发酵工程复习资料 21页

--发酵工程复习资料第一章绪论1、发酵及发酵产品各包括哪些类型？答案要点：一）发酵的类型：按发酵原料分类：糖类物质发酵、石油发酵、废水发酵；按发酵形式分类：固体发酵、液体发酵；按发酵工艺流程分类：分批发酵、连续发酵、流加发酵；按发酵过程对氧的需求分类：厌氧发酵、通风发酵；按发酵产物分类：氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵、酶制剂发酵二）发酵产品的类型：以菌体为产品、以微生物的酶为产品、以微生物的代谢产物为产品、生物转化过程2、了解发酵工程的组成、基本要求及主要特点。答案要点：一）组成：上游工程：菌种选育、种子培养、培养基设计与制作、接种等。　　　发酵工程：发酵培养。　　　下游工程：产物的提取纯化、副产品的回收、废物处理等。二）基本要求：发酵设备、合适的菌种、合适的培养基、有严格的无菌生长环境三）主要特点：1）发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件简单；2）发酵所用的原料主要以再生资源为主；3）发酵过程通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物；4）获得按常规方法难以生产的产品；5）投资少，见效快，经济效率高；6）维持无菌条件是发酵成败的关键；7）环境污染小。3、为什么说发酵工程在国民经济中有着重要的地位？答案要点：因为发酵工程在医药、食品、能源、化工、冶金、农业、环境保护等方面均有着十分重要的作用，例如：抗生素的生产；饮料食品等的制造；沼气、微生物采油、生物肥料、生物农药以及三废处理等方面都有很重要的应用。所以说发酵工程在国民经济中有着重要的地位。4、了解发酵工业的类型及必备条件。答案要点：一）发酵工业类型：食品发酵工业：食品、酒类1）传统分类非食品发酵工业：抗生素、有机酸、氨基酸、酶制剂、核苷酸、单细胞蛋白酿造业：利用微生物生产具有较高风味要求的发酵食品。-可修编辑-\n--2）现代分类发酵工业：经过微生物纯种培养后，提炼、精制而获得成分单纯、无风味要求的产品。如：抗生素、柠檬酸、酶制剂、酒精等。二）发酵工业必备条件：1）适宜的微生物菌种；2）满足微生物生长的条件：培养基、生长温度、pH值、溶解氧的浓度等。3）微生物发酵厂房、设备；4）产品提取、精制的方法与设备。5、定义：1）发酵：利用培养生物细胞来获得产物的全过程。2）发酵工程：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程中的一种新技术。3）发酵工业：利用生物生命活动中产生的酶来加工原料中的有机或无机物而获得新产品的工业。4）生物转化：生物催化剂（生物细胞或其产生的酶）将一种化合物转化成化学结构相似，但在经济上更有价值的化合物的过程。第二章发酵原料及处理1、名词解释糊化：在温水中，淀粉颗粒无限膨胀形成均一的黏稠液体的现象。液化：淀粉糊化后，如果提高温度至130℃，由于支链淀粉的全部（几乎）溶解，网状结构彻底破坏，淀粉溶液的黏度迅速下降，变为流动的性较好的醪液的现象。糖化：用糖化酶讲糊精和低聚糖彻底水解成葡萄糖的过程。老化（回生）：液化了的淀粉醪液在温度降低时，黏度会逐步增加，降到60℃时，变得非常黏，到55℃以下会变成凝胶，时间一长，则会重新产生部分结晶的现象。对数残留定律：在微生物灭菌过程中，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比：—dN/dt=kN此即为对数残留定律。DE值：葡萄糖值，液化液或糖化液中的还原糖含量（葡萄糖）占干物质的百分率为DE值。实消：分批灭菌即实消，是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，将发酵罐和培养基同时灭菌，再冷却到接种温度备用。连消：连续灭菌也叫连消，就是将培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。双酶糖化法：即酶解法，用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的方法。2、工业发酵原料有哪些？淀粉质原料处理的方法有哪些？为什么要预处理？-可修编辑-\n--答案要点：一）发酵工业原料类型：1）淀粉质原料（粮食原料）2）糖质原料3）纤维质原料4）石油化工产品5）其他：野生植物类二）淀粉质原料的处理方法：预处理（除杂、粉碎）→淀粉糊化（水热处理、焙炒法、膨化法、低温蒸煮法）→淀粉糖化（酸解法、酶解法、酸酶结合法）三）预处理的目的：除杂的目的：除去原料中的金属、石块、沙子、泥土、杂草等。粉碎的目的：改变原料的状态，增加物料表面积，有利于原料细胞中的淀粉颗粒从细胞中游离出来。3、淀粉水解糖的制备方法有哪些？各有何特点？答案要点：　一）酸解法及其特点：酸解法：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。特点：对设备的要求：耐腐蚀、耐高温、耐高压。对淀粉原料要求较严格：淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。淀粉的转化率较低。淀粉乳浓度高，淀粉转化率低，　二）酶解法及其特点：酶解法（双酶糖化法）：用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的方法。特点：酶解反应时间较长（48h）；需要设备较多；糖液过滤困难。随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶制剂的大量生产，酶法制糖逐渐取代酸法制糖已是淀粉水解制糖的一个发展趋势。　三）酸酶结合法及其特点：1）酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶将其水解成葡萄糖的方法。特点：适用原料：淀粉粒坚硬的谷物原料。优点：能结合酸解法、酶解法的优点，提高生产效率。注意事项：酸的用量。2）酶酸法：将淀粉乳先用α-淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖的方法。特点：适用原料：颗粒大小不一的原料。优点：生产易控制，时间短。注意事项：淀粉浓度较酸解法要高；酸水解时稍增加pH值。4、培养基有哪几种类型？各有何作用？选择发酵工业培养基有何要求？答案要点：　一）培养基的类型及作用：　　　斜面培养基：菌种活化、保藏菌种。　　种子培养基：扩大培养，增加强壮、健康、活性高的细胞数量。　　　发酵培养基：最大限度的获得目的产物。二）发酵工业培养基的基本要求-可修编辑-\n--1）能够提高微生物生长繁殖及产物合成的基本成分。2）选择合适的培养基原料，且培养基成分配比合理。3）原料来源广、质量稳定、价格低廉5、简述发酵工业培养基的设计程序及方法。答案要点：设计程序，分为三步：1）初步确定可能的培养基成分：查找资料，根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定；2）单因子实验：单因子实验确定培养基的成分；单因子实验确定各成分的适宜浓度；3）相应面实验：采用正交试验设计对单因子实验结果进行综合试验，确定发酵培养基配方。摇瓶水平反应器水平6、影响培养基灭菌的因素有哪些？发酵培养基灭菌方法有哪些？各有何特点？答案要点：　一）影响培养基灭菌的因素：　　　1）培养基成分：油脂、糖类、蛋白质增加微生物的耐热性。2）pH值：pH值6.0～8.0，微生物最耐热；pH值愈低，灭菌所需的时间愈短。　　　3）培养基中的颗粒：颗粒小，灭菌容易；颗粒大，灭菌难。　　　4）泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，阻碍热传导，影响灭菌效果。二）发酵培养基灭菌方法及特点1）分批灭菌：无需专门的灭菌设备；能连同发酵设备一道灭菌，灭菌温度难控制；适合中小型发酵罐使用。2）连续灭菌：需专门灭菌设施发酵罐、灭菌设施应先做灭菌先处理；灭菌温度高；灭菌时间短。7、为什么采用高温短时灭菌既有利于杀灭微生物，又有利于减少营养物质破坏？答案要点：因为：1）微生物的热死规律及培养基中营养成分破坏符合化学反应的一级反应动力学，即：dN∕dt=-KNdC∕dt=-KC　2）另外反应常熟与温度的关系为：K’=A’e-E/RT3）灭菌的活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E，因此，随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数＞培养基中营养成分分解的速率常数的增加倍数。　4）温度每升高10℃，速率常数的增加倍数为（Q10）不同。　　　一般化学反应Q10为1.5～2.0；　　　杀灭芽胞的反应Q10为5～10；　　　杀灭微生物细胞的反应Q10为35左右。5）在热灭菌的过程中，微生物死亡的速度＞营养成分破坏速度。“高温瞬时灭菌法”可减少培养基营养成分的破坏。所以采用高温短时灭菌既有利于杀灭微生物，又有利于减少营养物质破坏。第三章水和空气的处理-可修编辑-\n--1、名词解释1）水的硬度：即水的软硬程度，系指单位体积的水中所含钙、镁盐的数量。总硬度是指碳酸盐和非碳酸盐硬度的总和，其中，“暂时硬度”主要指碳酸盐硬度，即用加热方法可以除去的重碳酸盐硬度。“永久硬度”主要指硫酸盐硬度，即用加热方法也不易除去的硬度。2）水的软化：除去水中钙、镁等金属离子的过程3）固体曲：是一种传统的粗酶制剂，微生物与粗发酵营养成分初步发酵得到的干粉末制品，可用作种子用于下游发酵生产。如酒曲等。4）无菌空气：是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。5）惯性撞击：指尘粒随着空气流过纤维层的弯曲通道时，由于颗粒的惯性较大，脱离弯曲流线与纤维碰撞而附着的过程。6）过滤介质：过滤介质是过滤除菌的关键，直接关系到介质的消耗量、过滤过程动力消耗、设备的结构、尺寸，更是关系到运转过程的稳定性。对过滤介质的总的要吸附性强、阻力小、空气流量大、能耐干热。一般过滤介质分为纤维状或颗粒状过滤介质、过滤纸、微孔过滤膜三大类。7）空气穿透率：过滤后空气的微粒数与过滤前空气的微粒数的比值。8）L90：为过滤除菌效率达到90%时的介质滤层厚度2、发酵用水的来源有几种，各有什么优缺点？答：1）深井水：水质清洁，含杂质少，温度稳定，不受气温和季节影响，水生生物少，没有或很少有微生物。没有致病菌，溶解类浓度高，硬度高。2）自来水：方便快捷，无需进行金属离子等的处理，不受季节影响，水质较清洁，但费用高，会使生产成本过高。3）地表水：来源广，水量充足，但水质差杂质多，温度不稳定，受气温、季节影响较大，水生生物多，微生物较多，可能存在致病细菌。3、发酵用水杀菌的方法有哪些（简答）？答：1）氯杀菌：氯在水中形成次氯酸，有强氧化作用，能穿透细菌胞膜进入胞，破坏胞酶和细胞生理机能而使细菌死亡。2）臭氧杀菌：利用臭氧的强氧化能力可以杀菌。臭氧杀菌穿透力强，暗处也能够杀菌，也没有出现耐菌性。3）紫外线杀菌：紫外线波长在240－260nm之间，为最有效的杀菌波段，波段中之波长最强点是253.7nm。4、空气中微生物的分布的特点（简答）？答：1）空气中的含菌量随环境不同而有很大差异：干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多；人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多；地面又比高空的空气含菌量多。2）各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异。5、介质过滤除菌机理包括哪几点（简答）？-可修编辑-\n--答：1）惯性冲击滞留作用机理；2）拦截滞留作用机理；3）布朗扩散截留作用机理4）重力沉降作用机理；5）静电吸附作用机理6、发酵空气的处理包括哪两个大步骤？答：1）包括：空气预处理；空气过滤空气预处理的目的:提高压缩前空气的洁净度；去除压缩后空气中的油和水空气处理的具体操作:空气----空压机---储气罐----冷却---除油水---加热---总过滤器---分过滤器---无菌空气7、一台发酵空气，滤膜厚度为1.5m，滤层中空气的微粒浓度为5000个/m3，单位滤层除去的微粒数为3000个/m3，求L90？答：对数穿透定律：空气通过滤层，其微粒数随着滤层的厚度逐渐降低，即：N－滤层中空气的微粒浓度，个/m3L–过滤介质的厚度，mdN/dL-----单位滤层除去的微粒数，个/m3K---过滤常数K=(dN/dL)/(-N)=-3000/5000L90=2.303/K=-3.84第四章工业发酵的染菌及其防治1、名词解释1）杂菌:是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。2）生物需氧量:（生化需氧量）是指由于水中的好氧微生物的繁殖或呼吸作用，水中有机物被分解时所消耗的溶解氧的量，简称BOD。3）溶解氧:空气中的分子态氧溶解在水中称为溶解氧，通常记作DO。-可修编辑-\n--4）法兰连接：就是把两个管道、管件或器材，先各自固定在一个法兰盘上，两个法兰盘之间，加上法兰垫，用螺栓连接在一起，完成了连接。5）死角：是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。2、染菌对产物的提取和质量有何影响？答：一、对过滤的影响：发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加大造成的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。二、对提取的影响：有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开。如酒精的有机萃取离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量。三、对产品质量的影响：对在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。3、发酵过程中染菌有哪几种方法，各有什么优缺点？答：一、目前生产上常用的杂菌检查方法有：①显微镜检查：染色----镜检②平板划线检查：倒平板----空培养----待测样品划线----培养观察③酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养----接入样品----培养观察二、优缺点：1）显微镜检优点：简便、快速，缺点：不易检出早期杂菌。2）平板划线法优点：结果也更为准确缺点：需经较长时间培养3）酚红肉汤培养优点：采用葡萄糖酚红肉汤，由于细菌生长，发酵葡萄糖产酸而使酚红指示剂由红色变成黄色，容易读取结果。缺点：1 注意细菌生长的时间与数量2细菌生长中的代谢物质（绿脓杆菌）4、截止阀和隔膜阀各有什么优缺点？答：A：截止阀优点：结构简单，制造维修方便；密封性好，密封面间摩擦力小，寿命较长；工作行程小，启用时间短。缺点：截止阀在使用中经常发生以下两个问题：阀心轧坏、填料的渗漏。-可修编辑-\n--方向问题：发酵罐在灭菌通蒸汽时，对关闭时的阀门，严密度要求较严格，因而在发酵罐临近的截止阀按规定装置的反方向安装。打料、接种、加油、加糖等管道上的截止阀，在发酵过程中还需要灭菌，阀门应按正向安装。B.隔膜阀优点：严密不漏；无填料；阀结构为流线型，流量大，阻力小，无死角，无堆积物，在关闭时不会使紧密面轧坏；检修方便。但须定期检查隔膜有否老化及脱落。缺点：制造不够精密；体积较大，在管道上占用较大的面积和空间；中心易引起渗漏。隔膜阀开关费力，需要借助扳手；橡胶隔膜是橡胶和帘布复合制成，如质量不好，帘布与橡胶易脱落，固定隔膜的螺栓也易脱落。5、种子带菌如何判断，一旦确定如何防止？答：1）判断方法：在每次接种后留取少量种子悬浮液进行平板肉汤培养，借以判断种子是否染菌。2）防止方法：一旦确定种子染菌：①就加强种子管理、严格无菌操作，就种子本身带菌的问题，加强种子管理，严格规处理种子。②无菌操作方面，确保培养基、培养器皿和用具、发酵罐及附属设备灭菌等灭菌彻底；③培养和保藏严格控制环境无菌染菌的培养物不得带入菌种室、摇瓶间；④操作规正确确保不受杂菌污染。6、当发酵罐偶尔染菌，一般采取什么措施？答：(1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4-10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80°C，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。(2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量每立方米罐的体积0.12~0.17升。(3)对染菌的种子罐可在罐放水后进行灭菌，灭菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。7、噬菌体感染后应采取什么方式防止污染？答：1）必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。2）车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面3）种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间4）认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放。5）选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。6）发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70-80°C杀死噬菌体，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。第五章菌种与种子扩大培养1、名词解释1）营养缺陷型：是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。-可修编辑-\n--2）MM：基本培养基，能满足野生型菌株正常生长的培养基。3）SM：补充培养基，在基本培养基中加入相应的营养成分的培养基。4）CM：完全培养基，能满足各种营养缺陷型生长的培养基。5）种子扩大培养：将原始休眠菌种接入试管斜面活化后，经摇瓶、种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。2、怎样从自然界中分离筛选工业菌种？在菌种分离过程中为什么要进行富集培养？分别叙述不同材料富集培养的方法。答案要点：一）自然界中筛选工业菌种的步骤：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。筛选:包括初筛与复筛。菌种鉴定发酵性能测定二）富集培养的理由：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势，有利于分离。三）不同材料的富集方法：1）土中细菌的富集培养与分离：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。2）植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养，取样，洗涤，取1ml洗涤液经适度稀释后平板涂布。3）水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。3、以紫外线诱变为例，叙述诱变育种的程序及注意事项。答案要点：一）紫外线诱变育种程序：出发菌株的选择→菌种培养（对数期）及菌悬液的制备→紫外线诱变处理（距离30cm、照射0.5-1min）→中间培养（诱变菌液置于适宜液体培养基中，震动暗培养12h ）→平板稀释分离→初筛→复筛。　二）注意事项：1）选择自然界新分离的野生型菌株或在生产中经生产选种得到与野生型较相似的菌株；选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞。2）处理菌悬液要求为活力类似单细胞或单孢子。3）紫外线处理菌液不能过厚。4）中间培养严谨见可见光。5）操作全程严格无菌操作。4、工业菌种常用的保藏方法有哪些？分别简述各类保藏的主要技术。答案要点：-可修编辑-\n--1）普通冷冻保藏：将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞，分接到试管或指管，将管口用橡胶塞严格封好，置于冰箱中(-20℃)保存。2）超低温冷冻保藏(-60~-80℃)：离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；用可用含10％甘油或5%二甲亚砜的新鲜液体培养基悬浮所收获的细胞，或可用含10％甘油或5%二甲亚砜的新鲜液体洗下斜面菌种上的微生物细胞，然后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。3）液氮冷冻保藏：用含10％甘油或5%二甲亚砜的新鲜液体洗下斜面菌种上的微生物细胞，或在液体培养物中加入等体积20%无菌甘油或10%二甲亚砜；然后按0.5-lml分装玻璃安瓿，用酒精喷灯封口；先将安瓿置于5℃冰箱中3min后，置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。4）冷冻真空干燥法：①将待保藏菌种的细胞或孢子悬液悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；②在低温（-45℃左右）下使微生物细胞快速冷冻；③在真空条件下使冰升华，以除去大部分的水。5、为什么要进行种子扩大培养？简述种子扩大培养的工艺过程及各阶段的主要目的。答案要点：一）种子扩培的目的：种子扩大培养是将原始休眠菌种接入试管斜面活化后，经摇瓶、种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。因此是满足接种量的需要；驯化菌种，达到缩短发酵时间，保证生产水平的要求。二）工艺过程及目的：　　　1）实验室种子的制备：菌种充分活化；菌体数量增加。　　　2）生产车间种子制备：获得大量的菌体，达到发酵罐所需的接种量；进行菌种驯化，接入发酵罐后能迅速生长6、发酵工程对种子质量有何要求？种子扩大培养过程中我们应注意哪些因素的影响？答案要点：一）种子的质量要求：菌种细胞的生长活力强；　　　　　　　　　　　　生理性状稳定；　　　　　　　　　　　　菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；　　　　　　　　　　　　无杂菌污染；　　　　　　　　　　　　保持稳定的生产能力。二）扩大培养中应很注意的因素：7、何谓种龄、接种量？种龄长短、接种量大小分别对发酵工程有何影响？答：1）种龄：是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。①种龄过短，菌体太少。种龄过长，菌体老化。②是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。③不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。2）接种量：是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。①较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。②接种量过大或者过小，均会影响发酵。-可修编辑-\n--③不同菌株，不同的制种方法，孢子数或菌体量不同，种子的活性也不相同，接种量需要进行优化。④通常接种量为：细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%。第六章发酵工艺条件的控制1、名词解释1）分批发酵：是指在一个密闭系统投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖。特定条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。2）连续发酵：指以一定的速度向培养系统添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液使培养系统培养液的量维持恒定的微生物培养方式。3）补料发酵：FBC又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式。4）生物热：在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。5）CRR：CO2释放率，即CO2的比释放率与菌体浓度的乘积。6）氧饱和度：发酵液中氧的浓度与临界溶氧浓度之比。2、分别简述分批发酵、补料发酵和连续发酵的特点。答：一）分批发酵：操作简单、周期短；染菌的机会减少；生产过程、产品质量易掌握；不适用于测定过程动力学；对基质浓度敏感的产物，用分批发酵不合适二）补料发酵：1）补料分批发酵与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。2）与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。3）定期补充和带放使发酵液稀释，送去提取的发酵液体积更大；4）发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成；5）一些经代谢产生的前体可能丢失；6）有利于非产生菌突变株的生长三）连续发酵：1）可提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；　　2）便于自动控制；　　3）增加了染菌机会：长时间不断地向发酵系统供给无菌空气和培养基；4）菌种发生变异的可能性较大。3、在发酵生产中如何计算发酵热。-可修编辑-\n--答：发酵热的测定可采用以下两种方法：①利用热交换原理:测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热：Q发酵=G×Cm（t2–t1）/V（Cm：水的比热G：冷却水流量）②利用温度变化率S（℃/h）：先使罐温恒定，再关闭自控装置，测量S，根据Q发酵=ＫＳ（Ｓ：温度随时间上升的速率　　Ｋ：系统的热容量）4、如何对不同阶段的最适温度进行选择。答：1）根据菌种及生长阶段选择　　微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度围也不同。　　通常前期菌量少，取稍高的温度，使菌生长迅速；中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此温度要稍低一些，推迟衰老。后期产物合成能力降低，又提高温度，刺激产物合成到放罐。2）根据培养条件选择　　温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。　　通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。　　培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3）根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。5、简述引起pH上升或下降的原因。答：在发酵过程中，pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。在产生菌的代谢过程中，菌体本身具有一定的调整周围环境pH，构建最适pH值的能力。一）基质代谢（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸性物质、生理碱性物质利用后pH会下降或上升二）产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。三）菌体自溶，pH上升。四）其他引起pH上升的因素①C/N比例不当，N过多，氨基氮释放；②生理碱性物质过多；③中间补料时碱性物加入量过大五）其他引起pH下降的因素①培养基中C/N不当，有机酸积累；②消沫油加得过多；③生理酸性物质过多；；-可修编辑-\n--6、在实际生产中如何选择最适pH值。答：发酵工程中基质代谢、产物形成、菌体自溶会使pH发生变化。正交试验设计是研究多因素多水平的一种设计方法。最适pH值的确定：根据正交实验的实验结果用不同的pH值出发进行发酵，发酵过程中定时测定和调节pH值以维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为生长最适pH。同样的方法可测得产物合成的最适pH值。但同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。确定发酵最适pH值时，要考虑温度的影响。7、简述CO2对发酵的可能影响机理。答：1）CO2对菌体生长的作用：直接影响――排出CO2高于4%时，碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降。2）CO2影响产物形成：阻碍基质分解和ATP生成，影响产物的合成。3）CO2影响菌体形态：不同的CO2浓度菌体形态不同4）CO2对细胞的作用机制：①CO2作用在细胞膜的脂肪核心部位。②影响细胞膜表面的蛋白质。影响细胞膜的流动性及表面电荷密度，影响细胞膜的运输效率。8、简述影响泡沫稳定性的因素以及泡沫对发酵的不利影响。答：一）影响泡沫稳定性的因素1）泡径大小：大泡易于破灭，寿命较长的的都是小泡。泡越小，合并成大气泡的历程就越长；更能经受液体流失所造成的稳定性的损失；2）溶液所含助泡物的类型和浓度：（1）降低表面力（2）增加泡沫弹性（3）助泡剂浓度：浓度增加，泡沫稳定性增高3）起泡液的粘度：粘稠的液膜，有助于吸收外力的冲击，起到缓冲的作用，增加稳定性。4）温度：表面力最低值时的浓度随温度变化。5）pH：影响助泡剂的溶解度和表层的吸附状态6）表面电荷：离子型表面活性剂，减少排液速度，延缓泡沫变薄过程，使泡沫稳定。二）泡沫对发酵的不利影响1）降低生产能力；2）引起原料浪费3）影响菌的呼吸；4）引起染菌8、在发酵生产中怎样选择合适的消泡剂。答：１、表面活性剂，具有较低的表面力（聚力弱），消泡效果明显。２、对气-液界面的散布系数必须足够大，才能迅速消泡；３、无毒害性，且不影响发酵菌体；不会在使用、运输中引起任何危害；４、不干扰各种测量仪表的使用；５、在水中的溶解度较小，以保持持久的消泡性能；６、应该在低浓度时具有消泡活性；-可修编辑-\n--７、应该对产物的提取不产生任何影响；８、应该对氧传递不产生影响；９、能耐高温灭菌。１０、来源方便，使用成本低；第七章发酵动力学1、名词解释：1）得率系数：两种物质得失之间的计量比。2）限制性营养物：指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。3）倍增时间：微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，也叫增代时间.4）稀释率：补料速度与反应器体积的比值，即D=F/v2、为什么说微生物分批培养是一种非稳态的过程？答：分批培养又称分批发酵，是指在一个密闭系统投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。微生物生长可分为停滞(延迟)期、对数生长期、减速期、稳定期和死亡期等四个阶段。每一个阶段微生物所处的环境不断变化，营养物质不断减少，菌体数量增加，代谢物质增多。物理、化学和生物参数均随时间而变化。所以说，微生物分批培养是一种非稳态的过程。3、影响停滞期长短的决定因素有哪些？答：接种物的生理状态和浓度是停滞期长短的关键。如果接种物处于对数生长期，那么就很有可能不存在停滞期。微生物细胞立即开始生长。反之，如果接种物本身已经停止生长，那么，微生物细胞就需要有更长的停滞期以适应环境。4、稳定期微生物出现二次生长的原因。答：由于细胞的溶解作用，一些新的营养物质，诸如细胞的糖类、蛋白质等被释放出来，又作为细胞的营养物质，从而使存活的细胞继续缓慢生长出现通常所成的二次成稳性生长。5、比较分批培养和连续培养的优缺点？答：一）分批培养：优点：操作简单；操作引起染菌的概率低;不会产生菌种老化和变异等问题缺点：非生产时间较长、设备利用率低。二）连续培养：优点：能维持低基质浓度；可以提高设备利用率和单位时间的产量；便于自动控制。连续培养的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速增微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。缺点：菌种发生变异的可能性较大；要求严格的无菌条件。6、分批培养与连续发酵的生产率如何计算？如何确定连续培养的最大生产率？答：分批培养过程的生产率：连续培养过程的生产率：-可修编辑-\n--DC为临界稀释率，即最大稀释率。X=Yx/s(S0-S)当D很小时，S趋向于0，X=YX/SS0，若D增大，X减小，当D=DC=μmax，X=0，S趋向于S0。达到清洗点。D=μmaxD>μmax时会造成菌体的溢出7、计算题在F=200ml/h的恒速流加操作中培养某细胞，流加底物浓度100g/L，该反应符合Monod方程，参数为μmax=0.3h-1，Ks=0.1g/L，Yx/s=0.5。流加开始时，生物质总量为30g，当流加2h后，系统处于稳态。此时反应器有效体积为1000ml。计算：培养液的初始体积流加2h时反应器中的底物浓度流加2h时反应器中的生物总量解：1、当流加2h后，系统处于稳态。此时反应器有效体积为1000ml。即有效体积为1000ml初始体积=1000-Fx2=100-200x2=600ml2、系统处于稳态，该反应符合Monod方程M=D=0.2h-1底物浓度3、流加2h时反应器中菌体浓度X=Yx/s(S0-S)=0.5*(100-0.2)=49.9g/L2h反应器有效体积为1000ml2h时反应器中的生物总量Z=49.9+30=79.9第八章发酵产物的提取与精制工程1、名词解释-可修编辑-\n--1）萃取法：利用物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配比不同而达到分离纯化的方法。2）浓缩：使溶剂蒸发而提高溶液的浓度，泛指不需要的部分减少而需要的部分的相对含量增高。3）结晶：从液相或气相中生成具有一定形状的晶体状固体发酵产品的方法。4）错流过滤：在泵的推动下料液平行于膜面流动，与死端过滤不同的是料液流经膜面时产生的间接力把膜面上滞留的颗粒带走，从而使污染层保持在一个较薄的水平。5）离子交换层析：利用离子交换剂上的可交换离子交换吸附周围介质中的离子而达到分离目的的柱层析方法。6）凝胶层析：利用凝胶的网状结构为固定相，根据分子大小进行分离的一种方法7）双水相：两种亲水性高分子聚合物在水溶液中的浓度达到一定时，自动形成互不相溶的两相。２、叙述发酵产物提取与精制工程的工艺流程。答案要点：预处理及菌体分离→产物的提取→产品的精制→成品的加工3、发酵产物提取之前，为什么要进行预处理？叙述预处理的程序、目的及方法。答案要点：　一）预处理的目的：因为1）发酵醪的组成：菌体+发酵液；2）发酵产物存在的位置：发酵液中或菌体中；3）发酵液中发酵产物浓度低；4）酵液中有固形悬浮物存在，发酵液粘稠；5）酵液中杂质成分较多。　二）预处理的程序：发酵醪预处理→细胞破碎及碎片分离→发酵液预处理　　1）发酵醪预处理的目的、方法：①加热法：降低粘度；除去蛋白质等。②调节pH至蛋白质等电点：除去蛋白质及金属离子。③离心分离法、过滤分离：出去颗粒和较大团块④加速菌体分离的辅助方法：絮凝法、吸附法、加助滤剂法　　2）细胞破碎的目的、方法：①机械破碎法：高匀浆法、珠磨法：使细胞经剪切和撞击而破碎。超声波破碎法：产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。撞击法：高压冲击冰晶，导致细胞变形而碎。②非机械破碎法：渗透压冲击法、反复冻结—溶化法、干燥法、酶溶法：破坏细胞壁中某些化学物质的结构，导致细胞破裂。化学试剂破碎法：改变细胞壁、细胞膜渗透性，使胞物质有选择性的释放出来。　　3）发酵液预处理的目的、方法：①去除蛋白质方法：加热——过滤调节pH——过滤-可修编辑-\n--②除去重金属离子、色素、热原质、毒素等杂质。除去方法：吸附法（离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等材料）③根据目的产物的理化特性，调节适宜的温度和pH，减少目的产物的破坏和损失。4、沉淀提取法常用的方法有哪些？叙述各方法的原理及应用。答案要点：一）盐析沉淀法：①原理：添加中性盐，破坏蛋白质的胶体性质、破坏蛋白质分子表面的水化膜及所带电荷，使蛋白质沉淀。②提取物质：蛋白质、酶制剂二）等电点沉淀法：①原理：两性电解质在等电点是溶解度最低的原理而提取。②提取物质：氨基酸三）有机溶剂沉淀法：①原理：有机溶剂的分子与大量的水分子结合，破坏蛋白质颗粒周围的水化层，失去水化层的蛋白质胶体颗粒聚集而沉淀。②提取物质：蛋白质、氨基酸、核酸、多糖类、脂类、抗生素、维生素等。四）复合沉淀法—金属盐沉淀法：①原理：氨基酸与金属盐结合形成氨基酸金属盐沉淀而析出，氨基酸金属盐沉淀析出物溶解后调pH至氨基酸等电点，氨基酸沉淀析出。②提取物：氨基酸5、吸附法、蒸馏法、萃取法、膜分离法提取发酵产物的原理分别是什么？各适合提取哪些发酵产物？答案要点：一）吸附法：①原理：吸附剂将发酵液中的提取物吸附，再用吸附剂上被吸附的物质洗脱下来。常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅胶、树脂等。②提取物质：抗生素、维生素、蛋白质、氨基酸等。二）蒸馏法：①原理：根据不同物质其沸点不同的原理，将混合液进行分离。②提取物质：挥发性物质三）萃取法：①原理：混合物中不同组分在同种溶剂中溶解度不同，利用不同溶剂从混合物中提取目标产物。　②提取物质：抗生素、蛋白质、脂类。四）膜分离法：①原理：利用具有一定选择透性的过滤介质制成的膜使混合液中的物质透过或截留。②提取物质：磷脂、蛋白质等。6、叙述发酵产物纯化的方法及原理。答案要点：-可修编辑-\n--一）凝胶层析法：混合液中，不同的溶质其粒子大小不同，在层析柱移动速度不同而将不同的物质分离。二）离子交换层析法：交换剂上可交换的阴离子或阳离子与介质中的离子交换吸附，然后用洗脱剂洗脱。三）结晶法：溶质从溶液（液相）析出形成晶体（固相），同类分子、离子才能排列形成晶体。7、产品干燥是指将产品干燥成固体吗？为什么？答案要点：不是，因为产品干燥是利用各种方法使产品中的水分气化从而形成固体产品、半固体产品或浓缩液的一项技术。根据得到的产物的类型不同，使用的干燥方法也不同，常用的方法有：喷雾干燥、气流干燥、沸腾干燥、冷冻干燥和真空干燥。通过干燥过程而得到的产物有半固体产品和浓缩液，如：乙醇溶液等。因此，产品的干燥不是指将产品干燥成固体。第九章发酵设备1、发酵工业种子制备需要哪些主要设备？答案要点：发酵工业种子制备包括二个阶段，即实验室种子制备和生产车间种子制。实验室种子制备所需设备：恒温培养箱、摇床、高压灭菌锅、无菌室或超净工作台生产车间种子制备所需设备：种子罐；辅助设备（蒸汽发生器、蒸汽输送管道、无菌空气设备、发酵液输送设备）。2、请你根据现已掌握的知识，拟定出以玉米为原料发酵生产酒精的主要设备清单。答案要点：　　　玉米预处理设备：除杂、粉碎设备；糊化、糖化设备；　　　种子制备设备：　　　培养基制作设备：　　　乙醇发酵设备：　　　发酵醪、发酵液预处理设备：　　　乙醇提取设备：3、了解发酵罐的类型及其应用。答案要点：1）密闭厌氧发酵罐：厌氧发酵，主要用于厌氧微生物的发酵，如：酒精、啤酒、乳酸、丙酮丁醇等的发酵。2）密闭通气发酵罐：好氧发酵，主要用于好氧微生物的发酵生产，如：抗生素、酶制剂、酵母、氨基酸等产品的发酵，可分为：部机械搅拌型发酵罐、空气喷射提升式发酵罐、多孔塔式发酵罐。4、机械搅拌通气式发酵罐和机械搅拌自吸式发酵罐有什么主要区别？答案要点：机械搅拌通气式发酵罐：通气、搅拌设施分开装于罐机械搅拌自吸式发酵罐：无独立的通气设施，罐中央装有自吸式搅拌器第十章微生物发酵产品1、名词解释：-可修编辑-\n--1）共沸蒸馏：使用一种能与水共沸的共沸剂将待蒸馏水溶液中的水共沸蒸馏的方法。2）青霉素：从青霉菌培养液中提制的、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。3）啤酒：以麦芽为主要原料，加酒花，经酵母发酵酿制而成的，含有二氧化碳气体、起泡的低酒精度饮料。4）上面酵母：凝聚状；发酵温度15~25℃；发酵终了，大部分细胞悬浮于液面；37℃能生长。5）下面酵母：分散状，发酵温度5~12℃；发酵终了，大部分细胞沉淀于底部；37℃不能生长。6）一罐发酵法：采用圆柱体锥底发酵罐（CCT）主发酵、后发酵、贮酒一罐完成发酵生产啤酒的方法。2、何谓微生物发酵产品？微生物发酵产品包括哪几大类型？分别介绍述啤酒、白酒、酱油、食醋、乙醇、乳酸发酵的菌种及发酵原料。答案要点：1）生物发酵产品：利用微生物及酶制剂发酵的产物精制加工而成的产品。2）微生物产品的类型：发酵食品、发酵化学品、生物药物、酶制剂。3）啤酒：发酵菌种：酵母菌生产主要原料：麦芽、水、酒花等。白酒：发酵菌种：霉菌、酵母菌。主要原料：淀粉质原料。酱油：发酵菌种：曲霉、酵母菌、乳酸菌主要原料：大豆、麸皮、食盐；或小鱼、小虾、食盐。食醋：发酵菌种：霉菌、酵母菌、醋酸菌。主要原料：淀粉质原料；糖蜜；果汁；白酒等。乙醇：发酵菌种：霉菌、酵母菌。发酵原料：淀粉质原料、纤维素原料、糖蜜。乳酸：发酵菌种：根霉、乳酸菌。发酵原料：淀粉质原料、纤维素原料、糖蜜、玉米浆、麸皮等。3、叙述青霉素发酵生产的工艺流程、各阶段的主要目的及主要控制技术。答案要点：　1）青霉素发酵生产工艺流程：斜面培养、孢子扩大培养、一级种子发酵、二级种子发酵三级发酵；　　　2）各阶段的主要目的及主要控制技术①斜面培养：活化菌种、获得斜面孢子斜面培养温度：25~26℃；培养时间：6~8d。②孢子扩大培养：孢子的扩大培养方法：浅层固体培养；培养温度、时间：25℃；7d。③一级种子发酵：种子罐液体培养培养基pH：自然。培养方法：通气搅拌培养（空气流量1：3（体积比）300－350r/min）。培养温度、时间：26~28℃；40~50h。④二级种子发酵：繁殖罐液体培养-可修编辑-\n--通气搅拌培养：1：1－1.5；250－280r/min；培养pH：自然，培养温度、时间：24~26℃；10－14h。⑤三级发酵：发酵罐发酵通气搅拌：1：0.7~1.8；150－200r/min；罐压：0.04~0.05MPa；发酵时间：200h左右。　　　4、了解青霉素提取与精制方法及其原理。答案要点：　1）青霉素提取工艺流程：预处理、萃取、萃取液脱色、结晶、干燥　2）预处理方法：真空转鼓过滤：加絮凝剂，除去菌丝体。调节pH4.5-5.0：硫酸调节。板框式过滤机过滤：加助滤剂硅藻土（0.07%）；除去蛋白质。3）萃取方法及原理：有机溶媒萃取。萃取原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂；青霉素盐易溶于水。萃取方法：酸化：发酵滤液硫酸酸化（pH2）；萃取：加萃取剂（发酵滤液的1/3）；分离：碟片式离心机分离；反萃取：NaHCO3调节pH6.8-7.1，青霉素溶解；酸化→萃取→分离→反萃取。4）萃取液脱色方法及原理：萃取液活性炭脱色→板框过滤除去活性炭。　5）结晶方法及原理：共沸蒸馏结晶：使用一种能与水共沸的共沸剂将待蒸馏水溶液中的水共沸蒸馏。　　直接结晶法：萃取液+醋酸钠－乙醇溶液→结晶青霉素钠盐萃取液+醋酸钾－乙醇溶液→结晶青霉素钾盐6）干燥：洗涤→干燥→成品青霉素5、叙述一罐法发酵生产啤酒的工艺流程及技术要求。答案要点：　　　工艺流程：麦芽汁制备、种子制备、满罐、接种、主发酵、封罐、双乙酰还原、降温、酵母回收、贮酒。1）麦芽汁制备：将固态麦芽、非发芽谷物、酒花用水调制加工成澄清透明的麦芽汁2）种子制备：原始菌种要纯、无污染、无变异；每阶段扩大培养最好在酵母对数生长期移植；保证氧气供应等。3）满罐：不超过24h。满罐后每隔1天排放一次冷凝固物，共排3次。4）接种：接种量以满罐后酵母数（1.2～1.5）×107个/ml为准。5）主发酵：外观发酵度达到55%时及时升温至10℃。6）封罐：当外观当外观发酵度达到60%时封罐升压；发酵罐压力控制在0.10～0.15MPa。7）双乙酰还原：温度升至12℃，主发酵结束，进行双乙酰还原。8）降温：双乙酰还原结束后降温，24h使温度降至5℃。9）酵母回收：降温结束后停留1天进行酵母回收。10）贮酒：24h继续降温至-1℃～-1.5℃时贮酒。贮酒时间：淡季7天以上，旺季3天以上。6、鲜啤、熟啤、纯生有何区别？-可修编辑-\n--答：-可修编辑-