《高中教育酶》PPT课件 84页

第六章酶第一节概述第二节酶的命名与分类第三节酶分子的组成与结构第四节酶催化作用的机制第五节酶促反应动力学第六节酶的分离纯化\n第一节概述1.概念：酶（Enzyme）：是生物活细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂。2.生物催化剂一、酶是生物催化剂……克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类(天然酶、生物工程酶)核酸类模拟生物催化剂3.胞外酶与胞内酶酶虽是由细胞产生的,但并非必须在细胞内才能起作用,有些酶被分泌到细胞外才发生作用。这类酶称“胞外酶”。大部分酶在细胞内起催化作用称为“胞内酶”。\n什么是催化剂？在化学反应里能改变其他化学物质的化学反应速率，而本身的质量和化学性质在反应前后都没有发生变化的物质叫做催化剂。酶就是与所有催化剂一样能显著改变化学反应的反应速率，反应前后不发生任何变化的物质。二、酶的催化作用\n盐酸蔗糖蔗糖蔗糖酶蔗糖真空无菌无变化蔗糖盐酸△果糖+葡萄糖蔗糖蔗糖酶37℃果糖+葡萄糖实验：\n实验中盐酸和蔗糖酶就是催化剂，它们都可以显著加快化学反应的反应速率，自己本身在反应前后不发生任何改变。催化剂能加快化学反应的原理：根据有效碰撞理论，分子之间的有效碰撞是发生化学反应的条件，而只有活化分子、原子或离子才能发生有效碰撞。因此，在发生化学反应之前，反应物需要吸收能量，由普通分子（原子、离子）转变成活化分子（原子、离子），所需的能量称为活化能。\n活化能：在一定温度下，1mol底物全部进入活化状态所需的自由能，单位J/mol。\n催化剂可以使反应的活化能大大降低，使得一些原本需要激烈条件（如高温、高压等）才能发生的反应在较温和的条件下即可发生，因此大大加快了反应速率。蔗糖分解反应的活化能为32万J/mol；加入盐酸后反应的活化能降为25000J/mol,加入蔗糖酶后反应的活化能降为9400J/mol。\n三、酶的作用特点（一）与无机催化剂相比，有如下共同点：反应前后都不发生数量和质量变化；能加快反应速度,但不改变反应的平衡点；从热力学上看,只能催化热力学上允许进行的反应，都能降低反应所需的活化能。\n（二）酶的作用特点1.化学本质是蛋白质2.高度专一性3.高效率4.条件温和5.活性可调控\n1.酶是蛋白质1926年Sumner第一次从刀豆种子中提取了脲酶结晶，证明其具有蛋白质性质。30年代，Northrop又分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，证明酶的化学本质是蛋白质。酶具有蛋白质的特性如：两性解离、胶体性质、加热使酶变性、颜色反应等；酶可以被蛋白酶水解而丧失活性；许多酶的氨基酸顺序已被测定；1969年人工合成了牛胰核糖核酸酶。\n2.高度的专一性一种酶只能作用于某一类或某种特定的物质，这种性质称为酶的专一性。（1）结构专一性概念：酶对所催化的分子化学结构的特殊要求和选择。类别：绝对专一性和相对专一性（2）立体异构专一性概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求类别：旋光异构专一性和几何异构专一性\n绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。如：过氧化氢酶底物：过氧化氢琥珀酸脱氢酶底物：琥珀酸相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。包括键专一性和基团专一性。\n\n消化道内几种蛋白酶的专一性\n反应速度与不加催化剂相比可提高108～1020，与加普通催化剂相比可提高107～1013.3、高效率例2H2O2→2H2O+O21moleH2O2酶能催化5×106moleH2O2的分解1moleFe3+只能催化6×10-4moleH2O2的分解\n4、条件温和酶促反应一般要求在常温、常压、中性酸碱度等温和的条件下进行。因为酶是蛋白质，在高温、强酸、强碱等环境中容易失去活性。而非生物催化剂的作用条件就比较苛刻了。例：N2+3H2→2NH3人工合成：300个大气压，500℃，铁催化剂；生物合成：常温、常压、中性\n5、可调控性与化学催化剂相比，酶催化作用的最显著的特征是其催化活性可以自动地调控。生物体内进行的化学反应，虽然种类繁多，但非常协调有序。底物浓度、产物浓度以及环境条件的改变，都有可能影响酶催化活性，从而控制生化反应协调有序的进行。一个失去控制的酶已经毫无意义，在生物体内也不会起作用。\n第二节酶的分类与命名一、酶的分类：根据酶所催化的反应类型，可将酶分为六大类：氧化还原酶类，转移酶类，水解酶类，裂合酶类，异构酶类，合成酶类。1、氧化还原酶类凡能催化底物发生氧化还原反应的酶，均称为氧化还原酶（oxido-reductases）。此类酶中包括有脱氢酶、加氧酶（oxygenases）、氧化酶（oxidases）、还原酶（reductase）、过氧化物酶（peroxidases）等\n其中种数最多的是脱氢酶。脱氢酶催化的反应，可用通式表示为：AH2＋B→A＋BH2例：乙醇+NAD+醇脱氢酶乙醛+NADH+H+由氧化酶所催化的反应可表示为：2AH2＋O2→2A＋2H2O例：酶褐变（多酚氧化酶，酪氨酸酶）\n2.转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应：\n3.水解酶：催化催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶催化的脂的水解反应：\n4.裂合酶：催化从底物上移去某些基团而形成双键的非水解性反应及其逆反应的酶。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。\n5.异构酶：催化同分异构体的相互转变，即底物分子内基团或原子的重排过程的酶。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖\n6.合成酶：又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。如：Gln合成酶,丙酮酸羧化酶,乙酰辅酶A合成酶。A+B+ATPAB+ADP+Pi\n二、酶的编号：EC、类、亚类、亚亚类、顺序号类：表示反应性质，前面所述的六大类；亚类：表示反应性质：如第一类中的氧化、脱氢；亚亚类：表示作用键的类型或受体；顺序号：表示底物。如乙醇脱氢酶的标码是EC1.1.1.1，表示它属于氧化还原酶类、第一亚类、第一亚亚类、排号第一国际酶学委员会标志\n二、酶的命名1.习惯命名法底物名称脲酶、淀粉酶、蛋白酶反应性质脱氢酶、加氧酶、转氨酶两者结合琥珀酸脱氢酶、谷丙转氨酶酶的来源胃蛋白酶、木瓜蛋白酶2.国际系统命名法底物1：底物2反应类型如：琥珀酸：FAD氧化还原酶\n\n第三节酶的组成与结构一、酶的组成按化学成分酶分为：单纯酶和结合酶1.单纯酶：只由蛋白质组成，如脲酶、淀粉酶、蛋白酶。2.结合酶：除蛋白质外，还有对热稳定的非蛋白小分子物质，称辅因子。\n辅因子：辅酶、辅基、金属离子辅酶:与酶蛋白结合疏松，用透析法可以除去.辅基:与酶蛋白结合紧密，不能用透析法除去小分子有机化合物.往往是由维生素参与形成的小分子有机物。如：NAD+,FMN,FAD…….金属离子：与酶蛋白结合，有的紧，有的松如：Cu2+,Fe3+…….\n酶蛋白与辅因子单独存在时，均无催化活力。只有二者结合成完整的分子时，才具有酶活力。此完整的酶分子称为全酶（holoenzyme）。全酶=酶蛋白＋辅因子主导作用辅助作用酶蛋白本身决定酶反应的专一性及高效性，而辅因子直接作为电子、原子或某些化学基团的载体起传递作用，参与反应并促进整个催化过程。\n通常一种酶蛋白只能与一种辅酶结合，组成一个全酶，作用一种底物，向着一个方向进行化学反应。而一种辅酶，则可以与若干种酶蛋白结合，组成为若干个全酶，催化若干种底物发生同一类型的化学反应。如乳酸脱氢酶的酶蛋白，只能与NAD+结合，组成乳酸脱氢酶，使底物乳酸发生脱氢反应。但可以与NAD+结合的酶蛋白则有很多种，如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶及磷酸甘油脱氢酶中都含NAD+，能分别催化乳酸、苹果酸及磷酸甘油发生脱氢反应。\n由此也可看出，酶蛋白决定了反应底物的种类，即决定该酶的专一性，而辅酶（基）决定底物的反应类型。\n二、酶的结构（一）酶的结构与蛋白质的结构相同，是具有一定空间结构的蛋白质。（二）根据酶蛋白的结构特点，酶可分为：1.单体酶:只有一条多肽链,分子量在13,000-35,000之间，一般是水解酶,如蛋白酶、羧肽酶。2.寡聚酶：由两个或两个以上的亚基组成,亚基之间由非共价键相连，亚基可以是相同的,也可以是不同的，分子量在35,000-几百万，如丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶。3.多酶复合体：由几个酶有组织的聚集在一起,功能上相互配合，第一个酶的产物是第二个酶的底物，如丙酮酸脱氢酶、脂肪酸合成酶。\n三、酶的活性中心（一）活性中心的概念酶的活性中心：指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。(二）、催化部位和结合部位从功能上看，可以认为活性中心有两个功能部位，一是与底物结合的结合部位，决定酶对底物的专一性；二是催化底物发生键的断裂及新键形成的催化部位，决定酶促反应的类型，即酶的催化性质。\n（三）必需基团:参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团，包括活性中心基团及维持活性中心的基团。\n活性中心结合部位催化部位与底物结合，决定酶的专一性底物的敏感键在此处断裂而形成新键，决定酶的高效性\n酶分子必需基团其它部分（非必需基团）活性中心维持活性中心的必需基团结合部位催化部位调控部位酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用\n（四）酶活性中心的形成酶蛋白多肽链经过盘绕折叠形成特定的空间结构，使相关的AA形成微区。AspHisSer活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser195胰凝乳蛋白酶的活性中心为Tyr248为Arg145为Glu270为底物羧肽酶活性中心示意图\n一些酶活性中心的氨基酸残基酶氨基酸残基数活性中心残基牛胰核糖核酸酶A124His12His119Lys41溶菌酶129Asp52Glu35木瓜蛋白酶212Cys25His159枯草杆菌蛋白酶275His64Ser221胰凝乳蛋白酶245His57Asp102Ser195碳酸酐酶His93—Zn—His95↓His117\n（五）酶活性中心的结构特征1.活性中心是酶分子表面的一个凹穴，一定的大小和特殊的构象，在与底物接触时表现一定的柔性。X-Y\n2.构成活性中心的大多数AA残基为疏水性的，使此小区形成一个非极性的微环境，有利于与底物作用。在活性中心内仅有少数极性AA残基以其功能基团直接与底物作用。活性中心的AA在一级结构上相距很远，甚至不在一条肽链上，但在三级结构上比较靠近。胰凝乳蛋白酶的活性中心3.在活性中心，底物以弱键与酶结合（有利于产物形成）。\n（六）酶原1.酶原：某些酶在细胞内合成或初分泌时没有催化活性，这种无活性状态的酶前身物称为酶原。2.酶原激活：酶原变成酶的过程（切去几个AA的肽段）。实质：酶活性中心的形成或暴露过程。\n1、胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活\n2、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活\n第四节酶的作用机制一.酶催化作用的本质：降低反应活化能。E+SP+EES能量水平反应过程GE1E2S\n二、中间产物学说——酶降低活化能的原因酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。许多实验事实证明了E－S复合物的存在。E－S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。\n三、酶专一性的作用机理（理论）1.锁钥学说认为底物分子或底物分子的一部分象钥匙那样，专一地楔入到酶的活性中心部位，也就是说底物分子进行化学反应的部位与酶分子活性中心具有紧密互补的关系。酶专一性的“锁钥学说”锁钥学说无法解释酶活性中心有一定柔性\n2.诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。酶专一性的“诱导契合学说”\n第五节酶促反应动力学一、酶促反应速度（V）：单位时间内产物的生成量或单位时间内底物的消耗量。在反应初期，产物增加得比较快，酶促反应的速度（d[P]/dt）近似为一个常数。随着时间延长，酶促反应的速度便逐渐减弱（即曲线斜率下降）酶反应过程曲线\n二、酶活力的测定（一）酶活力的概念及表示方法1.概念：检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来表示。\n2.酶活力的表示方法活力单位：规定条件（最适条件）下，一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。国际单位（U）:指在标准条件下，1分钟内催化1微摩尔(umol)底物的酶量，或是转化1微摩尔(umol)底物中的有关基团的酶量。Katal：指在最适条件下，每秒钟催化1mol底物转化所需的酶量。简称Kat。1Kat=6×107U注意：以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。\n（二）酶活力的测定终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。要求测定初速度最适条件[S]》[E]\n三、底物浓度对酶反应速度的影响（一）底物浓度对酶反应速度的影响pH、T、[E]固定时，V对[S]作下图：\n1.基础中间产物学说2.前提（1）S与E形成中间产物，且整个反应速度取决于ESP+E（2）产物浓度为0（初速度）（3）[S]》[E]（4）反应达到平衡（二）米氏方程（Michaelis-Mentenequation）\n[S][Et]-[ES][ES][ES]生成速度：[ES]分解速度：当酶反应体系处于平衡时：即：令：则：经整理得：（1）米氏方程推导\n由于酶促反应速度由[ES]决定，即：所以（2）将（2）代入（1）得：（3）当[Et]＝[ES]时，所以（4）将（4）代入（3），则：—米氏方程\n由米氏方程可以看出：（1）[S]很小时，[S]《Km，则V=Vmax/Km，一级反应；（2）[S]很大时，[S]》Km，则V=Vmax，零级反应；（3）[S]处于Km附近时，混和级反应。\n（三）米氏常数Km1.意义：（1）Km：当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度，单位mol/L。即：Km=[S]（2）Km是酶的特征常数之一。只与酶的性质有关,而与酶浓度无关。\n（3）如果一种酶有几种底物,就有几种Km值，Km值最小的底物称该酶的最适底物。Km值还受pH及温度影响。因此Km值作为常数是在一定条件下而言的。（4）当K2>K3时，1/Km可以近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km愈大，Km愈小，达到最大反应速度一半时所需浓度就愈小，亲和力就越大。反之亦然：Km愈大，亲和力就越小\n2.Km值的求法——双倒数作图法测定一个酶促反应的Km的方法很多,一般最常用双倒数作图法:改写成直线方程：斜率=Km/Vmax1/Vmax-1/Km实验时，选择不同的[S]测定相应的V，求出两者的倒数，1/V对1/[S]作图，绘出直线，其斜率为Km/Vmax。将直线延长与横轴相交，在横轴上的截距为－1/Km，这样，Km就可以从直线的截距上计算出来。直线在纵轴上的截距为1/Vmax。\nKm值与米氏方程的实际用途：a由所要求的反应速度（应达到Vmax的百分数），求出应当加入底物的合理浓度。b由已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度。eg1.若要求反应速度到达Vmax的99%，其底物浓度应为：99%=100%[S]/（Km+[S]）　　　　　　　　∴[S]=99Kmeg2.若要求反应速度达到Vmax的90%，其底物浓度应为：　90%=100%[S]/（Km+[S]）　　　　　　　　　∴[S]=90Km练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？\n四、酶浓度对酶反应速度的影响〔E〕v酶浓度与反应速率成正比由米氏方程可推导出酶反应速度与酶浓度成正比的关系：V=Vmax[S]Km+[S]=k2[E][S]Km+[S]=k2[S]Km+[S]·[E]\n五、pH对酶促反应的影响1.pH对酶促反应的影响实验结果：pH最适pHv\n2、最适pH一般4～8动物酶5.5～6.5；植物酶6.5～8.0；酶的最适pH受酶纯度、底物的种类、缓冲液等影响。3、酶有最适pH的原因：PH影响酶分子活性中心基团的解离状态；底物的解离状态；从而影响ES的形成。只有一种解离状态适合底物与酶的结合。\n六、温度对酶促反应的影响v温度最适温度1.温度对酶促反应的影响实验结果\n（1）在温度低时，温度升高，反应速度加快。(2)温度达到一定时，反应速度达到最大。（3）温度继续升高，反应速度不仅不增加，反而降低\n2、最适温度在一定条件下，酶催化反应速率最大时的温度为最适温度。一般动物酶的最适温度为：35～45℃，一般植物的酶最适温度稍高，通常40～55℃。最适温度是酶的特性之一，但是不是固定不变的常数，其他条件会影响它。与酶作用时间的长短有关，酶可以在短时间内耐受较高的温度，然而当酶反应时间较长时，最适温度就要低一点。\n3、温度对酶促反应的影响原理温度对酶促反应速度的影响，表现为双重作用：（1）与非酶的化学反应相同，当温度升高，活化分子数增多，酶促反应速度加快；（2）由于酶是蛋白质，随着温度升高而使酶逐步变性，即通过酶活力的减少而降低酶的反应速度。\n4、稳定温度在一定温度范围内，酶不发生或很少发生变性失活，这个温度为酶的稳定温度。大多数酶在温度升高到50—60℃以上活性就迅速丧失。酶的失活温度与酶的变性温度很相近。酶的稳定温度与作用时间有关：作用时间短，稳定温度可以高一点，作用时间长，稳定温度就低。\n有些酶的稳定温度可以在加入保护剂后而提高。如：α—淀粉酶稳定温度为93℃，加入CaCl2后稳定温度可以提高到97℃。\n七、激活剂对酶反应速度的影响凡能提高酶活性的物质,都称为激活剂,其中大部分是离子或简单有机化合物。按其分子大小可分为：1、无机离子（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+等；（2）阳离子,α-淀粉酶受Cl-激活；（3）H+，胃蛋白酶受H+激活；2.有机分子（1）某些还原剂GSH、半胱氨酸等；（2）EDTA、金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，解除抑制。3.具有蛋白质性质的大分子物质酶原酶蛋白酶\n八、抑制剂对酶促反应的影响有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂（inhibitor)。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。\n抑制作用的类型：根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，分为两大类：可逆性抑制作用不可逆性抑制作用\n（一）可逆性抑制作用可逆性抑制作用：抑制剂与酶Pr以非共价键可逆结合，可用透析的方法除去。可逆性抑制作用可以分为三种类型：竞争性抑制作用非竞争性抑制作用反竞争性抑制作用\n1.竞争性抑制作用（1）抑制剂的化学结构与底物相似，与底物竞争酶活性中心，形成EI，减少了酶与底物的结合，降低酶反应速度。（2）抑制作用的强弱取决于[I]/[S]。（3）可采用提高[S]来消除这种抑制作用。\n\n2.非竞争性抑制作用（1）非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的部位结合，引起酶分子构象变化，使酶活性中心催化作用降低。（2）抑制作用的强弱取决于抑制剂的绝对浓度。（3）不能用增大[S]的方法来消除抑制作用。\n\n竞争性抑制与非竞争性抑制作用的区别底物与酶专一性结合竞争性抑制作用非竞争性抑制作用\n3.反竞争性抑制作用抑制剂不能与游离酶结合，只与ES复合物结合形成ESI，形成的ESI不能转变为产物。\n（二）不可逆性抑制作用抑制剂以比较牢固的共价键和酶结合，不能用透析的方法除去。按照不可逆抑作用的选择性不同,又可分为专一性的不可逆抑制和非专一性不可抑制两类。非专一性不可抑制作用：抑制剂可作用于酶分子上的不同基团或作用于几类不同的酶。抑制剂有：碘乙酸、DNFB等烷化剂；磺酰氯、酸酐等酰化剂。如:专一性不可逆抑制作用：抑制剂只作用于酶蛋白的一种AA侧链基团或仅作用于一类酶。\n第六节酶的分离和纯化一、酶的分离，纯化的一般步骤1．选材2．破碎细胞3．抽提4．去核酸、去多糖5．提纯6．保存\n1．全部操作在低温0～4℃。2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度。二、酶的分离，纯化的注意事项\n天天都有好心情！