降油及产絮凝剂的微生物菌群培养和废水处理特性研究 70页

摘要摘要本课题构建出具有同时产絮凝剂和降油功能的复合菌群(JJDF6+QSHDF4+JJY2)，并应用于石化废水的处理，得到了较好的处理效果。以蜂蜜废水和氨厂尿素生产废水代替通用发酵培养基中的碳源与氮源进行产絮凝剂实验，结果表明，完全可以用蜂蜜废水与尿素生产废水替代碳源与氮源，降低培养成本，实现以废治废。通过正交实验和方差分析，得到菌群产絮凝剂的优化培养条件是：分别接种1．5mlJJDF6、1．5mlQSHDF4和1．5mlJJY2种子液至50ml替碳替氮含油发酵培养基，调节pH为10．0，30"C、160rpm条件下摇床培养72h。在该优化条件下，所产MBF的絮凝率E5为92．2l％。油降解率的优化培养条件为：将1．5ml的JJDF6种子液、1．5mlQSHDF4种子液和1．5mlJJY2的种子液将种至50“替碳替氮含油发酵培养基，调pH为10．0，30"C、160rpm条件下摇床培养72h。在该优化条件下，油去除率为91．18％。对复合菌群所产MBF进行提纯固化，产率为15g(絮凝剂)／L(发酵液)。定性分析试验表明，其主要成分为多糖类物质。参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》及《真菌鉴定手册》，初步判断QSHDF4为短杆菌属，JJY2为奈瑟氏球菌属，JJDF6为酵母属。最佳去除CODcr工艺为：投加1．5mlMBF、5．0mll％CaCl2于100ml石化废水中，调节pH值至10．0，摇匀后静置10rain。在该优化条件下，CODc，去除率可达71．52％。最佳去除浊度工艺为：投加1．5mlMBF、5．0ml1％CaCl2于100ml石化废水中，调节pH值调至10．0，摇匀后静置10min。在该优化条件下，浊度去除率达77．85％。复合菌群所产MBF处理石化废水，去除CODcf和去除浊度的动力学方程分别为：ct=Co(1一虿磊iij百两五)‘mg／L’和G=co‘1一三i百蒜’(A)。复合菌群降油率为91．18％时，动力学方程为Ct=Coem033瓤(rag／L)。关键词：复合菌群：降解；微生物絮凝剂：替代培养基；石化废水n摘要ABSTRACTInthisstudy,multiplemicroorganismswhichcanproduceMBFanddegradeoilareconstructedwithstrainsJJDF6、QSHDF4andJJY2．whenapplicatedtothepetrochemicalwastewatertreatment，ithasgoodperformance．SubstituteculturemediumwhichusehoneyandcarbamidewastewatertoreplacethecarbonandnitrogensourceWaSstudiedinthispaper．Theresultshowthatit’SaeffectwaytoreducethecostofMBFproductionandaidealwaytomakegooduseofwaSte．TheoptimalcultivatingconditionforMBFproductionislistedasfollowing：1．5mlgermsolutionofeachstrain。pill0．0，30"C、160rpmand72h．underthissituation，theflocculatingactivityCallreach92．21％，theremovalrateofoiliS91．18％．theoptimaloildegradingconditionarethesamewiththebestcultivatingconditionofMBFproductionexceptthepHandrotatespeed．foroildegradation，thebestpHandrotatespeedare：pill0．0，160rpm．TheproductivityofthepartiallypurifiedMBFis15gramperliterfermentationsolution．．themaincompoinentarepolysaccharide．Accordingto{Bergey’SManualofDeterminativeBacteriology))and《ManualofDeterminativemycology》，wecanmaketheprimarilyidentification，theresultare：QSHDF4isBrevibacterlamBreed，JJY2isNeisseriaTrenisanandJJDF6pertainstoSaccharomyces。TheMBFproducedbymultiplemicroorganismsexcelsattreatingpetrochemicalwastewater．theoptimalconditiongofremlvalCOD“are：1，5mlMBF,5．0ml1％CaCl2to100mlpetrochemicalwastewater,thenadjustthepHto10．0andsettlefor10minuteafterstired．underthissituation，theremovalrateCanreach71．52％．astoturbiddegree．thebestCOnditionare：1．5mlMBF,5．0mIl％CaCl2to100mlpetrochemicalwastewater,pHl0，0，．tenminuteafterstired,themaxturbiddegreeremovalrateiS77．85％．ThekineticequationofCOD“andturbiddegreeremovalare：ct=[．o(1一虿磊i靠)‘mg／L’和ct=Co(1一三聂西蒜’(A)aRespectively．theoildegradationkineticequationisCt=C。e’00333‘(mg／L)。KeyWords：multiplemicroorganisms；degradation；microbialflocculants；substitutesubstrate；petrochemicalwastewaterIIn前言刖吾长期以来，在制药、食品、化工等水处理中使用的絮凝剂主要是化学絮凝剂，大致有两大类：以铝系和铁系混凝剂为代表的无机高分子类和以聚丙烯酰胺为代表的合成有机高分子絮凝剂，但这些化学絮凝剂往往对人体有害。如铝盐具有毒性和不良环境效应(如诱发老年痴呆症、易使材料腐蚀)，铁盐会造成处理水中带颜色，高浓度的铁也会对人类健康和生态环境产生不利影响；聚丙烯酰胺的单体具有神经毒性和“三致”效应(致突变、致畸、致癌)。因此，开发研制价廉、高效无毒的新型微生物絮凝剂十分重要。微生物絮凝剂(microbialflocculant或bioflocculant，简称MBF)是一种高效、无毒、使用范围广、对环境不产生二次污染的新一代絮凝剂。它是通过直接利用微生物细胞、细胞提取物或代谢产物，发酵、提取、精制而得到的有絮凝活性的物质。产生微生物絮凝剂的微生物资源极为丰富，获得的方法也较简单，成本低廉，这些是目前使用的无机或有机合成高分子絮凝剂所不具备的。由于微生物絮凝剂的优点非常突出，其研制和应用近年来一直是水处理领域的热点。以往，研究人员多集中于单一菌株的分离、培养及应用的研究，使得研究进展缓慢，制备成本偏高，且工业应用状况不理想。近两年来，研究人员在筛选新的高效絮凝剂的同时，也在寻找新的途径，开发新型微生物絮凝剂，使其能更符合工业化大规模生产的需要，并且能在水处理领域实际应用中效率更高，受环境变化影响更小。目前，国内有不少大学和研究机构纷纷把新型微生物絮凝剂的研发作为今后科研的一个重点方向，研制应用前景看好的新型微生物絮凝剂。新的研究领域包括复合型生物絮凝剂的研制，微生物絮凝剂与其它絮凝剂的复配，微生物絮凝剂的生物学研究及微生物絮凝剂的替代培养基研究等。微生物产生絮凝剂所用的培养基价格昂贵，难以进行大规模的工业化生产。因此，本课题在如何构建具有产絮凝剂和降油的多功能复合菌群，以及利用蜂蜜废水和氨厂尿素生产废水替代培养基产絮凝剂等方面进行了大量的研究，并将所产絮凝剂应用于石化废水处理，为微生物絮凝剂资源的应用与开发提供了有价值的参考。n学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：割、挪签字日期：2彻7年f月题自学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解壹璺叁鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌太学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：铡、娜签字日期：姗年6月心日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：新躲肥签字日期。≯刀7年6月，日电话：邮编：n第1章文献综述1．1引言随着科学技术的发展和人类生活水平的提高，人们对水质提出了越来越高的要求，这自然就推动了水处理技术和水处理絮凝剂的飞速发展。在当今，水处理技术发展日新月异，其中絮凝沉淀法因成本较低、处理效果较好而在水处理中得到了日益广泛的应用。絮凝处理是通过向待处理的水体中加入絮凝剂，使水体中胶体体系在絮凝剂作用下，相互接触、碰撞、脱稳、凝集成一定粒径的聚集体，并进一步通过碰撞、网捕卷扫、共同沉淀等作用聚集成较大絮状沉淀而沉淀下来，达到固液分离的目的，其主要是去除废水中的胶体和悬浮体，同时也能有效地去除一些溶解性的杂质【l】。在人类文明的发展史上，最早使用絮凝剂处理水的历史追溯到古埃及人采用甜扁桃汁净化饮用水，我国明朝时也有用明矾[A12(S04)rK2S04-24H20】净水的记录。1884年，美国人海征特取得了以硫酸铝预处理滤池水的专利权。1872～1887年，氧化铁盐被推广应用，并在1887年取得对预分离出氢氧化铁沉渣的箱形过滤装置的专利。此后絮凝剂逐渐应用于污水处理中，1912年开始用氯化硫酸亚铁作为絮凝剂，1929年开始用铝酸钠，20世纪50年代开始采用氯化铝。近年来絮凝剂广泛用于工业和生活污水和沉渣的处理，应用范围不断扩大。由于絮凝在水处理中的重要作用，絮凝日渐发展成为一门重要的技术，围绕絮凝剂的制各、优化及使用的研究不断深入。从最早使用天然絮凝剂到初级合成絮凝剂如FeS04·7H20、AICl3及硅系列絮凝剂，再到现今的高聚合类絮凝剂如聚合氯化铝(PAC)、聚合硫酸铁(PFS)、聚硅硫酸铝(PASS)和聚丙烯酰胺(PAM)等以及生物絮凝剂，人类使用絮凝剂的过程经历了一个从天然到合成，再到天然的循环过程【7'8】。在絮凝沉淀工艺中，絮凝剂是一个决定性的因素，其好坏直接决定了该工艺的处理效果。目前常用絮凝剂主要有无机絮凝剂、人工合成有机高分子絮凝剂和天然高分子絮凝剂三大类【21。虽然前两类絮凝剂在絮凝活性方面及经济方面有许多优点，但是在安全性和对环境的二次污染等方面存在自身难以克服的缺陷。已有研究表明饮用铝盐浓度较高的饮用水的人，患老年痴呆症的较多[31；聚丙烯n第1章文献综述酰胺等人工合成有机高分子絮凝剂有的并无毒性，但是合成它们的单体往往具有强烈的神经毒性和“三致效应”f致畸、致突变、致癌)，导致这些絮凝剂的应用受到了很大的限制【4】。因此开发高效、无毒、无二次污染的絮凝剂迫在眉睫。微生物絮凝削是一种天然生物高分子絮凝剂，对人体无害，可以被生物降解【”。它是一类由微生物产生的有絮凝活性的代谢产物，有糖蛋白、粘多糖、蛋白质、纤维素和DNA等。微生物絮凝剂具有两大特点：一是不存在二次污染，使用安全、方便、应用条件粗放、絮凝效果好；二是来源广，能产生絮凝剂的微生物种类多，生长快，价格低廉，易于采取生物工程手段实现产业化。因此，微生物絮凝剂的开发和应用引起人们关注，应用前景极为广阔【6】。1．2微生物絮凝剂的研究概况LouisPasteur(1876)最早报道了酵母菌能产生絮凝【9】的现象，两年以后，有科学家发现也有细菌具有同样的作用。而自从美国科学家Butterfieml935年)最早从活性污泥中筛选到絮凝剂产生菌以来，人们开始对微生物絮凝剂逐渐进行了越来越深入的研究，在絮凝条件、机理、产絮凝剂的基因控制、絮凝剂的纯化、性质及应用等方面进行了一系列的研究工作，其中日本在这方面的研究工作成效尤其显著【10-20]。国外关于微生物絮凝剂产品的报道最多的主要是：J．Nakamuara等人以酱油曲霉AJ7002(Aspergillus)为原料生产的AJ7002微生物絮凝剂【2l，22l；H．Takagi拟青霉素(Paecilomycessp．I．1)微生物生产的PFl01絮凝剂，对枯草杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母、血红细胞、活性污泥、纤维素粉、活性炭、硅藻土、氧化铝等有良好的絮凝效果田241：R．Kurane等人利用红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)微生物生产的NOc一1絮凝剂，对大肠杆菌、酵母泥浆水、粉煤水、活性炭粉水、膨胀污泥、纸浆废水、畜产废水等均有极好的絮凝和脱色效果[2526]。美国、日本、英国、法国、德国，前苏联、芬兰、葡萄牙、以色列、韩国都对微生物絮凝剂进行了大量的研究，并取得了一些相应的研究成果【嘲。我国在微生物絮凝剂研究和应用上与国外相比有很大差距，据已有的文献报道，我国在微生物絮凝剂的研究尚处于实验室阶段。见诸报道的有陆茂林所在的江苏微生物研究所从土壤和污泥中筛选出两株絮凝活性较高的诺卡氏菌，并对其适宜培养基，培养时间和培养液pH变化与絮凝活性之间的关系进行了研2n第1章文献综述究【27l：张本兰从活性污泥中筛选到絮凝活性较高的微生物絮凝剂菌株(P．alcaligenes8724)用于处理造纸黑液和氯霉素等有机废水【281；李智良所在的中国科学院成都生物研究所用常规的细菌分离纯化方法从废水、土壤、活性污泥中分离筛选到6株絮凝剂产生菌，用其发酵离心上清液对造纸黑液、皮革废水、偶氮染料废水、硫化染料废水、电镀废水、彩印制板废水、石油化工废水、造币废水及蓝黑水、碳素墨水等进行絮凝试验的结果表明，废水固液分离效果良好，CODc，去除率在55％～98％，悬浮物、色度、浊度去除率均在90％以上【29】；王镇等筛选出絮凝活性较高的四株菌(SporolactobacillusGC3；ArthrobaeterSB6,PseudomonasSB8；AeromonasGC24)p01；黄民生等从污水处理厂的回流污泥中分离筛选出3株絮凝剂产生菌，该菌株所产培养液可使土壤悬液浊度去除率达99％以上，使碱性染料废水CODc，去除率为70％左右，色度去除率为92％左右pl-361；东北大学的邓述波等从土壤中分离筛选得到一株能产生高效微生物絮凝剂的芽孢杆菌A9。絮凝实验结果表明，用MBFA9处理高岭土悬浮液，效果明显优于其他种类MBF，且不需添加ca2+及Al”等助凝剂，用量也仅为一般MBF用量的1，10～1，loo：处理含泥河水、硫化染料废水、淀粉厂黄浆废水，悬浮物及CODc，的去除率明显高于聚丙烯酰胺等传统的化学絮凝剂p⋯。最近，南昌大学的张志强利用复合菌群所产的絮凝剂应用于处理靛蓝印染废水，获得同时降低CODc,和脱色的良好效果，为微生物絮凝剂的应用提供了有价值的参考p”。总之，目前国内对微生物絮凝剂的研究，大多处在菌种筛选和菌株培养液对废水处理的实验室小试阶段，培养基多以葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、淀粉等作为有机碳源，以酵母浸出汁、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白氨基酸等作为有机氮源，存在培养基成本高的缺点。要使微生物絮凝剂在我国真正地应用于水处理，还需要进行大量的、进一步的试验和研究。1．3微生物絮凝剂产生菌1．3．1微生物絮凝剂产生菌的种类能够产生絮凝剂的微生物称为絮凝性微生物。迄今已发现的絮凝性微生物多达25种以上。它们分布于细菌、放线菌、霉菌和酵母菌之中f381，目前已报道的部分絮凝剂产生菌如表1．1所示[39．40I。3n第1章文献综述细菌RhodococcuserythroPolisNocardiacalcarcaNocardiarhodniiNoeardiarestrieaCOrvnebacteri啪AlcaligeneslalasAgrobacteriumsP．0erskcoviasEPseudomonassP．AcinetobaetersP．DematitimsP．CorynebactedumFlavobaetedumEnterobactersP．AnabaenasP．SPorolactobaecillussP．Mycobaeterium红平红球菌石灰壤诺卡氏菌红色诺卡菌椿象虫诺卡氏菌捧状杆菌协腹产碱杆菌土壤杆菌属厄氏菌属假单胞菌属不动菌属暗色抱属裂烃棒状杆菌产黄菌属肠杆菌属项圈藻芽抱乳杆菌属分枝杆菌属Bcillusmegaterium巨大芽孢杆菌1．3．2微生物絮凝剂产生菌的分离、筛选目前国内外研究所采用的絮凝微生物种群主要通过以下三方面途径获得；来自天然土壤和沉积物；来自活性污泥；直接购买能产生絮凝剂的纯种微生物菌株。从天然土壤或活性污泥中获得产絮凝剂菌株一般采用的方法是[37l：以普通细菌培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)作为分离培养基，通过稀释法和平板划线法多次分离至获得纯种。将纯化菌株接种至筛选培养基中，根据培养液的絮凝活性筛选出絮凝剂产生菌，然后再对这些菌株的特性进行研究。总的筛选模式为：样品采集及预处理一菌株的分离纯化一浅层发酵培养一絮凝剂的提取一絮凝活性检测一菌种取舍(初筛、复筛)一菌种鉴定一各菌株絮凝活性的遗传稳定性检验一实际废水4n第l章文献综述用于微生物絮凝剂的效果验证14卜50l。1．3．3微生物絮凝剂的絮凝机理及影响因素1．3．3．1微生物絮凝剂的絮凝机理目前对微生物絮凝剂絮凝机理的研究较多集中在用经典的絮凝机理来对其进行解释。较为流行的是吸附架桥理论，即吸附在某个微粒表面的线性生物分子长链可能同时吸附在另一个微粒表面上，絮凝剂大分子通过借助离子键、氢键和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒，在颗粒间产生架桥现象，从而形成一种网状三维结构沉淀下来。图1．1是根据吸附架桥理论绘制的絮凝机理示意图。该理论可以解释大多数微生物絮凝剂引起的絮凝现象【51。5们。?+。搴孑+孑竺絮擞莉裟詈：篙梨鬣絮凝沉淀图1．1絮凝机理示意图此外，还有电中和作用，卷扫作用等经典絮凝理论，以及粘质假说、Grabtree的醋合假说、Friedman的菌体外纤维素纤丝学说、荚膜学说、疏水学说等15”。1．3．3．2絮凝效果影响因素影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素有很多，包括絮凝剂本身的性质，并与外界环境密切相关。一般来说，主要的影响因素微生物絮凝剂本身特性、絮凝剂的投加量、温度、pH值、金属离子的种类及其投加量等。(1)微生物絮凝剂本身特性的影响【57】微生物絮凝剂的主要成分中含有亲水的活性基团，如氨基、羧基等，故其絮凝机理与有机高分子絮凝剂(利用其线性分子的特点起到一种粘接架桥作用而使颗粒絮凝)相同。其絮凝效果会受分子形状、分子量等因素影响。一般说来，线形结构有利于絮凝，如果分子结构是交联的或支链结构，其絮凝效果就差；分子量越大，絮凝剂活性就越高。(2)絮凝剂的投加量对絮凝能力的影响【571一般，絮凝剂都有一个最佳投加量，投加量过多过少都会导致絮凝效果下5n第1章文献综述降。据分析，最佳投加量大约是固体颗粒表面吸附的大分子化合物达到饱和时一半的吸附量，此时大分子在固体颗粒上架桥机率最高。如果絮凝剂加入量过多，一开始微粒就被若干个高分子链包围，微粒再没有空白部位去吸附其它的高分子链，结果形成无吸附部位的稳定颗粒。f3)温度对絮凝能力的影响【5驯温度对一些微生物絮凝剂的絮凝活性有较大影响。主要是因为这些絮凝剂的蛋白质成分因高温变性而丧失部分絮凝活性。所以由多聚糖构成的絮凝剂就不受温度的影响。例如，Aspergillussajae产生的絮凝剂在温度为30～80℃时，活性最大，高于或低于这个温度活性便迅速下降，Rhodococcuserythropolis产生的絮凝剂在100℃的水中加热15分钟后，其絮凝活性下降50％，而Paecilomycessp．产生的聚半乳糖胺絮凝剂在0～100℃之间时，絮凝活性几乎不变。(4)溶液的pH值对絮凝能力的影响1591由于DH值影响胶体颗粒表面电荷，从而影响他们之间的吸附行为。不同絮凝剂pH值的变化敏感程度不同。如真菌Paecilomyeessp．产生的絮凝剂聚半乳糖胺，在pH为4～7．5时，絮凝活性最强，当pH值为3或8时，絮凝活性急剧下降。AspergillussojaePseudomonasaeruginose，StapHylococcusaureus，Corynbaeteriumbrevicale，Streptomycesvinaceus在pH值为3～5时表现出絮凝活性，但当pH为7～9时丧失絮凝活性，原因是高pH值使酵母细胞表面的带电量减少。(5)金属离子的种类及其投加量对絮凝能力的影响有些微生物絮凝剂中含有金属离子，金属离子可以加强生物絮凝剂的桥联作用和中和作用，对微生物絮凝剂的絮凝活性有着重要意义，甚至是必需的条件。即使对于不含有金属离子的微生物絮凝剂，添加一些金属离子也能够提高絮凝活性。容易受金属阳离子影响的多数是蛋白质(多肽)型的微生物絮凝剂。例如，H．anomala的絮凝和非絮凝菌株其细胞壁的脂肪酸和氨基酸的组分与含量虽无较大差别，但其金属离子含量有着极大的差异，前者ca”、M92+和Na+的含量远比后者高。各种离子在絮凝剂中的作用目前得到较为深入的研究。具体来说，Ca2+的作用：ca2+可以显著提高微生物絮凝剂的活性【鲫，对于一些微生物来说，形成絮凝体必须有二价钙离子的参与，但对另一些微生物却不是这样。一般认为，钙离子的作用是起化学桥联作用，在絮凝微生物细胞之间联结细胞表面的蛋白质和多糖。Mf+的作用：添加M92+也能够提高微生物絮凝剂的活性，6n第1章文献综述但关于镁离子的作用，一些研究者根据各自的研究结果得出的结论并不一致【61韶l。Na+的作用：Na+可以增加絮凝剂的活性，但达到一定浓度后，再提高Na+的浓度对增加絮凝活性的意义不大。除上述3种金属离子之外，Fe3+和A1”对絮凝活性也有作用。但这两种离子在低浓度时可以提高微生物絮凝剂的活性，达到一定浓度后，反而会抑制絮凝物的形成。各种金属离子对于絮凝机理不同的微生物絮凝剂的影响不一致。对K．marxianus产生的絮凝剂来说，ca2+，C02+，Mn2+，SP和M92+以及三价离子ce3+、舢3+的效应基本是相似的，都能促进絮凝，但均不如Fe2+和sn2+。而对于S．eerevisiae，ce3+不能促进絮凝，而A13+仍能很好地提高絮凝效果。二价离子中的ca2+，C02+，Mn2+，Ve2+和M92+能够有效地加快絮凝，而S112+和SP的效果较差。铁离子和碳酸根离子对Paecilomycessp．产生的絮凝剂的活性有一定的抑制作用f6】。1．4利用废弃物作为替代培养基目前各种絮凝剂产生菌大都是在实验室中以葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、淀粉等作为有机碳源，以酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白氨基酸等作为有机氮源的，存在着培养成本高的缺点。因此，开发廉价的代用品，甚至是高浓度的有机废物，作为絮凝剂产生菌的碳源和氮源以降低微生物絮凝剂的生产成本，具有重要的意义畔-69]。1．4．1秸秆、稻草等农业废弃物这种底物具有来源广泛，价格低廉，没有毒性的特点，它不仅能为后期絮凝剂的生长提供营养，而且本身具有一定的絮凝性，可对絮凝处理起到促进作[571。复合型生物絮凝剂的培养便是采用了这种生物材料。1．4．2鱼粉废水大连理工大学的周旭等人在培育假单胞菌(Pseudomonasspl)时，利用鱼粉废水生产出了性能良好的微生物絮凝剂PSD21。据报道该絮凝剂低温储存325天内活性稳定。在pH为12时，废水中加热30min后，活性下降不多J50％。经有机溶剂提取、冻干后获得的絮凝剂干粉活性恢复率可高达99％～66％t701。这说明利用鱼粉废水作替代培养基是可行的。7n第1章文献综述1．4．3氨化合的甘蔗渣【ABG)和鸡毛(GCF)与氨化合了的甘蔗渣(ABG)和鸡毛(GCF)，不仅能为微生物提供能源，而且能提供附加底物。由于甘蔗渣和鸡毛的廉价易得，因此如果能把它们与微生物絮凝剂共同开发，就会在提高絮凝性能的同时大幅度降低成本，为其工业化生产开辟道路【71l。1．4．4豆饼、水产废水和牛血在NOC21的培养基中，使用豆饼、水产废水和牛血取代酵母浸膏，结果培养基的价格下降了2／3以上，但其中的牛血浓度对絮凝剂产量影响较大【721。也有文献报道使用黄豆汁替代酵母膏以及添加M矿+可以提高微生物絮凝剂的絮凝效果【731。1．4．5国外关于替代培养基的研究在Kurane，R的研究中，解烃棒杆菌(Corynebacteriumhydrocarboclastus)采用了煤油为底物产生絮凝剂【74I。而红平红球菌(Nocardiaerythropolis)可以在降解与塑料生产有关的酞酸酯的同时，产生絮凝剂【751。在Kurane对红平红球菌的优化培养中，他选用了自然界广泛存在的乙醇1761、米糠、鱼肉和葵花籽粉作为培养基的替代成分，大大降低了生产成本【771。Kurane还用啤酒制造中大量产生的麦芽根作为NOC21的有机氮源，结果发现絮凝活性显著提高，研究还发现该絮凝剂的絮凝对象范围广泛，可絮凝活性污泥等有机物质、高岭土等无机物质及可溶性着色物质等，并且麦芽根还可以与其他有机氮源(如大豆粉、大豆渣、玉米面等)一起使用【78】。另外，生产罐头食品的废弃物及酿酒的酒渣可以作为培养基中廉价的碳源【791。南昌大学张志强的研究表明，啤酒废水完全可以取代葡萄糖作为其构建的絮凝剂产生菌群的碳源和能源I”1。同时，南昌大学的李昌花也成功的利用牛奶废水替代氮源进行了研究【801。1．5微生物絮凝剂处理废水的研究从目前国内外对微生物絮凝剂应用范围的研究看，与有机或无机合成高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂不仅可以替代传统絮凝剂用于给水处理，或者用于医药、食品加工和发酵等行业的固液分离，而且在高浓度难降解废水的除浊、8n第1章文献综述除重金属、脱色和除油等方面也表现出相当的优势。1．5．1畜产废水的处理。射I畜产废水是含COD较高的难处理有机废水，采用合成有机絮凝剂迸行处理虽然有较好的效果，但存在二次污染。猪粪尿废水采用NOC．1JJtlCa2+处理lOmin后，废水的上清液变成几乎透明的液体，废水中的TOC处理前的8200mg／L变为2980mg／L，去除率达63．7％，OD660由处理前的15．7变为0．86，浊度去除率94．5％。1．5．2可消除污泥膨胀182l不少工业废水在采用活性污泥处理过程中．形成的活性污泥容易发生膨胀，从而影响处理效率。若添加微生物絮凝剂，会取得良好效果。如甘草制药废水生化处理过程中形成的膨胀性污泥，当在其中添加NOC．1微生物絮凝剂后，污泥的污泥体积指数(SVI)很快从290下降到50，消除了污泥的膨胀，恢复了活性污泥的沉降能力。1．5．3去除废水中的浊度含有高悬浮物的建筑材料加工废水是较难处理的一类废水，例如陶瓷厂废水，主要包括胚体废水和釉药废水两种，前者主要含有较多的粘土颗粒，后者除含粘土颗粒外，还有相当数量的釉药。当添加NOC．1处理5min后，胚体废水的OD660从原来的1．4降低到0．043：釉药废水的OD660从17．2下降No．35：浊度去除率分别为96．6％和97．9％，可得到几乎透明的上清液‘831。1．5．4对污泥脱水的作用对污泥进行脱水能够为后续处理创造有利条件。用红乎红球菌培养物2ml和5Inl浓度为1％的Ca2+溶液，处理95ml浓缩后的污泥，可以使污泥体积在20min内浓缩为原来的92％，上清液的OD550值小于O．05tul。1．5．5在废水除油或油水分离中的作用用协腹产碱杆菌培养物可以很容易地将棕榈酸从其乳化液中分离出来。无论是无机絮凝剂还是人工合成高分子絮凝剂从未有过这样好的絮凝效果。这种微生物絮凝剂不仅有望用于乳化液的油水分离，也可为海上溢油的控制提供一9n第1章文献综述种安全有效的絮凝剂f85l。1．5．6在废水脱色中的作用186471现今的活性污泥法技术除去废水中的COD。并非难事，但对于脱色几乎还没有特效的方法，特别是对于那些可溶性色素很难处理，而采用微生物絮凝剂NOC．1，对墨水、糖蜜废水、造纸黑液、颜料废水等进行的试验表明，处理后上清液变为无色透明。辛宝平用EalcaUgenes8724菌株产生的絮凝剂在实验室对纸浆黑液和氯霉素等颜色较深的废水进行脱色处理，其脱色率分别达95％和98％以上。1．5．7处理高浓度有机废水畜产废水是含COD．较高的难处理有机废水，采用合成有机絮凝剂虽然有较好的效果，但存在二次污染。微生物絮凝剂可以有效的去除畜牧废水中的TOCTN[ss]。1．6微生物絮凝剂的发展方向目前微生物絮凝剂的应用还大多停留在实验室研究阶段，真正应用到实际中的不多。尽管如此，微生物絮凝剂仍然具有广阔的应用前景。从目前的研究来看，微生物絮凝剂不仅能去除废水中的SS、COD、BOD和色素，还能对乳浊液中的油水分离、发酵液中菌体分离以及溶液中重金属离子的去除等方面有很好的效果【”J。邓述波[90-91】用微生物絮凝剂MBFA9处理淀粉废水，在有Ca“作为助凝剂时，ss和COD。，的去除率分别达到85．5％和68．5％，其效果要明显优于传统的化学絮凝剂。絮凝剂NU．2瞰】是由海洋粘杆菌Nannocystissp．所产生的，研究发现它对某些染料废液的脱色能力能够达到99*。Flee．MockOh等[931筛选出一株絮凝剂产生菌Paenibacillussp．AM49，其产生的絮凝剂能够有效地用于大规模处理绿藻Chlorellavulgaris，其絮凝率可达到83％，高于硫酸铝和聚丙烯酰胺。AnastasiosI．Zouboulis等1941研究用微生物絮凝剂来去除垃圾填埋场的渗滤液中的腐殖酸，其去除率达到了85％。S．P．voayalakshmit95l用微生物Bacillussubtili作为一种絮凝剂分离精煤，发现菌体细胞能够粘附在煤颗粒的表面并迅速发生沉淀，使煤颗粒从煤浆中分离出来。10n第1章文献综述鉴于目前国内外的研究状况，微生物絮凝剂的主要发展趋势体现在以下几个方面：(1)加大絮凝微生物的筛选力度和范围，从而筛选到更多的高效絮凝微生物。自然界产生絮凝剂的微生物种类很多，但根据目前的方法，筛选到它们是比较困难的，而且效率很低。因此有必要找到一种能够快速准确的筛选微生物絮凝剂产生菌的有效方法，从而筛选出更多的高效絮凝剂产生菌，建立完善的微生物絮凝剂产生菌菌种库嘲。(2)从生产工艺的角度出发，选用廉价的工业废料作为培养基以降低培养基配制成本，建立高效生化反应器，优化培养的运行条件，提高培养基效率，不断探索新工艺新方法，使微生物絮凝剂的生产真正实现产业化水平。例如在NOC．1的培养基中，用水产废水和牛血取代酵母浸膏后，培养基的价格下降了2，3以上晰l；Citrobactersp．TKF04可以用乙酸作为唯一的碳源营养来合成絮凝剂【97】。(3)加强对微生物絮凝剂的物质结构特性、絮凝特性等方面的基础性研究，深入研究微生物絮凝剂的絮凝机理以及它在处理不同水质废水时的共性与特性。拓宽微生物絮凝剂的应用范围，使之能够处理各种不同类型的废水。根据不同的废水水质研制具有针对性的高效微生物絮凝剂或复合絮凝剂，既能明显提高絮凝效果，还可大大降低絮凝剂投加量，从而降低处理成本，这是使微生物絮凝剂实现工业应用的前提【聊。(4)利用现代分子生物学技术获得的高效絮凝基因，通过转基因技术，构建产絮凝剂的高效工程菌，以实现微生物絮凝剂的大规模生产。例如IshidaFujiiK等【981把Saccharomycescerevisiae396．9-6V的基因导入一株无絮凝性的菌株URA3位点上，使其获得了絮凝性((FSC27菌株)，再引入URA3的菌株FSCU-18的絮凝性能及产率比原菌株都好。(5)将微生物絮凝剂拓展到概念更广的生物絮凝剂研究范畴。例如HaxuhikoYokoi[s日l研究发现在厌氧条件下Enterobactersp．BY-29能够同时产生氢和絮凝剂。将酶和激素等促进微生物生长的物质加载到絮凝剂上，实现生化反应与絮凝处理的有机结合，以保证水处理的出水水质的前提下，缩短生化系统启动和废水在生化系统的停留时间。相信在不久的将来，随着对微生物絮凝荆研究的不断深入，微生物絮凝剂将会广泛地应用于工业废水处理、食品生产和发酵等工业中，并将最终取代无n第1章文献综述机絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂。’1．7石油降解菌的研究进展脚I利用微生物对有机污染物的降解作用，可以使污染物在其初始环境中降解。同物理、化学处理方法相比，微生物的生物处理技术具有下列优点：①污染物在原地被降解清除，避免了运输过程中的污染：②处理时间较短；③操作简便，对周围环境干扰少；④较少的处理经费，仅为传统的化学物理方法的30％～50％；⑤人类直接暴露在这些污染物下的机会较少；⑥不产生二次污染，遗留问题少。微生物处理的最终产物为C02和水，对人类无害。随着人们对环境污染认识的深入，对环境治理的力度越来越大，用传统的物理和化学方法治理石油污染越来越不能满足人们的要求，因此科学工作者不断探求新的治理技术。1965年Jones和Smith利用微生物处理石油，使石油发生了“物理化学”变化，从而诞生了微生物降解法。微生物降解法就是利用微生物来处理含油海水(淡水)和土壤，使其最终完全矿化。由于微生物治理技术费用低、对环境影响小、适用范围广等优点，因此在环境科学界，微生物处理技术被认为比物理和化学处理更具发展前途，它在土壤修复中的应用价值是不町估量的。欧洲各发达国家自20世纪80年代中期就对微生物处理技术进行初步研究，迄今为止，研究领域延伸至包括石油、农药、固体废弃物等对土壤、地下水及海洋污染的治理。国外在开展微生物治理石油污染较早，最早的是美国海洋微生物学家Zobell于1964年用原油和润滑油进行海洋细菌降解石油烃速率的研究。1972年的Deroo和Welmer、1977年的Milner、1979年的Seifert和Moldwan、1987年的MahlonC．Kenicutt、1989年的Scherrer和Mille、1990年Dkpokwasili和Ddokuma及1990年的Peters和Moldoman等都进行了相关的研究。1．7．1石油的化合物组成I瑚I石油中含有数百种化合物，主要由正构烷烃、异构烷烃、环烷烃、芳烃和非烃化合物及沥青质组成。1．7．1．1正构烷烃属饱和烃，在常温常压下，l～4个碳原子(C1～C4)的烷烃为气态，5～16个12n第1章文献综述碳原子(C5～C16)的烷烃为液态，17个碳原子以上(C17+)的高分子烷烃皆呈固态。石油中己鉴定出的正构烷烃有C1～C45，个别报导曾提及见NC60正构烷烃，但大部分正构烷烃碳数=C35。正构烷烃在石油中多数占15．5％(体积)，轻质石油可达30％以上，而重质石油可小于15％，其含量主要取决于生成石油的原始有机质的类型(陆相原油含量多，海相原油含量少)和原油的成熟度(未成熟的石油主要含大分子量的正构烷烃；成熟的石油中主要含中分子量的正构烷烃；降解的石油中主要含中、小分子量的正构烷烃)。1．7．1．2异构烷烃石油中的异构烷烃以=(210为主，且以异戊间二烯烷烃最重要。其特点是在直链上每4个碳原子有一个甲基支链。在沉积物和原油中以植烷、姥蛟烷、姥鱿烷和异十六烷的含量最高。研究和应用最多的是植烷和姥蛟烷。1．7．1．3环烷烃由许多围成环的多个次甲基(．CH2．)组成。组成环的碳原子数可以是大于3的任何数，相应称为三员环，四员环、五员环等。石油中的环烷烃多为五员环或六员环。其含量与成熟度有关：成熟度低的石油中主要含多环烷烃，成熟度高的石油中主要含单或双环烷烃。一般，单、双环占环烷烃的50．5％；三环占环烷烃的20％；四、五环占环烷烃的25％。1．7．1．4芳香烃芳香烃其特征是分子中含有苯环结构，属不饱和烃。根据其结构不同可分为单环、多环、稠环三类芳香烃。单环芳烃是指分子中含有一个苯环的芳香烃，包括苯及其同系物：多环芳烃是指分子中含两个或多个独立苯环的芳香烃；稠环芳香烃是指分子中含两个或多个苯环，彼此之间共用两个相邻碳原子稠合而成的芳香烃。在石油的低沸点馏分中，芳香烃含量较少，且多为单环芳香烃，如苯、甲苯和二甲苯。随沸点升高，芳香烃含量亦增多，除单环芳香烃外，出现双环芳香烃，如联苯。在重质馏分中还可能出现稠环芳香烃，如萘和菲，葸的含量较少。1．7．1．5非烃化合物石油中的非烃化合物主要是含硫、氮、氧三种元素的有机化合物，主要集中在石油的高沸点馏分中。含硫化合物：是最重要的非烃化合物，存在于中、重馏分中。主要有硫醇n第1章文献综述(．SH)、硫化物(．S．)(包括硫醚R．s．R’、环硫醚)、二硫化物(．S．S．)以及噻吩衍生物。此外，还有元素硫、硫化氢。含氮化合物：主要集中在胶质．沥青质中。石油中含氧化合物可分为碱性和中性两大类。碱性含氮化合物主要是吡咯、吲哚、咔唑的同系物及酰胺等。原油中含有具有重要意义的中性含氮化合物，即咔琳化合物，它是石油有机成因的重要生物标志物。含氧化合物：主要有酸性和中性两大类。酸性含氧化合物中有环烷酸、脂肪酸及酚，总称石油酸：中性含氧化合物有醛、酮等。其含量较少。1．7．2石油降解微生物的种类能降解烃的微生物非常多，有100余属，200多个种，分属于细菌、放线菌、霉菌、酵母等【10lI。它们的细胞均含有改变了的脂肪酸组分和较多的核糖体，并常将烃类累积在细胞质膜上，它们也能合成较多的磷脂。一般认为，细菌比真菌、放线菌更能有效地降解原油。降解原油的微生物大量的存在于污染地区，在受油污染的水和底部沉积物中，其数量可达102～106个／ml，比未受污染地区高出1～2个数量级。降解石油烃类化合物的细菌主要有：无色杆菌属(Aehromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)：黄杆菌属(Flavobacterium)、棒杆菌属(Coryneforms)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、假单孢菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobaeterium)等；放线菌中有放线菌属(Actinomycetes)、诺h氏菌属(Nocardia)：在真菌中有：假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、镰刀霉属(Fusarium)、青霉属(Penicilium)、木霉属(Trichoderma)、被孢霉属(Mortierella)等1100]。1．7．3石油污染微生物降解的机理石油是以链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量非烃类化合物为主要成分的复杂混合物。生物法主要原理是微生物利用石油烃类作为碳源进行同化降解，使其最终完全矿化，转变为无害的无机物质(C02和H20)的过程。各种石油成分的生物降解性因其化学结构不同和分子量大小而表现出一定的差异。一般说来，链烃比环烃易降解，不饱和烃比饱和易降解，直链烃比支链烃易降解。而且，14n第1章文献综述支链烷基愈多，其生物降解性愈差，尤其是碳链末端有季碳原子是特别顽固。对于多环芳烃，则很难被微生物降解【l吲。主要作用过程有以下三个方面[102,103】：(1)烃的直接吸收分解烃的微生物是生活在水体里、吸附在土粒上或存在于土壤孔隙中，和烃液滴的相互作用是在土壤孔隙里的油水界面上进行的。有的烃能直接溶于细胞膜的亲脂区而进入膜内；另一些则是微生物在油滴界面处先生成表面活性剂使之溶解后吸收，气态烃要溶于水后才能被吸收，污染物的水溶性是降解的主要因素。(2)烷、烯、炔烃的生物降解微生物对烷烃的降解主要有单一末端氧化、双末端氧化或心氧化、次末端氧化三种方式。单一末端氧化，首先是烷烃在末端的甲基被氧化，经过醇、醛的氧化生成脂肪酸，脂肪酸经B．氧化生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A在有氧的条件下进入TCA循环而最终被完全氧化成c02和H20。这是一种最为常见的代谢途径。次末端亚甲基氧化代谢途径，首先在链内的碳原子上插入氧，生成醇，再进一步氧化生成甲基酮，酮再代谢为脂，脂键裂解生成伯醇和脂肪酸，醇可继续氧化生成羧酸，羧酸则通过B．氧化进一步代谢；正烷烃分子两端的甲基氧化，形成二羧酸。具有碱基取代基的环烷烃可以作为微生物生长基质。没有取代基的环烷烃是原油的主要成分，它对微生物的降解抗性较大，能在环境中长期滞留。尽管自然界几乎没有以环烷烃为唯一碳源生长的微生物，但微生物群落对环烷烃的共代谢现象却普遍存在，所以，环烷烃在自然界中还是可以逐渐得到矿化的。环烷烃的羟基化是其降解的关键性步骤，在降解过程中经历了环已醇、环己酮和e-己酸内脂之后，开环形成羟基羧酸，而后进一步被氧化为二羧酸。经研究证明，大多数烯烃比芳香烃、烷烃都容易被微生物降解。烯烃降解时，微生物可以攻击甲基端，也可以攻击双键，形成的中间代谢有不饱和醇、不饱和脂肪酸、伯醇或仲醇、甲基酮类、1，2．环氧化物和1，2一醇等。也就是说，对烯烃的代谢，主要是通过产生具有双链的加氧化合物，进一步形成饱和或不饱和的脂肪酸，然后脂肪酸再经B．氧化进入TCA循环而完全被分解。目前对于炔烃的降解了解不多。有的细菌如Mycobactetiumvaccae能将它们代谢为不饱和脂肪酸并产生某些双键的位移或产生甲基化，形成带支链的饱和15n第1章文献综述脂肪酸。终端烯很容易被许多微生物降解。正构烷烃一氧化酶能使烯酶促生成环氧化物。Abbotte等人认为，离不饱和键较远一端甲基处的酶解，对这类化合物的降解可能具有更重要的意义。对异构烷烃的代谢研究得很少。因为正构烷烃一氧化酶一般不能酶促支链烷的氧化，所以绝大多数能降解正构烷烃的微生物不能降解异构烃。单支链烷烃的氧化多从离支点最远的甲基处开始。但其降解的中间产物可能累积起来不被进一步降解。(3)芳香烃的生物降解【104舶5】芳香烃的有氧代谢必须有分子氧参加，同时需要加氧酶的催化。单加氧酶和双加氧酶分别催化不同的反应途径，使苯环开裂，形成溶解的直链烃。单加氧酶将氧原子倒入芳香环中，形成中间产物环氧化物，再通过水合作用形成水合中间产物进行进一步的分解；双加氧酶将氧导入芳香环中，形成二羟基二醇，然后转化为邻苯二酚进行进一步的分解。苯与短链基苯在脱氢酶及氧化还原酶的参与下，经二醇的中间过程代谢成邻苯二酚和取代基邻苯二酚，后者可在邻位或间位处断裂，形成羧酸。多环芳烃(PAHs)在原油中的含量虽然只占O．1％左右，但由于它们的致癌活性和许多植物和微生物均能合成此化合物，因此它们在环境中的行为和归宿不容忽视。微生物(细菌、真菌)对PAHs的代谢方式有两种：一种是以PAHs作为唯一碳源和能源，另一种是把PAils与其它有机质进行共代谢或共氧化。微生物降解PAHs依赖于酶的活性，氧化加入到环上，形成C．0键断裂，苯环数减少。中间代谢物包括：二元醇，酚，环氧化物等，大多是致突变、致畸形、致癌变的，最终降解污染物到完全无害的组分：水和二氧化碳。好氧生物降解是目前普遍应用处理PAHs的技术。降解PAHs的微生物，首先是细胞产生加氧酶(单、双)，进行催化定位氧化反应。真菌产生单加氧酶，加氧原子到苯环上，形成氧化物，然后，加入H20产生反式二醇和酚。细菌产生双加氧酶，加双氧原子到苯环上，形成过氧化物，然后氧化为顺式二醇，脱氢产生酚。环的氧化是微生物降解PAHs的限制步骤，以后降解较快，很少积累中间代谢物。不同的途径有不同的中间产物，但普遍的中间产物是：邻苯二酚，2，5·二羟基苯甲酸，3，4-二羟基苯甲酸。邻苯二酚是普遍的中间产物，具体的化合物依赖于羟基组的位置，有正位、对位或其它。这些代谢物经过五种相似的途径降解：环碳键断裂，丁二醇，反丁烯二酸，丙酮酸，乙酸或乙醛。这些物16n第1章·文献综述质都能被微生物利用合成细胞蛋白。1．8课题的研究内容首先，从九江石化排水车间生化池、江西青山湖污水处理厂和江西朝阳污水处理厂的污泥中对菌株进行富集培养，通过稀释平板法和平板划线法多次分离至获得纯种。对分离纯化出的菌株进行絮凝实验和油类降解率的实验，筛选出高效絮凝菌和油类降解菌。再将絮凝菌和油类降解菌进行复合。用蜂蜜废水取代通用发酵培养基中的碳源，同时用氨厂尿素废水取代氮源，对所筛选到的菌种的产絮凝剂的培养基成分和培养条件进行优化研究。重点考察培养基的最佳碳源、最佳氮源的浓度，通过实验得出复合菌群的最佳培养优化条件，并将该复合菌群应用于石化废水的处理。把本课题组筛选到的絮凝剂产生菌和油降解菌按照不同的搭配方式进行混合培养，希望找出相互之间生态位分离的菌株，并利用有机废水作为产絮凝剂复合菌群的替代培养基，使得各种微生物在其生长过程中产生有用物质及其分泌物形成相互生长的基质和原料，通过相互共生、增殖关系形成一个结构稳定，既能降解污染物，又能产生高效微生物絮凝剂的复合菌群。17n第2章实验部分2．1制备工艺及技术路线从九江石化排水车间生化池、江西青山湖污水处理厂和江西朝阳污水处理厂的污泥中对菌株进行富集培养，通过稀释平板法和平板划线法多次分离至获得纯种。将获得的菌株接种至筛选培养基中培养。再把筛选到的絮凝剂产生菌与石油降解菌按照不同的搭配方式进行混合培养试验，找出有协同作用的菌株，构建既能降解油类，又能产生高效微生物絮凝剂的复合菌群，进一步优化其培养条件；并将复合菌群应用于：石化废水处理；接着对微生物絮凝剂进行提纯固化和成分分析，探讨其絮凝机理。采集及预处理技术路线如图2．1所示。富集培养分离纯化‰油降解菌的筛选图2．1技术路线MBF提纯固化产絮凝剂及降解实验研究降解油测定2．2主要实验仪器设备(1)隔水式恒温培养箱(GHX-9000B．1型1：(2)全温度振荡培养箱(HZQ．F160型)；(3)立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZX．-40CI型1；成分分析絮凝活性测定园获得高效菌群n第2章实验部分(4)电热鼓风干燥箱(CSl012型)：(5)可见光分光光度计(723型)；(6)紫外光分光光度计(11『-一190l型)；(7)酸度计(sartoriusPB—10型)；(8)海尔电冰箱(BCD-272WBCS型)；(9)生物安全柜(LRH．250A型1；(10)离心沉淀器(80．2型)；(11)生物显微镜(olympusCX37型)：(12)电子天平(HANGPINGJA2003型)：(13)真空干燥箱(DZF．6090型)。2．3主要实验材料(1)菌种来源：江西九江石化排水车间生化池活性污泥、江西朝阳污水处理厂氧化沟污泥和江西青山湖污水处理厂氧化沟污泥。(2)油：O稃柴油。(3)高蛉土悬液：在lOOml的比色管中加入0．49高岭土，加入lOOml蒸馏水，配制而成。(4)富集及分离培养基：①肉汤蛋白胨培养基；②查氏培养基；③马铃薯培养基；④高氏1号培养基；⑤石油类培养基。(5)絮凝剂产生菌筛选培养基：⑥通用发酵培养基。(6)石油降解菌筛选培养基：，⑦通用油培养基中使油浓度达到260mg／L。(7)蜂蜜废水：江西汪氏蜂蜜园生产废水，pH值为6．75，CODo为60795mg／L。(8)氨厂废水：江西氨厂尿素生产废水，pH值为5．46，氨氮浓度为30010mg／L。(9)石油醚：分析纯，馏分60～90℃，杭州石化厂出品。在紫外分光光度计上扫描该石油醚的吸收波长如图2．2所示。19n第2章实验部分光薏髓蜮，r、／7町7／弋99。r～～一—～～～～图2．2石油醚最大吸收波长图谱使用前在紫外分光光度计上扫描的最大吸收波长为225nm，在225nm处以水为参比，透光率达到88．5％，可直接使用。(10)九江石化厂排水车间沉淀池排水：pH猷J7．24，CODcr蔓7788．28mg，L，原水油浓度为127．5mg，L。2．4分析方法(1)MBF的絮凝活性(2)油的测定(3)CODc，的测定(4)pH值的测定(5)浊度去除率的测定723型分光光度计测OD550；紫外分光光度法(GBl2153--89)：重铬酸钾法(GBll914-891；玻璃电极法(GB7488-871；723型分光光度计测OD。2．5实验内容2．5．1菌株的富集分别往150ml锥形瓶装的50m10②③④⑤⑥号培养基中加入lonll污泥和数粒玻璃珠，在摇床中30℃，160rpm下进行富集培养。72h后，移取5lnl富集培养液至相对应的新鲜培养基中，在同样条件下培养72h。再重复一次上述操作，得到最终富集液。20n第2章实验部分2．5．2菌株的分离纯化采用稀释平板法对最终富集液中的微生物进行分离。在无菌操作条件下，将最终富集液稀释至l酽，10一，lO击，104，10罐等5个稀释度。先吸取0．5IIll菌液于相应编号的培养皿内，后将冷却至45℃左右的琼脂培养基倒入培养皿中，将培养皿平放在操作台上，顺时针或逆时针地来回转动，使培养基和菌液混合均匀，冷凝后即成平板。将平板倒置于生化培养箱中，在30℃下培养24h。采用平板划线法对菌株进行纯化。用接种环从上述平板中挑取单菌落，在相对应类型的无菌平板培养基上划线。将平板倒置于生化培养箱中，在30℃下培养24h。经多次平板划线获得纯菌株。将纯化的菌株转至相对应类型的斜面培养基中，在生化培养箱中30℃下培养24h，然后将其放入冰箱中44C下保存，以备使用。以后每月将菌株转种至相对应类型的新鲜斜面培养基中1次。2．5．3纯菌株的浅层发酵培养在无菌操作条件下，挑取斜面培养基上的菌苔，将其接种至150ml锥形瓶装的50ml@培养基中，在摇床培养箱中30"C，160rpm条件下培养72h后，将发酵液在离心机中4000rpm下离心20分钟，离心上清液即为待试菌液。2．5．4絮凝剂产生菌的筛选初筛：向100ml比色管中加入0．4g高岭土，5ml1％CaCh和2ml待试菌液，然后加蒸馏水至100ml，盖上磨口塞，将比色管作lO个上下的自然翻转，转速以每次翻转时气泡上升完毕为准，翻转结束后，静置10min。取比色管中50ml处的处理液，用723型分光光度计在55011111的波长下测定吸光度(A1)。同时以2ml新鲜通用发酵培养基或含油替碳替氮发酵培养基代替待试菌液，其它操作条件完全相同的实验作为对照，测其吸光度(B1)。絮凝率El计算式如下：n—JE1-苎—竺X100(2．1)蜀式中：El——絮凝率，％；Al——加待试菌液处理后的高岭土悬液吸光度，A；Bl——对照实验1的吸光度，A。复筛：向100ml比色管中加入0．4g高岭土，5mlI％CaCl2和2ml待试菌液，然后加蒸馏水至100ml，盖上磨口塞，将比色管作10个上下的自然翻转，转速以每n第2章实验部分次翻转时气泡上升完毕为准，翻转结束后，静置5rain。取比色管中50ml处的处理液，用723型分光光度计在55011111的波长下测定吸光度(A2)。同时以2ml新鲜通用发酵培养基或含油替碳替氮发酵培养基代替待试菌液，其它操作条件完全相同的实验作为对照，测其吸光度(B2)。絮凝率E2计算式如下：E，：垒二垒×100(2．2)。岛式中：E2——絮凝率，％：A2——加待试菌液处理后的高蛉土悬液吸光度，A；B2——对照实验2的吸光度，A。2．5．5石油降解菌的筛选2．5．5．1油含量的测定fllll1．绘制油标准曲线a．0．1g的油，用石油醚溶解在50mll瓶中，稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为2mg／L；b．吸取上述溶液2．5111l于50ml容量瓶中，以石油醚稀释至刻度，摇匀。其浓度为0．1mg／L。此溶液称为标准使用液。c．分别吸取标准使用液0．5、1．00、2．00{3．00、4．00、5．00ml于25ml容量瓶中，以石油醚稀释至刻度，摇匀。其浓度分别为O．002、O．004、O．008、0．012、O．016、O．020mg／L，在波长225nin处用1cm石英吸收池，以石油醚为空白，分别测其吸光度，绘制标准曲线。2，将己测量体积的水样，仔细移入1000m1分液漏斗中，加入1+1硫酸5“酸化(若采样时已酸化，则不需加酸)。加入氯化钠，其量约为水量的2％(m／v)。用20IIll石油醚(60℃～90℃馏分)清洗采样瓶后，移入分液漏斗中。充分振荡3min，静置使之分层，将水层移入采样瓶内。3，将石油醚萃取液通过内铺约5toni厚度无水硫酸钠层的砂芯漏斗，滤入50ml容量瓶内。4．将水层移入分液漏斗内，用20ml石油醚重复萃取一次，同上操作。然后用lOm1石油醚洗涤漏斗，其洗涤均收集于同一容量瓶内，并用石油醚稀释至标线。5．在选定的波长处，用10mm石英比色皿，以石油醚为参比，测量其吸光n第2章实验部分度。6．取水样相同体积的纯水，与水样同样操作，进行空白实验，测量吸光度。7．由水样测得的吸光度，减去空白实验的吸光度后，从标准曲线上查出相应的油含量。计算：油(馏，工)：—mxl—000(2．3)V式中：m—一从标准曲线中查出相应油的量(mg)；V．一水样体积(m1)。石油降解率r／=w0-wx×100(2．4)wo式中：w旷一对照培养液中残余油含量，rag／L：wX_—接各待测菌的培养液中残余油含量，mg／L。2．5．5．2分析方法：紫外分光光度法[891紫外分光光度法是利用石油及其产品中芳香族化合物和含共扼双键化合物在215～260nm紫外区的特征吸收来测定石油类含量。我国目前应用较多，一般选用石油醚或己烷为萃取剂。紫外分光光度法具有精密度好、灵敏度高、重现性好、操作简单快速、适于测定0．05～50mg／L的含油废水等优点。2．5．6复合菌群的构建将复筛所得的絮凝菌株接种到通用发酵培养基中，在摇床培养箱中30"C，160rpm条件下培养72h，发酵液作为种子液，放入冰箱1为4"C保存，以备使用。按照不同的菌株配组，将絮凝菌和降油菌的种子液接种到含油通用发酵培养基中，在摇床培养箱中30"C，160rpm条件下培养72h后，测定待试液体的絮凝率E2和油降解率，按(2．3)式计算出油的浓度。2．5．7复合菌群对油的降解改变含油的通用发酵培养基的油初始浓度，将构建复合菌群的菌株种子液各取O．5ml接种至150ml锥形瓶装的50ml培养基中，在摇床培养箱中30"C、160rpm条件下，每隔12h测定一次待试菌液的絮凝率E2和柴油的浓度，考察复合菌群对初始浓度100mg／L、200mg／L、320mg／L、500mg／L、660mg／L、1100mg／L的油降解率q。n第2章实验部分2．5．8复合菌群培养条件的优化用取自江西汪氏蜂蜜园的蜂蜜废水取代含油通用发酵培养基中的碳源，同时用江西氨厂尿素生产废水取代氮源，其它成分不变，对所筛选到的菌种的产絮凝剂的培养基成分和培养条件进行优化研究。重点考察培养基的最佳碳源、最佳氮源浓度以及培养基的初始培养温度、通气状况(或摇床速度)、接种量、pH值对菌种产絮凝剂的影响，确定菌株的生长特征以及合成絮凝剂时各个影响因素的最佳值，确定最佳的培养工艺。2．5．9MBF的提纯与成分分析。舯J2．5．9．1絮凝剂的提纯将复合菌群在含油替代废水培养基中的发酵液用蒸馏水稀释4倍，在离心机中4000rpm下离一L,30rain，用旋转蒸发器浓缩待试液体至原体积的一半，加入3倍体积的95％乙醇，放入冰箱中4。C过夜后，在离心机中4000rpmT离-t],30rain。将沉淀重新溶于蒸馏水中，重复Iii『面的步骤2次。再将沉淀用丙酮洗涤，乙醚洗涤，最后将其真空冷冻干燥，得到部分纯化的固态MBF。2．5．9．2成分分析方法(1)旺．萘酚溶液试验gt．萘酚溶液试验是碳水化合物所特有的试验。沿试管壁将浓硫酸慢慢加到MBF与n一萘酚的酒精溶液时，使溶液分成两层，在界面处发现形成紫色环。然后将溶液混合并冷却后，用水稀释发现析出暗紫色沉淀。此现象町说明MBF中含有碳水化合物。反应机理为碳水化合物与浓硫酸起作用，生成的产物中有糖醛或糖醛的衍生物，它们再与a．萘酚缩合，产生紫色的缩合物。(2)蒽酮试验葸酮与各种类型的糖反应产生绿色物质，这个反应是糖类所特有的。在小试管中加入含有1～5mg样品的水溶液0．5ml，倾斜此试管，沿壁滴加1mlO．2％蒽酮在95％浓硫酸中的溶液，1min后出现绿色环。此现象可说明MBF中含有多糖成分。(3)双缩脲试验双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。为确定MBF中是否含有蛋白质成份，进行了双缩脲试验。将lmlMBF和2ml10％NaOH溶液混合后，摇匀，再加入l％CuS04溶液两滴，发现有紫红色化合物生成。此现象说明MBF中可能含有蛋白质。n第2章实验部分(4)茚三酮试验由于蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲瓜的物质不一定都是蛋白质或多肽。为进一步确定MBF中是否含有蛋白质成份，可进行茚三酮试验。所有弘氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。将1mlMBF溶于l～3ml水中，加入lmlO．1％茚三酮水溶液，将混合物加热沸腾1～3min，发现有紫色物质生成。此现象可说明MBF中含有蛋白质成分。2．5．10菌种初步鉴定细菌的鉴定是参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)进行的，按其鉴定规则，制定实际的操作步骤。其鉴定规则为：①利用所有有用的资料；②每一步都应用常识来判断；③用最少数目的试验进行。实际的操作步骤为：①菌种纯化；②菌落形态观察；③判断该菌是化能自养，还是化能异养；④进行革兰氏染色，判断革兰氏属性，并溯细菌大小；⑤进行芽孢染色；⑥穿刺培养，考察该菌是否为兼性厌氧；⑦接触酶实验，考察是否接触酶阳性；⑧根据检索结果确定继续实验的内容。真菌的鉴定参照《真菌鉴定手册》。2．5．1l应用实验将复合菌群所产的MBF应用于石化废水的去除CODc,和去除浊度实验。在单因素(MBF投加量、1％CaCl2投加量、系统pH)实验的基础上，通过正交实验确定最佳的处理工艺条件。CODc，的去除率和浊度去除率分别用}Ll和№表示，№计算公式如下：∥2：B-_垒A×10010(2．5)Ⅳ2=×LZ．)Jn第2章实验部分’式中：肛r浊度去除率，％；A——处理后石化废水在525am波长下的吸光度，A；B——处理前石化废水在525am波长下的吸光度，A。n第3章结果与讨论3．1菌株的分离3．1．1菌株的富集活性污泥中虽然含有多种微生物，但单一菌种数量较少，有些会因不适应培养条件而很快死亡，不利于从大范围内筛选出需要的菌种。而进行富集培养，可获得较丰富种类的微生物。3．1．2菌株的分离纯化经多次稀释平板分离和平板划线纯化，共获得77株菌，其中絮凝菌73株，油降解菌4株，对它们进行编号。3．2絮凝剂产生菌的筛选3．2．1初筛结果将纯化的73株菌进行产絮凝剂初筛实验，从中筛选出能够产生具有一定絮凝活性物质的菌株。不加菌株的发酵液空白值OD550为0．106。结果如3．1表所示。表3．1初筛实验n第3章结果与讨论编号菌株pHOD550El(％)14CYRT46．550．02972．6415CYRT56．900．05449．0616CYRT66．580．1005．6617CYRT76．340．07826．4218CYRT85．610．114．7．5519JJTDl5．430．08618．8720JJTD25．370．04854．7221JJTD34．920．04557．5522JJTD46．820．142-33．9623JJTD55．930．08420．7524JJTD65．730．180．69．8l25JJTD76．780．04062．2626QSHTDl6．2l0．02873．5827QSHTD26．580．03765．0928OSHTD33．720．04557．5529QSHTD46．620．03666．0430QSHTD55．930．02378．303lQSHTD64．730．03566．9832OSHTD76．650．03566．9833QSHTD85．270．03765．0934CYTDl5．470．03269．8135CYTD26．56O．02378．3036CY’rI)35．02O．01982．0837CYTD46．180．02873．5838CYTD55．580．01982．8039CYT【)65．250．03071．7040CYTD75．930．02576．424lCy兀)85．440．06439．6242CYTD94．130．04359．4343JJCSl6．7lO．03l70．7544JJCS24．92O．02675．7445JJCS36．1lO．02378．3046JJC．546．970．546-415．0947”CS56．820．03566．9848JJCS66．380．06736．7949JJCS73．67O．01883．0250JJCS84．320．07033．9651JJCS94．290．118．11．3252JJCSl05．690．1032．8353QSHCSl6．710．05449．06n第3章结果与讨论由表3．1可知，有36株菌所产MBF絮凝率在60％以上。3．2．2复筛结果对所产MBF絮凝率在60％以上的36株菌进行复筛。不加菌株的发酵液空白值ODs50为0．130。复筛结果如表3．2所示。表3．2复筛实验n第3章结果Me论13CYTD24．370．127．2．3l14CYTD35．020．07l45．3815CYTD45．470．07l45．3816CYTD55．580．10221．5417CYTD66．8l0．10420．0018CyⅡ)75．980．08633．8519JJDF65．420．01985．3820QSHDFI6．81O．03275．382lQSHDF26．86O．01290．7722QSHDF45．450．02680．0023QSHDF55．730．05061．5424JJCSl6．7l0，01687．6925JJCS26．700．02183．8526JJCS36．1l0．03076．9227JJCS56．820．02580．7728JJCS73．670．01489．2329Q·SHCS36．73O．08733．0830QSHCS44．51O．08733．0831QSHCS54．38O．195-50．0032CYCSl6．330．05260．0033CYCS26．550．05061．5434CYCS46．580．03473．8535CYCS66．580．05l60．7736CYCS76．570．05855．38从表3．2可以看出，有7株菌的絮凝率E2在80％pA上，它们是JJDF6、QSHDF2、QSHDF4、JJCSI、JJCS2、JJCS5及JJCS7，选取这7株菌作为参与构建复合菌群的菌株。n第3章结果与讨论3．3石油降解菌的筛选3．3．1油标准曲线0204060油浓度(mg／L)y=0．0423x一0．0138R2=0．99％图3．1油标准曲线3．3．2初筛结果将从石化污泥中筛选纯化的4株菌进行降解油的筛选实验，从中筛选出能够降解油的菌株。结果如表3．3所示。表3．3油降解菌的筛选实验由实验得出，JJY2的去油率最好，达到-／72．12％，因此选取该株菌做为与高效絮凝菌进行复合的复合菌。5251502lO一《一墼絮签n第3章结果与讨论3．4复合菌群的构建将表3．2中复筛出的7株能够产生较高絮凝活性物质的菌株和表3．3复筛出的油降解菌JJY2按照不同的配组进行复合菌群培养试验，其中空白含油发酵液的参照值为0．350。实验结果如表3．4所示。表3．4构建复合菌群JJDF6+JJY28．25O．13561．4375．59QSHDF2+JJY27．910．07877．7167．68QSHDF4+JJY26．73O．1lO68．5778．15ljCSl+jⅣ29．830．10968．85SoSsJJCS2+JJY28．470．24131．1450．17JJCS5+j州24．860．503-30．4249．86JJCS7+JJY26．070．23233．7l70．15JJDF6+QSHDF2十JJY27．460．09971．7l78．96JJDF6+QSHDF4+JJY25．240．03091．2988．4lJJDF6+JJCSl+JJY26．490．20641．1483．10JmF6+Hcs2+5n26．230．15555．7175。24JJDF6+JJCS5+JJY27．65O．11367．7181．06JJDF6+JJCS7+JJY26．120．08874．8673．81QSHDF2+QSHDF4+JJY28．450．07877．7182．95QS皿F2+JJCSI+JJY26．300．08974．5778．2lQSHDF2+JJCS2+JJY25．180．10270．8667．49QSHDF2+JJCS5+JJY26．370．21339．1474．38OSHDF2+JJCS7+JJY25．690．15456肿65．74OSHDF4+JJCSl+JJY26．820．3276．5776．53QSHDF4+JJCS2+JJY25．1l0．766／62．85QSHDF4+JJCS5+JJY26．840．17250．8666．02QSHDF4+JJCS7+JJY25．760．07478．8675．32JJCSl+JJCS2+JJY28．9l0．09373．4355．19JJCSI+JJCS5+JJY27．08O．OSl76．8684．7lJJCSl+JJCS7+JJY26．820．14558．5768．94JJCS2+JJCS5+JJY27．130．20840．5760．02JJCS2+JJCS7+JJY27．350．16752．2981．7528JJCS5+JJCS7+JJY26．2l0．06880．5782．08●23456789mn屹”H：2№”博伸加扒趁∞M筋拍”n第3章结果与讨论从表3．4中可知，菌群JJDF6+QsHDF4+JJY2所产MBF絮凝率E3和对油的降解率Tl在80％以上，絮凝率E3和油降解率T1分别为91．29％和88．41％，而菌株JmF6和QSHDF4在相同条件下单独培养时，它们所产MBF的絮凝率E3分别为85．38％和80．00％。3．5复合菌群对油的降解考察复合菌群对不同浓度油的降解效果。实验结果见表3．5和图3．2所示。表3．5复合菌群对不同初始浓度油的降解o12243648607284时间(11)图3．2复合菌群对不同初始浓度油的降解啪Ⅲ啪跏伽蓍|姗mo(1高5世爱暴n第3章结果与讨论从表3．5和图3．2可看出，在loomg／L和200mg／L两个浓度下，经84h培养之后，油降解率11为87．00％和81．50％。而在500mg／L和660mg／L两个浓度下，油降解率T1分别为87．40％和73．18％，要达到更高的降解率，还需一定时间，说明油初始浓度越大，降解油所需的时间越长。只有当油初始浓度为320mg／L时，油降解率T1有最大值93．44％。由此得出，复合菌群在发酵液中油浓度为320mg／L时，对油的降解率最佳。3．6复合菌群利用蜂蜜废水和氨厂尿素生产废水替代培养基产絮凝剂的研究3．6．1废水的来源及其特征3．6．1．1蜂蜜废水作为复合菌群的碳源蜂蜜营养丰富，除水分外，主要以糖类为主、并含适量的维生素、矿物质、氨基酸及酵素类等物质。糖类占蜂蜜总量70％～80％，主要以果糖、葡萄糖为主，占总糖类的80％～90％，此外尚含少量的麦芽糖、蔗糖掣109]。目前，尚未见到有关利用蜂蜜废水来培养絮凝剂产生菌的报道。因此，尝试用蜂蜜废水代替葡萄糖作为复合菌群的碳源和能源，研究有关培养条件对絮凝剂产生菌产MBF的影响，可为蜂蜜废水应用于MBF生产提供基础数据。本实验选用汪氏蜂蜜园的加工生产线洗槽废水做为实验材料，其pH值为6．75，CODc，为60795mg／L。3．6．1．2氨厂尿素生产废水作为复合菌群的氮源尿素生产废水中含有大量氮源，如果让其通过废水排放流失，是一种资源和能源的浪费Ino】。氨厂尿素生产在氨转化为尿素的过程中容易造成氮素的流失，因此，本实验尝试用氨厂尿素生产废水取代发酵培养基中的氮源，一方面可以节约资源，以废治废，另一方面也可以在替代通用发酵培养基中的氮源，充分利用废水中的氮素。本实验的替代氮源水源选自江西氨厂的尿素生产废水，其pH值为5．46，氨氮浓度为30010mg／L。3．6．2利用蜂蜜废水和氨厂废水作为碳源和氮源的可行性研究以蜂蜜废水代替通用发酵培养基中的葡萄糖作为复合菌群的碳源，另一方n第3章结果与讨论面，以氨厂尿素生产废水代替通用发酵培养基中的氮源，研究培养基中蜂蜜废水和氨厂尿素生产废水浓度对复合菌群产生MBF的影响。将O．5IIll的JJDF6种子液、O．5ml的QSHDF4种子液和O．5ml的JJY2种子液(复合1)接种至150ml锥形瓶装的50ml废水替代培养基中，在摇床培养箱中30℃、160rpm条件下培养72h后，测定发酵液离心上清液的絮凝率E4。将复合l的实验结果与同样条件下0．5ml的种子液JJCS5、JJCS7、JJY2(复合2)实验结果进行对比。结果如表3．6、表3．7和图3．3、图3．4所示。表3．6发酵培养基中蜂蜜废水浓度对复合菌群所产MBF絮凝活性的影响誊∞碍菇疑05000100001500020000蜂蜜废水COOEr(rag／L)图3．3蜂蜜废水浓度对复合菌群所产MBF絮凝活性的影响∞们∞0n第3章结果与讨论表3．7发酵培养基中氨厂尿素生产废水浓度对复合菌群所产MBF絮凝活性的影响10080一詈60静囊40．200O50010001500氨厂尿素车间废水的氨氮浓度(mg／L)图3．4氨厂尿素生产废水浓度对复合菌群所产MBF絮凝活性的影响由表3．6、表3．7和图3．3、图3．4可以看出，复合1较之与复合2絮凝效果有较大的优势，在替碳和替氮培养基中的产絮凝剂的絮凝活性都达到了90％以上。所以选取复合1，即菌群JJDF6+QSHDF4+JJY2作为实验筛选的最优菌群。发酵培养基中蜂蜜废水替代碳源COD。，浓度为9000mgrL时，絮凝率为最大值95．88％；氨厂生产废水替代氮源氨氮浓度为200mg／L时，絮凝率为最大值99．83％。因此，菌群JJDF6+QSHDF4+JJY2的最佳替代发酵培养基的优化条件为：以CODc，为9000mg／L的蜂蜜废水代替通用发酵培养基中的葡萄糖，并以氨氮含量为200mga_,的氨厂尿素生产废水取代发酵培养基中的氮源，其它成份不变，配制成替碳替氮发酵培养基。n第3章结粟与讨论3．6．3复合菌群的培养条件优化为了提高微生物絮凝剂在培养液中的浓度，必须在培养时提供充足的营养、适宜的温度、良好的通气状况，菌体才能正常生长并产生大量的絮凝剂。同时，在为微生物提供充足营养的同时，还要考虑到营养物的种类等对絮凝剂产生的影响，为了获得高浓度的絮凝剂，必须对培养条件进行优化。在前面的研究中，已经由实验得知复合菌群在含油发酵陪养基中油初始浓度为320mg／L时，复合菌群的油降解率最大，且所产絮凝剂仍有较高絮凝率，为了体现复合菌群降解油和产絮凝剂的双重功能，在替碳替氮发酵培养基中加入油，使其浓度达到320mg／L。3．6．3．1培养温度对复合菌群的影响调节替碳替氮含油发酵培养基的初始pH为10．0，高压蒸气灭菌。将O．5mlJJDF6的种子液、0．5mlQSHDF4的种子液和O．5mlJJY2的种子液接种至150ml锥形瓶装的50ml替碳替氮含油发酵培养基中，改变培养温度，在摇床培养箱中160rpm条件下培养72h后，测定待试液体絮凝率E5和油的浓度，并计算出油降解率，1。实验结果见表3．8和图3．5所示。表3．8培养温度对复合菌群的影响编号培养温度(℃)油降解率1f％)絮凝率Ej(％)l2065．4572．8l22576．2874．7833079．3l82．5443576．79go．2554072．5276．371020304050温度(℃)图3．5培养温度对复合菌群的影响37lOO8060童簪40耋200∞如加0主v每塑书景n第3章结果与讨论从表3．8和图3．5中可以看出，在培养温度为30℃时，复合菌群对油的降解率和所产的MBF絮凝率均达到最高，分别为79-3l％和82．54％。适宜的温度有利于微生物保持良好的生长速率与代谢速率，微生物的生命活动和物质代谢都与温度有关。温度过高或过低会影响酶的活性，影响细胞代谢和物质的合成、积累。复合菌群的适宜生长温度为30"C，在此温度下，构成复合菌群的微生物能大量生长繁殖，对油的降解率最高，并分泌大量絮凝活性较高的MBF。3．6．3．2摇床转速对复合菌群的影响调节替碳替氮含油发酵培养基的pH为10．0，高压蒸气灭菌。将O．5mlJJDF6的种子液、0．5mlQSHDF4的种子液和O．5mlJJY2的种子液接种至150ml锥形瓶装的50ml替碳替氮含油发酵培养基中，改变摇床转速，在摇床培养箱中30"C条件下培养72h后，测定待试液体絮凝率E5和油的浓度，并计算出油降解率11。实验结果见表3．9和图3．6所示。表3．9摇床转速对复合菌群的影响10080；i60箸40景2001008060琶碍40蓬躺20O050100150200摇庶转速(rpm)图3．6摇床转速对复合菌群的影响表3．9和图3．6表明，随着摇床转速的增加，复合菌群所产MBF的絮凝活性呈现出先升高后降低的特点。当摇床转速为160rpm时，所产MBF的絮凝率n第3章结果与讨论E5达到最大值80．92％。而油降解率随摇床转速的增大不断增大，当摇床转速为160rpm时，达到78．59％，之后再增加摇床转速为180rpm，油降解率n略为增加，为79．65％。综合考虑和油降解率T1两方面的原因，确定最佳摇床转速为160rpmo3．6．3．3接种量对复合菌群的影响调节替碳替氮含油发酵培养基的pH值为lO．O，高压蒸气灭菌。改变50ml的替碳替氮含油发酵培养基中的JJDF6种子液、QSHDF4种子液和JJY2种子液的接种量，在摇床培养箱中30℃、160rpm条件下培养72h后，测定待试液体絮凝率E5和油的浓度，并计算出油降解率11。实验结果见表3．10和图3．7所示。表3．10接种量对复合菌群的影响00．5lt．522．53接种星(m1)图3．7接种量对复合菌群的影响10080^60芒并40羹200∞舳∞趵0一乎一哥篷q曩n第3章结果与讨论表3．10和图3．7表明，随着接种量的增加，复合菌群所产MBF的絮i疑率和对油的降解率均逐渐增加，在接种量为t．5ml时，MBF的絮；疑率和油降解率均达到最高。当接种量为1．5ml时，所产MBF的絮凝率E5为90．57％，油降解率．f1为88．62％。因此，选择复合菌群的最佳接种量为1．5ml(种子液)／50ml(替碳替氮发酵培养基)。3．6．3．4培养基初始pH对复合菌群的影响由于培养基的初始pH会影响培养基中有机化合物的离子化作用，从而对微生物有间接影响，因为多数离子状态的化合物更容易渗入细胞。而且，酶只有在最适宜的值时才能发挥其最大活性，不适宜的值使酶的活性降低，进而影响微生物细胞内的微生物化学工程。因而，pH初始值对复合菌群产MBF和油的降解率都有一定的影响。改变替碳替氮含油发酵培养基的pH，研究pH对复合菌群所产MBF的絮凝率和油降解率的影响。将1．5mlJJDF6的种子液、1．5mlQSHDF4的种子液和1．5mlJJY2的种子液接种至150ml锥形瓶装的50ml替碳替氮含浊发酵培养基中，在摇床培养箱中30℃、160rpm条件下培养72h后，测定待试液体絮凝率E2和油的浓度，并计算出油降解率rl。实验结果见表3，11和图3．8所示。表3．1l培养基初始pH对复合菌群的影响n第3章结果与讨论468lO12初始pH图3．8培养基初始pH值对复合菌群的影响从表3．12和图3．8中可以看出，培养基初始pH对复合菌群有较大影响。随着培养基初始口H的上升，絮凝率对油的降解率均呈现先升高后降低的特点。图3．5表明，复合菌群对油的降解率在pH为10．O时达到最高值84．09％，MBF的絮凝率E5达到最大值91．19％。因此，选择复合菌群的初始pH为10．0。3．6．3．5培养条件优化正交实验为迸一步优化复合菌群的培养条件，根据以上单因素实验的结果，选取种子液的接种量、摇床转速和培养基的初始pH三个因素进行复合菌群培养条件优化的正交实验。每个因素各取三个水平，三种种子培养液的接种量分别取1．0ml、1．5mI、2．0ml，摇床转速分别取140rpm、160rpm、180rpm，培养基的初始pH值分别取9．0、10．0、11．0。正交实验的各因子水平见表3．12。表3．123因素3水平正交实验因子水平根据正交实验表L9(33)进行正交实验，结果见表3．13。根据复合菌群的去油率和絮凝率确定复合菌群培养条件优化条件的方差分析表见表3．14、表3．15。418熏J)$n№∞o∞加o^善fd荽差震n第3章结果与讨论表3．13复合菌群培养条件优化正交实验k(33)74．2l／70．9586．94／84．1877．50／83．5912．73／13．2375．82／75．3582．27／86．4879。67／76，886．45／11．1280．S影78．6881．36，81．6276．52／78．414．84／3．2l74．2580．1968．5I82．1489．9688．7371．0879．6781．7663．3684．2565．2380．1487．4585．9582．5687．7380．47注：i和R行中，斜线上方以柴油降解率计，斜线F方以絮凝率计。表3．14复合菌群培养条件优化去油率方差分析因素A因素B因素C误差322．43457．67515．7882161．21721．536Fom(2，2)=19．00+228．8383．85227．8941．05514．972总和T410．8678l2323l3l2I23l23123l23，23456789一‰一也一也Rn第3章结果与讨论在正交实验表中，极差R的值能够反应出各因素对实验指标的影响程度。由正交表3．13可知，三个因素对复合菌群产MBF的絮凝率的影响大小依次为种子液的接种量、摇床转速、培养基的初始pH，即A282C2；对复合菌群对油降解率影响大小依次为：种子液的接种量、摇床转速、培养基的初始pn，即AeB3C2。根据表3．14和表3．15对复合菌群培养条件优化去油率和絮凝率进行方差分析，其中两个表中的因素A的F值>Fe值，说明只有因素A的影响为显著。单因素实验中，考察pH对复合菌群的絮凝效果时，pH为9．0时已达到91．19％，pn为10．0时，MBF的絮凝率Es虽达到最大值91．74％，絮凝率提高不大。因此考虑到成本问题，选取pH9．0为最佳值。絮凝的优化培养条件是：将1．5lIlI的JJDF6种子液、1．5mlQSHDF4种子液和1．5mlJJY2的种子液将种至50IIll替碳替氮含油发酵培养基，调pH为9．0，在115℃下高压蒸气灭菌30min，在摇床培养箱中30℃、160rpm条件下培养72h。在该优化条件下，实验得出MBF的絮凝率E5达92．21％。油降解率的优化培养条件为：将1．5IIll的JJDF6种子液、1．5mlQSHDF4种子液和1．5mlJJY2的种子液将种至50IIll替碳替氮含油发酵培养基，调pn为10．0，在115℃下高压蒸气灭菌30rain，在摇床培养箱中30℃、180rpm条件下培养72h。在该优化条件下，实验得出油去除率达91．18％。本研究用蜂蜜废水和氨厂尿素生产废水代替通用发酵培养基中的碳源和氮源，培养复合菌群产微生物絮凝剂，在有效地利用废水中的营养物质、降低絮凝剂生产成本的同时，也为该类废水的处理提供了新的方法。n第3章结果与讨论3．7絮凝剂的提纯及成分分析从发酵液中提取絮凝剂，得到部分纯化的固态MBF。部分纯化的固态MBF呈黄白色，粉末状，产量为15g(絮凝剂)／L(发酵液)。对部分纯化的固态MBF进行a．荼酚试验，葸酮试验，双缩脲试验和茚三酮实验，以定性确定其化学成分，实验结果见表3．16。表3．16复合菌群所产MBF的成分分析结果从表3．16可知，复合菌群所产的MBF的主要成分为多糖类物质。3．8菌种鉴定用光学显微镜对菌株QSHDF4jJJY2和JJDF6的个体特征进行观察，并拍摄了菌株照片，见图3．9～图3．11．。图3．9蓝株QSHDF4(x1000)n第3章结果与讨论图3．10菌株JJDF6(X1000)图3．11菌株JJY2(x1000)从显微镜油镜下观察，菌株QSHDF4细胞为杆状，大小为O．5×2．0ttm，根据其分离纯化的过程确定为化能异养菌；菌株JJDF6为真菌，大小为8．0x4．0ttm，直径2～2．5lam；菌株JJY2为细胞为球状，直径O．6～1．0岬，根据其分离纯化的过程确定为化能异养菌。穿刺培养实验表明，QSHDF4、JJDF6和JJY2均能沿穿刺线生长，并且在穿刺线底部生长良好，故都为好氧兼性厌氧菌。菌株QSHDF4、JJDF6和菌株JJY2的生化实验结果见表3．17。n第3章结果与讨论注；表中。十”表示阳性反应。～”表砸|{}i性反应。根据以上特性，参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)，初步判断QSHDF4为短杆菌属，JJY2为奈瑟氏球菌属；参照《真菌鉴定手册》初步判断JJDF6为酵母属。3．9微生物絮凝剂对石化废水的絮凝及对油的降解实验用复合菌群所产MBF对石化废水进行絮凝去除CODc，和浊度的实验，研究pH值、MBF用量和助凝剂1％CaCl2用量等三个因素对处理效果的影响。先进行单因素实验，后根据单因素实验的结果，进行正交实验，以确定MBF处理石化废水的最佳处理工艺。为了准确反映絮凝效果，需先确定石化废水的最大吸收波长。通过用723型分光光度计测定石化废水在不同波长下的吸光度值，找出吸光度最大时的波长值。实验结果见图3．12。图3．12不同波长下石化废水的吸光度从图3．12可以看出，石化废水在波长525姗下的吸光度值是最大的。因此，以处理前后石化废水在525nm波长下吸光度值的变化来反映MBF对其的絮凝n第3章结果与讨论效果。3．9．1系统pH对处理效果的影响将lm1复合菌群所产的MBF和5ml1％CaCl2投加至100ml的石化废水中，调节其pH值，混合均匀，静置10min后测定其上清液的CODc，和ODs25，计算出COOc，去除率和浊度去除率。实验结果见表3．18和图3．13。表3．18系统pH对处理效果的影响盆u糌餐曹§g社餐q世蘑5791l13初始pH图3．13系统pH对处理石化废水效果的影响从表3．18和国3．13还可知，CODcr的去除率和浊度去除率都随着MBF用量的增加先升高后降低。当系统pH提高为10．0时，CODcr去除率和浊度去除率分别为53．3％和71．37％，为最优值。因此，认为系统pH以10．0为宜。3．9．2MBF用量对处理效果的影响改变MBF的用量，将复合菌群所产的MBF和511lll％ca02投加至100mln第3章结果0讨论的石化废水中，调节其pH值为10．0，混合均匀，静置10min后测定其上清液的OD525和CODc，，计算出其CODc，去除率和浊度去除率。实验结果见表3．19和图3．14。表3．19MBF用量对处理效果的影响窑簪餐毫晷奢瞥篮q型爱00．5l1．5Z2．5MBF用量(m1)图3．14MBF用量对处理石化废水效果的影响从表3．19和图3．14可以看出，MBF的用量对处理石化废水的效果有很大影响。CODc，的去除率和浊度去除率都随着MBF用量的增加先升高后降低。当MBF用量为1．5ml时，CODc，去除率为60．50％，浊度去除率为73．56％，均达到了最大值。因此，MBF的用量选定为1．5ml。3．9．31％CaCh用量对处理效果的影响改变1％CaCh的用量，将1．5IIll复合菌群产生的MBF和1％CaCl2投加至100ral的石化废水中，调节其pH值为10．0，混合均匀，静置10rain后测定其上清液的OD525，计算出其CODcr去除率和浊度去除率。实验结果见表3．20和铂跖船舛％孵∞笱“∞乃记J盘2j9"¨∞鲐∞硒mDmO0D由DmD5l2505OnL互l23^，56m∞0∞舳∞们∞0n第3章结果与讨论竺兰壁墨釜12超薹i茎釜!竺竺苎竺兰!竺兰竺兰竺兰!竺l1．50．51032．9512．07／1．51．03．05．07．OlO1047．8860．7467．8l61．5319．5471．2672．9974．14盒爵簦爿窖802468l_tnCaCl2用量(埘1)器7060窑50蒌篓薹20≯图3．15I％CaCl2溶液用量对处理石化废水效果的影响从表3．20和图3．15可以看出，1％CaCl：的用量对处理石化废水的效果有较大影响。CODc，的去除率随着1％CaCl2用量的增加先升高后降低。当1％CaCl2的用量为5ml时，CODc，去除率为67．81％，为最优值。浊度去除率一直处于随着]％CaCh用量不断升高的状态，但考虑到]％CaCl2用量为5“时，浊度去除率为72．99％，而1％CaCl2用量增加到7Inl时浊度去除率为74．14％，浊度去除率提高不多。因此，1％CaCl2的用量选定为5IIll。3．9．4正交实验为进一步优化复合菌群所产MBF处理石化废水的工艺，根据以上单因素实验的结果，选取MBF用量、1％CaCl2用量和系统pH三个因素进行处理石化废水的正交实验。每个因素各取三个水平，MBF用量取1．0ml、1．5ml、2．0ml，l∞∞∞∞∞∞∞m0n第3章结果与讨论％CaCl2用量取4,5ml、5．0ml、5．5ml，系统pH取9．0、10．0、11．0。正交实验结果见表3．22。同时复合菌群处理石化废水的CODc，去除率和絮凝率的方差分析见表3．23、表3．24。正交实验因素与水平见表3．21。表3．213囡素3水平正交实验因子水平表3．22处理石化废水正交实验表L0(33145．40／64．4045．40／69．1145．10／71．2260．43／74．0056．03／71．8453．53／71．6748．57／69．4448．57／66．8951．37／65．5615．00／9．6010．63／4．958．43／5．6633．151．946．260．669．35I．442．550．848．165．3370．2057．6775．0072．0075．1767．OO73．3374．00注：万和R行中，斜线上方以CODo去除率计，斜线下方以浊度去除率计。5012323l312l23l23l23i23●23456789一q一也一bRn第3章结果与讨论方差平方和自由度均方F值Fe显著性来源SfV从正交实验表3．22可以看出，用复合菌群所产MBF处理石化废水时，MBF用量、1％CaCl2用量和系统pH三个因素对复合菌群CODc，去除率的影响大小依次为：MBF用量、1％CaCl2用量、系统pH，即A282C2。三个因素对复合菌群浊度去除率影响大小依次为：MBF用量、系统pH、1％CaCl2用量，即A2C282。根据表3．23和表3．24对处理石化废水CODc，去除率和浊度去除率进行方差分析，其中表3．23中，对复合菌群CODc，去除率的影晌大小分析得出只有因素A的F值>Fe值，说明因素A的影响显著，即MBF用量为最主要的因素。从表3．24中可以看出，对复合菌群浊度去除率的影响大小的因素中，A的F值>Fe值，说明因素A的影响显著。最佳去除CODc，工艺为：投加1．5mlMBF、5．0mll％CaCl2于100ml石化废水中，调节pH值至10．0，摇匀后静置10min。在该优化条件下，实验得出CODc，去除率达到71．52％。最佳去除浊度工艺为：投加1．5mlMBF、5．0mll％CaCl2于100ml石化废水中，调节pH值调至10．0，摇匀后静置10min。在该优化条件下，实验得出浊度去除率达77．85％。n第3章结累与讨论3．9．5絮凝过程实验将按照最佳去除CODc，工艺投加了絮凝剂的石化废水摇匀后静置，在不同的静置时间段取上清液，测定其COD。，。结果见表3．25和图3．17。表3．25CODc,随时间变化关系OlO20304050时间(Illin)图3．17CODcr随时间变化关系将按照最佳去除浊度工艺投加了絮凝剂的石化废水摇匀后静置。在不同的静置时间取上清液，测定其OD525。结果见表3．26和图3，18。啪㈣枷猢o(1＼彗I)-uooon第3章结果与讨论表3．26ODⅢ随时间变化关系0．20．1620．12吕0．08O．04O10203040时间(Ⅲin)图3．18浊度随时间变化关系从图3．17和图3．18中可以看出，在颗粒絮凝沉降过程中，当较粗颗粒沉降后，剩下的较细颗粒沉降渐趋缓慢，在较长时间内上清液中的CODc，和OD525几乎保持不变，它们与沉降时间的关系类似于双曲线的一部分。因此，采用双曲线模式对实验数据进行拟合。旦：卜—L(3．1)Coa+bt式中：t——石化废水静置时间，rain；n第3章结果与讨论Co_一石化废水原水的OD525(A)或CODc，(mg／L)；Ct——处理后石化废水静置t时间的OD525(A)或CODcf(mg／L)；a，b——拟合参数。由式(3．1)aT知，当t趋于无穷大时，Co=l—b。因此，参数b可用来反映絮凝沉降的快慢，b的绝对值越小，相对浓度衰减越快，一b、>Ks时，则得到：u2‰(3．8)对以上的降解曲线使用该动力学方程进行拟合，可以得到以下动力学方程：Ct=Coe揶0333‘(rag／L)(3．9)上式即为复合菌群油降解浓度与时间的关系。喜}伽伽亘|蓍|卿啪啪瑚∞。2≥d囊善盘震n第4章结论与建议4．1结论(I)本课题利用筛选到的絮凝剂产生菌和油降解菌，构建出具有絮凝和降解油双重功能的复合菌群(JJDF6+OSHDF4+JJY2)。通过正交实验和方差分析，得到絮凝的优化培养条件是：将1．5ml的JJDF6种子液、1．5mlQSHDF4种子液和1．5mlJJY2的种子液将种至50IIll替碳替氮含油发酵培养基，调pH为10．0，在摇床培养箱中30。C、160rpm条件下培养72h。在该优化条件下，MBF的絮凝率B为92．21％。油降解率的优化培养条件为：将1．5mI的JJDF6种子液、1．5mlQSHDF4种子液和1．5mlJJY2的种子液将种至50ml替碳替氮含油发酵培养基，调pH为10．0，在摇床培养箱中30℃、160rpm条件下培养72h。在该优化条件下，油去除率为91．18％。(2)以蜂蜜废水和氨厂尿素生产废水代替通用发酵培养基中的碳源和氮源，对复合菌群培养过程进行优化。菌群JJDF6+QSHDF4+JJY2的最佳替代发酵培养基的优化条件为以CODc，为9000mg／L的蜂蜜废水代替通用发酵培养基中的葡萄糖，并以氨氮含量为200mg／L的氨厂尿素生产废水取代发酵培养基中的氮源，其它成份不变，配制成替碳替氮发酵培养基。(3)对复合菌群的发酵液进行提纯固化。制得部分纯化的MBF，产率为15g(絮凝剂)／L(发酵液)。对部分纯化的固态MBF定性成分分析实验表明，复合菌群所产的MBF主要成分为多糖类物质。(4)对构成复合菌群的JJDF6、QSHDF4和JJY2进行了初步鉴定。参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)，初步判断QSHDF4为短杆菌属，JJY2为奈瑟氏球菌属；参照《真菌鉴定手册》初步判断JJDF6为酵母属。(5)复合菌群所产MBF对石化废水有较好的处理效果。MBF用量、l％CaCh用量和系统pH三个因素对复合菌群CODc，去除率的影响大小依次为：MBF用量、1％CaCl2用量、系统pH。三个因素对复合菌群浊度去除率影响大小依次为：MBF用量、系统pH、l％CaCl2用量。最佳去除CODcf工艺为：投加1．5mlMBF、5．0mll％CaCl2于100ml石化n第4章结论与建议废水中，调节pH值至10．0，摇匀后静置10min。在该优化条件下，CODc，去除率可达71．52％。最佳去除浊度工艺为：投加1．5mlMBF、5．0ml1％CaCl2于100ml石化废水中，调节pH值调至10．0，摇匀后静置10min。在该优化条件下，浊度去除率达77．85％。复合菌群所产MBF处理替碳替氮废水去除CODc，的动力学方程和去除浊度的动力学方程分别为：ct=Co(1一虿磊页蒜)‘mg，L’和G=co‘1一三而F蒜’(A)。动力学研究表明复合菌群对油的降解时间和油浓度为一级反应，得到动力学方程为Ct--C。e加·033孔。(6)复合菌群所产MBF的主要絮凝机理是“吸附架桥”。MBF中含有多糖，分子量大，分子链的伸展性好，分子的有效长度较大，极易发生架桥作用，且含有大量的．OH．及．COO．等活性基团，因此MBF分子能在Ca2+的作用下压缩商岭土颗粒表面双电层，降低高岭土颗粒表面的电负性，并借助范德华力、氢键及其它化学键形式吸附到颗粒表面，形成较强的吸附作用。4．2建议(1)在己有的研究成果基础上更系统深入地开展机理研究。对特定絮凝剂和胶体颗粒的组成、结构、电荷及各种反应条件作定性定量的分析。减少微生物絮凝工作中的盲目性，以便控制絮凝剂发挥作用的最优条件。(2)进一步考察复合菌群之间各菌的生态协同效应与相互增殖关系，为复合菌群的构建提供理论指导。(3)防止菌种退化，做好菌种的妥善保护工作。n致谢我的论文是在导师林波教授的精心指导和亲切关怀下完成的，从论文的选题，到实验方案的建立、到实验的阶段进展、到论文的最后审阅，无不渗透了林老师的大量心血。林老师学识渊博，治学严谨，诲人不倦，为人正直，淡泊名利，德高望重。导师在环境科学与工程领域的敏锐洞察力和丰富实践经验，让我受益非浅。导师在思想上、品质上的言传身教，使我从中领悟到许多在书本上学不到的东西。在此，我向导师表示最衷心的感谢。感谢胡九成教授在论文撰写过程中提出的宝贵建议。，在分析实验中，戴宝麟副教授给予我精心指导，在此向戴老师表示我最衷心的感谢!感谢黎俊老师和姚彦红老师在微生物实验方面的悉心指导。学习期间，南昌大学环境科学与工程学院和南昌大学环境工程教研室的各位领导和老师给了我许多关心和帮助。感谢万金保老师．刘雷老师、何宗健老师等对我学习的帮助和生活的关心。感谢张文涛老师在实验药品和设备上给予我的大力支持。感谢我的师姐李昌花对我的无私帮助及同学左燕君，杨圣云和师弟师妹在实验上给了我真诚的帮助和支持。感谢我的家人对我的理解与支持!在此，谨向他们表示我最衷心的感谢和最崇高的敬意!一孙娜2007年5月n参考文献[193[20]E21]房秀福，李浩然，王玉兰．水处理中絮凝剂的研究进展【J】．黑龙江水利科技，2005，3(33)马青山，贾瑟，孙丽珉等．絮凝化学和絮凝剂(第l版)O吲．北京：中国环境科学出版社，1990．苑云英，黄明华，岑运华．微生物絮凝剂刍议【J】．环境科技，1992，12(6)：21-23．茹至刚废水治理工程技术[MI．北京：中国环境科学出版社，1989．DavidPollsrd．ScreeningofBilfloceulant-ProdueingMicrobesUtilizingFattyAcidsandtheirPropertiesofProducingFlocculates[J]．AustralianMiner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