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　　RANTES、MIP1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制研究：王晓颖樊嘉周俭邱双健吴晓峰刘银坤汤钊猷【摘要】目的探讨RANTES、MIP1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制。方法使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察RANTES、MIP1α刺激后人肝癌细胞聚合型肌动蛋白(Factin)聚合的变化。采用明胶酶谱法分析RANTES、MIP1α对人肝癌细胞基质金属蛋白酶分泌及活性的影响。结果RANTES、MIP1α可诱导人肝癌细胞内Factin的聚合，并刺激细胞突起和伪足形成。明胶酶谱显示RANTES、MIP1α刺激后人肝癌细胞基质金属蛋白酶MMP2、MMP9等活性显著增加，降解基质能力增强。结论RANTES、MIP1α趋化因子可以诱导Factin聚合促进人肝癌细胞定向运动，并通过增加基质金属蛋白酶活性提高人肝癌细胞侵袭能力。【关键词】肝肿瘤；趋化因子；细胞运动；肿瘤浸润MechanismofRANTESandMIP1αpromotinginvasionandmigrationofhepatomacarcinomacells【Abstract】ObjectiveToinvestigatemechanismof\nchemokinesincludingRANTESandMIP1αpromotinginvasionandmigrationofhepatomacarcinomacells(HCC).MethodsThepolymerizationofHCCFactinstimulatedbyRANTESandMIP1αetryandconfocalmicroscope.GelatinzymographyassayatrixmetalloproteinaseofHCC.ResultsBothRANTESandMIP1αcouldprominentlypromotepolymerizationofFactinandformationofcellprocessandpseudopodiaofHCC.GelatinzymographyassaysshoulationotemigrationofHCCbyinducingpolymerizationofFactinandincreaseinvasivepotentialofHCCbyenhancingactivityofMMPs.【Keyacarcinoma;Chemokines;Cellmigration;Tumorinvasion趋化因子(chemokines)是一类分泌型小分子蛋白质。近来发现其与肿瘤侵袭转移密切相关［1-2］。我们前期研究发现肝癌细胞表达CCR1趋化因子受体，其配体RANTES、MIP1α等趋化因子可以促进肝癌细胞侵袭运动［3］。为进一步阐明RANTES、MIP1α等趋化因子促进肝癌细胞侵袭运动的机制，本研究深入观察RANTES、MIP1α刺激后人肝癌细胞聚合型肌动蛋白(Factin)及基质金属蛋白酶变化情况。\n1材料与方法1.1细胞培养高转移人肝癌细胞株MHCC97H由本所建立。采用DMEM培养液，37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养。1.2悬浮细胞肌动蛋白聚合试验将处于对数生长期的MHCC97H人肝癌细胞常规消化脱壁，重悬于PBS，浓度为1×106个细胞/ml。取上述细胞悬液分别加入含100ng/ml的RANTES或MIP1α(RD公司)无血清DMEM培养液，不加趋化因子为空白对照。分别于趋化因子刺激后15、30、60、120、300和600s时，加入固定染色液［含0.1mg/mlLPC，磷酸缓冲液配制的10%福尔马林，1.65×10-6mol/L的FITCPhalloidin(MolecularProbes公司)］并染色10min。染色后的细胞1500r/min离心5min，用1mlPBS液重悬细胞，上流式细胞仪分析。每次分析1×105个细胞。最大激发波长为560nm，吸收波长为540nm。以空白对照组的荧光总量为100%计算趋化因子刺激各时间点荧光总量的相对比值。1.3贴壁细胞的肌动蛋白聚合试验将处于对数生长期的MHCC97H人肝癌细胞常规消化脱壁，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，制备浓度为1×104个细胞/ml。将上述细胞悬液加入预置细胞培养载玻片的6孔培养板的各室中，培养24\nh至肿瘤细胞完全贴壁，PBS液洗涤。每室加入含100ng/mlRANTES或MIP1α的无血清高糖DMEM培养液2ml，不加趋化因子为对照，孵育2h。吸弃培养液，用PBS液洗涤。加入3.7%中性甲醛固定10min，PBS液洗涤。丙酮脱水1min。每孔加入1mlPBS液配制的0.2%TritonX100，室温处理10min透化细胞，PBS液洗涤。每张爬片孔分别滴加100μl10μg/mlFITCPhalloidin，避光室温孵育40min。PBS洗涤除去未结合的FITCPhalloidin。每孔加入200μlPBS液1∶1000稀释的DAPI(MolecularProbes公司)，复染核0.5min。流水缓慢冲洗2min，除去未结合的DAPI。吸去多余水分，空气中阴干后，VECTASHIELD抗褪色封片剂(Vector公司)封片，用激光扫描共聚焦显微镜观察。1.4明胶酶谱法测定金属蛋白酶活性5×105个细胞接种于6孔培养板，加含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养24h，至60%～70%。移去培养液，加入含100ng/ml趋化因子的无血清培养液，对照不加趋化因子，孵育24h。吸取上清液，离心去除细胞。BCA法测定总蛋白，调整溶液体积使蛋白浓度为2.0mg/ml。配制含0.1%明胶和0.1%SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶，取条件培养液10μl与等体积的2×上样缓冲液(0.125mol/LTrisHCL，pH6.8，20%甘油，4%SDS，0.005%溴酚蓝)混合，于Tris甘氨酸SDS电泳缓冲液中电泳，电压为12\nV/cm3，直至溴酚蓝跑至凝胶底部；置于复性缓冲液(25%TritonX100)中轻摇，室温孵育30min×2次；置入显影缓冲液(含0.121%TrisBase、0.63%TrisHCL、1.17%NaCl、0.074%CaCl2、0.002%Brij35)，摇床缓慢摇动，37℃孵育18h；0.5%的考马斯亮蓝R250染色30min；加入脱色液(含50%甲醇、10%乙酸)适当脱色；凝胶用成像分析系统行灰度扫描及图像分析，以电泳条带的光密度值代表酶活性进行定量分析。1.5统计学分析应用SPSS11.5统计软件进行分析，计量资料采用±s表示，两样本均数的比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1RANTES、MIP1α对人肝癌细胞肌动蛋白聚合的影响RANTES刺激悬浮MHCC97H人肝癌细胞后，可显著增加MHCC97H细胞Factin的聚合，30s时Factin的含量即可达到高峰，为基础含量的2.1倍，但此后Factin含量又逐渐下降，至300s后基本维持在一个比较恒定的水平。而MIP1α刺激后，60s时Factin的含量达到高峰，为基础含量的1.8倍。RANTES、MIP1α刺激MHCC97H细胞后，不同时间点Factin含量变化见图1。\n共聚焦显微镜观察贴壁生长的MHCC97H细胞，对照组在没有RANTES或MIP1α刺激的状态下，肿瘤细胞呈多边形，细胞内Factin含量较少，呈丝状排列，细胞突起少见。在加入RANTES或MIP1α刺激60min后，部分细胞形态发生明显变化，产生较多突起和片状、丝状伪足，细胞内Factin的含量显著增加，并在细胞伪足和细胞运动的前导侧浓集，见图2。2.2RANTES、MIP1α对人肝癌细胞降解细胞外基质能力的影响明胶酶谱显示MHCC97H细胞体外培养可分泌MMP2、MMP9及活性型MMP9等基质金属蛋白酶，但以MMP2为主。受100ng/mlRANTES或MIP1α刺激后，MHCC97H细胞分泌基质金属蛋白酶活性增加(图3)。对明胶酶谱条带IOD值的分析显示：RANTES或MIP1α处理后细胞中MMP2、MMP9及活性型MMP9的分泌均显著上调(P<0.05，表1)。表1趋化因子对人肝癌细胞基质金属蛋白酶分泌及活性的影响(IOD值)子与肿瘤的侵袭、转移密切相关［1-2］。但趋化因子及受体在肝癌侵袭转移中作用研究甚少。Kubo等［4］报道肝癌IL8表达水平与肝癌血管侵犯相关。Yang等［5］发现CCL3与肝癌进展有关。我们前期研究发现RANTES、MIP1α\n等趋化因子可以促进人肝癌细胞侵袭运动，但机制尚未阐明。以肌动蛋白为基础的运动系统是细胞对外界刺激产生反应的重要动力结构。肌动蛋白丝是目前公认的肿瘤细胞运动及转移相关骨架蛋白。细胞在接受细胞外信号刺激后，游离型的肌动蛋白形成聚合型的肌动蛋白，而后者在细胞执行多种生物学功能中发挥重要的作用，如伪足形成、趋化反应、胞吞胞吐作用、细胞质分裂、细胞增殖、组织形成等［6-8］。本研究中应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测发现，受RANTES、MIP1α等趋化因子刺激后，人肝癌细胞中Factin的含量迅速增加，在60s内即可达到峰值，随后Factin可向细胞膜下或细胞运动的前导侧聚集。在贴壁细胞中还可观察到突起和伪足形成。由于伪足在细胞定向运动中具有重要作用。因此RANTES、MIP1α等趋化因子可以通过CCR1受体引起人肝癌细胞内Factin的聚合和伪足的形成，诱导肝癌细胞定向迁移运动。肿瘤细胞在侵袭转移过程中会遇到一系列组织屏障。这些屏障由细胞外基质中的基底膜及间质、基质所组成，肿瘤细胞侵袭转移时必须释放各种蛋白水解酶降解基质成分并突破这些屏障，其中基质金属蛋白酶类与肿瘤侵袭转移联系最为广泛［9］。我们前期体外侵袭试验证实RANTES、MIP1α\n等趋化因子可增加人肝癌细胞侵袭穿透人工重建基底膜胶(Metrigel胶)的能力。本研究采用明胶酶谱分析显示肝癌细胞接受RANTES、MIP1α等趋化因子信号刺激后，MMP2、MMP9等金属蛋白酶活性上调。Theret等［10］报道MMP2与肝癌转移能力呈正相关。Chung等［11］证实MMP9表达及活性上调可以增加肝癌侵袭性。RANTES、MIP1α等趋化因子上调人肝癌细胞多种基质金属蛋白酶表达水平及活性，提示其可以通过增强肝癌细胞降解细胞外基质的能力促进肝癌细胞侵袭性。综上所述，RANTES、MIP1α等趋化因子可以诱导Factin聚合和伪足形成，促进人肝癌细胞定向运动，并通过上调MMP2、MMP9基质金属蛋白酶活性增加人肝癌细胞侵袭性。由于RANTES、MIP1α等趋化因子在体内多种病理生理条件下广泛表达，因此两者可能在肝癌侵袭转移中起重要作用，阻断RANTES、MIP1α等趋化因子与肝癌细胞相互作用、抑制其信号传导通路可抑制人肝癌细胞侵袭运动，为防治肝癌转移复发提供新策略。【参考文献】［1］Balkokineokinesandthemolecularbasisofcancermetastasis.NEnglJMed,2001,345(11):833-835.［3］\n王晓颖，樊嘉，周俭，等.CCR1趋化因子受体在人肝癌组织中表达及其临床意义.中华肝胆外科杂志，2006，12(2):101-104.［4］KuboF,UenoS,Hianhepatocellularcarcinomacorrelatesorangiogenesis.AnnSurgOncol,2005,12(10):800-807.［5］YangX,LuP,FujiiC,etal.Essentialcontributionofachemokine,CCL3,anditsreceptor,CCR1,tohepatocellularcarcinomaprogression.IntJC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