局部应用gdnf对运动神经的保护作用研究 4页

　　局部应用GDNF对运动神经的保护作用研究【摘要】　　目的研究周围神经损伤后，经蛛网膜下腔置管局部应用外源性胶质细胞源性神经营养因子(glialcelllinederivedneurotrophicfactor，GDNF)对脊髓前角运动神经元的保护作用。方法成年SD大鼠随机分为两组，即手术加生理盐水组和手术加GDNF组。切断大鼠坐骨神经致相应脊髓前角运动神经元损伤，于L5、6腰椎椎间隙行蛛网膜下腔置管，并注入外源性GDNF(10μg/mL)，分别与术后4、8、12周行神经功能指数检测；于不同时间处死动物并取材，对L4～6节段脊髓标本冰冻切片，行尼氏体染色、光镜检查，并于术后12周取坐骨神经，行电镜检查并采用图象分析仪检测有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径。结果GDNF组的坐骨神经功能指数、脊髓前角运动神经元的存活率、有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径均优于对照组，经统计学处理，两组差异有显著性(P＜0.05)。结论通过蛛网膜下腔注入外源性GDNF保护相应的脊髓运动神经元的同时也促进外周神经功能的恢复。【关键词】周围神经损伤运动神经元胶质细胞源性神经营养因子　　Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofexogenousglialcelllinederivedneurotrophicfactor(GDNF)infusedintothecavitassubarachnoidealisonspinalfrontcornermotorneuronsaftersciaticnerveaxotomy.MethodsFortyEighthealthySDratslydividedinto2groups：NSgroupandGDNFgroup.TheleftsciaticnerveinratsenofL4～6spinalcordeandsectioned.TheNisslstaininginmotorneuronsotorneurons.Electronmicroscopicobservationandmorphometricanalysisedat12berofmotorneuronsinspinalfrontcornerhigherthanthatofNSgroup.Themeanaxondiametersandmeanmyelinesheaththicknessotorneuronfromdeathaftersciaticnerveinjury，andtoencouragetheperipherynerverecovery.　　Keyotorneuron；glialcelllinederivedneurotrophicfactor(GDNF)　　周围神经损伤可引起神经近端发生“轴突反应”，造成相应脊髓神经元胞体出现一系列形态、生化功能和代谢上的变化，严重时引起胞体的凋亡［1］。周围神经损伤后再生的先决条件是神经元胞体的存活及轴突的延伸，而后两者又有赖于微环境中神经生长因子的浓度。胶质细胞源性神经营养因子(glialcelllinederivedneurotrophic\nfactor，GDNF)是近年发现的重要神经营养因子(neurotrophicfactor，NTF)，是目前特异性最强的多巴胺能NTF，对运动神经元和感觉神经元均有强大的神经营养作用［2］。本实验旨在通过切断并显微吻合坐骨神经造成动物脊髓前角运动神经元损伤，经蛛网膜下腔置管局部应用GDNF，达到保护神经元以及促进神经再生的目的。　　1材料和方法　　1.1动物及分组SD雄性健康大鼠36只(山西医科大学动物实验中心提供)，体重250～300g，随机分组：a)GDNF(购于美国PeprotechAsia公司)组18只，5％水合氯醛腹腔麻醉后，左侧坐骨神经于梨状肌下缘1cm处切断，用9～0无创线缝合神经外膜。于L5、6椎间隙行蛛网膜下腔置管，于手术当天起通过留置管注入GDNF6μL(10μg/mL)，连续注射10d；b)生理盐水(NS)组18只，同法给予生理盐水6μL。　　1.2实验标本制备术后4、8、12周分别处死动物并取材。经左心室插管灌注多聚甲醛固定液后，取腰膨大脊髓(中心为L4～6节段)，－20℃连续冰冻切片，进行尼氏体染色(Thionine硫堇染色法)观察。　　1.3电镜检查术后12周，将以横断处为中心的包括远近端各约2cm长的神经取下，去除多余组织，固定于2.5％戊二醛中2h，缓冲液冲洗，10％锇酸固定后，逐级酒精丙酮酸脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片，醋酸铀饱和水溶液染色后再用枸橼酸铅染色，JEOL100型透射电镜观察。　　1.4图像分析及数据处理切片经光镜检查照相及显微图像分析系统分析，计数脊髓前角大、中型运动神经元数目，对髓鞘进行定量测量。检测数据以(±s)表示，采用SPSS软件分析，不同时间点两样本均数比较进行t检验，组内不同时间点比较用SNKq检验。　　2结果　　2.1坐骨神经功能指数(sciaticfunctioninders，SFI)测定4周时，两组大鼠的坐骨神经功能指数无统计学差异，8、12周时，GDNF组SFI优于NS组，P＜0.05(见表1)。　　2.2尼氏体染色本实验计数的神经元为位于脊髓前角外侧细胞核较大的中型神经元。脊髓前角运动神经元的存活率以手术侧与非手术侧同类神经元的数量相比表示，4周后，可见两组神经元的存活率存在显著性差异(见表2)。　　2.3透射电镜观察结果\n12周时，GDNF组：可见轴突及髓鞘成熟，髓鞘呈同心圆样排列，胞膜清楚，板层结构清晰，雪旺细胞增生活跃，胞浆内富含线粒体，髓鞘分布较均匀，形态及大小趋于正常。NS组：可见有髓纤维髓鞘薄，厚薄不均匀，髓鞘板层松散，密度不均，排列不规则，轴突直径较细，髓鞘受压变形。　　经统计学分析，GDNF组的有髓神经纤维数目，髓鞘厚度和轴突直径均优于NS组，经统计学分析，有显著性差异(P＜0.05)(见表3)。表1术后各组大鼠SFI变化情况表2坐骨神经切断后脊髓前角运动神经元存活率的变化情况表3术后12周神经轴突图象分析结果*注：与NS组比较，*P＜0.05。　　3讨论　　3.1周围神经损伤后脊髓前角运动神经元的保护策略周围神经损伤后轴索逆向运输的神经营养因子缺乏是造成神经元病变和死亡的原因之一，提供外源性神经营养因子可以延长神经元的存活时间［3］。有实验表明，切断新生大鼠运动神经，在断端应用一定浓度的GDNF则可阻止神经元的退变、死亡和萎缩［4］，所以神经功能重建的有效治疗方法就是实施神经吻合的同时，对神经元采取保护性措施，使神经元为再生轴突提供基本的物质条件。本实验中SD大鼠的坐骨神经损伤后先通过显微外科技术对神经进行外膜缝合，经椎间隙置管并使其位置固定，再通过留置管向腰膨大神经元的部位给予GDNF，结果表明实验组GDNF的应用有效的保护了脊髓前角运动神经元，且明显提高神经元的存活率。　　3.2GDNF自1993年首先发现GDNF以来，大量的动物实验表明，GDNF对发育和成熟的运动神经元有神经营养作用，是迄今为止发现的对运动神经元作用最强的神经营养因子。本实验中，实验组应用GDNF后，不同时间点分别与对照组比较，发现运动神经元的数量以及外周神经髓鞘的厚度及直径等指标均优于对照组。提示精细的神经断端缝合加神经元保护较单纯神经断端缝合更有利于神经功能恢复。采用Allen脊髓损伤模型研究表明，脊髓挫伤后GDNFmRNA表达急剧增加，损伤局部给予外源性GDNF能避免和减少脊髓神经元凋亡［5，6］。　　3.3蛛网膜下腔给药的优点经蛛网膜下腔置管局部应用GDNF的优点具体表现在，通过蛛网膜下腔给药可以将留置管固定在靠近腰膨大损伤神经元周围，可以提高损伤局部的神经营养因子浓度；经留置管可反复多次给药；干预措施远离神经损伤部位，给损伤神经一个相对稳定的恢复环境。蛛网膜下腔内注射药物的吸收机制：蛛网膜下腔脑脊液大部分经蛛网膜绒毛回到静脉窦，另一部分可直接经中枢神经系统表面毛细血管吸收。脑脊液可看作是广义的细胞外液，作为媒介，神经细胞可以通过脑脊液直接进行物质交换，吸收营养，排泄代谢产物［7］。\n　　随着对周围神经损伤所致相关神经元胞体变性机制的研究及从分子水平研究的日趋深入，如何应用基因工程向损伤局部移植能产生神经营养因子的遗传修饰细胞，减少神经元的凋亡，促使其结构和功能的恢复，将成为下一步研究的重点。【参考