高考生物一轮复习第十单元生物技术与工程第35讲基因工程Ⅱ基因工程的原理与应用课件 83页

第 35 讲 基因工程 (Ⅱ) 基因工程的原理与应用 生物技术与工程 （选择性必修 3 ） 第十单元 等级考 (2017 级 ) 课标要求 内容标准 活动要求 1 ．简述基因工程的诞生。 2 ．简述基因工程的原理及技术。 3 ．举例说出基因工程的应用。 4 ．简述蛋白质工程。 1 ． 基因工程的概念 (1) 供体：提供 ____________ 。 (2) 操作环境： ________ 。 (3) 操作水平： ________ 水平。 (4) 原理： ____________ 。 (5) 受体：表达目的基因。 (6) 本质：性状在 ________ 体内的表达。 (7) 优点：克服 __________________ 的障碍，定向改造生物的 ____________ 。 考点一　基因工程的基本工具 目的基因　 体外　 分子　 基因重组　 受体　 远缘杂交不亲和　 遗传性状　 2 ． 基因工程的诞生 (1)20 世纪中叶，基础理论取得了重大突破 ① DNA 是遗传物质的证明 1944 年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了 _____ _________________ ，还证明了 ___________________________________________ 。 ② DNA 双螺旋结构和中心法则的确立 1953 年，沃森和克里克建立了 _______________________ 模型。 1958 年，梅塞尔松和斯塔尔用实验证明 __________________ 。随后不久确立的中心法则，解开了 DNA 复制、转录和翻译过程之谜，阐明了遗传信息流动的方向。 生物 的遗传物质是 DNA DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体 DNA 双螺旋结构 DNA 的半保留复制 ③ 遗传密码的破译 1963 年，尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码。 1966 年，霍拉纳用实验证实了尼伦伯格提出的遗传密码的存在。这些成果不仅使人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套 ____________ ，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。 (2) 技术发明使基因工程的实施成为可能 ① 基因转移载体的发现 1967 年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核 DNA 之外的质粒有 ____________ 能力，并可以在 _____________ 间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具。 遗传密码 自我复制 细菌细胞 ② 工具酶的发现 1970 年，阿尔伯、内森斯，史密斯在细菌中发现了第一个限制性内切酶 ( 简称限制酶 ) 后， 20 世纪 70 年代初相继发现了多种限制酶和连接酶，以及逆转录酶，这些发现为 DNA 的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 ③ DNA 合成和测序技术的发明 自 1965 年，桑格发明氨基酸序列分析技术后， 1977 年，科学家又发明了 DNA 序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能，之后， DNA 合成仪的问世又为 _________ 、 ________ 和 __________________ 的获得提供了方便。 引物 探针 小分子量 DNA 基因 ④ DNA 体外重组的实现 1972 年伯格首先在体外进行了 DNA 改造的研究，成功地构建了第一个体外重组 DNA 分子。 ⑤ 重组 DNA 表达实验的成功 1973 年，博耶和科恩选用仅含单一 EcoRI 酶切位点的载体质粒 pSC101 ，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的 DNA 片段重组。重组的 DNA 转入大肠杆菌 DNA 中，转录出相应的 mRNA 。这个实验证明了 a. __________________________________ ， b. ______________________________ ， c. _______________________________________ _________________________________ 。至此，基因工程正式问世。 质粒不仅可以作为基因工程的载体 重组 DNA 还可以进入受体细胞 外源基因可以在原核细胞中成功表达， 并实现物种之间的基因交流 第一例转基因动物问世 1980 年，科学家首次通过 _____________ 培育出世界上第一个转基因小鼠。 1983 年，科学家又采用 ______________ 法，培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展阶段。 PCR 技术的发明 基因工程问世后， 1988 年由穆里斯发明的 PCR 技术，使基因工程技术得到了进一步发展和完善。 显微注射 农杆菌转化 3 ． 基因工程的操作工具 (1) 限制酶 原核　 特定的核苷酸序列　 磷酸二酯键　 黏性末端　 (2)DNA 连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的 DNA 片段 ____________________ 。 ②类型 常用类型 E · coli DNA 连接酶 T 4 DNA 连接酶 来源 ____________ T 4 噬菌体 功能 只缝合 ____________ 缝合 ____________________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 ______________ 拼接成 DNA 分子　 大肠杆菌　 黏性末端　 黏性末端和平末端　 磷酸二酯键　 ③DNA 连接酶和限制酶的关系 双链环状 DNA 分子　 限制酶切割位点　 标记基因　 动植物病毒　 受体细胞　 [ 归纳整合 ] 1 ． 限制酶的特点与使用 (1) 限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身 DNA 的原因是原核生物 DNA 分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 (2) 在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在 DNA 连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。 (3) 为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓 “ 环化 ” 可用不同的限制酶分别处理含目的基因的 DNA 和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。 2 ． 与 DNA 相关的五种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将 DNA 切成两个片段 DNA 连接酶 磷酸二酯键 将两个 DNA 片段连接为一个 DNA 分子 DNA 聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA ( 水解 ) 酶 磷酸二酯键 将 DNA 片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链 DNA 分子局部解旋为单链，形成 两条长链 3 ． 全面理解基因工程中的载体 (1) 应具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。 ②具有一个至多个限制酶切点，可供外源 DNA 片段插入。 ③具有标记基因，可供重组 DNA 的鉴定和选择。 (2) 与膜载体的区别：基因工程中的载体是 DNA 分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 [ 思维探究 ] 据两种限制酶的作用图示思考相关问题： (1) 已知限制酶 Eco RⅠ 和 Sma Ⅰ 识别的碱基序列和酶切位点分别为 G ↓ AATTC 和 CCC ↓ GGG ，在图中画出两种限制酶切割 DNA 后产生的末端并写出末端的种类。 提示： (2) 图①和②产出的末端类型有什么不同？ 提示： ①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。 (3) Eco RⅠ 限制酶和 Sma Ⅰ 限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同，说明限制酶具有怎样的特性？ 提示： 专一性。 [ 教材深挖 ] 教材选修 3 P 4 “ 寻根问底 ” ：根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 提示： 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源 DNA 侵入时，会利用限制酶将外源 DNA 切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源 DNA 、使之失效，从而达到保护自身的目的。 命题点一　限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶的作用 1 ． (2019 · 甘肃兰州期末考试 ) 1972 年伯格首先在体外进行了 DNA 改造的研究，成功地构建了第一个体外重组 DNA 分子，下列相关叙述正确的是 ( 　　 ) A ．不同的 DNA 分子必须用同一种限制酶切割，才能产生相同的黏性末端 B ． DNA 连接酶、 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键 C ．当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 的两条链分别切开时，产生的是平末端 D ．限制酶和 DNA 连接酶的作用部位不同 B 解析 　 有些限制酶的识别序列不同但可以产生相同的黏性末端， A 错误； DNA 连接酶、 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶和逆转录酶都能催化形成磷酸二酯键， B 正确；当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端， C 错误；限制酶和 DNA 连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键， D 错误。 2 ． (2016 · 全国卷 Ⅲ ， T40) 图 (a) 中的三个 DNA 片段上依次表示出了 Eco RⅠ 、 Bam HⅠ 和 Sau 3AⅠ 三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图 (b) 为某种表达载体的示意图 ( 载体上的 Eco RⅠ 、 Sau 3AⅠ 的切点是唯一的 ) 。 图 (a) 图 (b) 根据基因工程的有关知识，回答下列问题： (1) 经 Bam H Ⅰ 酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 _________ 酶切后的产物连接，理由是 ___________________________________________________ 。 (2) 若某人利用图 (b) 所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图 (c) 所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ________ ，不能表达的原因是 ______________________________________________ _________________________________________________________________ 。 Sau 3AⅠ 　 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　 甲和丙　 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 ( 其他合理答案也可 ) (3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的有 _________________ 和 _______________ ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是 _____________ 。 E . coli DNA 连接酶　 图 (c) T 4 DNA 连接酶　 T 4 DNA 连接酶 　 3 ． (2019 · 四川乐山一模 ) 为了解基因结构，通常选取一特定长度的线性 DNA 分子，先用一种限制酶切割，通过电泳技术将单酶水解片段分离，计算相对大小；然后再用另一种酶对单酶水解片段进行降解，分析片段大小。下表是某小组进行的相关实验。 已知第一线性 DNA 序列共有 5000bp (bp 为碱基对 ) 第一步水解 产物 ( 单位 bp) 第二步水解 产物 ( 单位 bp) A 酶切割 3 500 将第一步水解产物分离后，分别用 B 酶切割 1500 2000 1 000 1 000 500 500 B 酶切割 2 000 将第一步水解产物分离后，分别用 A 酶切割 500 1500 3 000 2000 1000 经 A 酶和 B 酶 同时切割 2000 1500 1000 500 (1) 该实验中体现出限制酶的作用特点是 __________________________________ ______________________________ 。 (2) 由实验可知，在这段已知序列上， A 酶与 B 酶的识别序列分别为 _______ 个和 ______ 个。 (3) 根据表中数据，请在下图中用箭头标出相应限制酶的酶切位点。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，且在特定的位点切割 2 　 1 　 磷酸二酯键 　 (1) 质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有 __________________ ________________( 答出两点即可 ) ，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 (2) 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 _____________ __________________________________________ ；并且 _________________ 和 _________________________________________________ 的细胞也是不能区分的，其原因是 _______________________________________________________ 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 _________ 的固体培养基。 (3) 基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于 ___________ 。 能自我复制、　 具有标记基因 　 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　 含有质粒载体　 含有插入了目的基因的重组质粒 ( 或答含有重组质粒 ) 　 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　 四环素　 受体细胞 　 解析 　 质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段 ( 基因 ) 插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体 DNA 上，随染色体 DNA 进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择等等。 (2) 在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。 (3) 某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其 DNA 复制所需的原料来自于受体细胞。 5 ． (2019 · 福建三明市段考 ) 基因工程中最常用的运载体是质粒，作为运载体，需有标记基因，如抗青霉素基因、抗四环素基因等。现欲鉴别某种细菌质粒抗药性基因的类别，设计如下实验： 材料用具：青霉素、四环素的 10 万单位溶液，菌种试管，已经灭菌的含细菌培养基的培养皿，酒精灯，接种环，一次性注射器，蒸馏水，恒温箱。 方法步骤： 第一步：取 3 个含细菌培养基的培养皿并分别标上 1 、 2 、 3 号，在酒精灯旁，用 3 只注射器分别注入 1mL 蒸馏水、青霉素溶液、四环素溶液，并使之分布在整个培养基表面； 第二步：将接种环放在酒精灯的火焰 ______( 填 “ 上 ” 或 “ 旁 ” ) 灼烧，并在酒精灯的火焰 ______( 填 “ 上 ” 或 “ 旁 ” ) 取菌种，对 3 个培养皿分别接种； 第三步：将接种后的 3 个培养皿放入 37℃ 恒温箱中培养 24h 。 上　 旁　 请对结果进行预测： ①若 ________________ 号培养基中细菌存活，说明该细菌质粒上有两种抗性基因； ②若 1 号培养基中细菌存活， 2 、 3 号培养基中没有细菌存活，说明 ___________________________________ ； ③ _________________________________________________________________ ___________________________________________________ ； ④ _________________________________________________________________ ___________________________________________________ 。 1 、 2 、 3 　 该细菌质粒上两种抗性基因都没有　 1 、 2 号培养基中细菌存活， 3 号培养基中没有细菌存活，说明该细菌质粒上有青霉素抗性基因　 1 、 3 号培养基中细菌存活， 2 号培养基中没有细菌存活，说明该细菌质粒上有四环素抗性基因 解析 　 根据题意可知，本实验的目的是鉴别某种细菌质粒抗药性基因的类别，即检测转基因细菌在何种培养基中能正常生长、繁殖；根据已有的步骤安排，按照无菌操作的要求，第二步中应将接种环放在酒精灯的火焰上灼烧，并在酒精灯的火焰旁 ( 无菌区 ) 取菌种，对 3 个培养皿分别接种。若基因工程中构建完成的目的细菌中含有某种抗生素抗性基因 ( 标记基因 ) ，该基因正常表达，则会赋予该工程菌抵抗此抗生素的能力，这样该工程菌就可以在含有该种抗生素的培养基中正常生长、繁殖，否则工程菌不能在含有该抗生素的培养基生存；因此①若该工程菌质粒上有两种抗性基因，则细菌可在 1 、 2 、 3 号培养基中细菌存活；②若该工程菌质粒上两种抗性基因都没有，则细菌可在 1 号培养基中细菌存活，而 2 、 3 号培养基中没有细菌存活；③若该工程菌质粒上仅含有青霉素抗性基因，则细菌能在 1 、 2 号培养基中细菌存活，而在 3 号培养基中没有细菌存活；④若该工程菌质粒上仅含有四环素抗性基因，则细菌可在 1 、 3 号培养基中细菌存活，而 2 号培养基中没有细菌存活。 1 ． 基本操作程序 考点二　基因工程的操作过程与应用 基因文库　 mRNA 反转录　 DNA 合成仪　 RNA 聚合酶　 转录　 转录　 目的基因　 农杆菌转化法　 显微注射　 感受态细胞　 分子杂交技术　 抗原－抗体杂交　 2 ． 基因工程的应用 (1) 动物基因工程：用于提高动物 ____________ 从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产 ________ ；用转基因动物作器官移植的 ________ 等。 (2) 植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和 ________ 转基因植物；利用转基因改良植物的 ________ 。 (3) 比较基因治疗与基因诊断 生长速度　 原理 操作过程 进展 基因治疗 ____________ 利用 ____________ 导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗 ( 疾病 ) 临床实验 基因诊断 ____________ 制作特定 ____________ 与病人样品 DNA 混合，分析杂交带情况 临床应用 药物　 供体　 抗逆　 品质　 基因表达　 正常基因　 碱基互补配对　 DNA 探针　 [ 归纳整合 ] 1 ． 几种获取目的基因方法的比较 方法 从基因文库中获取 人工合成 从基因组文库中获取 从部分基因文库，如 cDNA 文库中获取 化学合成法 逆转录法 过程 供体细胞中的 DNA ↓ 限制酶 许多 DNA 片段 ↓插入 载体 ↓导入 受体菌群 ( 基因组文库 ) ↓ 分离 目的基因 目的基因的 mRNA ↓ 逆转录 单链 DNA ↓ 合成 双链 DNA ↓ 插入 载体 ↓导入 受体菌群 (cDNA 文库 ) ↓ 分离 目的基因 蛋白质的氨基 酸序列 ↓推测 mRNA 的核苷 酸序列 ↓推测 结构基因的核 苷酸序列 ↓化学合成 目的基因 目的基因 的 mRNA ↓ 逆转录 单链 DNA ↓ 合成 双链 DNA 即目的 基因 2 ． 基因工程操作程序中的 “ 三、三、二、一 ” (1) 目的基因 “ 三种获取方法 ” ： ①从基因文库中获取 ( 基因组文库、 cDNA 文库 ) ； ②利用 PCR 技术扩增：其实质是在体外对目的基因进行大量复制。用 PCR 仪控制温度：变性 (90 ～ 95 ℃)→ 复性 (55 ～ 60 ℃)→ 延伸 (70 ～ 75 ℃) ； ③通过 DNA 合成仪用化学方法人工合成 ( 用于核苷酸序列已知，且核苷酸数目较少的基因 ) 、利用 mRNA 反转录法合成。 (2) 将目的基因导入受体细胞的 “ 三种类型 ” ： ①导入植物细胞 —— 农杆菌转化法 ( 花粉管通道法、基因枪法 ) ； ②导入动物细胞 —— 显微注射法 ( 导入受精卵 ) ； ③导入微生物细胞 —— 转化法。 (3) 目的基因检测与鉴定的 “ 两个水平 ” ： (4) 基因工程操作的 “ 一个核心 ” —— 基因表达载体的构建。 [ 思维探究 ] 据图分析抗虫棉的培育过程 (1) 该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？ 提示： 目的基因是 Bt 毒蛋白基因，载体是 Ti 质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。 (2) 该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的 DNA 上？ 提示： 采用的方法是农杆菌转化法，由于 Ti 质粒上的 T － DNA 可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体 DNA 上，而目的基因又插入到了 T － DNA 上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体 DNA 上。 (3) 该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？ 提示： 抗原 — 抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。 [ 教材深挖 ] 教材选修 3P 8 “ 求异思维 ” ：你能推测出 mRNA 反转录形成 cRNA 的过程大致分为哪些步骤吗？ 提示： 第 1 步： mRNA 在反转录酶的作用下形成 RNA － DNA 杂交分子，第 2 步：在核酸酶的作用下将 RNA － DNA 杂交分子中的 RNA 水解掉，形成 RNA 单链，第 3 步：以 RNA 单链为模板，在 DNA 聚合酶的作用下形成双链的 DNA 。 命题点一　基因工程操作程序的分析 1 ． (2019 · 安徽合肥一中期末考试 ) 下列关于 cDNA 文库和基因组文库的说法，不正确的是 ( 　　 ) A ． cDNA 文库中的 DNA 来源于 mRNA 的逆转录过程 B ．如果某种生物的 cDNA 文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同 C ． cDNA 文库中的基因都没有启动子 D ．一种生物的 cDNA 文库可以有许多种，但基因组文库只有一种 B 解析 　 cDNA 是指以 mRNA 为模板，由逆转录酶催化形成的互补 DNA ， cDNA 文库中的基因来自 mRNA 的逆转录过程， A 正确； mRNA 是由基因中的外显子部分转录后拼接形成的，因此 cDNA 文库中的基因不包含启动子和内含子等结构，与该生物的基因组文库中对应的基因结构不同， B 错误； cDNA 文库中的基因都没有启动子， C 正确；由于 cDNA 文库中只含有某种生物的部分基因，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此一种生物的 cDNA 文库可能有多种，而基因组文库只有一种， D 正确。 2 ． (2017 · 全国卷 Ⅰ ， T38 ，节选 ) 真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA 序列的机制。已知在人体中基因 A( 有内含子 ) 可以表达出某种特定蛋白 ( 简称蛋白 A) 。回答下列问题： (1) 某同学从人的基因组文库中获得了基因 A ，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白 A ，其原因是 _______________________________________________________ _______________________________________________ 。 基因 A 有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的 RNA 序列不能被切除，无法表达出蛋白 A (2) 若用家蚕作为表达基因 A 的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 _________ 作为载体，其原因是 _____________________________________ 。 (3) 若要高效地获得蛋白 A ，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有 ____________________( 答出两点即可 ) 等优点。 (4) 若要检测基因 A 是否翻译出蛋白 A ，可用的检测物质是 _______________( 填 “ 蛋白 A 的基因 ” 或 “ 蛋白 A 的抗体 ” ) 。 (5) 艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA 是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是 ________________________________________________ 。 噬菌体　 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕　 繁殖快、容易培养　 蛋白 A 的抗体　 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体　 解析 　 人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因 A 有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的 RNA 序列的机制，故无法表达出蛋白 A 。 (2) 噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。 (3) 与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白 A ，可选用大肠杆菌作为受体。 (4) 检测基因 A 是否翻译出蛋白 A ，可用抗原－抗体杂交法。 (5) 艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中， S 型细菌的 DNA 可以使 R 型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了 R 型细菌的 DNA 分子中并成功得以表达。也就是说 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。 3 ． (2019 · 福建三明市段考 ) 绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒 (TMV) 基因，可以合成一种抗 TMV 蛋白，叶片对 TMV 具有抗感染性。烟草是重要的经济作物，由于 TMV 的感染会导致大幅度减产。科技人员利用基因工程技术培育出了抗 TMV 的烟草，主要流程如图所示。 (1) 科技人员从绞股蓝细胞中提取抗 TMV 基因转录的 mRNA 时，提取液中需添加 _____________________ ，防止 RNA 的降解。 (2) 在构建重组 Ti 质粒时，除添加目的基因外，为了使目的基因能表达，还应该添加 ___________ 和 ___________ 。 (3) 过程⑤需应用 _____________ 技术，其原理是 __________________ 。此过程中培养基中加入卡那霉素的目的 __________________________________________ 。 (4) 过程⑥可采取 ________________ 的方法，检测植株是否合成了抗 TMV 蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过 __________________ 的方法来确定植株是否具有抗性。 RNA 酶抑制剂　 启动子　 终止子　 植物组织培养　 植物细胞的全能性　 筛选含有目的基因的再生植株 ( 或“受体细胞” ) 　 抗原 — 抗体杂交　 接种烟草花叶病毒　 解析 　 科技人员从绞股蓝细胞中提取抗 TMV 基因转录的 mRNA 时，提取液中需添加 RNA 酶抑制剂，防止 RNA 的降解。 (2) 在植物基因工程中，构建重组 Ti 质粒时，通常要用 ( 同种 ) 限制酶分别切割含目的基因的 DNA 分子和 Ti 质粒，使它们产生相同的黏性末端，然后再用 DNA 连接酶进行连接。为了使目的基因能表达，重组质粒在组成上还应添加启动子、终止子。 (3)⑤ 是把受体细胞培养成再生植株的过程，此过程要用到植物组织培养技术，其原理是植物细胞的全能性。此过程中培养基中加入卡那霉素的目的是筛选含有目的基因的再生植株 ( 或 “ 受体细胞 ” ) 。 (4) 检测植株是否合成了抗 TMV 蛋白，过程⑥可采取抗原 — 抗体杂交的方法，在个体水平的鉴定过程中，可通过接种烟草花叶病毒的方法来确定植株是否具有抗性，接种烟草花叶病毒后，如果烟草植株不被感染，说明其具有抗性。 命题点二　基因工程的应用 4 ． (2018 · 全国卷 Ⅰ ， T38) 回答下列问题： (1) 博耶 (H.Boyer) 和科恩 (S.Cohen) 将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了 ____________________________________________________________________( 答出两点即可 ) 。 体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达　 (2) 体外重组的质粒可通过 Ca 2 ＋ 参与的 _________ 方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体 DNA 通常需与 ______________________________ 组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体 DNA 导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是 _________ 。 (3) 真核生物基因 ( 目的基因 ) 在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用 __________________ 的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加 ____________ 的抑制剂。 转化　 外壳蛋白 ( 或答噬菌体蛋白 ) 　 细菌　 蛋白酶缺陷型　 蛋白酶　 解析 　 将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。 (2) 重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用 Ca 2 ＋ 参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体 DNA 和外壳蛋白 ( 或噬菌体蛋白 ) 进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。 (3) 为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。 5 ． (2019 · 福建福州市检测 ) 为了有效控制水稻害虫的危害，中国农业科学院和华中农业大学合作，成功地获得了转 Bt 基因的二倍体水稻。该基因来源于苏云金芽孢杆菌，基因的表达产物 Bt 毒蛋白具有良好的杀虫效果。请回答： (1) 若知道 Bt 毒蛋白的氨基酸序列，则可以推测出 Bt 基因的核苷酸序列，但推测出的核苷酸序列并不是唯一的，其原因是 ______________________ 。在已知 Bt 基因的核苷酸序列之后，再通过 ____________ 方法获取目的基因。 密码子具有简并性　 人工合成　 (2) 获得 Bt 基因后，在体外可以通过 ________ 技术进行扩增，该技术需要的条件是 _________ 、酶、 dNTP 、模板，其中的酶是 ___________________________ ，然后构建基因表达载体。基因表达载体中除了具目的基因、启动子和终止子之外，还需具有 ______________________ 。 (3) 将 Bt 基因导入水稻细胞中时不宜采用农杆菌转化法，最可能的原因是 ______________________________________________________________ 。 (4) 可采用抗虫接种实验的方法，在 __________ 水平上鉴定 Bt 基因在受体植株内是否成功表达。 PCR 　 引物　 Taq 酶 ( 或热稳定 DNA 聚合酶 ) 　 标记基因和复制原点　 水稻是单子叶植物，而农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力　 个体　 解析 　 由于密码子具有简并性，导致在依据 Bt 毒蛋白的氨基酸序列推测出 Bt 基因的核苷酸序列时，推测出的核苷酸序列并不是唯一的。在已知 Bt 基因的核苷酸序列的前提下，可通过人工合成的方法获取目的基因。 (2) 在体外可通过 PCR 技术扩增 Bt 基因，该技术需要的条件是引物、 Taq 酶 ( 或热稳定 DNA 聚合酶 ) 、 dNTP 、模板。基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等。 (3) 由于水稻是单子叶植物，而农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力，所以将 Bt 基因导入水稻细胞中时不宜采用农杆菌转化法。 (4) 采用抗虫接种实验的方法来鉴定 Bt 基因在受体植株内是否成功表达，这属于在个体水平上进行的鉴定。 1 ． 概念理解 考点三　蛋白质工程 基因修饰　 改造了　 新的蛋白质　 蛋白质结构　 蛋白质的结构　 氨基酸序列　 现有蛋白质　 [ 归纳整合 ] 蛋白质工程与基因工程的关系 项目 区别 与联系　　 蛋白质工程 基因工程 区 别 过程 预期蛋白质功能 → 设计预期的蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因 → 构建基因表达载体 → 将目的基因导入受体细胞 → 目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品 结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 联系 ① 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 ② 基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造 [ 思维探究 ] 现代生物技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的。下图表示利用乳腺生物反应器生产某种动物蛋白的流程示意图，请分析回答下列问题： (1) 该生产流程中应用到的现代生物技术有哪些？ ( 写出其中两种 ) 。 提示： 蛋白质工程、基因工程、胚胎移植技术 ( 任写两种 ) 。 (2) 图中 A 、 B 分别表示什么含义？ 提示： A ：推测应有的氨基酸序列， B ：基因表达载体。 (3) 蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是什么？ 提示： 改造后的基因能够遗传，且改造基因易于操作。 [ 教材深挖 ] 教材选修 3P 27 “ 异想天开 ” ：为什么到目前为止还没有生产出人类需要的蛋白质的结构？ 提示： 因为蛋白质的高级结构非常复杂，人们对蛋白质的高级结构及其在生物体内如何行使功能知之甚少。 命题点一　蛋白质工程的分析 1 ． (2019 · 湖北孝感市一模 ) T 4 溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码 T 4 溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的 T 4 溶菌酶第三位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第 97 位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了 T 4 溶菌酶的耐热性。回答下列问题： (1) 上述操作涉及的技术属于 _____________ 工程，该技术的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→ ________________________→________________________→ 找到相应的脱氧核苷酸序列。 蛋白质　 设计预期的蛋白质结构　 推测应有的氨基酸序列　 (2) 在确定目的基因的碱基序列后，可通过 __________________ 的方法获取目的基因，再利用 ____________ 技术进行扩增。 (3) 在将目的基因导入受体细胞前，要构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有 ____________ 、 ____________ 以及标记基因等。标记基因的作用是 _______________________________________________________ ____________________ 。 人工合成　 PCR 　 启动子　 终止子　 为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 　 解析 　 上述过程是对基因进行改造，结果得到耐热性提高的蛋白质，因此属于蛋白质工程的范畴。技术的基本途径：从预期的蛋白质功能出发 → 设计预期的蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到相应的脱氧核苷酸序列。 (2) 在确定目的基因的碱基序列后，可通过人工合成的方法获取目的基因，再利用 PCR 技术进行扩增。 (3) 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 2 ． (2019 · 河南郑州调研 ) 科学家运用基因工程技术将结核杆菌 MPT64 基因 ( 能控制合成 MPT64 蛋白 ) 成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。请回答下列问题： (1) 基因工程的核心是 ________________________ ，所用到的工具酶有 _______________________________________________ 。 (2) 通常采用 PCR 技术扩增 MPT64 基因，前提是要 ______________________ __________________ ，以便根据这一序列合成引物，在操作步骤中冷却至 55 － 60℃ 的目的是 ____________________________________________ 。 基因表达载体的构建　 限制性核酸内切酶 ( 限制酶 ) 、 DNA 连接酶　 有一段已知 MPT64 基因的　 核苷酸序列　 引物结合到模板 DNA 链 ( 或引物与模板链结合 ) 　 (3) 根据农杆菌的特点，如果将 MPT64 基因插入到 _____________________ ，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的 ________________ 上。要确认 MPT64 基因是否插入胡萝卜植株中，可用 ____________________ 技术。 (4) 蛋白质工程技术是通过 __________________________ ，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。 Ti 质粒的 T － DNA 　 染色体 DNA 　 DNA 分子杂交　 基因修饰或基因合成　 解析 　 基因工程的核心是基因表达载体的构建，所用到的工具酶有限制性核酸内切酶 ( 限制酶 ) 和 DNA 连接酶。 (2) 通常采用 PCR 技术扩增 MPT64 基因 ( 目的基因 ) ，前提是要有一段已知 MPT64 基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物；在操作步骤中冷却至 55 － 60℃ 的目的是使引物结合到模板 DNA 链 ( 或引物与模板链结合 ) 。 (3) 农杆菌的 Ti 质粒的 T — DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。根据农杆菌的这一特点，如果将 MPT64 基因插入到 Ti 质粒的 T － DNA 中，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的染色体 DNA 上。要确认 MPT64 基因是否插入胡萝卜植株中，可用 DNA 分子杂交技术。 (4) 蛋白质工程技术是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。 命题点二　蛋白质工程与基因工程的综合应用 3 ． (2015 · 全国卷 Ⅱ ， T40) 已知生物体内有一种蛋白质 (P) ，该蛋白质是一种转运蛋白，由 305 个氨基酸组成。如果将 P 分子中 158 位的丝氨酸变成亮氨酸， 240 位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质 (P 1 ) 不但保留 P 的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题： (1) 从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的 ____________________ 进行改造。 (2) 以 P 基因序列为基础，获得 P 1 基因的途径有修饰 __________ 基因或合成 _______ 基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括 _____________ 的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即： ______________________________________________________________ 。 (3) 蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过 _________________ 和 ________________ ，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，在经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物 ________ 进行鉴定。 氨基酸序列 ( 或结构 ) 　 P 　 P 1 　 DNA 和 RNA 　 DNA→RNA 、 RNA→DNA 、 RNA→ 蛋白质 ( 或转录、逆转录、翻译 ) 　 设计蛋白质结构　 推测氨基酸序列　 功能　 解析 　 由题干信息可知改造蛋白质的功能，可通过改变蛋白质的结构实现。 (2) 依据蛋白质工程的定义及题中信息可知获得 P 1 基因的途径有修饰现有 (P) 基因或合成新 (P 1 ) 基因。中心法则的全部内容包括： DNA 的复制、 RNA 的复制、转录、逆转录和翻译。 (3) 蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发 → 设计预期的蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到相应的脱氧核苷酸序列。通过蛋白质工程合成的蛋白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。 4 ． (2019 · 河南新乡一模 ) 干扰素是用于治疗病毒感染和癌症的免疫活性蛋白质，若人的干扰素基因在大肠杆菌内表达，产生的抗病毒性较低且保存困难，若将第 17 位的半胱氨酸改造为丝氨酸，则生产出的干扰素的抗病毒性是原来的 100 倍，且可在－ 70 ℃ 条件下保存半年，下图是构建干扰素工程菌的过程示意图。回答下列问题。 (1) 要改变干扰素的功能，可以考虑对干扰素的 _____________ 进行改造。对干扰素进行改造，也可直接对干扰素基因进行改造，其原因是 ____________________ ___________________________________________________________ 。 (2)③ 过程将 B 导入大肠杆菌，需用 ________ 对大肠杆菌进行处理，使其处于能 _______________________________ 的生理状态。 (3) 要检测 B 是否导入大肠杆菌，将③过程后的大肠杆菌先接种于含 ________________ 的培养基上，然后将在该培养基上生长的大肠杆菌接种在含 ____________ 的培养基上，在前者培养基上能生长而在后者培养基上不能生长的是导入 B 的工程菌。 (4) 利用图中工程菌不能生产有活性的干扰素，这是因为 ____________________ _________________________________________________ 。 氨基酸序列　 蛋白质的结构由基因决定，基因可以直接遗传；对基因进行改造比对蛋白质改造容易　 Ca 2 ＋ 　 吸收周围环境中的 DNA 　 氨苄青霉素　 四环素　 大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体，不具备加工干扰素的能力　 解析 　 根据题干信息，若将第 17 位的半胱氨酸改造为丝氨酸，则生产出的干扰素的抗病毒性是原来的 100 倍，且在－ 70 ℃ 条件下保存半年，因此可以对干扰素的氨基酸序列进行改造。对干扰素进行改造，也可直接对干扰素基因进行改造，原因是：蛋白质的结构由基因决定，基因可以直接遗传；对基因进行改造比对蛋白质改造容易。 (2) 将重组质粒导入大肠杆菌，需用 Ca 2 ＋ 处理，使大肠杆菌能吸收周围环境中的 DNA ，成为感受态细胞。 (3) 将③过程后的大肠杆菌进行筛选时，先用含氨苄青霉素的培养基进行培养，淘汰没有导入任何质粒的大肠杆菌，能生长的则是含有普通质粒和重组质粒 ( 二者都含抗氨苄青霉素基因 ) 的大肠杆菌；然后将该培养基上生长的菌落用 “ 盖章 ” 的方法接种到含四环素的培养基上，在含四环素的培养基上能生长的是含普通质粒的大肠杆菌，将两个培养基进行位置对照，在含氨苄青霉素的培养基上能生长，而在含四环素的培养基上该位置没有菌落出现，则属于导入重组质粒的工程菌。 (4) 干扰素是分泌蛋白，在核糖体中合成后需要经过内质网和高尔基体加工才具有生物活性，而大肠杆菌是原核生物，无内质网和高尔基体，不具备加工干扰素的能力，所以利用图中工程菌不能生产有活性的干扰素。 1 ．切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别 6 个核苷酸序列 ( 　　 ) 2 ． DNA 连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 ( 　　 ) 3 ． E · coli DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端 ( 　　 ) 4 ．限制酶也可以识别和切割 RNA ( 　　 ) 5 ．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 ( 　　 ) 6 ．每个质粒 DNA 分子上至少含一个限制酶识别位点 ( 　　 ) 课堂小结 · 内化体系 ……………………………………………………………………………………………………………… ◎ × 　 × 　 × 　 × 　 × 　 √　 7 ．载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达 ( 　　 ) 8 ．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列 ( 　　 ) 9 ．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达 ( 　　 ) 10 ．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 ( 　　 ) 11 ．由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用 ( 　　 ) 12 ．蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质 ( 　　 ) √ 　 × 　 √　 √　 × 　 √　 1 ．限制酶是一类酶，而不是一种酶。 2 ．将一个基因从 DNA 分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。 3 ．不同 DNA 分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个 DNA 分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。 4 ．限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。 5 ．目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间。 ……………………………………………………………………………………………………………… ◎ 6 ．与启动子、终止子有关的三个易错点 启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子 (1) 启动子：一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端。它是 RNA 聚合酶识别、结合的部位。 (2) 终止子：一段有特殊结构的 DNA 短片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。 (3) 起始密码子和终止密码子位于 mRNA 上，分别控制翻译过程的启动和终止。 7 ．受体细胞选择时需注意：要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素必须用真核生物酵母菌 ( 需内质网、高尔基体的加工、分泌 ) ；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。