基于白腐真菌的固定化及其在废水处理中的应用 71页

南京理工大学硕士学位论文白腐真菌的固定化及其在废水处理中的应用姓名：谢冬瑾申请学位级别：硕士专业：环境工程指导教师：严莲荷;周申范20080525n硕Ij论文[J腐真菌的I州定化及jE和废水处理中的应用摘要本文主要研究了白腐真菌的固定化及其在废水处理中的应用，首先从培养条件入手得出最适宜白腐真菌生长的条件，在最佳生长条件下投加锰、铜、吐温80的量分别为1．0mmol／L、0．3mmol／L、0．01mmol／L时可以促进白腐真菌生长并缩短其生长周期，减少降解苯酚所需的时间。通过对所选的八种材料作对比试验，确定出吸附法固定化白腐真菌的最佳载体为木屑和丝瓜囊，不同载体体积对COD去除率的影响较苯酚明显；组合固定化最佳条件为：硝酸钙的浓度取2％、小球直径取3mm、交联时间取4h、已吸附真菌载体的投加量取59，所得固定化颗粒最佳的活化pH为5；各种不同形态白腐真菌处理废水时吸附法效果优于包埋法和游离的白腐真菌。吸附固定化白腐真菌处理焦化废水，经过3d，COD和苯酚的去除率分别为88．89％、72．38％。处理苯胺废水，经过4d，COD去除率达84．1％。处理炼油废水，经过12h，苯酚的去除率达到100％；在2．5d时，COD及油的去除率分别达到97．52％和96．86％。处理河水，经过2．5d，COD去除率为85．04％；经过20h，钠、钙、铅的去除率分别为77．8％、72．1％和95．8％，对于铜的去除效果不是很明显。关键字：白腐真菌，微量元素，固定化，废水nAbstractTheimmobilizationofwhiterotfungianditsuseinwastewatertreatmenthasbeenstudiedinthearticle．勋ebestcultureconditionsforthegrowthofwhiterotfungiiscomfirmedbystudyingonitscultureconditions．Underthebestcultureconditions，whiletheamountofcopper、manganeseandTween80are1．0mmol／L、0．3mmol／L、0．01mmol／Lrespectively，itwillnotonlypromotethegrowthofwhiterotfungibutalsoshortenthetimeinthedegradationofphen01．Throughthecomparisonoftheeightkindsofmaterials，Vegetablespongeandsawdustarethebestcarrierscomparedwithothersinimmobilizewhiterotfungibyabsorption；TheeffectofthesizeofthecarrierontheremovalrateofCODisrelativelyobviouscomparedwithphenol；ThebestconditionsofImmobilizationofwhiterotfungibytheCombinationofAbsorption—embeddinghavebeenfound：theconcentrationofCalciumNitriteis2％；diameteris3mm；cross-linkingtimeis4h；theamountofabsorbedwhiterotfungiis59andactivationpHchosen5．Throughtthecomparisonofdifferentshapeofwhiterotfungi，immobilizedwhiterotfungibyabsorptionhashigherefficiencythanembeddingwhiterotfungiorfreecells．Theimmobilizedwhiterotfungusbyabsorptionwaschosentotreatseveralwastewaters．TheremovalrateofCODandphenolsinthecokingwastewaterwere88．89％and72．38％in3days．TheremovalrateofCODintheanilinewastewaterwas84．1％in4days．TheremoralrateofphenolsintheRefineryWastewaterwas100％in12hours．TlleremovalrateofCODandoilintheRefineryWastewaterwere97．52％and96．86％in2．5days．TheremovalrateofCODintheriverwastewaterwas85．04％in2．5daysandtheremovalrateofNa、Ca、Pbare77．8％、72．1％、95．8％respectively．TheremovalrateofCuiSnotobvious．Keyword：whiterotfungi，traceelements，immobilization，wastewatern声明本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明确的说明。研究生签名：州年多月一日学位论文使用授权声明南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。研究生签名：沙c『年‘月7日n硕{：论义白腐真菌的Iilil定化及j￡n：废水处理中的应用1绪论1．1白腐真菌白腐真菌(whiterotfungi)是一类丝状真菌，因腐生在树木或木材上，引起木质白色腐烂而得此名。分类学上，白腐真菌属于真菌门，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲。包括桦多孔菌、漏斗状侧耳、糙皮侧耳、粉状侧抱霉、拟革盖菌等200多个品系。国际上很多研究发现更具有降解能力的是其中一典型种PhanerochaeteChysosporiumburdsall[¨，中文名为白腐真菌，属非褶菌目，伏革科，显革菌属。1．1．1木质素降解酶的来源白腐真菌所产生的参与木质素降解的酶系主要由木质素过氧化物酶(fligninperoxidase，LiP)、锰过氧化物酶(fmanganeseper----oxidase，MnP)和漆酶(1accase)等组成，这些酶类合称为木质素降解酶或木质素酶。1．1．2木素酶系及催化反应机理白腐真菌对污染物的降解过程是以木质素降解酶(简称木素酶或关键酶)及其引发的催化反应为核心，其对木质素和其他物质的降解要依赖于一些酶的分泌，这些酶共同组成了木质素降解酶系统。其主要组分如下【2】：H202产生酶系，主要包括葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶、甲醇氧化酶、VA氧化酶和脂酰辅酶A；木质素氧化酶系，主要有木质素过氧化物酶、Mn过氧化物酶和漆酶；其他酶系还有硝基还原酶、醌还原酶、甲基化酶、蛋白酶、过氧化物岐化酶、解氨酶、葡糖苷酶、脱卤酶和纤维二糖脱氢酶等。目前国内外关注最多的是木质素过氧化物酶、Mn过氧化物酶和漆酶这三种酶，其中又以漆酶为主。但许多研究表明，不同种白腐真菌或同种白腐真菌在不同的条件下其关键酶系的组成也可能不同。木质素过氧化物酶(LIP)最早发现于自腐真菌，他是菌对营养物质消耗做出反应，合成和分泌的一种过氧化物酶。LiP的氧化还原电势很高，是唯一能够直接降解非酚型木质素的白腐真菌关键酶【21。锰过氧化物酶(MnP)是唯一的中间过氧化酶。氨基酸顺序与Lip相同。锰过氧化物酶的活性不仅依赖于H202，还依赖于Mn2+的存在。漆酶(Lac)主要分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类，是一种发现较早的含铜的多酚氧化酶，主要来源于生漆和真菌。漆酶作为一种多酚氧化酶，它可催化氧化酚类或芳胺类等多种底物，同时分子氧被还原为水【31。木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是在既限碳、又限氮条件下产生的严格次级代谢产物，在工业废水中碳、氮源营养物的存在限制了细胞对酶的分泌【4】'由于木质素过氧化nl绪论硕Jj论文物酶和锰过氧化物酶在降解有机污染物时，需要大量的H202作为辅助剂【51，这在现实情况下很难实现，限制了其在实际生产中的应用：漆酶可在碳和／或氮存在条件下由菌体分泌16】，更重要的是漆酶具有780mV氧化还原电位，能把分子氧直接还原为水，在没有H202和其它次级代谢产物存在下，可催化有机污染物的氧化。因此，漆酶在生物技术和环境保护方面有着巨大的应用潜力。1．1．3白腐真菌主要酶系的影响因素pH对LiP、MnP、Lac的催化作用的影响各不相同，比较而言LiP的最佳pH,FN对要低于MnP和Lac[21。白腐真菌降解有机污染物时，其所分泌的漆酶起着很重要的作用。所以白腐真菌分泌漆酶的能力对白腐真菌降解有机污染物的能力有着重要影响。许多有机的、无机的添加剂以及培养条件对白腐真菌分泌漆酶的能力有重要影响。1．1．3．1有机添加剂大多数诱导剂都有毒性，且对细胞生长有抑制作用。漆酶的诱导剂多为结构和木质素有关的低分子芳香化合物或木质素降解的碎片化合物，如香草酸，香豆酸，阿魏酸，单宁酸，焦儿茶酚，芦黎醇，愈创木酚吐温，卞醇等【7矧，这些物质都有一个共同点，即芳核上有一OH或一NH：基团。研究表明2，5一二甲代苯胺作为最有效的诱导剂可明显提高白腐真菌分泌漆酶的能力【9．101。对不同的菌种来说，不同的诱导剂对酶活的影响往往不同，不同的菌有不同的最适宜诱导剂。1．1．3．2无机添加剂微量元素，如Fe，Zn，Mn，Cu等，往往或是酶的活性基的组成成分，或是酶的激活剂，它们对酶的影响不容忽视。不同的菌体受微量元素影响不同。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，铜是它的活性基的组成成分，它对漆酶有活化作用【111，其中CuS04被认为是最好的重金属诱导剂；另；ZI-Mn2+对漆酶也有重要作用，如高浓度的Mn2+可提高砌lebiabrevispora的漆酶酶活，但对Dichomitussqualenss来说，漆酶酶活却不受Mn2+的影响【121。胡道伟f13】等人在最佳碳源氮源和浓度与较好的诱导剂表面活性剂组成的培养基中测定金属离子对产漆酶的影响，结果表明生命金属离子对漆酶的产生有影响，其中Na+并-IAg+的影响不大，Ca“，M矿+，Fe3+，Mn2+，A矿，Cu2+几种离子都有较大影响，而cu2+影响最大，这可能与漆酶的结构有一定关系。Cu2+必须在白腐真菌的指数生长期加入才能最大程度起到促进作用，而在停滞期加入则会抑制漆酶的产生能力。也有研究发现，说明培养基中适量的Cu2+对菌株漆酶的合成及活性是必不可少的。但过多的Cu2+又抑制菌株漆酶的分泌【14】。氮元素的浓度【15肿】和类型也会对微生物分泌木质素溶解酶产生很大影响。1．1．3．3培养条件2n硕J：论文(j腐真菌的filil定化及其柏：废水处理中的心用目前关于真菌漆酶产酶条件研究最多的是液体培养，但也有固体培养的报道。在液体培养研究中，采用振荡培养的方式较多，因为真菌为好氧菌，振荡给氧有利于菌体生长和漆酶的分泌：也有文献报道，静置培养更有利于产酶【1&19】。一般认为，漆酶为次级代谢酶，菌体在碳、氮源耗尽的条件下才大量分泌，因此，限碳、限氮培养尤其是限氮培养更有利于漆酶生产【201。但也有文献报道，富氮培养有利于漆酶生产【211。郭梅【221等人研究证实了白腐菌Trametesversicolor在低碳高氮的条件下有利于漆酶的分泌：在培养基中添加天然盐和麦芽精的培养基被认为是分泌漆酶最好的培养基，甘蔗渣则被认为是最好的漆酶分泌促进剂之一。另外，白腐真菌的生长与分泌漆酶有一定的相关性。一般而言，生长好的白腐真菌分泌漆酶高，生长差的白腐真菌分泌漆酶低，也即只有当生物量达到一定的程度，漆酶才会有比较高的分泌，但是白腐真菌的生长和产漆酶并不同步，没有明显的正相关性。1．1．4白腐真菌的生物降解白腐真菌木质素中所有的主要聚合物包括纤维素、半纤维素、木质素都能有效降解并引起白色腐烂。1．1．4．1白腐真菌生物降解的特点白腐真菌的生物降解的特点可以概括为：非专一性、非水解性和细胞外性。从理论上讲，是木质素的结构特征决定了白腐真菌生物降解的特点。1．1．4．2白腐真菌降解机理白腐真菌中的代表种黄胞原毛平革菌，其生物降解活动之发生在次生代谢阶段，其有降解功能的各种酶及相关组分在一定的营养限制下发生以自由基为基础的链式反应降解过程。在这个降解过程中，过氧化酶是反应的启动者，在它们的作用下，先形成高度活性的自由基中间物，继而以链式反应方式产生许多不同的自由基，促使降解底物的氧化。1．1．4．3白腐真菌木素降解特点与优势与其它微生物种类相比，白腐菌能更快、更彻底地降解木素，在降解难降解的污染物上有以下优势：(1)不需经过特定污染物的预条件化，便可非常有效地降解环境中的低浓度污染物。(2)具动力学优势，催化启动初始氧化反应的酶对底物无真正意义上的Km值，从而有利于氧化产物的形成，并能将污染物降至于零的水平。(3)产生氧化能力极强的·OH，抑制其他微生物生长，具竞争优势。(4)降解对象——有毒污染物不必进入细胞内代谢而在其细胞外即可得到有效降解，白腐菌从而显现出旺盛的生命力。3n1绪论硕l：论文(5)非专一性降解的特性使之能降解大量结构不同的化学物质，这便使白腐菌有更广的适用性。(6)适应于固、液两种体系，优于其它只能用于水溶液中可溶性底物的处理的其它微生物系统。(7)可利用废弃物中的木质纤维等廉价营养源，从而对营养物的要求低，所需投入成本低。由此可见，白腐菌作为高效、低耗、广谱、适用性强的微生物，在环境治理及工业生产方面都有广泛的研究、研究价值。1．2白腐真菌在水处理中的应用自1985年Bumpus等在Science&报道白腐菌对持久性环境污染物的降解，白腐菌就受到微生物学家和环境毒理学家的关注。据报道【2孓241，白腐菌是降解芳香化合物能力最强的微生物，国内外大量的研究工作针对芳香化合物进行，如：氯代芳香化合物、氯代苯胺化合物、硝基苯、氯代酚、多氯联苯、多坏芳香化合物和二嗯英等。到目前为止，白腐菌的应用研究总的来说体现在以下两大方面：一是利用其或者其所产的过氧化物酶系应用于工业上预处理某些原料以降低工业能耗，且实现清洁生产：二是利用其对底物的非专一性降解污染物而应用于环境污染治理。白腐真菌处理染料废水技术是近几年来新兴的有效处理方法。白腐真菌降解染料的能力非常耐25之71，尤其是砌anerochaetechrysosporium。白腐菌能够通过所分泌的特殊的降解酶系及其他机制将各种人工合成的染料彻底降解为C02和H20，具有良好的脱色效果。根据Kiml28】等人的研究，每种染料的结构及其复杂性直接决定着用白腐菌将其脱色的效率，不同染料之间的一点细微结构上的差异会对脱色效率带来很大影响。白腐菌直接处理漂白废水，将漂白废水中的有机氯化物转变成为无机氯和C02，H20和菌体本身，从而破坏和消除发色基团组织和结构，达到去除有机氯化物、COD、BOD和色度的目的。吴娟【29】等利用几种白腐菌处理蒸煮黑液。高航【30】等人以煤渣为填料，在自制反应器内利用白腐菌生物膜对垃圾渗沥液生化出水进行深度处理。与活性污泥法相比，白腐菌连续处理垃圾渗沥液生化出水的效果明显较好。夏邦权131】等利用白腐真菌作为微生物絮凝剂处理煤泥废水，絮凝效果达94％。何德文【32J等人概述了白腐真菌的特性和降解机理，同时利用白腐真菌生化降解两种生物难降解的有机废水。实验结果表明，白腐真菌对生物难降解的n汀炸药废水和分散染料废水有着良好的降解性能。王德刮33】采用白腐真菌和活性污泥混合处理焦化废水，研究发现加入白腐真菌有利于提高处理效率。任大军【矧等利用白腐真菌降解吲哚，不同的共代谢基质体系下白腐真菌都可以去除99％以上的吲哚。钟伟【35J等人利用白腐真菌降解原油亦取得良好效果。除此之外白腐真4n硕l二论文[J腐真菌的同定化及其拍：废水处理中的应用菌已在其他领域也取得一些进展06-3踟。1．3微生物固定化技术微生物固定化技术是利用物理或化学手段将游离的微生物，定位于限定的空间区域内，在保持微生物活性基本不变的情况下，且能反复使用的基本技术。在传统的废水生物处理工艺中，微生物通常是在水中以悬浮态生长的，因而易于从反应器中流失。另外，微生物菌体与水的密度差小，将微生物从反应器中流出的水中回收进行重复利用较为困难。改善的办法是采用固定化技术，将微生物通过一定的技术手段(如利用载体材料、包埋物质或合理控制水力条件等)使微生物保持在反应器内，以利于提高生物反应器内微生物的数量，利于反应后的固液分离，利于去除氨氮、去除高浓度有机物或难以生物降解物质，提高系统的处理能力和适应性。因此，微生物固定化技术因能使生物处理工艺实现高效低耗，运行管理简化的有效措施，有着很好的应用前景。1．3．1生物固定化方法按照固定化载体和作用原理的不同，微生物的固定化方法主要有表面吸附(结合)固定化、(多聚体)包埋固定化、交联(键联)固定化、和自身固定化(微生物细胞间自交联固定化)等几种方法。细胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、交联法、膜截流固定化技术和联合固定化技术，其中吸附法和包埋法最为常用。1．3．1．1表面吸附(结合)固定化表面吸附(结合)固定化系指微生物吸附在载体表面而固定的方法，该方法操作简单，微生物固定过程对细胞活性的影响小，但所固定的微生物数量受所用载体的种类及其表面积的限制。同时，微生物与载体间的吸附强度也不够牢固，故载体的选择十分关键【39】。1．3．1．2包埋固定化包埋固定化是使微生物细胞包埋在半透明的聚合物或膜内，或使微生物细胞扩散进入多孔性载体内或包埋在凝胶或微胶囊内，小分子底物及反应代谢物可自由出入这些载体的孔道或凝胶膜，而微生物细胞却不能移动。常用的有凝胶包埋法、纤维包埋法和微胶囊法。但是由于高浓度的溶液在与细胞混合时，会使细胞受到很高的剪切力作用，而细胞膜对剪切力非常敏感，在混合过程中，会导致细胞的大量死亡【40】。1．3．1．3交联固定化交联固定化是利用两个或两个以上的功能基团，使微生物菌体相连接成网状结构，即使功能基团直接于微生物细胞表面的反应基团如氨基、烃基等进行交联，形成共价键而达到固定化的目的。该方法又分为戊二醛交联法、鳌合法和物理交联法等。1．3．1．4膜截流固定化技术Snl绪论顾I：论文酶和细胞都不能通过半透膜、中空纤维膜和超滤膜等，可以被截留，而产物和底物都能透过，因此膜截流也是固定化的一种方式。这种方法可以使基质与微生物细胞充分接触，而且方法简单，通过膜的孔径选择可以选择性的控制底物和产物的扩散。但是该方法容易造成膜堵塞从而降低反应效率。1．3．1．5自身固定化除上述几种微生物固定化方法外，还有一种利用处理装置结构的合理设计、运行二次的良好控制及微生物自身作用进行微生物固定化的方法，即所谓的自身固定化(或称细胞间自交联固定)。这种固定化过程是通过严格控制生物处理反应器的运转负荷、处理过程中的影响因素，在一定的水流条件下，依靠微生物自身的絮凝作用而形成的固定化微生物(常之为颗粒污泥)。这种固定化技术在高浓度有机废水的处理方面正在发挥越来越大的作用。1．3．1．6联合固定化技术联合固定化最初是指把外来酶结合于固定化完整细胞上，后来又发展为将两种酶、两种微生物或生物催化剂与底物或其他物质结合在一起的固定化方法。联合固定化生物催化剂可以充分利用酶和细胞的特点，把不同来源的酶和细胞的性质结合起来达到更好效果。联合固定化好氧与厌氧微生物体系可以有效解决混合培养技术中供氧难的问题，还可实现在同一反应器中同时进行两步反应。1．3．1．7组合固定化技术组合固定化技术应用具有十分广泛的含义，其本身的目的是为了克服单一固定化技术本身所固有的缺点，如采用吸附一交联固定化方法，既提高了固定化酶中酶活保留率，又增加了固定化酶的稳定性。1．3．2生物固定化载体材料固定化微生物细胞载体主要可分为四大类：无机载体、多糖与蛋白质类、天然高分子凝胶载体和有机合成高分子凝胶载体。1．3．2．1无机类载体无机载体类有微孔玻璃、碎石、卵石、煤渣、焦碳、石英砂、硅胶、沸石、氧化铝、水合氧化钛、多孔陶瓷、活性炭、砖粒、高岭土、硅藻土等。1．3．2．2多糖与蛋白质类载体多糖与蛋白质类载体有纤维素、交联葡萄糖、琼脂、胶原、纤维蛋白、明胶、淀粉、黄原胶、几丁质、壳聚糖、虾青素、琼脂糖、戊二醛、血纤维原等。此类载体材料具有固定化成型方便，对微生物毒性小，传质性能好，固定化密度高等优点。多糖能够被生物体中的酶降解成易被活体吸收、无毒副作用的小分子物质，不会残留在活体内，是良好的生物固定化载体材料。但此类载体材料强度较低，容易生物降解，稳定性差。6n硕：}：论文白腐真菌的liIiI定化及其红废水处理中的心用1．3．2．3天然有机类载体天然有机类载体有琼脂、卡拉胶、角叉菜胶、海藻酸盐、明胶、骨胶原、植物秸秆等。这类载体对微生物无毒害作用、传质性好、操作简单、价格便宜，但这种载体在处理废水过程中，受到各种离子的侵蚀，会逐渐溶解，也会被生物降解缩短寿命。这类载体在自然界中大量存在，可以为微生物提供一定的营养，有广阔的应用前景。1．3．2．4人工合成有机类载体人工合成有机类载体有聚丙烯酰胺(ACAM)凝胶、聚乙烯醇(PVA)凝胶、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶、磁性高分子聚合物、离子交换树脂等。生物固定化技术以其独特的优点引起了人们的普遍关注，国内外学者也作了大量的研究。理想的固定化微生物细胞载体应该具有以下特征：固定化过程简单，能在常温常压下固定化，易于制成各种形状：成本低：固定化过程中及固定化后对微生物无毒或毒性小；传质性能好，透气性和透光性良好；固定化密度大；载体内细胞漏出少，外面的细胞难以进入；机械强度高，物理强度及化学稳定性好；抗微生物分解性能好；沉降分离性好；使用寿命长。1．3．3固定化微生物技术的主要特征固定微生物技术在近几年来发展迅速，在废水生物处理中的应用研究也与同俱增，并得到越来越普遍的关注，目前已进入开发使用阶段．该技术在废水处理中的应用具有以下特征：1．3．3．1密集微生物维持反应器中生物量的浓度根据废水生物处理的基本原理，微生物浓度越高，则所需的反应时间越短，所需的反应器容积越小，从而有利于降低处理设施的工程投资和工程造价。1．3．3．2易于实现固液分离固定化微生物由于其生长在不溶性载体的表面，其密度远较水大，且微生物处于高度密集状态，因而易于与水分离，利于微生物的截流及重复利用，实现了水力停留时间与固体停留时间的分离，为提高处理工艺的研究、开发和设计应用创造了十分有利的条件。此外，良好的固液分离，还大大简化了传统工艺中所需的污泥回流和沉淀分离设备，并大大减少处理出水中悬浮物的浓度，利于提高出水水质。固定化微生物良好的固液分离性能在废水处理中应用还使得反应器保持高浓度低生长速率的微生物为可能。1．3．3．3使用于含有有毒有害物的处理通过不同方法固定化的微生物，由于其高度密集或被作为载体和包埋材料的高分子物质所覆盖，因而当含有有毒有害物的废水与之接触时，由于高密集的强抵抗能力或覆盖物的阻隔作用，削弱了有毒有害物对微生物的冲击作用，使反应器工艺运行的安全性7nl绪论硕．1：论文能得到大大提高。尤其当利用经驯化后的固定化技术处理此类废水时，则比传统工艺具有更大优势。1．3．4影响微生物固定化的重要因素影响微生物固定化的因烈4l】主要有以下三个方面：微生物的本身性质(如浓度、活性等)，所使用载体的性质(如种类、表面特性、化学性质等)以及环境特征。1．3．4．1微生物的性质在微生物固定化过程中，高的悬浮态微生物浓度，将加速微生物向载体表面的传递，增加其与载体的接触机会，有利于微生物在载体上固定化；同时高的微生物活性，也有利于其代谢作用分泌更多的多聚糖类物质，多聚糖所具有的粘性作用可促进微生物与载体的粘附，缩短可逆附着的时间，从而加快固定化进程，较高的微生物活性可使其具有较高的能量水平，而能量水平的提高也有利于其在向载体表面的主动或被动输送和附着过程中，克服或削弱各种作用力的不利影响，提高其初始积累速率。1．3．4．3载体的性质载体的表面粗糙度及其电荷是影响固定化速率的重要因素，载体材料的表面越粗糙，越有利于微生物在其表面附着固定，同时粗糙表面上空洞、缝隙等的存在，对已吸附的微生物具有保护伞的作用，使它们免受水力扰动、剪切和冲刷的影响；在一般环境条件下，微生物表面通常带负电荷，根据异性相吸原则，使用表面带有正电荷的材料作为载体将有利于加速固定进程，使微生物在液相中向载体表面的输送变得更为容易。1．3．4．3环境特征主要有废水的pH值和水力流念两个方面。废水液J(H的pH值对微生物在载体表面的固定化速率的影响主要表现影响微生物的表面带电特性；水力流态的控制是从以下两方面考虑：一方面为实现良好的处理效果，需增加微生物与废水接触的机会，因而需要一定紊动程度，另一方面载体表面不同的水流速度将产生不同的水力剪切作用，为有利于微生物在载体表面的附着生长，要求将水流紊动程度控制在微生物与载体的结合体所能承受的范围内。1．4生物固定化技术在水处理中的应用固定化微生物技术在废水处理中应用较广，被处理废水的种类主要有：造纸废水、印染废水、含氮废水、含难降解污染物的有机废水、重会属废水、其他废水。将白腐菌固定在旋转盘(RBC)上处理漂白废水，利用白腐菌Trichocherma．印固定在RCB上处理木浆CEH漂白废水，处理3天，脱色率达85％t421。Messnert43J等人丌发的MYCOPOR工艺，将白腐菌PChrysosporiumBKMIF．1767固定在滴滤器的多孑L泡沫载体上，停留时问6．12h其脱色率、AOX去除率和COD去除率分别可达87％，80％和40％。Eaton，8n硕{?论文白腐真菌的同定化及j￡4i废水处理中的J娅用Chang和Kirkt“郴】采用PChrysosporium4天对E1段废水脱色采用薄膜反应器可脱色80％。Gordon等人【46J用海藻酸钠包舭Chrysosporium连续处理二氯酚，降解率可高达96％。D．Livemoche等人【471研究发现，用海藻酸钠包埋Coriolusversicolor3天处理碱抽提段废水时其脱色率高达80％，而不用包埋处理，其脱色率只有60％，并且表明在空气条件下比厌氧条件下重复利用的菌株能重复和有效的脱色，pH5．0LI',pH7．0脱色快。林鹿等人【4＆49】发现白腐菌可有效消除废水毒性，处理效果与处理方法有关，且吸附固定化白腐菌连续处理>PVA固定化白腐菌间歇处理>PVA固定化白腐菌静置培养>游离白腐菌静置培养。范伟平【50】用稻草木固白腐菌用于染料废水处理，认为稻草术载体加入有利于提高白腐菌稳定性。林鹿、王双飞等【5l】利用PVA小球和土业煤渣吸附一固定白腐菌处理CEH漂白废水，最大脱色率达到91．2％，COD去除率为88．7％。Marwaha【52J等人分别采用黄麻绳、棉花、小麦等作为Pchrysosporium的载体，在厌氧条件下消化黑液。Woodardl531等人利用锯末作为载体，处理木质素含量在1000m∥L的造纸废水。SammaiahPallerlat54】等研究了分别用未固定的和经聚氨基甲酸乙酯固定的Trametesversicolor降解五氯酚(PCP)，固定化后的处理效率远远高于自由白腐真菌其处理效率。安东等【55】采用间歇式物理循环吸附法对活性炭柱进行工程菌的固定，经反冲洗后投入正常运行，固定化生物炭工艺对TOC的去除率稳定在40％．50％，可以提高氨氮去除率30％；对三卤甲烷生成势(THMFP)的去除率比普通活性炭工艺提高了11％．39％；对臭氧氧化副产物(甲醛)具有长期的去除效果。刘幽燕等【56】以沸石为载体用吸附生长法固定化产碱杆菌DN25，将固定化细胞用于含氰液的降解；郎兴华【57】等用固定化细菌吸附铅和镉。除此之外固定化微生物被用来处理微污染等其余污染物【58枷】。刘长风【61】等采用天然高分子包埋材料(如海藻酸钠)和合成高分子(如聚乙烯醇和聚丙烯酰胺)材料处理含酚废水，得出用天然高分子改性合成高分子为包埋材料时效果最好。Pail621等进行了固定化微生物填充床反应器在高负荷运行下降解苯酚的实验研究。他们采用颗粒活性炭吸附和海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化微生物。结果表明，与颗粒活性炭相比，海藻酸钙颗粒具有更高的苯酚去除速率。Amselmof叫等研究了用琼脂、海藻酸钙、卡拉胶和聚丙烯酰胺等载体包埋固定化微生物降解苯酚。随后他们又以聚氨酯泡沫为载体固定镰刀菌(frusarium够)菌丝体，在完全混合反应器中降解苯酚。AmandaI“1等以PVA-H3803包埋法固定化假单胞菌(pseudomonas)在流化床反应器中连续降解苯酚。固定化细胞在三相流化床中连续运行2周，进水酚质量浓度从250mg／L逐渐提高至lJl300mg／L，出水酚浓度均为0，且固定化细胞具有良好的机械强度。齐素芳【65】等用壳聚糖和海藻酸钠作为载体，包埋固定化硝化细菌处理养殖水体中的9nl绪论顾l：论文氨氮，在一定条件下氨氮去除率达至U94％以上。曹德菊i66]等采用明胶、琼脂、海藻酸钠作为载体对枯草杆菌进行固定化，固定化微生物对镉存在生物吸附作用。徐雪芹【67】等利用丝瓜瓤固定简青霉，研究了其吸附废水中Pb2+和Cu2+的机理，确定最佳实验条件。郭平【68】等用固定化细胞壁多糖吸附铜、锌和镍，得出最佳吸附量。吕荣湖【69】等用聚乙烯醇一海藻酸钠复配作为包埋固定化载体材料，制备成固定化微生物小球，在初始油含量低于50mg／L时，除油率保持在87％以上，出水油含量一般可保持在5mg／L以下；Berrio，J【70】等利用固定化白腐真菌在除油及酚类化合物降解上取得很好的效果；郭静仪f711等利用木屑作为载体的固定化微生物对含油废水进行处理，原油浓度为10．0．30．og／L时去除率为75．5—94．3％。1．5选题的科学意义及研究的主要内容选题的科学意义：微生物固定化是自然界中的一种普遍现象，是生物细胞适应环境的一种反应。微生物固定化技术是指通过化学或物理的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，使之保持生物活性并能反复利用的方法。固定化细胞具有细胞密度大，反应速度快，微生物流失少，产物容易分离，反应过程控制较容易等优点，与游离细胞相比，明显地显示出优越性，固定化技术是作为一门新的技术已应用于工业水处理行业。近年来，微生物固定化技术成为各国学者研究的热点。基于白腐真菌的特性和生物固定化技术的发展，本课题的研究也将会具有重要的实际价值。白腐真菌是一类能够有效的降解许多难降解有机污染物的真菌，通过分泌木质素过氧化酶、锰过氧化酶、漆酶等胞外酶能有效的提高了它对污染物毒性的适应能力，快速降解有机污染物。到目前为止白腐真菌是被认为是降解芳香化合物能力最强的真菌微生物。近年来，白腐真菌被广泛应用于造纸废水、染料废水、炸药废水等高浓度有机废水的研究和应用上，而将其应用于焦化废水的研究在国内还很少见，因此，研究白腐真菌处理焦化废水的各种影响因素和确定最佳处理条件，具有重要的理论意义。在充分了解了焦化废水中主要污染物成分和白腐真菌及微生物固定化技术的各种特点后，本课题尝试利用以固定化的白腐真菌为主体，辅以其他处理手段来处理焦化废水、苯胺废水等实际废水。研究内容要解决的问题：。(1)白腐真菌的培养与生长条件的测定。主要研究白腐真菌的最佳生长条件，确定微量元素对它影响的投加量，从而可以有效地在后续的废水处理中提高降解的效率，缩短降解时间。10n硕士论文白腐真菌的同定化及其nj废水处理中的心用(2)白腐真菌的固定化。主要研究白腐真菌最佳的固定化材料和条件，并与未固定化的白腐真菌的进行对比；研究不同固定化方法和不同载体对白腐真菌活性的的影响及其处理模拟废水效果；研究不同形态的白腐真菌处理废水的效果。(3)白腐真菌的驯化。主要研究经固定化后的白腐真菌经驯化后的处理效果及其处理废水时的优势，与不经驯化的白腐真菌作对比，用于后续实验中。(4)固定化的白腐真菌处理几种实际废水的试验。主要研究进水污染物浓度、pH值、温度、时间和固定化白腐真菌的量对其处理效果的影响。预期解决的主要问题：问题一：白腐真菌的培养问题。国内外学者对白腐真菌的生长条件进行了大量研究并取得了很大成就，但是对于白腐真菌培养中出现的污染现象的控制和如何扩大培养还没有很好的解决办法。另外本课题研究的某钢铁公司焦化厂所产生的焦化废水中不仅含有难降解有机污染物，可生化性差，而且含有氰化物等对生物有剧毒的化合物，这对白腐真菌的活性会造成很大影响，因此白腐真菌的驯化也将是一大难题。本课题拟利用白腐真菌适宜低pH值和对底物要求低的特点来控制白腐真菌培养中出现的污染现象，采取模拟废水对白腐真菌进行驯化，并在驯化的同时投加一定的营养物。最终较好的解决培养与驯化问题。问题二：固定化方法与载体的选择问题。生物固定化技术近年来一直是水处理研究中的热点，国内外学者对多种固定化方法和各种载体进行了深入的研究。但是对于白腐真菌的固定化来说如何选择适宜的载体和固定方式来保持其活性、提高处理效率还是个问题。本课题将根据白腐真菌的特点选择常用的且具有代表性的包埋法、载体吸附法等方法固定，按照对生物毒性小、机械强度高、能反复再生利用、以废治废等原则通过具体效果比较来选择合理的载体。问题三：焦化废水中酚类等难降解有机污染物的降解问题。焦化废水处理的难点在于难降解有机污染物的处理，虽然白腐真菌可以降解这一类有机物，但是高浓度的有毒物质会抑制白腐真菌的生长和漆酶的分泌。另外由于焦化废水可生化性差，白腐真菌降解需要较长时间。据此，本课题将采用微电解法预处理以降低焦化废水的毒性，并尝试投加葡萄糖等为白腐真菌降解提供有利条件，最终使酚类的去除率达90％左右。再通过深度处理使其达标。n2[J腐真菌的培养及微量／C素的影响顾卜论文2白腐真菌的培养及微量元素的影响2．1菌种试验菌种为南京理工大学水处理研究所提供的白腐真菌(Phanerochaete2．2仪器设备与药品2．2．1试验设备与仪器试验用主要设备与仪器如表2．1所示：表2．1实验仪器及设备Table2．1Instrumentsandequipmentsofexperiment2．2．2主要实验药品磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、硫酸(p=1．84g／mL)、氢氧化钠、氯化钙、氯化铵、硝酸铵、酒石酸铵、硫酸亚铁、五水合硫酸铜、硫酸锰、吐温80、苯酚、4一氨基安替比林为分析纯；琼脂粉、葡萄糖为生化试剂；蒸馏水等由实验室提供。12n硕．I：论文臼腐真菌的同定化及】e存废水处理中的应用2．3实验方法2．3．1分析方法目测观察：主要观察白腐真菌在平皿内的分布情况、生长活力、颜色等。用于表征白腐真菌在平皿培养过程中的生长情况。比浊法：比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定菌体的数量。菌体悬浮液的浓度在一定范围内与吸光度成正比，所以可用分光光度计测定菌液浊度，用浊度表示样品菌液的浓度。此法用于表征白腐真菌在液体培养与驯化过程中的生长情况。苯酚测定：4一氨基安替比林分光光度法(GB7490-矗7)。2．3．2平皿培养2．3．2．1培养基磷酸二氢钾0．4g、磷酸氢二钾1．6g、七水合硫酸镁0．2g、硝酸铵0．5g、六水合氯化高铁50mg、氯化钙25mg、琼脂粉8g力H／N．1000m晓瓶中，加蒸馏水至标线，调节pH为6左右，在高温高压(121Mpa)下灭菌15—20min。再加入经紫外光灭菌的葡萄糖20g。2．3．2．2接种方法将培养基冷却至45℃"-'50℃，然后注入灭过菌的培养皿中，待培养基凝固后，用接种环挑取白腐真菌以划线方式接种到固体培养基上，在30℃下恒温培养，同时在培养箱中放入几烧杯蒸馏水，以保持湿度。2．3．3培养条件对白腐真菌的影响2．3．3．1培养基磷酸二氢钾0．4g／L、磷酸氢二钾1．6g／L、七水合硫酸镁0．2g／L、一定量的氮源、苯酚lmg／L，加蒸馏水溶解后调节pH，分别装入250ml锥形瓶中，在高温高压(121Mpa)下灭菌15—20min，最后加入经紫外光灭菌的葡萄糖4∥L。2．3．3．2接种方法将培养基冷却然后分装到经高温灭菌的250mL锥形瓶中，用微量移液管移取液体培养的白腐真菌菌液到装有蒸馏水的试管(经高温高压(121Mpa)灭菌15min)中，摇匀，稀释到适宜浓度后静置5min。用微量移液管移取1mL上清液至装有培养基的锥形瓶中，用4层纱布和一层牛皮纸封口，放在水浴摇床上恒温培养。2．3．3．3培养基的选择与生长曲线的测定分别制取上述液体培养基，接种等量的白腐真菌，置于水浴摇床上在一定温度及转速下恒温培养。定时取样，用比浊法测定菌液中白腐真菌的相对浓度，确定生长曲线，测定浊度时应充分震荡使菌丝均匀，以避免测定时指针晃动所引起的误差。13n2[J腐真菌的培养及微量／己素的影响硕I：论文2．3．3．4苯酚浓度的测定培养过程中定时取样，按照3．2．1中苯酚的测定方法测定溶液中苯酚的浓度。2．3．4微量元素对白腐真菌的影响2．3．4．1培养基磷酸二氢钾0．4∥L、磷酸氢二钾1．6叽、七水合硫酸镁0．2g／L、酒石酸铵0．1e,／L、苯酚1mg／L及一定量的微量元素，加蒸馏水溶解后调节pH为5，分别装入250ml锥形瓶中，在高温高压(121Mpa)下灭菌15。20min，最后加入经紫外光灭菌的葡萄糖4∥L。2．3．4．2接种方法将培养基冷却然后分装到经高温灭菌的250mL锥形瓶中，用微量移液管移取液体培养的白腐真菌菌液到装有蒸馏水的试管(经高温高压(121Mpa)灭菌15min)中，摇匀，稀释到适宜浓度后静置5min。用微量移液管移取1mL上清液至装有培养基的锥形瓶中，用4层纱布和一层牛皮纸封口，放在水浴摇床上恒温培养。2．3．4．3培养基的选择与生长曲线的测定分别制取上述液体培养基，接种等量的白腐真菌，置于水浴恒温30。C摇床上培养，转速为180r／min。定时取样，用比浊法测定菌液中白腐真菌的相对浓度，确定生长曲线，测定浊度时应充分震荡使菌丝均匀，以避免测定时指针晃动所引起的误差。2．3．4．4苯酚浓度的测定培养过程中定时取样，按照3．2．1中苯酚的测定方法测定溶液中苯酚的浓度。2．4结果与讨论2．4．1平皿培养按照2．3．2．1的方法用基础培养基进行培养，接种后第1天，没有明显现象；接种后第2天，有少量菌丝出现；接种后第3天，菌丝开始增多，划线部分菌丝长成菌落；接种后第4天，菌落面积增大已基本布满整个培养皿；接种后第5天，白腐真菌已经布满整个培养皿，菌丝充满整个培养皿，且菌丝呈绒毛状，生长旺盛。实验结果表明，白腐真菌在基础培养基上只要3—4天即可达到对数增长期。在基础培养基上的白腐真菌菌丝较长，呈绒毛状，生长十分旺盛。可选择基础培养基用于菌种的扩大培养。2．4．2培养条件对白腐真菌生长的影响碳元素作为白腐真菌必不可缺的元素已有很多学者作了研究，其中木质素分解最好的碳源是葡萄糖且被广泛使用，近年周晓燕【72】等人在葡萄糖补料对白腐真菌产酶的影响方面作了研究，指出葡萄糖补料可以有效的刺激白腐真菌产酶，且连续低浓度的葡萄14n硕士论文白腐真菌的同定化及其住废水处理中的应用糖补料可以获得较优的产酶效果。本实验主要从培养基pH、培养基氮元素种类、培养温度及培养时摇床转速四个方面考虑其对白腐真菌的影响：2．4．2．1pH的影响按2．3．3中的实验方法进行试验，调节培养基pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10，试验结果如图2．1所示：从图中可明显看出，pH为4和5最适宜白腐真菌生长，pH为6时白腐真菌也会达到一定的浊度，但是相比较而言生长周期要LLpH为4和5的长，pH为4和5的菌液浓度在3．5天时已经到达最大而pH为6的则要在4．5天时才可以完成。pH为7、8时白腐真菌虽有生长，但是浓度较小，说明偏碱性溶液会抑制白腐真菌生长。pH为2、3、9、10贝J]不宣白腐真菌生长，溶液基本无变化。试验初期各个酸度下白腐真菌生长均无明显变化，锥形瓶中溶液基本澄清，第2天时pH为4、5的瓶中出现白色菌丝，白腐真菌己开始有一定程度生长，其他瓶中仍无明显变化，第3．5天pH为4、5的瓶中溶液出现许多规则接近球形的白色菌球，溶液浓度大，白腐真菌生长达最高点，进入稳定期。pH为6、7的瓶中开始有白色菌球出现，第4．5天pH为6、7的瓶中溶液菌球变大，但浓度没有pH为4、5的瓶中的浓度大。之后白腐菌丌始出现老化、死亡，进入衰减期溶液颜色变暗。随着pH的不同，白腐真菌所形成形态也不尽相同，有球状、絮状及细小菌丝构成的浊液，一般pH较小则会形成较规则球体【7引。图2．1不同pH时的生长曲线Fig．2．1ThegrowthcurveunderdifferentpH2．4．2．2氮元素的影响(1)无机氮的影响：15n2[J腐真菌的培养及微量，e素的影响硕I：论文按2．3．3中的实验方法进行试验，为了确定有机氮的最佳投加量，选择氯化铵作为培养基中的氮源，取氮元素浓度分别为0g／L、0．01g／L、0．03g／L、0．05g／L、0．1g／L、0．2g／L、0．4g／L、0．6g／L、0．8g／L，实验结果如图2．2所示：在接种后前两天，各个浓度下白腐真菌均无明显变化，第1．5天时除没有加入氮元素的浓度无明显变化之外，其余各个瓶中白腐真菌均有生长，第4天时基本都达到最大值，其中以氮元素浓度为0．8∥L、0．1g／L、0．2g／L的生长情况最好溶液呈白色絮状且浓度高。说明氮元素是白腐真菌生长必须的营养元素，且高氮条件更适宜白腐真菌生长。也有文献【2】说限氮有利于白腐真菌生长。T／d图2．2氯化铵为氮源时生长曲线Fig．2．2Thegrowthcurveunderdifferentammonium(2)有机氮的影响按2．3．3中的实验方法进行试验，为了确定有机氮的最佳投加量，将选择酒石酸铵作为培养基中的氮源，取氮元素浓度分别为0g／L、o．01g／L、O．03g／L、0．05g／L、0．1g／L、0．2∥L、O．4g／L、0．6g／L、0．8g／L，结果如图2．3所示：第1．5天时除没有加入氮元素的浓度无明显变化之外，其余各个瓶中自腐真菌均有生长，且呈直径很小的白色团状。之后，各个溶液中菌团开始增多，菌团直径也逐渐变大，溶液浓度增大，且团状白腐真菌易沉降于瓶底。在第5天左右各个瓶中自腐真菌生长达最大值。其中以氮元素浓度为0．03g／L、0．1g／L的效果最佳。由图2．2和图2．3也可明显看出同样量的氮元素，有机氮效果比无机氮好，有机氮生长对数期也要长一点，所形成大的菌团更易于分离，且达到最大浊度时所需有机氮源要小于无机氮。2．4．2-3水浴温度的影响16n硕J：论文白腐真菌的同定化及Je袖：废水处理中的J妪用按2．3．4中的实验方法进行试验，调节摇床水浴温度分别为10℃、20℃、30℃、34。C、39℃、44℃。结果如图2．4所示：由曲线可知高温有益于白腐真菌的生长，在10℃时，白腐真菌生长缓慢，一周之内基本没有变化。白腐真菌是喜热温度的，最佳生长温度为39℃，考虑其它因素综合选择与室温接近的30℃为实验最佳温度。2．4．2．4摇床转速的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，调节摇床转速分别为0r／min、60r／min、120r／min、180r／min、250r／min，结果如图2．5所示：由图中明显看出转速为120r／min时白腐真菌生长最佳。转速的不同决定了氧的传递或扩散，实验过程中发现，不同转速时白腐真菌的所形成不同形状，静置时，瓶中溶液形成白色絮状且液面覆盖了白色的一层菌体，溶液有分层感，上层溶液中菌体浓度高；随着转速增加，白腐真菌形成菌球，且由于转速增加时剪切力加大使得菌球的直径逐渐变小。图中亦可发现转速为180r／min、250r／min时，停滞期出现的时间比其它要来得早些，这是因为随着转速增加摇瓶中溶解氧增大，自然会促进作为好氧菌的白腐真菌的生长，综合考虑实验结果及经济因素选择转速为120r／min。图2．3酒彳i酸铵为氮源时生长曲线Fig．2．3Thegrowthcurveunderdifferentammoniumtartrate17n2白腐真菌的培养及微量／己索的影响硕}：论文3I'--Z＼X一●一卫●一上L3卜00．0O．51．01．52．02．53．03．54．04．5T／d图2．4不同温度时生长曲线Fig．2．4ThegrowthcurveunderdifferenttemperaturesT／d图2．5不同转速时生长曲线Fig．2．5Thegrowthcurveunderdifferentrotatingspeed2．4．3微量元素对白腐真菌生长的影响2．4．3．1铜元素的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，铜离子浓度分别为Ommol／L、0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5retool／L、0．8mmol／L、1mmol／L、1．5mmol／L、2mmol／L、3mmol／L。结果如183卜z＼xp一可一直-I了卜n硕I：论文白腐真菌的同定化及其在废水处理中的应用图2．6所示：从0．5天开始，铜元素浓度为0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5mmol／L的溶液已出现白色菌团，但直径较小，之后白腐真菌进入对数增长期，在第3．5天浓度就达到最大，菌液为白色团状，以铜元素浓度为0．5mmol／L最佳。未加入铜元素的也第2天溶液中出现白色菌丝。但是铜元素过高时菌液浓度变化均不是很大，说明铜离子浓度过高反而会抑制白腐真菌生长。白腐真菌分泌的主要酶素之一是漆酶，而铜是漆酶的重要组分之一。所以在培养基中加入一定量的铜可以促进漆酶的分泌，从而促进白腐真菌生长。与前几副图相比较加入微量元素铜明显加快了白腐真菌生长。图2．6加入铜元素时的生长曲线Fig．2．6Thegrowthcurveofaddingcopper2．4．3．2锰元素的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，锰离子浓度分别为0mmol／L、0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5mmol／L、0．8mmol／L、1mmol／L、1．5mmol／L、2mmol／L、3mmol／L。结果如图2．7所示：由图可明显看出，在生长初期白腐真菌浓度就开始有变化，在第2．5天已到达生长的最大浓度其中以锰元素浓度为0．1mmol／L、0．3mmol／L的溶液浓度最大，出现大量大颗粒状白色菌团，其中以锰元素浓度为0．1mmol／L最佳。与加入铜元素相比较，菌液浓度要大且达到最大浓度作用时间也要短。锰过氧化酶也是白腐真菌分泌的最主要的酶素之一，同样锰元素是锰过氧化酶的重要组分。在某些菌种中锰还调节锰过氧化酶、木质素过氧化酶和漆酶的产生【15】，所以一定量的锰离子可以促进白腐真菌的生长，缩短其生长的世代周期。2．4．3．3铁元素的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，亚铁离子浓度分别为0mmol／L、0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5mmol／L、0．8mmol／L、1mmol／L、1．5mmol／L、2mmol／L、3mmol／L。19n2[J腐真菌的培养及微量冗索的影响硕Ij论文结果如图2．8所示：整体看来，铁元素对白腐真菌生长的促进作用并不显著，但是亚铁离子浓度为0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5mmol／L的对其生长还是有一定的促进作用的，与未加入铁元素的曲线相比，其浓度最大值出现要早半天且溶液的浓度也要大一点，溶液为白色絮状且絮体较大。铁元素含量过高时，白腐真菌也有一定程度生长，但浓度不是很大，说明铁元素含量过高对白腐真菌的生长稍有抑制作用。20图2．7加入锰元素时的生长曲线Fig．2．7Thegrowthcurveofaddingmanganese2．4．3．4Tween80的影响图2．8加入铁元素时的生长曲线Fig．2．8Thegrowthcurveofaddingironn硕l：论文白腐真菌的同定化及】en：废水处理中的心用按2．3．4中的实验方法进行试验，Tween80的浓度分别取0mmol／L、0．005mmol／L、0．01mmol／L、0．02mmol／L、0．03mmol／L、0．04mmol／L、0．05mmol／L、0．07mmol／L。结果如图2．9所示：试验初期，添力HTween80作用并不明显，但两天后，Tween80浓度为0．005mmol／L、0．03mmol／L中自腐真菌已有直径不大的白色颗粒产生。第3天，浓度为0．005mmol／L、0．03mmol／L的白腐真菌大量生长且呈大的颗粒状，颗粒容易沉降，易于实现分离。浓度为0．01mmol／L也开始生长，在第4天达到最大浓度，而其余曲线基本无变化。定量的Tween80不仅可以有效地保护木质素酶因受机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失，而且可以与木质素过氧化酶相互作用引起活性提高，对酶的合成也有一定的激活或诱导作用从而提高酶产量，促进白腐真菌生长。3I--Z＼X．‘J’一勺●一五L3I--图2．9加入吐温80时的生长曲线Fig．2．9ThegrowthCHIVeofaddingTween802．4．4培养条件对白腐真菌降解苯酚的影响2．4．4．1pH的影响按2．3．3中的实验方法进行试验，调节培养基pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10，结果如图2．10所示：整体看来pH为4、5、6、7ft']白腐真菌降解苯酚的能力最强。试验第l天，pH为5的溶液中苯酚的去除率已有5％，而在第4天时，pH为4、5、6的溶液中苯酚去除率已达N100％，pH为7的溶液中苯酚去除率也有60％左右，pH为8的溶液在第5天对苯酚的降解可达50％左右。而在其他pH下苯酚基本无降解。最适宜白腐真菌生长的pH为5左右，此时其生长旺盛，降解污染物所分泌的酶素浓度也要高一点，在此酸度条件下白腐真菌对苯酚的降解作用明显。21n2[J腐真菌的培养及微量／幻甏的影响硕l：论文《0要；>暑二2兰乱2．4．4．2氮元素的影响《。=L；'呈竺●_-2兰正图2．10pH对苯酚的去除率的影响Fig．2．10TheeffectofpHonPhenolremovalrateI／d图2．11加入氯化铵对苯酚的去除率的影响Fig．2．11TheeffectofammoniumonPhenolremovalrate(1)无机氮的影响：按2-3．3中的实验方法进行试验，为了确定有机氮的最佳投加量，将培养基中的硝酸铵用氯化铵代替，取氮元素浓度分别为Og／L、0．01g／L、O．03g／L、0．05∥L、0．1g／L、0．2g／L、0．4g／L、0．6g／L、0．8g／L，结果如图2．11所示：试验初期，曲线变化不明显，第2．5天，氮元素浓度为O．2g／L的溶液中苯酚的去除率已有20％左右，第4天去除率已达N80％左右，氮元素浓度为O．05∥L的溶液苯酚去除率也接近80％，其他氮元素浓度较高溶液苯酚去除率也有50％左右。第5天，氮元素浓度为0．2g／L-0．8g／L22n硕I：论文白腐真菌的同定化及】{；4：废水处理中的J澎用时，苯酚的去除率均达到100％。从图中可看出氮元素作为白腐真菌生长的必要元素对白腐真菌降解苯酚起着重要作用，氮元素由无机氮提供时高浓度的氮更易于促进白腐真菌降解苯酚。(2)有机氮的影响：按2．3．3中的实验方法进行试验，为了确定有机氮的最佳投加量，将培养基中的硝酸铵用酒石酸铵代替，取氮元素浓度分别为0∥L、0．01∥L、0．03∥L、0．05g／L、0．1g／L、0．2g／L、0．4g／L、0．6g／L、0．8g／L，结果如图2．12所示：从图可明显看出，fiiJ'3天内苯酚去除率基本无变化，3天后苯酚去除率有较明显的变化，氮元素的浓度为0．03∥I，加．6g／L时，苯酚去除率开始上升，第4天苯酚的去除率接近50％，第5天去除率达至tJl00％。由于接种的菌种较少，降解试验初期为白腐真菌的量较少，苯酚基本没有降解。随时间延长，菌的数量不断增多，菌体分泌酶迅速增加，4天后，在一定的营养浓度下达到产酶高峰，苯酚去除率大大提高。从图2．12还可以看出，没有加入氮元素时，苯酚浓度基本没有变化，说明氮源是白腐真菌生长的必需元素。氮源对合成漆酶有重要的影响，高水平的氮可以提高漆酶的合成但是高浓度的氮对白腐真菌降解苯酚具有一定的抑制作用，这是因为铵会抑制一些酶的分泌，这一现象也符合其他学者的研究[741o2．4．4．3水浴温度的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，调节摇床水浴的温度分别为10℃、20℃、30℃、34℃、39℃、44℃。结果如图2．13所示：从图中可明显看到低温不易于白腐真菌各类酶素的分泌，而白腐真菌对苯酚的降解主要依赖于各类酶素，IO。C时最终苯酚的去除率只有40％左右，而高于30℃的几个温度下白腐真菌的降解效果均比较好，说明在高温产生的酶活性高于低温时产生的酶活性，但在44℃时初期降解效果不是很好，可能因为温度过高影响白腐真菌生长从而影响其酶的分泌及酶的活性，但是白腐真菌有比较强的适应性，在此温度下后期处理效果还是比较显著。2．4．4．4摇床转速的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，调节摇床转速分别为Or／min、60r／min、120r／min、180r／min、250r／min，结果如图2．14所示：不同转速对白腐真菌降解苯酚的区别不是很明显，白腐真菌降解水中的污染物主要靠其酶素，在过高的转速中，虽然有利于氧气与菌群接触可以促进其生长，但是过高的转速所引起的剪切力却破坏了降解酶使其失去活性，在静置情况下，前期降解效果比较缓慢，因为营养物和氧气的传质效率低使得白腐真菌所分泌的酶未能达到一定的浓度，使其降解能力下降。n2[J腐真菌的培养及微量／己素的影响硕J：论文图2．12酒行酸铵对苯酚的去除率的影响Fig。2。12TheeffectofammoniumOnPhenolremovalrateT／d图2．13温度对苯酚的去除率的影响Fig．2．13TheeffectoftemperaturesonPhenolremovalrate—‘／Dp∞．I一四>oEo．|一ocoL．厶，6＼op可．I一母>oE∞．|一ocoL|山n硕-J：论文白腐真菌的同定化及】{；在废水处理中的心用木＼∞葛k●一‘口>呈竺●_-o罨舌图2．14转速对苯酚的去除率的影响Fig．2．14TheeffectofrotatingspeedonPhenolremovalrate2．4．5微量元素对白腐真菌降解苯酚的影响2．4．5．1铜元素的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，铜离子浓度分别为0mmol／L、0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5mmol／L、0．8mmol／L、1mmol／L、1．5mmol／L、2mmol／L、3mmol／L。结果如图2．15所示：从图可看出铜元素对白腐真菌降解苯酚有明显的促进作用，与图2．11、2．12相比图2．15中苯酚去除率在降解试验初期就有变化，两天后铜离子浓度为0．1mmol／L、0．3mmol／L时，苯酚去除率变化明显，其中铜离子浓度为0．3mmol／L时，第3天苯酚去除率即可达到100％。白腐真菌是通过分泌的胞外酶实现对有机物降解的，其中漆酶是最主要的降解酶之一，而铜是漆酶的重要组分之一。在培养基中加入一定量的铜可以促进漆酶的合成并增强漆酶在细胞外环境中的稳定性，进而加速了苯酚的降解。但过高水平的铜离子浓度同样会抑制菌对苯酚的降解。n2[J腐真菌的培养及微量冗素的影响硕I：论文《要!j暑二2兰厶图2．15铜元素对苯酚的去除率的影响Fig．2．15TheeffectcopperonPhenolremovalrate2．4．5．2锰元素的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，锰离子浓度分别为0mmol／L、0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．Smmol／L、0．8mmol／L、1mmol／L、1．5mmol／L、2mmol／L、3mmol／L。结果如图2．16所示：从图可以看出锰元素和铜元素一样对白腐真菌降解苯酚有明显的促进作用，但前两天内的铜元素的影响较明显，锰元素影响较小。从第2天到第4天，锰元素对苯酚去除率的影响和铜元素相似，两天后锰离子浓度为1mmol／L、0．3mmol／L时，苯酚去除率变化明显，其中浓度为1mmol／L时，在第3．5天苯酚去除率接近100％。锰过氧化酶也是白腐真菌分泌的用于有机物降解的最主要的酶之一，同样锰元素是锰过氧化酶的重要组分，对于锰过氧化酶的活性是必须的。在某些菌种中锰还调节锰过氧化酶、木质素过氧化酶和漆酶的产生，所以定量的锰离子可以提高白腐真菌对苯酚的降解速率。n硕．1：论文亡j腐真菌的I古I定化及Je确：废水处理中的心用《卫要罩暑二2星图2．16锰元素对苯酚去除率的影响Fig．2．16TheeffectofmanganeseonPhenolremovalrate2．4．5．3铁元素的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，亚铁离子浓度分别为0mmol／L、0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5mmol／L、0．8mmol／L、1mmol／L、1．5mmol／L、2mmol／L、3mmol／L。结果如图2．17所示：从图可看出fiii3天苯酚去除率变化情况与氮元素的类似。3天后铁离子浓度为0．5mmol／断口1mmol／L时，苯酚去除率变化较快，其中浓度为0．5mmol／L的第4天苯酚的去除率约50％，第5天去除率已接近100％。在降解初期，铁元素对白腐真菌降解苯酚影响不大，但后期还是在一定程度促进了苯酚的降解，促进作用不是很明显。2．4．5．4Tween80的影响按2．3．4中的实验方法进行试验，Tween80的浓度分别取0mmol／L、0．005mmol／L、0．01mmol／L、0．02mmol／L、0．03mmol／L、0．04mmol／L、0．05mmol／L、0．07mmol／L。结果如图2．18所示：从图可以看出Tween80浓度为0．01mmol／L的曲线变化最明显，虽然前2．5天曲线都是基本无变化但是后期浓度为0．01mmol／L的曲线在第四天对苯酚的降解率达到100％，高浓度的Tween80明显会抑制苯酚的降解。定量的Tween80不仅可以有效地保护木质素酶因受机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失，而且可以与木质素过氧化酶相互作用引起活性提高，对酶的合成也有一定的激活或诱导作用从而提高酶产量，促进苯酚降解。27n2[J腐真菌的培养及微量元素的影响硕I二论义2．5小结0．00．51．01．52．02．53．03．54．04．55．05．56．01-／d图2．17铁元素对苯酚去除率的影响Fig．2．17TheeffectofirononPhenolremovalrateT／d图2．18吐温80对苯酚去除率的影响Fig．2．18TheeffectofTween80onPhenolremovalrate(1)基础培养基中白腐真菌经过5—7天的平皿培养后菌丝充满整个培养皿，且呈绒毛状，生长旺盛，可用于菌种的扩大培养。(2)液体振荡培养时，最适宜白腐真菌生长的pH为5，氮元素作为白腐真菌生长的28—‘／op∞．|一叮>oE廿-I—ocoL|乱—‘／op仍-l一订>oEo—I—oco上山n硕一I二论文臼腐真菌的同定化及je柏：废水处理中的应用必要元素其最佳投入量为无机氮0．8g／L有机氮0．03g／L，考虑经济等其他因素选择最佳的温度为30℃，摇床转速为120r／min；投加一定量的铜元素、锰元素及Tween80对白腐真菌的生长有明显促进作用且缩短其生长周期，加入铁元素时促进作用不明显。各个元素的最佳投加量分别为铜0．5mmol／L、锰0．1mmol／L、铁O．3mmol／L、Tween80为0．03mmol／L。(3)选择pH为5、温度为30℃、摇床转速为120r／min时白腐真菌对苯酚的降解效果最佳，与此同时加入一定的微量元素铜、锰及Tween80对白腐真菌降解苯酚有明显的促进作用，相比之下铁的促进作用并不显著。白腐真菌降解苯酚各种微量元素的最佳浓度分别为：氮0．19／L；铁0．5mmol／L；锰1．0mmol／L；铜0．3mmol／L；Tween80为0．01mmol／L。n3[J腐真菌的同定化硕I：论文3白腐真菌的固定化3．1仪器设备与药品3．1．1实验仪器与设备试验用主要设备与仪器如表3．1所示。表3．1实验仪器及设备Table3．1Instrumentsandequipmentsofexperiment3．1．2主要实验药品磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、硝酸铵、氯化钙、六水合氯化铁、苯酚、硫酸银、硫酸亚铁铵、硫酸(p=1．84g．mL-1)、邻菲罗林为分析纯；重铬酸钾为优级纯：海藻酸钠、聚乙烯醇(PVA)、硼酸为化学纯；琼脂粉、葡萄糖、营养肉汤为生化试剂；蒸馏水、木屑等由实验室提供。3．2实验方法3．2．1分析方法COD的测定：重铬酸盐法(GBll914．89)。苯酚测定：4一氨基安替比林分光光度法(GB7490．_87)。菌液浓度的测定：比浊法。30n顾一l：论文白腐真菌的闶定化及其ni废水处理中的应用比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定菌体的数量。菌体悬浮液的浓度在一定范围内与吸光度成正比，所以，可用分光光度计测定菌液浊度，用浊度表示样品菌液浓度。3．2．2吸附固定化固定化方法因固定化载体和作用原理的不同分为几大类，吸附固定化是指由于载体与微生物之问的静电作用使得微生物吸附在载体表面而固定的方法，该方法操作简单是目前固定化方法中应用较广泛的一种，此方法中载体的选择是核心。根据白腐真菌的特点，分别采丝瓜囊、玉米芯、活性炭、木屑等固定化载体吸附固定白腐真菌。通过比较不同固定化载体的可操作性、经济性、菌体吸附量、载体稳定性以及固定化的白腐真菌对焦化废水的处理效果的比较，选择较为理想的固定化载体。3．2．2．1吸附固定化方法的选择(1)直接吸附：称取10g木屑，放入2％的H202溶液中浸泡30min，用蒸馏水洗至中性。将木屑加入装有1000mL培养基的烧杯中，接种基础培养基固体培养的菌种，调节pH为5，在30。C恒温水浴中曝气培养，培养卜5天后滤去培养液即得木屑直接吸附固定化的白腐真菌。用生理盐水洗净后在30℃，pH=6．0的条件下降解模拟废水，测定苯酚及COD去除率。(2)先培养后吸附：接种基础培养基固体培养的菌种于装有1000mL培养基的烧杯中，调节液体培养基pH为5，在30。C恒温水浴中曝气培养两天。称取10g木屑，放入2％的H202溶液中浸泡30min，用蒸馏水洗至中性，加入已培养两天的液体培养基中，继续培养2_3天后滤去培养液即得木屑吸附固定化的白腐真菌。用生理盐水洗净后在30℃，pH=6．0的条件下降解模拟废水，测定苯酚及COD去除率。3．2．2．2吸附固定化载体的选择开发具有良好性能的固定化载体也是固定化微生物细胞技术研究中一个最为重要的课题之一。试验按照对白腐真菌无毒害作用、传质性好、操作简单、价格便宜以及以废治废的原则选择载体，并进行可行性研究。按照3．2．2．1中(1)的方法，分别利用等量的稻草粉末、棉花秆粉末、麦秆粉术、花生壳粉末、木屑、玉米芯、丝瓜囊、活性炭等农业废品固定化白腐真菌，并在30℃、pH：6．0的条件下对模拟废水进行降解，测定不同载体固定化的白腐真菌对模拟废水中苯酚和COD的去除率。3．2．2．3不同体积的载体吸附固定化的比较按照3．2．2．1中(1)的方法，分别将质量相同但表面积比大约为50-l的花生壳固定化白腐真菌，并在30℃、pH=6．O的条件下对模拟废水进行降解，测定不同体积载体吸附固定化的白腐真菌对模拟废水中苯酚和COD的去除率。31n3[J腐真菌的同定化硕i：论文3．2．3包埋固定化3．2．3．1包埋方法的优化(1)海藻酸钙+活性炭包埋细胞包埋在海藻酸钠盐中是一种简单和无毒的固定化方法，本试验中加入本身具有吸附作用的活性炭，滴入一定浓度的氯化钙溶液，海藻酸钠水溶液与钙离子接触时生成海藻酸钙而形成凝胶，可根据钙离子的多少以及海藻酸钠和活性炭的浓度调节凝胶的强度。制取固定化小球操作流程如图3．1所示：I白腐真菌菌丝l活性炭+海藻酸钠溶液图3。l海藻酸钠一氯化钙与活性炭法制备同定化白腐真菌Fig．3．1Preparationofimmobilizedwhiterotfungiwithsodiumalginate、CaCl2andC将白腐真菌菌丝和海藻酸钠和活性炭的溶液均匀混合，制成白腐真菌菌丝为5％、海藻酸钠浓度为5％、活性炭为8％的混合液。用注射器将该混合液滴入2％的氯化钙溶液中反应4h左右，得到固定化小球，用生理敲水洗净后在30℃，pH为6的条件下降解模拟废水，测定模拟废水苯酚及COD的去除率。(2)PvA+SA包埋在PVA中加入少量海藻酸钠，海藻酸钙的存在改善形成小珠的表面性质可以在～定程度上解决PVA引起的粘连问题，将其混合溶液滴入硝酸钙溶液，代替了传统的氯化钙。将白腐真菌菌丝、PVA溶液和海藻酸钠溶液均匀混合，制成白腐真菌菌丝为5％、PVA浓度为8％、海藻酸钠浓度为l％的混合液。用注射器将该混合液滴入浓度为2％的硝32n硕士论义臼腐真菌的同定化及其住废水处理中的应用酸钙溶液中交联4h后得到固定化小球，用生理盐水洗净后在30"C，pH=6．0的条件下降解模拟废水，测定模拟废水苯酚及COD的去除率，制备小球的操作流程如图3．2所示：图3．2P、，A一硝酸钙法同定化自腐真菌Fig．3．2PreparationofimmobilizedwhiterotfungiwithPVAandCaN03(3)PVA．硼酸法PVA一硼酸交联法是一种常用的微生物固定化方法，其中硼酸的酸性导致细胞存活较难，PVA的黏性使得做成的小珠有自聚合趋向。试验中加入单体丙烯酰胺和N，N’一亚甲基双丙烯酰胺以解决此法带来的不足。根据上述反应机理制取固定化小球将白腐真菌菌丝、PVA溶液和海藻酸钠溶液均匀混合，制成白腐真菌菌丝为5％、PVA浓度为8％、海藻酸钠浓度为l％的混合液，所得溶液放置4h后加入0．05g／mL单体丙烯酰胺和0．006g／mLN，N’一亚甲基双丙烯酰胺。用注射器将该混合液滴入硝酸钙浓度为2％的饱和硼酸溶液中交联4h后得到固定化小球，用生理盐水洗净后在30*(2，pH'-6．0的条件下降解模拟废水，测定模拟废水苯酚及COD的去除率，制备小球的操作流程如图3．3所示：3．2．3．2吸附一包埋法最佳条件联合固定化是目前微生物固定化研究的新的方向。按照3．2．2．1中(1)的方法制取已吸附固定化的白腐真菌，再按照3．2．3．1中(2)的方法在不同的条件下包埋固定化，制取固定化小球，制备小球的操作流程如图3．4所示：33n3[|腐真菌的同定化硕I：论文I单体丙烯酰胺乘1N,N'-距甲基双丙烯酰胺滴入硝酸钙浓度为2％的饱和硼酸溶液中形成小球，同化4h生理盐水洗涤问定化小球(中3～5mm)降解模拟废水图3．3PvA一硝酸钙法同定化白腐真菌Fig．3．3PreparationofimmobilizedwhiterotfungiwithPVAandH3803图3．4先吸附后包埋的方法制备州定化小球Fig·3·4Preparationofimmobilizedwhiterotfungibyabsorptionandembeddingn硕．1：论文白腐真菌的同定化及Jt：-彳t!废水处理中的胞用(1)确定最佳硝酸钙浓度按照图3．4隹j1]作固定化小球，制取硝酸钙浓度分别为0．5％、1％、2％、3％、4％、5％、的小球，固化小球直径为3"-'5mm，交联一定时间后曝气，观察不同硝酸钙浓度下小球成球情况及机械强度等物理性质；(2)确定最佳小球直径按照图3．4制作固定化小球，在已确定的最佳硝酸钙浓度下，制取直径分别为2mm、4mm、6mm、8mm、10mm、12mm的小球，交联一定时间后曝气，观察不同直径下小球成球情况及机械强度等物理性质；(3)确定最佳交联时间按照图3．4锌j1]作固定化小球，在已确定的最佳成球直径以及硝酸钙浓度下，取交联时间分别为1h、4h、6h、12h、24h包埋固定化小球，交联后曝气，观察不同交联时间下小球成球情况及机械强度等物理性质；(4)确定最佳吸附真菌投加量按照图3．4制作固定化小球，在己确定的最佳成球直径、最佳硝酸钙以及最佳交联时间下，取己吸附白腐真菌的木屑湿重分别为5g、10g、15g、20g、25g、30gN埋固定化小球，交联后曝气，观察不同质量载体下小球成球情况及机械强度等物理性质；(5)正交实验确定最佳因素组合以上四个因素均对包埋固定化微生物有比较大的影响作用，在上述单一试验确定了对应的最佳数值后做四因素三水平J下交试验。(6)确定最佳活化pH．以正交实验结果为准制取固定化小球，分别置于pH为2，3，4，5，6，7，8，9，10的营养液中活化，活化相同时间后降解模拟废水，测定其苯酚的去除率，确定活化最佳的pH。3．2．4试验方法优化按照3．2．2．1中(1)的方法制取已吸附固定化的白腐真菌，3．2．3．1中(2)的方法包埋固定化制取固定化小球，3．2．3．2中(5)中确定的最佳试验条件制取联合固定化小球，基础培养基培养液体的游离菌种；对吸附固定化及包埋固定化的菌种做电镜，观察菌种生长情况，做出比较；将不同试验方法所得的白腐真菌在30*(2，pH=6．0的条件下降解模拟废水，测定模拟废水苯酚及COD的去除率，确定最佳试验方法。35n3[J腐真菌的『jlil定化硕lj论文3．3结果与讨论3．3．1吸附固定化3．3．1．1吸附固定化方法的选择按照3．2．2．1的两种方法吸附固定白腐真菌并对模拟废水进行降解，处理结果如图3．5和3．6所示。起始废水苯酚的浓度为282mg／L，COD为1608mg／L。随着处理时间的延长，苯酚及COD的去除率稳定提高，在16h时达到最大去除率，此时苯酚去除率达到100％，COD去除率大约97％。从实验结果可以看出两种吸附方法均有较好的固定化效果。木屑中木质素促进真菌的生长，且真菌在吸附的情况下形成直径大的菌团，提高了降解能力。直接吸附的固定化方法对苯酚及COD的降解较好于先培养后吸附的固定化方法。从实验中可以看出直接吸附一开始就因溶液中有木屑使得形成的小颗粒菌团可以吸附逐渐而成大颗粒的菌团，且菌团易沉降；从降解曲线也可以看出直接吸附降解的速率要更快。堡案二粤呈2重兰ft．图3．5不同吸附同定化方法降解苯酚Fig．3．5Thedegradationofphenolunderdifferentadsorptionmethodn硕J：论文白腐真菌的同定化及其在废水处理中的心用T／h图3．6不同吸附同定化方法对COD的降解Fig．3．6ThedegradationofCODunderdifferentadsorptionmethod3．2．1．2吸附固定化载体的选择T／h图3．7不同同定化载体苯酚去除率Fig．3．7Theremovalrateofphenolunderdifferentcarries37《op西．|Ie>99JDoo|'￡g∞．J一哪>oE9J—o匕oc也n3臼腐真菌的嘲定化硕’l：论文T加图3．8不同固定化载体COD去除率Fig．3．8TheremovalrateofCODunderdifferentcarries按照3．2．2．2的两种方法吸附固定白腐真菌并对模拟废水进行降解，处理结果如图3．7和3．8所示。起始废水苯酚的浓度为288mg／L，COD为2180mg／L。随着处理时间的延长，各种载体苯酚及COD的去除率稳定提高，在15h左右稻草粉末、玉米芯、丝瓜囊对苯酚的去除率达到100％，其余几种载体对苯酚的去除率也有96％左右；与此同时在15h时稻草杆及花生壳粉末对COD的去除率分别为97．1％以及97％，在18h的时候丝瓜囊对COD的去除率达至1J98．7％，稻草粉末、花生壳粉末、活性炭对COD的去除率为97％左右，玉米芯、麸皮、棉花杆粉末、木屑对COD的去除率为96％左右。从实验结果可以看所选择的几种载体均有较好的固定化效果，载体的表面性质如粗糙度等可能是影响白腐真菌表面附着的因素。稻草粉末和麸皮材质较软，密度较小，物理强度差，在废水处理过程中不易沉降分离且易于生物降解，虽然稻草粉末整体处理效果还是比较好的，但是其本身所引起的COD也是比较高的，所以这两种载体不适于白腐真菌的固定化。几种载体中活性炭作为无机载体其处理效果不是最佳，相比较而言成本也最高。玉米芯、丝瓜囊、花生壳粉末、木屑和棉花秆粉末材质较硬，密度比水稍大，物理强度较好，沉降分离性好，具有～定的抗生物降解能力。相对来说，丝瓜囊、玉米芯以及花生壳粉末是比较理想的载体，这与其特殊的空间结构有很大关系：这几种载体内部均有许多微囊孔，白腐真菌可吸附生长于这些微囊中，避免了吸附力小而导致固定化菌大量流失的现象；此外这种微囊结构使得载体本身具有较大的比表面积，增强了对废水中污染物的吸附能力。木屑则具有最为广阔的应用前景，～方面木屑可以为白腐真菌的生长提供必要的营养，而且木屑的一些特殊成分可以促进白腐真菌酶的分泌；另一n硕：i?论文白腐真菌的州定化及其在废水处理中的应用方面，木屑作为工农业废品大量存在，用木屑固定化白腐真菌处理废水可以达到以废治废的目的。3．2．1．3不同体积的载体吸附固定化的比较按照3．2．2．3的方法吸附固定白腐真菌并对模拟废水进行降解，处理结果如图3．9和3．10所示。模拟废水起始苯酚的浓度为284mg／L，COD为2013mg／L。随着处理时间的延长，苯酚及COD的去除率稳定提高，可以看出不同体积载体对苯酚去除率的影响不是很显著，ijiJ'10h体积小的花生壳粉末占优势，12h时，花生壳粉未对苯酚去除率到达100％而花生壳则需要14h左右。但是对COD去除率花生壳又明显优于花生壳粉末，21h花生壳对COD去除率达到100％而花生壳粉末在95％左右。可以看出花生壳粉末由于其本身有更大的表面积使得固定化的菌浓度更大，与此同时由于其容易溶于水中又引起COD增高。逑∞童葡占E巴石岙孟图3．9不同体积固定化载体苯酚去除率Fig．3．9TheeffectofdifferentsizeonPhenolremovalraten3[j腐真菌的同定化硕I：论文述。童焉弓Eeo‘)图3．10不同体积同定化载体COD去除率Fig．3．10TheeffectofdifferentsizeonCODremovalrate3．3．2包埋固定化3．2．2．1包埋方法的优化按照3．2．3．1试验，处理结果如图3．11及3．12所示。起始废水苯酚的浓度为282mg／L，COD为2054mg／L。随着处理时间的延长，苯酚及COD的去除率稳定提高。用海藻酸钠一氯化钙包埋固定白腐真菌的方法优于PVA一硼酸包埋法，处理时间也缩短了不少。这主要是由于P删白腐真菌的毒性较高，抑制了白腐真菌的活性，而海藻酸钠与氯化钙对白腐真菌活性的影响相对较小。三种包埋方法对废水中苯酚和COD的都有较好的去除效果，其中以3．2．3．1中方法(2)效果最好，在16h时苯酚的去除率接近100％，COD去除率业较高。实验中可以发现，活性炭的加入使得小球的机械强度减弱，致使在处理过程中小球容易破裂；PVA法形成的小珠弹性较好、机械强度高。与此同时在硼酸溶液中交联所得小球因硼酸的毒性不易活化，但因加入单体丙烯酰胺和N，N’一亚甲基双丙烯酰胺明显改善了小球的粘连性；所以在处理过程中对苯酚和COD的降解效果不是特别理想。n硕．L．论文臼腐真菌的同定化及其柱废水处理中的心用述暑=要呈巴重兰乱图3．11不同包埋方法苯酚去除率Fig．3．1lThePhenolremovalrateunderdifferentimmobilizemethods图3．12不同包埋方法COD去除率Fig．3．12TheCODremovalrateunderdifferentimmobilizemethods从上述实验结果可以看出PⅥ卜硼酸法固定化过程简单，易于成形，成本低；基质通透性好；固定化细胞密度大，载体内细胞漏出少；物理强度和化学稳定性好，抗生物降解性强；沉降分离性好。但是在此过程中，由于高浓度的溶液在与细胞混合时，会使细胞受到很高的剪切力作用，而细胞膜对剪切力非常敏感，在混合过程中，会导致细胞的大量死亡，而且反应也非常剧烈，这就会大大影响微生物的活性，致使固定化的白腐真菌降解能力下降。41n3[J腐真菌的同定化顾I：论文海藻酸钠一氯化钙包埋法也具有PVA一硼酸法过程简单，基质通透性好；固定化细胞密度大，沉降分离性好等优点，而且生物毒性低，更易于成球，物理强度和化学稳定性也比较好。但该方法制备的小球抗生物降解性较弱，也不jtHPVA一硼酸法经济。3．2．3．2吸附一包埋法联合固定化最佳条件的确定(1)最佳硝酸钙浓度的确定按照3．2．3．2，取(1)中的条件进行试验，可看到相关的结果如表3．2所示：随着硝酸钙浓度的增加小球的强度及其沉降性能均增大，浓度过低时所形成的小球较软，在后续处理过程中容易损坏，但是当浓度大于3％时由于溶液的黏性增加，虽然所生成小球硬度增加，但是脆性亦增加，容易破裂。表3．2不同硝酸钙浓度Table3．2Dif!ferentconcentrationofCalciumNitrite注：‘‘+++”代表小球性能最佳；‘‘++”性能次之；‘‘+”最差(以下均相同)。(2)最佳小球直径的确定表3．3不同直径Table3．3Differentdiameter按照3．2．3．2，取(2)中的条件进行试验，可看到相关的结果如表3．3所示：在制备小球时其直径带来的影响还是比较大的。这是由于凝胶小球直径越大，越不利于传质，造42n硕．I：论文(J腐真菌的同定化及je矗：废水处理中的心用成凝胶小球内部的细胞营养供给不足，代谢产物累积过多，小球内部环境恶化，不利于真菌生长代谢的进行，在具体的试验过程中，直径过小又难以控制，由试验得出直径4mill左右较容易控制，且成型规则。(3)最佳交联时间的确定按照3．2．3．2，取(3)中的条件进行试验，可看到相关的结果如表3．4所示：一般增加交联时间可以增and,球的固化过程，保证利用的长期性，但是交联时间过长小球的机械强度越大，内部机构也更加紧密，会导致传质性能的降低，通透性也下降，所形成小球即使长时间活化其降解效果也比较差。表3．4不同交联时间Table3．4Differentcross—linkingtime投加量(g)机械强度规则程度沉降性溶胀性通透性按照3．2．3．2，取(4)中的条件进行试验，可看到相关的结果如表3．5所示：在固定化颗粒中会发生传质的抗性，也就是营养物的进入和底物的派出产生一对矛盾，对氧向固定化生物内的扩散，都会有负面影响，当固定化细胞迅速生长时只会形成一个薄的周围生长层而小珠内的生物量较少，由于周围生物量对氧的要求他们的生长速度大于氧向43n3[J腐真菌的同定化硕lj论文颗粒的扩散速度，所以为了减缓这一问题在选择生物量时要谨慎，且包埋生物量过大也会引起营养的不足导致酶量及其活性的下降。(5)正交实验表3．6包埋因素正交实验组Table3．6Theimmobilizationfactorsoforthographicaltable序号硝酸钙浓度小球直径(mm)交联时间(h)包堋鼙(g)0。5％0．5％O．5％1％2％92％51210表3．7正交实验数据表Table3．7Thedatasheetoforthographicaltable实验号硝酸钙浓度小球直径(mm)交联时间(h)包埋量(g)空白降解率(％)l0．5％3l2l2420．5％44525630．5％5121033341％31239851％44515461％5121024472％3l29582％44538692％51210148Klj113217154126K动196202195Kaj229125182184i·38725l42K2jK3j656765764225m25m25●4他●4挖●43453453412345678n硕l?论文白腐真菌的同定化及】E在废水处理中的应用按照表3．6中的试验条件用吸附包埋法固定化小球，用生理盐水洗净后在30℃，pH=6．0的条件下降解模拟废水，测定模拟废水中苯酚的去除率，确定最佳试验条件。由表3．7中正交实验结果可以看出吸附包埋固定化白腐真菌的最佳理论实验条件组合应该为硝酸钙的浓度取2％、小球直径取3mm、交联时间取4h、投加的吸附真菌的量取59。但是在9组试验中并无此组合，为了检验此组合是否为最佳水平，取上述四个条件在其余实验条件相同时继续做追加试验，相同时间后测的苯酚的去除率为99．2％，所以确定组合固定化的最佳实验条件为硝酸钙的浓度2％、小球直径3mm、交联时问4h、投加的吸附真菌的量59。但考虑实际中交联时间为4h时所得小球的机械强度比较差可以选择适当大的延长交联时间，加大其硬化过程，增加小球的硬度和机械强度，从而提高在实际处理过程中时间及反复使用次数。(6)活化最佳pH的确定按照3．2．3．2，取(6)中的条件进行试验，可看到相关的结果如图3．13和3．14所示：固定化后的白腐真菌所能适应的pH范围更加宽，本来作为酸性条件下生长的菌体经过固定化活化后可明显在偏碱性条件下生长，且有一定的降解效果。比较而言，在初始苯酚及COD含量分别为276．99mg／L署1]1285．49mg／L时pH为4—5左右的降解率最高。逞∞肖三goE是石岳C正图3．13不同pH时苯酚去除率Fig．3．13ThePhenolremovalrateunderdifferentPH45n3[J腐真菌的闱定化硕l：论文逻萎雪呈尘8oT／h图3．14不同pH时COD去除率Fig．3．14TheCODremovalrateunderdifferentPH3．3．3试验方法优化按照3．2．4试验，所做电镜如图所示，处理结果如图3．15至3．24所示。由电镜图片可以看出，对于吸附包埋法，未活化前，由于包埋剂的影响，小球上只有少量菌种存在并以孢子的性态存在，活化后小珠表面长出很多菌丝，交织存在，比较紧密，生长情况好，从其剖面途中可以看出不仅表面，小球内部也长满菌丝且有部分孢子存在，用此种方法制成的小珠在处理过废水后表面依然菌丝交织，不同的是由于营养代谢的影响出现出芽生殖。用吸附法固定白腐真菌不仅木屑表面铺满菌丝，而且木屑的微囊内部也充满了大量菌丝，用其处理废水后，菌丝以一定的形状交织布满载体表面，废水毒性的影响，出现部分孢子。对于直接包埋法，毒性作用使得其表面在未活化前基本没有什么菌群，是由极其少量的刨子存在，活化后，菌种在营养物作用下快速生长充满小球表面，内部变化就没有吸附包埋那么明显快速，但是也有部分出芽生长，经废水处理后，小球外部菌丝紧密，内部孢子数目增多。白腐真菌在营养物质中有有性和无性生殖两种繁殖方式，其中孢子生殖就是一种无性繁殖的方式，在一定的环境和营养条件下白腐真菌采取孢子繁殖，使得所得的固定化的真菌在一定的时间内可以反复使用且能保持其应有的活性。n砸f。论文山膳真菌的州定化肚其n废水处理中的脚用幽317吸附包圳活化后剖面的扫描电镜Fig317SEMofprofileofactivatedwhiterotfungusfirstbyadsorptionthenbyembeddingn3口腐真菌的州定化剐I：论空48刚3．∞吸附处理后的扫描电镜Fig．3．20SEMofwhiterotfungusbyadsoTptionaftHtreatmentn颅1：论文白腐真曹的瑚定化及其在废水赴理中的应用幽3．23包埋括化后剖面的扫描电镜Fig．3．23SEMofprofileofactivatedwhiterotfungusbyembeddingn3口腐真菌的晰定化碰I：it文幽324包蜱处理厉的扫描电锐Fig．3．24SEMofwhiterotfungusbyembeddingaftertreah-nent起始废水苯酚的浓度为229mg／L，COD为1962mg／L。随着处理时『日J的延长，苯酚及COD的去除率稳定提高。在1611时达到最大去除率，此时苯酚去除率达到100％，COD去除率大约97％。由图中3．25和3．26可明显看出吸附法固定化的白腐真菌对苯酚和COD的去除率均好于其它几种方法培养的菌种，尤其在苯酚去除率上，最早达到最大去除率，远远快于其它几种，但是在对COD的去除上由于吸附法固定化本身对COD就有影响，使得其与吸附包埋联合固定化方法相比效果不是特别突出，总体看来吸附法较优。因为包埋固定化材料的传质阻力较大，对培养基中的营养物质和氧气向细胞内的传递以及胞内代谢废物向胞外的传递也会有不利影响。在细胞的特定代谢阶段，细胞对营养物质和氧4t的消耗速度都会加快，因此在某阶段固定化细胞颗粒中心的细胞会处丁缺营养或缺氧的状态：而积累在腿内的代谢废物则会对细胞的生理产，E不良甚至毒害影响。采用吸附的固定化方法，细胞直接结合在结构疏松的载体上，对产物、营养物和氧气等的扩散影响很小。n硕：L论文白腐真菌的周定化及其在废水处理中的应用避暑言占磊言岳孟述董零星巴8o、i6图3．25不同形态菌种时苯酚去除率Fig．3．25ThePhenolremovalrateunderdifferentshape图3．26不同形态菌种时COD去除率Fig．3．26TheCODremovalrateunderdifferentshape综合电镜图片和处理出水的数据可知，吸附法操作简单，菌群在载体上生长效果好，降解效果佳，废水中有一部分的微生物悬浮生长，木屑内的空隙中也有大量微生物附着生长，同时木屑可吸附部分污染物在其表面为白腐真菌的降解提供有利条件。另外由于木屑的扩散阻力在木屑孔隙中的白腐真菌受酚类等有毒物质的抑制作用会减小。木屑吸附固定化过程对细胞活性的影响小，可以为固定化的白腐真菌提供一定的营养，并为白51n3臼腐真菌的Iilil定化硕．L论文腐真菌的降解提供有利条件，十分经济，而且可以达到以废治废的目的。但微生物与载体间的吸附强度也不够牢固，载体易生物降解且在曝气量过大时容易使团状打散引起上浮，影响出水水质。3．4小结(1)吸附固定化中将载体直接加入接种了白腐真菌的培养基时的固定化的效果优于将载体加入已培养好的白腐真菌悬浊液之中：在固定化载体得选择上以木屑、丝瓜囊为最佳载体；不同体积载体对苯酚去除率的影响不是很显著，但是对COD去除率花生壳又明显优于花生壳粉末。(2)包埋固定化中以将白腐真菌菌丝、PVA溶液和海藻酸钠溶液均匀混合而成的混合液滴入硝酸钙溶液中交联得到的小球效果最佳，此法操作简单且成本低，去除效果好；组合固定化最佳条件为：硝酸钙的浓度取2％、小球直径取3mm、交联时间取4h、已吸附真菌的投加量取59，但考虑实际中交联时间为4h时所得小球的机械强度比较差可以选择适当大的延长交联时间，所得固定化颗粒最佳的活化pH为5。(3)各种不同的形态白腐真菌处理废水时以吸附法效果最佳，不管是在苯酚去除率还是COD的去除率上处理速度和处理效果均占优势，但该法对曝气量的要求比较严格。52n硕士论文白腐真菌的固定化及其在废水处理中的应用4固定化白腐真菌处理实际废水4．1实验仪器设备与药品4．1．1主要试验仪器设备试验用主要设备与仪器如表4．1所示。表4．1实验仪器及设备Table4．1Instrumentsandequipmentsofexperiment4．1．2主要实验药品磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硝酸铵、氯化钙、氯化高铁、硫酸银、硫酸亚铁铵、硫酸(p=1．84g．mL-1)、浓盐酸、四氯化碳、邻菲罗林、氢氧化钠、高锰酸钾、硫酸铜、磷酸、甲基橙、苯酚、溴酸钾、溴化钾、硫代硫酸钠、氯化铵、4一氨基安替比林、铁氰化钾、氯化钠、氢氧化钾、硝酸铅为分析纯；重铬酸钾为优级纯。53n4同定化白腐真菌处理实际污水硕L论文4．2实验方法4．2．1分析方法COD的测定：重铬酸盐法(GB11914-89)。酚类化合物浓度测定：4一氨基安替比林直接分光光度法(GB7490-87)油类的测定：红外光度法(GB／T16488．1996)金属的测定：火焰原子分光光度法4．2．2固定化白腐真菌处理焦化废水根据3．3．1的实验结果，选择以木屑为载体吸附固定白腐真菌并用于焦化废水的处理。取一定质量的木屑固定化自腐真菌，调节pH值为6、温度为30*(2，曝气条件下处理焦化废水，每12h取样，测定COD和酚类化合物的去除率。4．2．3固定化白腐真菌处理苯胺废水根据3．3．1的实验结果，选择以丝瓜囊为载体吸附固定白腐真菌并用于苯胺废水的处理。取一定质量的丝瓜囊固定化白腐真菌，调节pH值为6、温度为30。C，曝气条件下处理苯胺废水，每12h取样，测定COD的去除率。4．2．4固定化白腐真菌处理炼油废水根据3．3．1的实验结果，选择以木屑为载体吸附固定白腐真菌并用于炼油废水的处理。取一定质量的木屑固定化白腐真菌，调节pH值为6、温度为304C，曝气条件下处理炼油废水，每12h取样，测定COD和酚类及油的去除率。4．2．5固定化白腐真菌处理河水根据3．3．1的实验结果，选择以木屑为载体吸附固定白腐真菌并用于河水的处理。取一定质量的木屑固定化白腐真菌，调节pH值为6、温度为30*(2，曝气条件下处理河水，每12h取样，测定COD的去除率；每隔4h取样测定水中金属钠、铅、钙、铜的去除率。4．3结果与讨论4．3．1固定化白腐真菌处理焦化废水按4．2．2的方法进行实验，结果如图4．1、4．2所示。焦化废水COD起始浓度为1353mg／L，苯酚起始浓度为205mg／L，经过3天，COD和苯酚的去除率分别为88．89％、72．38％。n硕上论文白腐真菌的同定化及其在废水处理中的应用迟壹理垩oEeo逞∞荟罢篆砉岳茬T，d图4．1焦化废水中COD去除率Fig．4．1TheremovalrateofCODonCokingWastewaterI，a图4．2酚类的去除率Fig．4．2TheremovalrateofPhenol从图中可以看出，随着时间的延长，白腐真菌对焦化废水中COD和酚类的降解效果稳定提高，白腐真菌有着强的适应性，当处理时间延长的时候，焦化废水中有毒有害的物质对固定化自腐真菌的抑制作用减弱，当焦化废水浓度过高时固定化白腐真菌对COD、酚类的去除率不是特别高，但是白腐真菌对焦化废水中难降解的有毒有害有机物还是有较好的降解效果。SSn4同定化白腐真菌处理实际污水硕上论文4．3．2固定化白腐真菌处理苯胺废水按4．2．3的方法进行实验，结果如图4．3所示。苯胺废水COD初始浓度为1184mg／L，经过4d的处理之后COD浓度降为188．2mg／L，去除率达84．1％。迟童季邑史8olla图4．3苯胺废水COD的去除率Fig．4．3TheremovalrateofCODonanilinewastewater从图中看出，起初去除率的增长比较缓慢，属于菌种对苯胺废水的适应阶段，去除率不是很高，只有接近60％，但是随着处理时间的增加，苯胺废水中COD的去除率又有新的提高，不仅如此，由于固定化载体为丝瓜囊，其大量的微孑L也有着很好的吸附作用，对于浊度及色度较深的苯胺废水来讲在处理一段时间后，溶液的色度和浊度有着明显的下降，从深棕色变为淡的棕黄色，比起游离的白腐真菌固定化菌种吸附溶液中各种杂质的能力更强。4．3．3固定化白腐真菌处理炼油废水按4．2．4的方法进行实验，结果如图4．4、4．5所示。炼油废水起始COD、苯酚及油的含量分别为：2208．8mg／L、57．5mg／L、97．59mg／L。经过12h后，苯酚的含量已经检测不出，去除率达到100％；在2．5d时，COD及油的含量分别降为：54．67mg／L、3．06mg／L，去除率分别达到97．52％和96．86％。可以看出在炼油废水中COD虽然比较高，但是相对于焦化废水来讲炼油水中的有毒有害物质比较少，所以对固定化的白腐真菌降解COD的影响不大，对于炼油废水中含量较低的酚类更是显示出快速的降解能力。图中可以看出白腐真菌除油的效果也是很明显的，首先木屑本身对油类就有一定的吸附作用，其次白腐真菌对油类也有很强的降解能力。整体看来，不论是在COD还是油的去除率上，第一天的时候去除率均达到较高的水平，之后也没有反弹，保持着比较好的效果。n硕上论文白腐真菌的同定化及其在废水处理中的应用堡星零星巴8oT，d图4．4炼油废水COD的去除率Fig．4．4TheremovalrateofCODonRefineryWastewaterI／a图4．5炼油废水油的去除率Fig．4．5TheremovalrateofoilonRefineryWastewater4．3．4固定化白腐真菌处理河水按4．2．5的方法进行实验，结果如图4．6和4．7所示。河水COD的起始浓度为163．68mg／L，经过2．5d的处理，COD的浓度降为24．8mg／L，去除率为85．04％。经过20小时的处理，原水中钠的含量从起始的5485．92mg／L降解为1221．64mg／L，钙的含量从起始的57n4同定化臼腐真菌处理实际污水硕士论文373．29mg／L降解为104．17mg／L，铅的从起始的3．73mg／L降解为0．16mg／L，去除率分别为77．8％、72．1％和95．8％。从图中可以看出，对于河水这种低COD的水样，白腐真菌对其亦有着很好的去除效果，由此看来生物法处理低浓度也是可行的。其次，本实验中河水取自学校友谊河，河中污染污物成分比起其余的河水来讲可能更接近于生活污水，水中含盐量高，尤其是钠离子的浓度，即使在这种环境下，白腐真菌还是对各种金属盐离子有着很好的去除，对于铜来讲起始浓度为0．09mg／L，起初还是有一定的降解的，但后期会有一定的回升，考虑到后期菌种的死亡等因素，可能是被吸附或包裹在菌体中的部分铜随着菌种的生长周期又溶解到水中所致，另外就是在处理过程中溶液中的pH也会因为白腐真菌的生长而又一定的波动，铜的吸附可能受pH影响比较大【751。图4．6河水COD的去除率Fig．4．6TheremovalrateofCODOilriverwater，6、粤霉一m，、DEm正凸oon硕上论文白腐真菌的同定化及其往废水处理中的廊用4．4小结Tm图4．7金属盐的去除率Fig．4．7Theremovalrateofmetalsalts(1)木屑固定化白腐真菌处理COD起始浓度为1353mg／L，苯酚起始浓度为205mg／L的焦化废水，经过3d，COD和苯酚的去除率分别为88．89％、72．38％。(2)丝瓜囊固定化白腐真菌处理COD初始浓度为1184mg／L的苯胺废水，经过4d的处理之后COD浓度降为188．2mg／L，去除率达84．1％。(3)木屑固定化白腐真菌处理起始COD、苯酚及油的含量分别为：2208．8mg／L、57．5mg／L、97．59mg／L的炼油废水。经过12h后，苯酚的去除率达到100％；在2．5d时，COD及油的去除率分别达N97．52％和96．86％。(4)木屑固定化白腐真菌处理起始COD浓度为163．68meCL的河水经过2．5d的处理，COD去除率为85．04％。经过20h的处理，原水中钠的含量从起始的5485．92mg／L降解为1221．64mg／L，钙的含量从起始的373．29mg／L降解为104．17mg／L，铅的从起始的3．73mg／L降解为0．16mg／L，去除率分别为77．8％、72．1％和95．8％，对于铜的去除效果不是很明显。59u￡∞寄JIⅢ，、oEo忙盟奇∞n5结论硕J：论文论文从白腐真菌的培养问题入手，以固定化白腐真菌及其在废水处理中的应用为主要研究对象，研究了培养条件和几种微量元素对白腐真菌生长及其降解苯酚的影响，并重点研究了白腐真菌的固定化以及固定化白腐真菌在几种实际废水处理中的应用，得到以下主要结论：(1)基础培养基中白腐真菌经过5—7天的平皿培养后且呈绒毛状，菌丝铺满整个培养皿；液体振荡培养时，最适宜生长条件选择pH为5，摇床转速为120r／min，温度为30℃，氮元素最佳投入量为无机氮0．8g／L，有机氮0．03∥L；于此同时，当投加的铜元素、锰元素及Tween80的量分别O．5mmol／L、0．1mmol／L、0．03mmol／L时对白腐真菌的生长有明显促进作用且缩短其生长周期，加入铁元素时作用不明显。(2)摇床实验中，当培养条件选择pH为5、温度为30"0、摇床转速为120r／min时白腐真菌对苯酚的降解效果最佳，与此同时加入一定的微量元素铜、锰及Tween80对白腐真菌降解苯酚有明显的促进作用，相比之下铁的促进作用并不显著。白腐真菌降解苯酚各种微量元素的最佳浓度分别为：无机氮0．19／L；有机氮0．03g／L；铁0．5mmol／L；锰1．0mmol／L：铜O．3mmol／L；Tween80为0．01mmol／L。(3)吸附固定化中将载体直接加入接种了白腐真菌的培养基时的固定化的效果优于将载体加入已培养好的白腐真菌悬浊液之中；在固定化载体得选择上以木屑、丝瓜囊为最佳载体；不同体积载体对苯酚去除率的影响不是很显著，但是在COD去除率上花生壳的效果明显优于花生壳粉末。(4)包埋固定化中以将白腐真菌菌丝、PVA溶液和海藻酸钠溶液均匀混合而成的混合液滴入硝酸钙溶液中交联得到的小球效果最佳；组合固定化最佳条件为：硝酸钙的浓度取2％、小球直径取3mm、交联时间取4h、已吸附真菌的投加量取59，所得固定化颗粒最佳的活化pH为5；各种不同的形态白腐真菌处理废水时以吸附法效果最佳。(5)木屑固定化白腐真菌处理焦化废水，经过3d，COD和苯酚的去除率分别为88．89％、72．38％；丝瓜囊固定化白腐真菌处理苯胺废水，经过4d，COD去除率达84．1％；木屑固定化白腐真菌处理炼油废水，经过12h，苯酚的去除率达到100％；在2．5d时，COD及油的去除率分别达到97．52％和96．86％。木屑固定化白腐真菌处理河水，经过2．5d，COD去除率为85．04％，经过20h的处理，原水中钠、钙、铅的去除率分别为77．8％、72．1％和95．8％，对于铜的去除效果不是很明显。n硕f：论文白腐真菌的固定化及其在废水处理中的应用致谢本论文是在我的导师严莲荷研究员和周申范教授的悉心和耐心指导下完成的，老师们渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远，永远值得我学习，这也将激励和鞭策我在以后的工作和学习中不断进取，追求新的奋斗目标，在此我衷心的感谢这两位老师的指导和帮助。与此同时，在攻读硕士期间，王瑛副研究给予了我很大帮助，在此特别表示感谢。衷心的祝愿三位老师在今后的同子罩身体健康、一帆风顺。感谢南京理工大学水处理研究所的全体老师，感谢本实验室的卢永、王巧林、姜怡勤、李兵、罗成燕、周鹏、臧学章、谈晖、殷智超等各位同学，感谢他们在实验过程中给予我的建议和帮助，本文的顺利完成与他们的积极配合是密不可分的。感谢我的同门，谢谢你们给予我的帮助!感谢我的家人——我的父母、弟弟。没有你们，就不会有今天的我!我一直感恩，感恩于我可以拥有一个如此温馨的家庭，让我所有的一切都可以在你们这里得到理解与支持，使我能够iliON完成学业。我爱你们，爱我的家!感谢和我一起生活两年的室友，感谢我的朋友，感谢你们在我失意时给我鼓励，在失落时给我支持，感谢你们和我一路走来，让我在此过程中倍感温暖!感谢评阅、评议硕士学位论文和出席硕士学位论文答辩会的各位专家、教授，感谢他们在百忙之中给予的指导。61n参考文献硕J?论文【1】李慧蓉．白腐真菌在碳素循环中的地位和作用．微生物学通报，1996，23(2)：105·109『21李慧蓉．白腐真菌生物学和生物技术．北京：化学工业出版社，2005：25．71【3】刘玲．白腐真菌及其木质素酶的研究进展．饲料工业，2006，27(8)：21．28【4】ZhenZ，YuJ．StressesonimmobilizedPhanerochaetechrysosporiumhyphaeinsubmergedculturesforligninaseproduction．CanJChemEng，1998，76：784—789【5】YoungL，Yu．Ligninase-catalyzeddecolorizationsyntheticdyes．WaterRes，1997，31：1187．193【6】MunozC，GuilenF，MartinezAT，eta1．LaccaseisoenzymesofPleurotuseryngii：characterization，catalyticproperties，andparticipationinactivationofmolecularoxygenandMn肘oxidation．ApplEnvironMicrobiol，1997，63：2166—2174【7】CoutoSR，GundinM，LorenzoM，SanromanMA．ScreeningofsupportsandinducersforlaccaseproductionbyTrametesversivolorinsemi-solid—stateconditions．ProcessBiochemistry,2002，38：249-255【8】AroraDS，GillPK．Effectsofvariousmediaandsupplementsonlaccaseproductionbysomewhiterotfungi．BioresourceTechnology,2001，77：89—91【9】EggertC，TempU，ErikssonK-EL．TheligninolyticsystemofthewhiterotfungusPycnoporuscinnabarinus：purificationandcharacterizationofthelaccase．ApplEnvironMicrobi01．，1996，62：1151-1158【10】LorenzoM，MoldesD，RodriguezCoutoS，eta1．ImprovinglaccaseproductionbyemployingdifferentlignocellulosicwastesinsubmergedculturesofTrametesversiocolor．BioresourceTechnology,2002，82：109—113【11】PalmieriGGiardinaP，BiancoC．CopperinductionoflaccaseisoenzymesintheligninolyticfungusPleurotusostreatus．Appl．Environ．Microbiol，2000，66：920—924【12】康从宝，刘巧，李清心，等．白腐真菌产漆酶的纯化及部分酶学性质．中国生物化学与分子生物学报，2002，18(5)：638．642【13】胡道伟，付时雨．漆酶催化活性中心结构及其特性研究进展．林产化学与工业，2001，21(3)：69·75【14】高大文，文湘华，周晓燕，等．微量元素对白腐真菌的生长影响的抑制酵母菌效果的研究．环境科学，2006，27(8)：1623．1626【15】李翠珍，文湘华．白腐真菌F2的生长及产木质素降解酶特性的研究．环境科学学报，2005，25(2)：226．230n硕．1j论文自腐真菌的用定化及j￡在废水处理中的应用【16】KaalEEl，FieldJA,JoyceTW．Increasingligninolyticenzymeactivitiesinseveralwhite—rotbasidiomycetesbyN—sufficientmedia．BioresTeclm01．，1995，53：133．139【17】BuswellJA,CaiYJ，ChangST．EffectofnutrientNandmanganeseonmanganeseperoxidaseandlaccaseproductionbyLentinula(Lentinus)edodes．FEMSMicrobiolLett．，1995，128：81-88【18】刘祖同，罗信昌．食用覃菌生物技术及应用．北京：清华大学出版社，2002【19】ArdonO，KeremZ，HadarYEnhancememtoflaccaseactivityinliquidculturesoftheligninolyticfungusPleurotusostreatusbycittonstalkextract．Biotechnol，1996，51：201-207【20】AroraDS，GillPK．Laccaseproductionbysomewhiterotfungiunderdifferentnutritionalconditions．BioresourceTechnology,2000，73：283-285【21】GalhaupC，WagnerH，HinterstoisserB，eta1．Increasedproductionoflaccasebythewood—degradingbasidiomyceteTrametespubescens．EnzymeandMicrobioalTechnology,2002，30：529-536一【22】郭梅，蒲军，梁鹏，等．白腐菌产漆酶发酵条件的优化．食品研究与开发，2006，27(6)：9—12【23】PickardMA，RomanR，TinocoR，eta1．PolycyclicaromatichydrocarbonmetabolismbywhiterotfungiandoxidationbyCoeiolopslsgallicaUAMH8260laccase．ApplEnvironMicrobiol，1999，65：3805—3809【24】CharlesJ，GudrunKDietmarS．Potentialofaquaticfungiderivedfromdiversefreshwaterenvironmentstodecolourisesyntheticazoandanthraquinonedyes．BioresourceTechnology,2008，99(5)：1225·1235【25】KimTH，LeeYYangJ．Decolorizationofdyesolutionsbyamembranebioreactor(MBR)usingwhite—rotfungi．Desalination，2004，168：287—293【26】寇晓芳，安立超，左志芳，等．白腐真菌一活性污泥联用降解染料废水．精细化工，2007，24(5)：500·503【27】金敏，李君文．白腐菌处理染料废水的研究进展．环境污染治理技术与设备，2003，4(3)：54-58【28】KimSJ，IshikawaKHiraiM，eta1．Characteristicsofanewlyisolatedfungus，GeotrichumcandidumDec1，whichdecolorizesvariousdyes．JournalofFermentationandBioengineering，1995，79：601-607【29】吴涓，肖亚中，王怡平．白腐真菌处理狄法造纸黑液废水的研究．生物学杂志，2002，19(5)：17·19【30】高航，徐宏勇，刘勇弟．白腐菌附着式生物膜反应器处理垃圾渗沥液技术研究．环境科学学报，2004，24(2)：309．31463n参考文献硕I：论义【31】夏邦权，吴学风．白腐真菌处理煤泥水的实验研究．中国煤炭，2006，32(8)：62．64【32】何德文，肖羽堂，周申范．白腐真菌处理难生物降解的有机废水研究．工业水处理，2000，20(3)：16—18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