不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响 79页

湖南师范大学硕士学位论文不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响姓名：满维祥申请学位级别：硕士专业：运动人体科学指导教师：汤长发20100501\n摘要目的：检测不同强度运动后成年SD大鼠比目鱼肌和胫骨前肌中不同肌纤维类型以及MHC亚型和大鼠体重的变化情况，旨在探讨不同强度运动能否引起快、慢肌纤维之间和MHC亚型之间相互转化。方法：健康SD大鼠40只，3月龄；体重为200．2409；分成4组：安静组(C，n=10)、小强度运动组(LE，n=10)、中等强度运动组(ME，n=10)和大强度运动组(HE，n=10)。采用孙晓娟的运动方案，在坡度为00的跑台上进行训练(小强度运动组：19m／minx60min，中等强度运动组：26m／minx44min，大强度运动组34m／minx34min)，共八周，每次训练要求各运动组总距离基本相等。对照组和运动组大鼠分别于安静状态和运动后24小时腹腔麻醉后断头处死，取大鼠右侧后肢比目鱼肌和胫骨前肌，分别用ATP酶染色法鉴定I型和II型肌纤维；用MoticMed6．013数码医学图像分析系统分析I型和II型肌纤维的目标个数、目标面积以及各肌纤维百分比；SDS．PAGE凝胶电泳技术分离MHCI、MHCIIa、MHCIIb和MHCIIx。结果：1)不同强度运动后，与对照组比较，运动组大鼠体重减轻(PMHCIIb>姗CIIX>姗CIIa。一、提取肌凝蛋白及测定蛋白浓度(一)配置溶液l、Gubstraub溶液(50ml，PH6．5)：KH2P040．1M，KCL0．3M，涨：HP04O．05，调至PH6．5。2、肌凝蛋白提纯液(50ml，PH6．5)：K2HPO。0．05M，KCLlmM，Na2CO。lmM，KH：PO。0．1M，调至PH6．5。\n不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响(二)多次离心法提取肌凝蛋白1、在超低温冰箱中取出保存的SD大鼠比目鱼肌和股四头肌，约0．29，用研钵加液氦研磨成粉状，随后置于Iml离心管，力IGubstraub溶液50咄l，4"C过夜。2、在4"C的温度下，100009离。心lOmin，取上清液；并以7ml预冷无离子水稀释，充分混合后，再在4℃的温度下，100009离-心lOmin。3、倒掉上清，离心沉淀用30al的肌凝蛋白提取液1溶解，再加上预冷无离子水1．2ml稀释，充分混合后，经溶液移至1．5ml离心管。4、在4"C的温度下，120009离，心12min，电泳沉淀用10咄1肌凝蛋白提纯液溶解。(三)Bradford法测定蛋白浓度Bradford法测定蛋白浓度的实验原理是：考马斯亮蓝G-250在酸性条件下与蛋白质结合后，染料的最大吸收峰值从465nm变为595nm。在一定的线性范围内，反应液在595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比。测量595nm处吸光度便可进行蛋白定量。本实验采用此实验原理测试肌凝蛋白的蛋白量，提取相应量的肌凝蛋白。二、SDS-PAGE凝胶电泳(一)配置溶液l、20％SDS：双蒸水50ral，SDS(十二烷基磺酸钠)lOg，充分溶解后室温保存。2、样品缓冲液(10m1)：0．5MTris-HCL缓冲液(PH6．8)2ml，209铋SDS2ml，0．1％溴酚蓝0．5ml，甘油2ml，加双蒸水至9ml冰箱保存，\n硕士学位论文使用前加巯基乙醇lml，混匀。3、电极缓冲液(3000m1)：20％SDSl5ml，Tris39，甘氨酸43．29，加双蒸水至3000ml。4、30％凝胶储液A：N，N甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．59，丙烯酰胺(Acr)309，双蒸水lOOml，溶解后，棕色瓶内冰箱保存。5、30％凝胶储液B：N，N甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．69，丙烯酰胺(Acr)309，双蒸水lOOml，溶解后，棕色瓶内冰箱保存。6、浓缩胶缓冲液(100ml，PH6．8)：双蒸水70ml，Tris69，用3NHCL调至PH6．8，加双蒸水至lOOml，冰箱保存。7、分离胶缓冲液(100ml，PH8．8)：双蒸水70ml，Trisl8．29，用3NHCL调至PH6．8，加双蒸水至lOOml，冰箱保存。8、10％过硫酸铵(AP)：过硫酸铵19，双蒸水lOml，新鲜配置(实验前配)。9、配制分离胶(30m1)：分离胶缓冲液7．5ml，20％SDSO．6ml，30％凝胶储液A8ml，双蒸水4．7ml，甘油9ml，TEMED20／[11．混合均匀，灌胶前21A,20091过硫酸铵(浓度10％)。10、配制浓缩胶(10m1)：分离胶缓冲液2．5ml，20％SDSO．2ml，30％凝胶储液B1．34ml，双蒸水3ml，甘油3ml，TEMEDl吮1．混合均匀，灌胶前加入10％过硫酸铵10吮1。(--)电泳具体操作步骤l、首先安装电泳玻璃板●2、用滴管吸取少量的、用电极缓冲液配制的、浓度为1．3％的热14\n不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响琼脂糖溶液，滴入凝胶腔与电极下槽底部之间所形成的凹槽内，待琼脂糖凝固后，凝胶腔下的2～3mm缝隙即被堵住(通电时可作为盐桥)。3、迅速在两玻璃板的间隙中灌注新鲜配制的分离胶溶液，留出2～3mm高，再在胶液面上小心注入一层正丁醇(约2～3咖高)，以阻止氧气进入凝胶溶液，如有气泡迅速将胶液中的气泡压出。5、待分离胶完全聚合后(约30分钟，根据室温不同聚合时间不同)，倒出覆盖的正丁醇，再用滤纸吸出残留的正丁醇。6、在聚合的分离胶上直接灌注新配制的浓缩胶，并立即在浓缩胶中插入干净的梳子，小心避免生成气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙；将凝胶垂直放置于室温下待用。7、待浓缩胶完全聚合后(30分钟)，小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液(上槽中的电极缓冲液要加满，以淹没短板为准；下槽中的电极缓冲液将正极淹没即可)，并设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。8、根据测定蛋白浓度，取样蛋白2咄g，并加等体积的样品缓冲液，使其充分混匀，并在100。C沸水中水浴3～6分钟，使蛋白质充分变性。9、电泳：插好电源线(注意正负极)，打开电源(恒压70V)，在冰箱中电泳38d,时，4。C：10、配制染色液(1000m1)：考马斯亮蓝(G一250)lg，冰乙酸lOOml，甲醇450ml，双蒸水450ml。1l、配制脱色液(1000m1)：冰乙酸75ml，甲醇250ml，双蒸水\n硕士学位论文675mi。12、染色：电泳结束后，取下SDS凝胶模，卸下凝胶膜上的橡胶框，用镊子将短玻璃撬开后取出短板，用双蒸水轻柔洗涤，小心地将凝胶取出，置于37"C染色液中染色l小时。13、脱色：染色完毕的凝胶用自来水清洗后，置于脱色液中，脱色液在摇床上反复轻轻震荡脱色。脱色过程需多次更换脱色液。14、扫描和分析：待凝胶脱色后，用Tanon凝胶图像拍摄系统扫描，用Tanon凝胶图像处理系统计算MHCI、MHCⅡa、MHCIIb、MHCIIx的灰度值，并计算其百分比。2．5质量控制2．5．1实验动物运动训练时，动物在跑台的后1／3处时，使用声音刺激和毛刷刺激尾部，有时也采用电刺激，使动物保持在跑台前1／2处，确保运动强度与运动量。2．5．2实验动物运动时间固定在每天下午14：0-一17：30之间，且采用固定的跑台、固定人员训练和饲养。2．5．3实验动物取材、指标检测人员固定，确保指标检测的有效性，消除人员因素引起的误差。2．5．4所有实验用玻璃器皿均采用清洗液(重铬酸钾+浓硫酸+水)浸泡24小时以上后用自来水冲洗，再用超纯水润洗3次后高压灭菌、烘干。最后于80℃烘烤2—4小时以上。2．5．5实验用试剂于i贝!}试当天配制，其它特殊试剂的配制均按要求在准确时间配制，配制后的试剂按照标准条件存放。ATP酶染色实\n不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响验，实验前准确测定PH值，符合实验要求。2．5．6SDS凝胶电泳，主要是分离胶和浓缩胶的聚合，要求用新鲜的过硫酸铵，注意温度和时间，上样准确。2．6数据处理所有实验数据均应用SPSSl6．O统计软件包进行分析，以平均数±标准差(j±S)表示各定量指标的平均值和离散程度，组间差异采用方差分析，取显著水平a=O．05。\n硕士学位论文3实验结果3．1大鼠运动情况与体重变化3．1-1大鼠运动情况运动组30只SD大鼠，小强度组与中等强度组大鼠都很好地完成了训练任务，整个实验过程未出现拒跑现象，观察结果与田野险73等人的研究情况基本一致。但大强度组大鼠与中、小强度组比较，训练情况较差，后十多分钟要用毛刷、电刺激等刺激大鼠，才能完成训练任务。表3—1SD大鼠运动．里坐!皇兰：!卫星呈塾垒壁垒!呈!曼坐呈翌!垒!!皇圣!丝垫!塑堡垒丝旦翌垫兰望!垒坐组别数量(只)运动强度(m／min)运动时间(min)如表3-1所示，中强度组(C)(26X44m／min)、小强度组(LE)(19×60re／rain)的大鼠运动期间基本能够维持原强度工作，中等强度组有个别大鼠有受伤情况(脚掌出血)。大强度组(HE)(34X34m／min)的大鼠在运动期间，前20分钟在没有任何刺激的情况下基本可维持原强度工作，但在后14min运动时间里，运动能力下降，不能维持原强度工作，必须采用毛刷刺激，与电刺激才能基本维持，刺激频率达到7-9次／min。说明大强度运动\n不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响后，动物产生疲劳，动物在接受连续刺激，才能继续进行运动；有4只大鼠有受伤史(脚底出血)，并有两只大鼠死亡，提示由于负荷较大，因此疲劳程度也加深。3．1．2大鼠体重变化SD大鼠实验前，按体重分层随机分成四个组，C组、LE组、ME组、HE组。实验后，各组SD大鼠体重变化差异明显。SD大鼠实验前后的体重变化情况见表3-2，图3-1。表3-2SD大鼠体重变化墅!皇兰：!婴皇业塑皇!!皇!鲍!!皇塑曼呈垫墨旦!坐实验前体重(g)实验后体重(g)注：六代表与C组比较，P<0．05；★★代表与C组比较，P<0．01图3-1SD大鼠体重变化Fi93·1ThefigofweightchangeinSDrats从表3—2、图3-1可知，C组、LE组、ME组、HE组大鼠实验前、\n硕士学位论文实验后体重变化情况，研究结果显示：实验前，是按体重分层随机抽样均分，与对照组比较各组体重无明显差异(P>O．05)，差异无统计学意义；实验后，各组大鼠体重都有较大程度的增加，与C组比较，中等强度组和小强度组大鼠体重有明显差异，C组增加更为显著(PME组>HE组，虽有差异，但差异不明显(P>O．05)，差异无统计学意义。从整个实验组来看，SD大鼠的体重变化趋势是：C组>LT组>ME组>HE组。3．2ATP酶染色结果3．2．1比目鱼肌I型和II型肌纤维面密度变化情况ATP酶染色图见附录l，I型和II型肌纤维图片显色对比明显，在碱性环境下染色，II型肌纤维呈棕褐色，I型纤维不显色或呈浅色。比目鱼肌I型和II型肌纤维面密度变化情况如表3—3，图3-2，图3-3：研究结果显示：与对照组比较，I型肌纤维面密度，小强度组明显增加(PO．05)，差异无统计学意义。3．2．2胫骨前肌I型和II型肌纤维面密度变化情况胫骨前肌I型和II型肌纤维面密度变化情况如表3-4，图3-4，图3—5结果显示：与对照组比较，小强度组的I型肌纤维面密度明显增加(PO．05)，无显著性差异，II型肌纤维增加(P>O．05)，无显著性差异，差异均无统计学意义。3．2．3比目鱼肌I型和II型肌纤维数密度变化情况比目鱼肌I型和II型肌纤维数密度变化情况如表3-5，图3-6，图3-7。结果显示：与对照组比较，小强度组的I型肌纤维数密度增加(P>O．05)；中等强度组和大强度组I型肌纤维数密度减少(P>0．05)，无显著性差异；差异无统计学意义；小强度组的Ⅱ型肌纤维数密度减少(P>O．05)，中等强度组和大强度组的II型肌纤维数密度增加(P>O．05)，无显著性差异；差异均无统计学意义。\n不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响表3-5SD大鼠比目鱼肌I型和II型肌纤维数密度变化III注同上表与小强度组比较，中等强度组的I型肌纤维数密度减少(P<0．05)，有显著性差异；II型肌纤维数密度增加(PO．05)，II型肌纤维数密度增加(P>O．05)，均无显著性差异，差异也均无统计学意义。与中等强度组比较，大强度组的I型肌纤维数密度增加和II型肌纤维数密度减少(P>O．05)，无显著性差异，差异无统计学意义。图3-6SD大鼠比目鱼肌I型肌纤维数密度变化Fig3-6ThetypeImusclefibernumberdensity(S．D)0frat’SSOL\n硕士学位论文图3—7SD大鼠比目鱼肌II型肌纤维数密度变化Fig3-7ThetypeIImusclefibernumberdensity(S．D)0frat’sSOL3．2．4胫骨前肌I型和II型肌纤维数密度变化情况胫骨前肌I型和II型肌纤维数密度变化情况见表3-6，图3-8，图3—9：研究结果显示：与对照组比较，小强度组的I型肌纤维数密度增加(P>O．05)，II型肌纤维数密度减少(P>O．05)，无显著性差异，差异无统计学意义，中等强度组的I型肌纤维数密度减少(P<0．05)，有显著性差异，Ⅱ型肌纤维数密度明显增加(PO．05)，无显著性差异，差异无统计学意义，II型肌纤维数密度增加(PO．05)，无显著性差异，差异无统计学意义；中等强度组的II型肌纤维数密度增加(PO．05)，无显著性差异，差异无统计学意义。与中等强度组比较，大强度组的I型数密度增加(P>O．05)，II型肌纤维数密度减少(P>O．05)，均无显著性差异，差异均无统计学意义。图3-8SD大鼠胫骨前肌I型肌纤维数密度变化Fig3-8ThetypcImusclefibernumberdensity(S．D)ofrat’sTA\n硕士学位论文图3-9SD大鼠胫骨前肌II型肌纤维数密度变化Fig3-9ThetypelImusclefibernumberdensity(S．D)ofrat’STA3．3SDS-PAGE凝胶电泳结果3．3．1比目鱼肌Mac亚型百分比变化情况SDS—PAGE凝胶电泳图见附录2，由图2可见，不同强度运动组MHC亚型百分比差异明显。比目鱼肌MHC亚型百分比变化情况见表3—7，图3—10，结果显示：与对照组比较，小强度组MHCI％和MHCIIx％都升高(P<0．01)，MHCIIb％和MHCIIa％都降低(PO．05)，大强度组的MHCI％降低(P>O．05)，MHCIIb％升高(P>0．05)，无显著性差异，差异无统计学意义。\n不同强度运动对大鼠骨骼肌肌纤维类型的影响表3—7sD太鼠比目鱼肌眦肌纤维类型百分比构成坠竖!堡!鲤篓!螋e箜!塑堕婴鲤!!垫组别姗CI％唧cIIb％哪cIIx％N眦IIa％注：同上表。与小强度组比较，中等强度组的MHcI％降低，MHCIIb％、删Cllx％、蛐Clla％均升高(P<0．01)，大强度组的删cI％降低，i蛀ICIIb％、MHCIIx％升高(P<0．01)，有非常显著性差异，差异具有统计学意义；大强度组的肝IClla％降低(P>O．05)，无显著性差异，差异无统计学意义。与中等强度组比较，太强度组的MHCI％、删Cllb％升高，MHCIIa％降低(P<0．01)，有非常显著性差异，差异具有统计学意义，大强度组的唧cII】【96升高(P>O．05)，无显著性差异，差异无统计学意义。sD大鼠MHC肌纤维百分比构成图胁CI％MHCIIb％MHClIx％MHCIIa％图3-10SD大鼠比目鱼肌姗c肌纤维类型百分比构成Fj93．10Themusc|：-fibe'{compo日tioaolSDIm’sSOL嚣舳阳∞∞蚰如加加0\n颈士学位论文3．3．2胫骨前肌删c亚型百分比变化情况胫骨前肌蛐C亚型百分比变化情况见表3-8，圈3—11，研究结果显示：与对照组比较，小强度组的删Clla％升高(P<0．05)，有显著性差异，枷cI％明显升高(P<0．01)，删CIIx％显著降低(P<0．01)，有非常显著性差异，差异均具有统计学意义；中等强度组的MHCI％、WACIIb％均降低，删Clla％升高(PO．05)，无显著性差异，差异无统计学意义。与中等强度组比较，大强度组的MHCI％升高(P>O．05)，无显著性差异，差异无统计学意义；MHCIIa％降低，MHCIIb％和MHCIIx％明显升高(P