高中生物核心概念高考复习课件-PCR技术 43页

2021/7/18PCR技术（聚合酶链式反应）\nATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长DNA的体内复制基本过程\nATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶DNA的体内复制基本过程\nATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA的体内复制基本过程\n1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E.coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪\nKaryB.Mullis<>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,穆利斯荣获1993年度诺贝尔化学奖。\n引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段\nTaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020\n72℃94℃55℃PCR循环\n一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR技术原理和基本操作\nTaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+\n标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物　各200umol/L800ul引物　　　　　   各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR技术的反应条件\nDenaturetemplateDNAbyheat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step1–\nPCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；\nPCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA互补链。3’\nEndofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。\nTargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon\n2021/7/18181缓冲液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可有添加剂、共溶剂等。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。二、有关PCR反应体系常识2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。3、引物使用浓度为0.1-0.5mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配。\n2021/7/18194、模板单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。5、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性。常用的有：1）TaqDNA聚合酶2）TthDNA聚合酶3）VentDNA聚合酶4）PwoDNA聚合酶5）PfuDNA聚合酶6）混合DNA聚合酶。\n2021/7/1820PCR引物的设计一般原则引物长度一般以18～30bp为宜，过短降低特异性，过长会引起退火时结合的模板数减少，降低反应效率。解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，两条引物间的Tm值越接近越好。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构。引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能。要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。引物5’末端碱基可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其它序列均应无明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。\n2021/7/1821三、PCR反应程序1、常规程序：94℃左右预变性几十秒至几分钟；94℃左右变性10秒至1分钟；50-65℃左右退火30秒至1分钟；20-35个循环72℃左右延伸30秒至几分钟；72℃左右最后延伸和加尾3-10分钟；4-25℃保持3分钟或更长。2、退火和延伸温度：退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5℃，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。\n2021/7/18223、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时间长，简单模板时间短，复杂模板时间长。退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短，引物结构差的退火时间宜长。延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。\n1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍\n模板DNA95℃\nPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物\nPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶\nPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始\nPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq\nPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束\nPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数\nPCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA\nPCR操作（录像）\nPCR中其它注意的事项1.防止污染试剂小量分装吸头及EP管(离心管)一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作2.设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板、无模板试剂对照：除模板外的所有组分\nPCR应用举例1、在PCR产物两端添加限制性酶切位点在PCR引物的5’加上根据需要而设计的酶切位点，PCR产物内部无该切点。在酶切位点的5’加3个左右的保护碱基，其数目多少取决该酶的性质。PCR产物经电泳回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。\n2021/7/18352、TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个突出的A。T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的3’末端具有一个突出的T。TA克隆：将3’末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等。\n3、反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列\n已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶\n4、利用接头的PCR/锚定PCR(anchoredPCR)将基因组总DNA用限制酶切割，然后将序列已知的接头连接到酶切片段的两端，以提供PCR的锚定引物，该锚定引物与已知序列中的基因特异引物组合后，用于目标基因侧翼序列的扩增。为了减少锚定引物与锚定引物之间组合后构成的非特异扩增，可以将接头替换为一端平、另一端为5’突变的结构，且对3’凹陷的碱基实行亚氨基修饰。\n5、多重PCR(multiplexPCR)：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物\n现嫌1嫌2嫌3父’父子母6、PCR-VNTR多态性检测\n\nPCR技术的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……凡是生命科学领域，PCR都有用武之地。\n本课到此结束