人教版高中生物选修1知识点清单 21页

1 高中生物选修 1 知识点 专题 1 传统发酵技术的应用 课题 1 果酒和果醋的制作 1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。 2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 ·无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵 3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 ·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖 4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C6H12O6＋6O2＋6H2O→6CO2＋12H2O+能量 5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2+能量 6、20℃左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在 18℃-25℃ 7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发酵过程中, 随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧 呈酸性的发 酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。 8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂 9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变 为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 C6H12O6＋2O2→2CH3COOH＋2CO2＋2H2O C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O 10、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中 断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为 32℃，控制好发酵温度，使发酵 时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧 化。 11、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋） 12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与 酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液 2ｍL，再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H2SO43 滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液 3 滴，振荡试管，观察颜色 13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒 精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过 一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污 染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时， 应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。 疑难解答 （1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 （2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？ 如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气 时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。 2 （3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在 18～25℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在 30～35℃？ 温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最 适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为 32℃，因此要将温度控制在 30～35℃。 课题 2 腐乳的制作 1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛 霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。 2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可 将脂肪水解为甘油和脂肪酸。 3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制 4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。 前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。 后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳 的香气。 5、将豆腐切成 3cm×3cm×1cm 的若干块。所用豆腐的含水量为 70％左右，水分过多则腐乳不易成 形。*水分测定方法如下：精确称取经研钵研磨成糊状的样品 5～10g(精确到 0.02mg)，置于已知 重量的蒸发皿中，均匀摊平后，在 100～105℃电热干燥箱内干燥 4h，取出后置于干燥器内冷却 至室温后称重，然后再烘 30min，直至所称重量不变为止。 样品水分含量（%）计算公式如下： (烘干前容器和样品质量-烘干后容器和样品质量)/烘干前样品质量 ·毛霉的生长：条件:将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在 15～18℃，并保持一定的湿度。 来源：1.来自空气中的毛霉孢子，2. 直接接种优良毛霉菌种 时间：5 天 ·加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加 盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为 8 天左右。 ·用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败 变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味 ·食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质 2.析出水分，使豆腐变硬，在后期制作过程 中不易酥烂 3.调味作用，给腐乳以必要的咸味 4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。 ·配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒 的含量一般控制在 12%左右。 ·酒的作用：1.防止杂菌污染以防腐 2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味 3.酒精含量的高低与 腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期 延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成 块。 ·香辛料的作用：1.调味作用 2.杀菌防腐作用 3.参与并促进发酵过程 ·防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小 3 亚 硝 酸 盐 含 量 发酵时间（d） 心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火 焰，防止瓶口被污染。 疑难解答 （1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？ 豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 （2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？ 盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。 （3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？ 含水量为 70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。 （4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对 人体有害吗？它的作用是什么？ “皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的 “体”，使腐乳成形。 课题 3 制作泡菜 ·制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，将糖分解为乳酸 。 分裂方式是二分裂。反应式为：C6H12O6 酶 2C3H6O3+能量 含抗生素牛奶不能生产酸奶的原 因是抗生素杀死乳酸菌。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。 ·亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。 ·膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过 20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜 pH 、温度和 一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。 ·一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在 10 天之后食用最好 测定亚硝酸盐含量的方法是：比色法 原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对基苯磺酸发生重氮化反应 后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓 度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。 专题 2 微生物的培养与应用 课题 1 微生物的实验室培养 ·培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微 生物培养的物质基础。 ·培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固 4 剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微 生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液 体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于 观察微生物的运动及菌种保藏等。 ·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制 而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然 物质配制而成，常用于实际工业生产。 ·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入 某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生 物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。 ·培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 （生长因子）等。 ·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源；糖类、石油、花生粉 饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。 ·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如 N2、NH3、NO3 -、NH4 +（无机氮源）蛋白质、氨基 酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用 N2。 ·培养基还要满足微生物生长对 PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要 在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的 pH 调至酸性，培养细菌是需要将 pH 调至中性或 微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件 ·无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面： ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 ·消毒与灭菌的区别 消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不 包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学 药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。 灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼 烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。 灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。 ④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。 5 比较项 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭 消毒 较为温和 部分生活状态的微生物 不能 灭菌 强烈 全部微生物 能 制作牛肉膏蛋白胨固体培养基 （1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 （2）倒平板操作的步骤： ①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。 ③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。 ④等待平板冷却凝固，大约需 5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底 在上。 ·倒平板操作的讨论 1.培养基灭菌后，需要冷却到 50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进 行倒平板了。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过度地挥 发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微 生物吗？为什么？ 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微 生物。 纯化大肠杆菌 （1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 （2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分 散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群 体，这就是菌落。 （3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂 固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。 （4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从 而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。 （5）平板划线法操作步骤： ①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。 ③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。 6 ⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速 伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后， 从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不 要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。 ·平板划线操作的讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼 烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前 灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种 直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便 得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操 作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细 菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 （6）涂布平板操作的步骤： ①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。 ③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 8～10s。 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。 涂布平板操作的讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一 想，第 2 步应如何进行无菌操作？ 提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接 触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。 菌种的保存 （1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。 ①临时保藏方法 将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入 4℃的冰箱中保藏。以后每 3～6 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。 ②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。 （2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。 在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混 匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。 疑难解答 （1）生物的营养 营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖 7 所需的外源物质。 人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。 植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。 微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。 （2）确定培养基制作是否合格的方法 将未接种的培养基在恒温箱中保温 1～2 天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则 需要重新制备。 课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 尿素 是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿 素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶 尿素最初是从人的尿液中发现的 筛选菌株 （1）实验室中微生物的筛选应用的原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH 等），同时抑制或阻止其他微生 物生长。 （2）选择性培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养 基，称作选择培养基。 （3）配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入 有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高 浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。 统计菌落数目 （1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通 过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置 3～5 个平板，选择菌落数在 30～300 的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的 实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在 30~300 之间的平板进行计数 2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入 TTC（在计数琼脂中加入适量的 TTC(0.5% TTC 1ML 加到 100ML 琼脂中),细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义）. 3.本法仅限于形成菌落的微生物 8 设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照 实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可 能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。 实验设计 实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综 合考虑和安排。 （1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的 土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7 的土壤中取样。铲去表层土，在距 地表约 3～8cm 的土壤层取样。 （2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用 一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在 30~300 之间、适于计数的平板。 测定土壤中细菌的数量，一般选用 104 105 106 测定放线菌的数量，一般选用 103 104 105 测定真菌的数量，一般选用 102 103 104 （3）微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌 30~37℃ 1~2 天 放线菌 25~28℃ 5~7 天 霉菌 25~28℃ 3~4 天 每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间 不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时 间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色 疑难解答 （1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3 个平板，计算出平板菌落数的平均值 每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代 表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M 代表稀释倍数 课题 3 分解纤维素的微生物的分离 纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。 纤维素与纤维素酶 （1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。 （2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C1 酶、CX 酶和葡萄糖苷酶，前两 种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖， 为微生物的生长提供营养。 9 纤维素分解菌的筛选 （1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。 （2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤 维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基 中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成， 培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤 维素分解菌。 分离分解纤维素的微生物的实验流程 土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将 样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落 （1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。 （2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板 （3）刚果红染色法种类 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。 课题延伸 对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素 分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤 维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。 疑难解答 （1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因 此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。 （2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环 境。一般应将纸埋于深约 10cm 左右腐殖土壤中。 （3）两种刚果红染色法的比较 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这 样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问 题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现 假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地 位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的 能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。 （4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适 应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。 10 专题 3 植物的组织培养技术 课题 1 菊花的组织培养 植物组织培养的基本过程 细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。 离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细 胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细 胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进 行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地 里，可以发育成完整的植物体。 植物细胞工程 具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都 具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下， 通过基因的选择性表达，构成不同组织和器官。 植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物 新品种以及细胞产物的工厂化生产等。 ·细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？ 使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。 比较根尖分生组织和愈伤组织的异同 影响植物组织培养的条件 材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物 的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的 茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺 盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。 营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常 用的培养基是 MS 培养基，其中含有的大量元素是 N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是 Fe、Mn、 B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。 激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素 存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物 激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。 组织类型 细胞来源 细胞形态 细胞结构 细胞排列 细胞去向 根尖 分生组织 受精卵 正方形 无液泡 紧密 分化成多种 细胞组织 愈伤组织 高度分化细胞 无定形 高度液泡化 疏松 再分化成新个体 相同点 都通过有丝分裂进行细胞增殖 11 + 环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将 pH 控制在 5.8 左右，温度 控制在 18~22℃，并且每日用日光灯照射 12h. 4、操作流程 配制 MS 固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。 ·使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。 ·配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并 用蒸馏水定容到 1000 毫升。 ·在菊花组织培养中，可以不添加植物激素 原因是菊花茎段组织培养比较容易。·灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。 ·MS 培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS 培养基有哪些特点？ 大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维 生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。 微生物培养基以有机营养为主，MS 培养基则需提供大量无机营养。 外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的 嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗 20min 左 右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为 70%的酒精中摇动 2~3 次，持续 6~7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质 量分数为 0.1%的氯化汞溶液中 1~2min。取出后，在无菌水中至少清洗 3 次，漂洗消毒液。 注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。 接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种 7～8 个外植体。外植体接种与 细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。 培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（18~22℃）和光照（12h） 移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后 将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。 栽培 外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌 污染；锥形瓶密封性差等。 使用顺序 实验结果 先生长素， 后细胞分裂素 有利于分裂但不分化 先细胞分裂素， 后生长素 细胞既分裂也分化 同时使用 分化频率提高 生长素／ 细胞分裂素比值与结果 比值高时 促根分化， 抑芽形成 比值低时 促芽分化， 抑根形成 比值适中 促进愈伤组织生长 12 专题 2 月季的花药培养 被子植物的花粉发育被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有 许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植 物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4 个单倍 体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的 4 个单倍体细胞彼此分离，形成 4 个具有单细胞核的花 粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞 核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成 1 个生殖细胞核和 1 个花粉管细胞核，进而形成 两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。 注意：①成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核， 二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一 次有丝分裂，形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）②花粉发育过 程中的四分体和动物细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分 裂形成的 4 个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同 源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。③同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完 全相同。 产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径，一种 是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分 化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。 注意：①无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根②胚状体：植物体细胞组织培养过程 中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有 胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。 影响花药培养的因素诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选 择与培养基的组成是主要的影响因素 ·亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。 ·合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功 率最高 ·花蕾：选择完全未开放的花蕾 ·亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响 ·材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉 发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青- 铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色 ·材料的消毒 ·接种和培养：灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。 在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去 除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药 7～10 个,培 养温度控制在 25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般经过 20～30 天培养后,会发 13 现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化 出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂 后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需要对培养出来 的植株做进一步的鉴定和筛选。 植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相 同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释 放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使 花药培养的难度大为增加。 专题 4 酶的研究与应用知识点 课题 1 果胶酶在果汁生产中的作用 由水果制作果汁要解决两个主要问题：一是果肉的出汁率低，耗时长；二是榨取的果汁浑 浊、黏度高，容易发生沉淀。 1、植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分有纤维素和_果胶_。并且两者不溶于水，在果汁加工 中，既影响出汁率，又使果汁浑浊。 2、果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分 子化合物，不溶于水。在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶的作用是 能够将果胶_分解成可溶性的_半乳醛酸，瓦解植物的细胞壁及胞间层，并且使果汁变得澄清。 3、果胶酶是一类酶总称，包括_果胶分解酶 、 多聚半乳糖醛酸酶 、果胶酯酶_等。 4、酶的活性是指 酶催化一定化学反应的 的能力。酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催 化的某一化学反应的反应速度 来表示。在科学研究与工业生产中，酶反应速度用单位时间内、单 位体积中反应物的减小量或产物的增加量来表示。 5、影响酶活性的因素包括：温度 、PH、酶的抑制剂等。 （二）．实验设计 〔设计一〕探究温度对酶活性的影响 当酶处于最适温度或最适 pH 时，酶的活性最高；若温度过高、过酸或过碱，则导致酶变性失 活。在一定范围内，果肉的出汁率和果汁的澄清度与果胶酶的活性成正比。 此实验的自变量是温度 _；根据单一变量原则，你应确保各实验组相同的变量有_PH 底物浓度底 物量 实验器材 酶的用量 等等_。 〔设计二〕探究 PH 对酶活性的影响 探究 pH 对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成 pH 梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴 加热。反应液中的 pH 可以通过体积分数为 0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。 〔设计三〕探究果胶酶的用量 探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和 pH 对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变 量是果胶酶的用量，其他因素都应保持不变。实验时可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配 制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的 pH 必须相同，否 则将影响实验结果的准 旁栏思考题 1．为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理？ 提示：将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的温度是相同 的，避免了果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问题。 2．在探究温度或 pH 的影响时，是否需要设置对照？如果需要，又应该如何设置？为什么？ 14 提示：需要设置对照实验，不同的温度梯度之间或不同的 pH 梯度之间就可以作为对照，这种对照 称为相互对照。 3．A 同学将哪个因素作为变量，控制哪些因素不变？为什么要作这样的处理？B 同学呢？ 提示：A 同学将温度或 pH 作为变量，控制不变的量有苹果泥的用量、果胶酶的用量、反应的时间 和过滤的时间等。只有在实验中保证一个自变量，实验结果才能说明问题。B 同学对于变量的处理 应该与 A 同学相同，只是观察因变量的角度不同。 4．想一想，为什么能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？ 提示：果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反应了 果胶酶的催化分解果胶的能力。在不同的温度和 pH 下，果胶酶的活性越大，苹果汁的体积就越 大。 5．当探究温度对果胶酶活性的影响时，哪个因素是变量，哪些因素应该保持不变？ 提示：温度是变量，应控制果泥量、果胶酶的浓度和用量、水浴时间和混合物的 pH 等所有其他条 件不变。只有这样才能保证只有温度一个变量对果胶酶的活性产生影响。 实验变量与反应变量(如表) 实验变量(自变量) 反应变量(因变量) 含义 实验中实验者所操纵的因素或条件 由于实验变量改变而引起的变化和结果 实例 温度或 pH 果汁量 联系 实验变量为原因，反应变量是结果，二者是因果关系 课题 2 探讨加酶洗衣粉的洗涤效果 1、酶绝大多数是蛋白质，少数为 RNA；酶具有生物 催化 作用；酶具有高效 性、专一性特点， 但易受温度、PH、表面活性剂等因素的影响。 （1）加酶洗衣粉是指含酶制剂 的洗衣粉，目前常用的酶制剂有蛋白酶 、 脂肪酶 、淀粉酶和纤 维素酶四类。普通洗衣粉中含磷，含磷的污水排放可能导致 微生物和藻类大量繁殖，造成水 体污染，加酶洗衣粉可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠，使洗涤剂朝无磷的方向发展，减少 对环境的污染。 （2）脂肪酶可以将脂肪分解成 甘油和脂肪酸，蛋白酶可以将蛋白质分解成 小分子肽和氨基酸 ， 小分子肽可在 肽酶 作用下分解成氨基酸；淀粉酶可以将淀粉分解成 可溶性麦芽糖，纤维素 酶可以将纤维素分解成 葡萄糖 ，以达到去污的目的，因此，蛋白类纤维织物（羊毛、蚕丝 等）不能用 加（蛋白）酶洗衣粉 来洗涤。 （3）应用最广泛、效果最明显的是 碱性蛋白 酶和 碱性脂肪 酶。 碱性蛋白酶能将血渍 、 奶 渍等含有大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或 小分子的肽，使污迹容易从衣物上脱落。 （4）衣物的洗涤，不仅要考虑到洗涤效果，还要考虑衣物的承受能力 、 洗涤成本等因素。 （5）加酶洗衣粉可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，使洗衣粉朝低磷无磷的方向发展，减 少对环境的污染。 2、实验设计遵循原则：是单一变量原则、对照原则和等量原则，比如探究普通洗衣粉和加酶洗衣 粉对衣物污渍的洗涤效果有何不同时，用控制使用不同种类洗衣粉为变量，其他条件完全一致； 同时普通洗衣粉处理污渍物与加酶洗衣粉处理污渍物形成 对照 实验。 3．不同种类的酶洗衣粉对同一污渍的洗涤效果 （1）实验原理：不同种类的加酶洗衣粉所加的酶不同，而酶具有 专一性 ，所以对不同污渍的洗 涤效果不同。 4、比较普通洗衣粉和加酶洗衣粉去污原理的异同 15 普通洗衣粉 加酶洗衣粉 相同点 表面活性剂可以产生泡沫，将油脂分子分散开，水软化剂可以分 散污垢，等 不同点 酶可以将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易溶 于水，从而与纤维分开 专题 5 ＤＮＡ和蛋白质技术 课题 1 ＤＮＡ的粗提取与鉴定 ·提取 DNA 的溶解性原理包括哪些方面？ DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精。 ·DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度有何特点？要使 DNA 溶解，需要使用什么浓度？要使 DNA 析 出，又需要使用什么浓度？ 在 0.14mol/L 时溶解度最小；较高浓度可使 DNA 溶解；0.14mol/L 可使 DNA 析出。 ·在溶解细胞中的 DNA 时，人们通常选用 2mol/LNaCl 溶液；将 DNA 分子析 出的方法是向溶有 DNA 的 NaCl 溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释 NaCl 溶液。 酒精是一种常用有机溶剂，但 DNA 却不能溶于酒精（特别是 95％冷却酒 精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。 从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止 DNA 降解；二是 降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加 DNA 分子柔韧性，减少断裂。 ·采用 DNA 不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？ 将 DNA 和蛋白质进一步分离。 ·提取 DNA 还可以利用 DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和 怎样的温度值？ 蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对 DNA 产生影响。温度值为 60～ 75℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而 DNA 不会变性。 补充：DNA 的变性是指 DNA 分子在高温下解螺旋，其温度在 80℃以上，如在 PCR 技术中 DNA 变 性温度在 95℃。 ·洗涤剂在提取 DNA 中有何作用？ 洗涤剂瓦解细胞膜。 ·当鉴定提取出的物质是否是 DNA 时，需要使用什么指示剂进行鉴定？ 在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺呈现蓝色。 原理总结：通过利用不同浓度 NaCl 溶液溶解或析出 DNA，可以从细胞中提取和提纯 DNA；再利 用酒精进一步将 DNA 与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是 否是 DNA。 实验材料的选取 16 不同生物的组织中 DNA 含量不同。在选取材料时，应本着 DNA 含量高、材料易得、便于提取的 原则。 本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的 DNA 含量丰富，材料易 得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求 较高，操作繁琐，历时较长。 鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少 DNA 的 损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。 破碎细胞，获取含 DNA 的滤液 ·若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含 DNA 的滤液？ 在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗 涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。 ·为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加 上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出 DNA。 ·在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙 布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解 DNA 物质；选用尼龙布进 行过滤。 ·在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？ 破碎细胞壁，使核物质容易溶解在 NaCl 溶液中；研磨不充分会使 DNA 的提取量减少，影响实验结 果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 。具体做法。10mL 鸡血＋20mL 蒸馏水→同方向搅拌→3 层尼龙布过滤→滤液 去除滤液中的杂质 为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？ 用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使 DNA 析出，能 除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出 DNA，就能够除去与 DNA 溶解度不同 的多种杂质。 最初获得的 DNA 滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯 DNA。 方案一的原理是 DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白 质，不分解 DNA；方案三的原理是蛋白质和 DNA 的变性温度不同。 方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的 DNA 与蛋白质分开；方案三利用的是 DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与 DNA 分离。 析出与鉴定 ·在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的 DNA 呈何颜色？ 滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置 2～3 分钟，析出的白色丝 状物就是 DNA。DNA 呈白色。 ·怎样鉴定析出的白色丝状物就是 DNA 呢？ 17 具体做法。试管 2 支，编号甲乙→各加等量 5mLNaCl 溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶 解→各加 4mL 二苯胺，混合均匀→沸水浴 5min→观察颜色变化 实验操作 制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心 ↓ 破碎细胞，释放 DNA… 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌 ↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。 溶解核内 DNA………… 加入 NaCl 至 2mol/L，同一方向缓慢搅拌 ↓ DNA 析出……………… 加蒸馏水至 0.14mol/L，过滤，在溶解到 2mol/L 溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。 DNA 初步纯化………… 与等体积 95％冷却酒精混合，析出白色丝状物 ↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA 鉴定……………… 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色 注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧 杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰 到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。 专题 6 植物有效成分的提取 课题 1 植物芳香油的提取 天然香料的来源：植物、动物 不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。 芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。 芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。 水蒸气蒸馏法： 原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。 方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。 水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。 水汽蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。 不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压 榨法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作） 18 萃取法： 原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。 方法：原料浸泡在溶剂中→得到浸泡液→有机溶剂挥发→芳香油。 不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质 蒸馏装置包括：铁架台两个、酒精灯、石棉网、蒸馏瓶、橡胶塞、蒸馏头、温度计、直型冷凝管、 接液管、锥形瓶，以及连接进水口和出水口的橡皮管。所有仪器必须事先干燥，保证无水。整套蒸 馏装置可分为左、中、右三部 分，其中左边的部分通过加热进 行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右 边的部分用来接收。安装仪器一 般都按照自下而上、从左到右的 顺序。拆卸仪器的顺序与安装时 相反。具体安装顺序和方法如 下。 （1）固定热源──酒精灯。 （2）固定蒸馏瓶，使其离热源的 距离如教科书中图 6-2 所示，并 且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水 平面垂直。 （3）安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。 （4）连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管 与水龙头相连。 （5）连接接液管（或称尾接管）。 （6）将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接受器，接收瓶应在 实验前称重，并做好记录。 （7）将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限 与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。 蒸馏装置安装完毕后，可以在蒸馏瓶中加几粒沸石，防 止液体过度沸腾。打开水龙头，缓缓通入冷水，然后开 始加热。加热时可以观察到，蒸馏瓶中的液体逐渐沸 腾，蒸气逐渐上升，温度计读数也略有上升。当蒸气的 顶端达到温度计水银球部位时，温度计读数急剧上升。 在整个蒸馏过程中，应保证温度计的水银球上常有因冷 凝作用而形成的液滴。控制蒸馏的时间和速度，通常以 每秒 1～2 滴为宜。 分液漏斗的使用方法如下。 （1）首先把活塞擦干，为活塞均匀涂上一层润滑脂，注意切勿将润滑脂涂得太厚或使润滑脂进入 活塞孔中，以免污染萃取液。 19 （2）塞好活塞后，把活塞旋转几圈，使润滑脂分布均匀。并用水检查分液漏斗的顶塞与活塞处是 否渗漏，确认不漏水后再使用。 （3）将分液漏斗放置在大小合适的、并已固定在铁架台上的铁圈中，关好活塞。将待分离的液体 从上部开口处倒入漏斗中，塞紧顶塞，注意顶塞不能涂润滑脂。 （4）取下分液漏斗，用右手手掌顶住漏斗顶塞并握住漏斗颈，左手握住漏斗活塞处，大拇指压紧 活塞，将分液漏斗略倾斜，前后振荡（开始振荡时要慢）。 （5）振荡后，使漏斗口仍保持原倾斜状态，左手仍握在漏斗活塞处，下部管口指向无人处，用拇 指和食指旋开活塞，使其释放出漏斗内的蒸气或产生的气体，以使内外压力平衡，这一步操作也称 做“放气”。 （6）重复上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的气体时为止。再将分液漏斗剧烈振荡 2～3 min，然后将漏斗放回铁圈中，待液体静置分层。 蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。 玫瑰精油的提取 ·0.1g/mL 氯化钠溶液：促使油水混合物（乳浊液）中油和水的分离。无水硫酸钠：吸收油层中的 水分。 实验步骤：①采集玫瑰花：采集盛花期（5 月中上旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。 ②装入蒸馏原料：称取 50g 玫瑰花放入蒸馏瓶，添加 200mL 蒸馏水。 ③安装蒸馏装置：按照从左向右、自下到上次序安装水蒸气蒸馏装置。 ④加热蒸馏：控制蒸馏时间和速度（1～2 滴/秒），获得乳白色乳浊液；拆卸装置。 ⑤分离油层：向乳浊液加入 NaCl 溶液后，利用分液漏斗分离出上面的油层。 ⑥除去水分：向油层中加入无水硫酸钠，24h 后过滤，得到玫瑰油。 ＊注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。 橘皮精油的提取 橘皮精油的主要成分：柠檬烯，主要分布在橘皮中。 石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。 小苏打、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的 0.25％和 5％）。 实验步骤：①橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗沥干。 ②石灰水浸泡：用 7～8％石灰水浸泡橘皮 24h。 ③清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。 ④粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压榨机压榨得到压榨液。 ⑤过滤压榨液：用布袋过滤，滤液再高速离心处理，分离出上层橘皮油。 ⑥静置处理：将橘皮油在 5～10℃冰箱中静置 5～7d，分离出上层澄清橘皮油。 ⑦再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。 分析：静置处理目的：除去果蜡和水分。 课题 2 胡萝卜素的提取 胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶 剂。 20 依据碳碳双键的数目划分为α、β、γ 三类。 其中最主要的组成成分为β-胡萝卜素。 作用：①治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；②常用于食品色素；③使癌变细胞恢复 成正常细胞。 提取β－胡萝卜素的方法主要有三种：①从植物中提取②从大面积养殖的岩藻中获得③利用微生物 的发酵生产 实验步骤①粉碎：使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。②干燥：脱水温度太高，干燥时间太 长会导致胡萝卜素分解。③萃取 Ⅰ、萃取剂的选择 水溶性的：乙醇、丙酮 水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、 乙醚、苯、四氯化碳等 选择：具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。 Ⅱ、影响萃取的因素 主要因素：萃取剂的性质和使用量 次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等 一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。 萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥 Ⅲ、胡萝卜素提取 装置的设计：萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使 用明火加热容易引起燃烧爆炸。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装 置。萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。在浓缩之前，还要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。 ④过滤：除去萃取液中的不溶物 ⑤浓缩：蒸发出有机溶剂 鉴定：纸层析法 滤纸：18 ㎝×30 ㎝ 基线：滤纸下端距底边 2 ㎝处做一基线，在基线上取 A、B、C、 D 四点。 点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取样品进行点样。点 样应该快速细致，在基线上形成直径２ｍｍ左右的圆点，每次点 样后，可用吹风机将溶剂吹干，注意保持滤纸干燥。等滤纸上的 点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，至于装有１ｃｍ深的 石油醚的密封玻璃瓶中。等各种色素完全分开后，观察标准样品 中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。 １．乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗？为什么？ 答：胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性有机溶剂，因萃取中能与水混溶而影响萃取效 果，所以不用它们作萃取剂。 2.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，哪种最适宜用来提取胡萝卜素？ 答：在这五种有机溶剂中，石油醚的沸点最高，在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃 取剂。 21 提取方法 实验原理 方法步骤 适用范围 水蒸气蒸馏 利用水蒸气将挥发性较强的 芳香油携带出来 1.水蒸气蒸馏 2.分离油层 3.除水过滤 适用于提取玫瑰油、薄荷油等 挥发性强的芳香油 压榨法 通过机械加压，压榨出果皮 中的芳香油 1.石灰水浸泡、漂洗 2.压榨、过滤、静置 3.再次过滤 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原 料的提取 有机溶剂萃取 使芳香油溶解在有机溶剂 中，蒸发溶剂后就可获得芳香油 1.粉碎、干燥 2.萃取、过滤 3.浓缩 适用范围广，要求原料的颗粒 要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液 中