微生物限度检查标准操作规程 19页

目的：建立微生物限度检查法操作规程 范围：微生物限度的检查 1．简述 1.1 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原﹑辅料受到微生物污染 程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。 1.2 检查的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。 2．设备、仪器及用具 2.1 设备 2.1.1 无菌室 2.1.1.1 无菌室要求应采光良好，光照度不低于300勒克斯。温度应控制在 18～26℃，相对湿度40～60%。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形 成正压、不低于4.9Pa，洁净度不应低于10000级，局部净化度为100级。 2.1.1.2洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及沉降菌数测定法。 2.1.1.2.1 浮 游 菌 数 测 试 方 法 （ 参 照 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T16293—1996）。 2.1.1.2.2 沉降菌数测定（Ⅱ法） 无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养 琼脂平板3个（经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长）。以无菌方式（或经传 文 件 微生物限度检查标准操作规程 编 号 SOP•09•1011 版 本 2 页码 1/17 编 制 日 期 替 代 ∕ 审 定 日 期 颁 发 质量保障部 批 准 日 期 生 效 年 1 月 20 日 发 放 质保中心 递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。 在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长平均菌落数不超 过1个。 2.1.1.3 无菌操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到100级。净 化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。 2.1.1.4 消毒处理 无菌室应在每次操作前、后均用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台 及可能污染的死角。开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。 2.1.2 其他设备 净化工作台、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃），微波炉（或 其他适宜加热装置）、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高 压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。 2.2 仪器及器皿 2.2.1 菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平或药物天平（感量 0.1g）， PH 系列比色计。 2.2.2 玻璃器皿 锥形瓶（250～300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（陶瓷制，直径 10～12cm）、 培养皿（9cm）、量筒 （100ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（lml 分度 0.O1， 10ml 分度 0.1）、注射器（20 或 30ml）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒 缸（带盖）。 2.2.3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞 入约5cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应 加棉塞或硅胶塞， 若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞， 再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均予160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min， 烘干备 2.3 用具 2.3.1 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用 70%～75%乙醇 溶液浸泡） 2.3.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，）灭菌，备用。也可用一次性 无菌衣、帽、口罩、手套 2.3.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、 乙醇棉球或 碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢 药匙、试 管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（ 12cm）、实验记录纸等 3．试液 3.1 消毒液 3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。 3.1.2 5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可 选用其他适宜消毒液 3.1.3 75%乙醇溶液 3.1.4 碘酊或碘伏溶液 3.2 稀释剂和试剂 3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠 9.0g，加水使溶解成 1000ml，121℃灭菌 20min 3.2.2 无菌聚山梨酯-80 3.2.3 无菌聚山梨酯-80 氯化钠溶液 取聚山梨酯-80 1ml，加 0.9%氯化钠溶液使成 100ml，121℃灭菌 20min 3.2.4 无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2） 取磷酸氢二钠 25.8g 与磷酸二氢钠 4.4g，加水稀释至 1000ml，121℃灭菌 20min。 3.2.5 无菌 0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC） 取氯化三苯四氮唑 0.1g，加水使溶解成 10ml。 3.2.6 无菌对氨基苯甲酸溶液 3.2.7 欧-波（Ehrlich-Boehme）试液 3.2.8 甲基红试液 3.2.9 V-P 试液 3.2.10 革兰染色液 3.2.11 中性红指示液 3.2.12 亚甲蓝指示液 3.2.13 溴麝香草酚蓝指示液 3.2.1 4 酸性品红指示液 3.2.15 曙红钠指示液 4．培养基 4.1 营养琼脂培养基 4.2 玫瑰红钠琼脂培养基 4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基 4.4 营养肉汤培养基 4.5 胆盐乳糖（BL）培养基 4.6 4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基 4.7 乳糖培养基 4.8 蛋白胨水培养基 4.9 磷酸盐葡萄糖胨水培养基 4.10 枸橼酸盐培养基 4.11 曙红亚甲蓝（EMB）琼脂培养基 4.12 麦康凯琼脂培养基 4.13 对照用菌液 取大肠杆菌［CMCC（B） 44102］的营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml 营养肉汤培养基内，36 土 1℃培养 18～24h 后，用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 1： 106，使对照菌液加入量含菌 50～100 个（一般用量为 0.lml），其菌数在做阳性 对照的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。 4.14 培养基制备应注意： 4.14.1 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行校验。 若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试 剂规格应为化学纯以上。 4.14.2 配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌 后使用。 4.14.3 培养基的分装量不得超过容器的 2/3，以免灭菌时溢出。包装时， 塞子必须 塞紧，以免松动或脱落造成染菌。 4.14.4 培养基配制后应在 2h 内灭菌，避免细菌繁殖。 4.14.5 灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，以免水分 散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。 4.14.6 勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。应 用水浴或微波炉加热。 5．供试品抽样、保存及检验量 5.1 抽样 5.1.1 一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2 个以上最小包装单 位）的 3 倍量（以备复试）。 5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械 损伤、明显破裂的包装不得作为样品。 5.1.3 凡能从药品、瓶口(外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫 蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。 5.2 保存 5.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试 品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。 5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样 品不得作为供试品。 5.3 检验量 5.3.1 所有剂型的检验量均需取 2 个以上包装单位。 5.3.2 固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为 10g。 5.3.3 液体制剂检验量为10ml。 5.3.4 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固 体制剂不低于 3g，液体制剂采用原液者不得少于 6ml，采用供试液者不得少于 3ml，外用药品不得少于 5g。 6．操作方法 6.1 试验前准备 6.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（lml、 10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备 足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。 6.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于 30min。 6.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再 用 0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口 罩、手套。 6.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供 试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。 6.2 供试液的制备 6.2.1 液体供试品 取供试品 10ml，置灭菌锥形瓶中，加入 90ml 稀释剂，摇匀，作为 1：10 供试液。 6.2.2 固体、半固体或粘稠液供试品 称取供试品 10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入 100ml 0.9%无菌氯化 钠溶液，振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置 45℃士 1℃ 水浴中振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置 45℃士 1℃水浴振摇 溶解。 6.2.3 以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂，制成 1：20～1： 10O 供试液。 6.2.4 含抑菌成分供试品 供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌。不能检出时，该供试液须按以 下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。 6.2.4.1 稀释法 取规定量的供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用 的浓度。 6.2.4.2 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，3000r/min 离心 30min，移去上清 液，留底部 集菌液约 2ml，再稀释该供试液至原规定量。如有不溶性药渣，可先以 500r/min 离心 5 min，取全部上层液，再按上述方法集菌处理。 6.2.4.3 薄膜过滤法 取规定量的供试液于稀释剂 100ml 中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约 50mm、孔径不大于 0.45 士 0.02μm 微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂 冲洗滤膜 3 次，每次 50-100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养 基中。 6.2.4.4 中和法取规定量含磺胺类的供试品，于 100ml 增菌液（含 l%对氨 基苯甲酸约 1～5ml）中；含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培养基 100ml 中。 6.2.4.5 沉淀法 取规定量供试液，自然沉降 5min，取上层液于 100ml 增菌液中，本法适用 于难溶于水的抗菌制剂。 7．细菌、霉菌（酵母菌）计数 检查细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之 一。 该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母 菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数 依据。测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜 中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温 度、PH 和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。 7.1 供试液的稀释（10 倍递增稀释法） 7.1.1 取 2～3 支灭菌试管，分别加入 9ml 灭菌稀释剂（此时操作一般为： 左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执 10ml 吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰 正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试管塞应立即 塞上。 7.1.2 另取 1 支 lml 灭菌吸管吸 1：10 均匀供试液 lml，加入装有 9ml 灭 菌稀释剂的试管中混匀，即为 1： 100 供试液。以此类推，根据供试品污染程度， 可稀释至 1： 102. 1： 103. 1： 104 等适宜稀释级（至少共 3 级）。每递增 1 稀 释级，必须另换一支吸管。 7.1.3 在作 10 倍递增稀释时，吸管插入第 1 级稀释液内不低于液面 2.5cm， 反复吸吹 约 10 次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管 内壁调整液量至刻度，再沿第 2 级稀释管的内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地 吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。 7.2 注平皿 在进行 10 倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各 lml 至 每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用 l 支吸管），每一稀释级注 2～3 个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时， 将 lml 供试液慢慢全部注入平皿 中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时作阴性对照（待各级稀释液 注皿完毕后，用 l 支 lml 吸管吸取稀释剂各 lml，分别注入 4 个平皿中。其中 2 个作细菌数阴性对照；另 2 个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用 YPD 琼脂测 定酵母菌数时，则再增加 2 个平皿作酵母菌数阴性对照）。 7.3 倾注培养基 将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫 瑰红钠琼脂）熔化，冷至约 45℃时，倾注上述各个平皿约 15ml，以顺时针或反 时针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，置 操作台上待凝。 7.4 培养 细菌计数平板倒置于 30～35℃培养箱中培养 48h。霉菌、酵母菌计数平板于 25～28℃培养箱中培养 72h。 7.5 菌落计数 7.5.1 一般将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光 衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意 细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡 等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。 7.5.2 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、 霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征 及染色形态。 7.5.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产 生沉淀物， 经过培养后有时形成数量很多且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为了有利于菌落 计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2 个平皿），注皿后不 经培养而放置于 冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用 0.001%TTC 营养琼脂注皿，经 培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。 有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌 落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用 0.001%TTC 营养琼脂注皿，经培养 后生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计。 7.5.4 若平板上有 2 个或 2 个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以 2 个或 2 个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界线，一条链作为一个 菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生 长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。 7.5.5 记录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级 2 或 3 个平板菌落的平均 数。当菌落数在 15 以上的同稀释级二平板菌落数相差 l 倍时，该稀释级菌落数 不得作为计数依据；当 2 个平板菌落数均在 15（含 15）以下时，两个平板菌落 数的差值允许范围为 0～4， 1～7， 2～9， 3～10， 4～12，5～14，6～15。 超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。 7.5.6 在下列情况下、点计菌落时间需提前或延长培养时间： 7.5.6.1 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在 24h，霉菌点计需在 48h 作 初步点计（点计霉菌菌落时，动作直轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形 成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。 7.5.6.2 在 48h 点计细菌，72h 点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培 养时间 4～7 天，再点计菌落数。 7.5.6.3 对有疑议的供试品以 YPD 培养基作酵母菌计数时，可培养至 1 周再 点计菌落数。 7.5.7 供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红钠琼脂 平板点计霉菌数，一般液体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌及酵母菌总数； 含蜂蜜及王浆的合 剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按 YPD 琼脂平板点计酵母菌菌落数，二 者合并为霉菌及酵母菌数。 7.6 菌数报告规则 7.6.1 细菌数选取平均菌落数在 30～300 之间的稀释级，霉菌、酵母菌数选 取平均菌落数在 30～100 之间的稀释级作为报告菌数的依据。 如只有 1 个稀释级平均菌落数在 30～300（30～100）之间，则将该稀释级 的菌落数乘以稀释倍数报告（见附表例 7.6.1）。 7.6.2 如有 2 个相邻稀释级平均菌落数在 30～300（30～100）时，则按比 值计算。当比值≤2 时，则以 2 个稀释级的平均菌落数均值报告。当比值>2 时， 则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表附 7.6.2）。 高稀释级平均菌落数×稀释倍数 比值 = 低稀释级平均菌落数×稀释倍数 7.6.3 如有 3 个稀释级平均菌落数均在 30～300（30～100）之间时，则以 后 2 个稀释级计算级间比值报告（同 7.6.2），（见附表例 7.6.3）。 7.6.4 如各稀释级平均菌落数均在 300（100）以上，则按最高稀释级平均 菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在 30 以下，则按最低稀释 级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表 7.6.4）。 7.6.5 如各稀释级平均菌落数均不在 30～300（30～100）之间，则以最接 近 30 或 300（100）的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表 7.6.5）。 7.6.6 如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小 于 1 时，应报告菌数为＜10 个/g 或 ml（见附表例 7.6.6）。如供试品原液平板均 未生长霉菌及酵母菌，报告未检出霉菌及酵母菌/ml。 7.6.7 当各稀释级平均菌落数均小于 30 时，如高稀释级平均菌落数大于或 等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌数 （见附表例 7.6.7）。 7.6.8 附表：细菌数报告规则举例 规则 原液 各稀释级菌落数 比值 菌落数 报告数 1：10 1：102 1：103 7.6.1 1365 164 20 — 16400 16000 7.6.2 2760 295 46 1.6 37750 38000 （*培养基稀释法测定）7.6.9 7.6.9 培养基稀释法： 取低稀释级供试液（原液或 1：10 供试液）3 份，每份各 1ml，分别注入 5 个或 5 个以上平皿中（每皿 0.2ml 或≤0.2ml），每 1 个平皿倾注营养琼脂培养基约 15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。 5个或5个以上平板点计的菌落之和，即为每 lml菌落数，共得3组数据。以 3 份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。 7.7 结果报告 7.7.1 菌落数在 100 以内时，按实有数据报告。 7.7.2 菌落数大于 100 时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处 理。 7.8 复试 供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取 2 倍包装 量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。 7.9 注意事项 7.9.1 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接 触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。 7.9.2 从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在 lh 内完成，避免由于时间 过长导致菌细胞繁殖或死亡。 7.9.3 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液，以免造成实验误差。 7.6.2 2890 271 60 2.2 27100 27000 7.6.3 239 202 35 1.7 27600 28000 7.6.3 236 196 42 2.1 19600 20000 7.6.4 不可计 4650 513 — 513000 510000 7.6.4 24 19 12 — 240 240 7.6.5 不可计 305 12 — 30500 30000 7.6.6 0.5 0 0 — 5 10 7.9.4 为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理： 7.9.4.1 开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机 1～2h 后合盖， 放入培养箱培养； 7.9.4.2 换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。 7.9.4.3 加 TTC于倾注培养基前，在每 1000ml营养琼脂内加入灭菌 l%TTC 溶液 lml（最终浓度为0.001%），混匀后倾注平皿。 7.10 一般情况下，以营养琼脂平板计数细菌数，玫瑰红钠琼脂平板计数霉 菌、酵母菌数。在特殊情况下，如营养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌，且多于玫 瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母菌菌落数，则以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌数报 告；反之，如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的细菌菌落数， 则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告。如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母菌数或 玫瑰红钠琼脂平板生长的细菌菌落数超过该品种微生物限度规定时，经复试2次， 如3次结果的平均值仍超过规定，应判供试品不合格。 8．大肠杆菌检查法 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为 指示系统来鉴别目标菌。 8.1 增菌培养 取胆盐乳糖（BL）培养基 3 瓶，每瓶各 100ml。2 瓶分别加入规定量的供试液， 其中 1 加入对照菌 50～100 个作阳性对照，第 3 瓶加入与供试液等量的稀释剂作 阴性对照。37℃培养 18～24h（必要时可延至 48h）。阴性对照应无菌生长。 摇匀上述 BL 增菌培养液，以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试 品阳性对照培养液、阴性对照培养液各 0.2ml，分别接种至 5mlMUG-蛋白陈培 养基管， 37℃培养分别于 5、24h 后，将各管置 365nrn 紫外灯下观察有无蓝白 色荧光，然后加欧-波试液 4～5 滴于上述 MUG 管内，观察液面颜色。MUG 阳 性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色），报告检出大肠杆菌；MUG 阴性（无荧 光）、靛基质阴性（无色），报告未检出大肠杆菌。 8.2 分离培养 如 MUG 阳性、靛基质阴性或 MUG 阴性、靛基质阳性时，将上述供试品 BL 增菌培养液 轻轻摇动，以接种环沾取 1～2 环培养液划线于 EMB 或麦康凯琼脂平板上，培 养 18～24h，观察 EMB 或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。当阳性 对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于 表 1 所列特征，可判为供试品 1g 或 lml 未检出大肠杆菌。 表 1 大肠杆菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 曙红亚甲蓝琼脂 （EMB） 典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑， 湿润，有金属光泽。 非典型菌落呈淡紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗 色中心，无金属光泽。 麦康凯琼脂 典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑， 湿润。 非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。 8.3 当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因， 重新试 验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长者，挑取 可疑菌落做革兰染色、镜检、IMViC试验。 8.4 纯培养 如生长菌落与表 1 所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落 的表面中心，沾取培养物，应挑选 2～3 个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜 面，培养 18～24h，作以下检查。 如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾 取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于 EMB 琼脂平板，培养 18～24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。 8.5 革兰染色、镜检 8.5.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜 面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰 2～3 次（载 玻片不烫手）固定。 8.5.2 滴加结晶紫染液，染色 1min，水洗。 8.5.3 滴加碘液，媒染 1min，水洗，以滤纸吸干余水。 8.5.4 滴加 95％乙醇，脱色 20～30s，水洗。 8.5.5 滴加沙黄染液，复染 lmin，待干后，镜检。 8.5.6 染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰 阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。 8.5.7 注意事项 8.5.7.1 玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连 成片。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。 8.5.7.2 培养物的菌龄以 16～24h 为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染成 红色。 8.5.7.3 脱色是关键，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染 成阴性。 8.6 生化试验 8.6.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养 24～48h，观察产酸（指示剂为酸 性品红者 避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种 5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳 糖的细菌，可于 24h 出现阳性。或适当延长培养时间。 8.6.2 靛基质试验（I） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养 24～48h，沿管壁加入欧-波试 液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大 肠杆菌靛基质试验为阳性。一般 24h 即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取 出 1 或 2ml 培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养 24h，作靛基质试验。 8.6.3 甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养 48 士 2h，于 培养液中加入甲基红指示液 2～3 滴（约每 ml 培养液加指示液 1 滴），轻微摇动， 立即观察，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。 8.6.4 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养 48 土 2h，于 每 2ml 培养液中加入α-萘酚乙醇试液 lml，混匀，再加 40％氢氧化钾试液 0.4ml， 充分振摇，在 4h（通常在 30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。 8.6.5 枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养 2～4 天，培养基 斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌落 生长为阴性。 8.7 结果判断 8.7.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验 MUG 呈阳性，供试品 MUG 阳性、靛基质阳性，报告 1g 或 lml 供试品检出大肠杆菌。MUG 阴性、靛基质阴 性，报告 1g 或 lml 供试品未检出大肠杆菌。 8.7.2 MUG 阳性、靛基质阴性、IMViC 试验为－+ －－、革兰阴性杆菌，报 告 1g 或 lml 供试品检出大肠杆菌；MUG 阴性、靛基质阳性、IMViC 试验为 + + －－、革兰阴性杆菌，报告 1g 或 lml 供试品检出大肠杆菌。 8.7.3 供试品培养物检查不符合 8.7.2 二项中的任一项，报告 1g l 或 lml 供 试品未检出大肠杆菌。 8.7.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不 能作出检验报告。 8.8 注意事项 8.8.1 MUG 法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志 贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其 MUG 为 阳性。因此，在 MUG 培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干 扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检 出。既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌。 8.8.2 配制 MUG 培养基时，务必校正 PH 值，灭菌后 PH 不得过 7.4，否 则 PH 值偏高， MUG 分解，本身则显荧光；分装 MUG 培养基的试管应挑选， 试管、蛋白胨不得显荧光。 8.8.3 培养时间 供试品培养液接种于 MUG 培养基中的培养时间，一般在 4h、24h 观察是否 产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至 48h 再观察结果。由 于大肠埃希菌各菌株间的 GUD 的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的 差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；PH 的改变；大量竞争菌和 样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。 8.8.4 结果观察 取供试品的 MUG 试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在 365nrn 紫外灯下观 察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品 MUG 管是否 有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。 如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对 照管。 8.8.5 药品中污染的大肠杆菌，易受生产工艺及药物的影响。在曙红亚甲蓝 琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑取可疑菌落往往凭经验， 主观性较大，务必挑选 2～3 个以上菌落分别做 IMViC 试验鉴别，挑选菌落越多， 检出阳性菌的机 率越高，如仅挑选一个菌落做 IMViC 试验鉴别，则易漏检。 8.8.6 在 IMViC 试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂 斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中。切勿将 培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。 枸橼酸盐利用试验培养时间，原定为 2 天，根据试验资料，发现培养 3 天 后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养 2 天是不够的，故试验培养时间改为 2～ 4 天。 8.8.7 阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阳 对照菌液的制备、计数及加入含供试品的培养基中等操作，不能在检测供试品的 无菌室或净化台上进行，必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及 操作环境。 8.8.8 在各类供试品中检测大肠杆菌及其他控制菌，按一次检出结果为准， 不再抽样复检。检出的大肠杆菌及其他控制菌培养物须保留 1 个月，备查。