结合法、物理吸附法、生物特异性吸附法、离子结合法。共价结合法是指经过化学修饰并且活化的载体和氨基酸上的一些残基通过共价键结合的方法；物理吸附法是指生物催化剂被吸附载体吸附到其表面，生物催化剂被固定化的方法。生物催化剂和吸附载体之间的作用包括氢键、范德华力和静电作用。共价结合法指的是固相支持物表面上反应基团和细胞表面上的官能团之间通过形成化学共价键得以连接从而使细胞固定化的方法。通过共价结合法得以固定的微生物和固相载体有较强的结合力，但是因为固定过程中操作较复杂，反应激烈，因而微生物活性受到较大抑制，应用的普遍性较差。吸附法指很多细胞利用吸附能力吸附到固体的物质表面或其他细胞的表面。吸附法包括离子吸附法和物理吸附法。物理吸附常用的吸附剂有活性炭、硅胶、沸石、多孔玻璃、纤维素和石英砂等，它们吸附到细胞表面上得以固定化。离子吸附法通过解离状态下的细胞带静电引力使带有相异电荷的离子交换剂得以固定的方法。乙酸的生产利用了木屑吸附装填细胞的固定化反应器，固定化细胞最早应用在之一过程中。吸附法技术成本低，过程要求简单，空间的位阻小，载体可再生用来重复利用，反应过程温和，缺点是有较差的牢固性，在外界环境突变的情况下，微生物（酶）容易从载体上脱落下来。固定化细胞（酶）生物活性和结合量和载体种类有很大关系。由于溶液与细胞之间没有屏障，出口料液如果不含游离细胞不适合用吸附法固定细胞。（3）系统截留法：是通过各种半透膜(如超滤膜、渗析膜、中空纤维膜、反渗透膜等)，把生物催化剂限定在一定的空间范围内并且以可溶形式存在，然后将生物催化剂过滤、离心、沉淀并将其返回到生物反应器中循环使用的方法。（4）联合固定化(co-immobilization)最初是指在固定化完整细胞上结合外来酶。后来，人们又发展在底物或其他物质上联合固定两种微生物细胞、两种酶或生物催化剂(酶、细胞)。（5）交联法又叫无载体固定化法，该法不利用载体，生物催化剂之间依靠化学的作用或物理的相互结合。化学交联法是指生物催化剂和胺类、醛类、水合金属氧化物等之间形成共价键相互联结而达到固定化目的的方法。生物催化剂和以上具有双功能或多功能基团的交联剂能形成不溶性的大分子。物理交联法是通过改变微生物培养过程的条件，如温度、离子强度、pH值等，使微生物细胞间发生直接作用实现絮凝(flocculation)或颗粒化(pelletization)而固定化下来的方法，形成的固定化微生物常称为颗粒污泥。15n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究交联法与共价结合法相似，通过细胞与载体表面上两个及两个以上官能团之间产生分子间的交连得以实现细胞固定化。但交联法中使用的载体是非水溶性的，双重氮联苯胺、戊二醛等是常用的交联剂。交联法固定的细胞与载体稳定性高，联结牢固，但是交联过程反应激烈，生化反应复杂，使微生物的活性受到抑制，所以适用的范围较狭窄。1.3.5.2生物固定化技术中常用的包埋材料（1）天然高分子多糖类此类载体材料具有对微生物毒性小，固定化成型方便，固定化密度高，传质[52]性能好等优点，但强度较低。常见的载体材料有海藻酸钠、琼脂、卡拉胶等。海藻酸钠价格低廉，温和无毒，常常用来固定活细胞和敏感细胞。因为海藻酸钠与钙盐、铝盐等能形成不溶于水且具有耐热性凝胶，利用这一特性将微生物细胞包埋固定，包埋起来的微生物细胞损伤小，但钙离子在含多价阴离子和高浓度电解质中易脱落，导致凝胶的机械强度下降。琼脂是一种天然高分子多糖，包埋细胞方法简单，琼脂糖胶有良好的惰性，具有较大空隙，高分子物质可以扩散过去，且对细胞没有毒性。但它的化学稳定[53]性和机械性能差。（2）合成高分子化合物此类载体化学稳定性和机械强度好，抗微生物分解性好。常用的有聚乙烯醇[54,55]和聚丙烯酰胺等。聚乙烯醇(PVA)凝胶价格低廉，强度较高，抗微生物分解性能强，化学稳定性好，和ACAM凝胶比较起来，细胞的活性损失小，对生物的毒性很小，和海藻酸钙包埋法比较起来，存活时间长，但PVA凝胶的缺点是交联不彻底，导致少量有机碳成分溶出，同时PVA凝胶固定化要求的条件复杂，硬化需要的时间较长。PVA凝胶的制备方法可以分为两种：一种是PVA-硼酸法，另一种是PVA-冷冻法。聚丙烯酰胺(ACAM)凝胶是利用聚丙烯酰胺作为单体，通过N,N-甲叉双丙烯酰胺当作双功能交联剂制成的凝胶，热稳定性、化学和机械性能良好。[56][57]除了以上介绍的这几种常用载体材料以外，还有硅石，沸石等。集中固[58]定化细胞载体材料的性能比较见表1.216n硕士学位论文表1.2几种固定化细胞载体材料的性能比较载体材料琼脂海藻酸钙角叉莱胶聚丙烯酰胺聚乙烯醇-硼酸压缩强度0.50.80.81.42.75耐曝气强度差一般一般好好扩散系数/6.8（30℃）3.73（25℃）5.44~6.673.42（25℃）（60~75℃）有效系数75685860/耐生物分解性差较差较差好好对生物毒性无无无较差一般固定化难易易易易难较易成本便宜较便宜贵贵便宜1.4非损伤微测技术的研究进展非损伤微测技术(Non-invasiveMicro-testTechnique,NMT)是一种新型的电生理技术，生理学、基础生物学、农林学、医学以及药物机理等领域逐渐应用到这[59][60]项技术。这种技术可获取到被测物活体、实时并且不间断的离子流信息。非损伤微测技术与膜片钳技术在时间和空间上比较，都具有无法替代的优势。非损伤微测技术，又叫做“无损微测技术"，是一种选择性离子/分子微电极技术。非损伤微测技术在保持被测样品完整的条件下，在真实生理环境状态下，获取各种进出样品的离子和分子的流速、浓度和三维运动方向的信息，因此对样品没有损伤性，具有高的空间分辨率和时间分辨率，具有动态、活体、内外兼测、实时、多维扫描与测量、长时间测量的特点，另外对测定的材料不限，测定材料可以是单细胞、细胞层、器官、组织以及整体，还可以是富集的细胞器，并且以后能够运用非损伤微测技术的分子离子种类会越来越多。非损伤微测技术是获取[61]生物样品内外离子或分子运动的信息的重要途径和方式。过去人们在研究植物根部的无机离子运输时，总是使用各种化学分析和失踪技术。近20年来，人们使用先进的生物物理和分子技术(如荧光成像和膜片钳)，来研究细胞膜上的转运器，以及转运器之间的相互作用。但是，荧光成像和膜片[62]钳等技术降低了转运器的生理学真实性。因此，把这些先进技术得到的结论运用到真正植株上是不完全正确的。非损伤微测技术和其他离子流测量技术的比较见表1.2，非损伤微测技术不仅有高的空间分辨率、高的时间分辨率的特点，而且对生物样品的损伤性小，即[63]保证样品在不被破坏的情况下，得到进出样品的各种离子和分子的信息。17n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究表1.3非损伤微测技术与其他离子流测量技术的比较粒子流测量技术优点缺点放射性示踪剂操作相对简单，可量化具体离空间分辨率受限制子的非指向性流量核磁共振光谱非损伤性只检测原子，空间分辨率低，通常为几小时荧光显微镜非损伤性，时间分辨率高，空校准困难，可测量的离子有间分辨率高限，一些探针缺乏识别力，离子探针与细胞代谢物相互作用膜片钳提供在细胞膜上关于动力学方法相对复杂，得出的结论生和运输蛋白质的综合信息理真实性低刺穿微电极测定细胞膜点位，监测细胞质技术和技能要求高，不太可能中离子平衡变化被用于常规非损伤微测非损伤性，接近生理状态环境选择性微电极技术制作困难，下进行测定，空间分辨率高，不易保存，离子载体的选择性同时测量几种离子系数不理想，一定程度上限制了其应用范围1.5抗氧化酶体系的研究1.5.1氧化应激和抗氧化酶氧化应激（OxidativeStress，OS）是指体内抗氧化作用与氧化失衡，氧化大过抗氧化作用，导致蛋白酶分泌增加，中性粒细胞炎性浸润，产生大量的氧化中间产物。自由基产生的负面作用称为体内的氧化应激，氧化应激是引起疾病和衰老的重要原因。-ROS包括羟自由基（.OH）、超氧阴离子（.O2）和过氧化氢（H2O2）等；RNS-包括二氧化氮（.NO2）、一氧化氮（.NO）和过氧化亚硝酸盐（.ONOO）等。机体的抗氧化系统可以分为两种，一种是抗氧化酶系统，包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶(SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px）等；另一种是非抗氧化18n硕士学位论文酶系统，包括维生素E、维生素C、褪黑素、谷胱甘肽、类胡萝卜素、α-硫辛酸、微量元素锌、铜、硒（Se）等。研究表明，抗氧化系统可以降低氧化应激带来的损害。氧化剂、抗氧化剂的平衡被氧化应激打破，强氧化剂和抗氧化剂的不平衡导致细胞损伤。这些损伤的显示剂包括蛋白质氧化产物、DNA碱基、脂质过氧化产物等。血管细胞增长能通过细胞内的信号反应性氧化物（ReactiveOxidativeSpecies,ROS）表现出来。在ROS活性过度的情况下，血管疾病状态（如动脉粥样硬化、高血压）与其有关。过氧化物是ROS家族的一个重要成员。大量研究表明ROS增加现象与神经退行性病变有关；在血管细胞外超氧化物歧化酶减少的情况下，冠状动脉疾病状态OS加剧，因为在对抗超氧化物阴离子中超氧化物歧化酶发挥了重要的保护作用。OS在癫痫、肺纤维化、动脉粥样硬化、高血压、猝死、帕金森病中扮演重要角色。镉是一种对植物和动物有危害的重金属，当植物吸收镉重金属后，镉的化学[64]活性和生物毒性，会通过多种途径表现出其对植物产生毒害。镉胁迫下，植物[65,66]合成叶绿素的酶的活性受到抑制，叶绿素的含量降低；光合作用系统中的色[67]素蛋白复合体因为植物中镉的积累团聚在一起，导致光合速率降低，生长受抑。[68,69]大量活性氧的产生是镉对植物毒害的另一种重要表现。活性氧在植物中过度[70]积累不仅会使膜脂发生过氧化，还能破坏核酸、蛋白质等生物大分子物的活性[71]和功能，紊乱植物的代谢过程。POD参与植物的生长发育、细胞分裂等重要的生理活动，是植物体内必不可少的代谢酶。同时POD能通过抗氧化作用保护细胞膜，防止重金属破坏细胞膜或[72]者降低受破坏的程度，因此，也是植物体内抗氧化酶系统的重要组成成员。重金属胁迫能使植物细胞活性氧代谢的失调并导致氧自由基的积累，另外还能损伤细胞的膜结构，紊乱细胞生理生化代谢，SOD作为一种重要的防御酶，其活性对于植物抵抗重金属毒害的能力具有十分重要的作用。SOD的主要作用是清除生物体内的活性氧，能维持植物体内活性氧自由基在较低水平，从而避免了活[73]性氧对植物细胞的伤害。SOD与小分子物质(如抗坏血酸和谷胱甘肽等)共同[74]作用使植物体内的活性氧自由基保持在较低水平，从而防止自由基的毒害。过氧化氢酶（CAT）的功能是清除细胞内过多的H2O2，能够,使细胞内H2O2维持在一个正常水平，达到保护膜结构的目的，因此是一种保护性酶。通过测定CAT和SOD酶活性的变化情况，来即时了解植物在有毒物质胁迫作用下受伤害[75]的程度。19n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究1.6本课题的研究目的及内容1.6.1研究内容和意义从前面综述可以看出，白腐真菌已经被广泛应用于处理废水中重金属和有机物，包埋TiO2和黄孢原毛平革菌的复合生物吸附剂可以提高重金属和有机物的去除率。本试验中TiO2经过氮修饰，不仅可以使TiO2在光波长小于380nm条件下降解有机物，而且在波长380nm以上也可以降解有机物。白腐真菌在重金属-有机物污染废水中的响应已经有人研究过了，主要是集中+2+在重金属对白腐真菌的生理流速（H、O2、Cd流速）和抗氧化酶体系（MDA-含量、O2、SOD、CAT活性）等，结果表明重金属和有机物能破坏细胞膜，增加细胞膜的通透性，改变生理流速的大小。有毒物质引起细胞膜的脂质硬化，质膜ATPase活性降低，质子泵产生的跨膜电动势降低。而且，有毒物质使细胞产生活-性氧自由基（O2、H2O2），破坏细胞结构。但是在抗氧化酶的作用下，活性氧自由基能有效的清除，在高浓度重金属或有机物浓度下，抗氧化酶就会失活，细胞就会被破坏，甚至死亡。现阶段，对复合纳米生物材料在重金属-有机物污染废水中的响应还没有人研究过，因为复合纳米生物材料对处理复合废水的重要意义，研究复合纳米生物材料在废水中的响应显得十分重要。本研究中复合纳米生物材料在有毒物质作用下的响应包括复合纳米生物材料+2+中白腐真菌的生理流速（H、O2、Cd流速）和抗氧化酶（NADH氧化酶、SOD、CAT）活性的变化，以此来研究有毒物质对复合纳米生物材料中白腐真菌的影响，揭示生理流速和有毒物质之间的关系，以及复合纳米生物材料中白腐真菌体内抗氧化酶体系的作用机制。2+此研究揭示了Cd进入复合纳米生物材料的机制，复合纳米生物材料中白腐+真菌通过调节H、O2流速抵抗有毒物质的机制，抗氧化酶活性变化与有毒物质浓度变化的关系，为废水处理中复合纳米生物材料的生理流速和抗氧化酶活性变化的研究提供了重要的参考价值。1.6.2研究的技术方案本实验主要研究思路与技术路线如图1.1所示。20n硕士学位论文图1.1研究技术路线21n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究第2章复合纳米生物材料的制备2.1材料与方法2.1.1仪器与主要试剂2.1.1.1实验主要仪器（1）双重蒸馏水器；（2）磁力搅拌器；（3）洁净台（SW-CJ-2FD，苏州净化，中国）（3）高温灭菌锅；（4）浊度仪（XZ-0101S，上海，中国）；（5）马弗炉（SRJX，北京，中国）；（6）电烘箱（DHG-9003，上海，中国）；（7）pH计(Mettler)；（8）电子天平(AEl63，Mettler)；（9）振荡培养箱(ZHWY，上海，中国)；（10）试管，试管架，移液管，移液枪，棉签，枪头，玻璃棒；（11）容量瓶，锥形瓶，量筒、烧杯、注射器等。（12）原子吸收分光光度计(PerkinElmerAA700，USA)，空气—乙炔火焰原子化器，镉空心阴极灯；（13）液相色谱仪（Agilent1100，美国）；（14）冷冻干燥仪(FD-1,Boyikang,Beijing,China)；（15）环境扫描电子显微镜(FEIQUANTA-200,HollandFEICompany,Holland)。2.1.1.2实验主要试剂无机试剂：MgSO4·7H2O，KH2PO4，MnSO4，CaCl2，FeSO4·7H2O，NaCl，CoSO4，ZnSO4，AlK(SO4)2，CuSO4·5H2O，NaMoO4，H3BO3；有机试剂：琼脂，葡萄糖，无水乙酸钠，酒石酸铵，生物素，氨基三乙酸酯，叶酸，盐酸硫胺素（维生素B1），维生素B6盐酸盐，核黄素（维生素B2），维生素B12，DL-泛酸钙，烟酸，硫辛酸，对氨基苯甲酸，尿素，冰醋酸，无水乙醇，钛酸四22n硕士学位论文丁酯。（1）1g/LCd(II)储备液的配制：称取2.75gCd(NO3)2·4(H2O)溶于1L去离子水中，定容至1L，摇匀，备用。（2）1g/L2,4-DCP储备液的配制：称取1g2,4-DCP溶于1L去离子水中，定容至1L，摇匀，保存在棕色试剂瓶中，避光。2.1.2菌种来源及培养基2.1.2.1菌种来源黄孢原毛平革菌BKMF-1767（CCTCCAF96007）（Phanerochaetechrysosporium）菌株购买于中国武汉菌种保藏中心。4℃保存在土豆琼脂培养基（PDA）上。2.1.2.2培养基本实验，黄孢原毛平革菌首先被传代保存于土豆琼脂培养基（PDA）上，然后再进行扩大生长培养。（1）PDA培养基成分（1L）：200g土豆浸出液，1.5gMgSO4·7H2O，3gKH2PO4，20g琼脂，20g葡萄糖。其制备方法：称取100g洗净去皮马铃薯，切成小块，置于1L烧杯中，加水500mL，煮沸半个小时，经纱布过滤至另一烧杯中，然后向烧杯中加入10g葡萄糖、1.5gKH2PO4、0.75gMgSO4·7H2O和10g琼脂，用玻璃棒搅拌使之充分溶解冷却后，加蒸馏水定容至500mL，然后分装于锥形瓶，于121℃下高压蒸汽灭菌30min后取出，在无菌条件下移入培养皿（约2/3培养皿液量），冷却后备用。（2）生长培养基成分（1L）：葡萄糖11.098g/L，酒石酸铵0.22g/L，KH2PO40.2g/L，MgSO4·7H2O0.05g/L，CaCl20.01g/L，无水乙酸钠1.6g/L，无机溶液1ml/L，维生素溶液0.5mL/L，pH=5.6~5.8；无机溶液：称取3.0gMgSO4·7H2O，1.5g氨基三乙酸酯，1.0gNaCl，0.5gMnSO4，0.1gCoSO4，0.1gFeSO4·7H2O，0.1gZnSO4，0.082mgCaCl2，0.01gCuSO4·5H2O，0.01gH3BO3，0.01gAlK(SO4)2，0.01gNaMoO4溶于1L双重蒸馏水中；维生素：称取0.005g盐酸硫胺素（维生素B1），0.002g生物素，0.002g叶酸，0.01g维生素B6盐酸盐，0.005g核黄素（维生素B2），0.005g烟酸，0.000123n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究g维生素B12，0.005g对氨基苯甲酸，0.005gDL-泛酸钙，0.005g硫辛酸；2.1.3氮修饰纳米TiO2材料的制备本实验采用溶胶凝胶法制备氮修饰纳米二氧化钛，具体步骤如下：（1）首先称取0.282g的尿素于烧杯中，然后加入40ml的无水乙醇、8ml双重蒸馏水和12ml冰醋酸，开启磁力搅拌至尿素完全溶解后，即得A液。（2）取32ml的钛酸四正丁酯加入到盛有128ml无水乙醇的锥形瓶中，混合均匀，即得B液。（3）用注射器抽取A液并将其缓慢滴加到B液中，边滴加边搅拌，等A液和B液混合后，放在空气中24h后会形成乳白色的凝胶。（4）将凝胶装在培养皿中，转移到恒温真空干燥箱中，80℃烘干，直到凝胶变成颗粒状的结晶物才将其取出。（5）将颗粒状的结晶物用研钵研磨成粉末状，置于马弗炉中于500℃条件下煅烧2h，得到氮修饰纳米二氧化钛。2.1.4复合纳米生物材料的制备把2gTiO2加入到100mL2%（m/m）海藻酸钠溶液中；菌悬液制备：从固体培养基上刮取黄孢原毛平革菌孢子，均匀混合于100mL6已灭菌的蒸馏水中，制成浊度为1.0×10CFU/mL的孢子悬液；包埋小球的制备：将含有纳米TiO2的100mL海藻酸钠溶液和孢子悬液的混合溶液用注射器吸取，滴加到200mLCaCl2（3%，m/m）溶液中，静置2h，将包埋小球转移到500mL的摇瓶的液体培养基中，每个锥形瓶中放3g包埋小球，150r/min，37℃，培养3d，过滤，用蒸馏水冲洗3次即得到包埋小球。2.1.5包埋黄孢原毛平革菌的制备菌悬液制备：从固体培养基上刮取黄孢原毛平革菌孢子，均匀混合于100mL6已灭菌的蒸馏水中，制成浊度为1.0×10CFU/mL的孢子悬液；包埋小球的制备：将100mL海藻酸钠溶液和孢子悬液的混合溶液用注射器吸取，滴加到200mLCaCl2（3%，m/m）溶液中，静置2h，将包埋小球转移到500mL的摇瓶的液体培养基中，每个锥形瓶中放3g包埋小球，150r/min，37℃，培养3d，过滤，用蒸馏水冲洗3次即得到包埋小球。2.1.6Cd(II)的测定与计算方法(1)标准曲线的绘制准确吸取镉标准使用液10、20、30、40、50μL移入1~5号50mL容量瓶中，然后用0.2%HNO3溶液定容至刻度，摇匀，此时，1~5号容量瓶中的镉浓度分别24n硕士学位论文为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L。上述标准溶液配制好后，在原子吸收分光光度计上测定其吸光度，然后以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。(2)样品处理2+包埋小球在培养基中培养3天后，向锥形瓶中添加一定量的Cd和2,4-DCP2+使其溶液的Cd浓度分别为0,0.1,0.25,0.5,0.6,0.7mM和2,4-DCP浓度为10-1mg/L。然后继续在振荡培养箱中37°C和150rmin条件下培养24h，测定锥形2+2+瓶内添加Cd前和添加后Cd的浓度，计算去除率和吸附容量。(3)样品测定由于实验试样溶液中镉离子的初始浓度在标准曲线的范围之外，因此，在试样测定前应进行一定比例的稀释。稀释后，利用原子吸收分光光度计，在标准曲线条件下，测定试样溶液的吸光度，计算溶液中镉的浓度。复合纳米生物材料对镉离子的去除率和吸附容量按下式2.1和2.2计算：CC0去除率（%）100%(2.1)C0(CC)V0Q(2.2)M其中，Q表示复合纳米生物材料对镉的吸附容量(mg/g)，C0表示镉离子的初始浓度(mg/L)，C表示镉离子的平衡浓度(mg/L)，V表示溶液体积(mL)，M表示复合纳米生物材料的干重(g)。2.1.72,4-DCP的测定与计算方法(1)标准曲线的绘制：准确吸取2,4-DCP的标准使用液使容量瓶中的2,4-DCP浓度分别为5、10、20、40、80、100、120mg/L。上述标准溶液配制好后，在液相色谱仪上测定其峰值高度，然后以浓度为横坐标，峰值高度为纵坐标绘制标准曲线。(2)样品处理2+包埋小球在培养基中培养3天后，向锥形瓶中添加一定量的Cd和2,4-DCP2+使其溶液的Cd浓度为0.1mM和2,4-DCP浓度分别为5，10，20，40，80，100，-1120mg/L。然后继续在振荡培养箱中37°C和150rmin条件下培养70h，测定锥形瓶内添加2,4-DCP前和添加后2,4-DCP的浓度，计算去除率和吸附容量。(3)样品测定液相色谱仪测定条件：流动相为甲醇/水（4/1），液相流速为1.0ml/min，287nm条件下测定，柱温为25°C。25n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究复合纳米生物材料对2,4-DCP的去除率和吸附容量按下式2.3和2.4计算：CC0去除率（%）100%(2.3)C0(CC)V0Q(2.4)M其中，Q表示复合纳米生物材料对2,4-DCP的吸附容量(mg/g)，C0表示2,4-DCP的初始浓度(mg/L)，C表示2，4-DCP的平衡浓度(mg/L)，V表示溶液体积(mL)，M表示复合纳米生物材料的干重(g)。2.2结果与讨论2.2.1复合纳米生物材料对2,4-DCP的去除效果图2.1复合纳米生物材料在不同浓度2,4-DCP的作用下对2,4-DCP的的去除率和吸附量的关系图从图2.1可以看出，复合纳米生物材料对2,4-DCP的去除率在10mg/L时达到最大值，去除率为58.2%，吸附量随着2,4-DCP的浓度增加，这个结果表明2,4-DCP的浓度越大，复合纳米生物材料去除的2,4-DCP就越多，但是去除率在10mg/L时达到最大值。这可能是因为2,4-DCP的浓度在低浓度范围内，能被复合纳米生物材料中白腐真菌和纳米二氧化钛降解成小分子中间产物，这些小分子26n硕士学位论文为复合纳米生物材料中白腐真菌提供碳源和能源，所以去除率提高；但是2,4-DCP的浓度继续增大时，2,4-DCP会对复合纳米生物材料中白腐真菌产生毒害作用，并且浓度越大，毒害作用越明显，所以随着2,4-DCP的浓度增加，去除率下降。2+2.2.2复合纳米生物材料对Cd的去除效果2+2+图2.2复合纳米生物材料在不同浓度的Cd的作用下对Cd的去除率和吸附量的关系图2+从图2.2可以看出，复合纳米生物材料对Cd的去除率在0.25mM时达到最2+2+大值，吸附量随着Cd的浓度增加，这个结果表明的Cd浓度越大，复合纳米生2+物材料去除的Cd就越多，0.5mMCd(NO3)2时吸附量(27.6mg/g)比0.1mM2+Cd(NO3)2的吸附量（3.49mg/g）。这可能是因为Cd的浓度在低浓度范围内，有2+利于复合纳米生物材料中白腐真菌的生命活动，Cd在低浓度时对白腐真菌有促2+2+进作用，所以去除率提高；但是Cd的浓度继续增大时，Cd会对复合纳米生物2+材料中白腐真菌产生毒害作用，并且浓度越大，毒害作用越明显，所以随着Cd2+2+的浓度增加，去除率下降。Cd的初始浓度是影响复合纳米生物材料对Cd吸附量的一个重要方面，浓度越高能提高复合纳米生物材料和水溶液间的传质动力，2+2+使更多的Cd到达材料表面被去除，同时高浓度的Cd还能增加离子和材料间的碰撞次数，提高材料的吸附量。2.3本章小结2+本章介绍了复合纳米生物材料的制备方法以及2,4-DCP和Cd的浓度对复合纳米生物材料去除有毒物质的影响。实验结果表明，复合纳米生物材料降解27n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究2,4-DCP的最佳浓度为10mg/L，吸附重金属的最佳浓度为0.25mM；复合纳米生2+物材料对重金属或有机物的吸附量随着2,4-DCP或Cd的浓度增加而增加，去除2+率在低浓度2,4-DCP或Cd范围内提高，但浓度继续增加去除率反而下降。28n硕士学位论文第3章复合纳米生物材料的离子流速的变化3.1材料和方法3.1.1非损伤微测技术简介非损伤微测技术是集化学、物理学、生物学、现代电子学及计算机等多学科为一体的技术，以获取实时、无标记的进出活体样本分子和离子流速和运动方向[76,77]的信息为目的。实际测量过程中，在电脑自动控制下，通过特异性离子/分子选择电极，获取进出样品各种分子和离子流速、浓度及其运动方向的动态信息。非损伤微测技术对样品进行实时、动态的原位测量，通过测量的结果可以获得样品的生命活动规律和生理特征等微观信息。+2+++2+-4+2+目前，非损伤微测技术可以测量H、Ca、Na、K、Mg、Cl、NH、Cd、-2+NO3、Pb以及O2、葡萄糖、H2O2、抗坏血酸等几十种离子和分子，今后由于特异性电极种类的增加，能够测量的分子、离子的种类也会不断增加。3.1.2非损伤微测技术工作原理非损伤微测技术的工作原理是物质有从高浓度向低浓度扩散，带电粒子从高2+2+电势向低电势移动。为了更好的解释这一原理，下面以Ca浓度梯度和Ca微电极为例，具体说明非损伤微测的物理学原理。[61]2+如图3.1所示，Ca离子选择性电极在待测离子梯度中以已知距离dx进行两点测量，并分别获得测试点的电压V1和V2。两点间的浓度差dc则可以从V1、V2及已知的电压/浓度校正曲线计算获得。D代表是离子/分子特异的扩散系数（单-2-1位：cms），将它们代入Fick定律公式计算（3.1）：dcJD（3.1）dx2+-2-1可获得Ca离子的流动方向及速率（单位：pmolcms），即每秒钟通过一个平方厘米的该分子/离子摩尔数。29n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究[61]图3.1非损伤微测技术的工作原理示意图3.1.3测试系统及电极利用非损伤微测扫描离子选择微电极技术（NMT系统：BIO-IM,YoungerUSA,+LLC,Amherst,MA）测定镉和2,4-DCP胁迫下复合纳米生物材料的H流变化；利用氧流速光纤系统（YGOO-01A;YoungerUSA,LLC）测定氧流速。实验中，样品[89]测试、系统及信号收集如图3.2所示。图3.3为测试过程中，微电极复合纳米生物材料表面收集信号的抓图。MotorParallelPortController1FrameGrabberMotorParallelPortController2VideoCameraASETSoftwareZoomTriggerFocusMicroscopeD/AD/AOffsetSubtractioneFungiPelletsptrodO3DStepperMotorOutputSignal2DStepperDifferentialMotorMicroxTX3Amplifierx10-100OffsetPotentialTestMedium[89]图3.2离子流测定的非损伤测试系统装置示意图30n硕士学位论文图3.3微电极在复合纳米生物材料表面信号采集图+非损伤微测技术已广泛应用在离子流测定方面。在H流测定前，先从前端灌充商业购买的液态选择性离子交换剂（产品号：95293;Sigma-Aldrich,StLouis,MO）。从后部灌充电解液（15mMNaCl+40mMKH2PO4,pH7.0）到拉制好并硅烷化的玻璃电极（内径：2-4µm；XYPG120-2,Xuyue）；电极尖端留出约1cm长的空间，制备好的电极在使用前需要在校正液中校正（校正液1#：1.5mMKH2PO4,0.1mMKCl,pH4.0；校正液2#：1.5mMKH2PO4,0.1mMKCl,pH5.0），只有当Nernstian斜率大于58mV/decade的电极为合格电极，如果电极制作不合格，不可以进行测量，应该重复上面的步骤再制作，直至电极合格。利用光纤氧气微传感器（电极）测定氧流速时，同样需要将电极（尖端直径6±1µm）进行校正，方法是将电极放在21%氧的无氮媒介中。测定中，将电极尖端置于距离复合纳米生物材料表面约3±1µm处作为原点，在垂直于复合纳米生物材料表面的方向进行两点移动，测量两点电压差，两点移动距离为30µm，来获取溶液中目标粒子的浓度梯度。氧流采样时间间隔为8.91s；2++Cd、H的采样时间间隔为5.96s。31n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究3.1.4质子流和氧流测定方案（1）瞬时粒子流测定收集培养3天的包埋小球，用超纯水冲洗3遍，置于测试液中平衡10min（测试液成份：1.5mMKH2PO4,0.1mMKCl,pH4.5）。平衡之后，将包埋小球置于新+鲜测试液中记录H或氧气流5~6min，之后加入一定体积的2,4-DCP母液，使测+试液中的2,4-DCP终浓度为10mg/L，继续监测复合纳米生物材料表面的H或氧气流（约15min）；再次往测试体系中加入一定体积的Cd(NO3)2母液，使测试液+中的Cd(NO3)2终浓度为0.1mM，继续监测H或氧气流变化情况。由于2,4-DCP或Cd(NO3)2母液进入溶液以后需要1min左右扩散，所以这段时间内的实验数据不是包埋小球真实的生理流速，应该从1min以后开始记录实验数据并作为实验结果进行数据处理。3.1.5镉离子流速测定方案实验中采用非损伤微测技术测定镉离子进出包埋小球的流速。仪器设备、原理及电极制作方法同3.2.2。唯一的不同之处在于测定镉离子时电极灌充的电解液、尖端的离子交换剂及校正液与前面的不同。2+在Cd流测定前，先从前端灌充商业购买的液态选择性离子交换剂（产品号：20909;Sigma-Aldrich,StLouis,MO）。从后部灌充电解液（10mMCdCl2+0.1mMKCl）到拉制好并硅烷化的玻璃电极（内径：2-4µm；XYPG120-2,Xuyue）；电极尖端留出约1cm长的空间，制备好的电极在使用前需要在校正液中校正（校正液1#：0.05mMCd(NO3)2,1.5mMKH2PO4,0.1mMKCl,pH4.5；校正液2#：0.5mMCd(NO3)2,1.5mMKH2PO4,0.1mMKCl,pH4.5），只有当Nernstian斜率大于25mV/decade的电极为合格电极，如果电极制作不合格，不可以进行测量，应该重复上面的步骤再制作，直至电极合格。（1）瞬时镉离子流测定收集培养3天的包埋小球，用超纯水冲洗3遍，置于测试液中平衡10min（测试液成份：0.1mMCd(NO3)2,1.5mMKH2PO4,0.1mMKCl,pH4.5）。平衡之后，2+将包埋小球置于新鲜测试液中记录Cd流30min，之后加入一定体积的2,4-DCP母液，使测试液中的2,4-DCP终浓度为10mg/L，继续监测复合纳米生物材料表2+面的Cd流（约15min）。测定过程中由于加入2,4-DCP母液会引起扩散效应，因而加药后重新开始记录的约1min(溶液中电位不稳定)的数据结果不是包埋小球真实的响应，因此不计入实验结果使用。收集培养3天的包埋小球，用超纯水冲洗3遍，置于测试液中平衡10min（测试液成份：0.1mMCd(NO3)2,1.5mMKH2PO4,0.1mMKCl,pH4.5）。平衡之后，32n硕士学位论文将包埋小球置于新鲜测试液中记录镉离子流15min，之后加入一定体积的GdCl3母液（钙离子通道抑制剂），使测试液中的GdCl3终浓度为0.1mM，继续监测包埋小球表面的镉离子流（约10min）。由于GdCl3母液进入溶液以后需要1min左右扩散，所以这段时间内的实验数据不是包埋小球真实的生理流速，应该从1min以后开始记录实验数据并作为实验结果进行数据处理。3.1.6数据分析每个处理样至少做3个重复。粒子流速根据旭月科技有限公司开发的Mageflux软件进行计算，网址http:www.youngerusa.eoln/mageflux,orhttp:xuyue.net/mageflux.3.2结果与讨论3.2.1复合纳米生物材料的镉流测定结果分析2+将包埋小球置于含0.1mMCd(NO3)2和10mg/L2,4-DCP的溶液中，观察Cd进出包埋小球的情况如图3.4所示。-402+ACdflux-60)-1s-2-80olcm-1002,4-DCP(pmflux-1202+Cd-140-160010203040Time(min)2+图3.4复合纳米生物材料在0.1mMCd(NO3)2和10mg/L2,4-DCP作用下Cd即时流速2+-2-1Cd流在最初30min以内的平均流速为-147±5pmolcms(负的代表流进，2+-2-1正的代表流出)。在添加2,4-DCP后，Cd流速从-51±1pmolcms降到-116±0.2-2-1pmolcms。这是因为2,4-DCP可以被分解成小分子物质如，1,3-二甲苯、2-巯基-1-甲基戊烷、4-己烯-1-醇等，这些小分子物质是复合纳米生物材料把2,4-DCP脱[78]氯作用之后的中间产物，它们是复合纳米生物材料中白腐真菌的碳源，对菌体33n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究[79]有利，而且10mg/L是复合材料吸附2,4-DCP的最佳浓度，此时去除率达到最大值。这可能是由于添加2,4-DCP后酶分泌到包埋小球表面促进复合纳米生物材料2+中白腐真菌对Cd的吸附。2+将包埋小球置于含0.1mMCd(NO3)2和0.1mMGdCl3的溶液中，观察Cd进出包埋小球的情况如图3.5。Cd2+fluxChangesinCd2+flux00-20-20)-1sec-40-40-2flux(%)2+-60-60ux(pmolcmfl-80-80ngesinCd2+haCdC-100-100GdCl3addedCd2+added-120-1202+图3.5复合纳米生物材料在0.1mMCd(NO3)2和0.1mMGdCl3作用下Cd平均流速和流速变化图2+−2在开始测定的15±0.2min内，Cd呈现明显的内流（−107.5±4pmolcm−1[80]2+s），随后添加0.1mM的GdCl3（钙离子通道抑制剂），Cd内流大大降低至−75−2−12+2+±2pmolcms，Cd流速减少了30%左右。说明钙离子通道对Cd进入包埋小球的重要作用。离子通道对膜电位的稳态、产生和保持，信号的传输都有重要的[81]2+2+[82]作用，Cd通过膜蛋白进出离子通道，它还能和钙离子结合并调节Ca。以2+上结果表明Cd流速的减少是由于加入GdCl3是离子通道受阻。图3.6为用0.1mMCd(NO3)2和0.5mMCd(NO3)2镉处理不同时间后，复合纳米生物材料的平均镉流。用0.1mMCd(NO3)2分别处理0、1和6h后，观测10min内，2+−2−1复合纳米生物材料的平均Cd流分别为−104±4，−39±4，−26±3pmolcms。随着处理时间的延长，镉内流逐渐降低，说明复合纳米生物材料对镉的吸附和摄[83]取过程逐渐趋于平衡。当Cd(NO3)2的处理浓度为0.5mM时，所得到的镉流趋势跟0.1mM镉处理时一致。0.1和0.5mMCd(NO3)2处理6h后，复合纳米生物材料2+的实时镉流如图3.6所示，此时复合纳米生物材料对Cd还未达到平衡。34n硕士学位论文Exposuretime(h)0160-20-40)-1-60sec-80A-2A-100olcm-120-340(pmflux2+Cd-3600.1mM0.5mM-380图3.6复合纳米生物材料在0.1mMCd(NO3)2和0.5mMCd(NO3)2作用下，作用时间分别为2+0h,1h,6h时Cd流速本实验中，0.5mMCd(NO3)2胁迫开始阶段的镉内流比0.1mMCd(NO3)2胁迫时的镉内流高出许多，大概是0.1mMCd(NO3)2流速的3.5倍，这可能是由于不同的镉浓度导致不同的传质驱动力及生物毒性所致。溶液中镉浓度越高，传质驱动[84]2+[85,86]力越强，因而能增强复合纳米生物材料和Cd之间的碰撞，增强镉流。2+2+复合纳米生物材料的Cd流速远远大于Phanerochaetechrysosporium的Cd2+流速表明复合纳米生物材料对Cd有更大的吸附量，这可能是复合纳米生物材料中白腐真菌的官能团和菌丝以及纳米材料TiO2的吸附面积大的原因。+3.2.2复合纳米生物材料的H和O2流的测定结果分析+将包埋小球置于含0.1mMCd(NO3)2和10mg/L2,4-DCP的溶液中，观察H和O2进出包埋小球的情况如图3.7。35n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究560O2fluxA540)-1Cd2+sec520-22,4-DCPolcm500ux(pm480fl2O460440051015202530Time(min)50+BHflux0)2,4-DCP2+-1Cd-50sec-2-100olcm-150ux(pm+fl-200H-250-300010203040Time(min)+图3.7（A）复合纳米生物材料在10mg/L2,4-DCP和0.1mMCd(NO3)2作用下H流速；（B）复合纳米生物材料在10mg/L2,4-DCP和0.1mMCd(NO3)2作用下O2流速2+O2流在2,4-DCP和Cd胁迫后都减小，O2流速都是外流，2,4-DCP胁迫下−2−1−2−12+O2流从489.6pmolcms降到475.6pmolcms，Cd胁迫下O2流从502.4−2−1−2−1pmolcms降到488.3pmolcms。O2流速由ROS清除者（如CAT）和呼吸2+-作用共同决定的。在2,4-DCP和Cd作用下，ROS清除者会将H2O2，O2转化为[87]2+O2，同时在2,4-DCP和Cd的作用下，O2的内流流速会增大，有类似的研究36n硕士学位论文[88]可以证明，例如N.europaea在20uMCCCP胁迫作用下，O2流从-34±5pmol−2−1−2−1cms增加为-61±3pmolcms这两个因素共同决定O2流速的变化。相比较[89]Phanerochaetechrysosporium的O2流是内流，复合纳米生物材料的O2流为外流，可能是复合纳米生物材料利用呼吸作用和抗氧化酶来提高对有毒物质的抵抗作用。+镉和2,4-DCP胁迫下，复合纳米生物材料的实时H或O2流如图3.7所示，。10+−2−1mg/L的2,4-DCP胁迫使复合纳米生物材料H内流由−100±0.6pmolcms增加−2−1到−274±0.7pmolcms（负值表示内流，正值代表外流）。随着0.1mMCd(NO3)2+的加入，H流由内流迅速转变成外流，并随着胁迫时间增加而呈减小趋势，测定−2−1的平均外流为5±4pmolcms。+以上结果表明H流速取决于复合纳米生物材料所处的环境和能量转运这两[90]个因素。2,4-DCP加入媒介后会改变细胞的生物活性或扰乱细胞膜磷脂结构，+++导致细胞质膜的H穿透性增加，所以H流速在2，4-DCP加入时增加。H-ATPase++酶是一种质子泵，存在细胞膜上，H跨膜运动主要由质膜H-ATPase产生的跨膜2++质子电动势决定的。Cd会降低质膜H-ATPase的活性和质子电动势，导致质子[91]2++转运减少，所以复合纳米生物材料在Cd胁迫时H流速减小，最后由内流变+为外流。和Phanerochaetechrysosporium的H流速比较起来，复合纳米生物材料+2+在2,4-DCP的胁迫作用下有更大的的H内流流速，在Cd的胁迫作用下有更小+的H外流流速，可能是由于复合纳米生物材料在有毒物质的作用下细胞膜通透性+增加和质膜H-ATPase活性降低引起的。3.3本章小结2++本章研究了复合纳米生物材料在2,4-DCP或Cd作用下的H、O2流的变化2+情况；复合纳米生物材料在10mg/L2,4-DCP作用下的即时Cd流，0.1mMCd(NO3)2和0.1mMGdCl3作用下的平均镉流以及镉流变化对比，0.1mMCd(NO3)2和0.5mMCd(NO3)2作用下0h,1h,6h时的即时镉流。+研究结果表明，H流速取决于复合纳米生物材料所处的环境和能量转运这两个因素，O2流速由ROS清除者（如CAT）和呼吸作用共同决定的。2,4-DCP增+2+加复合纳米生物材料中白腐真菌的细胞膜的通透性使H流增加，Cd降低质膜++2+H-ATPase活性使进入复合材料的H流减少甚至变成外流；2,4-DCP和Cd作用下都使复合材料中白腐真菌的呼吸作用增强，导致复合材料的O2外流减小。复合2+2+纳米生物材料的Cd流随着Cd浓度的增加而增加，吸附时间越长，镉流逐渐趋于平衡，在加入钙离子通道抑制剂GdCl3后，镉流下降了30%。以上结果说明复2+合纳米生物材料对Cd的吸附随浓度的增加而增加，一定时间后吸附达到平衡，2+钙离子通道对Cd的吸附起非常重要的作用。37n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究第4章复合纳米生物材料的抗氧化酶活性的变化4.1前言水中重金属离子的污染备受关注，生物吸附是一种有效去除水中重金属离子2+2+6+的方法。包埋白腐真菌的复合吸附剂对水中重金属离子，例如Cd、Pb、Cr等有很强的去除效果，重金属离子对复合吸附剂微生物有毒害作用，同时微生物对重金属离子有一定的耐受性，这与复合吸附剂的微生物的抗氧化机制和磷酸氧化机制有关。SOD和CAT是生物体内内源性抗氧化防御系统中的主要酶，它们与自由基之间处于一种动态平衡，当细胞处于应激状态下，体内氧化磷酸化作用增强，从而产生足够的能量维持生命需要，但同时也导致了自由基的产生增多，导致脂质出现氧化损伤。如果测定的SOD和CAT活性升高，说明它们清除氧自由基的能力增强，即减少自由基带来的氧化损伤。NADH氧化酶是细胞中重要的氧代谢酶，它能够清除细胞内氧毒性，帮助细胞抗击外界氧压力，对于维持细胞内氧平衡具有重要作用。ATP用于储存能量，当细胞需要能量时，ATP分解释放能量。当ATP的含量增大时，说明细胞需要的能量增多，此时通过调节呼吸链和氧化磷酸化反应来增加ATP的含量，满足细胞的供能需要。目前有用粉碎-浸提-离心分离-超滤-浓缩-离心喷雾干燥的方法提取植物中SOD，用CO2超临界萃取法提取动物肝脏中CAT，用离心、超声破碎法和渗透压冲击法破碎细胞提取细菌中FMN-NADH氧化还原酶。由于提取SOD、CAT、NADH氧化酶的方法不尽相同，而且提取的方法复杂，要同时提取复合吸附剂的微生物SOD、CAT、NADH氧化酶就有困难。取出包埋白腐真菌的小球，进行液氮研磨得到研磨样品；将研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧化酶的复合物，具有细胞破碎效果好，提取效率高等优势。4.2实验方法和试剂4.2.1实验仪器与试剂实验仪器：（1）离心机；（2）超声波仪；蒸馏水仪；（3）研钵；（4）紫外−可见光分光光度计(UV754N,Shanghai,China)。38n硕士学位论文实验试剂：液氮，磷酸，甲硫氨基酸，硝基四唑氮蓝，EDTA-Na2，核黄素，H2O2，盐酸，氢氧化钠，N,N-二羟乙基甘氨酸，噻唑蓝，吩嗪乙基硫酸盐，乙醇，乙醇脱氢酶。4.2.2复合纳米生物材料的破碎和上清液的提取2+（1）将培养包埋小球的锥形瓶平均分为6组，向每组培养液中分别加入Cd，2+使最终溶液的Cd的浓度分别为0、0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM；然后将培养液进行胁迫培养12h，取出包埋小球过滤分离并用蒸馏水清洗3次，将水分去掉测定湿重，用液氮将其研磨得到研磨样品。（2）将步骤（1）中制备得到的研磨样品加入4℃预冷的浓度为0.2mol/LpH7.8的磷酸缓冲液定容至40mL，转移到离心管中，冰浴下超声处理（超声处理的功率为500w，总时间3min，单次超声持续时间为3s，单次超声间隔时间为9s），然后8000r/min离心15min，取上清液为提取液于4℃保存备用。4.2.3酶活的测定4.2.3.1测定SOD酶活力取10mL提取液于4℃下以8000r/min离心15min，取离心后的上清液作为[92]酶液，将酶液采用硝基四唑氮蓝法测定SOD酶活力。酶促反应体系包括1.5mL的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液；0.3mL的0.013mol/L甲硫氨基酸溶液；0.3mL的75μmol/L硝基四唑氮蓝溶液；0.3mL的10μmol/LEDTA-Na2；0.3mL的2μmol/L核黄素溶液；0.05mL酶液。对照反应体系：不加提取液的反应体系。将上述酶促反应体系装于透光性好的容器中并混合均匀，然后置于4000lx，将上述对照反应体系装于另一容器中混合均匀后置于暗处放置相同时间（20min）。反应结束后以不照光的对照管作为空白，在波长560nm下测定各管吸光度。以抑制硝基四唑氮蓝光化反应为蓝色的甲腙的50%为一个酶活单位计算SOD活性，具体计算公式见4.1。VSOD酶活力=(AckAE)(4.1)Ack5.0WVt其中，Ack表示对照管的吸光度，AE表示样品管的吸光度，V表示样品液总体积（mL），Vt表示测定时样品用量（mL），W表示样品鲜重。4.2.3.2测定CAT酶活力取10mL上清液于4℃下离心15min，离心转速4000r/min，取离心后的上清液作为酶液，将酶液采用紫外吸收法测定CAT酶活力。39n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究酶促反应体系包括1.5mL的0.2mol/LpH7.0的磷酸缓冲液，0.3mL的0.01mol/LH2O2，1.0mL的蒸馏水，0.2mL的酶液。将上述酶促反应体系于240nm下测定吸光度的变化量，以每分钟吸光度减少0.01为一个酶活单位计算CAT酶活性，具体计算公式见4.2。AV2401CAT酶活力=(4.2)1.0VttFw其中，V1表示样品液总体积（mL），Vt表示测定时样品用量（mL），Fw表示样品鲜重,t表示反应时间。4.2.3.3测定NADH酶活力取10mL的上清液加入3mL0.2mol/L的NaOH溶液萃取NADH，50℃水浴10min，然后迅速放入冰中冷却至0℃，接着加入1.5mL浓度为0.2mol/LHCl溶液，于4℃下离心15min，离心转速8000r/min，取离心后的上清液作为酶液，[93]将酶液采用酶循环法测定NADH氧化酶活力，图4.1为酶循环反应机理图。酶促反应体系包括150μL的酶液，0.9mL的纯水，0.6mL的1.0mol/L（pH8.0）Bicinebuffer，0.3mL的乙醇，0.3mL的40mmol/LEDTA，0.3mL的4.2mmol/LMTT，0.6mL的16.6mmol/LPES，150的μL乙醇脱氢酶。将上述酶促反应体系在570nm条件下测定吸光度的变化量，以每分钟吸光度增加0.01为一个酶活单位计算NADH酶活性，具体计算公式见4.3。AV5701NADH氧化酶活力=(4.3)1.0VttFw其中，V1表示样品液总体积（mL），Vt表示测定时样品用量（mL），Fw表示样品鲜重，t表示反应时间。+图4.1NADH和NAD酶循环反应的机理图4.3复合纳米生物材料的酶活结果分析在镉的胁迫作用下一部分细胞会死亡，但也有一部分细胞自身能抵抗镉的毒害作用存活下来。这是因为在镉的胁迫作用下，细胞能产生抗氧化酶来抵抗镉的毒害作用。基于抗氧化酶抵御有毒物质侵害方面的重要作用，本实验研究了复合纳米生物材料中白腐真菌体内抗氧化酶SOD、CAT和NADH氧化酶活性的变化，来揭示这三种对氧化胁迫的响应和它们之间的关系。镉诱导产生的ROS会刺激抗细胞内抗氧化剂的产生（如抗氧化酶类SOD、40n硕士学位论文CAT和NADH氧化酶），以保护细胞组分免受ROS损伤。本实验中，考察了SOD、CAT和NADH氧化酶等复合纳米生物材料中黄胞原毛平革菌体内对抗氧化胁迫发挥重要作用的酶的活性。SOD对镉胁迫的响应随镉浓度如图4.1所示，在一定镉浓度范围内，SOD活性随镉浓度增加而增大；但当镉浓度达到0.7mM时，SOD活性反而降低了，SOD的活性在0.6mM镉浓度条件下达到最大值。低浓度的镉刺激了CAT产生而呈现较高活性，但增加镉浓度，CAT活性降低，NADH氧化酶的变化趋势与CAT的类似，两者都是在0.25mM镉浓度条件下酶活达到最大-1-1值，分别为9.7UgFW和6.5UgFW。1475)NADHoxidase(withTiO2)-1NADHoxidase(withoutTiO)212CAT(withTiO)270CAT(withoutTiO)210SOD(withTiO2))SOD(withoutTiO)-1265860tivity(Ug6c55daseandCATactivities(Ug4SODaoxi502NADH045Control0.10.250.50.60.7Cdconcentration(mM)图4.2复合纳米生物材料（包埋TiO2）和包埋黄孢原毛平革菌（没有包埋TiO2）在不同镉浓度下的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NADH氧化酶）活性变化.复合纳米生物材料中白腐真菌体内SOD、CAT和酶对NADH氧化酶对镉胁迫的响应明显。当镉浓度较低时，上述酶的活性与对照相比表现为增大，这是抗[94]氧化酶类的活性在一定程度上是细胞克服氧化胁迫能力的体现；相反，当增大镉浓度很大时，上述酶的活性受到了抑制。这可能是长时间高浓度镉胁迫造成的复合纳米生物材料中白腐真菌体内氧化损伤程度超过了菌体自身的承受范围，抗[95]氧化酶系无法消除大量产生的ROS，导致菌体活性降低甚至细胞大量死亡。重金属镉是微生物非必需元素，在微生物体内有很强的蓄积性，也是水环境最重要的污染物之一，可以对本实验中复合纳米生物材料中白腐真菌造成直接中毒或潜在的中毒。在自由基产生的酶反应过程中，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH氧化酶)是一种重要的催化酶。在它的催化作用下，尼克酰胺腺嘌呤二41n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究核苷酸氧化酶（NADH氧化酶）可通过将单电子或双电子给予O2的方式产生活[96,97]性氧成分。超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内唯一以直接自由基为底物的酶，-它的主要生理作用就是催化超氧化物阴离子自由基(O．)，发生歧化反应，将其[98,99][100]转变为H2O2和O2，是生物中起保护作用的关键酶。过氧化物酶(CAT)能[101]够催化H2O2分解为H2O和O2。自由基攻击膜上不饱和脂肪酸以后产生丙二醛(MDA)，蛋白质的游离氨基与MDA作用，导致蛋白质分子内和分子间交联，[102]引起细胞损伤。这3种酶以及丙二醛围绕自由基的消除、产生和对机体的损伤这个功能核心，发挥各自特定的作用，彼此之间又密切相关。图4.2中还比较了复合纳米生物材料和包埋黄胞原毛平革菌在不同镉浓度下的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NADH氧化酶）活性变化。复合纳米生物材料的酶活相对于包埋黄胞原毛平革菌的酶活来说都降低了，这可能是因为TiO2对复合纳米生物材料中白腐真菌有毒害作用。TiO2可以引起氧化损伤和核转录因子Nrf2的受阻，Nrf2调节许多抗氧[103]2+化酶和解毒酶的基因编码，所以复合纳米生物材料的酶活变化受到Cd浓度和TiO2两者的影响。4.4本章小结本章研究了复合纳米生物材料在不同镉浓度条件下的抗氧化酶（NADH氧化酶、SOD、CAT）的活性变化。研究结果表明三种酶的活性在一定镉浓度范围内提高，超过这个浓度范围，酶活反而下降。NADH氧化酶和CAT的酶活在0.25mM时达到最大值，SOD的酶活在0.6mM时达到最大值。在镉离子的作用下，为防止活性氧自由基对微生物的危害，NADH氧化酶、SOD、CAT的活性提高，但是浓度太高，酶会失活，细胞趋于死亡。实验还对比了复合纳米生物材料和包埋黄孢原毛平革菌的酶活，结果表明复合纳米生物材料的酶活比包埋黄孢原毛平革菌的酶活低，这是因为纳米TiO2对复合纳米生物材料中白腐真菌有毒害作用，酶的活性受到抑制。42n硕士学位论文结论1研究结论图5.1复合纳米生物材料在有毒物质作用下离子流和抗氧化酶的作用机制图2+本论文以2,4-DCP和Cd对包埋纳米TiO2和黄孢原毛平革菌的复合材料的影2+响为出发点，研究了复合纳米生物材料对2,4-DCP和Cd的去除率及吸附量，2++2+2,4-DCP和Cd作用下复合纳米生物材料的H、O2、Cd流的变化情况，体内抗氧化酶NADH氧化酶、SOD、CAT三者酶的活性。研究结果可以用图5.1大体概+2+括：在有毒物质的作用下，复合纳米生物材料通过调节H、O2、Cd流来抵御有毒物质引起的损害，同时体内NADH氧化酶、SOD、CAT形成闭合循环回路去除氧自由基带来的负面影响，本论文从第二章到第四章详细说明了实验结果得出的结论，如下几条：（1）复合纳米生物材料降解2,4-DCP的最佳浓度为10mg/L，吸附重金属的最佳浓度为0.25mM；复合纳米生物材料对重金属或有机物的吸附量随着2,4-DCP或2+2+Cd的浓度增加而增加，去除率在低浓度2,4-DCP或Cd范围内提高，但浓度继续增加去除率反而下降。+（2）H流速取决于复合纳米生物材料所处的环境和能量转运这两个因素，O2流速由ROS清除者（如CAT）和呼吸作用共同决定的。2,4-DCP增加复合纳米生物+2++材料中白腐真菌的细胞膜的通透性使H流增加，Cd降低质膜H-ATPase活性使+2+进入复合材料的H流减少甚至变成外流；2,4-DCP和Cd作用下都使复合材料中43n废水处理中复合纳米生物材料白腐真菌的生理响应机制研究白腐真菌的呼吸作用增强，导致复合材料的O2外流减小。复合纳米生物材料的2+2+Cd流随着Cd浓度的增加而增加，吸附时间越长，镉流逐渐趋于平衡，在加入钙离子通道抑制剂GdCl3后，镉流下降了30%。以上结果说明复合纳米生物材料2+对Cd的吸附随浓度的增加而增加，一定时间后吸附达到平衡，钙离子通道对2+Cd的吸附起非常重要的作用。（3）NADH氧化酶、SOD、CAT的活性在一定镉浓度范围内提高，超过这个浓度范围，酶活反而下降。NADH氧化酶和CAT的酶活在0.25mM时达到最大值，SOD的酶活在0.6mM时达到最大值。在镉离子的作用下，为防止活性氧自由基对微生物的危害，NADH氧化酶、SOD、CAT的活性提高，但是浓度太高，酶会失活，细胞趋于死亡。实验还对比了复合纳米生物材料和包埋黄孢原毛平革菌的酶活，结果表明复合纳米生物材料的酶活比包埋黄孢原毛平革菌的酶活低，这是因为纳米TiO2对复合纳米生物材料中白腐真菌有毒害作用，酶的活性受到抑制。2研究展望本研究探讨了废水处理中复合纳米生物材料的生理流速和抗氧化酶活性的变化，成功的制备了对重金属和有机物有较高去除率的复合纳米生物材料，运用先进的离子流测量技术——非损伤微测技术测定了复合纳米生物材料在有毒物质作用下的生理流速变化，明确了三种抗氧化酶在去除有毒物质引起的氧自由基中各自起到的作用，为今后研究包埋微生物和纳米材料的复合吸附剂对有毒物质的响应机制提供了重要的参考价值，但是本实验有以下几点需要改进：（1）本实验中使用的是模拟废水，即实验室自己配制的含一定浓度重金属和有机物的溶液，现实生活中的污染废水成分复杂，对复合纳米生物材料的影响因素就多了，因此今后要研究实际污染废水对复合纳米生物材料的影响。（2）复合纳米生物材料制备过程中白腐真菌的培养时间长，将复合纳米生物材料应用到实际中去除重金属和有机物有些难度，需要进一步改进制备方法，使其能在去除现实生活中的重金属和有机物得到广泛应用。（3）本研究仅仅研究了生理流速和抗氧化酶这两个方面，今后还可以从基因层面、生理代谢等方面研究有毒物质对复合纳米生物材料中白腐真菌的影响，使得我们对于复合纳米生物材料对有毒物质的响应有更加全面的了解。44n硕士学位论文参考文献[1]贾广宁.重金属污染的危害与防治.有色矿冶,2004,20(1):39-42[2]王晓燕,尚伟.水体有毒有机污染物的危害及优先控制污染物.首都师范大学学报,2002,23(3):73-78[3]何勇田，熊先哲.复合污染研究进展.环境科学，1994,15(6):79-83[4]FeronV,GrotenJP.Toxicologicalevaluationofchemicalmixtures.Foodandchemicaltoxicology,2002,40:825-839[5]沈国清,陆贻通，周培.土壤环境中重金属和多环芳烃复合污染研究进展.上海交通大学学报,2005,23(1):102-106[6]郑振华,周培疆,吴振斌.复合污染研究的新进展.应用生态学报,2001,12(3):469-473[7]LongY-T.ThedamageofDNAbytoxicchemicalformationofDNAadduct.Advancesinenvironmentalscience,1993,1(4):24-40[8]许嘉琳,杨居荣.陆地生态系统中的重金属.北京:中国环境科学出版社,1996[9]李广云，曹永富，赵书民,等.土壤重金属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