脉络丛 neuro2a细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突的排斥作用 9页

　　脉络丛Neuro2A细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突的排斥作用【关键词】Slit2脉络丛脊髓运动神经元轴突维共培养［Abstract］Objective:ToinvestigatetheeffectofthechoroidplexusortheNeuro2Acellsontheembryonicspinalmotoraxons.Methods：TouseECMGelasatissueculturesubstrate,3dimentioncocultureofthechoroidsplexusortheNeuro2Acellsbryonicspinalmotorcolumn(Embryonic12days,E12)adeinthesubstrate.ToobservetheeffectofthechoroidplexusortheNeuro2Acellsontheembryonicspinalmotoraxons.Results：After2daysofcoculture,orespinalmotoraxonsthedistalpartofthechoroidplexusortheNeuro2Acells.Conclusion：ThechoroidplexusandtheNeuro2Acellshadtherepellingeffectonembryonicspinalmotoraxons.［Keybryonicspinalmotoraxons;3dimentioncoculture\n神经细胞迁移和轴突导向是神经系统发育和再生过程中的重要问题。目前发现一系列与神经迁移和神经元轴突导向有关的分子,如Slit,Netrin,Semaphorin,Ephrin等［1］。Slit和其受体Robo(roundabout)是目前研究较热的一对轴突导向分子，其研究主要集中在神经系统发育方面，特别是对于调控联合神经元轴突穿越中线的作用研究已成为热点［2］；而对于中枢神经损伤后再生作用机制的研究较少［3］。我们建立脉络丛组织、Neuro2A细胞株与胚胎脊髓运动神经柱的三维共培养体系，观察两者对运动神经元轴突生长影响的作用,从脊髓发育角度探索脊髓损伤后的脊髓神经轴突再生、导向的机制。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物胚龄分别为12天、19天的SD孕鼠。SD大鼠购于江苏大学实验动物中心。将成熟的雌雄成年SD大鼠合笼后，次日清晨查雌性大鼠，作阴道涂片，见到精子者定为受孕第0天，计为P0。1.1.2主要试剂L15培养基（Gibco公司），DMEM/F12（Gibco公司），FBS（Gibco公司），PBS（Boster公司），ECMGel(Sigma公司)，青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司）等。1.1.3主要实验器材\nEppendorf台式离心机，超净工作台（Airtech公司），CO2恒温细胞培养箱（Thermo公司），24孔细胞培养板（Corning公司）,显微手术器械一套，体视显微镜（Olympus公司）,倒置相差显微镜（Olympus公司），滤器（Millipore公司:孔径0.22μm），玻璃圆盖片（直径：14mm），一次移液管（Coster公司），一次性注射器（规格1ml,5ml）等。1.2方法1.2.1胚胎SD大鼠的取材（1）按要求分别取胚胎12天、19天的SD孕鼠,断颈处死,放置于75%乙醇中浸泡消毒10min。在超净台中取出乙醇浸泡后的孕鼠,将其仰卧位固定在大鼠解剖台上。无菌操作下取下腹部弧形切口,依次切开皮肤、皮下组织、腹部肌肉，显露双角子宫，在不侵入子宫和刺破羊膜的情况下取出呈现“串珠样”含有胚胎的子宫。（2）将取出的含有胚胎的子宫放置在无菌培养皿中。眼科剪剪开子宫，羊膜，取出鼠胚，放置于盛有双抗的PBS培养皿中，洗去残余血迹待用。1.2.2含有胚胎背部肌肉提取物培养基的配制（1）将取出的胚龄为19天的胎鼠放在一干燥培养皿中，将鼠胚用眼科剪断头，取其背部肌肉称重为0.5g（湿重），剪碎后放入30mlDMEM/F12培养基中浸泡，半小时后取浸泡液行4000r/min离心15min，取上清液行抽滤处理（需2～3个滤器）。（2）用无菌的DMEM/F12将滤液稀释至100\nml，加入双抗后备用。1.2.3脉络丛组织的分离和培养(1)取成年大鼠（3月龄，雌雄不限），断头处死，鼠头放置于75%乙醇中浸泡消毒10min。在超净台中取出乙醇浸泡的鼠头，固定在解剖台上。(2)无菌操作下依次纵行剪开头部正中的皮肤，显露颅骨，血管钳咬除颅骨后显露大脑。(3)眼科镊取出大脑，放置于含有双抗的无菌PBS中，洗去残余血液，眼科剪沿大脑冠状面切开大脑，显露两侧侧脑室，在侧脑室后方用眼科镊取脉络丛组织。(4)取出的脉络丛组织放置在含双抗DMEM/F12的培养基中，放置于CO2恒温细胞培养箱中待用。1.2.4大鼠脊髓前角运动神经柱的分离（1）将取出的胚龄为12天的胎鼠放入盛有少量L15培养基的无菌培养皿中，在体视显微镜下用1ml一次性注射器2支作为解剖针顺行取出脑干平面以下脊髓组织,剔除脊髓被膜，取出的脊髓放入4℃含有双抗的L15培养基中。（2）在体视显微镜下将取出的脊髓组织继续用1ml一次性注射器2支作为解剖针将脊髓的腹侧前柱取出（openbookmethod）［4］,放在4℃含双抗的L15培养基中待用。1.2.5脊髓运动神经柱与脉络丛组织的共培养①在体视显微镜下将前取出的脉络丛和脊髓前角运动神经柱用显微器械分离成小段（1mm×1mm大小）;②\n将分离的脉络丛组织小段和脊髓前柱小段放在无菌的圆盖片中,调节彼此距离使其靠近但又不接触(小于1mm距离);③用4℃无菌的ECMGel（每孔20μl）作为三维培养基质胶覆盖固定两组织块;④将圆盖片放入24孔板中，加入37℃的含有胚胎背部肌肉提取物DMEM/F12的双抗培养基。CO2恒温培养箱培养24～36h后观察共培养结果。1.2.6脊髓运动神经柱与Neuro2A细胞株的共培养①将Neuro2A细胞株分别用0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清DMEM/F12中和，离心后弃去上清得到细胞。将细胞用4℃ECMGel溶解后，将含有细胞的ECMGel以每孔5μl种植于玻璃圆盖片的中央;②待ECMGel凝固后，将分离脊髓前柱小段放在预先凝固了的基质胶上，并调节彼此距离使其靠近但又不接触(小于1　mm距离);③用4℃无菌的ECMGel（每孔20μl）作为三维培养基质胶覆盖固定脊髓组织和细胞悬滴;④将圆盖片放入24孔板中，加入37℃的含有胚胎背部肌肉提取物DMEM/F12的双抗培养基。CO2恒温培养箱培养24～36　h后观察共培养结果。2结果2.1脊髓前角运动神经元、脉络丛组织共培养36h后脊髓运动神经元轴突生长情况在脊髓前角运动神经元、脉络丛组织共培养36\nh后，脊髓腹侧组织背离脉络丛一侧的神经轴突生长旺盛且较长，轴突生长方向无明显偏向，呈现放射状生长（图1a）；脊髓腹部组织靠近脉络丛一侧的轴突偏向,背离脉络丛生长,且轴突生长较少较短（图1b）。2.2脊髓前角运动神经元、Neuro2A细胞株共培养脊髓运动神经元轴突生长随时间变化的情况在脊髓前角运动神经元、Neuro2A细胞株共培养24h后脊髓运动神经元轴突呈现极向生长；36h后极向生长更加明显，表现为面向细胞聚集团的脊髓运动神经元神经轴突数量较少，长度较短；而远离细胞聚集团的脊髓运动神经元神经轴突数量密集，生长旺盛，呈现放射性生长。见图2。图2左侧为Neuro2A细胞株；右侧为脊髓前角运动神经柱组织。3讨论Slit最初是在果蝇体内发现的细胞外信号分子，是在进化中高度保守的蛋白,后来发现哺乳动物体内主要由发育期的脊髓中线胶质细胞和大脑中隔组织分泌。Brose等［5］指出Slit分子是发现的第一种对神经元迁移和轴突生长都有导向作用的因子。S）方向迁移的可能机制，即脉络丛分泌的排斥性物质参与大脑皮质神经元导向作用，同时在研究过程中发现一种小鼠神经母细胞瘤(Neuro2A细胞株)分泌一种相对分子质量和全长Slit2一致（190\nkDa）的蛋白，并且发现这种分泌蛋白和Slit2抗体存在交叉反应，从而提出这种分泌蛋白可能是Slit2或者是Slit家族的其他成员。既然Slit2全长片段可以排斥脊髓运动神经元轴突［7］，而脉络丛组织和Neuro2A细胞株可能分泌全长Slit2，因此我们将脉络丛或Neuro2A细胞株与胚胎脊髓运动神经元共培养，来研究Slit2对于脊髓运动神经元轴突生长的作用。在研究中，我们选取胚龄为12天的SD大鼠胚胎脊髓，此时脊髓运动神经元处于分化阶段，有利于我们观察轴突生长变化；我们选取胚龄19天的SD大鼠背部肌肉提取物作为培养基，考虑到含有背部肌肉提取物的培养基中可能含有促进神经生长的物质。通过实验我们发现脉络丛或Neuro2A细胞株确实排斥胚胎脊髓运动神经元轴突，从而在体外证实了脉络丛或Neuro2A细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突生长存在排斥性导向作用，与体内一致。这种排斥性导向作用很有可能为Slit2所参与。【参考文献】［1］SeegerMA,BeattieCE.Attractionversusrepulsion:modularreceptorsmakethedifferenceinaxonguidance［J］.Cell,1999,97(7):821-824.［2］LindaJR.Surroundedbyslithoissuralaxonscanbeledastray［J］.Neuron,2002,33(2):153-155.\n［3］肖卫东，易成腊.成年大鼠SCI后神经生长导向因子Netrin和Slit的表达及定位［J］.中国脊柱脊髓杂志，2006，16，（11）：843-846.［4］GuthrieS,PiniA.Chemorepulsionofdevelopingmotoraxonsbythefloorplate［J］.Neuron,1995,14(6):1117-1130.［5］BroseK,BlandKS,aL,etal.Diversityandspecificityofactionsofslit2proteolyticfragmentsinaxonguidance［J］.JNeurosci,2001,21(12):4281-4289.［9］LinL,RaoY,IsacsonO.Netrin1andslit2regulateanddirectneuritegroidbraindopaminergicneurons［J］.MolCellNeurosci,2005,28(3):547-555.［10］SeitaH,KenI,TetsijiM,etal.SlitandGlypican1mRNAsarecoexpressedinthereactiveastrocytesoftheinjuredadultbrain［J］.Glia,2003,42(2):130-138.\n［11］肖卫东，易成腊.神经生长导向因子Slit2在成年大鼠急性脊髓损伤后的表达［J］.中华实验外科杂志,2006,23(8):987-989.［12］HuH.Chemorepulsionofneuronalmigrationbyslit2inthedevelopingmammalianforebrain［J］.Neuron,1999,23（4）:703-711.