酱油酿造废水处理系统中微生物时空分布特征及相关环境因子分析 66页

硕士学位论文酱油酿造废水处理系统中微生物时空分布特征及相关环境因子分析作者姓名叶冬冬学科专业发酵工程指导教师罗立新教授所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2018年4月nSpatio-temporalDistributionofMicrobialCommunitiesInFull-scaleSystemTreatingSoySauceBrewingWastewaterandAnalysisofRelatedEnvironmentalFactorsADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：YeDongdongSupervisor：Prof.LuoLixinSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,Chinan分类号：Q93学校代号：10561学号：201520133838华南理工大学硕士学位论文酱油酿造废水处理过程中微生物群落时空分布特征及相关环境因子分析作者姓名：叶冬冬指导教师姓名、职称：罗立新教授申请学位级别：工学硕士学科专业名称：发酵工程研究方向：工业微生物学论文提交日期：2018年4月27日论文答辩日期：2018年6月1日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：林影委员：林炜铁崔堂兵李爽梁书利n华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研宄成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：讨身身：日期：Ｖｆｉ年Ｓ月４日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，艮Ｐ：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅（除在保密期内的保密论文外）学校可以公布学位论文的全；部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文一。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相致。本学位论文属于：□保密，（校保密委员会审定为涉密学位时间：年日）＿月＿于年月日解密后适用本授权书。＿＿益不保密，同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览；同意将本人学位论文提交中国学术期刊（光盘版）电子杂志社全文出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，传播学位论文的全部或部分内容。“”（请在以上相应方框内打Ｖ）作者签名：日期：指导教师签名：ｔ日期n摘要酱油工业化生产产生大量废水，对生态环境造成严重的影响。厌氧/缺氧/好氧-膜生物反应器组合工艺（A2O-MBR）是目前处理酱油酿造废水最主要的方法，活性污泥中复杂的微生物群落对污染物的去除起着十分重要的作用，其时空分布特征与污染物去除息息相关，且受到环境因子的影响。目前，酱油酿造废水处理过程中微生物群落的时空分布特征及相关环境因子的研究相对较少。运用16SrRNA基因和16SrRNA高通量测序研究A2O-MBR系统处理酱油酿造废水过程中微生物的群落结构和代谢活性。在DNA和RNA水平上，微生物群落具有不同的多样性。Proteobacteria是丰度最高、代谢最活跃的细菌。丰富的Megasphaera、Thauera和Azoarcus代谢活性较低，而少量存在的Psychrobacter在厌氧池中具有最高的代谢活性。Cenarchaeales是最丰富、最活跃的古菌目，大多数的氢营养型产甲烷菌与Megasphaera存在互养关系。少量存在的Methanosarcinales和Nitrosopumilales在缺氧池中具有较高的代谢活性。此外，通过基于DNA和RNA的qPCR对细菌和古菌进行定量，发现16SrRNA/rRNA基因拷贝数比率随着污水处理的进行呈逐渐下降的趋势。其次，运用16SrRNA基因和16SrRNA高通量测序研究A2O-MBR系统处理酱油酿造废水过程中微生物的时空分布特征及与环境因子的关系。与古菌不同，总的和活的细菌呈现季节性的聚类。Firmicutes和Planctomycetes在夏季和秋季的相对丰度增加，而Thaumarchaeota相对丰度减少。在冬季，Prevotella_9和Lactobacillus的代谢更加活跃。温度、pH、化学需氧量（COD）、总氨氮（TAN）、硝酸盐氮（NO--N）是影响3细菌和古菌组成的主要环境因子。Firmicutes和Bacteroidetes与COD和TAN呈正相关，而Proteobacteria呈负相关。SM1A02在夏季和秋季的相对丰度增加，与温度呈正相关。Methanomicrobiales与TAN呈正相关，对氨具有高亲和力。此外，总的细菌生物量在冬季明显增加，并且高温促进微生物生物量的动态变化。FAPROTAX预测表明细菌的代谢功能没有明显的季节性差异，化能异养、好氧化能异养、发酵、硝酸盐还原、氮呼吸是细菌主要的代谢功能。总之，该研究分析了酱油酿造废水处理过程中微生物群落的时空分布特征及相关环境因子，为酱油酿造废水处理提供理论依据和数据支撑。关键词：微生物群落结构；时空分布；16SrRNA基因和16SrRNA高通量测序；荧光定量PCR；酱油酿造废水InAbstractIndustrialproductionofsoysaucehasresultedinlargequantitiesofeffluents,representinganimportantsourceofpollution.Currently,anaerobic-anoxic-aerobicmembranebioreactorprocess(A2O-MBR)isthemostcommonlyappliedfortreatmentofsoysaucebrewingwastewater.Highlydiversemicroorganismswithinactivatedsludgearefunctionallyimportantforpollutantsremoval,whosespatio-temporaldistributionarerelatedtotheratesofcontaminantsremovalandinfluencedbyenvironmentalfactors.Nevertheless,stillcomparativelylittleisknownaboutthespatio-temporaldistributionofmicrobialcommunitiesinthesoysaucebrewingwastewatertreatmentprocessandrelatedenvironmentalfactors.MicrobialcommunitystructuresandmetabolicactivityintheA2O-MBRsystemtreatingsoysauce-producingwastewaterwerestudiedusing16SrRNAgeneandrRNAhigh-throughputsequencing.AtDNAandRNAlevel,microbialcommunitiesharboreddistinctbiodiversity.Proteobacteriawasthemostabundantandactivephyluminactivatedsludge.AbundantMegasphaera,ThaueraandAzoarcuswereinslowmetabolism,whilePsychrobacterwithlowabundancehadthehighestpotentialforactivityintheanaerobictank.Asforarchaea,CenarchaealeswasthemostabundantandactiveorderandalargeamountofhydrogenotrophicmethanogenskeptsyntrophicwithMegasphaera.Theraretaxa,suchasMethanosarcinalesandNitrosopumilales,hadahighpotentialforactivityintheanoxictank.Furthermore,thetotalandactivemicrobeswerequantifiedviaDNAandRNA-basedqPCRandthe16SrRNA:rRNAgeneratiosofbacteriaandarchaeadecreasedalongwiththetreatmentprocess.Next,spatio-temporaldistributionofmicrobialcommunitiesandrelatedenvironmentalfactorsintheA2O-MBRsystemtreatingsoysauce-producingwastewaterwereinvestigatedusing16SrRNAgeneandrRNAhigh-throughputsequencing.Distinctfromthearchaealcommunity,thetotalandactivebacteriawereseasonallyclustered.FirmicutesandPlanctomycetesincreasedtheirabundanceinsummerandautumn,whileThaumarchaeotadecreased.Inwinter,Prevotella_9andLactobacillusshiftedtobemoremetabolicallyactive.qPCRresultsshowedthatthebiomassofthetotalbacteriasignificantlyincreasedinwinterandhightemperaturefacilitatedthedynamicchangesofarchaealbiomass.Temperature,pH,chemicaloxygendemand(COD),totalammonianitrogen(TAN)andnitratenitrogen(NO--N)3weremajorfactorsinfluencingthestructureofmicrobialcommunities.FirmicutesandBacteroideteswerepositivelycorrelatedwithCODandTAN,whileProteobacterianegativelycorrelated.SM1A02increaseditsabundanceinsummerandautumnandpositivelycorrelatedIInwithtemperature.Methanomicrobialeswaspositivelycorrelatedwithtotalammonianitrogen,highlyaffiliativewithammonia.Furthermore,thebiomassofthetotalbacteriasignificantlyincreasedinwinterandhightemperaturefacilitatedthedynamicchangesofmicrobialbiomass.FAPROTAXpredictedthatthemainmetabolicfunctionsoftaxawerechemoheterotrophy,aerobicchemoheterotrophy,fermentation,nitratereductionandnitrogenrespirationwithnosignificantseasonaldifferences.Altogether,thisstudyinvestigatedthespatio-temporaldistributionofmicrobialcommunitiesandrelatedenvironmentalfactorsduringthesoysaucebrewingwastewatertreatmentprocess,andprovidedtheoreticalbasisanddatasupportfortreatmentofsoysaucebrewingwastewater.Keywords:microbialcommunitystructure;spatio-temporaldistribution;high-throughputsequencingof16SrRNAgeneand16SrRNA;qPCR;soysaucebrewingwastewaterIIIn目录摘要.............................................................................................................................................IAbstract.....................................................................................................................................II第一章绪论..............................................................................................................................11.1酱油酿造废水概述.............................................................................................................11.1.1酱油酿造废水来源及特点.......................................................................................11.1.2酱油酿造废水对环境的危害...................................................................................11.1.3酱油酿造废水处理方法...........................................................................................11.2活性污泥法概述.................................................................................................................21.2.1活性污泥法...............................................................................................................21.2.2A2O-MBR组合工艺.................................................................................................21.3活性污泥微生物研究现状.................................................................................................21.3.1活性污泥微生物群落结构及多样性.......................................................................21.3.2活性污泥微生物代谢活性.......................................................................................31.3.3活性污泥微生物生物量...........................................................................................31.3.4季节性对活性污泥微生物的影响...........................................................................31.4本文研究的目的意义和内容.........................................................................................41.4.1研究目的和意义.......................................................................................................41.4.2研究内容...................................................................................................................4第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析..........................................62.1材料与方法..................................................................................................................62.1.1仪器与试剂...............................................................................................................62.1.2实验材料及预处理...................................................................................................72.1.3核酸的提取及反转录...............................................................................................82.1.4不同功能池细菌及古菌生物量测定.......................................................................82.1.5细菌及古菌16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序分析.................................92.2结果与讨论...................................................................................................................102.2.1酱油酿造废水处理过程中微生物多样性的分析.................................................102.2.2酱油酿造废水处理过程中细菌的群落结构和代谢活性.....................................122.2.3酱油酿造废水处理过程中古菌的群落结构和代谢活性.....................................15IVn2.2.4酱油酿造废水处理过程中微生物的生物量.........................................................162.3本章小结.......................................................................................................................18第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析................................................193.1材料与方法...................................................................................................................193.1.1仪器与试剂.............................................................................................................193.1.2实验材料及预处理.................................................................................................193.1.3核酸的提取及反转录.............................................................................................193.1.4不同功能池细菌及古菌生物量测定.....................................................................193.1.5细菌及古菌16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序分析...............................193.2结果与讨论...................................................................................................................203.2.1季节性对酱油酿造废水处理过程中微生物多样性的影响.................................203.2.2季节性对酱油酿造废水处理过程中细菌群落结构的影响.................................243.2.4季节性对酱油酿造废水处理过程中微生物生物量的影响.................................283.2.5季节性对酱油酿造废水处理过程中微生物功能的影响.....................................293.3本章小结.......................................................................................................................31第四章酱油酿造废水处理过程中环境因子与微生物群落的关系....................................324.1材料与方法...................................................................................................................324.1.1仪器与试剂.............................................................................................................324.1.2实验材料及预处理.................................................................................................354.1.3废水理化指标的测定.............................................................................................354.1.4RDA及网络分析....................................................................................................354.2结果与讨论...................................................................................................................364.2.1酱油酿造废水处理过程中废水理化性质.............................................................364.2.2酱油酿造废水处理过程中细菌群落结构与环境参数的关系.............................384.2.3酱油酿造废水处理过程中古菌群落结构与环境参数的关系.............................394.3本章小结.......................................................................................................................41结论与展望..............................................................................................................................42参考文献..................................................................................................................................44攻读硕士学位期间取得的研究成果......................................................................................55致谢..........................................................................................................................................56Vn第一章绪论第一章绪论1.1酱油酿造废水概述1.1.1酱油酿造废水来源及特点酱油是中国传统调味品，是以大豆、脱脂大豆、小麦、麦麸等为原料，经微生物发酵酿制而成[1]。一般酱油的生产工艺过程包括原料处理、制曲、发酵、浸出淋油及加热配制等工序。在该过程中将产生大量的废水，主要来源于包装容器的清洗消毒废水、生产场地及设备的清洗废水、原料浸泡废水和发酵罐池的冲洗废水[2]。成分复杂，是一种重要的污染物。废水中的主要成分包括粮食残留物、发酵过程产物、微量洗涤剂、消毒剂、大量盐分、各种微生物及其分泌的酶和代谢产物等等。导致废水呈现较高的色度，处理具有一定的难度。此外，酱油酿造废水具有有机物浓度高、氨氮高、盐度大、有异味，但可生化性好等特点[3]。同时，大多数酱油生产企业都是间歇性或季节性生产不同品类的调味品，导致污水成分及水量变化较大。1.1.2酱油酿造废水对环境的危害传统调味品的持续生产和工业化导致环境污染问题突出，尤其是酱油酿造工业。据测算，每生产1t酱油将产生6-9t的酱油废水[4]。这些大量的酱油酿造废水含有较高的有机物、氮、磷浓度，对环境具有极其严重的影响。若直接排入湖泊、河口、海湾等缓流水体，能够引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，导致水体溶氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡，出现水体富营养化。此外，酱油酿造废水含盐量高，可破坏土壤结构，分散土壤胶体，使土壤中的缓效性氮和钾释放出来，使得土壤中速效养分进一步增加[5]。对环境造成极其严重的后果，同时对人们饮用水安全造成极大的威胁[6]。1.1.3酱油酿造废水处理方法目前，酱油酿造废水常用的处理方法有物理、化学和生物方法：物理法包括进水口设置细格栅、气浮法、吸附法、渗析法等；化学法包括氧化还原法、化学絮凝法等；生物法包括厌氧生物处理、好氧生物处理、膜生物反应器技术、光合细菌法等[7]。因酱油酿造废水的BOD/COD（生化耗氧量/化学需氧量）大于0.5，可生化性好，目前广泛采用的生化处理方法就具有较为理想的出水效果。然而酱油酿造废水也具有高色度、高盐度的特点，在进行生化处理前有必要进行一定的物理化学预处理或后处理。1n华南理工大学硕士学位论文1.2活性污泥法概述1.2.1活性污泥法活性污泥法是利用微生物新陈代谢降解有机污染物的生物处理技术，目前被广泛应用于废水处理，其处理效率以及出水水质主要取决于组成活性污泥的微生物种类、数量、特性等。活性污泥成分复杂，不仅包括吸附污水中的有机和无机物质，还包括有代谢功能的活性微生物群体，微生物内源呼吸和自身氧化的沉淀[8]。里面的微生物主要有细菌、真菌、原生动物和后生动物等。其中起主要净水作用的是细菌[6,9,10]。这些微生物不仅参加一些小分子细胞新陈代谢，而且通过酶的水解作用使得大部分大分子有机物通过一系列的水解反应变成可被细菌细胞吸收的较小单位的物质。活性污泥中微生物群落的多样性已成为当今研究的热点。1.2.2A2O-MBR组合工艺厌氧/缺氧/好氧（A2O）与膜生物反应器（MBR）等传统工艺的结合被证明是处理污水的有效手段之一[11]。可使出水稳定达到GB/T18920-2002的要求，用于冷却、冲洗、浇灌等方面，在缓解水资源短缺方面具有示范作用。A2O-MBR活性污泥法是目前处理酱油酿造废水常用的方法，其工艺流程简单、操作成本低和能源需求低，能够实现稳定[12]。污水通过格栅、沉砂池、调节池等预处理，进入A的脱氮除磷2O生化池，经过生化处理后泥水混合液进入膜池，通过中空纤维膜分离实现出水。1.3活性污泥微生物研究现状1.3.1活性污泥微生物群落结构及多样性活性污泥中含有大量必要的微生物，对污染物的降解及去除起着关键作用[13]。提高活性污泥微生物群落种类和结构的多样性，有助于提高废水处理系统的整体效果，降低处理成本。变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和硝化螺菌门（Nitrospirae）被发现是活性污泥主要的细菌类群，对有机物的转化起着重要作用，并参与氮、磷、硫的生物化学循环[14-16]。相比于细菌，古菌在废水处理过程中的多样性要比细菌群落低几十到几百倍，甚至几千倍，对N、C、P的去除作用也不甚明显。然而，古菌在其他方面具有重要的功能，比如与细菌的共生关系[17]、产生甲烷[18]、形成膜结构[19]等。研究这些菌群的作用及功能，不仅需要了解活性污泥中微生物的群落结构及多样性，还需要了解它们的代谢活动，以及在不同条件下的动态变化。2n第一章绪论1.3.2活性污泥微生物代谢活性活性污泥微生物具有不同的代谢状态，例如，生长、活跃、休眠和死亡，导致污水处理过程中不同的污染物去除效率[20]。具有代谢活性的微生物在活性污泥中起着决定性的作用，因此，为进一步阐述微生物的作用，将微生物的功能与它们的代谢状态联系起来是十分必要的。目前，高通量测序（IlluminaHiSeqSequencing）已成为一种研究污水处理过程中微生物群落结构及多样性的常用技术。然而，大多数的扩增子测序集中于rRNA基因（rDNA），代表总的微生物，无法区分样本中的死亡、休眠或代谢活跃的部分[6,21-23]。rRNA转录子是较好的标记，比rDNA灵敏度高，可准确反映细胞水平的微生物群落变化，目前已被广泛应用于鉴定环境样品中微生物的代谢状态[24,25]。对某些微生物类群，更高的RNA/DNA比率代表更高的代谢活性[26]。此外，比较DNA和RNA水平上的微生物能更好地研究影响复杂微生物群落结构的环境因素[24]。Romanowicz揭示pH和土壤水分能够影响森林土壤中总微生物和活性微生物的组成[27]。当前已有研究开始采用DNA和RNA的方法分析环境微生物的代谢活性[28,29]。Smith报道，在嗜冷厌氧MBR处理生活污水的过程中，随着温度从15℃降到3℃，膜上微生物的代谢多样性逐渐增加，以响应膜上更高的有机物浓度[30]。因此，通过DNA及RNA的联合分析，探究污水处理过程中微生物代谢活性是十分重要的。然而，酱油酿造废水处理过程中DNA和RNA水平上的微生物生物量、群落结构的季节性变化和代谢活性的动态演变到目前少有研究。1.3.3活性污泥微生物生物量活性污泥中含有丰富的微生物种类和生物量浓度，是目前研究微生物多样性的重要资源[9,13]。里面的微生物是由细菌、真菌、原生动物和后生动物等多种群体组成的混合群体。对于环境微生物的研究主要是依赖于纯培养，然而环境微生物中只有一部分的菌群能被分离培养。随着分子技术的出现，极大促进微生物多样性的研究。与宏基因组测序等测序技术相比，荧光定量PCR（qPCR）技术能确定出样品中菌体的具体数量，同时具有操作简便、快速高效、特异性强、高通量等特点，目前已被广泛应用于活性污泥中微生物群落的定量分析[31]。1.3.4季节性对活性污泥微生物的影响微生物的群落结构以及代谢活性通常受到环境条件的影响[32]。在实际污水处理过程中，现有的研究多集中于揭示了微生物群落结构与环境条件在某一时刻的相关性[33-35]。3n华南理工大学硕士学位论文然而，污水处理厂进水的水质和水量随着季节而发生周期性的变化，能够影响活性污泥中微生物的生长和繁殖，进而影响污水处理厂的处理效率等[36,37]。水质和操作参数的季节性波动，例如COD、氨氮（TAN）、盐度、pH值、温度和溶氧（DO）水平，可以导致微生物生物量、菌群结构以及代谢活性发生显著的变化[38]。其中以温度的变化最为显著，能够影响微生物的比增长速率，尤其在冬季低温的环境下，硝化作用和反硝化作用将受到严重抑制。因此，季节性变化是联系微生物群落结构与环境因素[39]和评估污水处理过程稳定性[40]的重要方法。不同生态系统中微生物群落的季节性分布，例如海洋[41]、河流[21]、土壤[42]等，已被广泛的研究。然而，酱油酿造废水处理系统中微生物的季节性分布到目前少有研究[43,44]。1.4本文研究的目的意义和内容1.4.1研究目的和意义酱油作为人们日常生活中的调味品，随着产量的增加，所产生的废水治理问题也受到越来越多的关注。A2O-MBR活性污泥法是目前处理酱油酿造废水最主要的方法，活性污泥中的微生物对污染物的去除起着重要的作用。目前，高通量测序已成为研究环境微生物的常用技术，不过大多数的研究是基于DNA，无法区分样本中代谢活跃的部分。然而，以16SrRNA为分子标记可以评估环境样本中微生物的代谢状态。此外，季节性变化能够改变水质、水温、处理效率等，是联系微生物群落结构与环境因素和评价废水处理过程稳定性的一种方法。应用16SrRNA基因和16SrRNA高通量测序和qPCR技术，研究酱油酿造废水处理过程中微生物群落的时空分布特征和对环境因子的响应，对于调控和优化污水处理系统、揭示微生物的迁移转化规律、有针对性地开展生物法污水处理具有重要意义。1.4.2研究内容1.本文以广东某酱油酿造厂A2O-MBR废水处理系统为研究对象，依次采集调节池、厌氧池、缺氧池、好氧池中水样。应用16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序技术，研究酱油酿造废水处理过程中细菌及古菌群落结构动态演变规律。通过比较DNA及RNA水平上相对丰度的差异，研究酱油酿造废水处理过程中微生物代谢活性的动态变化。同时利用qPCR技术研究酱油酿造废水处理过程中微生物生物量动态变化规律。2.结合应用16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序和qPCR技术，分别于春、夏、秋、4n第一章绪论冬4个季节，采集调节池、厌氧池、缺氧池、好氧池、MBR池中水样，研究酱油酿造废水处理过程中微生物群落的时空分布特征。在此基础上，利用主坐标分析（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA）及聚类分析（ClusterAnalysis，CA），研究酱油酿造废水处理过程中微生物群落结构季节性演变规律；采用qPCR技术研究酱油酿造废水处理过程中微生物生物量季节性变化规律；利用原核微生物注释代谢数据库（FAPROTAX）预测微生物群落的功能组成。通过统计学检验，分析季节性是否对酱油酿造废水处理过程中微生物群落的多样性、群落结构、生物量、代谢活性以及功能组成具有显著性的影响。3.分别于春、夏、秋、冬4个季节，测定调节池、厌氧池、缺氧池、好氧池、MBR池中水样的COD、TAN、总氮（TN）、总磷（TP）、硝酸盐氮（NO--N）、pH、DO、3温度、盐度等9项基本理化指标。研究酱油酿造废水处理过程中废水理化性质的变化规律，结合微生物的群落分布，采用生物学软件进行冗余分析（RedundancyAnalysis，RDA）及网络分析，研究影响微生物群落结构的主要因素，并揭示微生物群落结构与环境因子的关系。5n华南理工大学硕士学位论文第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析2.1材料与方法2.1.1仪器与试剂2.1.1.1主要试剂表2-1主要试剂及其规格、生产厂家Table2-1Thechemicalcategoryandmanufactureofreagent名称化学规格生产厂家琼脂糖生化法国Biowest公司EDTA超级纯广州威佳科技有限公司10×LoadingBuffer生化宝生物工程有限公司6×LoadingBuffer生化宝生物工程有限公司DL10000Marker生化TakaRa(大连)有限公司DL2000Marker生化TakaRa(大连)有限公司ExTaqDNA聚合酶(预混)生化TakaRa(大连)有限公司2.1.1.2主要仪器表2-2主要仪器及型号、生产厂家Table2-2ExperimentalInstruments仪器名称型号生产厂家高压灭菌锅LS-50HD型江阴滨江医疗设备有限公司去离子水生成器ADAP-24V型锐思捷科学仪器有限公司微量电子天平AS220.R2型RADWAG公司采水器ZH7102型北京中慧天诚科技有限公司混合仪MIX-25P型杭州米欧仪器有限公司金属浴仪K20型杭州奥盛仪器有限公司干燥箱GZX-9140MBE型上海博讯实业有限公司台式高速大离心机5804R型Eppendorf公司台式高速冷冻离心机Z323KHERMLE公司台式高速小离心机5418型Eppendorf公司生化培养箱SPX-250B-2型上海博讯实业有限公司双层恒温培养摇床SUKUN型宝生物工程（大连）有限公司超净工作台SW-CJ-1F型苏州净化设备有限公司水浴锅HWS-26型上海一恒科学仪器有限公司微波炉P70F23P-G5（SO）型格兰仕微波炉电器有限公司超微量分光光度计ND-1000型赛默飞世尔科技公司PCR扩增仪Mastertycler型Eppendorf公司ABI7500型实时荧光定量PCR仪赛默飞世尔科技公司6n第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析DNA电泳仪DYY-4C型北京市六一仪器厂凝胶成像仪UniversalHoodII型号Bio-Rad公司测序仪2500型Illumina公司2.1.1.3主要试剂的配制方法1)TE缓冲液：1mmol/L的EDTA，10mmol/L的Tris-HCl，将pH调至8.0。2)1×TAEBuffer缓冲液：1mmol/L的EDTA，40mmol/L的Tris-乙酸钠，经高温灭菌后于常温保存。3)50×TAEBuffer的配制：分别量取冰醋酸57.1mL，100mL的pH=8.0的0.5mol/LEDTA，并称取Trisbase242g，然后用无菌水定容到1L，经过高压灭菌后于室温保存。4)大肠杆菌感受态制备溶液：TFB1溶液的配置：100mmol/L的氯化钾，30mmol/L的醋酸钾，10mmol/L的氯化钙，50mmol/L的氯化锰，用冰乙酸将pH调至5.8，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌。2.1.2实验材料及预处理选取广东某酱油酿造厂废水处理系统为研究对象，其采用A2O-MBR组合工艺处理酱油酿造废水，日处理能力为2500m3/d，平均流量为104.17m3/h。包括依次序相互连通的调节池（TJ）、厌氧池（AT）、缺氧池（QT）、好氧池（OT）、MBR池（MBR）。具体的流程图如图2-1。OT和QT分别通过硝化和反硝化作用去除氮；OT和AT同时用来去除磷；而且，整个废水处理过程都能用来去除COD[13]。此废水属于典型的高有机物负荷废水，进水COD平均值为2500mg/L，平均BOD为1500mg/L，平均氨氮为150mg/L，平均固体悬浮物浓度为300mg/L。于2016年1月15日使用采水器采集TJ、AT、QT、OT的混合废水，取样深度为3~4m。取完样品后迅速放置于-20℃冰箱保存。并分别取10mL样品，4℃，6,000rpm离心10min，收集沉淀储存于-80℃。图2-1污水处理过程流程图Fig.2-1Schematicdiagramofsewagetreatmentprocess7n华南理工大学硕士学位论文2.1.3核酸的提取及反转录总DNA和RNA分别采用OMEGA公司的SoilDNAKit和SoilRNAKit进行提取，经1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测浓度及纯度。采用Takara公司PrimeScriptRTReagentKit进行逆转录。DNA和cDNA样品于-80℃保存备用。2.1.4不同功能池细菌及古菌生物量测定2.1.4.1荧光定量引物qPCR反应在ABI7500（AppliedBiosystem）荧光定量PCR仪上进行。本实验采用的细菌及古菌的引物如表2-3，由广州艾基生物技术有限公司合成。表2-3qPCR分析引物Table2-3PrimersusedforqPCR引物名称目标序列引物（5’-3’）参考文献338F细菌ACTCCTACGGGAGGCAGC[45]518RATTACCGCGGCTGCTCC340F古菌CCCTACGGGGYGCASCAG[46]519RTTACCGCGGCKGCTG2.1.4.2荧光定量反应体系及程序利用SYBR®PremixExTaqTMII试剂盒（Takara）和FastRealTimePCR扩增仪（7500，ABI）进行实时荧光定量PCR反应。采用八连管，每个样品3个平行，并且制备一组阴性对照。25μL的PCR反应的体系如下：试剂加入量SYBR®PremixEXTaq™II12.5μLRoxDyeII0.5μL引物1(10uM)0.5μL引物2(10uM)0.5μLDNA/cDNA2μLddH2O9μL反应程序如下:预变性95℃30s变性95℃10s退火55℃34s40个循环延伸72℃60s在55℃退火时检测荧光信号。2.1.4.3标准品的准备8n第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析以总DNA为模板，使用338F/518R和340F/519R为引物分别扩增细菌和古菌16SrRNA的V3区，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收，把目的片段克隆到pMD®18-T载体上。使用T4连接酶将纯化后的目的片段与18-T在16℃连接4h。然后10μL连接产物加入100μL感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰上放置1-3min，加入至890μLLB液体培养基，37℃振荡培养1-1.5h，取100μL菌液涂Amp板。然后37℃倒置培养过夜，12h后挑取阳性克隆子进行菌落PCR（引物为通用引物M13R/M13F，酶为ExTaqDNA聚合酶（预混），模板为菌落）。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检验，OMEGA胶回收试剂盒进行纯化，提取的细菌、古菌的质粒DNA浓度约为20ng/μL左右。2.1.4.4标准曲线的绘制通过ND-1000分光光度计检测质粒DNA提取效果及其浓度，根据己知质粒浓度和阿伏伽德罗常数（6.02×10²³）计算出每μL提取的质粒中靶基因的拷贝数，将质粒10倍稀释后作为标准曲线的模板，90μL稀释液+10μL质粒，做6个点，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线。每个浓度3个平行。待反应完成时，以阈值循环数Ct作为横坐标，荧光强度作为纵坐标绘制标准曲线。计算扩增效率，并绘制熔解曲线以考察引物对目标序列扩增的特异性。2.1.4.5数据分析利用7500systemSDSsoftware软件构建标准曲线及对荧光定量数据进行分析及作图。2.1.5细菌及古菌16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序分析2.1.5.1PCR扩增PCR反应使用NewEnglandBiolabs公司的Phusion®High-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer。采用引物515F/806R[6]和519F/915R[47]分别对细菌和古菌DNA和cDNA的16SrRNA的V4区进行扩增。细菌和古菌的反应体系和反应程序相同。反应体系（30μL）：Phusion®High-FidelityPCRMasterMix15μL，0.2mM正反引物，10ngDNA或cDNA模板。反应程序：98℃条件1min，然后98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸60s，如此进行30个循环，最后72℃条件5min。2.1.5.2PCR产物的混样和纯化9n华南理工大学硕士学位论文PCR扩增产物进行等浓度混样，充分混匀之后再使用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，最后，对目的条带使用Qiagen公司的胶回收试剂盒回收产物。2.1.5.3文库构建和上机测序使用Illumina公司的TruSeq®DNAPCR-FreeSamplePreparationKit建库试剂盒进行文库构建。文库构建好后经过Qubit®2.0Fluorometer和Agilent2100Bioanalyzer定量和文库检测，其结果合格后使用IlluminaHiSeq2500PE250（北京诺禾致源）进行上机测序。2.1.5.4数据信息分析利用FLASH（v1.2.7）对下机数据进行拼接和过滤得到原始数据。采用QIIMEpipeline去除低质量的数据[48]。使用GoldDatabase和UCHIME去除嵌合体，得到有效数据[49]。对所有样品的有效数据进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（OperationalTaxonomicUnits），并采用RDPClassifier（v2.2）与GreenGene数据库（v2013.5）进行物种注释分析[50]。利用QIIME（v1.7.0）计算α-多样性和基于加权unifrac距离的β-多样性[51]。使用R语言（v2.15.3）FactoMineR和ggplot2进行聚类分析和主成份分析（PrincipalComponent，PCA），从而分析样品之间的物种组成相似性和差异性。原始数据提交至NCBISRA数据库，序列号为SRP093171。2.2结果与讨论2.2.1酱油酿造废水处理过程中微生物多样性的分析α-多样性指数如OTUs值、Shannon及Chao1等均被检测，其结果如表2-4所示，对不同样品在97%一致性阈值下的α-多样性分析指数进行统计。其中，97%水平下聚类成为一个OTUs的序列被认为可能是源自于同一个种的序列。微生物群落在DNA和RNA水平上具有不同的生物多样性。细菌共有12280个OTUs，古菌共有9881个OTUs。在DNA水平上，OT具有最高的细菌多样性，其次是QT，而TJ和AT具有相似的OTUs值。在RNA水平上，AT具有最高的OTUs，而QT具有极其低的生物多样性。环境条件能很大改变活性微生物的生长情况[23]，表明QT中活的细菌多样性极有可能是受到污水条件的抑制。然而，在所有样品中古菌具有较高的生物多样性，表明污水条件没有对古菌造成抑制作用。该研究中微生物的多样性和丰富性远远高于食物或其他市政污水系统[52,53]。10n第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析表2-4微生物α-多样性指数Table2-4α-diversityindicesofmicrobialcommunities有效标OTUsGood’s样品名ShannonSimpsonChao1ACE签值(97%)coverageBacteriaTJ-DNA5177215376.680.961507.3215370.99AT-DNA5341315117.200.981457.3514810.99QT-DNA6444616306.440.941540.7216150.99OT-DNA4850019987.480.961980.8020060.99TJ-cDNA5715614766.330.961423.8414650.99AT-cDNA5389117947.500.981814.0518180.99QT-cDNA588819202.880.68888.479370.99OT-cDNA5095514144.550.801376.3513950.99ArchaeaTJ-DNA7053912606.370.951147.5512320.99AT-DNA6856213497.010.971295.6313850.99QT-DNA5130110506.300.961160.0111880.99OT-DNA3794410706.920.981015.2810530.99TJ-cDNA7966011436.360.971037.2910930.99AT-cDNA8159613286.440.961253.1613200.99QT-cDNA7865514367.130.981343.5714180.99OT-cDNA3657312457.280.971203.2912320.99图2-2基于OTUs的稀释曲线(a)细菌16SrRNAgene；(b)细菌16SrRNA；(c)古菌16SrRNAgene；(d)古菌16SrRNAFig.2-2RarefactioncurvesofOTUsfor(a)Bacterial16SrRNAgene;(b)Bacterial16SrRNA;(c)Archaeal16SrRNAgeneand(d)Archaeal16SrRNA11n华南理工大学硕士学位论文细菌和古菌的Shannon指数变化范围为2.883-7.497、6.295-7.282。Simpson指数差异较小，变化范围为0.940-0.979。Good’scoverage变化范围为0.988-0.996，表明测序深度足够检测样品中微生物的多样性。稀释曲线（RarefactionCurve）趋向平坦（图2-2），说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种（OTUs）。PCA分析表明微生物群落在DNA和RNA水平上聚类不同（图2-3）。在DNA水平上，AT和QT细菌的组成是相似的，而在RNA水平上，TJ和QT古菌的组成是相似的。基于RNA水平的细菌和基于DNA水平的古菌没有相似性。在DNA和RNA水平上，微生物群落具有不同的多样性和聚类关系，表明总微生物和活的微生物具有不同的群落结构。同时，不同的功能池具有不同的微生物多样性和菌群结构，受每一阶段污水水质和操作参数的影响[54]。图2-3PCA分析(a)细菌16SrRNAgene；(b)细菌16SrRNA；(c)古菌16SrRNAgene；(d)古菌16SrRNAFig.2-3PCAanalysis(a)Bacterial16SrRNAgene;(b)Bacterial16SrRNA;(c)Archaeal16SrRNAgene;(d)Archaeal16SrRNA2.2.2酱油酿造废水处理过程中细菌的群落结构和代谢活性IlluminaHiSeq测序结果显示，细菌序列可分为43个门，其中10个门的相对丰度超过1%（图2-4a）。酱油酿造废水处理过程中细菌类群主要由以下门构成：Firmicutes（30.89%±20.31%）、Proteobacteria（44.57%±28.77%）、Bacteroidetes（15.66%±7.96%）和Actinobacteria（2.61%±2.23%），与近期啤酒废水[55]和高有机物负荷废水[56]的研究结果一致。据研究，在同时反硝化和产甲烷过程中，颗粒状污泥中细菌的优势类群主要有Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes[57]。Ambuchi发现，Chloroflexi是常温厌氧硝化器中的优势菌，参与碳水化合物和细胞材料的降解[58]。而在本研究中Chloroflexi平均相对丰度只有0.31%。同时，研究表明浮霉菌门（Planctomycetes）是有氧颗粒污泥中最主要的细菌门[59]。然而，在本研究中Planctomycetes平均相对丰度小于1%。12n第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析图2-4(a)门水平上细菌群落结构（至少在一个样品中相对丰度>1%）；(b)目水平上古菌群落结构Fig.2-4(a)Bacterialcommunitystructuresatthephylumlevel(>1%abundanceatleastonesample);(b)Archaealcommunitystructuresattheorderlevel为评估微生物潜在的代谢活性，对DNA和RNA水平上的相对丰度进行比较，RNA/DNA>1的微生物被认为具有较高代谢活性。在生物处理单元中，Proteobacteria的RNA/DNA比率大于1，而且总Proteobacteria和活性Proteobacteria相对丰度随着污水处理的进行而增加。废水特性可能适合Proteobacteria的生长和新陈代谢，因此Proteobacteria成为优势菌群并保持新陈代谢活跃[54]。据研究，Proteobacteria是A2O（AO）系统中最主要的细菌门，与MBR和氧化沟系统不同[15,60]。此外，Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria的相对丰度随着污水处理的进行而降低，分别从49.40%、22.85%、6.03%降低至17.39%、13.92%、1.36%。虽然它们RNA/DNA比率（0.12-0.8）代表部分休眠13n华南理工大学硕士学位论文或死亡，但在污染物去除过程中也发挥着十分重要的作用。Firmicutes能降解碳水化合物，参与产酸和碳循环[61]。增加曝气可能导致Firmicutes的损失，因为Firmicutes在缺氧条件下才能快速生长[62]。Bacteroidetes参与蛋白质的降解，并能发酵氨基酸产生乙酸和NH[63][64][65]3。Actinobacteria能在废水系统中进行脱氮活动，而且与污泥的膨胀相关。图2-5属水平上细菌群落结构（至少在一个样品中相对丰度>1%）Fig.2-5Bacterialcommunitystructuresatthegenuslevel(>1%abundanceatleastonesample)至少在1个样本中相对丰度大于1%的细菌属有36个，占细菌的48.43-96%（图2-5）。TJ中复杂的有机物，如糖、蛋白质和脂质被水解成小分子，如氨基酸、长链脂肪酸、单糖和醇类[66]。参与该水解作用的细菌主要包括普氏菌属（Prevotella_9）、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus），分别占总菌的13.78%、12.71%、10.55%。其中，Lactobacillus的RNA/DNA比率大于1，表明其相对活跃，能够代谢大部分的有机物[67]。Prevotella_9和Lactobacillus的RNA/DNA比率小于1，表明在活性污泥中部分休眠或死亡。不动杆菌属（Acinetobacter）和弓形杆菌属（Arcobacter）在AT和QT中RNA/DNA比率范围为2.19-4.39，对氮、磷的去除起着十分重要的作用[68]。利用Acinetobacter和Arcobacter进行生物强化，可能是处理高氮、磷废水的有效途径。脱硫弧菌属（Desulfovibrio）仅在AT中含量较高，相对丰度大于1%，并且RNA/DNA比率14n第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析为3.31。索氏菌属（Thauera）和固氮弧菌属（Azoarcus）属于β-Proteobacteria的反硝化细菌，在OT中大量死亡或休眠，主要由于好氧区发生硝化反应，不适合反硝化细菌的生长。巨型球菌属（Megasphaera）在污水中大量存在（4.75%），而具有较低的生物活性。可能因为Prevotella_9、Lactococcus与Megasphaera竞争底物和分泌细菌素，抑制了Megasphaera的活性[69]。假单胞菌属（Pseudomonas）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）含量较低，但在AT中RNA/DNA比率大于1，表明含量低的微生物代谢可能更加活跃。Psychrobacter的RNA/DNA比率高达88.70。这些细菌具有不同的代谢活性可能是由于污水条件对微生物的选择，以及微生物间的相互作用[40]。2.2.3酱油酿造废水处理过程中古菌的群落结构和代谢活性古菌存在于各种环境中，具有产甲烷、厌氧甲烷氧化和好氧氨氧化等生态功能[18]。在本研究中，酱油酿造废水处理过程中只发现2个古菌门，即奇古菌门（Thaumarchaeota）、广古菌门（Euryarchaeota）。Thaumarchaeota含量最丰富，相对丰度为55.44%-89.96%。然而，在纺织品和市政废水处理系统发现Euryarchaeota占主导地位[39,70]。图2-6属水平上古菌群落结构Fig.2-6Archaealcommunitystructuresatthegenuslevel该废水处理系统共发现8个古菌目（Fig.2-4b），其中餐古菌目（Cenarchaeales）含量最丰富，占Thaumarchaeota99%，能进行氨氧化[71]。随着废水处理过程的进行，15n华南理工大学硕士学位论文Cenarchaeales的代谢更加活跃。此外，Thaumarchaeota中亚硝化侏儒菌目（Nitrosopumilales）和Nitrososphaerales少量存在，相对丰度为0-0.04%。Euryarchaeota包括4个古菌目，并维持着不同的活性，与厌氧消化处理食物废水[72]和AnMBR处理抗生素溶剂废水[73]的结果相似。氢营养型的甲烷杆菌目（Methanobacteriales）和甲烷微菌目（Methanomicrobiales）占Euryarchaeota的绝大部分（71.53%）。细菌的组成是形成产甲烷菌的重要因素。Megasphaera在污水处理过程中广泛存在，能产生H[69]2，与氢营养型的产甲烷菌存在互养关系，这与氢营养型的产甲烷菌在污水处理过程中占主导地位是一致的。然而，氢营养型的产甲烷菌的代谢活性不高，与Megasphaera相同。解乙酸型的甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）相对丰度小于1%，然而在QT中RNA/DNA比率为2.01，表示代谢活跃。同样地，Nitrosopumilales在QT中具有较高的生物活性。甲烷胞菌目（Methanomassiliicoccales）在污水处理过程中大量存在并保持新陈代谢活跃，然而Methanosarcinales代谢不活跃。与细菌相同，古菌的代谢活性受环境条件和菌群间的相互作用的影响。13个古菌属中餐古菌属（Cenarchaeum）含量最高，占古菌的54.73-88.35%（图2-6）。可全部比对为Cenarchaeumsymbiosum，其属于ThaumarchaeotaGroupI.1a，可能具有氨氧化的能力，因在其体内发现能将氨氧化为亚硝酸的氨单加氧酶（AMO）亚基amoA基因[74]。其次是甲烷粒菌属（Methanocorpusculum）、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）和甲烷球形菌属（Methanosphaera），平均相对丰度依次为5.68%、4.02%、2.49%，均能利用H[75,76]2或CO2产生甲烷。在DNA水平上，甲烷粒菌属在AT和QT中相对丰度高达12.23%、12.49%。除这些古菌外，其他9个古菌属占古菌0.36%。与细菌相比，古菌的微生物群落并不复杂，在污水处理过程中对污染物的去除贡献较少。然而古菌的生物功能，包括与细菌的共生关系[17]、产甲烷、形成膜结构[19]，在活性污泥中也具有十分重要的意义。污染物的去除是通过所有功能微生物的共同合作完成的。2.2.4酱油酿造废水处理过程中微生物的生物量qPCR结果显示，在任一污水处理池中，总的和活的细菌比总的和活的古菌更丰富（图2-7），表明细菌在污水处理过程中起着主要作用。之前研究也发现，在废水处理系统[25,77]、淡水湖[78]、人工湿地[79]或高原土壤[80]中，细菌比古菌更丰富。Jang,H.M.研究发现在高负荷食物废水的厌氧消化过程中，古菌数量占总微生物（细菌与古菌之和）的10%[52]。在任一污水处理池中，细菌和古菌16SrRNA拷贝数总是比16SrRNA基因拷贝数多1-2个数量级。可能因为平均每个细胞的16SrRNA和16SrRNA基因拷贝数是不同的，16n第二章酱油酿造废水处理过程中微生物群落及生物量的分析如平均每个细菌细胞有103个16SrRNA拷贝数和4.2个16SrRNA基因拷贝数[81,82]。此外，细胞内16SrRNA拷贝数变化较大，根据细胞代谢状态16SrRNA拷贝数变化范围为10-105。Maza-MárquezP.研究发现在MBR中细菌及Mycolata的16SrRNA拷贝数要比16SrRNA基因拷贝数高2-3个数量级[83]。图2-7(a)细菌16SrRNA基因和16SrRNA拷贝数；(b)古菌16SrRNA基因和16SrRNA拷贝数；(c)细菌及古菌16SrRNA/16SrRNA基因比率Fig.2-7(a)Copiesof16SrRNAgeneand16SrRNAofbacteria;(b)Copiesof16SrRNAgeneand16SrRNAofarchaea;(c)16SrRNA/16SrRNAgeneratiosofbacteriaandarchaea由于环境因素的影响，总微生物和活的微生物生物量任一污水处理单元中是不同的[33,84]。AT和OT总细菌16SrRNA基因拷贝数（3.80×1012、1.56×1012copies/L混合液）比TJ和QT（3.14×1011、3.43×1011copies/L混合液）高一个数量级（图2-7a）。这两个阶段为污水处理过程中的关键步骤，进一步证明细菌在污水处理过程中起着十分重要的作用。此外，AT、QT和OT的总古菌16SrRNA基因拷贝数（1.78×1010-4.67×1010copies/L混合液）比TJ样品（2.42×109copies/L混合液）高一个数量级（图2-7b）。此外，活的细菌和活的古菌16SrRNA拷贝数变化范围分别为2.64×1013-7.11×1013、5.3217n华南理工大学硕士学位论文×1011-3.14×1012copies/L混合液（图2-6a,b）。并且，活的细菌和活的古菌生物量从AT到OT阶段逐渐减少，可能受水质的影响，比如逐渐降低的有机物浓度，与实际污水处理过程是一致的。16SrRNA/rRNA基因拷贝数比率一直被用作微生物代谢活性和生长率的指标，与生物转化和污染物去除相关[85,86]。TJ具有最大的细菌和古菌16SrRNA/rRNA基因拷贝数比率，分别为98.8、618.7（图2-7c）。随后，细菌和古菌16SrRNA/rRNA基因拷贝数比率呈逐渐下降的趋势，在OT阶段降至16.9、29.9。微生物生物量和代谢活性受底物理化性质和浓度的影响[87,88]。所以，活性污泥中微生物代谢活性的下降，标志着更好的水质，可能是由有机物缺乏所引起的。2.3本章小结(1)IlluminaHiSeq测序结果表明，酱油酿造废水处理过程中起主导作用的细菌是Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria。Proteobacteria保持较高的代谢活性，大量存在的Megasphaera、Thauera和Azoarcus代谢活性较低，而少量存在的Psychrobacter在厌氧池中具有最高的代谢活性。Cenarchaeales是丰度最高、代谢最活跃的古菌目。绝大多数的氢营养型产甲烷菌与Megasphaera保持互养关系。Methanosarcinales和Nitrosopumilales在活性污泥中少量存在，但在缺氧池中具有较高的代谢活性。(2)荧光定量PCR结果表明，酱油酿造废水处理过程中细菌起着主要作用。生物处理单元中的细菌和古菌生物量比调节池高，并且活的细菌和古菌生物量从AT到OT阶段逐渐减少。此外，细菌和古菌16SrRNA/rRNA基因拷贝数比率随着污水处理的进行而逐渐降低，表示微生物活性逐渐下降，可能是由于有机物缺乏导致的。(3)IlluminaHiSeq测序和荧光定量PCR结果表明，微生物群落结构、代谢活性和生物量在不同酱油酿造废水处理阶段具有一定的差别，与周围环境和物种间的相互作用有关。下一步研究应结合酱油酿造废水水质的变化，分析环境条件对微生物生物量、群落结构、代谢活性和功能的影响。(4)16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序可作为研究环境微生物群落结构和代谢活性的重要手段。本章节对酱油酿造废水处理过程中微生物群落结构和代谢活性的研究为进一步的工程应用提供了参考，如生物废水水处理厂生物强化和生物指示，将进一步提高酱油酿造厂废水处理的效率。18n第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析3.1材料与方法3.1.1仪器与试剂同2.1.1。3.1.2实验材料及预处理采样分别于2016年3月25日（春季）、6月28日（夏季）、9月27日（秋季）、12月26日（冬季）进行。使用采水器采集广东某酱油酿造厂A2O-MBR废水处理系统的调节池（TJ）、厌氧池（AT）、缺氧池（QT）、好氧池（OT）和MBR池（MBR）的混合废水，取样深度为3~4m。根据采样时间和采样池标记样品名，例如3_TJ代表3月TJ中水样，6_AT代表6月AT中水样。一共得到20个水样。取完样品后迅速放置于-20℃冰箱保存。并分别取10mL水样，4℃，6,000rpm离心10min，收集沉淀储存于-80℃。3.1.3核酸的提取及反转录同2.1.3。3.1.4不同功能池细菌及古菌生物量测定同2.1.4。3.1.5细菌及古菌16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序分析3.1.5.1PCR扩增同3.1.5.1。3.1.5.2PCR产物的混样和纯化同2.1.5.2。3.1.5.3文库构建和上机测序同2.1.5.3。3.1.5.6数据信息分析基于97%分类阈值进行OTUs聚类和物种分类分析，并采用RDPClassifier（v2.2）与GreenGene数据库（v2013.5）进行物种注释分析[50]。原始数据提交至NCBISRA数据库，序列号为PRJNA427642。然后利用QIIME（v1.7.0）进行下列多样性分析：α-多样性指数（Shannon、Simpson、Chao1、ACE和Good'scoverage），基于OTUs的PCA分析。此外，基于OTUs数据，利用FAPROTAX预测微生物的功能组成。通过Tukey19n华南理工大学硕士学位论文检验分析不同季节及功能池之间α-多样性、16SrRNA基因和16SrRNA拷贝数、细菌的功能组成差异是否显著。然后使用多因素方差分析（PERMANOVA）对4个不同季节中微生物群落结构进行统计学的分析，当P<0.05时，则认为具有显著差异。3.2结果与讨论3.2.1季节性对酱油酿造废水处理过程中微生物多样性的影响本章节对5个功能池中废水进行季节性采样，研究季节性对酱油酿造废水处理过程中微生物多样性、群落结构的影响。基于97%分类阈值，细菌群落共有7526个OTUs，每个样品含有1215-3033个OTUs（表3-1）。在绝大多数样品中（15/20），细菌在DNA水平上的物种丰富度指数比RNA水平上高，即OTUs数和Chao1。分析OTUs数和Chao1的变化趋势，发现在任一废水处理阶段细菌丰富度呈现大致相同的季节性变化。同时，在DNA和RNA水平上，OTUs数和Chao1在废水处理过程中的变化趋势相同。例如，在DNA水平上，所有功能池OTUs数和Chao1在夏季最高，在RNA水平，TJ、AT和OT的OTUs数和Chao1在秋季最高，QT和MBR在冬季最高。Shannon指数变化范围为3.50-8.90，表明所有活性污泥样品中含有较高的细菌多样性。活性污泥是微生物的重要来源，具有较高的生物多样性[9]。绝大多数样品中（17/20），细菌在DNA水平上的多样性比RNA水平高，除9_TJ、3_QT和6_QT之外。同样地，任一废水处理阶段细菌多样性呈现大致相同的季节性变化。例如，在DNA水平上，所有功能池Shannon指数在夏季最高，在RNA水平，TJ、AT和MBR的Shannon指数在秋季最高，QT在夏季最高。夏季和秋季细菌的丰富性和多样性最高，可能因为夏季和秋季的高温（>30℃）有利于细菌生长和新陈代谢[36]。微生物的多样性在一定程度上受到季节性温度和水质变化的影响。古菌群落共有4384个OTUs，平均每个样品含有160-1760个OTUs（表3-2）。绝大多数样品中（19/20），古菌在DNA水平上的物种丰富度指数比RNA水平高，即OTUs数和Chao1。与细菌不同，从DNA和RNA水平上，任一废水处理阶段古菌丰富度呈现出不同的季节性变化。在DNA水平上，TJ、QT和OT的OTUs数和Chao1在夏季最高，AT和MBR在秋季最高；在RNA水平上，TJ、AT的OTUs数和Chao1在秋季最高，QT、OT和MBR在春季最高。Shannon指数变化范围为1.71-8.04，RNA水平上AT和QT的Shannon指数在4个季节变化较大，波动幅度分别为2.69-8.04、1.71-6.96。同时，任一废水处理阶段古菌多样性呈现出不同的季节性变化。例如，在DNA水平上，20n第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析TJ和QT的Shannon指数在夏季最高，AT在冬季最高，OT和MBR在春季最高；在RNA水平上，TJ、QT、OT和MBR的Shannon指数在春季最高，AT在夏季最高。采用统计学检验微生物α-多样性指数在不同季节及功能池之间的差异。结果显示，α-多样性指数在不同功能池和季节之间没有显著性差异（P>0.05），表明该废水处理系统中微生物群落处于稳态中。此外，总的微生物丰富度和多样性高于活的微生物，可能因为死菌的DNA或细胞裂解“裸露的DNA”导致微生物丰富度和多样性被过高的估计[29]。16SrRNA表征的活的微生物确实不同于16SrRNA基因表征的总微生物[89]。基于OTUs水平的PCoA分析结果显示，总细菌和活的细菌群落季节性聚类明显，而古菌聚类分散（图3-1）。可将细菌40个DNA及cDNA样品分成3类，即春季的样品为一类，夏季和秋季的样品为一类，冬季的样品为一类（图3-1a）。这些样本足够代表酱油酿造废水处理过程中细菌群落结构的季节性变化，表示一年的周期[42]。细菌在春季聚类更密集，表示春季细菌群落结构更相似、更稳定。此外，夏季和秋季细菌组成相似，可能是夏季和秋季相似的温度所致。通过One-wayPERMANOVA检验发现春季细菌的组成与夏季、秋季存在显著性差异（P<0.05）。古菌40个DNA及cDNA样品聚类分散，表明同一季节中古菌的动态变化比细菌大（图3-1b）。21n华南理工大学硕士学位论文表3-1细菌α-多样性指数Table3-1α-diversityindicesofbacterialcommunityOTUsGood's分类样品名有效序列ShannonSimpsonChao1ACE(97%)coverageDNA3_TJ5101214825.400.89160516470.996_TJ5756929228.200.98329833650.979_TJ5805019406.630.96208621800.9812_TJ6222620115.990.92250624790.98RNA3_TJ4975012154.200.75130513340.996_TJ5294117736.790.96199720610.989_TJ5461721387.700.98233624380.9812_TJ5242317935.960.92206919960.98DNA3_AT6035123087.890.98254025510.986_AT5104830338.900.99330633180.979_AT5387725108.410.99271127280.9812_AT5582624767.710.97259127080.98RNA3_AT6426915074.700.80135914490.996_AT6274716784.280.67195220040.989_AT5920025018.290.99281128600.9812_AT4762820506.890.94217521820.98DNA3_QT5702616456.270.94171717660.996_QT4957821597.210.96233323500.989_QT6035719825.880.90226523800.9812_QT4706117175.700.91167718030.99RNA3_QT5041116896.690.95183318260.996_QT6174121768.120.98232123200.989_QT5527116103.730.72182720070.9812_QT5774614924.070.79174519140.98DNA3_OT6272716426.210.93180018010.996_OT5536921977.400.97236424800.989_OT6047819345.980.91217322150.9812_OT3179717536.690.94176117830.99RNA3_OT6420218085.540.87166017060.996_OT5762717775.400.84200820730.989_OT5477718113.950.72213222310.9812_OT5821813173.500.74151416210.99DNA3_MBR4713114386.100.93132214220.996_MBR5460722697.830.98253326320.989_MBR6081922066.870.94245225880.9812_MBR4839119446.250.93203521260.98RNA3_MBR6014116905.080.84177918580.986_MBR6329522425.420.79264427660.989_MBR3380316426.690.95159216420.9912_MBR5172313483.940.79148315640.9922n第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析表3-2古菌α-多样性指数Table3-1α-diversityindicesofarchaealcommunityOTUsGood's分类样品名有效序列ShannonSimpsonChao1ACE(97%)coverageDNA3_TJ7345210635.320.919119580.996_TJ5681417606.350.95162517610.989_TJ5499313075.590.95120213310.9912_TJ593939533.940.798569190.99RNA3_TJ534364185.310.963743891.006_TJ538886054.250.865465970.999_TJ5547811424.910.90102511110.9912_TJ501712743.300.782682611.00DNA3_AT7165012315.820.92126112540.996_AT4986214755.410.89140014640.989_AT5761617455.720.92163517960.9812_AT5096114296.370.94132713530.99RNA3_AT3280910517.030.98103410890.996_AT505574804.140.784624911.009_AT5847612378.040.99119912220.9912_AT453403142.690.713593911.00DNA3_QT5139110046.000.968729200.996_QT5988117676.450.96180818110.989_QT526248973.590.789169500.9912_QT5126112145.870.94117511870.99RNA3_QT4311112046.960.97128413290.996_QT450678956.730.978688930.999_QT478291601.710.443633121.0012_QT596773924.510.903603581.00DNA3_OT6610113006.550.97124813040.996_OT5751617116.230.94156416600.989_OT5508316655.350.89154317050.9812_OT4377411125.820.94119512280.99RNA3_OT3717311727.190.98119911780.996_OT489566284.210.805515860.999_OT477327464.280.786827250.9912_OT494308914.210.818108560.99DNA3_MBR8042613986.540.97130112940.996_MBR4880814746.500.96131513820.999_MBR4955415515.670.92136714490.9812_MBR5066711945.920.94105110900.99RNA3_MBR547587636.050.957217410.996_MBR267254054.090.806085630.999_MBR608155194.770.855135480.9912_MBR549325404.840.904874911.0023n华南理工大学硕士学位论文图3-1酱油酿造废水处理过程中细菌(a)和古菌(b)PCoA分析。组名代表采样月份和DNA或RNA分析Fig.3-1PCoAanalysisofbacteria(a)andarchaea(b)duringthesoysaucebrewingwastewatertreatmentprocess.ThegroupnamerepresentssamplingmonthandanalysisbyDNAorRNA.3.2.2季节性对酱油酿造废水处理过程中细菌群落结构的影响16SrRNA基因和16SrRNA测序揭示了酱油酿造废水处理过程中总菌和活菌的季节性分布。20个水样中检测到的7526个OTUs属于55个细菌门和819个细菌属。细菌主要由以下4个门构成：Proteobacteria（占总细菌和活的细菌的47.45±27.80%）、Firmicutes（21.25±19.78%）、Bacteroidetes（12.15±9.96%）和Planctomycetes（7.54±9.11%），其次是Nitrospirae（1.61%）、Actinobacteria（1.60%）、Spirochaetes（1.35%）和Chloroflexi（1.00%）（图3-2）。它们能降解蛋白质、糖类和脂肪，对污染物的去除起着重要作用[9]。在不同污水处理厂，Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Planctomycetes都能被检测到，可能因为高分类级别的细菌具有生态一致性[90]。尽管这些菌在酱油酿造废水处理过程中广泛存在，但它们的比例在不同的池子和季节间波动较大。与Firmicutes不同，总Proteobacteria在QT,OT和MBR中占主导，与之前研究相同[89]，并且在夏季和秋季的相对丰度减少。总Spirochaetes和总Synergistetes主要分布在AT，平均相对丰度分别为7.47%、1.87%，在9_AT和12_AT增加2–6倍。此外，总Planctomycetes和总Nitrospirae在QT,OT和MBR中占主导，尤其总Planctomycetes在夏季和秋季相对丰度增加2–3倍，占总细菌的15.91%–35.74%。同样24n第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析地，活的Planctomycetes在夏季和秋季更丰富，表明Planctomycetes更适应有氧和温暖的环境。与总Proteobacteria不同，活的Proteobacteria在3_TJ、3_AT中呈现较高的比例，平均占76.64%，主要由Acinetobacter和Arcobacter组成，可能受进水微生物的影响。在污水处理的开始阶段，微生物群落结构会受到进水微生物的影响，然后保持相对稳定[13,91]。螺旋菌门（Spirochaetes）和互养菌门（Synergistetes）主要分布在AT，在秋季和冬季的相对丰度是春季和夏季的三到五倍。Spirochaetes能发酵糖类，在污水处理过程中的具体生态功能仍不明确[92]。此外，活的Synergistetes在9_AT和12_AT中相对丰度急剧上升，高于总Synergistetes，表明Synergistetes具有较高代谢活性。图3-2前10细菌门的相对丰度。(a)总菌；(b)活菌Fig.3-2Relativeabundancesofthetoptenbacterialphylainthetotal(a)andactive(b)communities.25n华南理工大学硕士学位论文图3-3属水平总细菌和活的细菌相对丰度热图（前35）Fig.3-3Heatmaprepresentingtherelativeabundancesofthetotalandactivebacterialcommunitiesatthetaxalevelofgenus.Onlythetop35generapresented.酱油酿造废水处理过程中共发现11个细菌属的相对丰度大于1%。优势的细菌属主要为Thauera（15.22%）、Arcobacter（2.68%）、Lactobacillus（2.42%）、Prevotella_9（1.78%）、SM1A02（1.54%）、Megasphaera（1.51%）和Acinetobacter（1.23%）（图3-3）。总SM1A02和总Thauera在QT、OT和MBR中含量丰富。Planctomycetes中大多数不能鉴定到属水平，能被鉴定的部分中SM1A02含量相对丰富。总SM1A02在夏季和秋季占总细菌的5.20%–6.91%，在春季和冬季降低至1.17%。Thauera是主要的反硝化细菌，在6_AT中具有较高的反硝化活性。总Prevotella_9和总Lactobacillus只在TJ中含量丰富，分别占7.58%、5.86%。然而，活的Prevotella_9和活的Lactobacillus相对丰度在12_TJ中急剧上升，总共占活的细菌的47.89%，表明良好的有机物水解能力[66]。活的Arcobacter和活的Acinetobacter（ε-proteobacteria）在3_TJ、3_AT中分别占活菌68.12%、64.01%，而在其他样品中相对丰度小于2%。活的Lactococcus和活的明串珠菌属（Leuconostoc）在春季较丰富，并且总Lactococcus和总Leuconostoc在3_TJ中相对丰度急剧上升，分别占33.19%、3.24%，可能受春季进水微生物的影响。红环菌属（Rhodocyclus），主要的聚磷菌（PAOs），在污水中少量存在（<0.2%）。可能因为聚糖菌（GAOs）与PAOs竞争底物，导致PAOs含量降低，致使该废水处理系统除磷效果较差[93,94]。季节性变化是决定活性污泥中微生物组成的重要因素[95]，而温度可能是影响总细菌和活的细菌群落26n第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析结构的主要因素。3.2.3季节性对酱油酿造废水处理过程中古菌群落结构的影响图3-4古菌目的相对丰度。(a)总菌；(b)活菌Fig.3-4Relativeabundancesofarchaealorders.(a)thetotalcommunity;(b)theactivecommunity.酱油酿造废水处理过程中古菌群落结构多样性相比于细菌要低很多，共检测到4个古菌门、11个古菌目。在门水平上，主要由Thaumarchaeota（68.51±25.28%）、Euryarchaeota（16.81±20.79%）、泉古菌门（Crenarchaeota）（0.11±0.38%）和深古菌门（Bathyarchaeota）（0.00±0.01%）组成。在4个季节中，总Euryarchaeota相对丰度在AT阶段明显增加，主要因为厌氧环境促进甲烷古菌的生长。随着曝气的增加，总Euryarchaeota相对丰度逐渐减少，而总Thaumarchaeota相对丰度逐渐增加。同时总Thaumarchaeota在夏季和秋季相对丰度减少。此外，活的Euryarchaeota在12_TJ、12_AT27n华南理工大学硕士学位论文和12_QT成为丰度最高的类群。然而在夏季，整个污水处理阶段，活的Euryarchaeota含量极低（0.04%-2.80%）。在目水平上，Cenarchaeales是含量最丰富的古菌目（64.53%），能进行氨氧化，其次是Methanobacteriales（5.05%）、Methanomicrobiales（5.13%）、Methanomassiliicoccales（3.23%）、Nitrososphaerales（2.03%）（图3-4）。废水中产甲烷菌含量丰富，可以产生大量的甲烷。总Cenarchaeales在厌氧池相对丰度减少，而Methanomicrobiales在厌氧池相对丰度明显增加。总Methanosarcinales在春季大量存在，平均相对丰度为7.31%，而在其他季节下降至0.07%。对于活的古菌来说，Cenarchaeales在冬季，AT中相对丰度大幅度减少，仅占1.65%。相反地，Methanomicrobiales在冬季，AT中大量存在，占45.7%。此外，Methanobacteriales在冬季，TJ中相对丰度增加至59.39%，而在其他样品中只占3.24%。Methanomassiliicoccales在秋季、TJ中相对丰度增加至28.49%，之后保持相对稳定。古菌的分布受环境条件和菌群间的相互作用的影响，季节性对古菌的分布具有一定的影响。3.2.4季节性对酱油酿造废水处理过程中微生物生物量的影响图3-5细菌(a)和古菌(b)16SrRNA基因和16SrRNA拷贝数箱形图注：*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001(Tukey检验)Fig.3-5Boxplotof16SrRNAgeneand16SrRNAcopiesofbacteria(a)andarchaea(b).*indicatesP<0.05,**indicatesP<0.01,***indicatesP<0.001(measuredbyTukeytest).qPCR结果显示，微生物生物量随着季节变化而改变（图3-5），环境条件的改变将导致生物量的改变[33]。细菌16SrRNA基因拷贝数变化范围为1.69×1011-4.10×101228n第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析copies/L混合液，16SrRNA拷贝数变化范围为1.06×1012-5.11×1013copies/L混合液（图3-5a）。细菌16SrRNA拷贝数比细菌16SrRNA基因拷贝数高1-2个数量级，与之前的研究一致[83]。4个季节中总细菌和活的细菌含量丰富，表明酱油酿造废水处理过程中污染物去除效果良好。与总细菌数相比，污染物去除率与活的细菌数更相关。此外，4个季节中TJ16SrRNA基因拷贝数和16SrRNA拷贝数（1.69×1011–8.72×1011、1.06×1012–6.21×1012copies/L混合液）通常比A2O-MBR阶段低一个数量级，表明生物处理单元中细菌起着更重要的作用，高浓度有机物会促进细菌的生长和新陈代谢。冬季16SrRNA基因拷贝数明显高于其他三个季节，而且冬季16SrRNA拷贝数与春季16SrRNA拷贝数存在显著性差异（P<0.05）。可能因为在前3个季节废水处理系统经历了不同程度的膨胀和起泡，导致了细菌生物量的下降[96]。在所有功能池中，细菌16SrRNA基因和16SrRNA拷贝数在冬季最稳定，波动范围为3倍，而在其他季节呈现7倍的变化。其中，16SrRNA基因和16SrRNA拷贝数分别在秋季和夏季波动最大，表明高温促进细菌生物量的动态变化。在实际污水处理过程中，温度是影响微生物数量和动态变化的重要因素之一[97]。酱油酿造废水处理过程中总的和活的古菌生物量在不同功能池和季节间波动较大，古菌16SrRNA基因拷贝数介于3.40×108-7.41×1010copies/L混合液之间，16SrRNA拷贝数介于1.02×1011-2.69×1012copies/L混合液之间（图3-5b）。在秋季，QT中总古菌数量大幅下降，相比于AT阶段16SrRNA基因拷贝数下降98.79%。同样地，任一功能池中，古菌16SrRNA拷贝数比细菌16SrRNA基因拷贝数高1-2个数量级。所有功能池中，古菌16SrRNA基因在春季处于相对稳定的状态，波动范围为3倍，而其他季节有8倍以上的变化。然而古菌16SrRNA在冬季最稳定，波动范围为2倍。表明与细菌相同，高温促进古菌生物量的动态变化。3.2.5季节性对酱油酿造废水处理过程中微生物功能的影响研究酱油酿造废水处理过程中的微生物生理生态特性，需要将微生物动态变化与代谢功能联系起来。利用FAPROTAX预测所有样本中细菌群落的代谢功能组成（图3-6），DNA水平上1425/7526OTUs（18.93%）和RNA水平上1415/7526OTUs（18.80%）能被注释到一种或几种代谢功能组，共有90种代谢功能组。主要由以下构成：化能异养（21.68%）、好氧化能异养（12.37%）、发酵（9.47%）、硝酸盐还原（9.11%）、氮呼吸（8.36%）、亚硝酸盐呼吸（8.29%）和硝酸盐呼吸（8.03%）（图3-6）。化能异养是细菌主要的代谢功能，表明化能异养型细菌在污水中占优势，对污染物去除起着重要的作用。29n华南理工大学硕士学位论文此外，微生物代谢功能与氮循环密切相关，表明酱油酿造废水中含有较高浓度的氮，许多细菌参与氮循环，主要是硝化和反硝化[98]。Tukey检验表明，总的和活的细菌的代谢功能没有显著的季节性差异（P>0.05），与该废水处理系统的稳定性和鲁棒性有关。然而，每一代谢功能组的相对丰度在不同的季节和功能池间有所变化。发酵占TJ中细菌代谢功能的主要部分（23.16%），与TJ中具有较高的有机物浓度有关，TJ中发酵细菌分泌的胞外酶能够迅速将大分子的有机物水解为小分子的可溶物[99]。好氧化能异养在A[100]2O-MBR阶段和春季明显增加，表明A2O-MBR阶段对有机物和氮的去除效果良好。寄生或共生生物在TJ中比例较高，随着废水处理的进行而逐渐下降。废水处理厂是病原体主要来源之一，同时污水中病原体的去除是十分重要的[101]。对于活的细菌，好氧化能异养在3_TJ中呈现较高的比例（17.76%），而发酵所占的比例减小（4.58%）。3_TJ和3_AT中芳香化合物降解所占细菌功能的比例随着Arcobacter和Acinetobacter的增加而增加。许多芳香化合物可以被Arcobacter和Acinetobacter降解。有研究报道，Arcobacter和Acinetobacter是微生物能源电池（MicrobialFuelCell，MFC）中主要的石油烃降解者。图3-6细菌功能组成。(a)总菌；(b)活菌Fig.3-6Functionalcompositionofthetotal(a)andactive(b)bacterialcommunities30n第三章酱油酿造废水处理过程中微生物群落季节性分析3.3本章小结(1)IlluminaHiSeq测序结果表明，酱油酿造废水处理过程中起主导作用的细菌是Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Planctomycetes。细菌群落结构及代谢活性随着季节变化而变化，QT、OT和MBR中Firmicutes和Planctomycetes在夏季和秋季的相对丰度增加，Thauera是主要的反硝化细菌，在夏季、AT中具有较高的反硝化活性。(2)酱油酿造废水处理过程中古菌由Thaumarchaeota、Euryarchaeota、Crenarchaeota和Bathyarchaeota四个门组成。古菌的分布受季节的影响，夏季和秋季总Thaumarchaeota相对丰度减少，而Euryarchaeota在冬季、TJ、AT和QT成为丰度最高的类群。在目水平上，Cenarchaeales最丰富，其在厌氧池相对丰度减少，而Methanomicrobiales在厌氧池相对丰度明显增加。此外，春季Methanosarcinales在整个废水处理过程中大量存在。(3)荧光定量PCR结果表明，细菌和古菌16SrRNA拷贝数比16SrRNA基因拷贝数高1-2个数量级。酱油酿造废水处理过程中微生物生物量随着季节变化而变化，细菌生物量在冬季明显增加，并且高温促进古菌生物量的动态变化。(4)FAPROTAX功能预测结果表明，酱油酿造废水处理过程中细菌主要的代谢功能是化能异养、好氧化能异养、发酵、硝酸盐还原、氮呼吸、亚硝酸盐呼吸和硝酸盐呼吸。TJ和A2O-MBR阶段细菌代谢功能组成存在显著性，氮相关代谢和好氧化能异养在A2O-MBR阶段明显增加。然而，细菌的代谢功能组成在季节间没有显著性的差异。(5)酱油酿造废水处理过程中，细菌群落结构、代谢活性和生物量随着季节变化而变化，但是功能组成相对稳定，污染物去除效果良好，反映了该酱油酿造废水处理系统的稳定性和鲁棒性。未来的研究应立足于活性污泥中微生物数据库的构建，确保功能微生物的活性和稳定的污染物去除效率，运用微生物生态学研究解决污水处理厂中的实际问题，如除磷困难、活性污泥发泡和膨胀。31n华南理工大学硕士学位论文第四章酱油酿造废水处理过程中环境因子与微生物群落的关系4.1材料与方法4.1.1仪器与试剂4.1.1.1主要试剂表4-1主要试剂及其规格、生产厂家Table4-1Thechemicalcategoryandmanufactureofreagent名称规格生产厂家重铬酸钾优级纯天津市大茂化学试剂厂邻菲罗啉分析纯天津市大茂化学试剂厂硫酸亚铁分析纯天津市大茂化学试剂厂硫酸亚铁铵分析纯上海泰坦化学有限公司钼酸铵分析纯天津市大茂化学试剂厂过硫酸钾分析纯天津市大茂化学试剂厂抗坏血酸分析纯天津市致远化学试剂有限公司酒石酸锑钾分析纯天津市致远化学试剂有限公司酒石酸钾钠分析纯天津市致远化学试剂有限公司氨基磺酸分析纯天津市致远化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯天津市大茂化学试剂厂氢氧化钠分析纯天津市大茂化学试剂厂浓氨水分析纯天津市大茂化学试剂厂氯化铵优级纯天津市大茂化学试剂厂浓硫酸分析纯广州化学试剂厂甲醇分析纯广州化学试剂厂大孔径中性树脂分析纯广州化学试剂厂硫酸铝铵分析纯广州化学试剂厂硫酸铝钾分析纯上海泰坦化学有限公司碘化钾分析纯上海泰坦化学有限公司碘化汞分析纯上海泰坦化学有限公司硫酸锌分析纯上海泰坦化学有限公司硫酸银分析纯广东光华科技股份有限公司硫酸汞分析纯上海麦克林生化科技有限公司硝酸钾优级纯天津市科密欧化学试剂有限公司4.1.1.2主要仪器表4-2主要仪器及型号、生产厂家Table4-2ExperimentalInstruments仪器名称型号生产厂家高压灭菌锅LS-50HD型江阴滨江医疗设备有限公司32n第四章环境因子与微生物群落的关系去离子水生成器ADAP-24V型锐思捷科学仪器有限公司超纯水生成器Milli-QA10型密理博公司微量电子天平AS220.R2型波兰RADWAG公司磁力搅拌器85-2型上海思乐仪器有限公司金属浴仪K20型杭州奥盛仪器有限公司干燥箱GZX-9140MBE型上海博讯实业有限公司医疗设备厂台式高速大离心机Z323K德国HERMLE公司采水器ZH7102型北京中慧天诚科技有限公司pH计STARTER3100型OHAUS公司盐度计SA-287型Pxtong公司溶氧仪ST-400DOHAUS公司消解仪XJ-III型韶关市明天环保仪器有限公司分光光度计UV-2700型SHIMADZU公司水浴锅HWS-26型上海一恒科学仪器有限公司4.1.1.3主要试剂的配制方法1)重铬酸钾标准溶液［1/6K2Cr2O7=0.0500mol/L］：称取经120℃烘干2h的优级纯重铬酸钾2.4516g，用少量水溶解，移入1000mL容量瓶中，稀释至标线，摇匀。供标定硫酸亚铁铵标准溶液用。2)试亚铁灵指示剂：称取1.48g邻菲罗啉（C12H8N2·H2O）和0.695g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）溶于水中，稀释至100mL，贮于棕色瓶内。3)硫酸亚铁铵标准溶液［(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O≈0.05mol/L］：称取19.76g分析纯硫酸亚铁铵溶于水中，边搅拌边缓慢加入20mL浓硫酸，冷却后移入1000mL容量瓶中，加水稀释至标线，摇匀。临用前，用重铬酸钾标准溶液标定。标定方法：准确吸取10.00mL（标定：0.01mol/L的硫酸亚铁铵溶液时，取3.00mL）重铬酸钾标准溶液于250mL锥形瓶中，加水稀释至55mL左右，缓慢加入15mL浓硫酸，混匀。冷却后，加入2~3滴试亚铁灵指示剂用硫酸亚铁铵溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点。0.05∗10.00C［(NH4)2Fe(SO4)2］=V式中：C——硫酸亚铁铵标准溶液的浓度（mol/L）V——硫酸亚铁铵标准滴定溶液的用量（mL）4)消化液Ⅱ：称取9.80g重铬酸钾，50.0g硫酸铝钾［KAl(SO4)2·12H2O］，10.0g钼酸铵［(NH4)6Mo7O24·4H2O］，溶解于500mL水中，加入200mL浓硫酸，冷却后，转移至1000mL容量瓶中，用水稀释至标线。该溶液重铬酸钾浓度为0.2mol/L。用于测定COD浓度在50~1000mg/L的水样。33n华南理工大学硕士学位论文5)催化剂：称取8.8g硫酸银溶解于1L的浓硫酸中，摇匀。6)掩蔽剂：称取30.00g硫酸汞溶解于100mL10%的硫酸中。（氯离子含量不高的可适当减少硫酸汞的量）。7)10%H2SO4：取50mL蒸馏水，缓慢加入10mL浓硫酸，冷却后定溶至100mL。8)硫酸：1+1。9)5%过硫酸钾：称5g过硫酸钾（K2S2O8）溶解于水中，并稀释至100mL。10)10%抗坏血酸：称10g抗坏血酸（C6H8O6）溶解于水中，并稀释至100mL。贮于棕色瓶中，如不变色可长时间使用。11)钼酸盐溶液：称13g钼酸铵溶解于100mL水中，称0.35g酒石酸锑钾［KSbC4H4O6·1/2H2O］溶解于100mL水中，在不断搅拌下，将钼酸铵溶液徐徐加到300mL（1+1）硫酸中，加酒石酸锑钾溶液并混合均匀。贮于棕色瓶中冷处保存，至少可稳定两个月。12)磷标准溶液：A．贮备液：称取经110℃烘干2h的磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2187g，用少量水溶解后转移至1000mL容量瓶中，加（1+1）的硫酸5mL，用水稀释至标线。1.00mL此标准溶液含50.00μg磷。B．使用液：将10.00mL磷标准贮备液转移至250mL容量瓶中，用水稀释至标线并混匀。1.00mL此标准溶液含2.00μg磷。13)无氨水：在每升蒸馏水中加入0.1mL浓硫酸，在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，收集馏出液于玻璃容器中。14)碱性过硫酸钾：称取40g过硫酸钾，15g氢氧化钠，容于无氨水中，稀释至1000mL。溶液存放在聚乙烯瓶内，可贮存一周。15)1+9盐酸。16)硝酸钾标准溶液：A．贮备液：称取经105-110℃烘干3h的硝酸钾（KNO3）0.7218g溶于无氨水中，移至1000mL容量瓶中，稀释至标线。1.00mL此标准溶液含100μg硝酸盐氮。B．使用液：将贮备液用无氨水稀释10倍而得，1.00mL标准溶液含10μg硝酸盐氮。使用时配制。17)硫酸锌溶液，ρ=100g/L。称取10.0g硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶于水中，稀释至100mL。18)氢氧化钠溶液，ρ=250g/L。称取25g氢氧化钠溶于水中，稀释至100mL。19)酒石酸钾钠溶液，ρ=500g/L：称取50.0g酒石酸钾钠（KNaC4H6O6·4H2O）溶于100mL水中，加热煮沸以驱除氨，充分冷却后稀释至100mL。34n第四章环境因子与微生物群落的关系20)碘化汞-碘化钾-氢氧化钠（HgI2-KI-NaOH）溶液：称取16.0g氢氧化钠，溶于50mL水中，冷却至室温。称取7.0g碘化钾和10.0g碘化汞，溶于水中，然后将此溶液在搅拌下，缓慢加入到上述50mL氢氧化钠溶液中，用水稀释至100mL。贮于聚乙烯瓶内，用橡皮塞或聚乙烯盖子盖紧，于暗处存放，有效期1年。21)硫酸锌溶液：10%硫酸锌水溶液。22)氢氧化钠溶液：c(NaOH)＝5mol/L。23)氢氧化铝悬浮液：溶解125g硫酸铝钾或硫酸铝铵［NH4Al(SO4)2·12H2O］于1000mL水中，加热至60℃，在不断搅拌中，徐徐加入55mL浓氨水，放置约1h后，移入1000mL量筒内，用水反复洗涤沉淀，最后至洗涤液中不含硝酸盐氮为止。澄清后，把上清液尽量全部倾出，只留稠的悬浮液，最后加入1000mL水，使用前应振荡均匀。24)盐酸：c(HCl)=1mol/L。25)0.8%氨基磺酸溶液：避光保存于冰箱中。26)硝酸盐氮标准贮备液：称取0.722g经105~110℃干燥2h的优级纯硝酸钾溶于水，移入1000mL容量瓶中，稀释至标线。该标准贮备液每毫升含0.100mg硝酸盐氮。4.1.2实验材料及预处理同3.1.2。4.1.3废水理化指标的测定在采样的同时，对各采样点进行pH值、盐度、DO和水温的测定。pH值和盐度值分别采用pH计（OHAUS，STARTER3100）、盐度计（Pxtong，SA-287）测定，DO值和水温采用溶氧仪（OHAUS，ST-400D）测定。COD、TAN、TN、NO-3-N、TP含量分别采用GB11914-89《化学需氧量的测定》、HJ535-2009《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》、GB11894-89《水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》、HJ/T346─2007《水质硝酸盐氮的测定紫外分光光度法》、GB11893-89《水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》的方法测定。上述指标在室内用SHIMADZU公司UV-2700型分光光度计测定。4.1.4RDA及网络分析使用Canoco4.5软件，以pH值、盐度、DO、水温、COD、TAN、TN、NO-3-N、TP作为环境因子，对前10细菌门（见3.2.2）和古菌目（见3.2.3）分别进行RDA分析。35n华南理工大学硕士学位论文此外，以pH值、盐度、DO、水温、COD、TAN、TN、NO-3-N、TP作为环境子，对Spearman相关系数>0.75和P<0.5的细菌属（见3.2.2）进行网络分析。4.2结果与讨论4.2.1酱油酿造废水处理过程中废水理化性质污水的操作参数和理化特性随季节的变化而变化（表4-1）。具体地，水温随着季节而改变，变化范围为25-32℃。春季和冬季温度稳定在25℃左右（P>0.05），夏季和秋季温度稳定在32℃左右（P>0.05）。pH值变化范围为5.1-8.2，随着污水处理的进行略有增加。此外，在整个过程中，盐度稳定在6.6‰左右，在秋季进水的盐度（8.7‰）比其他季节高。NO-3-N浓度在QT和OT阶段由于发生硝化反应而增加，同时在夏季和秋季有所增加。进水COD和TAN随着季节的变化而变化，并且秋季的COD和TAN浓度几乎是其他季节的两倍。秋季酱油产量翻倍，从而导致进水COD和TAN升高。尽管在这4个季节中酱油酿造废水处理过程中废水理化性质有所波动，但COD和TAN平均出水浓度分别为285.32mg/L、7.03mg/L，平均去除效率分别为90.31%、93.57%。此外，TP在污水中的浓度从19到76mg/L不等，而且出水TP含量较高，去除困难。该污水处理系统实现了同时去除有机物和氮，而磷的去除在厌氧-好氧阶段是失败的。36n第四章环境因子与微生物群落的关系表4-1废水的理化指标Table4-1PhysicochemicalparametersofwastewaterDOTANNO-温度盐度COD3-NTNTP样品名pH(mg/L)(℃)(‰)(mg/L)(mg/L)(mg/L)(mg/L)(mg/L)3_TJ－22.1±0.25.4±0.05.1±0.12220±6479±13±1566±3119±16_TJ0.13±0.0430.2±0.35.3±0.03.8±0.12736±67496±15±1189±1526±19_TJ0.11±0.0231.8±0.25.1±0.18.7±0.15426±144237±324±2572±18776±512_TJ0.09±0.0225.0±0.15.1±0.15.7±0.12617±143112±39±2385±1437±33_AT0.21±0.0322.9±0.27.0±0.16.2±0.1712±138281±73±1284±1237±16_AT0.18±0.0530.8±0.37.0±0.07.5±0.1677±220225±22±1504±2359±29_AT0.02±0.0232.4±1.06.9±0.06.7±0.1879±64222±56±1231±1751±712_AT0.06±0.0324.8±0.36.7±0.08.0±0.11040±69279±43±1303±1069±13_QT0.11±0.0225.3±0.47.8±0.06.4±0.1456±5214±192±1176±636±26_QT0.09±0.0433.9±0.27.8±0.07.5±0.1428±213±1175±1391±947±19_QT0.25±0.0432.8±0.77.5±0.06.2±0.0247±488±1163±1517±15951±512_QT0.09±0.0225.1±0.27.9±0.07.0±0.0216±1714±127±2154±1260±23_OT5.44±0.0625.5±0.28.0±0.16.5±0.1347±3210±199±2218±635±16_OT6.73±0.0733.2±0.67.5±0.07.5±0.1423±1537±1193±1325±1849±19_OT7.11±0.0532.7±0.57.3±0.06.2±0.0251±11010±1163±1131±345±112_OT－25.1±0.17.7±0.07.0±0.0204±918±124±2133±644±23_MBR7.74±0.0325.2±0.18.0±0.16.5±0.1204±108±1102±1203±635±16_MBR8.46±0.0134.1±0.17.2±0.07.5±0.2448±1286±1188±1319±1365±59_MBR7.53±0.0633.0±0.18.1±0.06.2±0.0277±67±1129±4128±2248±512_MBR6.21±0.0524.9±0.18.2±0.17.0±0.0212±107±139±3126±1949±137n华南理工大学硕士学位论文4.2.2酱油酿造废水处理过程中细菌群落结构与环境参数的关系研究发现，酱油酿造废水处理过程中细菌群落结构与环境参数之间存在显著的相关性（Mantel检验：r=0.5945，P<0.001）。利用RDA分析研究前10细菌门和环境因子的关系，结果显示，温度、pH、COD、TAN和NO-3-N是影响废水处理系统中细菌分布的最重要的环境因子，而盐度、DO、TN和TP对细菌群落结构的影响不大（图4-1）。温度对微生物群落结构和代谢活性有很大的影响[38]。AtreyeeSims研究发现氨氧化细菌对低温敏感，在冬季不能被检测到[102]。此外，细菌群落结构受pH、COD和TAN的显著影响，与之前的研究一致[34,103]。在本研究中，总的和活的Firmicutes和Bacteroidetes与COD和TAN呈正相关，而总的和活的Proteobacteria与COD和TAN呈负相关，表明随着废水处理过程的进行，逐渐下降的COD和TAN更有利于Proteobacteria的积累。在饮用水系统中也发现Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes和COD之间相似的关系[104]。总的和活的Planctomycetes与NO-3-N呈正相关，参与硝化反应。至今，Planctomycetes中共发现21种厌氧氨氧化细菌，其中绝大多数能在废水处理厂中检测到[105]。总Nitrospirae与pH更相关，但是NO-3-N对活性Nitrospirae影响更大，其对氮的去除起着十分重要的作用[106]。总Spirochaetes和Synergistetes与TN呈正相关，但TN对活的细菌影响较小，活的Spirochaetes和Synergistetes与TAN更相关。图4-1前10细菌门与环境条件相关性的RDA分析。(a)总菌；(b)活菌Fig.4-1RDAanalysisofthecorrelationsbetweenthetop10bacterialphylaandenvironmentalconditions.(a)thetotalcommunity;(b)theactivecommunity.38n第四章环境因子与微生物群落的关系图4-2细菌属与环境条件相关性的网络分析。(a)总菌；(b)活菌注：蓝色节点为细菌属，绿色节点为环境因子，虚线代表负相关，实线代表正相关Fig.4-2Networkanalysisofthecorrelationsbetweenthebacterialgeneraandenvironmentalconditions.(a)thetotalcommunity;(b)theactivecommunity.Thenodeindicatesabacterialgenus(bluecolor)orenvironmentalfactor(greencolor).Thedashedlinerepresentsnegativecorrelationandthesolidlinerepresentspositivecorrelation.本研究进一步利用网络图分析细菌属与环境条件的相关性，只有Spearman相关系数>0.75和P<0.5的细菌属被分析（图4-2）。细菌分布与COD和TAN有很大的相关性，且许多总的细菌菌与它们呈正相关，例如Megasphaera、Prevotella_1和Atopobium。活的Prevotella_9和活的Lactobacillus分别与COD和TAN呈正相关。然而总的和活的Thauera与COD和TAN呈负相关，与NO--3-N呈正相关。NO3-N可诱导各种类型的氮还原酶，相比其他氮氧化物是首选的电子受体[93]。温度是影响微生物组成的重要因素，总的和活的SM1A02在夏季和秋季的相对丰度明显增加，与温度呈正相关。与总菌不同，温度、盐度和TP对更多的活菌造成抑制作用，例如Lactococcus、Leuconostoc和Victivallis。高盐和高渗透压对微生物的活性有影响，当盐浓度超过1%时，对COD、N、P的去除有明显的抑制作用[107]。总而言之，在废水处理过程中微生物群落结构受环境条件的影响。其他因素，例如微生物之间的相互作用、传播与迁移限制，在一定程度上也会对微生物群落结构造成影响[32]。4.2.3酱油酿造废水处理过程中古菌群落结构与环境参数的关系酱油酿造废水处理过程中古菌的分布是诸多因素共同作用而的结果，其RDA分析39n华南理工大学硕士学位论文显示，TAN、COD、温度、pH、NO-3-N是影响古菌群落结构和丰度的主要环境因子（图4-3）。Methanomicrobiales与TAN呈正相关，在AT阶段其丰度随TAN浓度的增加而显著升高，表明Methanomicrobiales对氨的高亲和力。Martenshabbena等指出与氨氧化细菌相比，氨氧化古菌对于氨氮和氧具有较高的亲和力[108]，在低氨氮和低溶解氧条件下依然能够有较好的氨氮去除效果。然而古菌在一定氨浓度下其活性也会受到抑制，可能因为氨氧化细菌的竞争作用和古菌胞内氨浓度过高而导致体内pH平衡的破坏，进而发生抑制作用[109]。温度是影响古菌群落结构和丰度的又一重要因素。然而，古菌对温度的响应范围比细菌更广，在极寒、极热的环境中都有古菌存在[110]。此外，古菌丰度和群落结构受pH驱动。Nicol等指出pH对古菌谱系具有选择性，氨氧化古菌的转录丰度会随pH的增加而显著下降[111]。COD也是影响古菌群落结构的关键因素，少量有机物能促进古菌的生长。此外，低溶解氧条件能促进古菌的生长，在低氧浓度下，氨氧化古菌比氨氧化细菌更具竞争优势[112]。盐度对总古菌和活的古菌影响较小，可能因为在废水处理过程中盐度波动不大。古菌最初发现于盐湖、高温热泉和深海喷口附近等极端环境下，其能在含盐和非含盐环境生存。废水性质是影响古菌的关键因素，其他因素，如污水运行参数（污泥停留时间、水力停留时间）、硫化物、磷酸盐等因子对古菌群落结构和丰度亦起作用[110,113]。图4-3古菌目与环境条件相关性的RDA分析。(a)总菌；(b)活菌Fig.4-3RDAanalysisofthecorrelationsbetweenthearchaealordersandenvironmentalconditions.(a)thetotalcommunity;(b)theactivecommunity.40n第四章环境因子与微生物群落的关系4.3本章小结(1)该酱油酿造废水处理系统污染物去除效果良好，具有稳定性和鲁棒性。从调节池到MBR池，平均COD去除效率为90.31%，平均氨氮去除率为93.57%，实现了同时除氮和有机物，而磷的去除效果较差。(2)细菌RDA和网络图分析表明，温度、pH、COD、TAN和NO-3-N是影响酱油酿造废水处理过程中细菌群落结构的主要因素。Firmicutes和Bacteroidetes与COD和TAN呈正相关，而Proteobacteria与COD和TAN呈负相关。在属水平上，绝大多数的细菌属与COD或TAN呈正相关，如Prevotella_9、Megasphaera。SM1A02在夏季和秋季的相对丰度明显增加，与温度呈正相关。(3)古菌RDA分析表明，TAN、COD、温度、pH、NO-3-N是影响酱油酿造废水处理过程中古菌分布的主要环境因子。Methanomicrobiales与TAN呈正相关，对氨具有高亲和力。少量有机物和低溶解氧条件能促进古菌的生长，同时温度和pH能影响古菌丰度和群落结构，盐度对总古菌和活的古菌影响相对较小。(4)酱油酿造废水处理过程中细菌和古菌时空分布特征受诸多环境因素的调控，包括温度、pH、COD、TAN、NO--N、DO等。其中，温度是重要的废水理化性质，其季3节性变化直接影响微生物的生长代谢和分布。41n华南理工大学硕士学位论文结论与展望结论本文运用16SrRNA基因和16SrRNA高通量测序和qPCR研究广东某酱油酿造厂A2O-MBR废水处理系统中细菌和古菌的时空分布特征，包括微生物数量、菌群结构、代谢活性和功能。此外，通过测定每一阶段废水的基本理化指标，分析微生物群落结构与环境因子的相关性。主要结论如下：(1)16SrRNA和16SrRNA基因高通量测序可作为研究环境微生物群落结构和代谢活性的重要手段。16SrRNA是鉴定环境样品中活的微生物的有效分子标记，比rDNA灵敏度高，可准确反映细胞水平的微生物群落变化。(2)酱油酿造废水处理过程中微生物的代谢活性与微生物的丰度不呈正相关，低丰度的微生物群落可能具有较高的代谢活性。丰富的Megasphaera、Thauera和Azoarcus代谢活性较低，而少量存在的Psychrobacter在AT中具有最高的代谢活性。少量存在的Methanosarcinales和Nitrosopumilales在QT中具有较高的代谢活性。(3)微生物群落结构、代谢活性和生物量在不同的功能池和季节间存在差异。Firmicutes和Planctomycetes在夏季和秋季的相对丰度增加，而Arcobacter和Acinetobacter在春季、调节池和厌氧池中呈现较高的比例。冬季总细菌数量明显高于其他季节，而高温能促进细菌和古菌生物量的动态变化。(4)微生物的多样性和时空分布受环境因素的影响。温度、pH、COD、TAN、NO--N3是影响细菌和古菌组成的主要环境因子，而盐度、溶氧、总氮（TN）、总磷（TP）的影响相对较小。Firmicutes和Bacteroidetes与COD和TAN呈正相关，Proteobacteria呈负相关。SM1A02在夏季和秋季的相对丰度明显增加，与温度呈正相关。Methanomicrobiales与TAN呈正相关，对氨具有高亲和力。(5)该酱油酿造废水处理系统微生物功能组成相对稳定，污染物去除效果良好，具有一定的稳定性和鲁棒性。从TJ至MBR池，平均COD去除效率为90.31%，平均氨氮去除率为93.57%，实现了同时除氮和有机物，而磷的去除效果较差。展望(1)活性污泥是微生物研究的重要资源，分子手段的出现进一步扩大了微生物研究的范围，主要以细菌为主，古菌和真核微生物多样性的研究较少。此外，活性污泥中大42n结论与展望量的微生物难以获得纯培养，未来的研究应立足于活性污泥中微生物数据库的构建。(2)污水处理厂普遍存在除磷困难、活性污泥发泡和膨胀等问题，基于微生物的基础研究，进一步探究如何优化功能微生物，调控生物降解和代谢能力，对解决污水处理厂普遍存在的问题和提高活性污泥系统的处理效能具有重要意义。(3)目前，污水处理系统中微生物多样性研究重点主要集中于群落结构、生物量、代谢活性和功能的研究，微生物对相关环境因子的响应也局限在丰度、种群结构的变化等方面。在不同环境条件下，如何从基因、蛋白以及转录水平探究微生物的响应机制还值得深入研究。43n华南理工大学硕士学位论文参考文献[1]ChengL,LinW,LiP,etal.ComparisonofmicrobialcommunitiesbetweennormalandswollencannedsoysaucesusingnestedPCR-denaturinggradientgelelectrophoresis,HPLCandplatetechniques[J].InternationalJournalofFoodScience&Technology,2014,49(11):2499-2505.[2]杨志泉,刘国林,周少奇.水解酸化—接触氧化—混凝沉淀处理酱油酿造废水[J].给水排水,2009,35(12):59-61.[3]LvS,LiangZ,LiX,etal.Investigationonbiomassperformanceofasubmergedmembranebioreactorfortreatingsoysaucewastewater[J].EnvironmentProtectionEngineering,2016,42(1):135-148.[4]陈于思,黄翔峰.酱油废水处理方法及其研究进展[J].环境科学导刊,2008,27(5):70-74.[5]任可爱,张惠群.长康乡金顶酱油厂废水排放稻田引起水稻减产原因初探[J].湖南农业科学,2004,(3):21-22.[6]BassinJP,RachidCTCC,VilelaC,etal.Revealingthebacterialprofileofananoxic-aerobicmoving-bedbiofilmreactorsystemtreatingachemicalindustrywastewater[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2017,120:152-160.[7]LuH,ZhangG,DaiX,etal.Photosyntheticbacteriatreatmentofsyntheticsoybeanwastewater:Directdegradationofmacromolecules[J].BioresourceTechnology,2010,101(19):7672-7674.[8]金浩,李柏林,欧杰,etal.污水处理活性污泥微生物群落多样性研究[J].微生物学杂志,2012,32(4):1-5.[9]FerreraI,SánchezO.Insightsintomicrobialdiversityinwastewatertreatmentsystems:Howfarhavewecome?[J].BiotechnologyAdvances,2016,34(5):790-802.[10]YeL,ZhangT,WangT,etal.MicrobialStructures,Functions,andMetabolicPathwaysinWastewaterTreatmentBioreactorsRevealedUsingHigh-ThroughputSequencing[J].EnvironmentalScience&Technology,2012,46(24):13244-13252.[11]AdhamS,GagliardoP,BoulosL,etal.Feasibilityofthemembranebioreactorprocessforwaterreclamation[J].WaterScience&Technology,2001,43(10):203-209.44n参考文献[12]Abu-AlhailS,LuXW.Experimentalinvestigationandmodelingofinnovativefive-tankanaerobic-anoxic/oxicprocess[J].AppliedMathematicalModelling,2014,38(1):278-290.[13]SaundersAM,AlbertsenM,VollertsenJ,etal.Theactivatedsludgeecosystemcontainsacorecommunityofabundantorganisms[J].TheISMEJournal,2015,10(1):11-20.[14]XiaS,Duan,L.,Song,Y.,Li,J.,Piceno,Y.M.,Andersen,G.L.,Alvarez-Cohen,L.,Moreno-Andrade,I.,Huang,C.L.,Hermanowicz,S.W.Bacterialcommunitystructureingeographicallydistributedbiologicalwastewatertreatmentreactors[J].EnvironmentalScience&Technology,2010,44(19):7391-7396.[15]HuM,WangX,WenX,etal.Microbialcommunitystructuresindifferentwastewatertreatmentplantsasrevealedby454-pyrosequencinganalysis[J].BioresourceTechnology,2012,117(10):72-79.[16]JenaJ,KumarR,SaifuddinM,etal.Anoxic–aerobicSBRsystemfornitrate,phosphateandCODremovalfromhigh-strengthwastewateranddiversitystudyofmicrobialcommunities[J].BiochemicalEngineeringJournal,2016,105:80-89.[17]JunHB,ParkSM,ParkNB,etal.Nitrogenremovalandsludgereductioninasymbioticactivatedsludgesystembetweenanaerobicarchaeaandbacteria[J].WaterScience&Technology,2004,50(6):189.[18]EmeL,DoolittleWF.Archaea[J].CurrentBiology,2015,25(19):851-855.[19]FredrikssonNJ,HermanssonM,WilénBM.DiversityanddynamicsofArchaeainanactivatedsludgewastewatertreatmentplant[J].BMCMicrobiology,2012,12(1):5518-5522.[20]BlazewiczSJ,BarnardRL,DalyRA,etal.EvaluatingrRNAasanindicatorofmicrobialactivityinenvironmentalcommunities:limitationsanduses[J].TheISMEJournal,2013,7(11):2061-2068.[21]HaoC,WeiP,PeiL,etal.SignificantseasonalvariationsofmicrobialcommunityinanacidminedrainagelakeinAnhuiProvince,China[J].EnvironmentalPollution,2017,223:507-516.[22]BanerjeeS,Baah-AcheamfourM,CarlyleCN,etal.Determinantsofbacterial45n华南理工大学硕士学位论文communitiesinCanadianagroforestrysystems[J].EnvironmentalMicrobiology,2016,18(6):1805-1816.[23]KearnsPJ,AngellJH,HowardEM,etal.Nutrientenrichmentinducesdormancyanddecreasesdiversityofactivebacteriainsaltmarshsediments[J].NatureCommunications,2016,7:12881.[24]DeAngelisKM,FirestoneMK.PhylogeneticClusteringofSoilMicrobialCommunitiesby16SrRNAbutNot16SrRNAGenes[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2012,78(7):2459-2461.[25]SundbergC,Al-SoudWA,LarssonM,etal.454pyrosequencinganalysesofbacterialandarchaealrichnessin21full-scalebiogasdigesters[J].FEMSMicrobiologyEcology,2013,85(3):612-626.[26]BaldrianP,KolaříkM,ŠtursováM,etal.Activeandtotalmicrobialcommunitiesinforestsoilarelargelydifferentandhighlystratifiedduringdecomposition[J].TheISMEJournal,2011,6(2):248-258.[27]RomanowiczKJ,FreedmanZB,UpchurchRA,etal.Activemicroorganismsinforestsoilsdifferfromthetotalcommunityyetareshapedbythesameenvironmentalfactors:theinfluenc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表）的论文，以及已投稿、或已成文打算投稿、或拟成文投稿的论文情况（只填写与学位论文内容相关的部分）：相当于学被索作者（全体序发表或投稿刊发表的卷期、位论文的引收作者，按顺题目号物名称、级别年月、页码哪一部分录情序排列）（章、节）况TotalandactivemicrobialInternationalYeD,Liangcommunitiesinafull-scaleBiodeterioration2017,7已发1H,ZhouW,第二章systemtreatingwastewater&123:206-215.表etal.fromsoysauceproductionBiodegradationSeasonalvariationoftotalYeD,Liangandactivebacterial拟投2H,TangH,communitiesinafull-scale第三、四章稿etalsystemtreatingsoysaucebrewingwastewater注：在“发表的卷期、年月、页码”栏：1如果论文已发表，请填写发表的卷期、年月、页码；2如果论文已被接受，填写将要发表的卷期、年月；3以上都不是，请据实填写“已投稿”，“拟投稿”。不够请另加页。二、与学位内容相关的其它成果（包括专利、著作、获奖项目等）55n华南理工大学硕士学位论文致谢本论文的实验工作是在华南理工大学B6-230实验室完成的，实验自始至终，都得到指导老师罗立新教授的悉心教诲，使本论文得以顺利完成。罗老师无论在论文方向、试验设计以及具体实验方法上都进行了细心的指导。对待工作，罗老师思维敏捷，治学严谨，兢兢业业，他对待科研的作风和精神都使我深为感动和受益，也增加了我对科研的热爱，是我认真学习和践行的楷模；对待生活，罗老师平易近人，可亲可敬，给予我无私的关怀和帮助，对我毕业后的发展方向也提出了宝贵意见，是我人生路上的引路人。谨此向他致以崇高的敬意与感谢！感谢三年来学习成长的地方——B6-230实验室，这里积极向上、只争朝夕的良好科研风气使我获益匪浅，受用终生。感谢本实验室的梁贺彬、林婕婷、甘兴、晏俊伟、汤涵岚、宋建琨、张祥、朱云飞、夏丽以及已毕业走上工作岗位的黎攀、冯锋、李莎、司丽芳、孟鑫、王晓雯、刘雄等兄弟姐妹无私的关心和帮助。与大家一起学习和工作的时光，将是我人生中美好而难忘的回忆。其中特别感谢梁贺彬师兄，在我实验或论文遇到瓶颈时，不厌其烦给我讲解，使我能够顺利地完成整个课题。同时感谢梁贺彬师兄在数据处理和英文论文撰写修改等方面给予的大力帮助！感谢浦跃武老师以及广东某酱油酿造厂的宋工和阮工在样本采集中给予的大力帮助！感谢我的家人对我攻读研究生的理解和支持。感谢我的父母，在我学习过程中，所付出的辛勤的劳动与默默的支持！最后，向在百忙中评阅本论文以及参加答辩的专家、老师们致以由衷的感谢，感谢您们耐心的评阅和给予的宝贵意见！再次致以深深的谢意！56n－２答ＩＶ辩委员会对论文的评定意见酱油工业化生产产生大量废水，对生态环境造成严重的影响。活性污泥中复杂的微生物群落对污染物的去除起着十分重要的作用，其时空分布特征与污染物去除息息相关，且受到环境因子的影响。该论文分析了酱油酿造废水处理过程中微生物群落的时空分布特征及相关环境因子，为酱油酿造废水处理提供理论依据和数据支撑。研宄发现酱油酿造废水处理过程中微生物的多样性、群落结构、代谢活性、生物量存Ｈ－在季节性差异，受诸多环境因素的调控，其中ＴＡＮ、ＣＯＤ、温度、ｐ、Ｎ０３－Ｎ是影响酱油酿造废水处理过程中细菌和古菌分布的主要环境因子。作者对相关文献进行了较好表述，实验方案设计合理，数据处理完善，行文语句通顺，讨论较为充分，论文答辩准备充分，具有条理和逻辑性。表明该生具有良好的基础理论和专业知识，能独立从事科研工作能力。经答辩委员会讨论和无记名投票一，致同意叶冬冬同学通过硕士论文答辩，并建议授予工学硕士学位。论文答辩日期：月日＿＾１５＿年＿１＿＿１＿＿°答辩委员会委员共到会委员５人＿＿ｈ表决票数：优秀（０）票；良好（今）票；及格（｜）票；不及格（０）票“”表决结果（打Ｖ）：优秀（）；良好（＼／）；及格（）；不及格（）￣决议：同意授予硕士学位（＼／）不同意授予硕士学位（）第１１页共１３页＼／