酶工程复习资料 11页

名词解释酶由生物或人工合成的具有催化特定反应能力的蛋白质、RNA或其复合体。酶工程酶制剂的大批量生产和应用的技术。它从应用的目的出发，将酶学理论与化学工程相结合研究酶，并在一定的反应装置中利用酶的催化特性，将原料转化为产物的一门新技术，主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。酶活性中心酶分子表面直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需氨基酸人体自身不能合成或者合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸必需基团包括活性部位(催化基团和结合基团)和活性中心外维持酶的空间结构的必须基团反应活化能分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol反应物全部进入活化状态所需的自由能。单纯酶只含蛋白质的酶或含不参与催化过程的非蛋白质组分的酶全酶(结合酶)由蛋白质组分(即酶蛋白)和非蛋白质组分(一般为辅酶或激活物)组成的一种结合酶或含有表达全部酶活性和调节活性所需的所有亚基的一种全寡聚酶。全酶=酶蛋白+辅因子辅酶一类可以将化学基团从一个酶转移到另一个酶上的有机小分子，与膜蛋白结合得疏松的小分子有机物,对于特定酶的活性发挥是必要的。辅基酶的辅因子的一种，其中较小的与膜蛋白结合得紧密的非蛋白质小分子有机物部分称辅基单体酶仅有一个活性中心一般是由一条链组成的多肽链构成的酶，能全部参与水解反应。如牛胰岛素。寡聚酶由2个或多个相同或不相同亚基组成的酶。已知所有的变构酶都是寡聚酶。多酶复合体多种酶靠非共价键相互嵌合催化连续反应的体系同工酶能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。酶原激活某些酶在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些没有活性的酶的前身称为酶原(zymogen),使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活(zymogenactivation)。Km值米氏常数，等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。是酶的特征常数之一，可近似的反应酶与底物的亲和力大小。Vmax值表示最大酶促反应速度不可逆抑制抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。可逆抑制抑制剂与酶的结合是可逆的。竞争性抑制抑制剂和底物竞争与酶结合。非竞争性抑制底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。反竞争性抑制抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。别构酶具有别构效应的酶称为别构酶。当某些化合物与酶分子中的别构部位可逆地结合后，酶分子的构象发生改变，使酶活性部位对底物的结合与催化作用受到影响，从而调节酶促反应速度及代谢过程，这种效应称为别构效应。别构酶常是代谢途径中催化第一步反应或处于代谢途径分支点上的一类调节酶，大多能被代谢最终产物所抑制，对代谢调控起重要作用。酶活性酶催化特定化学反应的能力。可用在一定条件下其所催化某一化学反应的速度表示。酶活性单位可用来表示酶活力的大小。酶活性单位在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，\nU/ml）活力回收固定化后固定化酶（或细胞）的总活力占用于固定化的游离酶（细胞）总活力的比例偶联率偶联率=（加入蛋白活力-上清蛋白活力）/加入蛋白活力相对活力相对活力=固定化酶总活力/（加入酶的总活力-上清中未偶联酶活力）半衰期固定化酶(细胞)在连续测定条件下,活力下降为最初活力一半时所经历的时间,称为半衰期.半衰期是衡量固定化酶(细胞)稳定性的指标.酶的固定化利用一定措施将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。固定化酶在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以回收使用.(不一定是固体)化学修饰凡通过化学基团的引入或除去,而使蛋白质共价结构发生改变,称为蛋白质的化学修饰.选择性化学修饰利用化学试剂对肽链特定的基团的专一性修饰,称为选择性化学修饰.亲和修饰又叫亲和标记,专一性不可逆修饰。修饰剂对被作用基团不仅具有基团的专一性而且具有部位的专一性,它们与底物有相类似的结构,对酶活性部位具有高度的专一性,能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记,这类专一性化学修饰称为亲和化学修饰(亲和标记,专一性不可逆修饰)大分子化学修饰可溶性大分子,通过共价键连于酶分子表面形成覆盖层的修饰。如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、羟甲基纤维素、多聚唾液酸、肝素等。化学交联利用具有两个反应活性部位的双功能基团使相隔较近的两个氨基酸残基之间或酶与其他分子之间发生交联反应，这种修饰方法叫化学交联蛋白质的稳定性蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力.Tm:蛋白质受热伸展过渡中点时的温度;水活度系统中水的逸度与纯水逸度之比,在理想条件下可用水的蒸气压代替,即在理想条件下水活度等于水的蒸汽压与同样条件下纯水蒸汽压之比.最适水量是保证酶的极性部位水合,表现活力必须的,也叫必需水.在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间达到最佳平衡点,酶表现出最大活力.pH记忆有机溶剂中的酶能够记忆它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH的现象pH忘记微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与它们的盐组成的混合物,可以作为有机相缓冲液,这两种形式的比例控制着有机相中酶的解离状态,使酶完全忘记干燥前它所处的水溶液的pH值的现象主客体化学主体与客体通过配位键和其他次级键形成稳定复合物的化学。超分子化学底物和受体以非共价键相互作用，如静电作用，氢键和范德华力等，形成具有稳定结构和性质的实体，即形成了超分子，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。酶的人工模拟从分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学；利用化学、生物化学等方法设计和合成较天然酶简单的非蛋白或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对底物的结合催化过程，即在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征。人工酶在尽量接近生物条件下人工模拟自然酶的模型化合物分子印迹制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程.这个分子叫印迹分子(printmolecule,P),也叫模板分子(template,T).分子印迹酶利用分子印迹技术制备能与底物特异性结合并具有一定的催化能力的聚合物叫分子印迹酶,是模拟酶的一种\n表面分子印迹在某些载体表面产生分子印迹空腔或进行表面修饰产生印迹结合部位的过程.生物印迹是分子印迹的一种,指以天然的生物材料,如蛋白质和糖类物质为骨架,在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程.生物印迹酶利用生物大分子进行分子印迹制备的具有底物识别功能和催化功能的生物大分子,叫生物印迹酶.肽酶模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。表面分子印迹在某些载体表面产生分子印迹空腔或进行表面修饰产生印迹结合部位的过程.抗体酶是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，因此称为抗体酶。（脱氧）核酶具有催化活性的（脱氧）核酸分子。分子定向进化在实验室试管中模拟达尔文的自然进化原理，对蛋白质(酶)的基因利用随机突变和随机杂交的方法加以改造，通过大规模筛选，从而得到性能上改良的优异变种。使蛋白质(酶)在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短至几个月，为蛋白质(酶)的工程应用提供了一个强有力的技术手段。易错PCR使用Taq酶进行PCR扩增目的基因时,通过调整反应条件（例如提高Mg2+浓度,加入Mn2+,改变体系中四种dNTP的浓度等）改变Taq酶的突变频率,从而向目的基因中,以一定的频率随机引入突变构建突变库然后选择或筛选需要的突变体连续易错PCR即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益的突变.DNA改组技术是一种有性PCR,将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起组成新的突变基因库.杂合酶由二种以上酶成分构成,将来自不同酶的结构单元(功能基、二级结构、三级结构、或功能域)或是整个酶分子进行组合或交换，可以产生具有所需要性质的优化酶杂合体，这种酶就是杂合酶。知识点梳理1.举例说明酶原激活的概念?并以此说明酶的结构与功能之间的关系.没有活性的酶的前体称为酶原,酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活;这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。例如胰腺细胞合成的糜蛋白酶原为245个氨基酸残基组成的单一肽链，分子内部有5对二硫键相连，该酶原的激活过程：首先由胰蛋白酶水解15位精氨酸和16位异亮氨酸残基间的肽键，激活成有完全催化活性的糜蛋白酶，再经其自身催化，去除二分子二肽成为有催化活性并具稳定结构的α—糜蛋白酶，能迅速分解变性蛋白质。酶的活性中心是酶的催化结构域，而必需基团包含了酶的活性中心以及维持整个酶蛋白（核酶）结构的必需氨基酸。所以必需基团和活性中心遭到破坏，酶都将失去催化能力。2.酶促反应速度,如何表示酶促反应速度用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度。3.试述影响酶促反应速度的主要因素.①酶浓度，有足够底物和其他条件不变的情况下：v=k[E]②底物浓度，米氏方程，当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成\n③pH，在一定的pH范围内酶是稳定的，表现出酶最大活力的最适pH值；pH对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。④温度，两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，热变性速度加快。最适温度⑤抑制剂，使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂⑥激活剂，凡能提高酶活力的物质4.写出米氏酶促反应动力学方程并说明其含义.Km值有何物理意义?如何测量Km值和Vmax值?vo=Vmax[S]/(Km+[S]),底物浓度对酶促反应速度的影响。Km值物理意义：（1）km是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。（2）从km可判断酶的专一性和天然底物。Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。（3）km=（k2+k3)/k1,当k2＞＞k3时，km的大小可以表示酶与底物的亲和性。（4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。（5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。①米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从v与[S]的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的[S]即为km（近似值）。②1/v=km/v*1/[s]+1/v,通常用双倒数作图法,,延长y=0时的x值即—1/km;x=0时，y值即1/Vmax5.充分理解酶的不可逆抑制,可逆抑制(竞争性、非竞争性、反竞争性），理解在上述抑制过程中Km和Vmax的变化①不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。②可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。③竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。所测均为表观值，Km变大，Vmax不变。④非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。Km不变，Vmax变小。⑤反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。Km变小，Vmax变小。6.酶的纯度的概念及测量酶的纯度的方法？常见沉淀剂.①酶的纯度：单位蛋白中所含的活力单位数，比活力=活力单位数/毫克蛋白（氮）②酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法常见沉淀剂:盐析法,多用于各种蛋白质和酶的分离纯化,常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等;有机溶剂沉淀法,多用于各种蛋白质和酶的分离纯化,用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。7.试述酶的作用原理及酶具有高效催化机制的可能原因.诱导嵌合学说、中间产物学说知酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应，降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快；因素有邻近定向效应、“张力”与“形变”、酸碱催化、共价催化、微环境的影响。\n8.分离提纯技术手段？在酶的分离提纯过程中主要技术指标是什么？（理解）p20纯化技术：凝胶过滤、离子交换、色谱聚焦、疏水作用、亲和分离等主要技术指标:比活力=活力单位数/毫克蛋白（氮）；纯化倍数=每次比活力/第一次比活力；产率%（回收率）=每次总活力/第一次总活力9.试述国际酶学委员会关于酶的分类及命名的原则,国际酶编号的含义及表述.分几大类?酶的编号(每种酶都有其唯一的独特的编号,可以看出酶的基本性质)：统一表示为：(EC数字1.数字2.数字3.数字4)，其中EC:EnzymeCommission(酶学委员会)如:乳酸脱氢酶(乳酸:NAD:氧化还原酶(EC1.1.1.27),表示该酶为第一大类(氧化还原酶类),属其中的第一亚类(作用于CH-OH基团),同时表示该酶属第一亚-亚类(表示其受体是NAD+或NADP+)6大类(顺序)：氧化还原酶类；转移酶；水解酶；裂合酶；异构酶；连接酶（合成酶）10.固定化酶与游离酶相比较的优势?①极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应③酶反应过程能够加以严格控制；④较游离酶更适合于多酶反应；⑤在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；⑥可以增加产物的收率，提高产物的质量；⑦酶的使用效率提高、成本降低。l固定化酶的缺点：①固定化时，酶的活力有损失；②只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；③增加了生产的成本，工厂初始投资大；④与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；⑤胞内酶必须经过酶的分离手续11.固定化酶活力概念，表示方法和测量方法？固定化酶活力:固定化酶催化某特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度表示。其酶活单位定义为每毫克干重固定化酶每分钟转化底物或生产产物的量，活力单位定义及表示方法:μmol.min-1.mg-1;或μmol.min-1.cm-1(酶板、酶管、酶膜）测量方法：固定化酶（细胞）的活力测定，应注明反应温度、pH、底物外，还应流注明搅拌速度、搅拌时间、测定系统类型。固定化酶活力的测定方法与游离酶不同,要做适当的改进之后才能用于固定化酶的测定;目前有二种基本的测定系统:填充床和均匀悬浮保温系统.测定方法分为间歇测定和连续测定两种①间歇测定:在搅拌或振荡反应器中,间隔一定时间取样,过滤后按常规进行测定.此法简单,\n但受反应器形状、大小及反应液量影响，必须固定条件下测定；尽可能在达到最高反应速度的振荡或搅拌条件下进行。②连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速与酶活力的关系算出酶活力。测定条件要尽量与工程条件相同。12.评价固定化效果指标和主要方法?常用的评估指标有：固定化酶的活力：是指固定化酶催化某一特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示；固定化酶的活力回收：是指固定化后固定化酶的总活力占用于固定化的游离酶总活力的比例；偶联效率：载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比。（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%；相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%；半衰期：是指在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所历经的连续工作时间，为衡量其稳定性的指标。维持酶的催化活性及专一性；利于生产的自动化、连续化；结合牢固，最大的稳定性；成本要低固定化方法分类固定化方法分类①非共价结合法结晶法分散法物理吸附法离子结合法②化学结合法交联法，共价结合法③包埋法微囊法，网格法,脂质体(定向)13.固定化共价固定的活化基团方法举例?交联法,常见的交联剂?重氮反应,适合水不溶性的带芳香氨基的载体.载体在稀盐酸或亚硝酸钠中进行反应,成为重氮盐衍生物,然后再在温和的条件下(中性偏碱pH8—9)和酶蛋白分子上相应的基团如酚羟基,咪唑基或氨基进行共价结合,得到固定化酶溴化氰—亚胺碳酸基反应含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。交联法就是利用双功能或多功能试剂使酶与酶，酶与蛋白，或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法，该法也是利用共价健固定酶的，所不同的是它不使用载体。最常用的交联剂是戊二醛,参与交联的基团有:a-氨基,e-NH2（Lys）,-SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等.一般而言：低酶浓度下主要形成分子内交联，交联后的酶仍呈溶解状态；高浓度下分子间交联增加，形成的固定化酶往往变为不溶态14.固定化酶的性质发生变化及其原因?为什么更加稳定了?酶活力变小（专一性也有所变化），稳定性提高，最适温度提高，最适pH值偏离（带正电荷载体最适pH向酸性偏离，较游离酶偏低），表观米氏常数Km值随载体的带电性能变化（中性-扩散限制-上升）.性质变化原因：①固定化改变了酶的结构或构象；②固定化后酶催化反应的空间障碍、扩散限制效应；③载体性质引起的分配效应及其对酶和反应体系性质的影响。更加稳定原因：①固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形②酶活力的缓慢释放③抑制酶的自行降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，而抑制了降解。15.固定化酶(细胞)的半衰期及其表示•固定化酶(细胞)在连续测定条件下,活力下降为最初活力一半时所经历的时间,称为半衰期.•半衰期是衡量固定化酶(细胞)稳定性的指标.\n•T1/2=0.696/KD•KD(衰减常数）=(-2.303/t)(lgE/E0)16.偶联率及相对活力的测定:活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比.即:固定化酶总活力/加入酶总活力*100%偶联率:载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%17.大分子化学修饰的优点？（抗原性的保持）可溶性大分子可通过共价键连于酶分子表面，形成覆盖层。稳定性提高，体内半衰期延长，免疫原性和毒性降低或消除，提高膜渗透性，提高疗效，增加在有机溶剂中的溶解度和耐有机溶剂变性的能力。18.举例分析为什么要进行酶的化学修饰？酶的化学修饰原因：稳定性、酶反应的最适条件、酶的专一性、米式常数过大、临床应用的特殊要求、酶种类的限制例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍19.试述ＰＥＧ表面化学修饰的优点？（MPEG单甲氧基PEG）它既能溶于水，又可溶于绝大多数有机溶剂，提高酶的抗蛋白水解能力，增加稳定性，延长半衰期；降低免疫原性和抗原性；毒副作用低。20.试述酶化学修饰的基本过程和基本策略首先是修饰剂和修饰条件的选择---提高修饰反应的专一性；修饰过程的跟踪-----获得修饰反应的数据;最后是对数据进行分析----确定修饰部位和修饰程度，对结果作出解释并提出合理化的改进。21.如何控制酶修饰反应的专一性？酶化学修饰对酶性质的影响有哪些？是否必定改变？试剂的选择:依赖修饰的目的.反应条件的选择(原则：允许修饰反应能顺利进行，同时不造成蛋白质的不可逆变性，有利于专一性地修饰蛋白质。因此对反应的温度、pH值、反应介质、缓冲液等都要根据以上原则进行考虑。)其他:利用蛋白质分子中某些基团的特殊性；选择不同的反应pH值；利用某些产物的不稳定性；亲和标记；差别标记；利用蛋白质状态的差异。酶经过修饰后，其性质的变化包括：提供生物活性（包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变）；增强在不良环境中的稳定性；针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；产生新的催化能力。22.简述酶的主要功能基团的修饰方法,记住每一种功能基团的修饰方法中的典型的一种,特别是有特征性光谱变化的一些基团修饰剂？（主要类型，主要修饰方法和修饰剂）具体修饰基团蛋白质侧链主要功能基有:氨基,羧基,巯基,咪唑基,酚基,吲哚基,胍基,甲硫基等;修饰反应主要有:酰化反应,烷基化反应,氧化还原反应,芳香环取代反应等;氨基：以卤代乙酸为修饰剂的烷基化的氨基。磷酸吡哆醛：325nm；三硝基苯磺酸：420nm和367nm；羧基：水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基；\n巯基：有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基修饰。N-乙基马来酰亚胺：300nm；对氯汞苯甲酸：250nm；5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸：412nm；咪唑基：以焦磷酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸为代表的组氨酸咪唑基的修饰；酚基：四硝基甲烷在温和条件下对硝化酪氨酸酚基的修饰；吲哚基：以N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）为代表的色氨酸吲哚基的修饰；胍基：以丁二酮为代表的具有二个邻位羰基的化合物的精氨酸残基的修饰；甲硫基：经过氧化氢、过甲酸等可将硫醚氧化成甲硫氨酸桠枫。23.试述如何分析酶修饰的程度和部位？⑴分析方法：光谱法追踪最简单最有用，但符合条件的试剂不多；目前最常用的方法是间接法：测量被修饰的氨基酸残基的量，要求修饰产物稳定，可通过二次修饰增加其稳定性。⑵化学修饰数据的分析：a)化追踪修饰过程光谱变化，或修饰过程对蛋白质某些酶学参数（活性、变构配体的调节作用等）的影响，从而获得修饰时间进程的曲线。b)可以了解修饰残基的性质和数目、修饰残基与蛋白质生物活性之间的关系等②确定必需基团的数目和性质:⑶化学修饰结果的解释u蛋白质功能改变的解释:如果修饰发生在活性部位或必需基团上;当修饰发生在远离活性部位的氨基酸上.u酶活力的改变可能是由于米氏常数的改变或最大反应速度的改变引起的.③学修饰的时间进程分析：24.修饰对酶的性质的影响（活力和稳定性变化）？及其他补充提高酶的活力增强酶的稳定性降低或消除酶的抗原性其他补充：①采用底物保护法是保持修饰酶活性的有效方法；②采用固相修饰法有利于修饰过程的控制和修饰产物的分离和分析；③在保持修饰酶活性和降低抗原性方面大分子的修饰效果远远好于小分子修饰剂；25.什么叫蛋白质的稳定性?如何理解蛋白质的稳定性这个概念?影响蛋白质稳定性的主要因素有哪些?如何理解疏水性与蛋白质稳定性的关系?（疏水键内部规则排列越高，稳定性越高）蛋白质的稳定性:蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力；蛋白质的特定功能是由其特定的空间结构决定的,要保持其生物活力,必须保持其空间结构的稳定。主要因素：金属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用；蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用；盐桥和氢键；二硫键；对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低；氨基酸残基的坚实装配；疏水相互作用关系:疏水性大小与稳定性没有必然的联系;非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排列是稳定性的原因之一;增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的疏水性26.蛋白质稳定性的指标?热稳定性的衡量标准和稳定性的最有效指标是什么?（半衰期，熔化温度，变性剂浓度）指标:半衰期;熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的变性剂浓度;蛋白质自由能;最大稳定性温度(Ts);在特定温度下蛋白质功能活性维持时间.热稳定性的衡量标准：Tm，Ts最有效指标:熔化温度Tm、蛋白质伸展50%时的变性剂浓度\n27.蛋白质失活有哪些可能的原因和机理?①蛋白质水解酶和自溶作用；②聚合作用（可逆性伸展~聚合Pro~二硫交换反应沉淀析出）；③极端pH（二硫键的破坏；活性中心氨基酸必需基团电离~蛋白质的伸展~不可逆聚合自溶）；④氧化作用（氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基）；⑤表面活性剂和去污剂（低浓度~强烈的相互作用~不可逆变性）；⑥变性剂（必需水、金属离子的失去和疏水作用力、介电常数的改变）：⑦重金属离子和巯基试剂（结合二硫键和氨基酸残基）；⑧热（伸展---不可逆失活）；⑨机械力；⑩冷冻和脱水（引起酶微环境中pH和离子强度的剧烈改变，减弱疏水相互作用,并可能引起二硫交换和巯基的氧化）；（11）辐射作用（产生自由基~破坏结构）28.从固定化和修饰的角度讨论酶的稳定化策略.①防止蛋白质的可逆伸展，②发生了可逆伸展，防止其不可逆失活发生~采取不同的特殊稳定化方法。固定化稳定酶的因素：空间障碍、机械方式的空间限制（交联或包埋）非共价修饰（反相胶束；添加剂:专一性底物及配体;非专一性中性盐和多羟基物质;与失活剂竞争的物质;除掉破坏化学催化剂的物质;蛋白质间非共价相连）化学修饰(可溶性大分子修饰酶、小分子修饰酶)蛋白质工程：基因操作技术，不仅改变酶的结构，也可以改变其催化活力及专一性和稳定性29.有机溶剂中酶的催化活性和选择性与什么因素有关?(至少指出4种因素)①反应系统的含水量②有机溶剂性质③酶的状态（固定化、游离、化学修饰、干粉等）④环境pH值30.酶在非水介质中酶结构及功能的关系如何变化?虽然酶整体结构和活性中心结构保持完整，但酶分子表面结构和动态结构却发生了变化，一些侧链也发生了显著的重排。使得酶在废水介质中具有更高的稳定性,并改变了酶的选择性,使其更容易与疏水非极性底物相结合,具有高度的定向化.31.酶在有机介质中具有更高稳定性的原因?在含微量水有机介质中时，①与蛋白质分子形成分子间氢键的水分子极少，蛋白质分子内氢键起主导作用使酶的刚性增强，②抑制了酶的不可逆失活、可逆协同性折叠、水解作用等有害反应32.酶在有机溶剂中表现催化作用与水的关系?有机介质反应体系中含有的水主要有与酶分子紧密结合的结合水和溶解于有机溶剂的游离水，结合水中必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等所必需的，而氢键、盐键等又是酶空间结构的主要稳定因素，酶分子一旦失去必需水，就必将使其空间构象破坏而失去催化功能。所以微量的水对酶有效发挥催化作用是必需的，因为水间接或直接地参与了酶天然构象中包括氢键、静电作用、疏水相互作用和范德华力在内的所有非共价相互作用。33.非水介质中酶的催化作用与溶剂的关系?通常有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的催化作用。1)对酶结合水的影响：①这种影响与有机溶剂介电常数(ε)和疏水性参数(lgP)有关.ε越大,lgP越小,对酶结合水的争夺能力越强,酶越容易失水；②增加酶表面的亲水性可以抑制酶在有机溶剂中的脱水作用.2)对酶的本身的影响：①动态影响：溶剂介电常数明显影响酶分子活动中心区域的活动性，但酶活性中心的活动性与酶活性并没有必然的联系；②酶结构：虽然酶整体结构和活性中心结构保持完整，但酶分子表面结构和动态结构却发生了变化，一些侧链也发生了显著的重排；④活性中心：主要是通过减少整个活性中心的数量，活性中心丧失的数量取决于有机溶剂的极性，非极性溶剂的影响更明显；⑤\n活性与溶剂属性：酶活性与溶剂属性之间可能存在某种定量关系，研究最多的是活力与极性参数lgP的关系，当lgP<2时，极性强，容易夺取酶分子表面水层，酶活力低故不宜作酶催化反应的非水介质；24的溶剂酶具有较高的活力，比较理想。1)溶剂对酶底物和产物的影响：使底物和产物溶剂化从而影响酶的活性。34.酶在非水介质中主要酶学性质的变化热力学稳定性和储存稳定性比水溶液中高催化的选择性①底物特异性（疏水作用力已不重要，结合的化学能直接加速反应）②对映体选择性（介质亲疏水性）③具有位置选择（选择催化底物区域基团）④化学键选择性（无需基团保护而合成目的产物）pH记忆（控制有机相中酶催化的最适pH）与pH忘记（中性与离子对形式~比例控制~酶解离状态干燥前缓冲溶液的pH值对微水有机溶剂中酶的活力无影响）35.试述模拟酶的基础理论⑴作用机制：①稳定过渡态理论（二个问题------结合方式和活化能）酶和底物的定向结合,键的扭曲及变形---降低反应的活化能.②人工体系中识别、结合和催化理论(催化基团的引入对催化效率的提高至关重要。底物的定向结合能力，有利于降低反应的活化能-------酶模型与底物相互匹配的立体化学,包括催化基团和底物之间必须具有相互匹配的立体化学特征。)⑵主客体化学和超分子化学是人工模拟酶的重要理论基础。36.试述模拟酶设计的基本策略⑴设计前必须了解:①酶活性中心-底物复合物的结构;②酶的专一性及其同底物结合的方式和能力;③反应的动力学及各中间物的知识⑵设计时应考虑的因素①非共价健：是生物酶柔韧性可变性和专一性的基础，模型酶应为底物提供良好的微环境（根据底物的特点）；②定向反应：催化基团相对结合点尽可能与底物的功能团相接近；③足够的水溶性，在接近生理条件下保持催化活性37.模拟酶的分类(至少举出4种)主客体酶模型（环糊精,冠醚,穴醚,杂环大环化合物,卟啉类等）；胶束酶模型；肽酶；抗体酶；分子印迹酶；半合成酶；杂合酶和进化酶38.抗体酶与抗体、一般蛋白酶的差别与底物结合方式:基态（抗体）、过渡态（一般蛋白酶）、抗原过渡态（抗体酶）与抗体相比较：相同点在于都是蛋白质；都能特异性地和靶分子结合；结合能相同。不同点在于酶与化学反应的高能过渡态结合，而抗体与基态的抗原结合。与一般酶相比较：相同点在于都具有催化效率高、专一性、区域和立体选择性、可进行化学修饰和具有辅酶因子等，并且在饱和动力学与竞争性抑制方面也极其相似。而区别在于抗体酶的本质是一类具有催化活性的免疫球蛋白，因此也具有抗体的高度选择性。抗体酶是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白。39.为什么自然界中主要的是核酶，不是脱氧核酶？核酶2`羟基的存在与核酶的多样性和催化能力密切相关，40．核酶相对于蛋白酶的差别（优缺点）？缺点：缺乏化学多样性；缺乏更多的催化基团；因而催化活力低，催化种类单一，天然核酶多是催化与磷酸基团有关的反应；\n优点：没有免疫反应；定位准确；容易通过分子技术人工设计和合成。41.（理解）试管中进行进化酶的策略由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性（突变或重组），然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，利用那些编码改进功能产物的基因来继续下一轮进化，重复这个过程直达到目标。定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选基本方法：易错PCR、连续易错PCR、DNA改组技术、基因家族的同源重组、外显子重组、杂合酶、计算机辅助设计42.进化酶PCR时DNA的常见的构建载体系统及其优缺点？噬菌体载体系统:优点为可以装载容量大的,适合于大片段的克隆.较好的质量控制;缺点:可采用的文库筛选方法有限,常常在载体系统中无法表达.质粒载体系统:操作方便,可塑性强,能够实现对基因文库的功能筛选.缺点:插入片段的容量较小.哺乳动物细胞表达系统:是一个新动向,已显示了良好的前景.43.（理解）杂合酶的制备的基本策略？①点突变（保持酶的活力）及二级结构互换（产生新特性但活力降低）；②功能域替换：转移活性部位至同系蛋白上+转移功能序列到呈现骨架蛋白上+转移活性部位到一个新的结构上③融合蛋白质