执业药师复习资料 38页

第六章色谱法药物分析课件西安交通大学药学院傅强fuqiang@mail.xjtu.edu.cn\n第六章色谱法考试大纲要求掌握薄层色谱法的基本原理、操作方法以及在药物鉴别、检查中的应用。掌握气相和高效液相色谱法的基本原理及其在药物鉴别、检查和含量测定中的应用。掌握气相色谱和高效液相色谱系统适用性试验的主要内容。熟悉电泳法的基本原理和常用的电泳方法。了解气相色谱仪和高效液相色谱仪的基本结构、毛细管电泳法的基本原理。\n第六章色谱法色谱法(chromatography)是建立在被分离组分在两相间具有不同分配特性基础上的分析方法。静止不动的一相称为固定相（stationaryphase），参与运动的另一相称为流动相（mobilephase）。\n一、分离原理\n（一）分配平衡在色谱分离过程中，当温度一定时，认为组分在两相间的分配可以达到热力学平衡，此时组分在固定相中的浓度（Cs）与在流动相中的浓度（Cm）之比为一个常数，表示为：K=Cs/CmK为平衡常数（equilibriumconstant）。当色谱体系的固定相和流动相一定时，K是反映组分保留特性的参数，K值大，表明组分与固定相的作用强，易于保留；反之，则组分与固定相的作用弱，易于进入流动相而被洗脱。由于不同组分其化学性质各异，就具有不同的保留特性或不同的K值，从而通过色谱方法得以分离。\n（二）保留参数色谱图（chromatogram）是由组分在柱中的浓度与流出时间作图形成的曲线。描述曲线特征的各种保留参数（retentionparameter），反映了组分在色谱柱中的作用和分离特性。1．保留时间组分从进样开始到柱后该组分出现峰值浓度时，所需的时间称为保留时间（retentiontime，tR）。而不保留组分从进样开始到出柱时，所需的时间称为死时间（voidtime，t0）。\n色谱图1．保留时间：保留时间；死时间；调整保留时间。2．容量因子：由于保留体积的大小与柱的尺寸有关，不能完全反映组分的保留特性，所以引入容量因子（capacityfactor，k′）的概念。根据分配平衡定义的容量因子为：在一定温度下，组分在两相间的分配达到平衡时，其在两相中的绝对量之比。\ntR=t0（k′+1）\n（三）理论塔板（theoreticalplate）两个组分被分离的条件首先是它们有不同的K值或k′值，但也与峰的形状和宽度有关。为了描述色谱峰的宽度，引入理论塔板数（n）的概念。\n理论塔板数与柱长（columnlengthen，L）成正比。所以，柱的性能还可用塔板高度（plateheight,H）来表示。理论塔板概念被广泛用来描述色谱柱的特性，性能良好的色谱柱，其理论塔板数高，塔板高度值小，峰形窄而对称。\n（四）范氏方程（VanDeemterequation）1956年，VanDeemter提出了色谱中塔板高度受三方面的因素影响，并总结出了与流动相线速（u）有关的经验表达式称为范氏方程:\n1．涡流扩散项（A）：与固定相的粒度大小和均匀度有关，与流动相的性质无关。气相色谱中使用空心毛细管柱时，由于无填充颗粒，A项为零。2．分子扩散项（B/u）：与组分在柱中的浓度梯度和分子的扩散运动有关，增加流速有利于克服由B/u项引起的色谱峰展宽。气相色谱中，B/u项是色谱峰展宽的主要因素；而液相色谱中，由于液态分子的扩散运动较低，B/u项可以忽略不计。3．传质阻力项（Cu）：与固定相的液层厚度和柱中流动相的迁移速度有关。组分进入固定相和从固定相返回流动相均需要一定的时间，所以增加流速将会造成分子质量迁移速度的差异，而引起色谱峰展宽。液相色谱中，Cu项是色谱峰展宽的主要因素。\nVanDeemter方程说明了填充均匀程度、载体粒度、载气种类、载气流速、柱温、固定液层厚度对柱效的影响，对色谱条件的选择具有重要意义。\n二、色谱系统适用性试验方法\n1.色谱柱的理论塔板数（n）:达到规定要求；2.分离度(R):除另有规定外R应大于1.5；3.重复性(RSD):取对照品溶液,连续进样5次其峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%；4.拖尾因子(T):除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。\n在给定色谱条件下，相邻的两个色谱峰被分离的程度用分离度来表示。tR1，tR2，Wb1和Wb2分别表示第一个和第二个色谱峰保留时间和峰宽。一般Rs>1.5，认为两峰完全基线分离。\n三、各种色谱法\n色谱法分类按两相状态分:气相色谱法气—固色谱法气—液色谱法液相色谱法液—固色谱法液—液色谱法\n按操作形式分：柱色谱法平面色谱法电泳法按分离机制分:分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法亲合色谱法等\n（一）薄层色谱法薄层色谱法（thinlayerchromatography，TLC）是将固定相铺于平板上，利用流动相的毛细现象推动组分迁移，由于不同组分在两相间分配特性或吸附作用的差异，而得以分离的色谱方法。与其他色谱方法相比，薄层色谱法具有操作简便、分析快速、应用广泛等特点。\n１．原理：分配系数的不同，引起差速迁移．２．比移值：３．色谱展开在流动相的作用下，组分在铺有固定相的平板上进行差速迁移而逐步被分离的过程称为色谱展开。通常将铺有固定相的平板称为薄层板，将流动相称为展开剂。对展开后的薄层板，组分斑点在薄层板中的位置是其定性分析的依据，而组分斑点的面积或吸收光强度则是其定量测定的依据。\n吸附剂：最常用的吸附剂包括：硅胶、氧化铝、硅藻土、粉末纤维素和聚酰胺等。展开剂：由混合溶剂组成的展开剂是推动组分迁移的原始动力，展开剂的推动力、吸附剂的吸附力与组分的作用力三者之间相互制约又相互竞争。所以，薄层吸附色谱的分离过程是一个“吸附、解离，再吸附、再解离”的往复循环过程。在此过程中，当组分和吸附剂一定时，展开剂的极性增加，组分的Rf值增大，反之Rf值减小。一般组分的Rf值在０.３～０.５的范围内为宜。\n４．操作方法：（１）吸附剂与展开剂的选择；（２）薄层板的制备；（３）点样与展开；（４）斑点的定位．\n（二）ＧＣ气相色谱法（gaschromatography，GC）是以气体为流动相的色谱法。主要有两类：气–固色谱法（gas–solidchromatography，GSC）和气–液色谱法（gas–liquidchromatography，GLC）。其中最常用的是气–液色谱法，被测样品组分在气液两相之间通过多次分配而得以分离。气相色谱法具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、检测灵敏度高、应用范围广等特点，可用于微量或痕量药物的分离、检测。但对于挥发性小、热稳定性差和极性过大的毒物，该方法的应用受到一定限制。\n１．原理：KA≠KB差速迁移。２．固定液与载体：色谱柱一般分为：填充柱和毛细管柱两大类型。填充柱在气–液色谱法中，应用的是填装了固定相的色谱柱。通常柱长1m~3m，内径3mm~6mm，一般短柱用玻璃管，长柱用不锈钢管。固定相为液体称为固定液，支撑固定液的惰性多孔固体称为载体。\n常用固定液:甲基硅油甲基硅橡胶苯基甲基聚硅氧烷聚乙二醇\n3.仪器\n检测器的输出信号强度与进入检测器组分的量成比例关系。对检测器的基本要求是灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，噪音低。浓度型检测器:热导检测器（TCD）;（2）电子捕获检测器（ECD）.质量型检测器:氢火焰离子化检测器（FID）\n4.应用:(1)定性鉴别:用保留值鉴别;(2)检查:内标法加校正因子测定供试品中某个杂质的含量;外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量;加校正因子的主成分自身对照法;不加校正因子的主成分自身对照法;峰面积归一化法;(3)含量测定:内标法、外标法\n小结:中国药典中各品种项下规定的色谱条件不得改变的有:检测器的种类;固定液品种及特殊的色谱材料;其余条件可以改变.\n（三）高效液相色谱法以液体为流动相的色谱法通称为液相色谱法。利用小粒径（3~10μm）固定相和压力泵输送流动相，使分离效率和分析速度明显提高的液相色谱法称为高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）。与气相色谱法比较，HPLC法不受被测样品挥发性和热稳定性的限制，适用于大部分的有机毒物的分析检测；另外，HPLC法中的流动相的选择范围较大，可以更有效地控制和改善分离条件，提高分离效率。\n1.原理:差速迁移;塔板理论同GC;速率理论H=A+Cu2.固定相:硅胶；化学键合相（ODS、氨基氰基键合相等）；键合型离子交换剂（强酸性磺酸型阳离子键合相、强碱性季铵型阴离子键合相）。3.流动相:正相色谱用极性小的有机溶剂；反相色谱常用甲醇－水或乙腈－水。\n4.分类:(1)吸附色谱法:一般固定相为吸附剂（如硅胶），流动相为极性较小的有机溶剂（如烷烃类）构成的分离体系，不同组分与吸附剂之间的“吸附与解吸附”作用大小是其分离的基础。例如，当被测组分一定时，硅胶的吸附作用大，则容量因子大，保留时间增长；同时流动相的极性大，则解吸附作用强，保留时间缩短。\n(2)液–液分配色谱法固定相和流动相为两种互不相溶的液体构成的分离体系，不同组分在两相间的分配作用大小是其分离的基础。化学键合固定相:通过化学键合反应合成的、表面键合有不同有机基团的刚性颗粒。根据化学键合固定相和流动相的极性，将液–液分配色谱法分为正相色谱法和反相色谱法两类，而后者是最常用的高效液相色谱方法。\n4.仪器:高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器及色谱工作站等组成。\n检测器：常用的有紫外检测器、荧光检测器和电化学检测器等。由于要求在线检测，检测池的体积（1μL~8μL）很小，并能耐一定压强。\n5.应用(1)定性鉴别:用保留值鉴别;(2)检查:同GC.内标法加校正因子测定供试品中某个杂质的含量;外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量;加校正因子的主成分自身对照法;不加校正因子的主成分自身对照法;峰面积归一化法;(3)含量测定:同GC.内标法、外标法\n(四)电泳法1．分离原理υ=μE影响电泳分离的条件有：缓冲液的pH值和离子强度、电场强度、样品浓度。2．各类电泳法包括：纸电泳法、醋酸纤维素电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法。3．毛细管电泳法以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析方法。其分离模式主要有毛细管区带电泳（CZE）等。