不同富集和分离培养条件下的含酚废水处理生物膜微生物群落结构与活性比较分析 7页

微生物学通报APR20,2009,36(4):498~504Microbiology©2009byInstituteofMicrobiology,CAStongbao@im.ac.cn研究报告不同富集和分离培养条件下的含酚废水处理生物膜微生物群落结构与活性比较分析*岳思青徐廷婷侯瑞青张晓君赵立平(上海交通大学生命科学技术学院教育部微生物代谢重点实验室上海200240)摘要:采用Biolog和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术研究了不同苯酚浓度培养对焦化废水处理厂反硝化池生物膜样品中微生物群落结构和代谢类型的影响。DGGE结果表明,不同浓度苯酚和不同培养方式富集培养后,细菌16SrDNA的部分条带分布谱形发生改变,还有部分条带只受到了苯酚浓度变化的影响;富集培养过程中由于碳源组成相对焦化废水简单,DGGE条带所代表的优势微生物多样性有所降低。Biolog试验结果表明,生物膜样本的细菌群落代谢能力最强;低浓度苯酚富集后的样品能利用的底物碳源类型最丰富。对Biolog试验结果的主成分分析显示,相同浓度苯酚富集培养后的细菌群落代谢功能多样性相似,但从DGGE结果看出其结构组成产生了变化。富集培养使样品微生物群落的代谢功能发生改变,低浓度的苯酚富集增加了群落中微生物的代谢类型。而不同条件获得的分离物其苯酚降解能力的初步分析也表明,富集与分离条件对苯酚降解菌的分离能力和得到的菌株特性具有差别。关键词:苯酚,细菌,变性梯度凝胶电泳,富集培养ComparativeAnalysisofCommunityStructureandActivityofWastewaterTreatmentBiofilmCultivatedUnderDifferentConditions*YUESi-QingXUTing-TingHOURui-QingZHANGXiao-JunZHAOLi-Ping(KeyLaboratoryofMicrobialMetabolism,MinistryofEducation,CollegeofLifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)Abstract:Theeffectofphenolconcentrationonthestructureandfunctionofmicrobialcommunities,whichwereculturedindifferentconditionsusingcokingwastewaterbiofilmasseeding,wasinvestigatedbyBiologanddenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)methods.Thelessnumberofbandsofcultivatedsam-plesonthedenaturinggradientgelelectrophoresisfingerprintof16SrRNAgeneindicatedreductionofdi-versityafterenrichmentandcultivation.SomebandsontheDGGEgelweresignificantlyinfluencedbythephenolconcentrationinmedium.TheresultsofBiologshowedthattheoriginalbiofilmsamplehadthe基金项目：国家自然科学基金(No.20677041);863计划重点项目(No.2007AA021301);上海市国际合作项目(No.05SR07107);上海市重点学科建设项目资助(No.B203);教育部留学回国人员科研启动基金资助项目*通讯作者：Tel:86-21-34204878;:xjzhangsjtu@gmail.com收稿日期：2008-10-02;接受日期：2009-02-06n岳思青等:不同富集和分离培养条件下的含酚废水处理生物膜微生物群落结构与活性比较分析499highestsubstrateutilitycapacityasmeasuredbyaveragewellcolordevelopment(AWCD).Butlowconcen-trationofphenolenrichedsampleS7showedmorediverseactivityontheutilityofCarboxylicacids.Theprincipalcomponentanalysis(PCA)ofBiologdatarevealedthatthemetabolicpatternsweresimilarwhenusingthesamephenolconcentration,althoughthesampleS7muchlesssimilartoothercultivatedsamples.Theseresultssuggestedthattheenrichmentandcultivationwithphenolsupplementeddecreasedthediver-sityandalsochangedthemetabolicfunctionofthemicrobialcommunity.Lowerphenolconcentrationin-creasedthemicrobialcommunitymetabolicactivity.Thephenoldegradingcapacityofisolatesfromeachsamplesindicatedthattheenrichmentandcultivationconditionhadchangedthetypeandpropertyofcul-truablebacteria.Basedontheseresults,weconcludedthatthedifferentmicroorganismswillbeisolatedun-derdifferentcultivationcondition.Keywords:Phenol,Bacteria,Denaturinggradientgelelectrophoresis,Enrichmentandcultivation焦化废水的组成非常复杂,苯酚是其中一种主Biolog研究苯酚浓度对群落结构及代谢类型的影响,[1]要的污染物。在处理焦化废水的工艺中,A1-A2-O以了解不同的分离策略对培养的微生物类型的影响,的处理效果较为理想的,而废水中的有机物如苯酚为采用合理的分离策略提供指导。[2]大部分是在缺氧段(A2池)去除的,所以研究A2池1材料和方法的微生物群落结构组成和主要污染物苯酚的关系,对去除焦化废水中的污染物有着重要的意义。1.1材料来源苯酚降解菌的分离是研究微生物降解苯酚的过生物膜样品取自上海焦化厂污水处理系统A2程和功能基因的重要方法之一,主要的分离手段是池(缺氧处理池)。该污水处理厂采用A1-A2-O法工富集培养。而富集培养往往是采用较高浓度的苯酚艺处理含酚废水,其中A2池的生物膜为降解有机[3]为碳源,此时,生长速率最高的少数种群占优势。物的主体。PCR试剂购自TaKaRa公司。[4]从过去对苯酚降解菌的分离情况来看,沈齐英等1.2培养基：用高浓度苯酚(500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、富集用培养基(1L)：KNO31.0g,K2HPO40.5g,2000mg/L)作为唯一碳源富集培养的方法从炼油污MgSO4·7H2O0.2g,NaAc15mmol,酒石酸钾钠5水中分离到3株降解高浓度苯酚的降酚菌株,均为15mmol,灭菌(1×10Pa灭菌20min)后每升中加入Pseudomonas属细菌。Muralikrishnan等[5]从废水中0.3g苯酚(HDPL培养基)或者0.03g苯酚(LDPL培分离到Pseudomonascepacia和Bacillusbrevis,能够养基)。分离培养基中灭菌前每升加入15g琼脂粉,[6]按苯酚浓度分为HDPS(0.3g/L苯酚)和LDPS降解2500mg/L的苯酚。高平平等采用原废水作为培养基对焦化废水进行降酚菌分离,得到与(0.03g/L苯酚)培养基。Alcaligenesfaecalis、Arthrobacternicotianae、Ochrobactrum1.3富集培养sp.具有较高同源性的菌株。Watanabe[7]等的研究发富集培养途径如图1所示,取10mLA2池生物现,以高浓度(500mg/L)的苯酚富集培养的菌株表膜样本分别接种于8mLHDPL和LDPL液体培养基,现出的苯酚氧化活性呈高亲和常数(high-Ks),而通28°C静置培养3d,然后转接于相同的新鲜培养基过连续恒化富集培养的菌株表现出的苯酚氧化活性中28°C培养2d。吸取富集物分别稀释涂于HDPS呈低亲和常数(low-Ks),后者是在自然环境的苯酚和LDPS固体平板上,菌落直径多数达到1mm~降解中起主要作用的类型。为此,熊顺子等[8]采用2mm后,用5mL无菌生理盐水洗涤平板,收集菌YPG、10%YPG和LB三种无苯酚的培养基进行苯体。回收菌液分装在灭菌的Eppendorf管中(含有酚降解菌的分离,结果获得更多样的降酚菌株。然20%甘油)保存于−70°C冰箱。而,目前尚未有研究比较不同苯酚浓度对于培养过1.4总DNA的提取程中微生物群落组成的影响。本研究采用不同浓度细菌培养物总DNA的提取参照文献[9],从生的苯酚分别培养A2池的微生物,用PCR-DGGE和物膜样品中提取总DNA参照文献[10]。http://journals.im.ac.cn/wswxtbcnn500微生物学通报2009,Vol.36,No.4图1富集分离途径及相应的微生物群落Fig.1EnrichmentandisolationstrategyNote:S1~S7:Microbialcommunityname.1.5样品16SrRNA基因V3区PCR扩增velopment,AWCD)的计算公式为:16SrRNA基因V3区PCR引物设计和反应条AWCD=[Σ(Ci−R)]/95件参照文献[11]：P2(534r):5′-ATTACCGCGGCTGCT其中Ci是除对照孔外各孔吸光度值,R是对照GG-3′和P3(341f):5′-CGCCCGCCGCGCGCG孔吸光度值。反应孔与对照孔的吸光度差值如果为GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTA负,则认为呈阴性反应且数值计为0。阳性反应指的CGGGAGGCAGCAG-3′25μL的反应体系中含有是,反应孔中的底物被利用而发生显色反应,吸光0.2mmol/LdNTPs,1×Buffer,2mmol/LMgCl2和值大于0.1的认为是阳性反应。底物利用丰度值则[12]0.75UTaq酶(TaKaRa)。引物P2和P3均为12.5pmol,由每个微平板中呈阳性反应的孔数来计算。TMDNA模板量10ng。PCR反应在MiniCycler(MJ1.9分光光度法测定苯酚降解情况ResearchInc)上进行,PCR引物由生工(上海)有限公利用苯酚在270nm处具有特异吸收峰的特[13]司合成。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,性,采用紫外分光光度法测定培养基中苯酚的降GDS8000凝胶成像系统(Ultra-VioletProductLtd)照解。选择各种条件下分离获得的菌株,在含0.03g/L像、记录分析结果。苯酚的无机盐培养基中培养4d后,菌液10000×g1.6PCR产物的DGGE分析离心10min后,取上清于270nm处测光吸收值,以[11]未接菌的培养基为空白对照。参照Muyzer等方法,对16SrRNA的V3可变区的扩增产物进行DGGE分析。DGGE使用8%2结果和分析聚丙烯酰胺凝胶,27%~55%变性梯度。电泳采用TMDCodeUniversalMutationDetectionSystem(Bio-2.1生物膜样品经不同条件培养后菌群结构的RadLaboratories,Hercules,CA,USA),200V电泳4h。比较电泳所使用的缓冲液是1×Tris-Acetate-EDTA(TAE,图2可以看出,S1即A2池生物膜样的条带最多,pH8.4)。电泳胶以SYBRGreenI(Amresco公司)染说明它的生物多样性也是最高的,这是因为焦化废色45min,GDS8000凝胶成像系统(Ultra-Violet水碳源组成复杂,所以微生物种类较多,可以看出ProductLtd)照像。条带a在S1中最亮,说明这类菌在A2生物膜样品1.7菌群活性的Biolog微平板测定中占优势,但是经过培养后,条带a变淡,说明经过保存的待测样品进行适当稀释后,取150μL的培养后群落结构出现变化,优势菌发生改变。经过稀释样品加到BiologGN微平板孔中,28°C培养7d,不同培养方法培养后,样品泳道中出现一条共同的期间每隔24h用酶标仪测定570nm波长吸光值。亮带g,并且不受苯酚浓度变化的影响,说明该类1.8Biolog微平板数据分析菌对于苯酚有较强的适应能力,从该图中也能看到95个孔吸光度的平均值(averagewellcolorde-高浓度苯酚液体培养物(S4)和低浓度苯酚液体http://journals.im.ac.cn/wswxtbcnn岳思青等:不同富集和分离培养条件下的含酚废水处理生物膜微生物群落结构与活性比较分析501碳源利用能力上的差异,可以看出,经过低浓度苯酚与高浓度苯酚的富集培养后,群落细菌对Biolog微孔板上碳源的利用能力发生了改变。原始A2生物膜样品具有最强的碳源利用能力,而低浓度苯酚富集培养得到的细菌(S7,S2)相对高浓度苯酚富集培养得到的细菌来说,具有较强的底物碳源利用能力。图2生物膜在不同条件下培养后PCR-DGGE电泳图Fig.2PCR-DGGEanalysisofbiofilmculturedindifferent图3Biolog板AWCD值随时间的变化conditionFig.3BacterialactivitychangeduringtheincubationonNote:ThesampleoflaneS1wasbiofilmfromA2reactor;S2-S7BiologplatewereS1culturedindifferentconditionsasshowninFig.1.从图4不同类型的碳源的利用情况来看,S1对培养物(S7)之间两者有很多相同的条带：如条带e、胺-酰胺类高聚物,氨基酸类及碳水化合物类的碳源f、g、h、i、j。但两者之间仍有不少差异,例如低利用量高于其培养物。在胺-酰胺类高聚物利用方面,浓度苯酚培养物中条带i的亮度大大高于高浓度苯除了S1生物膜样品以外,各个培养物的利用情况较酚培养的样品的相应条带,说明这一条带代表的菌为相似,均低于S1且相互之间差别不大。但S7对在低浓度苯酚培养物中丰度更高。在液体培养中均羧酸类碳源的利用能力增强,说明S7的菌群发生了占优势的条带f在平板培养的样品S2、S3、S5、S6不同于其他培养物的代谢类型变化。经过不同条件中变淡甚至消失了。从图2中还可看出苯酚浓度对的培养后,菌群对不同类型碳源各有不同的反应,于群落结构的影响,条带b、c和d在高浓度苯酚浓如S3在培养7d后对碳水化合物仍只有平均0.8左度的培养物(S2、S4、S5)中较亮,这些菌可能能够在右的光密度值,相对S1、S2、S7有1.0以上的光密较高浓度苯酚的条件下迅速生长。度值来说利用量较少,但在羧酸类碳源方面,S2、2.2生物膜样品经不同条件培养后菌群活性的S4、S5、S6培养7d后只有0.6~0.8的光密度值,S3比较则有0.9左右的光密度值。这都说明在不同浓度的微生物的平均活性常用Biolog板单孔颜色平均苯酚培养条件下,菌群结构的变化导致代谢类型发变化(AWCD)表示(如图3)。生了改变。由图3可以看出,AWCD值随着接种时间延长对Biolog板单孔颜色变化值,进行PCA分析而增大,在整个培养过程中S6最低,S1即A2生物(图5)。结果显示,PC1将各个样品的第1天与其他膜样的AWCD值增加的速度和达到的程度高于其的时间点区分开来,说明开始阶段菌群没有差异,他样品,这种差异在培养48h后尤为明显。第3天后,各个样品的碳源利用情况及代谢情况发[14]Garland等认为微生物群落ELISA反应(以AWCD生了不同的变化。经过7d的培养,各个孔内的碳源值表示)速度和最终能达到的程度与群落内能利用[15]利用情况发生了显著变化。由图5可以看出,A2单一碳底物的微生物数目和种类相关。AWCD值的池的生物膜样品S1培养第3天后和其他富集培养物大小代表了不同方法富集培养后得到的细菌对底物明显区分开来,说明生物膜样品中微生物代谢类型,http://journals.im.ac.cn/wswxtbcnn502微生物学通报2009,Vol.36,No.4图4对不同碳源的利用情况Fig.4Utilizationofdifferentcarbonsources图6不同样本的分离物培养后吸光值(270nm)分布Fig.6Theopticaldensity(270nm)distributionofisolatesafterculturedinmediumcontainingphenol图5不同培养物的主成分分析(PCA)Fig.5Principalcomponentanalysis(PCA)ofBiologGNdatafromdifferentsamples的847株分离物中,275株来自S2,245株来自S3,而Note:SamplenamewereassignedasSNx,SN(S1~S7asshowninFig.1),x(biologincubationtime)S5和S6各选取了140株和187株,不同样本得到的分离物吸光值分布如图6。对不同碳源利用情况在经过富集培养后发生了明显由于苯酚在270nm处有吸收峰,所测的的变化。从第3天到第7天的情况看来,PC2将S1、270nm处的吸光值能部分代表苯酚的降解情况。很S7与其它样品在不同的方向区分开来,说明在不同多菌株培养后吸光值升高,推测是较多中间代谢产浓度的苯酚影响下,微生物的群落结构及其功能发物积累造成。从图6可以看出,不同富集培养方法生了一些改变,从而对碳源的利用发生了变化。影响了所分离细菌的类型。高浓度苯酚富集后再在2.3分离菌株苯酚降解情况分析高浓度苯酚培养基上分离(S2),对降解苯酚的细菌空白对照的吸光值为0.493,共测定了847株分有较强的选择作用,抑制了其他不耐高浓度苯酚的离物在苯酚培养基培养后的270nm吸光值。在选取细菌,所以得到的分离物大部分能完全降解苯酚。http://journals.im.ac.cn/wswxtbcnn岳思青等:不同富集和分离培养条件下的含酚废水处理生物膜微生物群落结构与活性比较分析503而高浓度苯酚富集后以低浓度苯酚分离(S3)获得的出发,用PCR-DGGE揭示了不同浓度苯酚和培养方菌株中可完全分解苯酚的菌株较少,很多不耐高浓式的差别对微生物群落结构的影响,用不同浓度苯度苯酚的菌株得到分离。低浓度富集后再以高浓度酚富集培养后,生物膜样本中的一些条带出现缺失,苯酚培养基分离时(S5),几乎没有可完全降解苯酚这是由于碳源组成相对焦化废水简单,说明碳源组的菌株,而以低浓度苯酚培养基分离(S6)获得较多成多样性的降低导致了菌群结构组成多样性的降完全降解苯酚的菌株。S6分离获得的完全分解苯酚低。而随苯酚浓度和培养方式不同,细菌16SrDNA的菌株应该是不耐受高浓度苯酚的,因为在S5中未的部分条带分布和亮度发生改变,说明这些细菌类分离到此类菌株。群在不同浓度的苯酚和培养方式影响下发生了改变,如图2条带a的变化,虽然在生物膜中占有优势,但3讨论是由于培养过程中使用相对单一的碳源,在之后的在微生物降解的过程中,微生物的活性与群落培养中逐渐失去在菌群中的优势地位,而条带g则结构多样性是微生物生态学研究的重点。苯酚作为占据了优势。条带b、c、d在相对苯酚浓度较高的一种常见的污染物,尤其是焦化废水中主要的有毒情况下丰度较高,说明虽然碳源种类,培养条件相有害物质之一,它的微生物降解一直是大家关注的同,但是浓度不同的碳源仍然会对菌群有所影响。焦点。在苯酚降解菌的研究中,过往的研究从多种而条带f只出现在液体培养方式中,说明液体和固环境中,用各种培养条件分离出了种类繁多的苯酚体培养方式也会带来菌群结构的差异,在固体培养[16−18]降解菌,通过分析他们的降酚动力学常数发现基培养的过程中,某些在液体培养中占优势的细菌[7]这些降解菌存在较大差异,根据它们的降酚动力因不适宜的环境而不再具有优势。学常数,可以把这些苯酚降解菌分为两大类：高亲虽然PCR-DGGE/TGGE技术能够反映包括非培和常数和低亲和常数,进一步分析时发现,高亲和养细菌的菌群结构情况,但是微生物群落的生态功常数的降酚菌一般属于gamma变形菌纲,在高浓度能是由微生物的群落结构和活性共同决定的,而苯酚(大于500mg/L)生长较快,但并不是原始群落DGGE只能反映菌群组成情况,但是微生物群落的中的主要降酚菌,低亲和常数的降酚菌可能才是环信息不能单从序列上得到。Biolog微平板技术起初境中降解苯酚的主力军,而Zhang等人分离到一批[21]被用于异养细菌的分类鉴定,1991年Garland和系统进化地位很相似的苯酚降解菌(16SrRNA基因[14]Mills开始将该技术用于微生物群落变化的研究的相似性大于99.47%),并发现它们的苯酚降解能后,拓宽了它的应用范围。在近年的研究中,Biolog力和苯酚羟化酶基因也有很大的多样性,这加深了[22]多用于评价土壤微生物的群落水平底物利用情况。我们对苯酚降解菌多样性的理解,说明苯酚降解菌在Widmer等的研究中,采用了RFLP、PLFA、Biolog[19]中存在微多样性。同时比较分析了土壤微生物的群落特征,结果显示用稀释涂布平板分离的方法,培养基的营养组3种方法均能区分不同的土壤微生物群落,但成和温度等培养条件对于分离物的数量和多样性存Biolog的聚类分析结果与其余2种方法的结果有所[20]在很大影响。Uphoff等采用不同的碳源组成的培不同,作者认为,Biolog的结果与微生物群落的种类养基对海水中的微生物进行分离培养,发现丰富培组成关系不大,主要显示群落中可培养部分细菌的养基培养出来的多是gamma变形菌纲的细菌,多种功能[23]。在本研究中,用相同苯酚富集培养的样本碳源复合而成的培养基能培养出多样性较高的微生具有更高的相似性,虽然生物膜样本总体来说有较物,但是对于同种碳源在不同浓度下对于菌群结构强的碳源利用能力,但是低浓度苯酚液体富集使得的影响还没有进行研究。在实际处理工业废水的过羧酸类碳源利用能力增强,虽然DGGE的结果显示,程中,污染物的浓度会随时间的变化而不同。本研富集培养降低了生物膜中样本的微生物组成多样性,究的目的在于探讨不同浓度的同种污染物对于群落但是这可能与2种方法表征微生物群落特征方面不[12]结构的影响。也就是说如果采用不同浓度的苯酚进一致有关,Biolog代表的是群落的部分代谢活性,行富集分离,可能得到不同亲和常数占优势的菌而DGGE代表了群落中细菌的种类组成信息,即生[11]物多样性。Biolog的实验结果说明,不同浓度的群。本研究从采用不同浓度苯酚对生物膜进行富集http://journals.im.ac.cn/wswxtbcnn504微生物学通报2009,Vol.36,No.4苯酚的培养改变了微生物群落的代谢活性。而分离nity-levelphysiologicalprofilesinmicrobialecology.FEMSMicrobiologyEcology,1997,24(4):289−300.菌株的苯酚降解测定说明不同的富集分离方法获得[13]MuretC,PouetMF,TouraudE,etal.FromUVspectrato的菌株的特性差异较大。由此说明,采用不同浓度degradabilityofindustrialwastewater/definitionanduse的苯酚进行富集和分离,可以分离到不同类型的降ofa"shapefactor".WaterScienceandTechnology,2000,解菌株,通过对这些不同菌株的进一步筛选,最后42(5-6):47−53.[14]GarlandJL,MillsAL.Classificationandcharacterization获得可以在环境中真正起降解苯酚作用的菌株。ofheterotrophicmicrobialcommunitiesonthebasisofpatternsofcommunity-levelsole-carbon-sourceutiliza-参考文献tion.ApplEnvironMicrobiol,1991,57(8):2351−2359.[15]SmallaK,WachtendorfU,HeuerH,etal.Analysisof[1]何苗.焦化废水中芳香族有机物及杂环化合物在活BIOLOGGNsubstrateutilizationpatternsbymicrobial性污泥法处理中的去除特性.中国给水排水,1997,13:communities.ApplEnvironMicrobiol,1998,64(4):14−17.1220−1225.[2]仇雁翎,赵建夫,李咏梅.焦化废水中有机物在[16]HeinaruE,TruuJ,StottmeisterU,etal.ThreetypesofA1-A2-O系统各段的降解与转化.上海环境科学,2002,phenolandp-cresolcatabolisminphenol-andp-cresol-21:216−219.degradingbacteriaisolatedfromriverwatercontinuously[3]DunbarJ,WhiteS,ForneyL.Geneticdiversitythroughpollutedwithphenoliccompounds.FEMSMicrobiolEcol,thelookingglass:Effectofenrichmentbias.ApplEnviron2000,31(3):195−205.Microbiol,1997,63(4):1326−1331.[17]PrzybulewskaK,WieczorekA,NowakA,etal.Theisola-[4]沈齐英,刘录,申林波.降酚微生物的分离.化工环tionofmicroorganismscapableofphenoldegradation.Pol保,2002,22(4):191−194.JMicrobiol,2006,55(1):63−67.[5]ArutchelvanV,KanakasabaiV,NagarajanS,etal.Isola-[18]GengA,SohAE,LimCJ,etal.Isolationandcharacteri-tionandidentificationofnovelhighstrengthphenolde-gradingbacterialstrainsfromphenol-formaldehyderesinzationofaphenol-degradingbacteriumfromanindustrialmanufacturingindustrialwastewater.JHazardMater,activatedsludge.ApplMicrobiolBiotechnol,2006,71(5):2005,127(1-3):238−243.728−735.[6]高平平,陈迎春,刘彬彬,等.原废水培养基分离活性[19]ZhangXL,GaoPP,ChaoQF,etal.Microdiversityof污泥中的苯酚降解细菌.应用与环境生物学报,2003,phenolhydroxylasegenesamongphenol-degradingiso-9(2):189−192.latesofAlcaligenessp.fromanactivatedsludgesystem.[7]WatanabeKazuya,HinoSanae,OnoderaKo,etal.Diver-FEMSMicrobiologyLetters,2004,237(2):369−375.sityinkineticsofbacterialphenol-oxygenatingactivity.[20]UphoffHU,FelskeA,FehrW,etal.Themicrobialdiver-JournalofFermentationandBioengineering,1996,81(6):sityinpicoplanktonenrichmentcultures:amolecular560−563.[8]熊顺子,张学礼,陈慕云,等.无苯酚培养基分离到的screeningofmarineisolates.FEMSMicrobiolEcol,2001,降酚菌多样性的分子分析.应用与环境生物学报,2006,35(3):249−258.[21]CourcolRJ,HussonMO,IzardDE,etal.Comparisonof12(1):99−103.[9]赵立平,肖红,李艳琴,等.ERIC-PCR:一种快速鉴theMIC2000entericmediawithAPI20Eandconven-tionalmethodsforidentificationofEnterobacteriaceae.定环境细菌菌株的方法.应用与环境生物学报,1999,ZentralblBakteriolMikrobiolHyg,1982,252(4):5(增刊):30−33.472−479.[10]高平平,赵立平.可用于微生物群落分子生态学研究的[22]WeberKP,GehderM,LeggeRL.Assessmentofchanges活性污泥总DNA提取方法的研究.生态学报,2002,inthemicrobialcommunityofconstructedwetland22(11):2015−2020.mesocosmsinresponsetoacidminedrainageexposure.[11]MuyzerG,WaalEC,UitterlindenAG.Profilingofcom-WaterRes,2008,42(1-2):180−188.plexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgel[23]WidmerF,FliessbachA,LaczkoE,etal.Assessingsoilelectrophoresisanalysisofpolymerasechainreac-biologicalcharacteristics:acomparisonofbulksoiltion-amplifiedgenescodingfor16SrRNA.ApplEnvironcommunityDNA-,PLFA-,andBiolog(TM)-analyses.SoilMicrobiol,1993,59(3):695−700.Biology&Biochemistry,2001,33(7-8):1029−1036.[12]GarlandJL.Analysisandinterpretationofcommu-http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn